EP2744897A2 - Biotechnologisches syntheseverfahren von omega-funktionalisierten carbonsäuren und carbonsäure-estern aus einfachen kohlenstoffquellen - Google Patents

Biotechnologisches syntheseverfahren von omega-funktionalisierten carbonsäuren und carbonsäure-estern aus einfachen kohlenstoffquellen

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EP2744897A2
EP2744897A2 EP12745886.7A EP12745886A EP2744897A2 EP 2744897 A2 EP2744897 A2 EP 2744897A2 EP 12745886 A EP12745886 A EP 12745886A EP 2744897 A2 EP2744897 A2 EP 2744897A2
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EP
European Patent Office
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thioester
acyl
activity
amino
carboxylic acids
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12745886.7A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Steffen Schaffer
Nicole Decker
Jasmin GIELEN
Harald HÄGER
Thomas Haas
Markus PÖTTER
Hans-Georg Hennemann
Mirja Wessel
Michael Volland
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Degussa GmbH
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Publication date
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    • C12Y102/01004—Aldehyde dehydrogenase (NADP+) (1.2.1.4)
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    • C12Y102/01005—Aldehyde dehydrogenase [NAD(P)+] (1.2.1.5)
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    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01001—Alanine dehydrogenase (1.4.1.1)
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    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15003—Alkane 1-monooxygenase (1.14.15.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Definitions

  • carbohydrates such as glucose, sucrose, arabinose, xylose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose and hemicellulose, but also glycerol or simplest organic molecules such as C0 2 , CO or synthesis gas can be used.
  • Alcohol component is derived from methanol, ethanol or other primary alcohols having 3-18 carbon atoms, especially methanol and ethanol.
  • Atopobium Aurantimonas, Azoarcus, Azorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus,
  • E. coli in particular E. coli, Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp., Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Cyanobacteria, Klebsiella sp., Klebsiella oxytoca, Salmonella sp., Rhizobium sp. and
  • This method is also always suitable when possible products of the catalyzed by the enzyme activity to be determined reaction in the microorganism quickly can be metabolized or the activity in the Wiltyp itself is too low to be able to determine the enzyme activity to be determined by the product formation sufficient.
  • the enzyme Ei the reaction of lauric acid and / or lauric acid methyl ester to give co-hydroxy lauric acid and / or co-hydroxy lauric acid methyl ester as a measure of the enzyme activity is understood in particular.
  • preferred P450 alkane hydroxylases are selected from the list AA073954.1, AA073953.1, XP_002546279.1, AAA34353.2, P30607.1, XP_002421627.1, XP_718670.1, CAA39366.1, XP_001527524.1, AA073955.1 , AA073956.1, XP_002546278.1, EEQ43157.1, XP_718669.1, AAA34354.1, P10615.3, XP_002421628.1, 226487, P16141.3, CAA39367.1, Q9Y757.2, XP_001485567.1, AA073958.1 , XP_001383506.2, XP_460111.2, AA073959.1, Q12586.1, XP_460112.2, AAO73960.1, Q12589.1, AA073961.1, XP_460110.2, EEQ43763.1,
  • Microorganisms are known to the person skilled in the art. In particular molecular biological techniques are available here. Instructions for modifying and reducing protein expressions and associated enzyme activity reduction, especially for Candida, in particular for disrupting specific genes, are found in the expert in WO91 / 006660 and WO03 / 100013. Microorganisms preferred according to the invention are characterized in that the
  • ⁇ _08114403.1 ⁇ _003552869.1, ⁇ _002358112.1, ⁇ _08111138.1, ⁇ _003770046.1, ⁇ _003103898.1, ⁇ _08101069.1, ⁇ _08097706.1, ⁇ _08094005.1, ⁇ _003167240.1, ⁇ _002371817.1, ⁇ _004231854.1, EGA98455. 1, ⁇ _002430239.1, ⁇ _01049900.1, ⁇ _769819.1, ⁇ _768378.1, ⁇ _001143837.1, ⁇ _001108475.1, ⁇ _906040.1,
  • YP_294429.1 YP_0010281 12.1, ZP_02479747.1, YP_002874799.1, ZP_03541051 .1,
  • YP_003606536.1 ZP_02887167.1, YP_001795572.1, YP_487451.1, ACZ62814.1,
  • Hexanoic acid synthase a specialized fatty acid synthase of the FAS-I type, which catalyzes the synthesis of hexanoic acid from 2 molecules of malonyl-coenzyme A and one molecule of acetyl-coenzyme A.
  • Fatty acid ethyl esters Fatty acid ethyl esters, fatty alcohols, fatty alkyl acetates, fatty aldehydes, fatty amines, fatty amides, fatty sulfates, fatty ethers, ketones, alkanes, internal and terminal olefins, dicarboxylic acids, ⁇ , ⁇ -dicarboxylic acids and ⁇ , ⁇ -diols, from at least one simple carbon source capable of forming.
  • the document also describes preferred enzymes E according to the invention and their sequences, in particular in sections [0012] to [0060], Tables 7, 17, 26 and 27, FIGS. 1, 44 to 47 and 55 to 59, exemplary embodiments 1 to 38 and claims 1 to 17.
  • WO2010022090 A1 describes, in particular in sections [0022] to [0143] and [0238] to [0275], FIGS. 3 to 5, exemplary embodiment 2 and claims 5, 15, 16 and 36, microorganisms preferably used according to the invention have the first genetic modification, so they more compared to their wild type
  • WO2009140695 A1 describes in particular in the sections [0214] to [0248] and the embodiments 22 to 24 microorganisms which are preferably used according to the invention and have a first genetic engineering modification, so that they contain at least .fat. Fatty acids and fatty acid derivatives, in particular hydrocarbons, compared to their wild type be able to form a simple carbon source.
  • the document also describes preferred enzymes E according to the invention, and their sequences in particular in Table 1, Figure 40 and Examples 22 to 24.
  • microorganisms preferably used according to the invention which have a first genetic modification, so that they are able to form more fatty acids and fatty acid derivatives, in particular fatty acids and fatty acid esters, from at least one simple carbon source compared to their wild type.
  • the document also describes according to the invention preferred enzymes E, and their sequences, in particular on p.193, first paragraph, p.194, first and second paragraph, p.196, second paragraph, and in the Supplementary material.
  • Fatty acid derivatives in particular hexanoic acid from at least one simple carbon source capable of forming.
  • the document also describes preferred enzymes E iv according to the invention and their sequences on, in particular, page 5 and in exemplary embodiment 3.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von funktionalisierten Carbonsäuren und von funktionalisierten Carbonsäure-Estern aus einfachen Kohlenstoffquellen.

Description

Biotechnologisches Syntheseverfahren von ω-funktionalisierten Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern aus einfachen Kohlenstoffquellen
Gebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von
ω-funktionalisierten Carbonsäuren und von co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern aus einfachen Kohlenstoffquellen.
Stand der Technik
Die biotechnologische Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäuren und den
korrespondierenden Estern ist bisher ausschließlich in Form von Biotransformationen beschrieben worden, bei denen die korrespondierende Carbonsäure als Substrat mit einer entsprechenden biologischen Zelle in Kontakt gebracht wird, welche die notwendigen
Reaktionen enzymatisch katalysiert.
Solch ein Verfahren und Zellen, die zur Herstellung der co-Amino-Carbonsäuren und deren Ester geeignet sind, werden beispielweise in der WO2009077461 beschrieben.
Die EP2322598 beschreibt ebenfalls die Herstellung von ω-Hydroxy-Carbonsäuren und deren Estern in speziell ausgerüsteten Candida tropicalis Zellen aus Fettsäuren als eingesetzte Substrat. Ein sehr ähnliches Vorgehen wird in der WO201 1008232 beschrieben, in der Candida Zellen, welche in ihrer ß-Oxidation blockiert sind, ausgehend von Fettsäuren entsprechende co- funktionalisierte Carbonsäuren und Di-Säuren durch enzymatische Oxidation bilden.
Die als Substrat benötigten Fettsäuren und deren Derivate werden heute ausschließlich aus pflanzlichen und tierischen Ölen bzw. Fetten gewonnen. Dies hat eine Vielzahl von Nachteilen: Insbesondere tierische Fette treffen in Folge der BSE-Krise als Rohstoffe kaum noch auf Kundenakzeptanz. Pflanzliche Öle, die kurz- und mittelkettige Fettsäuren enthalten, sind entweder schwer verfügbar oder werden in tropischen Regionen produziert. Hier ist in vielen Fällen die Nachhaltigkeit der Produktion in Frage gestellt, da gegebenenfalls Regenwald gerodet wird, um die Anbauflächen bereit zu stellen.
Außerdem besitzen pflanzliche und tierische Öle bzw. Fette für den jeweiligen Rohstoff spezifische, aber festgelegte Fettsäurespektren. Daher findet hier eine Koppelproduktion statt, die für eine bestimmte Fettsäurespezies preisbestimmend sein kann. Zu guter letzt sind viele der pflanzlichen Öle gleichzeitig auch Nahrungsmittel, so dass unter bestimmten Umständen eine Konkurrenz zwischen stofflicher Verwertung und einer Verwertung als Nahrungsmittel auftreten kann.
Aufgabe der Erfindung war es, ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von co- funktionalisierten Carbonsäuren und von co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern
bereitzustellen, welches nicht auf Fettsäuren als Edukte angewiesen ist.
Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die im Folgenden beschriebenen Zellen enthaltend gentechnische Modifikationen die der Erfindung gestellte Aufgabe zu lösen vermögen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Mikroorganismen, die vermehrt
Carbonsäuren oder Carbonsäure-Ester synthetisieren und diese aufgrund von weiteren genetischen Merkmalen mit einer ω-Funktionalität versehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der vorgenannten Mikroorganismen zur Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäuren und von co-funktionalisierten
Carbonsäure-Estern sowie ein Verfahren zur Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäuren und von co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern unter Einsatz der Mikroorganismen.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Produktinhibition im
Herstellungsverfahren stark reduziert werden kann.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass das Verfahren die Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäuren und co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern aus nicht verwandten Kohlenstoffquellen mit hoher Raum-Zeit-Ausbeute, hoher Kohlenstoffausbeute und hoher Konzentration im Kulturüberstand ermöglicht. Insbesondere letzteres führt dazu, dass eine effiziente Aufarbeitung erleichtert wird. Die Erfindung umfasst Methoden für die Generierung von rekombinanten mikrobiellen Zellen, die in der Lage sind, co-funktionalisierte Carbonsäuren und co-funktionalisierte Carbonsäure- Ester aus nicht verwandten Kohlenstoffquellen herzustellen. Die vorliegende Erfindung umfasst somit einen Mikroorganismus, der eine erste gentechnische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp mehr Carbonsäure oder Carbonsäure-Ester aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermag, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus eine zweite gentechnische Modifikation aufweist, welche umfasst, dass der Mikroorganismus eine im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität
mindestens eines Enzyms E-i, welches die Umsetzung von Carbonsäuren oder Carbonsäure- Estern zu den entsprechenden ω-Hydroxy-Carbonsäuren oder co-Hydroxy-Carbonsäure-Estern katalysiert, aufweist.
Unter dem Begriff„eine erste gentechnische Modifikation" wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung mindestens eine gentechnische Veränderung des Mikroorganismus verstanden, bei dem ein oder mehrere Gene in ihrer Expression verglichen zum Wildtypstamm verändert, d.h. erhöht oder reduziert, wurden.
Unter dem Begriff„einfache Kohlenstoffquelle" werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Kohlenstoffquellen verstanden, bei denen im Kohlenstoffgerüst mindestens eine C-C- Bindung aufgebrochen und/oder mindestens ein Kohlenstoffatom der einfachen
Kohlenstoffquelle mit mindestens einem Kohlenstoffatom eines anderen Moleküls mindestens eine neue Bindung ausbilden muss, um zu dem Kohlenstoffgerüst der„mehr gebildeten Carbonsäuren oder Carbonsäure-Ester" zu gelangen.
Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent.
Als Kohlenstoffquelle können Kohlehydrate wie z. B. Glukose, Saccharose, Arabinose, Xylose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose und Hemicellulose, aber auch Glycerin oder einfachste organische Moleküle wie C02, CO oder Synthesegas eingesetzt werden.
Bevorzugte Carbonsäuren oder Carbonsäure-Ester der vorliegenden Erfindung stellen solche dar, die über mehr als ein, insbesondere 3 bis 36, bevorzugt 6 bis 24, insbesondere 10 bis 14 Kohlenstoffatome in der Carbonsäurekette aufweisen. Diese kann linear, verzweigt, gesättigt oder ungesättigt und gegebenenfalls mit anderen Gruppen substituiert sein. Die Carbonsäure-Ester sind bevorzugt solche, bei denen die Alkoholkomponente sich ableitet von Methanol, Ethanol oder anderen primären Alkoholen mit 3 - 18 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methanol und Ethanol.
Besonders bevorzugt sind die Carbonsäuren Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe
Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Capronsäure,
Önanthsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure,
Pentadecansäure, Palmitinsäure, Margarinsäure, Stearinsäure, Nonadecansäure,
Arachinsäure, Behensäure, Lignocerinsäure, Cerotinsäure, Montansäure, Melissinsäure, Undecylensäure, Myristoleinsäure, Petroselinsäure, Ölsäure, Elaidinsäure, Vaccensäure, Gadoleinsäure, Icosensäure, Cetoleinsäure, Erucasäure, Nervonsäure, Linolsäure, a- Linolensäure, γ-Linolensäure, Calendulasäure, Punicinsäure, α-Elaeostearinsäure, ß- Elaeostearinsäure, Arachidonsäure, Timnodonsäure, Clupanodonsäure, Cervonsäure,
Vernolsäure, Rizinolsäure
und deren Ester, wobei die Fettsäure-Ester bevorzugt solche sind, bei denen die
Alkoholkomponente sich ableitet von Methanol, Ethanol oder anderen primären Alkoholen mit 3 - 18 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methanol und Ethanol.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass aufgrund der guten genetischen Zugänglichkeit Mikroorganismen eingesetzt werden; ausgewählt aus der Gruppe der Bakterien, besonders aus der Gruppe enthaltend, bevorzugt bestehend aus, Abiotrophie, Acaryochloris, Accumulibacter, Acetivibrio, Acetobacter, Acetohalobium, Acetonema, Achromobacter, Acidaminococcus, Acidimicrobium, Acidiphilium, Acidithiobacillus, Acidobacterium, Acidothermus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinomyces, Actinosynnema, Aerococcus, Aeromicrobium, Aeromonas, Afipia, Aggregatibacter, Agrobacterium, Ahrensia, Akkermansia, Alcanivorax, Alicycliphilus, Alicyclobacillus, Aliivibrio, Alkalilimnicola, Alkaliphilus, Allochromatium,
Alteromonadales, Alteromonas, Aminobacterium, Aminomonas, Ammonifex, Amycolatopsis, Amycolicicoccus, Anabaena, Anaerobaculum, Anaerococcus, Anaerofustis, Anaerolinea, Anaeromyxobacter, Anaerostipes, Anaerotruncus, Anaplasma, Anoxybacillus, Aquifex,
Arcanobacterium, Arcobacter, Aromatoleum, Arthrobacter, Arthrospira, Asticcacaulis,
Atopobium, Aurantimonas, Azoarcus, Azorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus,
Bartonella, Basfia, Baumannia, Bdellovibrio, Beggiatoa, Beijerinckia, Bermanella, Beutenbergia, Bifidobacterium, Bilophila, Blastopirellula, Blautia, Blochmannia, Bordetella, Borrelia, Brachybacterium, Brachyspira, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Brucella, Buchnera, Bulleidia, Burkholderia, Butyrivibrio, Caldalkalibacillus, Caldanaerobacter, Caldicellulosiruptor, Calditerrivibrio, Caminibacter, Campylobacter, Carboxydibrachium, Carboxydothermus, Cardiobacterium, Carnobacterium, Carsonella, Catenibacterium,
Catenulispora, Catonella, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Centipeda, Chelativorans, Chloroflexus, Chromobacterium, Chromohalobacter, Chthoniobacter, Citreicella, Citrobacter, Citromicrobium, Clavibacter, Cloacamonas, Clostridium, Collinsella, Colwellia, Comamonas, Conexibacter, Congregibacter, Coprobacillus, Coprococcus, Coprothermobacter,
Coraliomargarita, Coriobacterium, corrodens, Corynebacterium, Coxiella, Crocosphaera, Cronobacter, Cryptobacterium, Cupriavidus, Cyanobium, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Dechloromonas, Deferribacter, Dehalococcoides, Dehalogenimonas, Deinococcus, Delftia, Denitrovibrio, Dermacoccus, Desmospora, Desulfarculus, Desulfatibacillum, Desulfitobacterium, Desulfobacca, Desulfobacterium, Desulfobulbus, Desulfococcus, Desulfohalobium,
Desulfomicrobium, Desulfonatronospira, Desulforudis, Desulfotalea, Desulfotomaculum, Desulfovibrio, Desulfurispirillum, Desulfurobacterium, Desulfuromonas, Dethiobacter,
Dethiosulfovibrio, Dialister, Dichelobacter, Dickeya, Dictyoglomus, Dietzia, Dinoroseobacter, Dorea, Edwardsieila, Ehrlichia, Eikenella, Elusimicrobium, Endoriftia, Enhydrobacter,
Enterobacter, Enterococcus, Epulopiscium, Erwinia, Erysipelothrix, Erythrobacter, Escherichia, Ethanoligenens, Eubacterium, Eubacterium, Exiguobacterium, Faecalibacterium, Ferrimonas, Fervidobacterium, Fibrobacter, Finegoldia, Flexistipes, Francisella, Frankia, Fructobacillus, Fulvimarina, Fusobacterium, Gallibacterium, Gallionella, Gardnerella, Gemella, Gemmata, Gemmatimonas, Geobacillus, Geobacter, Geodermatophilus, Glaciecola, Gloeobacter,
Glossina, Gluconacetobacter, Gordonia, Granulibacter, Granulicatella, Grimontia, Haemophilus, Hahella, Halanaerobiumns, Haliangium, Halomonas, Halorhodospira, Halothermothrix,
Halothiobacillus, Hamiltonella, Helicobacter, Heliobacterium, Herbaspirillum, Herminiimonas, Herpetosiphon, Hippea, Hirschia, Histophilus, Hodgkinia, Hoeflea, Holdemania, Hydrogenivirga, Hydrogenobaculum, Hylemonella, Hyphomicrobium, Hyphomonas, Idiomarina, llyobacter, Intrasporangium, Isoptericola, Isosphaera, Janibacter, Janthinobacterium, Jonesia, Jonquetella, Kangiella, Ketogulonicigenium, Kineococcus, Kingella, Klebsiella, Kocuria, Koribacter,
Kosmotoga, Kribbella, Ktedonobacter, Kytococcus, Labrenzia, Lactobacillus, Lactococcus,
Laribacter, Lautropia, Lawsonia, Legionella, Leifsonia, Lentisphaera, Leptolyngbya, Leptospira, Leptothrix, Leptotrichia, Leuconostoc, Liberibacter, Limnobacter, Listeria, Loktanella, Lutiella, Lyngbya, Lysinibacillus, Macrococcus, Magnetococcus, Magnetospirillum, Mahella, Mannheimia, Maricaulis, Marinithermus, Marinobacter, Marinomonas, Mariprofundus,
Maritimibacter, Marvinbryantia, Megasphaera, Meiothermus, Melissococcus, Mesorhizobium, Methylacidiphilum, Methylibium, Methylobacillus, Methylobacter, Methylobacterium,
Methylococcus, Methylocystis, Methylomicrobium, Methylophaga, Methylophilales,
Methylosinus, Methyloversatilis, Methylovorus, Microbacterium, Micrococcus, Microcoleus, Microcystis, Microlunatus, Micromonospora, Mitsuokella, Mobiluncus, Moorella, Moraxella, Moritella, Mycobacterium, Myxococcus, Nakamurella, Natranaerobius, Neisseria, Neorickettsia, Neptuniibacter, Nitratifractor, Nitratiruptor, Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrospira, Nocardia, Nocardioides, Nocardiopsis, Nodularia, Nostoc, Novosphingobium, Oceanibulbus, Oceanicaulis, Oceanicola, Oceanithermus, Oceanobacillus, Ochrobactrum, Octadecabacter, Odyssella, Oligotropha, Olsenella, Opitutus, Oribacterium, Orientia,
Ornithinibacillus, Oscillatoria, Oscillochloris, Oxalobacter, Paenibacillus, Pantoea, Paracoccus, Parascardovia, Parasutterella, Parvibaculum, Parvimonas, Parvularcula, Pasteurella, Pasteuria, Pectobacterium, Pediococcus, Pedosphaera, Pelagibaca, Pelagibacter, Pelobacter,
Pelotomaculum, Peptoniphilus, Peptostreptococcus, Persephonella, Petrotoga, Phaeobacter, Phascolarctobacterium, Phenylobacterium, Photobacterium, Pirellula, Planctomyces,
Planococcus, Plesiocystis, Polaromonas, Polaromonas, Polymorphum, Polynucleobacter, Poribacteria, Prochlorococcus, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudoalteromonas, Pseudoflavonifractor, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter, Pseudovibrio, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Psychromonas, Puniceispirillum, Pusillimonas,
Pyramidobacter, Rahnella, Ralstonia, Raphidiopsis, Regieila, Reinekea, Renibacterium, Rhizobium, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodoferax, Rhodomicrobium, Rhodopirellula, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rickettsia, Rickettsiella, Riesia, Roseburia, Roseibium, Roseiflexus, Roseobacter, Roseomonas, Roseovarius, Rothia, Rubrivivax, Rubrobacter,
Ruegeria, Ruminococcus, Ruthia, Saccharomonospora, Saccharophagus, Saccharopolyspora, Sagittula, Salinispora, Salmonella, Sanguibacte, Scardovia, Sebaldella, Segniliparus,
Selenomonas, Serratia, Shewanella, Shigella, Shuttleworthia, Sideroxydans, Silicibacter, Simonsieila, Sinorhizobium, Slackia, Sodalis, Solibacter, Solobacterium, Sorangium,
Sphaerobacter, Sphingobium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Spirochaeta, Sporosarcina, Stackebrandtia, Staphylococcus, Starkeya, Stenotrophomonas, Stigmatella, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Streptosporangium, Subdoligranulum, subvibrioides, Succinatimonas, Sulfitobacter, Sulfobacillus, Sulfuricurvum, Sulfurihydrogenibium, Sulfurimonas, Sulfurospirillum, Sulfurovum, Sutterella, Symbiobacterium, Synechocystis, Syntrophobacter, Syntrophobotulus, Syntrophomonas, Syntrophothermus, Syntrophus, taiwanensis, Taylorella, Teredinibacter, Terriglobus, Thalassiobium, Thauera, Thermaerobacter, Thermanaerovibrio, Thermincola, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium,
Thermobaculum, Thermobifida, Thermobispora, Thermocrinis, Thermodesulfatator,
Thermodesulfobacterium, Thermodesulfobium, Thermodesulfovibrio, Thermomicrobium, Thermomonospora, Thermosediminibacter, Thermosinus, Thermosipho,
Thermosynechococcus, Thermotoga, Thermovibrio, Thermus, Thioalkalimicrobium,
Thioalkalivibrio, Thiobacillus, Thiomicrospira, Thiomonas, Tolumonas, Treponema, tribocorum, Trichodesmium, Tropheryma, Truepera, Tsukamurella, Turicibacter, Variovorax, Veillonella, Verminephrobacter, Verrucomicrobium, Verrucosispora, Vesicomyosocius, Vibrio, Vibrionales, Victivallis, Weissella, Wigglesworthia, Wolbachia, Wolinella, Xanthobacter, Xanthomonas, Xenorhabdus, Xylanimonas, Xylella, Yersinia, Zinderia und Zymomonas,
insbesondere E. coli, Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp., Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Cyanobakterien, Klebsiella sp., Klebsiella oxytoca, Salmonella sp., Rhizobium sp. und
Rhizobium meliloti, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Clostridium sp., Corynebacterium sp.,
Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium sp., Chlorella sp. und Nostoc sp.,
wobei E. coli besonders bevorzugt ist.
Ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus weist eine im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms E-ι auf.
Der Begriff„gesteigerte Aktivität eines Enzyms", wie er vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise als gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen.
Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms E-ι als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann, sowie auch für eine erhöhte alkL- Genprodukt Bildung.
Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, die
Regulation der Expression des Gens modifiziert oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Mikroorganismen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Promotor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einen extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999, die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.
Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1 - und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer
Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar.
Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1 - oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001 ) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) und anschließende optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 1 1 1 : 2630-2647) analysiert werden.
Diese Methode bietet sich auch immer dann an, wenn mögliche Produkte der durch die zu bestimmende Enzymaktivität katalysierten Reaktion im Mikroorganismus schnell verstoffwechselt werden können oder aber die Aktivität im Wiltyp selber zu gering ist, um die zu bestimmende Enzymaktivität anhand der Produktbildung ausreichend bestimmen zu können. In Bezug auf das Enzym Ei wird insbesondere die Umsetzung von Laurinsäure und/oder Laurinsäuremethylester zu co-Hydroxy-Laurinsäure und/oder co-Hydroxy-Laurinsäuremethylester als Maß der Enzymaktivität verstanden.
Bestimmte Enzyme Ei Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, wenn in dem Mikroorganismus das Enzym E-ι ausgewählt ist aus der Gruppe:
Eia P450 Alkanhydroxylasen, welche bevorzugt die folgenden Reaktionen katalysieren: reduziertes Häm + Alkansäure(ester) = oxidiertes Häm + co-Hydroxy-Alkansäure(ester) + H20,
2 reduziertes Häm + Alkansäure(ester) = 2 oxidiertes Häm + co-Oxo-Alkansäure(ester) + 2 H20 oder
3 reduziertes Häm + Alkansäure(ester) = Alkanmonoxygenase + 3 oxidiertes Häm + co-Carboxy- Alkansäure(ester) + 3 H20 und bevorzugt
Bestandteil eines Reaktionssystems bestehend aus den zwei Enzym-Komponenten„Cytochrom P450 Alkanhydroxylase und NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase der EC 1.6.2.4" oder Bestandteil eines Reaktionssystems bestehend aus den drei Enzym-Komponenten„Cytochrom P450 Alkanhydroxylase vom CYP153-Typ, Ferredoxin-NAD(P)+-Reduktasen der EC 1.18.1 .2 oder EC 1 .18.1 .3 und Ferredoxin" darstellen, und
Eib AlkB Alkanhydroxylasen der EC 1 .14.15.3, welche bevorzugt die folgenden Reaktionen katalysiert: reduziertes Rubredoxin + Alkansäure(ester) = oxidiertes Rubredoxin + ω-Hydroxy- Alkansäure(ester) + H20,
2 reduzierte Rubredoxine + Alkansäure(ester) = 2 oxidierte Rubredoxine + ω-Οχο- Alkansäure(ester) + 2 H20 oder
3 reduzierte Rubredoxine + Alkansäure(ester) = Alkanmonoxygenase + 3 oxidierte Rubredoxine + co-Carboxy-Alkansäure(ester) + 3 H20 und bevorzugt
Bestandteil eines Reaktionssystems bestehend aus den drei Enzym-Komponenten„AlkB
Alkanhydroxylase der EC 1.14.15.3, AlkT Rubredoxin-NAD(P)+-Reduktase der EC 1 .18.1 .1 oder der EC 1 .18.1 .4 und Rubredoxin AlkG" darstellen. Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angeführten Accession-Nummern entsprechen den ProteinBank Datenbank-Einträgen des NCBI mit Datum vom 26.07.2011; in der Regel wird vorliegend die Versionsnummer des Eintrages durch„.Ziffer" wie beispielsweise „.1", kenntlich gemacht.
In diesem Zusammenhang bevorzugte P450 Alkanhydroxylasen sind ausgewählt aus der Liste AA073954.1, AA073953.1, XP_002546279.1, AAA34353.2, P30607.1 , XP_002421627.1 , XP_718670.1, CAA39366.1, XP_001527524.1 , AA073955.1, AA073956.1, XP_002546278.1 , EEQ43157.1, XP_718669.1, AAA34354.1, P10615.3, XP_002421628.1, 226487, P16141.3, CAA39367.1, Q9Y757.2, XP_001485567.1, AA073958.1, XP_001383506.2, XP_460111.2, AA073959.1 , Q12586.1 , XP_460112.2, AAO73960.1 , Q12589.1 , AA073961.1 , XP_460110.2, EEQ43763.1, XP_710174.1, EDK41572.2, XP_001482650.1 , CAA75058.1, XP_002548818.1, Q12588.1, XP_002422222.1, XP_001383636.2, XP_001525381.1 , XP_002548823.1 ,
P30610.1, AA073952.1, XP_002548428.1 , CAA36197.1 , XP_002421126.1 , AAA34320.1 ,
P16496.3, P30608.1, P24458.1, XP_717999.1, XP_001383817.1, Q9Y758.1 , XP_001482092.1 , XP_001383710.2, P30609.1 , AAB24479.1 , XP_457792.1 , XP_001524144.1 , XP_457727.2, XP_001525578.1, XP_002616743.1 , XP_002614836.1 , XP_001525577.1 , AA073957.1, Q12585.1, XP_001386440.2, XP_002616857.1 , XP_001483276.1 , XP_500402.1 , EDK39907.2, XP_500560.1, XP_001211376.1, XP_002560027.1, XP_504857.1, XP_500855.1,
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ΒΑΕ47482.1 , ACP39674.1 , ACP39704.1 , ACP39703.1 , ΥΡ_497095.1 , ACP39672.1 ,
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XP_001941811.1, XP_001220831.1 , XP_003296981.1 , XP_002480829.1 , BAD83681.1, XP_001827526.2, XP_369556.1 , CAK38224.1 , EFQ26532.1 , XP_002562328.1 ,
XP_001904540.1, EG052476.1 , XP_002382002.1 , XP_001225874.1 , XP_958030.2,
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XP_003052680.1, XP_365851.1, XP_001799910.1, XP_003347175.1, XP_002565258.1,
EGR48918.1, EGR52524.1 , XP_964653.2, XP_002147083.1 , XP_002843935.1 , EEH19393.1, CAC10088.1, EEH47609.1, EEQ92528.1, XP_001246560.1 , XP_002626168.1, XP_003024880.1, XP_003169255.1 , XP_003013780.1 , XP_003235691.1 , XP_746816.1, EGD98483.1 , XP_001389925.2, XP_002842817.1 , XP_002797278.1 , ADK36666.1 ,
XP_003305469.1, XP_001548471.1, XP_001806478.1, EFQ34989.1 , XP_001552987.1 , CAC24473.1, XP_002541530.1, EEQ89262.1 , XP_001247332.1 , XP_003066043.1 ,
EDP47672.1, XP_002628451.1 , XP_001910644.1 , EGR44510.1, EFQ36733.1,
XP_003052472.1, XP_001393445.2, XP_001522438.1 , XP_001397944.2, CAK49049.1, EFQ30109.1, XP_001585052.1, XP_388496.1, XP_003173913.1, CBF76609.1 , CAK46976.1 , XP_370476.1, XP_002145942.1 , XP_003004457.1 , ADK36663.1, XP_003040708.1 ,
XP_003351473.1, EFY84692.1 , XP_748328.2, XP_003190325.1 , XP_002378813.1 ,
EGR46513.1, XP_002145326.1 , XP_662462.1, XP_747469.1, XP_001935085.1 , EGR45892.1, EGP89995.1, XP_001222615.1, XP_001224356.1 , XP_001934479.1, XP_001267956.1 , ADK36661.1, EFY97845.1, EFY84206.1 , XP_001412594.1 , XP_002583529.1 ,
XP_002843371.1, XP_001587730.1, EGE03365.1, EFZ01428.1, XP_001558890.1,
XP_002487181.1, EFY92529.1 , XP_002380252.1 , EFY99978.1, BAG09240.1,
XP_002381768.1, XP_001800031.1, XP_001825073.2, BAE63940.1 , XP_681680.1 ,
XP_002486603.1, EGR50064.1 , CAK37996.1 , CA091865.1, XP_001258702.1,
XP_001586739.1, XP_001560806.1, CBF69707.1 , ADN43682.1 , XP_001593179.1 ,
XP_001392650.1, XP_366716.2, CAL69594.1 , XP_001269140.1 , XP_002566307.1 ,
XP_001555473.1, XP_663925.1, XP_001598033.1 , XP_001554305.1 , XP_001560475.1, EFQ32286.1, XP_001216788.1, XP_002483975.1, XP_002143660.1, EFQ36688.1,
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XP_002839066.1, EGC49561.1, EEH05830.1, BAA05146.1, EEH21852.1, XP_001559854.1, EER40289.1, XP_001560028.1 , XP_001554079.1 , XP_001559275.1 , EFY92064.1,
XP_001589816.1, EEH42702.1, XP_001554577.1 , XP_001592850.1 , YP_691921.1,
CAH59968.1 , AAS80270.1 , CAH59967.1 , ACQ99381.2, YP_003810988.1 , YP_957888.1 , CBW44755.1, ZP_05042596.1, ZP_01913735.1, ZP_05043097.1, ADQ00145.1,
γρ_004494060.1, ZP_08206912.1, BAE78452.1, NP_114222.1 , ACZ56357.1 , YP_640381.1 , ZP_04384919.1, ZP_08025219.1 , ZP_07715822.1 , ZP_06847816.1, YP_001702784.1 , AEK27137.1, ZP_07716433.1 , ZP_08199554.1 , YP_004495520.1 , YP_345718.1,
ZP_08022914.1, YP_001851443.1, BAG50428.1 , YP_001135848.1 , BAF95905.1,
YP_345695.1 , ACP39691.1 , ACP39664.1 , ACP39635.1 , ACP39633.1 , ACP39710.1 ,
ACP39698.1 , ACP39711.1, BAE47475.1 , BAE47474.1 , ABW76858.1 , ACO50699.1 , ACP39643.1 , ACP39639.1 , ACP39708.1 , ACM68663.1 , ACP39642.1 , ACP39684.1 ,
ACP39636.1 , ΖΡ_05095005.1 , ACP39652.1 , ΒΑΕ47473.1 , ACM68664.1 , ACP39646.1 , ACP39680.1 , ACP39692.1 , ACP39675.1 , ACP39632.1 , ΖΡ_05129284.1 , ACP39706.1 , ACP39695.1 , ACM68665.1 , ACP39654.1 , ACP39665.1 , ACP39649.1 , ΒΑΕ47472.1 ,
ACM68668.1 , ACP39676.1 , ACP39648.1 , ACP39647.1 , ΖΡ_01102434.1 , ACM68666.1 , ACP39641.1, ACM68669.1, ΖΡ_01625037.1, ACP39690.1, ACP39696.1, ACP39697.1, ACP39707.1 , ACP39682.1 , ACP39650.1 , ACP39638.1 , ΖΡ_05126641.1 , CAH04396.1 , ACP39658.1 , ΖΡ_01102687.1 , ACJ06772.1 , ΥΡ_001413041.1 , ΥΡ_552058.1 , ADE05601.1 , ADI19685.1, ΒΑΕ47479.1, ΖΡ_01626700.1 , ΖΡ_01618279.1, CAH61448.1 , ΥΡ_001411305.1 , ΥΡ_003591161.1, ΖΡ_01615522.1 , ACM68667.1 , ACP39651.1 , ΖΡ_05095535.1 ,
ΖΡ_01618489.1, ΝΡ_418882.1, ADI19983.1, ACP39677.1, ΒΑΕ47476.1 , ACP39655.1 , ACP39656.1 , AD119696.1 , ΒΑΕ47477.1 , ΥΡ_001413399.1 , ΥΡ_459878.1 , ΒΑΕ47480.1 , ΒΑΕ47481.1 , ACP39653.1 , ΒΑΕ47478.1 , ΥΡ_001681656.1 , ΖΡ_01618281.1 , ΖΡ_01627262.1 , ΥΡ_001413057.1 , ΥΡ_760740.1 , ΥΡ_001242466.1 , ΥΡ_001203574.1 , CAH61454.1 ,
ΥΡ_002129656.1 , ΥΡ_001672075.1 , ACP39709.1 , ΥΡ_001990805.1 , ΝΡ_946959.1 ,
ΥΡ_001203575.1, ΥΡ_783213.1, ΥΡ_003059227.1 , ΥΡ_004110202.1, ACP39645.1,
ΥΡ_487538.1 , CAH61451.1 , ΥΡ_570816.1 , ΥΡ_534107.1 , ΥΡ_001413223.1 , ΥΡ_001242465.1 , ΥΡ_557448.1, ΖΡ_08631162.1, ΝΡ_773883.1 , ΖΡ_00997728.1
und besonders bevorzugt
ΑΑ073954.1, ΑΑ073953.1, ΧΡ_002546279.1, ΑΑΑ34353.2, Ρ30607.1 , ΧΡ_002421627.1 , ΧΡ_718670.1, CAA39366.1, ΑΑ073955.1, ΑΑ073956.1, ΧΡ_002546278.1 , EEQ43157.1, ΧΡ_718669.1, ΑΑΑ34354.1, Ρ10615.3, ΧΡ_002421628.1, 226487, Ρ16141.3, CAA39367.1, ΑΑ073958.1 , ΑΑ073959.1 , Q12586.1 , ΑΑΟ73960.1 , Q12589.1 , ΑΑ073961.1 , EEQ43763.1 , ΧΡ_710174.1, CAA75058.1, ΧΡ_002548818.1, Q12588.1, ΧΡ_002422222.1, ΧΡ_002548823.1, Ρ30610.1, ΑΑ073952.1, ΧΡ_002548428.1, CAA36197.1 , ΧΡ_002421126.1 , ΑΑΑ34320.1 , Ρ16496.3, Ρ30608.1, Ρ24458.1 , ΧΡ_717999.1 , Ρ30609.1 , ΑΑΒ24479.1 , ΑΑ073957.1 ,
Q12585.1, ΧΡ_718066.1, CAA35593.1, ΧΡ_002548817.1, Ρ30611.1, Ρ43083.1 , Q12587.1 , Q12573.1, ΧΡ_002550661.1, Ρ30612.1, EEQ46951.1, ΧΡ_721410.1, ΧΡ_002421356.1, ΒΑΑ05145.1, BAG09241.1, CAC24473.1, BAG09240.1 , ΑΑΑ34334.1 , ΒΑΑ05146.1,
ΧΡ_500402.1, ΧΡ_500560.1, ΧΡ_504857.1, ΧΡ_500855.1, ΧΡ_504406.1, ΒΑΑ31433.1, ΧΡ_500856.1, ΧΡ_501148.1, ΧΡ_500097.1, ΧΡ_504311.1, ΧΡ_500273.1, ΧΡ_501667.1, ΧΡ_501748.1 , ΥΡ_691921.1 , CAH59968.1 , AAS80270.1 , CAH59967.1 , ACQ99381.2, YP_003810988.1 , ΥΡ_957888.1 , CBW44755.1 , ΖΡ_05042596.1 , ΖΡ_01913735.1 , ΖΡ_05043097.1 , ADQ00145.1 , ΥΡ_004494060.1 , ΖΡ_08206912.1 , ΒΑΕ78452.1 ,
ΝΡ_1 14222.1 , ACZ56357.1 , ΥΡ_640381.1 , ΖΡ_04384919.1 , ΖΡ_08025219.1 , ΖΡ_07715822.1 , ΖΡ_06847816.1 , ΥΡ_001702784.1 , ΑΕΚ27137.1 , ΖΡ_07716433.1 , ΖΡ_08199554.1 ,
ΥΡ_004495520.1 , ΥΡ_345718.1 , ΖΡ_08022914.1 , ΥΡ_001851443.1 , BAG50428.1 ,
ΥΡ_001 135848.1 , BAF95905.1 , ΥΡ_345695.1 , ACP39691.1 , ACP39664.1 , ACP39635.1 , ACP39633.1 , ACP39710.1 , ACP39698.1 , ACP3971 1.1 , ΒΑΕ47475.1 , ΒΑΕ47474.1 ,
ABW76858.1 , ACO50699.1 , ACP39643.1 , ACP39639.1 , ACP39708.1 , ACM68663.1 ,
ACP39642.1 , ACP39684.1 , ACP39636.1 , ΖΡ_05095005.1 , ACP39652.1 , ΒΑΕ47473.1 ,
ACM68664.1 , ACP39646.1 , ACP39680.1 , ACP39692.1 , ACP39675.1 , ACP39632.1 ,
ΖΡ_05129284.1 , ACP39706.1 , ACP39695.1 , ACM68665.1 , ACP39654.1 , ACP39665.1 , ACP39649.1 , ΒΑΕ47472.1 , ACM68668.1 , ACP39676.1 , ACP39648.1 , ACP39647.1 ,
ΖΡ_01 102434.1 , ACM68666.1 , ACP39641 .1 , ACM68669.1 , ΖΡ_01625037.1 , ACP39690.1 , ACP39696.1 , ACP39697.1 , ACP39707.1 , ACP39682.1 , ACP39650.1 und ACP39638.1 sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der
Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms E1a generell insbesondere die Umsetzung von Laurinsäure und/oder
Laurinsäuremethylester zu co-Hydroxy-Laurinsäure und/oder ω-Hydroxy-Laurinsäuremethylester verstanden wird.
Änderungen von Aminosäureresten einer gegebenen Polypeptidsequenz, die zu keinen wesentlichen Änderungen der Eigenschaften und Funktion des gegebenen Polypeptides führen, sind dem Fachmann bekannt. So können beispielsweise manche Aminosäuren oft problemlos gegeneinander ausgetauscht werden; Beispiele für solche geeigneten
Aminosäuresubstitutionen sind: Ala gegen Ser; Arg gegen Lys; Asn gegen Gin oder His; Asp gegen Glu; Cys gegen Ser; Gin gegen Asn; Glu gegen Asp; Gly gegen Pro; His gegen Asn oder Gin; lle gegen Leu oder Val; Leu gegen Met oder Val; Lys gegen Arg oder Gin oder Glu; Met gegen Leu oder lle; Phe gegen Met oder Leu oder Tyr; Ser gegen Thr; Thr gegen Ser; Trp gegen Tyr; Tyr gegen Trp oder Phe; Val gegen lle oder Leu. Ebenso ist bekannt, dass
Änderungen besonders am N- oder C-Terminus eines Polypeptides in Form von beispielsweise Aminosäureinsertionen oder -deletionen oft keinen wesentlichen Einfluss auf die Funktion des Polypeptides ausüben.
Erfindungsgemäß bevorzugte AlkB Alkanhydroxylasen sind ausgewählt aus der Liste
YP_001 185946.1 , Q9WWW6.1 , YP_957898.1 , YP_957728.1 , YP_694427.1 , BAC98365.1 , ZP_00957064.1 , CAC86944.1 , YP_001672212.1 , CAB59525.1 , ACH99213.1 , ACH99215.1 , ACH99216.1 , AAK56792.1 , ACH99229.1 , ACS91348.1 , AAP41820.1 , ZP_05128075.1 ,
CAM58121.1 , CAM58085.1 , ACQ44675.1 , ACZ62808.1 , ZP_01738706.1 , ZP_01916228.1 , ZP_01225325.1 , YP_001023605.1 , ACJ22747.1 , ACT91 140.1 , AAT91722.2, CBA27418.1 , YP_001889129.1 , EGC97932.1 , ACT91201.1 , ZP_05083049.1 , YP_554098.1 , ZP_01900149.1 , ADG26619.1 , ADG26657.1 , ADG26640.1 , ZP_06838771.1 , ADG26649.1 , ADG26651.1 , ZP_02374120.1 , YP_368326.1 , ZP_02380481 .1 , ADG26643.1 , ADG26628.1 , YP_442346.1 , ADG26620.1 , ADG26647.1 , ZP_07673680.1 , ADG26638.1 , YP_002232139.1 ,
YP_001 1 18743.1 , ZP_01764629.1 , YP_108945.1 , YP_334185.1 , ZP_04897834.1 ,
ZP_02889567.1 , YP_620386.1 , YP_002897546.1 , ZP_02166109.1 , ZP_02904755.1 ,
ADG26639.1 , YP_001892637.1 , ADG26642.1 , ZP_04939380.1 , ZP_02464124.1 ,
YP_102417.1 , CAC36356.1 , AC J22727.1 , YP_001764240.1 , YP_002765609.1 ,
YP_00194531 1.1 , ZP_03586616.1 , ACJ22665.1 , ZP_03574223.1 , CAC37038.1 ,
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ADA71113.1, ADA71091.1 , ADC29537.1 , ADA71084.1 , ADA71090.1 , CAH 56094.1 ,
XP_002945767.1 , ADA71137.1 , ADA71103.1, ADA71118.1, ADA71133.1 , ADA71102.1 , ADC29536.1, CAH56100.1, CAH56101.1, ACI15225.1, ACI15225.1, ABO26091.1, CAH55826.1 , CAH55824.1 , ΖΡ_08484419.1 , ADA71111.1, ACJ22759.1 , CAH55825.1 , CAH56106.1, CAH56099.1, CAC40957.1, ΖΡ_05075037.1, CAH56102.1, ΖΡ_06846296.1, ABJ16491.1, ΖΡ_05067177.1, ΧΡ_001698107.1, ΒΑΗ10789.1, ΒΑΗ10791.1, ΒΑΗ10793.1, ΒΑΗ 10788.1, ABJ 16490.1, ΒΑΗ10800.1, ΒΑΗ10790.1, ΒΑΗ 10792.1, ΖΡ_05075214.1,
ΒΑΗ10799.1, ΒΑΗ10795.1, ΒΑΗ10787.1, ΒΑΗ10798.1, ΒΑΗ10794.1, ΒΑΗ10801.1,
ΒΑΗ 10796.1, ΒΑΗ 10797.1, ΒΑΗ 10802.1, CAH56095.1, CAH56096.1 , ADC29538.1 ,
ΑΒΧ76425.1, ΖΡ_06727686.1, ΖΡ_07774883.1,ΥΡ_001615042.1,
insbesondere ΥΡ_001185946.1 , Q9WWW6.1 , ΥΡ_957898.1 , ΥΡ_957728.1 , ΥΡ_694427.1 , BAC98365.1, ΖΡ_00957064.1 , CAC86944.1, ΥΡ_001672212.1 , CAB59525.1, ACH99213.1, ACH99215.1, ACH99216.1, ΑΑΚ56792.1, ACH99229.1, ACS91348.1, ΑΑΡ41820.1
und besonders bevorzugt YP_001185946.1,
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms E1b generell insbesondere die Umsetzung von Laurinsäure und/oder
Laurinsäuremethylester zu co-Hydroxy-Laurinsäure und/oder ω-Hydroxy-Laurinsäuremethylester verstanden wird.
Hilfsenzyme zu Ε-ι Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass, wenn E1a eine eukaryotische P450 Alkanhydroxylasen darstellt, der erfindungsgemäße Mikroorganismus ebenfalls eine im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität einer NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase der EC 1 .6.2.4 aufweist. Dies hat den technischen Effekt, dass die Aktivität der eukaryotischen P450
Alkanhydroxylasen gesteigert und die Produktausbeuten erhöht werden.
NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen der EC 1 .6.2.4 katalysieren die folgende Reaktion: Oxidiertes Cytochrom P450 + NADPhT = Reduziertes Cytochrom P450 + NADP+ + H+
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass, wenn wenn E1a eine prokaryotische P450
Alkanhydroxylase des CYP153-Typs darstellt, der erfindungsgemäße Mikroorganismus ebenfalls eine im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität einer Ferredoxin-NAD(P)+- Reduktase der EC 1.18.1.2 oder EC 1 .18.1.3 und/oder eines Ferredoxins aufweist. Dies hat den technischen Effekt, dass die Aktivität der prokaryotischen P450 Alkanhydroxylase des CYP153- Typs gesteigert und die Produktausbeuten erhöht werden.
Ferredoxin-NAD(P)+-Reduktasen der EC 1.18.1 .2 oder EC 1.18.1.3 katalysieren die folgende Reaktion:
oxidiertes Ferredoxin + NAD(P)H + H+ = reduziertes Ferredoxin + NAD(P)+) und werden bevorzugt kodiert durch ein Gen, welches sich in unmittelbarer Nähe eines Genes einer vorgenannten prokaryotischen P450 Alkanhydroxylase des CYP153-Typs oder eines im
Zusammenhang mit dieser Erfindung beschriebenen Ferredoxins befindet.
Der Begriff„in unmittelbarer Nähe" bedeutet, dass zwischen den betrachteten Genen maximal drei andere Strukturgene lokalisiert sind.
Ferredoxine katalysieren die folgenden Reaktionen:
Alkanhydroxylase + reduziertes Ferredoxin + Alkansäure(ester) = Alkanmonoxygenase + oxidiertes Ferredoxin + co-Hydroxy-Alkansäure(ester) + H20,
Alkanhydroxylase + 2 reduzierte Ferredoxine + Alkansäure(ester) = Alkanhydroxylase + 2 oxidierte Ferredoxine + co-Oxo-Alkansäure(ester) + 2 H20 oder
Alkanhydroxylase + 3 reduzierte Ferredoxine + Alkansäure(ester) = Alkanhydroxylase + 3 oxidierte Ferredoxine + co-Carboxy-Alkansäure(ester) + 3 H20) und
werden bevorzugt kodiert durch ein Gen, welches sich in unmittelbarer Nähe eines Genes einer vorgenannten prokaryotischen P450 Alkanhydroxylase des CYP153-Typs oder einer vorgenannten Ferredoxin-NAD(P)+-Reduktase der EC 1.18.1.2 oder EC 1.18.1.3 befindet. Der Begriff„in unmittelbarer Nähe" bedeutet, dass zwischen den betrachteten Genen maximal drei andere Strukturgene lokalisiert sind.
Bevorzugte Mikroorganismen weisen eine im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität der Ferredoxin-NAD(P)+-Reduktase AlkT und eines Ferredoxins auf.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass, wenn E-ι eine AlkB Alkanhydroxylase der
EC 1.14.15.3 darstellt, der erfindungsgemäße Mikroorganismus ebenfalls eine im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität einer AlkT Rubredoxin-NAD(P)+-Reduktase der EC 1 .18.1 .1 oder der EC 1.18.1.4 und/oder eines Rubredoxins AlkG aufweist. Dies hat den technischen Effekt, dass die Aktivität der AlkB Alkanhydroxylase gesteigert und die Produktausbeuten erhöht werden.
AlkT Rubredoxin-NAD(P)+-Reduktasen der EC 1.18.1.1 oder EC 1 .18.1 .4, katalysieren die folgende Reaktion:
oxidiertes Rubredoxin + NAD(P)H + H+ = reduziertes Rubredoxin + NAD(P)+) und werden bevorzugt kodiert durch ein Gen, welches sich in unmittelbarer Nähe eines Genes einer vorgenannten AlkB Alkanhydroxylase der EC 1 .14.15.3 oder eines im Zusammenhang mit dieser Erfindung beschriebenen Rubredoxins AlkG befindet.
Der Begriff„in unmittelbarer Nähe" bedeutet, dass zwischen den betrachteten Genen maximal drei andere Strukturgene lokalisiert sind.
Rubredoxine AlkG katalysieren die folgenden Reaktionen:
Alkanmonoxygenase + reduziertes Rubredoxin + Alkansäure(ester) = Alkanmonoxygenase + oxidiertes Rubredoxin + co-Hydroxy-Alkansäure(ester) + H20, Alkanmonoxygenase + 2 reduzierte Rubredoxine + Alkansäure(ester) = Alkanmonoxygenase + 2 oxidierte Rubredoxine + co-Oxo-Alkansäure(ester) + 2 H20 oder
Alkanmonoxygenase + 3 reduzierte Rubredoxine + Alkansäure(ester) = Alkanmonoxygenase +
3 oxidierte Rubredoxine + co-Carboxy-Alkansäure(ester) + 3 H20) und
werden bevorzugt kodiert durch ein Gen, welches sich in unmittelbarer Nähe eines Genes einer vorgenannten AlkB Alkanhydroxylase der EC 1 .14.15.3 oder einer vorgenannten AlkT
Rubredoxin-NAD(P)+-Reduktase der EC 1 .18.1 .1 oder EC 1.18.1 .4 befindet. Der Begriff„in unmittelbarer Nähe" bedeutet, dass zwischen den betrachteten Genen maximal drei andere Strukturgene lokalisiert sind. Bevorzugte Mikroorganismen weisen eine im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität der AlkT Rubredoxin-NAD(P)+-Reduktase und des Rubredoxins AlkG auf.
Enzym E2 co-Aminierung
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, einen Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen, der insbesondere ω-funktionalisierte Carbonsäuren und co-funktionalisierte Carbonsäure-Ester aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu produzieren vermag, wobei die ω- Funktionalisierung einer co-ständigen, insbesondere primären Aminogruppe entspricht.
Hierdurch lassen sich die Mikroorganismen vorteilhaft in Verfahren zur Herstellung von ω -Amino-Carbonsäuren oder ω -Amino-Carbonsäure-Estern verwenden.
Daher sind erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen dadurch gekennzeichnet, dass die zweite gentechnische Modifikation zusätzlich umfasst, dass der Mikroorganismus eine im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzym E2, welches die Umsetzung von ω-Oxo-Carbonsäuren oder co-Oxo-Carbonsäure-Estern zu den entsprechenden ω -Amino- Carbonsäuren oder ω -Amino-Carbonsäure-Estern katalysiert, aufweist.
Erfindungsgemäß bevorzugt handelt es sich bei dem Enzym E2 um eine ω-Transaminase der EC 2.6.1 .-.
Als Maß für die Enzymaktivität E2 kann insbesondere die Umsetzung von co-Oxo-Laurinsäure und/oder ω-Oxo-Laurinsäuremethylester zu ω -Amino-Laurinsäure und/oder ω -Amino- Laurinsäuremethylester herangezogen werden.
Bevorzugte Enzyme E2 sind ausgewählt aus der Gruppe:
3HMU_A, AAD41041.1 , AAK15486.1 , ABE03917.1 , ADR60699.1 , ADR61066.1 , ADR62525.1 , AEL07495.1 , CAZ86955.1 , EFW82310.1 , EFW87681 .1 , EGC99983.1 , EGD03176.1 ,
EGE58369.1 , EGH06681 .1 , EGH08331.1 , EGH24301.1 , EGH32343.1 , EGH46412.1 ,
EGH55033.1 , EGH62152.1 , EGH67339.1 , EGH70821 .1 , EGH71404.1 , EGH78772.1 ,
EGH85312.1 , EGH97105.1 , EGP57596.1 , NP_102850.1 , NP_106560.1 , NP_248912.1 , NP_248990.1 , NP_354026.2, NP_421926.1 , NP_637699.1 , NP_642792.1 , NP_744329.1 , NP_744732.1 , NP_747283.1 , NP_795039.1 , NP_901695.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 12), XP_002943905.1 , YP_001021095.1 , YP_001059677.1 , YP_001061726.1 , YP_001066961.1 , YP_001074671 .1 , YP_001 120907.1 , YP_001 1401 17.1 , YP_001 170616.1 , YP_001 185848.1 , YP_ .001 188121.1 ΥΡ_ ,001233688.1 ΥΡ, ,001268866.1 ΥΡ, ,001270391.1 ΥΡ_001345703.1
YP_ _001412573.1 ΥΡ_ _001417624.1 ΥΡ, ,001526058.1 ΥΡ, ,001579295.1 ΥΡ_001581 170.1
ΥΡ_ _001668026.1 ΥΡ_ ,001669478.1 ΥΡ, ,001671460.1 ΥΡ, ,001685569.1 ΥΡ_001747156.1
ΥΡ_ _001749732.1 ΥΡ_ _001765463.1 ΥΡ, ,001766294.1 ΥΡ, ,001790770.1 ΥΡ_001808775.1
ΥΡ_ _001809596.1 ΥΡ_ _001859758.1 ΥΡ, ,001888405.1 ΥΡ, ,001903233.1 ΥΡ_001977571.1
ΥΡ_ _002229759.1 ΥΡ_ _002231363.1 ΥΡ, ,002280472.1 ΥΡ, ,002297678.1 ΥΡ_002543874.1
ΥΡ_ .00254901 1.1 ΥΡ_ .002796201 .1 ΥΡ, ,002801960.1 ΥΡ, ,002875335.1 ΥΡ_002897523.1
ΥΡ_ _002912290.1 ΥΡ_ _002974935.1 ΥΡ, ,003060891 .1 ΥΡ, ,003264235.1 ΥΡ_003552364.1
ΥΡ_ _003578319.1 ΥΡ_ ,003591946.1 ΥΡ, ,003607814.1 ΥΡ, ,003641922.1 ΥΡ_003674025.1
ΥΡ_ _003692877.1 ΥΡ_ ,0037551 12.1 ΥΡ, ,003896973.1 ΥΡ, ,003907026.1 ΥΡ_003912421.1
ΥΡ_ _004086766.1 ΥΡ_ ,004142571 .1 ΥΡ, 004147141 .1 ΥΡ, ,004228105.1 ΥΡ_004278247.1
ΥΡ_ _004305252.1 ΥΡ_ ,004356916.1 ΥΡ, ,004361407.1 ΥΡ, ,004378186.1 ΥΡ_004379856.1
ΥΡ_ _004390782.1 ΥΡ_ ,004472442.1 ΥΡ, ,004590892.1 ΥΡ, ,004612414.1 ΥΡ_004676537.1
ΥΡ_ _004693233.1 ΥΡ_ ,004701580.1 ΥΡ, ,004701637.1 ΥΡ, 004704442.1 ΥΡ_108931 .1
ΥΡ_1 10490.1 , ΥΡ_168667.1 , ΥΡ_237931 .1 , ΥΡ_260624.1 , ΥΡ_262985.1 ΥΡ_271307.1 ΥΡ_276987.1 , ΥΡ_334171.1 , ΥΡ_337172.1 , ΥΡ_350660.1 , ΥΡ_351 134.1 ΥΡ_364386.1 ΥΡ_366340.1 , ΥΡ_369710.1 , ΥΡ_370582.1 , ΥΡ_426342.1 , ΥΡ_440141 .1 ΥΡ_442361.1 ΥΡ_468848.1 , ΥΡ_521636.1 , ΥΡ_554363.1 , ΥΡ_608454.1 , ΥΡ_610700.1 ΥΡ_614980.1 ΥΡ_622254.1 , ΥΡ_625753.1 , ΥΡ_680590.1 , ΥΡ_751687.1 , ΥΡ_767071.1 ΥΡ_774090.1 ΥΡ_774932.1 , ΥΡ_788372.1 , ΥΡ_858562.1 , ΥΡ_928515.1 , ΥΡ_983084.1 ΥΡ_995622.1 ΖΡ 00948889.1 , ΖΡ 00954344.1 , ΖΡ 00959736.1 , ΖΡ 00998881.1 ΖΡ_0101 1725.1
ΖΡ_01037109.1 ΖΡ_01058030.1 ΖΡ_01076707.1 ΖΡ_01 103959.1 ΖΡ_01 167926.1 ΖΡ_01224713.1 ΖΡ_01442907.1 ΖΡ_01446892.1 ΖΡ_01550953.1 ΖΡ_01625518.1 ΖΡ_01745731.1 ΖΡ_01750280.1 ΖΡ_01754305.1 ΖΡ_01763880.1 ΖΡ_01769626.1 ΖΡ_01865961.1 ΖΡ_01881393.1 ΖΡ_01901558.1 ΖΡ_02145337.1 ΖΡ_02151268.1 ΖΡ_02152332.1 ΖΡ_02167267.1 ΖΡ_02190082.1 ΖΡ_02242934.1 ΖΡ_02360937.1 ΖΡ_02367056.1 ΖΡ_02385477.1 ΖΡ_02456487.1 ΖΡ_02883670.1 ΖΡ_03263915.1 ΖΡ_03263990.1 ΖΡ_03400081 .1 ΖΡ_03452573.1 ΖΡ_03456092.1 ΖΡ_03517291 .1 ΖΡ_03529055.1 ΖΡ_03571515.1 ΖΡ_03572809.1 ΖΡ_03587785.1 ΖΡ_03588560.1 ΖΡ_03697266.1 ΖΡ_03697962.1 ΖΡ_04521092.1 ΖΡ_04590693.1 ΖΡ_04890914.1 ΖΡ_04891982.1 ΖΡ_04893793.1 ΖΡ_04902131 .1 ΖΡ_04905327.1 ΖΡ_04941068.1 ΖΡ 04944536.1 ΖΡ 04945255.1 ΖΡ 04959332.1 ΖΡ 04964181.1 ΖΡ 05053721 .1 ZP_05063588.1, ZP_05073059.1, ZP_05077806.1, ZP_05082750.1, ZP_05091128.1, ZP_05095488.1, ZP_05101701.1 , ZP_05116783.1 , ZP_05121836.1, ZP_05127756.1 , ZP_05637806.1, ZP_05742087.1, ZP_05783548.1, ZP_05786246.1, ZP_05843149.1, ZP_05945960.1, ZP_06459045.1, ZP_06487195.1, ZP_06492453.1, ZP_06493162.1, ZP_06703644.1, ZP_06731146.1 , ZP_06839371.1 , ZP_07007312.1 , ZP_07266194.1, ZP_07374050.1, ZP_07662787.1, ZP_07778196.1, ZP_07797983.1, ZP_08099459.1, ZP_08138203.1, ZP_08141719.1, ZP_08142973.1 , ZP_08177102.1 , ZP_08185821.1, ZP_08186468.1, ZP_08208888.1 , ZP_08266590.1 , ZP_08402041.1 , ZP_08406891.1 , ZP_08522175.1, ZP_08527488.1 , ZP_08631252.1 , ZP_08636687.1 , SEQ ID NR: 08, SEQ ID NR: 09
insbesondere NP_901695.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 12), ZP_03697266.1, AAD41041.1, YP_002796201.1, ZP_03697962.1, YP_001859758.1, YP_002229759.1, YP_001120907.1, YP_110490.1 , ZP_04964181.1 , YP_774932.1 , YP_001766294.1 , YP_001581170.1 ,
YP_622254.1, ZP_03588560.1, YP_001809596.1, YP_370582.1, ZP_03572809.1,
NP_248990.1, YP_001888405.1 , ZP_04905327.1 , YP_001061726.1, YP_001668026.1, ZP_01750280.1, ZP_07778196.1, EGH71404.1, NP_744329.1 , YP_004147141.1 ,
ADR61066.1, ZP_05783548.1, YP_004701637.1, YP_366340.1, YP_003264235.1,
EGD03176.1, YP_001268866.1 , ZP_01901558.1 , ZP_05121836.1 , YP_003692877.1 ,
ZP_03517291.1, YP_002974935.1 , YP_001668026.1, ADR61066.1, NP_744329.1,
YP_001268866.1, YP_004701637.1, ZP_08142973.1, ADR62525.1, YP_610700.1,
NP_747283.1, ADR62525.1, YP_001270391.1 , YP_004704442.1 , YP_610700.1,
YP_001747156.1, ZP_08138203.1 , ZP_07266194.1, EGH70821.1 , YP_351134.1 ,
EGH32343.1 , EGH08331.1 , EGH67339.1 , YP_001668026.1 , YP_004701637.1 , YP_237931.1 , ZP_03400081.1 , ZP_05116783.1 , ZP_01550953.1 , ZP_07662787.1 , YP_928515.1 ,
YP_788372.1, YP_001021095.1, ZP_07797983.1, YP_003578319.1, YP_004305252.1, NP_248912.1 , ZP_08636687.1 , YP_003912421.1 , YP_751687.1 , ZP_08142973.1 ,
YP_271307.1,ZP_05082750.1, YP_001417624.1, YP_353455.1, SEQ ID NR: 08, SEQ ID NR: 09
und besonders bevorzugt NP_901695.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 12), YP_353455.1, SEQ ID NR: 08 und SEQ ID NR: 09
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der
Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms E2 generell insbesondere die Umsetzung von ω-Oxo-Laurinsäure und/oder co-Oxo- Laurinsäuremethylester zu ω -Amino-Laurinsäure und/oder ω -Amino-Laurinsäuremethylester verstanden wird.
Ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus mit einer im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E2 weist vorteilhaft eine im Vergleich zu seinem Wildtyp verminderte Aktivität einer Aldehyddehydrogenase der EC 1 .2.1.3, EC 1 .2.1.4 oder EC 1.2.1.5 auf, die die folgende Reaktion katalysiert:
co-Oxo-Alkansäure(ester) + NAD(P)+ = co-Carboxy-Alkansäure(ester) + NAD(P)H + H+
Solche Aldehyddehydrogenasen sind insbesondere solche, die unten als konkrete E5 gelistet sind, sowie solche, die unten als bevorzugte E4 Fettalkoholoxidasen der EC 1 .1 .3.20, AlkJ Alkoholdehydrogenasen der EC 1 .1 .99.- und Alkoholdehydrogenasen der EC 1 .1 .1 .1 oder EC 1 .1 .1 .2 gelistet sind und mindestens die zweite der beiden dort genannten Reaktionen katalysieren; solche Enzyme werden im Folgenden auch als Enzyme E4» bezeichnet.
Dies hat den technischen Effekt, dass der Abfluss der zu aminierenden co-Oxo-Carbonsäure oder des zu aminierenden ω-Oxo-Carbonsäure-Esters verhindert wird und somit mehr Substrat für die Produktbildung der ω -Amino-Carbonsäuren oder ω-Amino-Carbonsäure-Ester zur Verfügung steht.
Unter der Formulierung„im Vergleich zu seinem Wildtyp verminderte Aktivität" wird
vorzugsweise eine um mindestens 50 % verminderte, besonders bevorzugt um mindestens 90 %, darüber hinaus bevorzugt um mindestens 99.9 %, darüber hinaus noch mehr bevorzugt um mindestens 99,99 % und am meisten bevorzugt um mindestens 99,999 % verminderte Aktivität bezogen auf die Wildtyp-Aktivität verstanden. Die Formulierung„verminderte Aktivität" beinhaltet auch keine detektierbare Aktivität („Aktivität von null"). Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms erfolgen. Weitere Verfahren zur Verminderung von enzymatischen Aktivitäten in
Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere molekularbiologische Techniken bieten sich hier an. Anleitung zur Modifikation und Verminderung von Proteinexpressionen und damit einhergehender Enzymaktivitätsverringerung speziell für Candida, insbesondere zum Unterbrechen spezieller Gene findet der Fachmann in der WO91/006660 und WO03/100013. Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind dadurch gekennzeichnet, dass die
Verminderung der enzymatischen Aktivität erreicht wird durch Modifikation eines Genes umfassend eine Nukleinsäuresequenzen kodierend für die vorgenannten Enzyme, wobei die Modifikation ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus, Insertion von Fremd-DNA in das Gen, Deletion mindestens von Teilen des Gens, Punktmutationen in der Gensequenz, RNA-Interferenz (siRNA), antisense-RNA oder Modifikation (Insertion, Deletion oder Punktmutationen) von regulatorischen Sequenzen, welche das Gen flankieren. Unter Fremd-DNA ist in diesem Zusammenhang jegliche DNA-Sequenz zu verstehen, die dem Gen (und nicht dem Organismus)„fremd" ist. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass das Gen durch Insertion eines Selektionsmarkergens unterbrochen wird, somit die Fremd-DNA ein Selektionsmarkergen ist, wobei bevorzugt die Insertion durch homologe Rekombination in den Genlocus erfolgte. In diesem Zusammenhang kann es vorteilhaft sein, wenn das Selektionsmarkergen durch weitere Funktionalitäten erweitert wird, die wiederum eine anschließende Entfernung aus dem Gen ermöglichen. Dies kann beispielsweise durch dem Organismus fremde Rekombinationssysteme, wie etwa ein Cre/loxP-System oder FRT
(Flippase Recognition 7argei)-System oder das dem Organismus eigene homologe
Rekombinationssystem erreicht werden.
Die Verminderung der Aktivität des erfindungsgemäßen Mikroorganismus im Vergleich zu seinem Wildtyp wird bestimmt nach oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Aktivität unter Einsatz von möglichst gleichen Zellzahlen/-konzentrationen, wobei die Zellen unter gleichen Bedingungen wie beispielsweise Medium, Begasung, Agitation angezogen wurden.
Enzym E3 Cofaktor-Recycling co-Aminierung
Es kann für die Herstellung einer co-amino-funktionalisierten Carbonsäure oder eines co-amino- funktionalisierten Carbonsäure-Esters vorteilhaft sein, wenn die zweite gentechnische
Modifikation eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E3umfasst, welches die Umsetzung einer α-Keto-Carbonsäure zu einer Aminosäure katalysiert, Bevorzugt ist das Enzym E3 eine Aminosäuredehydrogenase, wie beispielsweise Serin-Dehydrogenasen, Aspartat- Dehydrogenasen, Phenylalanin-Dehydrogenasen und Glutamat-Dehydrogenasen, besonders bevorzugt eine Alanindehydrogenase der EC 1.4.1.1.
Solche bevorzugten Alanindehydrogenasen sind ausgewählt aus
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ΖΡ_08328557.1, CBL87253.1, CBL87167.1, ΥΡ_004316768.1, EFS92548.1 , ΥΡ_001016505.1 , EGG67688.1, ΥΡ_003528837.1, ΥΡ_002434942.1, ΥΡ_117835.1, ΥΡ_004150583.1,
ΥΡ_003755105.1, ΥΡ_002526442.1, ΥΡ_003120958.1, EGE94241.1 , ΥΡ_004345416.1 , EFS79952.1, ΖΡ_06964253.1, EGE60050.1, CBZ52359.1 , ADU40304.1 , ADQ77229.1 , ΥΡ_003196038.1, ΥΡ_144713.1, ΥΡ_001304143.1 , YPJ13082.1, AD076516.1,
ΥΡ_003326349.1, ΥΡ_003289755.1, ΥΡ_003089327.1, ΖΡ_07911965.1, ΖΡ_05773583.1, ΖΡ_05765271.1, ΥΡ_003154888.1, ΥΡ_003142045.1 , ΥΡ_002280953.1 , ΝΡ_371963.1, ΝΡ_422368.1, EGC98966.1, EGC76398.1 , ΥΡ_004263661.1 , ΥΡ_004252039.1 , ΥΡ_679036.1 , ΥΡ_499973.1, ΖΡ_08090745.1 , ΖΡ_08108339.1 , ΥΡ_001531594.1 , ΖΡ_01051588.1 ,
ΝΡ_646145.1, ΝΡ_224146.1 , ΖΡ_08054972.1 , ΖΡ_08053009.1 , ΥΡ_003584878.1 ,
ΖΡ_07939405.1, ΖΡ_03439290.1 , ADU82392.1, ADU83943.1, ADU85424.1, ADU80668.1, ΥΡ_001225733.1, ΥΡ_003863039.1 , ΖΡ_01061682.1 , ΥΡ_767568.1, ΖΡ_07865749.1 ,
ΖΡ. ,06858058 1 ΥΡ. ,628213.1, EFT81350.1, EFT66610.1, EFT51424.1 , ΖΡ_04839161.1 ,
ΖΡ. ,05633406 1 ΖΡ, ,05288381 1 AAR37813.1, EFS03282.1, EFS03278.1 , ΥΡ_004046539.
ΖΡ. ,07749550 1 ΖΡ, ,07729731 1 ADN80650.1, ΖΡ_07088856.1, ΖΡ_07080219.1,
ΖΡ. ,06949721 1 ΖΡ, ,05685436 1 ΥΡ_002550450.1, ΥΡ_803715.1, ΖΡ_07720023.1,
ΖΡ. ,07469700 1 ΖΡ, ,07365619 1 ΖΡ_06924335.1, ΖΡ_06715776.1, ΖΡ_06303722.1,
ΖΡ. ,06303721 1 ΖΡ. ,06264319 1 ΖΡ_06155528.1, ΖΡ_05745707.1, ΖΡ_04866244.1,
ΖΡ. ,04199629 1 ΖΡ, ,04195783 1 ΖΡ_04067276.1, ΖΡ_03968868.1, ΖΡ_03963857.1,
ΖΡ. ,03933079 1 ΖΡ, ,03497046 1 ΖΡ_03475134.1, ΖΡ_01890152.1 , ΖΡ_01086712.1 ,
ΖΡ. ,06021845 1 ΖΡ, ,02183427 1 ΖΡ_02162695.1, ΖΡ_02032824.1, ΖΡ_01993906.1,
ΖΡ. ,01993127 1 ΖΡ, ,01983694 1 ΖΡ_01972527.1, ΖΡ_01819838.1 , ΖΡ_01817962.1,
ΖΡ. ,01740947 1 ΖΡ, ,01734991 1 ΖΡ_01694775.1, ΖΡ_01678972.1 , ΖΡ_01468566.1 ,
ΖΡ. ,01408749 1 ΖΡ, ,01386800 1 ΖΡ_01202184.1, ΖΡ_01174108.1 , ΖΡ_01174047.1 ,
ΖΡ. ,01118729 1 ΖΡ. ,01081268 1 ΖΡ_00998573.1, ΖΡ_00739793.1, ΥΡ_002302140.1,
ΖΡ. ,07358151 1 ΖΡ, ,06668925 1 ΖΡ_06668924.1, ΖΡ_06667106.1, ΖΡ_06324464.1,
ΖΡ. ,06196777 1 ΖΡ, ,05114159 1 ΖΡ_05083968.1, ΖΡ_05070370.1, ΖΡ_05030022.1,
ΖΡ 04673064 1 ΖΡ 04581752 1 ΖΡ 01052079.1, ΖΡ 07661104.1 , ΖΡ 06077819.1, YP_002835579.1, YP_002267069.1 , ΥΡ_002129114.1 , ΥΡ_001929236.1 , ΥΡ_001910999.1 , ΥΡ_001854051.1, ΥΡ_001094152.1 , ΥΡ_001044252.1 , ΥΡ_861818.1, ΥΡ_915522.1,
ΥΡ_807371.1 , ΥΡ_353800.1 , ΥΡ_342402.1 , ΥΡ_065168.1 , ΥΡ_015797.1 , ΥΡ_005051.1 , ΝΡ_856449.1, ΝΡ_661547.1, ΝΡ_358448.1 , ΥΡ_003929442.1 , ΥΡ_003927769.1 ,
ADO06185.1 , ADO04689.1 , ADL23243.1 , ΥΡ_003789202.1 , ADJ79786.1 , ΥΡ_003516488.1 , ADI97953.1 , ADI35485.1 , ΥΡ_003716800.1 , ΖΡ_00241359.1 , ΥΡ_003718040.1 , CAQ49862.1 , ΥΡ_003282331.1 , ΑΑΡ97897.1 , ACX99978.1 , ACX98578.1 , ΥΡ_003472544.1 ,
ΖΡ_06382734.1, ΕΕΖ79852.1 , ΖΡ_05299989.1 , ΖΡ_05299895.1 , ΧΡ_002367632.1 ,
ΖΡ_03529835.1, ΖΡ_03517011.1 , ΖΡ_03505783.1 , ΧΡ_001310698.1 , ΑΒΚ27691.1,
CAB59281.2,
insbesondere ΝΡ_391071.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 11), BAI86717.1, YP_004205024.1, ZP_06873224.1, YP_003974610.1, YP_001422460.1 , AEB25326.1, YP_003921585.1 , YP_080482.1, ZP_03054334.1, YP_001488077.1, YP_081348.1, YP_003426902.1,
NP_243195.1, ZP_08004522.1, YP_003565624.1, YP_004095847.1, YP_003600348.1, ZP_08006697.1, ZP_04248389.1, YP_174267.1, YP_001376512.1, ZP_04226233.1,
ZP_04100460.1, YP_002369417.1 , ZP_03229411.1 , ZP_04110635.1 , ZP_04287684.1 , ZP_04172877.1, ZP_04158983.1 , ZP_04219330.1 , NP_830409.1 , YP_003790454.1 ,
ZP_04184510.1, YP_001642542.1, ZP_04074263.1 , ZP_04319784.1 , NP_847074.1,
YP_001373857.1, ZP_04122524.1 , ZP_03230841.1, YP_082111.1, N P_834329.1 ,
YP_002444060.1, ZP_04170954.1 , YP_002453687.1 , ZP_04153266.1 , ZP_04302850.1 , YP_002365390.1, ZP_04216141.1 , ZP_04298961.1 , ZP_00740055.1 , ZP_04277177.1 , ZP_04104350.1, ZP_04176651.1 , YP_001647239.1 , ZP_04188247.1 , ZP_04149717.1, YP_003794343.1, ZP_04230016.1 , YP_001643400.1 , ZP_04209092.1 , ZP_04235899.1 , YP_003428808.1, ZP_08005962.1, YP_003599946.1, YP_003565223.1, ZP_01859623.1, YP_004569425.1, ZP_04432601.1 , ZP_03227314.1 , YP_003699559.1 , ZP_07709417.1, ZP_01723571.1, NP_244046.1, ZP_08006365.1 , ZP_00738801.1 , ZP_04160852.1,
ZP_04166021.1, ZP_04154769.1 , ZP_04109769.1 , ZP_04109049.1, ZP_04108444.1 , ZP_04075249.1, ZP_00741173.1, ZP_00739793.1 , ZP_01174108.1 , ZP_01174047.1, ZP_00241359.1, ZP_04195783.1 , ZP_04199629.1 , ZP_04067276.1
und besonders bevorzugt NP_391071.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 11)
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der
Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms E3 generell insbesondere die Umsetzung von Pyruvat zu Alanin verstanden wird.
Enzym E4 co-Oxidation
Es kann für die Herstellung einer ω-amino-funktionalisierten Carbonsäure oder eines co-amino- funktionalisierten Carbonsäure-Esters vorteilhaft sein, wenn die zweite gentechnische
Modifikation eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E4 umfasst, welches die Umsetzung von co- Hydroxy-Carbonsäuren oder ω-Hydroxy-Carbonsäure-Estern zu den entsprechenden co-Oxo- Carbonsäuren oder co-Oxo-Carbonsäure-Estern katalysiert. Ebenso vorteilhaft kann diese gesteigerte Aktivität des Enzyms E4 sein, wenn die Darstellung von ω-Oxo-Carbonsäuren, co- Oxo-Carbonsäure-Estern, ω-Carboxy-Carbonsäure oder co-Carboxy-Carbonsäure-Estern gewünscht ist.
Sollten die erfindungsgemäßen Mikroorganismen in einem Verfahren zur Herstellung von co- Oxo-Carbonsäuren oder ω-Oxo-Carbonsäure-Estern bzw. von sich von ω-Οχο-Carbon säuren oder co-Oxo-Carbonsäure-Estern ableitenden ω-funktionalisierten Verbindungen wie
beispielsweise ω-Amino-Verbindungen verwendet werden, so ist es vorteilhaft, wenn der Mikroorganismus, wie oben bereits für E2 beschrieben, eine im Vergleich zu seinem Wildtyp verminderte Aktivität einer Aldehyddehydrogenase der EC 1 .2.1.3, EC 1 .2.1.4 oder EC 1.2.1 .5 aufweist. In diesem Zusammenhang sind bevorzugte Enzyme E4 solche, die nur die jeweils im folgenden Abschnitt erstgenannte der zwei genannten Reaktion katalysieren. Bestimmte Enzyme E4 Bevorzugt ist das Enzym E4
eine Fettalkoholoxidase der EC 1.1.3.20, welche bevorzugt mindestens eine der folgenden Reaktionen, insbesondere die erstgenannte, katalysiert:
co-Hydroxy-Alkansäure(ester) + 02 = co-Oxo-Alkansäure(ester) + H202 und
co-Oxo-Alkansäure(ester) + 02 = co-Carboxy-Alkansäure(ester) + H202 oder
eine AlkJ Alkoholdehydrogenase der EC 1.1.99.-, welche bevorzugt mindestens eine der folgenden Reaktionen, insbesondere die erstgenannte, katalysiert:
co-Hydroxy-Alkansäure(ester) + oxidierter Akzeptor = co-Oxo-Alkansäure(ester) + reduzierter Akzeptor und
co-Oxo-Alkansäure(ester) + oxidierter Akzeptor = co-Carboxy-Alkansäure(ester) + reduzierter Akzeptor oder
eine Alkoholdehydrogenase der EC 1.1.1.1 oder EC 1 .1.1.2, welche bevorzugt mindestens eine der folgenden Reaktionen, insbesondere die erstgenannte, katalysiert:
co-Hydroxy-Alkansäure(ester) + NAD(P)+ = ro-Oxo-Alkansäure(ester) + NAD(P)H + H+ und ω- Oxo-Alkansäure(ester) + NAD(P)+ = co-Carboxy-Alkansäure(ester) + NAD(P)H + H+.
Solche bevorzugten Fettalkoholoxidasen sind ausgewählt aus
AAS46878.1 , ACX81419.1 , AAS46879.1 , CAB75353.1 , AAS46880.1 , XP_712350.1 ,
XP_002422236.1 , XP_712386.1 , EEQ43775.1 , XP_001525361 .1 , XP_001386087.1 ,
XP_459506.2, CAB75351 .1 , CAB75352.1 , XP_001385255.2, EDK39369.2, XP_001484086.1 , XP_002618046.1 , XP_002548766.1 , XP_002548765.1 , XP_003041566.1 , XP_003328562.1 , XP_001214264.1 , XP_001904377.1 , XP_658227.1 , XP_001591990.1 , XP_753079.1 ,
XP_002569337.1 , XP_001268562.1 , XP_00334891 1.1 , EGP90120.1 , XP_001389382.1 , EER37923.1 , XP_001264046.1 , EG058212.1 , XP_001554225.1 , XP_003298648.1 ,
XP_959005.1 , XP_002841296.1 , XP_001940486.1 , EGR52262.1 , EEQ89581.1 , EGD99881 .1 , EFQ33355.1 , XP_001821 106.1 , XP_002622231 .1 , EGG03784.1 , EGC44059.1 ,
XP_003018036.1 , XP_00301 1696.1 , EFY90752.1 , XP_001227812.1 , XP_758170.1 ,
XP_001243546.1 , XP_002479333.1 , XP_003344707.1 , EFW14100.1 , XP_003071927.1 , XP_003171263.1, XP_003051757.1, XP_002147053.1 , EEH19591.1, EEH50473.1,
XP_001792978.1, XP_387094.1, EFY98644.1 , XP_002788971.1 , XP_002842592.1 ,
EFX04185.1, XP_003231449.1, XP_001729067.1, CBX94189.1 , XP_001413535.1 ,
ACF22878.1, B5WWZ9.1 , XP_002994642.1 , XP_002269629.1 , XP_002519938.1 ,
XP_002982582.1, NP_001047464.1, EEC73620.1 , XP_002981110.1 , XP_002960521.1 , NP_566729.1, XP_001541970.1 , XP_002967201.1 , BAK00483.1 , XP_002182547.1 ,
BAK02336.1, XP_002454190.1, XP_002328753.1, XP_002867943.1, XP_002285334.1, CAC87643.1, CAN71289.1, XP_002454188.1, AAL31049.1, XP_002464494.1, AAL31021.1, YP_117187.1, XP_002543430.1, CAA18625.1, XP_002883430.1, NP_193673.2,
XP_002529832.1, XP_001753124.1, NP_001142399.1 , ACN27562.1 , XP_002464495.1 , ACR36691.1, BAJ86655.1, B5WWZ8.1, NP_001148058.1 , ABR17814.1 , EAY78905.1,
NPJ94586.1, AAM63097.1, AAK64154.1, NP_001064839.2, XP_002869492.1 ,
XP_002314488.1, AAL31024.1, ZP_06967355.1 , AAP54248.2, XP_002311685.1, ACF87929.1, YP_907078.1, EGE07035.1, YP_001849908.1 , XP_002464496.1 , EEC67160.1 , AAL31027.1 , XP_001761391.1, XP_002961172.1, XP_002528823.1 , XP_002966834.1 , NP_001176205.1, XP_001763007.1, XP_002272123.1, XP_002889487.1, XP_003003157.1, NP_285451.1, EGG23219.1, NP_171895.2, YP_003395677.1, Q9ZWB9.1, ACF88407.1, ZP_06413771.1, EEE51131.1 , YP_003835264.1 , YP_003397164.1 , YP_004081922.1 , XP_003294587.1 , EEE51130.1 , YP_003647529.1 , YP_003647985.1 , CBI29206.3, XP_629786.1 ,
ZP_07964664.1, EEE57396.1, EEH09589.1 , YP_003265796.1 , YP_001840752.1 ,
ZP_08620775.1, ACR36076.1, ZP_05043749.1, YP_980677.1, ZP_05043728.1, YP_692894.1, NP_710223.1, EEC67159.1 , AAP03110.1 , EFA85697.1, YP_691805.1, YP_551012.1,
YP_001174466.1 , YP_002796294.1 , YP_004716331.1 , YP_001019547.1 , YP_585737.1 , AEA86007.1, YP_960830.1, YP_004743970.1, ZP_03431349.1, ZP_06448642.1,
ZP_07430351.1, NP_215006.2, ZP_03535393.1 , ZP_06801690.1, YP_001849132.1,
NP_854165.1, ZP_03427234.1, CBJ27378.1, NP_334920.1, ZP_08571383.1, YP_728161.1, ZP_01896040.1, ZP_03530923.1 , YP_551306.1, YP_003167456.1 , YP_606070.1,
ZP_06850167.1, ADP99095.1, YP_907986.1, ZP_04924166.1 , ZP_08139923.1 ,
YP_001270300.1, YP_521830.1, YP_003147410.1, YP_002007173.1, ADR62464.1,
YP_004382294.1, NP_747223.1 , YP_004687462.1 , NP_902159.1 , ZP_04936784.1 ,
YP_003914667.1, ZP_01306356.1, ZP_04750553.1, YP_002875279.1, YP_004704374.1, YP_001671392.1 , N P_249055.1 , ZP_06876360.1 , YP_001345853.1 , YP_002437969.1 , YP_004356853.1, YP_351075.1, CBI23676.3, ΥΡ_001189668.1 , ΥΡ_001528881.1 , ΥΡ_001613612.1, ΥΡ_001747218.1, ΥΡ_003393002.1 , ΥΡ_001365074.1 , ΖΡ_07778129.1 , ΖΡ_07392715.1 , ΥΡ_001553329.1 , ΥΡ_262925.1 , ΥΡ_751961.1 , ΥΡ_564183.1 ,
ΥΡ_003811876.1, ΥΡ_002356821.1 , ΥΡ_001051828.1 , ΥΡ_001837525.1 , ΝΡ_716513.1, ΖΡ_01915079.1 , ΖΡ_02156621.1 , ΥΡ_001184631.1 , ΥΡ_001475595.1 , ΖΡ_05042393.1 , ΥΡ_962228.1, ΥΡ_001612275.1 , ADV55625.1, ΥΡ_001675797.1 , ΥΡ_003555260.1 ,
ΖΡ_01075039.1, ΥΡ_003812822.1 , ΥΡ_001503351.1 , EFN52938.1, ΥΡ_001759063.1,
ΖΡ_06503577.1 , ΥΡ_871025.1 , ΖΡ_08564919.1 , ΥΡ_002310162.1 , ΥΡ_732875.1 ,
ΥΡ_001092722.1, ΥΡ_739324.1, ΧΡ_002333995.1 , ΝΡ_085596.1 , ΥΡ_928870.1 ,
EGD05748.1, ΝΡ_443993.1 , ΖΡ_08138057.1 , ΖΡ_05041587.1 , ΖΡ_07011380.1 ,
ΥΡ_001612684.1 , ΖΡ_07669342.1 , ΖΡ_06508361.1 , ΖΡ_03423639.1 , ΥΡ_923293.1 ,
ΖΡ_05061865.1, ΖΡ_08181496.1 , ΥΡ_559605.1, ΖΡ_06841320.1 , ΖΡ_01620712.1 ,
ΥΡ_001896340.1, ΖΡ_03276650.1 , ΥΡ_004303194.1 , ΖΡ_08180715.1 , ΖΡ_06382740.1 , ΖΡ_01034555.1 , ΥΡ_004604560.1 , ΥΡ_001020142.1 , ΥΡ_935375.1 , ΖΡ_01546137.1 ,
ΖΡ_07661079.1, ΥΡ_001860640.1, ΖΡ_06052841.1 , ΖΡ_01881170.1 , ΖΡ_05781455.1 , ΥΡ_932732.1, ΖΡ_08119300.1, ΥΡ_004715268.1, ΖΡ_03697402.1, ΥΡ_004126957.1,
ΖΡ_06703136.1, ΝΡ_642445.1, ΖΡ_08273900.1 , ΥΡ_004524313.1 , ΖΡ_01902993.1 ,
ΥΡ_001900094.1 , ΑΕΑ84888.1 , ΥΡ_004690289.1 , ΝΡ_714358.1 , ΥΡ_682471.1 , ΥΡ_003239.1 , ΥΡ_997465.1, ΥΡ_003452130.1 , ΖΡ_01739153.1 , ΥΡ_004219483.1 , ΥΡ_001761298.1 , ΖΡ_01438251.1, CBI37146.3, ΖΡ_04748383.1 , ΥΡ_004362245.1 , ΖΡ_05912795.1 ,
ΥΡ_003390234.1, ΥΡ_003122799.1 , CCB77579.1, EGB06416.1, ΖΡ_08389346.1,
ΥΡ_191496.1, ΖΡ_05224727.1, ΖΡ_01125614.1 , ΥΡ_466287.1, ΥΡ_001368620.1,
ΥΡ_001380256.1, ΥΡ_002361951.1 , ΥΡ_002756103.1 , ΥΡ_001801399.1, ΖΡ_06847140.1 , ΥΡ_003200069.1, ΥΡ_001940247.1, ΥΡ_001584322.1, ΖΡ_04679227.1, ΥΡ_002493674.1, ΥΡ_002135530.1, ΥΡ_004290424.1,ΥΡ_001772011.1, ΖΡ_08189046.1, ΖΡ_03423640.1, ΥΡ_001834251.1 , ΖΡ_01041752.1 , ΥΡ_001533410.1 , ΥΡ_269751.1 , ΥΡ_002432994.1 , ΥΡ_003694653.1, CAD47896.1, ΝΡ_769359.1 , ΥΡ_004239460.1 , ΥΡ_004605221.1 ,
ΥΡ_001961214.1, ΥΡ_001837513.1, ΥΡ_004335962.1, ΥΡ_004358600.1, ΖΡ_05050026.1, ΥΡ_003202983.1 , BAD03777.1 , ΖΡ_02165013.1 , ΝΡ_774131.1 , ΥΡ_432169.1 ,
ΖΡ_05000547.1, ΥΡ_001261233.1, ΧΡ_002593969.1, ΧΡ_002603265.1, ΥΡ_003342435.1, ΖΡ_01253183.1, EG036831.1 , ΥΡ_001866737.1 , ΥΡ_001523879.1 , ΥΡ_133594.1 ,
ΥΡ_003768990.1 , ΥΡ_001237820.1 , ΥΡ_003133224.1 , ΖΡ_01896771.1 , ΖΡ_01865125.1 , NP_960319.1 , YP_826958.1 , YP_003326608.1 , YP_002219515.1 , NP_217926.1 , ZP_07441899.2, YP_001208178.1, ADM42038.1 , YP_002433510.1 , ZP_08274313.1 ,
EG038668.1, ZP_03393221.1 , NP_356358.1 , ZP_06055780.1 , YP_001684562.1 ,
ZP_08528157.1, BAD03162.1, YP_001800712.1 , ACL37106.1, YP_883489.1, ZP_01075202.1, NP_969446.1, ZP_01129577.1 , YP_001530285.1 , ZP_04746501.1 , YP_001341980.1,
YP_905003.1, ZP_05218299.1, ZP_08665577.1 ,
bevorzugt
AAS46878.1, ACX81419.1, AAS46879.1, CAB75353.1 , AAS46880.1 , XP_712350.1 ,
XP_002422236.1, XP_712386.1, EEQ43775.1 , XP_001525361.1 , XP_001386087.1 ,
XP_459506.2, CAB75351.1, CAB75352.1 , XP_001385255.2, EDK39369.2, XP_001484086.1 , XP_002618046.1, XP_002548766.1 , XP_002548765.1 , XP_003041566.1, XP_001214264.1 , XP_001904377.1, XP_658227.1, XP_001591990.1 , XP_753079.1, XP_002569337.1 ,
XP_001268562.1, XP_003348911.1, EGP90120.1, XP_001389382.1 , EER37923.1,
XP_001264046.1, EG058212.1, XP_001554225.1, XP_003298648.1, XP_959005.1,
XP_002841296.1, XP_001940486.1 , EGR52262.1, EEQ89581.1, EGD99881.1, EFQ33355.1, XP_001821106.1, XP_002622231.1 , EGC44059.1, XP_003018036.1 , XP_003011696.1, EFY90752.1, XP_001227812.1 , XP_001243546.1 , XP_002479333.1 , XP_003344707.1 , EFW14100.1, XP_003071927.1, XP_003171263.1 , XP_003051757.1 , XP_002147053.1 , EEH19591.1, EEH50473.1, XP_001792978.1, XP_387094.1, EFY98644.1 , XP_002788971.1 , XP_002842592.1, EFX04185.1 , XP_003231449.1 , CBX94189.1 , XP_001413535.1 ,
XP_001541970.1, XP_002543430.1, EGE07035.1 , XP_003003157.1
und besonders bevorzugt
AAS46878.1, ACX81419.1, AAS46879.1, CAB75353.1 , AAS46880.1 , XP_712350.1 ,
XP_002422236.1, XP_712386.1, EEQ43775.1 , CAB75351.1 , CAB75352.1 , XP_002548766.1 , XP_002548765.1,
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms E4 generell insbesondere die Umsetzung von ω-Oxo-Laurinsäure und/oder co-Oxo- Laurinsäuremethylester zu co-Carboxy-Laurinsäure und/oder co-Carboxy-Laurinsäuremethylester bzw. die Umsetzung von ω-Hydroxy-Laurinsäure und/oder co-Hydroxy-Laurinsäuremethylester zu co-Oxo-Laurinsäure und/oder co-Oxo-Laurinsäuremethylester verstanden wird.
Solche bevorzugten AlkJ Alkoholdehydrogenasen sind ausgewählt aus
Q00593.1 , Q9WWW2.1 , ZP_00957061.1 , YP_957894.1 , CAC38030.1 , YP_694430.1 ,
YP_957725.1 , YP_001672216.1 , YP_552061 .1 , YP_130410.1 , ZP_06155535.1 ,
ZP_01222730.1 , YP_691907.1 , YP_002297804.1 , YP_004283522.1 , YP_001234383.1 , YP_004435031.1 , ZP_051 10316.1 , ZP_05042898.1 , YP_004466324.1 , ZP_08553549.1 , YP_004125220.1 , ADI22536.1 , ADI 18461.1 , YP_003810975.1 , YP_662346.1 ,
YP_004427557.1 , YP_692606.1 , ZP_05043291.1 , YP_440752.1 , ZP_02386160.1 ,
ZP_04763547.1 , ZP_02361232.1 , YP_003376674.1 , ZP_02354055.1 , ZP_05085930.1 , ADQ00130.1 , YP_003643016.1 , ZP_05040520.1 , YP_691922.1 , AAX23098.1 , BAD07371.1 , NP_104379.1 , YP_002551960.1 , YP_003908558.1 , YP_987903.1 , ZP_05785860.1 ,
YP_004145612.1 , YP_004140926.1 , CAZ88300.1 , ZP_05041901 .1 , YP_533645.1 ,
ZP_01754259.1 , CBA31223.1 , YP_587542.1 , YP_106852.1 , ZP_08402506.1 , ZP_05055020.1 , ZP_02400829.1 , YP_104747.1 , ZP_02409412.1 , YP_001057269.1 , YP_004229837.1 ,
YP_294429.1 , YP_0010281 12.1 , ZP_02479747.1 , YP_002874799.1 , ZP_03541051 .1 ,
YP_003606536.1 , ZP_02887167.1 , YP_001795572.1 , YP_487451.1 , ACZ62814.1 ,
YP_560809.1 , ZP_02167462.1 , YP_004482869.1 , YP_001581248.1 , ZP_07374066.1 ,
YP_001203981.1 , ZP_06840259.1 , ZP_01915145.1 , NP_774525.1 , ZP_03561080.1 ,
YP_001208258.1 , YP_001897374.1 , YP_001413909.1 , YP_366469.1 , YP_521854.1 ,
YP_004490642.1 , YP_003280349.1 , ZP_03588744.1 , YP_001562229.1 , YP_001 120981 .1 , ZP_03574970.1 , YP_004234225.1 , ZP_02377531 .1 , ZP_02149954.1 , YP_001237360.1 , ZP_03266156.1 , YP_782821.1 , YP_004754039.1 , BAB61732.1 , ZP_07046388.1 ,
ZP_02145452.1 , BAF45123.1 , YP_002129953.1 , YP_003812439.1 , ZP_01055291 .1 , BAF45124.1, EGH71399.1, ZP_05060389.1 , ZP_05090872.1 , BAF45126.1, BAB07804.1, ZP_06053464.1, YP_001238278.1 , ZP_04944469.1 , YP_001171160.1, YP_002984373.1 , YP_002237649.1 , ZP_08276443.1 , BAF98451.1 , ZP_05124197.1 , YP_568640.1 ,
ZP_05785341.1 , NP_769037.1 , YP_370657.1 , YP_775005.1 , ZP_02911119.1 , YP_165460.1 , ZP_02891796.1, YP_622328.1, ZP_07675057.1, YP_001901188.1, YP_003592183.1, ZP_02361040.1, NP_518244.1, YP_001809673.1, NP_947032.1, YP_001766369.1,
YP_002255997.1, ZP_04940241.1 , YP_004012032.1, YP_841049.1, YP_002983249.1 , YP_003643276.1, YP_003855487.1 , YP_003778137.1 , ZP_02361104.1 , CBA30511.1, ZP_05781295.1, YP_756865.1, ZP_02461782.1 , YP_002007988.1 , YP_004110133.1, YP_002229680.1, ZP_02386040.1, YP_004684069.1, YP_373268.1, YP_440614.1,
NP_421441.1 , YP_264896.1 , YP_004362617.1 , ZP_06053847.1 , YP_366538.1 ,
YP_003812285.1, YP_004154520.1, ZP_01901081.1, ZP_02372179.1 , ZP_02453559.1 , ADP98564.1, YP_003747084.1 , ZP_02487888.1 , ZP_01768075.1 , ZP_02400664.1 ,
YP_106680.1, YP_724753.1, YP_002907583.1, YP_004482470.1, YP_167582.1,
YP_270109.1 , YP_004362333.1 , ZP_02504034.1 , YP_003189363.1 , YP_973212.1 ,
ZP_00952746.1, YP_459665.1, YP_777218.1, YP_581107.1, ZP_01878091.1 ,
ZP_01057973.1, YP_002913124.1, ZP_01035570.1 , YP_001777560.1 , YP_552627.1, ZP_02890876.1 , YP_587146.1, YP_004141814.1, YP_001685369.1 , ZP_05343380.1 , NP_886000.1, ZP_04942359.1, ZP_01913732.1, ZP_08244266.1, YP_002233254.1, ZP_01816670.1, YP_837233.1, ZP_07478008.1 , ZP_01985205.1 , ZP_07473972.1 ,
ZP_01067090.1, ZP_01867788.1, ZP_01754024.1 , EGM19144.1 , ZP_07741283.1 ,
ZP_06876839.1, YP_002395287.1, ZP_07795498.1, NP_102692.1, NP_252789.1,
YP_004451100.1, ZP_01305514.1 , YP_002438481.1 , ZP_04930310.1 , YP_001810189.1 , YP_104187.1, ZP_01367534.1, YP_001346382.1 , ZP_01878466.1 , YP_789017.1,
YP_001115422.1, ZP_05067451.1 , ZP_05842072.1 , YP_001682976.1 , YP_761348.1, YP_004611600.1, YP_004188241.1 , NP_419761.1, EFV85163.1 , YP_684227.1 ,
ZP_06177455.1, NP_935088.1, YP_004614491.1 , ZP_08697916.1, YP_004689366.1 , ZP_05052326.1, YP_267420.1, YP_728575.1, YP_001759584.1, YP_557446.1,
ZP_06844897.1 , ZP_06079799.1 , YP_003771143.1 , ZP_05094472.1 , YP_511622.1 ,
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ΝΡ_541848.1, ΖΡ_00960263.1 , ΖΡ_02961617.1 , ΥΡ_001242097.1 , ΖΡ_05838258.1 , insbesondere
Q00593.1, Q9WWW2.1, ΖΡ_00957061.1 , ΥΡ_957894.1, CAC38030.1, ΥΡ_694430.1, ΥΡ_957725.1 , ΥΡ_001672216.1 , ΥΡ_552061.1 , ΥΡ_130410.1 , ΖΡ_06155535.1 ,
ΖΡ_01222730.1, ΥΡ_691907.1, ΥΡ_002297804.1, ΥΡ_004283522.1, ΥΡ_001234383.1, ΥΡ_004435031.1 , ΖΡ_05110316.1 , ΖΡ_05042898.1 , ΥΡ_004466324.1 , ΖΡ_08553549.1 , ΥΡ_004125220.1, ADI22536.1, ADI18461.1, ΥΡ_003810975.1, ΥΡ_662346.1,
ΥΡ_004427557.1, ΥΡ_692606.1, ΖΡ_05043291.1 , ΥΡ_440752.1, ΖΡ_02386160.1,
ΖΡ_04763547.1, ΖΡ_02361232.1, ΥΡ_003376674.1, ΖΡ_02354055.1, ΖΡ_05085930.1, ADQ00130.1 , ΥΡ_003643016.1 , ΖΡ_05040520.1 , ΥΡ_691922.1 , ΑΑΧ23098.1 , BAD07371.1 , ΝΡ_104379.1, ΥΡ_002551960.1, ΥΡ_003908558.1, ΥΡ_987903.1, ΖΡ_05785860.1, ΥΡ_004145612.1, ΥΡ_004140926.1, CAZ88300.1,
und besonders bevorzugt
Q00593.1, Q9WWW2.1, ΖΡ_00957061.1 , ΥΡ_957894.1, CAC38030.1, ΥΡ_694430.1, ΥΡ_957725.1 , ΥΡ_001672216.1.
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang insbesondere die Umsetzung von ω-Oxo-Laurinsäure und/oder co-Oxo-Laurinsäuremethylester zu co-Carboxy-Laurinsäure und/oder co-Carboxy-
Laurinsäuremethylester bzw. die Umsetzung von co-Hydroxy-Laurinsäure und/oder co-Hydroxy- Laurinsäuremethylester zu co-Oxo-Laurinsäure und/oder co-Oxo-Laurinsäuremethylester verstanden wird. Solche bevorzugten Alkoholdehydrogenasen der EC 1.1.1 .1 oder EC 1 .1.1.2 sind ausgewählt aus AdhE, AdhP, YjgB, YqhD, GIdA, EutG, YiaY, AdhE, AdhP, YhhX, YahK, HdhA, HisD, SerA, Tdh, Ugd, Udg, Gmd, YefA, YbiC, YdfG, YeaU, TtuC, YeiQ, YgbJ, YgcU, YgcT, YgcV, YggP, YgjR, Ylil, YqiB, YzzH, LdhA, GapA, Epd, DId, GatD, Gcd, GlpA, GIpB, GIpC, GIpD, GpsA und YphC aus Bakterien, insbesondere E. coli
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang insbesondere die Umsetzung von ω-Oxo-Laurinsäure und/oder co-Oxo-Laurinsäuremethylester zu co-Carboxy-Laurinsäure und/oder co-Carboxy- Laurinsäuremethylester bzw. die Umsetzung von ω-Hydroxy-Laurinsäure und/oder co-Hydroxy- Laurinsäuremethylester zu ω-Oxo-Laurinsäure und/oder co-Oxo-Laurinsäuremethylester verstanden wird.
Die WO2010062480 A2 beschreibt insbesondere in den Ausführungsbeispielen 3, 4, 6 und 7 Mikroorganismen, die verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E4 und deren Sequenzen insbesondere in der Abbildung 10 sowie den Ausführungsbeispielen 2 bis 7.
Enzym E5 co-Oxidation 2
Es kann für die Herstellung einer co-carboxy-funktionalisierten Carbonsäure oder eines ω- carboxy-funktionalisierten Carbonsäure-Esters vorteilhaft sein, wenn die zweite gentechnische Modifikation eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E5 umfasst, welches die Umsetzung von ω- Oxo-Carbonsäuren oder ω-Oxo-Carbonsäure-Estern zu den entsprechenden co-Carboxy- Carbonsäuren oder co-Carboxy-Carbonsäure-Estern katalysiert.
Bestimmte Enzyme E5
Bevorzugt ist das Enzym E5 eine Aldehyddehydrogenase der EC 1.2.1 .3, EC 1.2.1 .4 oder EC 1 .2.1.5, welche bevorzugt die folgenden Reaktion katalysiert:
co-Oxo-Alkansäure(ester) + NAD(P)+ = co-Carboxy-Alkansäure(ester) + NAD(P)H + H+
Solche bevorzugten Aldehyddehydrogenasen sind ausgewählt aus Prr, Usg, MhpF, AstD, GdhA, FrmA, Feab, Asd, Sad, PuuE, GabT, YgaW, BetB, PutA, PuuC, FeaB, AldA, Prr, EutA, GabD, AldB, TynA und Ynel aus Bakterien, insbesondere E. coli
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms E5 generell insbesondere die Umsetzung von ω-Oxo-Laurinsäure und/oder co-Oxo- Laurinsäuremethylester zu co-Carboxy-Laurinsäure und/oder co-Carboxy-Laurinsäuremethylester verstanden wird.
alkL
Generell kann es für den erfindungsgemäßen Mikroorganismus von Vorteil sein, wenn er die aus der einfachen Kohlenstoffquelle gebildeten co-funktionalisierten Carbonsäuren und ω- funktionalisierten Carbonsäure-Ester schnell in das Medium sezernieren kann.
Dies erreicht der Organismus vorteilhaft dadurch, dass die zweite gentechnische Modifikation zusätzlich umfasst, dass der Mikroorganismus verglichen zu seinem Wildtyp mehr alkL- Genprodukt bildet.
Unter dem Begriff„alkL-Genprodukt" werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Proteine verstanden, die mindestens eine der nachfolgenden beiden Bedingungen erfüllen:
1. ) Das Protein wird als ein Mitglied der Superfamilie der OmpW-Proteine (Proteinfamilie 3922 in der„Conserved Domain Database" (CDD) des„National Center for Biotechnology
Information" (NCBI)) identifiziert, wobei diese Zuordnung durch ein Alignment der
Aminosäuresequenz des Proteins mit den in der CDD des NCBI vorhandenen
Datenbankeinträgen, die bis zum 22.03.2010 hinterlegt wurden, unter Nutzung der
Standardsuchparameter, einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 0,01 und unter Verwendung des Algorithmus„blastp 2.2.23+", erfolgt,
2. ) bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST wird die Präsenz der konservierten Domäne„OmpW, Outer membrane protein W" (COG3047) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10"5 festgestellt (englisch„domain hit").
Bevorzugte in den erfindungsgemäßen Mikroorganismen enthaltene alkL-Genprodukte sind dadurch gekennzeichnet, dass die Produktion des alkL-Genproduktes im nativen Wirt durch Dicyclopropylketon induziert wird; in diesem Zusammenhang ist weiterhin bevorzugt, dass die Expression des alkL-Gens als Teil einer Gruppe von Genen, beispielsweise in einem Regulon wie etwa einem Operon, stattfindet.
In den erfindungsgemäßen Mikroorganismen enthaltene alkL-Genprodukte werden bevorzugt kodiert von alkL-Genen aus Organismen ausgewählt aus der Gruppe der gram-negativen
Bakterien, insbesondere der Gruppe enthaltend, bevorzugt bestehend aus Pseudomonas sp., Azotobacter sp., Desulfitobacterium sp., Burkholderia sp., bevorzugt Burkholderia cepacia, Xanthomonas sp., Rhodobacter sp., Ralstonia sp., Delftia sp.und Rickettsia sp., Oceanicaulis sp., Caulobacter sp., Marinobacter sp. und Rhodopseudomonas sp., bevorzugt Pseudomonas putida, Oceanicaulis alexandrii, Marinobacter aquaeolei, insbesondere Pseudomonas putida GPo1 und P1 , Oceanicaulis alexandrii HTCC2633, Caulobacter sp. K31 und Marinobacter aquaeolei VT8.
In diesem Zusammenhang sind ganz besonders bevorzugte alkL-Genprodukte kodiert durch die alkL-Gene aus Pseudomonas putida GPo1 und P1 , welche wiedergegeben werden durch Seq ID Nr. 1 und Seq ID Nr. 3, sowie Proteine mit Polypeptidsequenz Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4,
Seq ID Nr. 5, Seq ID Nr. 6 oder Seq ID Nr. 7 oder mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 5, Seq ID Nr. 6 oder Seq ID Nr. 7 durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der jeweiligen Bezugssequenz Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 5, Seq ID Nr. 6 oder Seq ID Nr. 7 besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, und zwar in einem System, wie es in den Ausführungsbeispielen beschrieben wird, bei dem Glucose zu co-Amino- Laurinsäure in einer £. coli-ZeWe umgesetzt wird. Eine Methode der Wahl zur Bestimmung der Syntheserate ist den Ausführungsbeispielen zu entnehmen.
Für die Definition der Units gilt hier die in der Enzymkinetik übliche Definition: 1 Unit
Biokatalysator setzt 1 μηηοΙ Substrat in einer Minute zum Produkt um.
1 U = 1 μη-ιοΙ/η-ιίη.
Erste gentechnische Modifikation zur Carbonsäure- und Carbonsäure-Ester-Synthese Erfindungsgemäß weisen die Mikroorganismen eine erste gentechnische Modifikation auf, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen.
Es ist in diesem Zusammenhang erfindungsgemäß bevorzugt, dass es sich bei der ersten gentechnischen Modifikation um eine verglichen zu der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme handelt, ausgewählt aus der Gruppe
E, Acyl-ACP (Acyl Carrier Protein)-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1 .2.14 oder EC 3.1 .2.22, welche die Hydrolyse eines Acyl-Acyl Carrier Protein-Thioesters katalysiert,
EN Acyl-CoA (Coenzym A)-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1 .2.19, EC 3.1.2.20 oder EC 3.1 .2.22, welche die Hydrolyse eines Acyl-Coenzym A- Thioesters katalysiert,
Eüb Acyl-CoA (Coenzym A):ACP (Acyl Carrier Protein)-!" ransacylase, welche bevorzugt eine Reaktion katalysiert, in der ein CoA-Thioester in einen ACP-Thioester umgewandelt wird, Ei,, Polyketidsynthase, welche eine Reaktion katalysiert, die an der Synthese von
Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern mitwirkt, und
Eiv Hexansäuresynthase, eine spezialisierte Fettsäuresynthase des FAS-I-Typs, welche die Synthese von Hexansäure aus 2 Molekülen Malonyl-Coenzym A und einem Molekül Acetyl- Coenzym A katalysiert. Bestimmte Enzyme £,
Die durch E, katalysierte Reaktion unterscheidet sich von der durch ΕΝ katalysierten lediglich dadurch, dass anstelle eines Acyl-Acyl Carrier Protein-Thioesters ein Acyl-Coenzym A-
Thioester hydolysiert wird. Es ist offenbar, dass viele der genannten Enzyme E, sich aufgrund signifikanter Nebenaktivität ebenfalls als ΕΞΜ einsetzen lassen werden, wie auch umgekehrt.
In erfindungsgemäß bevorzugten Zellen stellt das Enzym E, eines dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
AAC72881.1, ABB71579.1, CAC19934.1, AAC49180.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 10),
AAC49783.1, AAC49179.1, CAB60830.1, ABB71581.1, AAC49269.1, CAC19933.1,
CAA54060.1 , AAC72882.1 , Q39513.1 , AAC49784.1 , AB038558.1 , AB038555.1 , AB038556.1 , AB038554.1 , ADB79568.1 , ADB79569.1 , ACQ57188.1 , ACQ57189.1 , ABK96561.1 ,
ACQ63293.1 , ACQ57190.1 , Q9SQI3.1 , ABU96744.1 , ABC47311.1, XP_002324962.1 ,
AAD01982.1, AAB51525.1, ACV40757.1, XP_002309244.1 , CBI28125.3, ABD91726.1, XP_002284850.1, XP_002309243.1, XP_002515564.1, ACR56792.1, ACR56793.1,
XP_002892461.1, ABI18986.1, NP_172327.1, CAA85387.1, CAA85388.1 , ADA79524.1 , ACR56795.1 , ACR56794.1 , CAN81819.1 , ACF17654.1 , AAB71729.1 , ABH11710.1 ,
ACQ57187.1, AAX51637.1, AAB88824.1, AAQ08202.1, AAB71731.1, AAX51636.1,
CAC80370.1 , CAC80371.1 , AAG43858.1 , ABD83939.1 , AAD42220.2, AAG43860.1 ,
AAG43861.1 , AAG43857.1 , AAL15645.1 , AAB71730.1 , NP_001068400.1 , EAY86877.1 , NP_001056776.1, XP_002436457.1, NP_001149963.1 , ACN27901.1 , EAY99617.1,
ABL85052.1, XP_002437226.1, NP_001151366.1, ACF88154.1, NP_001147887.1 ,
XP_002453522.1, BAJ99650.1, EAZ37535.1, EAZ01545.1 , AAN17328.1 , EAY86884.1, EEE57469.1 , Q41635.1 , AAM09524.1 , Q39473.1 , NP_001057985.1 , AAC49001.1 ,
XP_001752161.1, XP_001770108.1, XP_001784994.1 , XP_002318751.1 , NP_001047567.1, XP_002322277.1, XP_002299627.1, XP_002511148.1, CBI15695.3, XP_002299629.1 , XP_002280321.1, CAN60643.1 , XP_002459731.1 , XP_002975500.1 , XP_002962077.1 , XP_001773771.1, NP_001151014.1, XP_002317894.1 , XP_002971008.1 , XP_001774723.1 , XP_002280147.1, XP_002526311.1, XP_002517525.1, XP_001764527.1 , ABI20759.1 , BAD73184.1, XP_002987091.1 , XP_002985480.1 , CBI26947.3, ABI20760.1 , XP_002303055.1 , XP_002885681.1 , ADH03021.1 , XP_002532744.1 , EAY74210.1 , EEC84846.1 , EEE54649.1 , AAG35064.1 , AAC49002.1 , CAD32683.1 , ACF78226.1 , BAJ96402.1 , XP_002462626.1 , NP_001 130099.1 , XP_002462625.1 , ABX82799.3, Q42712.1 , NP_193041.1 , AAB51524.1 , NP_189147.1 , ABR18461 .1 , XP_002863277.1 , AAC72883.1 , AAA33019.1 , CBI40881.3, XP_002262721.1 , AAB51523.1 , NP_001063601.1 , ADB79567.1 , AAL77443.1 , AAL77445.1 , AAQ08223.1 , AAL79361.1 , CAA52070.1 , AAA33020.1 , CAA52069.1 , XP_001785304.1 , CAC39106.1 , XP_002992591.1 , XP_002968049.1 , XP_001770737.1 , XP_001752563.1 , AAG43859.1 , XP_00297891 1.1 , XP_002977790.1 , ACB29661.1 , XP_002314829.1 ,
XP_002991471.1 , EAZ45287.1 , XP_002986974.1 , EEC73687.1 , XP_002312421 .1 ,
ACJ84621.1 , NP_001 150707.1 , AAD28187.1 , XP_001759159.1 , XP_001757193.1 ,
XP_002322077.1 , ABE01 139.1 , XP_002447294.1 , AAX54515.1 , AAD33870.1 ,
insbesondere
AAC72881 .1 , ABB71579.1 , CAC19934.1 , AAC49180.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 10), AAC49783.1 , AAC49179.1 , CAB60830.1 , ABB71581 .1 , AAC49269.1 , CAC19933.1 ,
CAA54060.1 , AAC72882.1 , Q39513.1 , AAC49784.1 , AAC72883.1 , Q41635.1 , AAC49001 .1 , sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms E, generell insbesondere die Hydrolyse von Dodecanoyl-ACP-Thioester verstanden wird.
Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung erste gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit der zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
Die WO2010063031 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0007] bis [0008], [0092] bis [0100], [0135] bis [0136], [0181] bis [0186] und [0204] bis [0213] sowie den
Ausführungsbeispielen 4 bis 8 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0012] bis [0013], [0155], [0160] bis [0163], [0185] bis [0190] und [0197] bis [0199], Abbildung 12, den Ausführungsbeispielen 4 bis 8 sowie Tabelle 3.
Die WO2010063032 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0007] bis [0008], [0092] bis [0100], [0135] bis [0136], [0181 ] bis [0186] und [0204] bis [0213], den Ausführungsbeispielen 4 bis 8 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen in insbesondere den
Abschnitten [0012] bis [0013], [0155], [0160] bis [0163], [0185] bis [0190] und [0197] bis [0199], Abbildung 12, den Ausführungsbeispielen 4 bis 8 sowie Tabelle 3.
Die WO201 1003034 A2 beschreibt insbesondere auf Seite 3, zweiter Abschnitt, bis Seite 7, erster Abschnitt, Seite 20, zweiter Abschnitt, bis Seite 22, zweiter Abschnitt, und auf Seite 156 bis Seite 166, fünfter Abschnitt, sowie in den Ansprüchen 1 bis 100 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Adipinsäure, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere auf Seite 35, dritter Abschnitt, und Seite 36, erster Abschnitt.
Die WO201 1008565 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0018] bis [0024] sowie [0086] bis [0102] und den Ausführungsbeispielen 2, 4, 7, 9 und 10 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren, Fettaldehyde, Fettalkohole, Alkane und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0009] bis [0018] und [0073] bis [0082], Abbildungen 1 bis 3 und 7, Tabelle 4, den Ausführungsbeispielen 1 bis 10 sowie den Ansprüchen 1 bis 5 und 1 1 bis 13.
Die WO2009076559 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0013] bis [0051] und
[0064] bis [001 1 1] sowie den Ansprüchen 1 bis 10 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren,
Fettalkohole, Alkane oder Alkene, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren
Sequenzen in insbesondere Tabelle 1 , den Abschnitten [0021], [0024] bis [0030] und [0064] bis [001 1 1] sowie Abbildung 6.
Die WO2010017245 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [001 1] bis [0015] und
[001 14] bis [00134], dem Ausführungsbeispiel 3 sowie den Ansprüchen 1 bis 2 und 9 bis 1 1 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen in insbesondere Tabellen 1 , 2 und 3, den Abschnitten [0080] bis [001 12] sowie den Ansprüchen 3 bis 8.
Die WO2010127318 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 1 bis 9 und 1 1 bis 16, den Ausführungsbeispielen 1 , 2 und 4, den Abbildungen 1A bis 1 E sowie den Ansprüchen 23 bis 43, 62 bis 79 und 101 bis 120 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Biodiesel-Äquivalente und andere
Fettsäurederivate, vor allem Fettsäu reethylester, Fettsäure-Ester, Wachsester, Fettalkohole und Fettaldehyde, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen auf insbesondere Seiten 17, 19 bis 23.
Die WO2008100251 A1 beschreibt insbesondere auf den Seiten 4 bis 7 und 45 bis 46, den
Abbildungen 1A bis 1 E sowie den Ansprüchen 9 bis 13 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester und Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen auf insbesondere Seiten 4 bis 5 und 45 bis 46.
Die WO2007136762 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 2 bis 4 und 17 bis 18, der Tabelle 7, den Abbildungen 2 bis 4, den Ausführungsbeispielen 2 bis 8 sowie den Ansprüchen 13 und 35 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste
gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester,
Kohlenwasserstoffe und Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere auf den Seiten 17 bis 18, in den Tabellen 1 , 7, 8 und 10 sowie der Abbildung 10.
Die WO20081 13041 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 35 bis 41 und 64 bis 67, der Abbildung 2, den Ausführungsbeispielen 6 und 10 sowie den Ansprüchen 7 und 36
erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Kohlenwasserstoffe, aliphatische Ketone und Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in Abbildung 7 und den Ausführungsbeispielen 6 und 10.
Die WO2010126891 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0034] bis [0091], [0195] bis [0222] und [0245] bis [0250], den Abbildungen 3 bis 5 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 5 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester und Fettalkohole, aus
mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in den
Abschnitten [0245] bis [0250], der Tabelle 1 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 5.
Die WO20101 18410 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0043], [0158] bis [0197], den Abbildungen 1 bis 4, den Ausführungsbeispielen 3 und 5 bis 8 sowie den Ansprüchen 1 bis 53 und 82 bis 100 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester und Wachsester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in den
Abschnitten [0158] bis [0197], der Tabelle 1 , den Abbildungen 3 und 4 und den
Ausführungsbeispielen 3 sowie 5 bis 8.
Die WO20101 18409 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0134] bis [0154], den Abbildungen 1 bis 3 sowie 6 und dem Ausführungsbeispiel 3 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure- Ester und Wachsester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0134] bis [0154], den Abbildungen 3 und 6 und dem
Ausführungsbeispiel 3.
Die WO2010075483 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0061] bis [0090], und [0287] bis [0367], den Abbildungen 1 , 4 und 5, den Ausführungsbeispielen 1 bis 38 sowie den Ansprüchen 18 bis 26 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren, Fettsäuremethylester,
Fettsäureethylester, Fettalkohole, Fettalkyl-Acetate, Fettaldehyde, Fettamine, Fettamide, Fettsulfate, Fettether, Ketone, Alkane, interne und terminale Olefine, Dicarbonsäuren, α,ω- Dicarbonsäuren und α,ω-Diole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0012] bis [0060], den Tabellen 7, 17, 26 und 27, den Abbildungen 1 , 44 bis 47 und 55 bis 59, den Ausführungsbeispielen 1 bis 38 sowie den Ansprüchen 1 bis 17.
Die WO2010062480 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0174] und [0296] bis [0330], den Ausführungsbeispielen 3 und 5 bis 8 sowie den Ansprüchen 17 und 24 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen
Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0174], der Tabelle 1 , sowie den Ausführungsbeispielen 3 und 5 bis 8.
Die WO2010042664 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0143] und [0241 ] bis [0275], dem Ausführungsbeispiel 2 sowie den Ansprüchen 3 und 9 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettaldehyde, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in der Tabelle 1 , der Abbildung 5 und dem Ausführungsbeispiel 2.
Die WO201 1008535 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0024] bis [0032], und [0138] bis [0158] sowie der Abbildung 13 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte
Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen.
Die WO2010022090 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0143] und [0238] bis [0275], den Abbildungen 3 bis 5 , dem Ausführungsbeispiel 2 sowie den Ansprüchen 5, 15, 16 und 36 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester und Wachsester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in der Tabelle 1 , der Abbildung 6 und dem Ausführungsbeispiel 2.
Die WO2009140695 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0214] bis [0248] und den Ausführungsbeispielen 22 bis 24 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Kohlenwasserstoffe, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in Tabelle 1 , der Abbildung 40 und den Ausführungsbeispielen 22 bis 24.
Die WO201002171 1 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0009] bis [0020] und [0257] bis [0317], den Abbildungen 3 bis 5 und 19, den Ausführungsbeispielen 2 bis 24 sowie den Ansprüchen 4, 5 und 30 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester und Wachsester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen, insbesondere in Tabelle 3, der Abbildung 6 und den Ausführungsbeispielen 2 bis 24.
Die WO2009085278 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0188] bis [0192] und Abbildung 10 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Olefine, aus mindestens einer einfachen
Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in der Tabelle 1 und der Abbildung 10.
Die WO201 1019858 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0023], [0064] bis [0074] und [0091] bis [0099], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13, der Abbildung 1 und dem Anspruch 8 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen
Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0085] bis [0090], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13 und Tabelle 1.
Die WO2009009391 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0010] bis [0019] und
[0191 ] bis [0299], den Abbildungen 3 bis 5, den Ausführungsbeispielen 2, 4 bis 6, 9 bis 14, 17 und 19 sowie den Ansprüchen 16, 39, 44 und 55 bis 59 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure- Ester, Wachsester und Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0010] bis [0019] und [0191] bis [0299], der Abbildung 9 sowie den Ausführungsbeispielen 2, 4 bis 6, 9 bis 14, 17 und 19.
Die WO2008151 149 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0009], [0015] bis [0033], [0053], [0071 ], [0174] bis [0191], [0274] und [0396], den Ansprüchen 53 bis 1 14, 188 bis 206 und 344 bis 355 sowie den Tabellen 1 bis 3 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen in insbesondere Tabelle 5.
Die WO2008147781 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0147] bis [0156], den Ausführungsbeispielen 1 bis 3, 8, 9 und 14 sowie den Ansprüchen 65 bis 71 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Kohlenwasserstoffe, Olefine und aliphatische Ketone, aus mindestens einer einfachen
Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in den Ausführungsbeispielen 1 bis 3, 8, 9 und 14.
Die WO20081 19082 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 3 bis 5, 8 bis 10 und 40 bis 77, in den Abbildungen 4 und 5, den Ausführungsbeispielen 2 bis 5 und 8 bis 18 sowie den
Ansprüchen 3 bis 39 und 152 bis 153 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte
Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Triglyceride, Biodiesel, Gasolin, Flugzeugtreibstoff und Fettalkohole aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in der Tabelle 1 , der Abbildung 1 , den Ausführungsbeispielen 2 bis 5 und 8 bis 18 sowie den Ansprüchen 124 bis 134 und 138 bis 141 .
Die WO2010135624 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0067] bis [0083], und [0095] bis [0098] erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0067] bis [0083] und [0095] bis [0098].
Zheng Z, Gong Q, Liu T, Deng Y, Chen JC und Chen GQ. (Thioesterase II of Escherichia coli plays an important role in 3-hydroxydecanoic acid production. Appl Environ Microbiol. 2004. 70(7):3807-13) beschreiben insbesondere auf den Seiten 3808 bis 3810 und 3012 sowie Tabelle 1 , 3 und 4 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester und Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen auf insbesondere den Seiten 3807 und in der Tabelle 2.
Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McCIure A, Del Cardayre SB und Keasling JD (Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature. 2010. 463(7280):559-62) beschreiben insbesondere in S.559, dritter Absatz, bis S.559, erster Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste
gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen, insbesondere in der
Supplementären Tabelle 1 .
Lennen RM, Braden DJ, West RA, Dumesic JA und Pfleger BF (A process for microbial hydrocarbon synthesis: Overproduction of fatty acids in Escherichia coli and catalytic conversion to alkanes. Biotechnol Bioeng. 2010. 106(2): 193-202) beschreiben insbesondere in S.193, erster Absatz, S.194, erster und zweiter Absatz, S.195, zweiter Absatz bis S. 197, zweiter Absatz, S.198, zweiter Absatz bis S. 199, dritter Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen, insbesondere auf S.193, erster Absatz, S.194, erster und zweiter Absatz, S.196, zweiter Absatz, und im Supplementären Material.
Liu T, Vora H und Khosla C. (Quantitative analysis and engineering of fatty acid biosynthesis in E. coli. Metab Eng. 2010 Jul;12(4):378-86.) beschreiben insbesondere in den Abschnitten 2.2, und 3.1 sowie in Tabelle 1 und 2 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen, insbesondere in Tabelle 1 . Yuan L, Voelker TA und Hawkins DJ. (Modification of the Substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering. Proc Natl Acad Sei U S A. 1995 Nov 7;92(23): 10639-43) beschreiben insbesondere auf S. 10641 , vierter Absatz, sowie in Abbildung 2 und Tabelle 1 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen, insbesondere auf S.10639 erster Absatz, S. 10640, zweiter, dritter und letzter Absatz, S. 10641 , zweiter und dritter Absatz, sowie in Abbildung 1 und Tabelle 1 und 2.
Lu X, Vora H und Khosla C. (Overproduction of free fatty acids in E. coli: implications for biodiesel produetion. Metab Eng. 2008. 10(6):333-9.) beschreiben insbesondere in S.334, zweiter Absatz, den Abschnitten 2.2, 2.3 und 3 (erster bis vierter Absatz) sowie in Tabelle 1 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen, insbesondere in Abschnitt 2.2.
Liu X, Sheng J und Curtiss INI R. (Fatty acid produetion in genetically modified eyanobacteria. Proc Natl Acad Sei U S A. 201 1. 108(17):6899-904) beschreiben insbesondere auf S. 6899, vierter und letzter Absatz, S.6900, erster bis vorletzter Absatz, und in Tabelle S1 der „Supporting Information" erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme E, und deren Sequenzen, insbesondere auf S. 6899, sechster und letzter Absatz. Bestimmte Enzyme
Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung erste gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit der zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McCIure A, Del Cardayre SB und Keasling JD (Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature. 2010. 463(7280):559-62) beschreiben insbesondere in S.559, dritter Absatz, bis S.559, erster Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste
gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme ΕΝ und deren Sequenzen, insbesondere in der
Supplementären Tabelle 1.
Lennen RM, Braden DJ, West RA, Dumesic JA und Pfleger BF (A process for microbial hydrocarbon synthesis: Overproduction of fatty acids in Escherichia coli and catalytic conversion to alkanes. Biotechnol Bioeng. 2010. 106(2): 193-202) beschreiben insbesondere in S.193, erster Absatz, S.194, erster und zweiter Absatz, S.195, zweiter Absatz bis S. 197, zweiter Absatz, S.198, zweiter Absatz bis S. 199, dritter Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme ΕΝ und deren Sequenzen, insbesondere auf S.193, erster Absatz, S.194, erster und zweiter Absatz, S.196, zweiter Absatz, und im Supplementären Material.
Liu T, Vora H und Khosla C. (Quantitative analysis and engineering of fatty acid biosynthesis in E. coli. Metab Eng. 2010 Jul;12(4):378-86.) beschreiben insbesondere in den Abschnitten 2.2, und 3.1 sowie in Tabelle 1 und 2 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme ΕΝ und deren Sequenzen, insbesondere in Tabelle 1. Yuan L, Voelker TA und Hawkins DJ. (Modification of the Substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering. Proc Natl Acad Sei U S A. 1995 Nov
7;92(23):10639-43) beschreiben insbesondere auf S. 10641 , vierter Absatz, sowie in Abbildung 2 und Tabelle 1 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme ΕΝ und deren Sequenzen, insbesondere auf S.10639 erster Absatz, S. 10640, zweiter, dritter und letzter Absatz, S. 10641 , zweiter und dritter Absatz, sowie in Abbildung 1 und Tabelle 1 und 2.
Lu X, Vora H und Khosla C. (Overproduction of free fatty acids in E. coli: implications for biodiesel produetion. Metab Eng. 2008. 10(6):333-9.) beschreiben insbesondere in S.334, zweiter Absatz, den Abschnitten 2.2, 2.3 und 3 (erster bis vierter Absatz) sowie in Tabelle 1 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme EÜ und deren Sequenzen, insbesondere in Abschnitt 2.2.
Liu X, Sheng J und Curtiss INI R. (Fatty acid produetion in genetically modified eyanobacteria. Proc Natl Acad Sei U S A. 201 1. 108(17):6899-904) beschreiben insbesondere auf S. 6899, vierter und letzter Absatz, S.6900, erster bis vorletzter Absatz, und in Tabelle S1 der „Supporting Information" erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, insbesondere Fettsäuren und Fettsäure-Ester, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme ΕΝ und deren Sequenzen, insbesondere auf S. 6899, sechster und letzter Absatz. Bestimmte Enzyme Em
Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung erste gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit der zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
Die WO2009121066 A1 beschreibt insbesondere in den Ansprüchen 8 bis 14 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Dicarbonsäuren, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Em und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [00026] bis [0054], den Ausführungsbeispielen 1 bis 6, den Abbildungen 4 bis 10 und den Ansprüchen 1 bis 7.
Die WO2009134899 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0079] bis [0082], dem Ausführungsbeispiel 1 und dem Anspruch 20 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte
Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Em und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0009] bis [0010] und [0044] bis [0078], dem Ausführungsbeispiel 1 , den Abbildungen 1 sowie 5 bis 8 und den Ansprüchen 15 bis 17 und 19.
Bestimmte Enzyme Eiv
In erfindungsgemäß bevorzugten Zellen stellt das Enzym Eiv eines dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
AAS90071.1 , XP_002379948.1 , AAS90024.1 , XP_001821514.2, BAE59512.1 , AAL99898.1 , AAS90001.1 , AAS90049.1 , XP_00191 1518.1 , ACH72901.1 , XP_681084.1 , AAC49198.1 , EFW18013.1 , XP_003070494.1 , XP_001241401 .1 , XP_002384449.1 , XP_001827206.1 , XP_002836001.1 , XP_001393196.1 , XP_660984.1 , XP_001395284.1 , XP_002148677.1 , XP_001827151.2, BAE66018.1, XP_001217254.1, CAK40139.1, XP_001393516.2,
XP_002477829.1, XP_002146311.1, XP_002340042.1, XP_002544942.1, CBF87553.1, XP_002149766.1, 2UV8_A, XP_682676.1, CBX98966.1, XP_002560069.1 , XP_001273102.1 , P15368.1 , XP_001273530.1 , CBX99714.1 , AAB41493.1 , XP_001823764.1 , XP_001388458.1 , XP_748738.1, EDP53207.1, XP_001259179.1 , XP_001825741.2, BAE64608.1,
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AAA34602.1, XP_003231209.1, XP_003019765.1, ADN94478.1, EEQ46070.1,
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XP_003328630.1, XP_681125.1, XP_003325251.1,
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Eiv generell insbesondere die Umsetzung zu Hexansäure aus 2 Molekülen
Malonyl-Coenzym A und einem Molekül Acetyl-Coenzym A verstanden wird.
Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung erste gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit der zweiten gentechnischen Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
Die WO201 1003034 A2 beschreibt insbesondere in S. 2 bis 3, S. 5 dritter Abschnitt, in den Ausführungsbeispielen 1 bis 4, 7 bis 9 und 12 bis 14 sowie den Ansprüchen 1 bis 100 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Hexansäure aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eiv und deren Sequenzen auf insbesondere S. 5 und im Ausführungsbeispiel 3.
Hitchman TS, Schmidt EW, Trail F, Rarick MD, Linz JE und Townsend CA. (Hexanoate synthase, a specialized type I fatty acid synthase in aflatoxin B1 biosynthesis. Bioorg Chem. 2001. 29(5):293-307) beschreiben insbesondere auf S. 296, vorletzter Absatz, bis S. 298, zweiter Absatz, erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Hexansäure, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eiv und deren Sequenzen in insbesondere S. 299, vierter Absatz, bis S. 302, erster Absatz.
Es kann im Zusammenhang mit der ersten gentechnischen Modifikation förderlich sein, anstelle des Enzyms E, eine Kombination der Aktivitätserhöhung verglichen zu der des Wildtyps eines Enzyms ΕΜ gepaart mit der eines Enzyms Eiib einzusetzen, welches eine Reaktion katalysiert, in der ein CoA-Thioester in einen ACP-Thioester umgewandelt wird.
Entsprechende Enzyme Eiib sind als Acyl-CoA (Coenzym A):ACP (Acyl Carrier Protein)- Transacylasen bekannt. Bevorzugte Enzyme Eiib sind ausgewählt aus
XP_003402554.1, YP_002908243.1 , YP_001778804.1 , YP_001670627.1 , YP_004703658.1 , YP_001747923.1, YP_004348703.1, YP_004352505.1, YP_004379169.1, ADR61731.1, YP_001269622.1 , YP_001186851.1 , YP_004659609.1 , YP_003519049.1 , YP_001811696.1 , YP_004616040.1, NP_252697.1, NP_252169.1, NP_249421.1 , ZP_06456665.1 ,
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YP_080427.1, YP_258557.1, YP_001985016.1, YP_002875182.1, YP_002871082.1,
YP_237050.1,YP_236199.1, NP_794008.1, NP_793082.1 , YP_609790.1 , EFW81598.1, EFW79804.1, ZP_07261632.1, ZP_07229875.1, ZP_06458504.1, ZP_05640568.1,
ZP_03399268.1, ZP_03398232.1, ZP_08004496.1, ZP_06876938.1, ZP_03227482.1, ZP_02511781.1, ZP_02503964.1 , ZP_02477255.1 , ZP_02466678.1 , ZP_02465791.1 , ZP_02461688.1, ZP_02417235.1, ZP_02414413.1 , ZP_02408727.1 , ZP_02376540.1 , ZP_02358949.1, ZP_07778021.1 , ZP_07774051.1 , ZP_07795409.1 , ZP_07089008.1 , YP_776393.1 , ZP_07684652.1 , ZP_06640022.1 , ZP_03054335.1 , ZP_02907621.1 ,
ZP_02891475.1, ZP_01862226.1, ZP_01769192.1 , ZP_01367441.1 , ZP_01366930.1, ZP_01364106.1, ZP_01312991.1, ZP_01173135.1 , ZP_07005523.1 , ZP_04955702.1 , ZP_04943305.1, ZP_04936014.1, ZP_04932415.1, ZP_04930223.1, ZP_04905334.1, ZP_04893870.1, ZP_04893165.1, ZP_04892059.1, ZP_04884056.1, YP_002438575.1, YP_002234939.1, YP_001488024.1 , YP_001346487.1 , YP_001350135.1 , YP_001347031.1 , YP_990329.1 , ΥΡ_860279.1 , ΥΡ_7891 1 1.1 , ΥΡ_792557.1 , ΥΡ_623139.1 , ΥΡ_175644.1 , ΥΡ_1 1 1362.1 , ΥΡ_1 10557.1 , ΥΡ_105231 .1 , ΝΡ_937516.1 , AAU44816.1 , ΑΑΑ25978.1 , ΧΡ_002721010.1 , ΑΑΚ81868.1 , ΑΑΚ71350.1 , ΑΑΚ71349.1 , ΖΡ_06499968.1 , ΖΡ_06498781 .1 , ΥΡ_003472045.1 , ACA03779.1 , ABL84756.1 , AAQ16175.1 , ΑΑΤ51302.1 , ΑΑΤ51 199.1 , ΖΡ_05639386.1 , ACH70299.1 , ACA60824.1 , ΒΑΒ32432.1 ,
insbesondere
ΑΑΚ81868.1 , ΝΡ_743567.1 , ΑΑΚ71349.1 , ΥΡ_001269622.1 , ADR61731 .1 , AAU44816.1 , AAQ16175.1 , ΥΡ_001670627.1 , ACH70299.1 , Q9KJH8.1 , ΥΡ_004703658.1 , ΖΡ_08139631 .1 , ΥΡ_609790.1 , ΥΡ_001747923.1 , ΥΡ_258557.1 , ΥΡ_347066.1 , ΥΡ_002871082.1 ,
ΥΡ_004352505.1 , ACA60824.1 , ΖΡ_07774051 .1 , ΒΑΒ32432.1 , ΖΡ_05640568.1 , EGH58099.1 , EGH64812.1 , EGH1 1618.1 , ΖΡ_06456665.1 , ΥΡ_2761 16.1 , EFW81598.1 , EGH95622.1 , EGH22129.1 , ΝΡ_794008.1 , ΖΡ_03399268.1 , ΖΡ_07264431.1 , EGH73565.1 , ΥΡ_237050.1 , ΖΡ_06498781.1 , EGH29888.1 , EGH79586.1 , EGH50352.1 , ΥΡ_792557.1 , ΥΡ_001350135.1 , ΖΡ_01364106.1 , ΖΡ_04932415.1 , Ν Ρ_249421 .1 , ΥΡ_004379169.1 , ACA03779.1 ,
ΥΡ_001 186851.1 , ΥΡ_004475334.1 , ΖΡ_04589662.1 , ΖΡ_03398232.1 , EGH1001 1.1 ,
ΖΡ_07229875.1 , ΖΡ_05639386.1 , EGH66549.1 , ΥΡ_275219.1 , ΖΡ_07005523.1 , EFW79804.1 , ΖΡ_06458504.1 , EGH85976.1 , ΥΡ_236199.1 , EGH43364.1 , ΖΡ_07261632.1 , ΖΡ_06499968.1 , EGH29417.1 , EGH54896.1 , EGH22392.1 , EGH97259.1 , ΝΡ_793082.1 , EGH90852.1 ,
EGH41593.1 , ΝΡ_252169.1 , ΖΡ_01366930.1 , ΥΡ_001347031.1 , ΖΡ_07778021.1 ,
ΥΡ_002875182.1 , ΑΑΑ25978.1 , ABL84756.1 , EGH81248.1 , ΖΡ_07795409.1
und besonders bevorzugt AAU44816.1 , ΝΡ_743567.1 , ΥΡ_001269622.1 , ADR61731.1 , ΑΑΚ71349.1 , ΥΡ_001670627.1 , ΑΑΚ81868.1 , AAQ16175.1 , Q9KJH8.1 , ACH70299.1 ,
ΥΡ_004703658.1 , ΖΡ_08139631 .1 , ΥΡ_609790.1 , ΥΡ_001747923.1 , ΑΑΚ71350.1 ,
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Eiib generell insbesondere die Umsetzung von Dodecanoyl-CoA-Thioester zu Dodecanoyl-ACP-Thioester verstanden wird.
Dritte gentechnische Modifikation für die Herstellung von Carbonsäure-Estern Insbesondere für die Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern, wie
beispielsweise co-Hydroxy-, co-Oxo-, ω-Carboxy- oder co-Amino-Carbonsäure-Estern ist es vorteilhaft, wenn der Mikroorganismus eine dritte gentechnische Modifikation aufweist, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme Eiib, Ev, Evi oder Evii umfasst, welche an der Umsetzung von Carbonsäuren oder co-funktionalisierten Carbonsäuren zu Carbonsäure-Estern oder co- funktionalisierten Carbonsäure-Estern beteiligt sind.
Es ist in diesem Zusammenhang erfindungsgemäß bevorzugt, dass es sich bei dieser gentechnischen Modifikation um eine verglichen zu der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme handelt, ausgewählt aus der Gruppe
Eüb Acyl-CoA (Coenzym A):ACP (Acyl Carrier Protein)-!" ransacylase, welche einen ACP- Thioester in einen CoA-Thioester bzw. einen CoA-Thioester in einen ACP-Thioester umwandelt, Ev Wachsester-Synthase oder Alkohol-O-Acyltransferase, bevorzugt der EC 2.3.1 .75 oder EC 2.3.1 .84, welche die Synthese eines Esters aus einem Acyl-Coenzym A-Thioester oder einem ACP-Thioester und einem Alkohol katalysiert,
Evi Acyl-CoA (Coenzym A)-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1 .3, welche die Synthese eines Acyl-Coenzym A-Thioesters katalysiert, und
Evii Acyl-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1 .2.2, EC 3.1 .2.4, EC 3.1.2.18, EC 3.1 .2.19, EC 3.1 .2.20 oder EC 3.1 .2.22, welche die Umsetzung eines Acyl-Thioesters mit einem Alkohol zu einem Carbonsäure-Ester katalysiert. ln diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die dritte gentechnische Modifikation Kombinationen der gesteigerte Aktivitäten der Enzyme ausgewählt aus
Ev, Evjj, EvEVj, EVjEVjj, EVjEVjjEjjb
umfasst.
Bevorzugte Enzyme Eiib in Zusammenhang mit der dritten gentechnischen Modifikation entsprechen den oben als bevorzugt herausgestellten Enzymen Eiib in Zusammenhang mit der ersten gentechnischen Modifikation.
Bestimmte Enzyme Ev
In erfindungsgemäß bevorzugten Zellen stellt das Enzym Ev eines dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
NP_808414.2, NP_001178653.1 , XP_003272721.1 , XP_002720111.1 , NP_001002254.1, XP_529027.1, XP_002831804.1, BAC28882.1 , XP_549056.2, XP_002918053.1,
XP_001085075.1, XP_002763005.1 , XP_002700092.1 , XP_599558.4, EDL95940.1,
XP_001496780.1, CAD89267.1, EFB28125.1,
YP_004747160.1, YP_004746900.1 , YP_004746665.1 , YP_004746558.1 , YP_004746531.1 , YP_004746530.1, YP_004745948.1, YP_004745222.1, YP_004744358.1, YP_004743710.1, YP_002492297.1, AEK40846.1, YP_001847685.1 , YP_001712672.1 , YP_001706290.1, YP_004724737.1 , YP_004723134.1 , AE J51098.1 , AEJ48174.1 , AEJ47480.1 ,
YP_004392630.1, YP_004099725.1 , YP_003912033.1 , YP_003652731.1 , YP_003301387.1, YP_003298139.1, YP_001509672.1, YP_001505948.1, YP_001432486.1, YP_001432432.1, YP_924893.1, YP_923981.1, YP_922869.1, YP_922597.1, YP_922419.1, ZP_08629145.1, ZP_08628906.1, YP_001380027.1, YP_001280731.1, YP_001280730.1, YP_888966.1, YP_890540.1, YP_888236.1, YP_888223.1, YP_888574.1, YP_884705.1, YP_889488.1, YP_886248.1, YP_882534.1, YP_881069.1, YP_881444.1, YP_883472.1, YP_879642.1, YP_884073.1 , YP_880917.1 , YP_882201.1 , YP_879422.1 , YP_707862.1 , YP_707847.1 , YP_707633.1, YP_707572.1, YP_707571.1, YP_706785.1, YP_706267.1, YP_705586.1, YP_705294.1 , YP_702929.1 , YP_701572.1 , YP_700576.1 , YP_700081.1 , YP_700033.1 , YP_700018.1, YP_700017.1, YP_699999.1, CCB78299.1, CCB78283.1, CCB72233.1, YP_004663601.1 , ΥΡ_004525283.1 , ΥΡ_004524901.1 , ΥΡ_004524237.1 , ΥΡ_004524223.1 , ΥΡ_004523752.1, ΥΡ_004522677.1, ΥΡ_004521797.1, ΥΡ_004521441.1, ΥΡ_004020500.1, ΥΡ_004014348.1, EGO40684.1, EG038684.1, EG038655.1, EG037244.1, EGO36970.1, EGO36701.1 , ΥΡ_003951335.1 , ΥΡ_003812176.1 , ΥΡ_003811992.1 , ΥΡ_003810691.1 , ΥΡ_003810418.1 , ΥΡ_003809501.1 , ΖΡ_08574204.1 , CCA19760.1 , ΧΡ_002900672.1 , ΖΡ_06414567.1, ΖΡ_06413635.1, ΖΡ_06411773.1 , ΖΡ_06411772.1, ΖΡ_06271823.1 , ΖΡ_05620754.1, ΖΡ_05360001.1 , ΖΡ_04752019.1 , ΖΡ_04751943.1, ΖΡ_04750965.1 , ΖΡ_04750465.1, ΖΡ_04750453.1 , ΖΡ_04750228.1 , ΖΡ_04750091.1 , ΖΡ_04749363.1 , ΖΡ_04749348.1, ΖΡ_04749293.1, ΖΡ_04749287.1, ΖΡ_04749022.1, ΖΡ_04748677.1, ΖΡ_04747379.1, ΖΡ_04747377.1 , ΖΡ_04747348.1 , ΖΡ_04747282.1 , ΖΡ_04747159.1, ΖΡ_04747093.1, ΖΡ_04746958.1, ΖΡ_04717323.1, ΖΡ_04684258.1, ΖΡ_04386203.1, ΖΡ_04385082.1, ΖΡ_04384030.1, ΖΡ_04384029.1, ΖΡ_03534755.1, ΖΡ_01115502.1, ΖΡ_01102322.1, ΥΡ_004583872.1 , ΥΡ_004583323.1 , ΥΡ_004573656.1 , ΥΡ_004571392.1 , ΥΡ_003513699.1, ΖΡ_08553011.1 , ΖΡ_08552672.1 , ΥΡ_003467054.1 , ΥΡ_003572597.1 , ΥΡ_579515.1 , ΥΡ_001136465.1 , ΥΡ_001136231.1 , ΥΡ_001135959.1 , ΥΡ_001135349.1 ,
ΥΡ_001133828.1 , ΥΡ_001133806.1 , ΥΡ_001133693.1 , ΥΡ_001133270.1 , ΥΡ_001132329.1 , ΥΡ_001131721.1, ΥΡ_001131631.1 , ΥΡ_001073715.1 , ΥΡ_001073143.1 , ΥΡ_001072388.1 , ΥΡ_001072036.1, ΥΡ_001071893.1, ΥΡ_001071814.1 , ΥΡ_001071689.1, ΥΡ_001070856.1 , ΥΡ_001069682.1, ΥΡ_001069164.1, ΥΡ_001068496.1, ΥΡ_939377.1, ΥΡ_642242.1, ΥΡ_641664.1, ΥΡ_641419.1, ΥΡ_640919.1, ΥΡ_640783.1, ΥΡ_640704.1, ΥΡ_640572.1, ΥΡ_640571.1, ΥΡ_640494.1, ΥΡ_639709.1, ΥΡ_639198.1, ΥΡ_638523.1, ΥΡ_638030.1, ΥΡ_637968.1, ΥΡ_637380.1, ΥΡ_446603.1, ΝΡ_001185377.1 , ΝΡ_200151.2, ΝΡ_568547.1, NPJ97641.1, ΝΡ_200150.1, ΝΡ_197139.1, ΝΡ_190490.1, NPJ90488.1, NPJ77356.1, γρ_004495408.1, ΥΡ_004495023.1, ΥΡ_004494197.1, ΥΡ_004494168.1, ΥΡ_004493973.1, ΥΡ_004493936.1 , ΥΡ_004493628.1 , ΥΡ_004493589.1 , ΥΡ_004493509.1 , ΥΡ_004493477.1 , γρ_004493462.1, ΥΡ_004492352.1, ΥΡ_004492155.1, ΥΡ_004492039.1, ΥΡ_004491716.1, ΥΡ_004491715.1, ΥΡ_004491501.1 , ΥΡ_003375642.1 , ΥΡ_003411203.1 , ΥΡ_003410436.1 , ΥΡ_003395271.1 , ΥΡ_003395089.1 , ΥΡ_003393635.1 , ΥΡ_003384208.1 , ΥΡ_003379551.1 , ΖΡ_04388235.1, ΥΡ_002134168.1, ΖΡ_01900421.1 , ΖΡ_01900085.1 , ΖΡ_01899829.1 , ΖΡ_01898741.1, ΒΑΚ05274.1, BAJ93623.1, BAJ97841.1, ΒΑΚ08349.1, BAJ93204.1, BAJ92722.1, ΒΑΚ06983.1, BAJ86545.1, ΒΑΚ02325.1, BAJ85619.1, BAJ84892.1,
ΖΡ_05218281.1, ΖΡ_05218149.1 , ΖΡ_05217310.1, ΖΡ_05216978.1 , ΖΡ_05216447.1 , ZP_05216446.1, ZP_05216025.1, ZP_05214687.1 , ZP_08476543.1 , ZP_04749239.1 ,
YP_823060.1 , ADP99639.1 , ADP98951.1 , ADP98855.1 , ADP98710.1 , ADP96265.1 ,
ZP_08461736.1, ZP_08461735.1 , ZP_07608690.1 , YP_045555.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 22), YP_872243.1, YP_004009106.1, YP_004008736.1, YP_004008003.1, YP_004007600.1, YP_004006799.1, YP_004006436.1, YP_004006072.1, YP_004005008.1, YP_003486913.1, NP_301898.1, ZP_08434757.1 , YP_004079491.1 , YP_004078785.1 , YP_004077880.1 , YP_004076486.1 , YP_004076464.1 , YP_004076350.1 , YP_004075391.1 , YP_004074864.1 , ZP_01103855.1, YP_465274.1, ZP_08403393.1 , ZP_08402717.1 , ZP_08402716.1 ,
YP_004427559.1, YP_001277083.1, YP_001276783.1, YP_524767.1, YP_522739.1,
YP_521788.1, YP_004335162.1, YP_004333708.1, YP_004332973.1, YP_004332349.1,
YP_004157731.1, YP_004224204.1 , YP_003275673.1 , YP_003275371.1 , YP_003274979.1 , YP_003274924.1, YP_003274705.1, YP_956544.1, YP_955502.1, YP_955007.1,
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YP_004010866.1, EGE24961.1, EGE18726.1, EGE15701.1, EGE12950.1, EGE10026.1, EGB03968.1, ZP_08206563.1, ZP_08205089.1, ZP_08204958.1, ZP_08204416.1,
ZP_08203326.1 , YP_714381.1 , YP_713817.1 , YP_694462.1 , YP_693524.1 , YP_003341775.1 , YP_003339587.1, ZP_08197177.1, ADW01905.1, YP_004242683.1, ZP_07484742.2,
ZP_07441979.2, ZP_07441978.2, ZP_07437333.2, ZP_06960424.1 , ZP_06801236.1 ,
ZP_06799517.1, ZP_05769718.1, ZP_05768326.1, ZP_05767970.1, ZP_05766272.1,
ZP_05763839.1, YP_003204265.1, YP_003203570.1, YP_003200768.1, YP_003134884.1, YP_003134608.1, ZP_05140320.1, NP_001140997.1 , EEE64643.1, EEE55448.1,
EEE32548.1, ZP_03534756.1, ZP_03533653.1, ZP_03531929.1, EEC71274.1, EAY98969.1, EAY75974.1, EAY75973.1, ADZ24988.1, ZP_08157247.1 , ZP_08156660.1 , ZP_08156249.1, ZP_08153292.1, ZP_08152876.1 , ZP_08152662.1 , YP_002946672.1 , YP_960669.1,
YP_960629.1, YP_960328.1, YP_958134.1, YP_957462.1, YP_001022272.1 , ZP_08123690.1 , ZP_08120547.1, ZP_08119498.1, EGB29195.1, EGB27143.1 , YP_003770089.1 ,
YP_003769971.1, YP_003764703.1, YP_003764513.1, YP_003103950.1, YP_003168536.1, YP_003168331.1, YP_003166844.1, CAJ88696.1, NP_769520.1 , YP_001141853.1 , YP_001108534.1 , ΥΡ_001106516.1 , ΥΡ_907824.1, ΥΡ_907344.1, ΥΡ_906945.1, ΥΡ_906856.1, ΥΡ_906855.1, ΥΡ_906831.1, ΥΡ_906494.1, ΥΡ_906243.1, ΥΡ_905962.1, ΥΡ_905765.1, ΥΡ_905343.1, ΥΡ_905239.1, ΥΡ_325796.1, ΥΡ_130413.1, ΝΡ_625255.1, ΝΡ_624462.1, ΝΡ_338129.1, ΝΡ_338004.1, ΝΡ_337859.1, ΝΡ_337740.1, ΝΡ_337694.1, ΝΡ_336266.1, ΝΡ_335919.1, ΝΡ_335351.1, ΝΡ_334638.1, ΝΡ_218257.1, ΝΡ_218251.1, ΝΡ_217997.1, ΝΡ_217888.1, ΝΡ_217751.1, ΝΡ_217750.1, ΝΡ_217646.1, ΝΡ_217604.1, ΝΡ_217603.1, ΝΡ_217000.1, ΝΡ_216801.1, ΝΡ_216276.1, ΝΡ_215941.1, ΝΡ_215410.1, ΝΡ_214735.1, ΖΡ_04661667.1 , EFW44815.1, EFW44455.1 , ΖΡ_08024634.1 , ΖΡ_08024620.1 , ΖΡ_08023777.1, ΖΡ_08023597.1, ΥΡ_002784032.1, ΥΡ_002783585.1, ΥΡ_002782904.1, ΥΡ_002782647.1, ΥΡ_002780099.1, ΥΡ_002779887.1, ΥΡ_002778497.1, ΥΡ_002777657.1, ΥΡ_002777402.1, ΖΡ_07966321.1 , ΖΡ_07944768.1 , CBI21867.3, CBI40547.3, CBI40544.3, CBI40540.3, CBI40536.3, CBI40534.3, CBI40533.3, CBI32385.3, ΖΡ_05765756.1 ,
ΖΡ_05765643.1, ΖΡ_05765597.1 , ΖΡ_05765596.1 , ΥΡ_001705267.1 , ΥΡ_001704692.1 , ΥΡ_001704281.1, ΥΡ_001702654.1 , ΥΡ_001701260.1, ΖΡ_05770434.1 , ΖΡ_05766274.1 , ΖΡ_05762133.1, ΖΡ_05762130.1, ΖΡ_01101223.1 , ΥΡ_481580.1, ΥΡ_979623.1,
ΥΡ_979196.1, ΖΡ_07414300.2, ΖΡ_03537340.1 , ΖΡ_03537339.1 , ΖΡ_03536772.1 ,
ΖΡ_03536404.1, ΖΡ_03433478.1, ΖΡ_03430367.1, ΖΡ_03430260.1, ΖΡ_03429345.1,
ΖΡ_03428583.1, ΖΡ_03426905.1, ΖΡ_03426458.1, ΖΡ_03426456.1, ΖΡ_03426455.1,
ΖΡ_03425014.1, ΖΡ_03424082.1 , ΖΡ_03421649.1 , ΖΡ_03419291.1 , ΖΡ_03418394.1,
ΖΡ_03417976.1, ΖΡ_03414875.1 , ΖΡ_06952098.1 , ΖΡ_05528769.1 , ΖΡ_05527907.1 ,
ΖΡ_05227984.1, ΖΡ_05227897.1, ΖΡ_05227653.1, ΖΡ_05227585.1, ΖΡ_05227420.1,
ΖΡ_05227202.1, ΖΡ_05226387.1, ΖΡ_05226386.1, ΖΡ_05225355.1, ΖΡ_05225200.1,
ΖΡ_05223431.1, ΖΡ_05223402.1, ΖΡ_04697793.1, ΖΡ_02550609.1, ΖΡ_02548969.1,
ΕΕΕ25493.1, ΑΒ013188.2, ΖΡ_07205208.1 , ΥΡ_589436.1 , BAJ33896.1 , ΖΡ_07718107.1 , ΖΡ_07717513.1, ΖΡ_07717390.1, ΖΡ_07716424.1 , ΖΡ_04384387.1 , ΖΡ_07376578.1 ,
ΖΡ_06871097.1, ΖΡ_06852444.1, ΖΡ_06852442.1, ΖΡ_06852283.1, ΖΡ_06852150.1,
ΖΡ_06852032.1, ΖΡ_06850980.1, ΖΡ_06850766.1, ΖΡ_06850644.1, ΖΡ_06849846.1,
ΖΡ_06849446.1 , ΖΡ_06849265.1 , ΖΡ_06848894.1 , ΖΡ_06848550.1 , ΖΡ_06847321.1 ,
ΖΡ_06847245.1, ΖΡ_06728640.1 , ΖΡ_06155537.1 , ΖΡ_03822106.1 , ΖΡ_03822105.1,
ΖΡ_03264909.1, ΖΡ_01915979.1, ΖΡ_01914209.1 , ΖΡ_01909198.1 , ΖΡ_01895985.1,
ΖΡ_01893763.1, ΖΡ_01893601.1 , ΖΡ_01893547.1 , ΖΡ_01864269.1 , ΖΡ_01736818.1 ,
ΖΡ_01693481.1, ΖΡ_01626518.1, ΖΡ_01616172.1 , ΖΡ_01461648.1, ΖΡ_01439861.1 , ZP_01311414.1, ZP_01222733.1 , ZP_01038993.1 , ZP_00997001.1 , ZP_06533596.1 , ZP_07308012.1, ZP_07282351.1, ZP_07282257.1, ZP_07278697.1, ZP_07277986.1, ZP_07277799.1, ZP_07011797.1 , ZP_06913634.1 , ZP_06711075.1 , ZP_06575037.1 , ZP_06523715.1, ZP_06522644.1, ZP_06520408.1, ZP_06518751.1, ZP_06514733.1, ZP_06511304.1, ZP_06510466.1, ZP_06509700.1 , ZP_06504004.1 , ZP_06452618.1 , ZP_06451687.1, ZP_06450049.1, ZP_06444722.1, ZP_06443996.1, ZP_06443677.1, ZP_06438510.1, ZP_06435077.1 , ZP_06434554.1 , ZP_06432969.1 , ZP_06431341.1 , ZP_06430915.1, ZP_05129423.1 , ZP_05127637.1 , ZP_05126217.1, ZP_05096686.1 , ZP_05095013.1, ZP_05094400.1, ZP_05093434.1, ZP_05043539.1, ZP_05041631.1, ZP_04959394.1 , ZP_04956551.1 , ZP_01052702.1 , YP_437020.1 , YP_436128.1 ,
YP_432512.1, YP_432391.1, ZP_06072118.1, ZP_06069021.1 , ZP_06065092.1 ,
ZP_06062254.1, YP_003032200.1, YP_003030813.1, YP_002766854.1, YP_002766842.1, YP_002766292.1 , YP_002765623.1 , YP_002765076.1 , YP_002764977.1 , YP_002764976.1 , YP_002764693.1, YP_002764633.1 , YP_002646305.1 , YP_002646304.1 , YP_001853537.1 , YP_001853530.1, YP_001853214.1, YP_001852100.1 , YP_001851711.1, YP_001851686.1, YP_001851684.1, YP_001851611.1, YP_001851610.1 , YP_001851579.1, YP_001850950.1 , YP_001850935.1, YP_001850900.1, YP_001850899.1 , YP_001850378.1 , YP_001849911.1 , YP_001849825.1, YP_001849624.1, YP_001849470.1 , YP_001848848.1 , YP_001848784.1 , YP_001822237.1, YP_001289190.1 , YP_001289078.1 , YP_001288434.1 , YP_001287727.1 , YP_001286168.1, YP_001085790.1, YP_856793.1, YP_629387.1, YP_615587.1,
YP_615252.1, YP_457389.1, YP_263530.1, NP_962591.1, NP_962411.1, NP_962281.1, NP_961234.1, NP_960903.1, NP_960387.1, NP_960090.1, NP_959281.1, NP_959065.1, NP_857403.1, NP_857149.1, NP_857148.1, NP_857047.1, NP_856907.1, NP_856759.1, NP_856156.1, NP_855443.1, NP_855112.1, NP_853892.1, NP_828432.1, NP_603766.1, XP_003081224.1, YP_003778608.1 , YP_003730939.1 , XP_003059244.1 , ADI13131.1,
XP_002992800.1, XP_002963877.1 , XP_001419779.1 , XP_002988280.1 , XP_002987493.1 , CBH32551.1 , CBH32550.1 , CBH19575.1 , CBH19574.1 , YP_003627553.1 , XP_002879777.1 , XP_002877657.1, XP_002877655.1, XP_002873570.1, XP_002871716.1, XP_002870738.1, XP_002868506.1, XP_002865972.1, XP_002864239.1, XP_002862308.1, ZP_05823139.1, NP_001043877.1, ZP_06693274.1, ZP_06058985.1, NP_001044374.1, XP_002835451.1 , XP_002787542.1, XP_002785958.1 , XP_002785645.1 , XP_002783220.1 , XP_002774061.1 , XP_002767852.1, XP_002766051.1 , XP_002765456.1 , XP_002765455.1 , XP_002677788.1 , XP_002671612.1, XP_002736281.1, CBA31373.1 , XP_002184474.1 , XP_002325936.1 , XP_002323705.1, XP_002325937.1, XP_002323911.1, XP_002323706.1, XP_002328965.1, XP_002318416.1 , XP_002310400.1 , ACY38597.1, ACY38596.1, ACY38595.1, ACY38594.1, ACY38593.1, ACY38592.1, ACY38591.1, ACY38590.1, ACX81315.1, ACX81314.1,
XP_001868729.1, XP_001847517.1, XP_001847515.1, XP_002502575.1 , ACU20370.1, ACU18073.1, XP_002523348.1, XP_002516707.1 , XP_002429016.1 , BAH89673.1,
XP_002440221.1, XP_002459294.1 , XP_002458560.1 , XP_320167.4, XP_001780431.1, XP_002364905.1, XP_002263196.1, XP_002263137.1, XP_002263409.1, XP_002263252.1, XP_002268615.1, XP_002278404.1, XP_002274522.1, XP_002282418.1, XP_001633379.1, XP_001632267.1, XP_001632004.1, XP_001622638.1 , XP_002155609.1 , XP_759225.1,
XP_002152406.1, XP_001914129.1, XP_001738032.1 , XP_001731626.1, XP_001209859.1 , CAN79451.1, CAN78449.1, CAN72806.1, CAN71951.1, CAN71950.1, CAN76656.1,
CAN62907.1 , AAZ08051.1 , ABO21022.1 , ABO21021.1 , ABO21020.1 , ABJ96321.1 ,
BAF01088.1, XP_758106.1, BAC42871.1, BAB09801.1, BAB09102.1, insbesondere
YP_045555.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 22) und NP_808414.2
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Ev generell insbesondere die Umwandlung von Dodecanoyl-CoA-Thioester und/oder Dodecanoyl-ACP-Thioester mit Methanol zu Dodecanoyl-Methylester verstanden wird.
Handelt es sich bei dem Enzym Ev um eine Alkohol-O-Acyltransferase der EC 2.3.1.84, so ist es bevorzugt, dass diese ausgewählt sind aus: EGA72844.1 , NP_015022.1 , S69991 , AAP72991.1 , EDN63695.1 , BAA05552.1 , AAP72992.1 , S69992, AAP72995.1 , XP_002552712.1 , XP_001646876.1 , XP_002551954.1 , EGA82692.1 , EDN61766.1 , EGA86689.1 , EGA74966.1 , AAU09735.1 , NP_01 1693.1 , XP_445666.1 ,
BAA13067.1 , AAP72993.1 , EGA62172.1 , XP_455762.1 , EGA58658.1 ,
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der
Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Ev generell insbesondere die Umwandlung von Dodecanoyl-CoA-Thioester mit Methanol zu Dodecanoyl-Methylester verstanden wird. Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung dritte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnische Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
Die WO2007136762 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 2 bis 4 und 21 bis 24, den
Abbildungen 2 bis 4, den Ausführungsbeispielen 1 , 2 und 5 bis 7 sowie den Ansprüchen 1 , 2, 5, 6, 9 bis 27 und 33 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine dritte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester,
Kohlenwasserstoffe und Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ev und deren Sequenzen insbesondere auf den Seiten 21 bis 24, in der Tabelle 10 und der Abbildung 10.
Bestimmte Enzyme Evi
In erfindungsgemäß bevorzugten Zellen stellt das Enzym Evi eines dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus YP_001724804.1 (kodiert durch SEQ ID NR: 21 )
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber der vorgenannten Bezugssequenz durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der
entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Evi generell insbesondere die Synthese von Dodecanoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
Bestimmte Enzyme Evii
Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung dritte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnische Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden. Die WO2010075483 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0061 ] bis [0090] und
[0287] bis [0367], den Abbildungen 1 , 4 und 5, den Ausführungsbeispielen 1 bis 38 sowie den Ansprüchen 18 bis 26 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine dritte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren, Fettsäuremethylester,
Fettsäureethylester, Fettalkohole, Fettalkyl-Acetate, Fettaldehyde, Fettamine, Fettamide, Fettsulfate, Fettether, Ketone, Alkane, interne und terminale Olefine, Dicarbonsäuren, α,ω- Dicarbonsäuren und α,ω-Diole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Evii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0012] bis [0060], den Tabellen 7, 17, 26 und 27, den Abbildungen 1 , 44 bis 47 und 55 bis 59, den Ausführungsbeispielen 1 bis 38 sowie den Ansprüchen 1 bis 17.
Vierte gentechnische Modifikation für die Herstellung von co-hydroxy- oder co-oxo- funktionalisierten Carbonsäuren bzw. -Estern
Für den Fall, dass die Herstellung von co-hydroxy- oder co-oxo-funktionalisierten Carbonsäuren bzw. -Estern - auch als Vorläuferstufe für weitere co-Funktionalisierungen wie beispielsweise co- Aminierung - gewünscht ist, kann es vorteilhaft sein, die entsprechenden Carbonsäuren bzw. - Ester, welche im Mikroorganismus in co-Stellung bis zur Carboxy-Funktion oxidiert wurden, entsprechend enzymatisch zu reduzieren.
Dazu weisen erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen eine vierte gentechnische
Modifikation auf, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des
Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme umfasst, ausgewählt aus der Gruppe
Eüb Acyl-CoA (Coenzym A):ACP (Acyl Carrier Protein)-!" ransacylase, welche einen ACP- Thioester in einen CoA-Thioester bzw. einen CoA-Thioester in einen ACP-Thioester umwandelt, Evi Acyl-CoA (Coenzym A)-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1.3, welche bevorzugt die Synthese eines Acyl-Coenzym A-Thioesters katalysiert, Eviü Acyl-CoA (Coenzym A)-Reduktase, bevorzugt der EC 1.2.1 .42 oder EC 1 .2.1.50, welche bevorzugt die Reduktion eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Alkan-1 -al oder Alkan-1 -ol katalysiert
Eix Fettsäurereduktase (auch Fettaldehyd-Dehydrogenase oder Arylaldehyd- Oxidoreduktase), bevorzugt der EC 1 .2.1.3, EC 1 .2.1 .20 oder EC 1.2.1 .48, welche bevorzugt die Reduktion einer Alkansäure zum entsprechenden Alkan-1 -al katalysiert, und
Ex Acyl-ACP (Acyl Carrier Protein)-Reduktase, bevorzugt der EC 1 .2.1 .80, welche bevorzugt die Reduktion eines Acyl-ACP-Thioesters zum entsprechenden Alkan-1 -al oder Alkan-1 -ol katalysiert.
In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die vierte gentechnische Modifikation Kombinationen an gesteigerten Aktivitäten der Enzyme ausgewählt aus
Eviii, Ejx, Ex, EVjEVjjj, EVjExEjjb
umfasst.
Bevorzugte Enzyme Eiib in Zusammenhang mit der vierten gentechnischen Modifikation entsprechen den oben als bevorzugt herausgestellten Enzymen Eiib in Zusammenhang mit der ersten und dritten gentechnischen Modifikation. Derart gestaltete, bevorzugte erfindungsgemäße Organismen sind ebenfalls hervorragend zur Herstellung von Verbindung geeignet, welche ausgewählt sind aus
α,ω-Alkandiole, α,ω-Alkandialdehyde, α-Οχο-ω-Hydroxyalkane und α,ω-Alkandiamine, α,ω-Alkendiole, α,ω-Alkendialdehyde, α-Οχο-ω-Hydroxyalkene und α,ω-Alkendiamine, da Verbindungen dieser Klassen neben den ω-funktionalisierten Carbonsäuren und ω- funktionalisierten Carbonsäure-Estern in signifikanten Mengen produziert werden.
In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass die Alken-Derivate insbesondere durch die Umsetzung von durch den Mikroorganismus gebildeten, ungesättigten Fettsäuren, wie etwa Palmitoleinsäure, Ölsäure, Linolsäure, a-Linolensäure, γ-Linolensäure entstehen.
Bestimmte Enzyme E™ Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung vierte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnische Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
Die WO201 1008565 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0021], [0103] bis [0106], [0108] und [0129] erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr
Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäuren, Fettaldehyde, Fettalkohole, Alkane und Fettsäure-Ester aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0104] bis [0106] sowie [0108] und [0129] und dem
Ausführungsbeispiel 1 1 .
Die WO2008151 149 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0009], [0015] bis [0037], [0053], [0071 ], [0171 ], [0174] bis [0191 ], [0274] und [0396], den Ansprüchen 53 bis 1 14, 188 bis 206 und 344 bis 355 sowie den Tabellen 1 bis 3 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0255] bis [0261] und [0269] sowie Tabellen 6 und 7.
Die WO2007136762 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 2 bis 4 und 19 bis 20, den Abbildungen 2 bis 4, den Ausführungsbeispielen 2 bis 7 sowie den Ansprüchen 4, 8 bis 27 und 33 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Kohlenwasserstoffe und
Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen insbesondere auf den Seiten 19 bis 20, in der Tabelle 10 und der Abbildung 10.
Die WO201 1019858 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0015] bis [0020], [0064] bis [0074], [0085] bis [0086] und [0092] bis [0099], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13, der Abbildung 1 und den Ansprüchen 1 bis 14 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen insbesondere in den
Abschnitten [0004] bis [0007] und [0075] bis [0080] sowie den Ausführungsbeispielen 1 bis 13. Die WO2009140695 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0031] bis [0040], [0051] und [0214] bis [0233], den Ausführungsbeispielen 22 bis 24, der Tabelle 1 , der Abbildung 40, den Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie den Ansprüchen 29 bis 30
erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Kohlenwasserstoffe, aus mindestens einer einfachen
Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0023] bis [0030], [0056], [0066] bis [0069] und [0193] bis [0208], der Tabelle 1 , der Abbildung 39, den
Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie den Ansprüchen 69 bis 74.
Die WO201 1008535 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0023] bis [0024], und [0133] bis [0158], der Abbildung 13, den Ansprüchen 39 und 45 bis 47 sowie den
Ausführungsbeispielen 1 bis 5 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0017] bis [0022], [0084] bis [0132], den Abbildungen 2 bis 12, den Ansprüchen 31 bis 37 und 40 bis 44 sowie den Ausführungsbeispielen 1 bis 5.
Die WO2010063031 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0007], [0092] bis [0100], [0181 ] bis [0183] und [0199] bis [0213] erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte
Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0191 ] bis [0194] sowie Tabellen 4 und 5. Die WO2010063032 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0007], [0092] bis [0100], [0181 ] bis [0183] und [0199] bis [0213] erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr mikrobielles Öl aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eviii und deren Sequenzen in insbesondere den Abschnitten [0191 ] bis [0194] sowie Tabellen 4 und 5.
Bestimmte Enzyme Eix
Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung vierte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnische Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
Die WO201 1019858 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0004] bis [0008], [0064] bis [0074], [0085] bis [0086], [0095] bis [0099], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13, der
Abbildung 1 und dem Anspruch 7 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eix und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0008] bis [0009], [0074] und [0081 ] bis [0082] sowie den Ausführungsbeispielen 1 bis 13.
Die WO2010135624 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0005], [0067] bis [0085] und [0092] bis [0102], den Ansprüchen 13 bis 17 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 4 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eix und deren Sequenzen insbesondere in den
Abschnitten [0005] bis [0006] und [0086] bis [0090], den Abbildungen 3 bis 7, dem Anspruch 28 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 4.
Die WO2010062480 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0022] bis [0174] und [0292] bis [0316], den Ausführungsbeispielen 1 und 3 bis 8, der Abbildung 9 sowie den Ansprüchen 17 und 24 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eix und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0019] bis [0032] und
[0263] bis [0286], der Tabelle 1 , den Abbildungen 6 bis 8 sowie den Ausführungsbeispielen 1 und 3 bis 8.
Die WO201042664 A2 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0236] bis [0261 ], dem Ausführungsbeispiel 2, der Abbildung 1 und 5 sowie dem Anspruch 25 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Eix und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [021 1 ] bis [0233], den Abbildungen 2 bis 4 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 2.
Bestimmte Enzyme Ex Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung vierte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnische Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
Die WO2007136762 A2 beschreibt insbesondere auf den Seiten 2 bis 4 und 19 bis 20, den
Abbildungen 2 bis 4, den Ausführungsbeispielen 2 bis 7 sowie den Ansprüchen 4, 8 bis 27 und 33 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und
Fettsäurederivate, insbesondere Fettsäure-Ester, Wachsester, Kohlenwasserstoffe und
Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ex und deren Sequenzen insbesondere auf den Seiten 19 bis 20, in der Tabelle 10 und der Abbildung 10. Die WO201 1019858 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0015] bis [0020], [0064] bis [0074], [0085] bis [0086] und [0092] bis [0099], den Ausführungsbeispielen 1 bis 13, der Abbildung 1 und den Ansprüchen 1 bis 14 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte
Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Fettalkohole, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ex und deren Sequenzen insbesondere in den
Abschnitten [0004] bis [0007] und [0075] bis [0080] sowie den Ausführungsbeispielen 1 bis 13. Die WO2009140695 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0031] bis [0040], [0051] und [0214] bis [0233], den Ausführungsbeispielen 22 bis 24, der Tabelle 1 , der Abbildung 40, den Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie dem Anspruch 29 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Kohlenwasserstoffe, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ex und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0023] bis [0030], [0056], [0066] bis [0069] und [0193] bis [0208], der Tabelle 1 , der Abbildung 39, den Ausführungsbeispielen 5 bis 24 und 28 bis 30 sowie den Ansprüchen 69 bis 74.
Die WO201 1008535 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0023] bis [0024], und [0133] bis [0158], der Abbildung 13, den Ansprüchen 39 und 45 bis 47 und dem
Ausführungsbeispielen 1 bis 5 erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Mikroorganismen, die eine vierte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Carbonsäuren, Hydroxy-Carbonsäuren und deren Lactone aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Ex und deren Sequenzen insbesondere in den Abschnitten [0017] bis [0022], [0084] bis [0132], den Abbildungen 2 bis 12, den Ansprüchen 31 bis 37 und 40 bis 44 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 5.
Fünfte gentechnische Modifikation zur Unterdrückung des Abbaus von Carbonsäuren- und Carbonsäurederivaten Erfindungsgemäß sind darüber hinaus Mikroorganismen bevorzugt, die eine fünfte gentechnische Modifikation aufweisen, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus verminderten Aktivität mindestens eines der Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe
Ea Acyl-CoA-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1.3, welche die Synthese eines Acyl- Coenzym A-Thioesters katalysiert,
Eb Acyl-CoA-Dehydrogenase, bevorzugt der EC 1 .3.99.-, EC 1.3.99.3, oder EC 1 .3.99.13, welche die Oxidation eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Enoyl-Coenzym A-Thioester katalysiert,
Ec Acyl-CoA-Oxidase, bevorzugt der EC 1.3.3.6, welche die Oxidation eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Enoyl-Coenzym A-Thioester katalysiert,
Ed Enoyl-CoA-Hydratase, bevorzugt der EC 4.2.1 .17 oder EC 4.2.1.74, welche die
Hydratisierung eines Enoyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden 3-Hydroxyacyl- Coenzym A-Thioester katalysiert,
Ee 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, bevorzugt der EC 1.1.1.35 oder EC 1.1.1 .21 1 , welche die Oxidation eines 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden 3- Oxoacyl-Coenzym A-Thioester katalysiert und
Ef Acetyl-CoA-Acyltransferase, bevorzugt der EC 2.3.1 .16, welche den Transfer eines Acetylrestes von einem 3-Oxoacyl-Coenzym A-Thioester auf Coenzym A überträgt und somit ein um zwei Kohlenstoffatome verkürzten Acyl-Coenzym A-Thioester erzeugt,
umfasst.
Dies hat den technischen Effekt, dass der Abfluss der durch die erste gentechnische
Modifikation vermehrt gebildeten Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, aber auch der durch die zweite, dritte und vierte gentechnische Modifikation vermehrt gebildeten ω-funktionalisierten Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, unterbunden wird.
Bestimmte Enzyme Ea
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in den erfindungsgemäßen Zellen das Enzym Ea eines darstellt, welches die Sequenz umfasst NP_416319.1. sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber der vorgenannten Bezugssequenz durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der
entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Ea generell insbesondere die Synthese von Dodecanoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
Bestimmte Enzyme Eb
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in den erfindungsgemäßen Zellen das Enzym Eb eines darstellt, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
AP_000876.1 , ZP_08341828.1 , YP_002291517.1 , ZP_08393771 .1 , EFW53921.1 ,
YP_003227327.1 , YP_001461409.1 , AEG35025.1 , YP_002385739.1 , EGJ00024.1 ,
ZP_08352177.1 , ZP_03070250.1 , ZP_08367389.1 , EGM63466.1 , CBI99746.1 ,
ZP_06660773.1 , ZP_08372569.1 , YP_309282.2, YP_001879017.1 , YP_003497883.1 ,
ACI71032.1 , YP_002406464.1 , EGB79412.1 , EFZ76765.1 , ZP_07145000.1 , ZP_07151031 .1 , AAZ87047.1 , EFZ56676.1 , ZP_06656148.1 , EGB35012.1 , EGB71054.1 , EFW49392.1 , ZP_07183316.1 , YP_002396328.1 , YP_002327805.1 , ZP_03027602.1 , AAG54546.1 ,
YP_001742341.1 , ZP_04538240.1 , EFX12717.1 , ACI71029.1 , NP_285938.2, ZP_03064986.1 , ZP_07120505.1 , YP_539295.2, ZP_03049609.1 , ZP_06652178.1 , AAP 15817.1 , NP_706224.3, ABI99723.1 , EGB60663.1 , EFW7191 1 .1 , EGH38574.1 , YP_668186.1 , EGK29152.1 ,
EGC05203.1 , ZP_02801 146.2, YP_687886.1 , ZP_08346491.1 , EGJ94671.1 , EGC94003.1 , ZP_08362542.1 , YP_002381459.1 , AAN78852.1 , NP_752308.2, ZP_07173894.1 , ZP_08357265.1, ZP_08382276.1, ZP_02902298.1, ZP_04560694.1, ZP_06354226.1,
CBY94356.1, NP_459307.1, EGE28353.1 , ZP_04657138.1 , YP_002225434.1 ,
YP_002635948.1, YP_151638.1, ZP_02663643.1, NP_454921.1 , YP_004729161.1 ,
YP_215297.1, YP_001454506.1 , YP_001571699.1, YP_003363866.1 , EGK30199.1,
EGJ91900.1, EGK28208.1 , ZP_08497358.1 , CBK85993.1 , YP_003611563.1 ,
YP_004592567.1, YP_003441061.1 , YP_002240296.1 , YP_002917946.1 , ZP_06549304.1 , ZP_06017126.1, YP_001333918.1, AAM28523.1 , ZP_08305363.1 , YP_001439185.1 ,
EGL74026.1 , YP_001175495.1 , ZP_05968792.1 , YP_003209204.1 , YP_003943022.1 , YP_004499335.1, ZP_06191708.1 , YP_001477183.1 , ZP_07951567.1, YP_003740265.1 , NP_668276.1, ZP_04637564.1, ZP_04631714.1, CBY26031.1, YP_004297237.1,
YP_001007400.1, ZP_04625511.1, YP_069424.1, ZP_04616432.1, ZP_04639135.1,
YP_001871363.1, ZP_04620883.1, ZP_06636999.1, ZP_07377275.1, YP_003929932.1, YP_001722031.1, ZP_04614013.1 , ZP_04628476.1 , YP_003713213.1, YP_003530236.1 , CBX79727.1 , YP_004114694.1 , YP_001908526.1 , ADP11689.1 , YP_002649711.1,
YP_003469212.1, YP_003519171.1 , YP_051564.1, ZP_03833764.1 , ZP_03827249.1 ,
NP_928504.1, YP_004211704.1, ZP_07681706.1, YP_003018849.1, YP_003260788.1, YP_003042091.1, ZP_05973896.1, ZP_03317495.1, ZP_02958330.2, EFW60358.1,
EGI98786.1, ZP_06127315.2, YP_002150121.1, ZP_03842196.1 , YP_003884303.1 ,
YP_003003248.1, YP_003334792.1, ZP_03379559.1, CBA73629.1, YP_002986552.1, ZP_06538530.1, ZP_01258771.1 , ZP_04921840.1 , ZP_06180371.1, ZP_08308836.1 ,
ZP_06174994.1, YP_001446380.1 , ZP_01237449.1 , ZP_01161468.1 , ZP_01222040.1 , ZP_06038476.1, ZP_05925639.1 , ZP_06154677.1 , ZP_02195704.1, ZP_01989646.1,
ZP_01868523.1, YPJ31060.1, ZP_05722161.1 , ZP_05716057.1, NP_798668.1, EGF45205.1, ZP_05120764.1, EGR07881.1 , ZP_08100412.1 , ZP_04919383.1 , ZP_06054287.1 ,
YP_002156761.1, YP_205315.2, ZP_04961417.1, ZP_06050299.1, ZP_08103013.1,
ZP_01949008.1, NP_231862.1, AEA79156.1, ZP_06081122.1, ZP_04418155.1,
YP_001217747.1, ZP_04413631.1, NP_935312.1 , ZP_01977990.1 , NP_760770.1,
YP_004188005.1, YP_002810906.1 , ZP_05884155.1 , ZP_05946273.1 , ZP_01065180.1 , ZP_01815735.1 , YP_002417909.1 , YP_002263750.1 , YP_856109.1 , ZP_07744057.1 ,
ZP_08520214.1, ZP_06034047.1 , YP_004565576.1 , ZP_05881167.1 , ZP_00991316.1, YP_734276.1 , ADT86286.1 , YP_001142550.1 , YP_869958.1 , ZP_08566610.1 ,
ZP_05876732.1, YP_001366225.1 , YP_001094233.1, ADV54653.1, YP_963612.1, YP_738268.1, YP_001502248.1 , ΥΡ_004391846.1 , ΥΡ_002311644.1 , ΥΡ_002358241.1 , ΥΡ_001050670.1, ΖΡ_07390237.1 , ΥΡ_001674114.1, ΥΡ_001554497.1, ΝΡ_718122.1, ΥΡ_001760976.1 , ΥΡ_927745.1 , ΥΡ_562771.1 , ΥΡ_003557130.1 , ΖΡ_02159449.1 ,
ΥΡ_003913548.1, ΥΡ_001473736.1, ΥΡ_750554.1, ΖΡ_01897495.1, ΥΡ_268985.1,
ΖΡ_01042474.1, ΖΡ_08570996.1 , ΥΡ_004427315.1 , ΖΡ_07010199.1 , ΥΡ_156047.1,
ΖΡ_07097521.1 , ΥΡ_004467113.1 , ΖΡ_01614110.1, ΥΡ_340459.1 , ΥΡ_004434754.1 ,
ΥΡ_662062.1 , ΥΡ_004068195.1 , ΖΡ_08409704.1 , ΖΡ_08622396.1 , ΖΡ_01135962.1 ,
ΖΡ_03560927.1, ΖΡ_04716612.1, EGB41427.1, EGP48304.1, EFV84045.1 , ΖΡ_08505249.1 , ΖΡ_06688896.1, ΥΡ_003980530.1 , ΥΡ_003168652.1 , ΥΡ_003146346.1 , ΥΡ_001250478.1 , ΥΡ_095752.1, ΥΡ_124009.1, CBW99992.1, ΥΡ_284763.1, ΥΡ_127029.1, ΥΡ_746940.1, ΖΡ_07663653.1, ΖΡ_03349444.1 , ΥΡ_002354470.1 , ΥΡ_004145615.1, ΥΡ_003524477.1 , ΖΡ_03698069.1, ΥΡ_003376672.1 , ΖΡ_06188282.1 , EFW81359.1, EGH83675.1, EGH67821.1, EFW83732.1, ΥΡ_273865.1, ΝΡ_902393.1 , ΖΡ_06457469.1 , EGH99235.1 , ΖΡ_03397893.1 , ΖΡ_07004262.1, ΖΡ_06732661.1 , ΖΡ_07263971.1 , EGH75297.1, ΝΡ_888341.1, EGH31566.1, EGH45251.1, ΝΡ_643363.1, EGH24154.1, EGH92666.1, EGH73945.1, EGH12424.1,
ΝΡ_793629.1 , ΖΡ_06705890.1 , ΥΡ_234714.1 , EGH62932.1 , EGH52925.1 , ΖΡ_01126966.1 , ΝΡ_841588.1, ΖΡ_05109483.1, ΥΡ_003847638.1, ΥΡ_004294524.1, ΖΡ_02244088.1,
ΝΡ_884586.1, ΖΡ_08176463.1, ΖΡ_04588788.1 , ΥΡ_450732.1, ΖΡ_08185386.1 ,
ΥΡ_001914265.1, ΥΡ_003527565.1, ΥΡ_004696148.1, ΝΡ_638218.1 , ΖΡ_05046817.1 , ΥΡ_343737.1, ΖΡ_07652844.1, ΥΡ_004227922.1, ΥΡ_364921.1, ΥΡ_001632020.1,
ΝΡ_744048.1 , ΥΡ_001898007.1 , ΥΡ_003145987.1 , ΥΡ_558241.1 , ΥΡ_410795.1 ,
ΥΡ_001895310.1, ΥΡ_002980410.1, ΖΡ_06841648.1, ΥΡ_258889.1, ΥΡ_931967.1,
ΥΡ_003760619.1, ΥΡ_002029446.1, ΥΡ_004474743.1, YPJ58312.1, ΥΡ_004380764.1, ΥΡ_001973352.1 , CBJ39115.1 , ΥΡ_349912.1 , ΥΡ_003753442.1 , ΖΡ_05135288.1 ,
ΥΡ_004700980.1 , ΥΡ_927690.1 , ΥΡ_001269130.1 , ΥΡ_742956.1 , ADR61321.1 ,
ΥΡ_001347709.1, ΥΡ_004355482.1, ΥΡ_003907207.1, ΝΡ_251505.1 , ΖΡ_04929120.1 , ΝΡ_518658.1, ΥΡ_002871500.1, ΖΡ_01451059.1, EGM21899.1 , ΥΡ_001187411.1 ,
ΖΡ_08570514.1, ΖΡ_07794119.1, ΥΡ_004391835.1 , ΥΡ_002256385.1 , ΖΡ_07774414.1 , ΥΡ_855885.1 , ΥΡ_563120.1 , ΥΡ_001172167.1 , ΥΡ_004713921.1 , ΖΡ_08138366.1 ,
ΑΕΑ83572.1 , ΥΡ_003746704.1 , ΖΡ_08521441.1, ΖΡ_05061205.1, ΥΡ_001667709.1,
ΥΡ_750573.1 , ΥΡ_607261.1 , ΖΡ_05118288.1 , ΥΡ_002311716.1 , ΝΡ_718079.1 , YP_003777020.1, ZP_06052248.1, ZP_00943163.1, ZP_08309312.1, AEG70141.1,
YP_001748377.1 , YP_001857928.1 , YP_001094176.1 , YP_003604813.1 , ZP_01947893.1 , insbesondere
EFW81359.1, EGH83675.1, EGH67821.1, EFW83732.1 , YP_273865.1 , ZP_06457469.1 , EGH99235.1, ZP_03397893.1 , ZP_07004262.1 , ZP_07263971.1 , EGH75297.1, EGH31566.1, EGH45251.1, EGH24154.1, EGH92666.1, EGH73945.1, EGH12424.1, NP_793629.1,
YP_234714.1, EGH62932.1, EGH52925.1 , ZP_04588788.1 , NP_744048.1 , YP_258889.1 , YP_004474743.1, YP_004380764.1 , YP_349912.1, YP_004700980.1 , YP_001269130.1, ADR61321.1 , YP_001347709.1 , YP_004355482.1 , NP_251505.1 , ZP_04929120.1 ,
YP_002871500.1 , EGM21899.1 , YP_001187411.1, ZP_07794119.1 , ZP_07774414.1 ,
YP_001172167.1, YP_004713921.1 , ZP_08138366.1 , AEA83572.1, YP_001667709.1, YP_607261.1 , YP_001748377.1 , YP_260045.1 , YP_002873091.1 , ZP_07775826.1 ,
CAC34855.1, EGH11916.1 , ZP_05641615.1 , ZP_06480669.1 , ZP_06480668.1 ,
ZP_05641616.1, ZP_06492823.1 , ZP_06492821.1 , EGH11920.1, EGH25319.1,
ZP_06492824.1 , ADX52254.1 , AP_000876.1 , ZP_08341828.1 , YP_002291517.1 ,
YP_003227327.1, YP_001461409.1 , AEG35025.1, YP_002385739.1 , ZP_08352177.1, ZP_03070250.1, ZP_08367389.1, CBI99746.1, ZP_06660773.1, ZP_08372569.1,
YP_003497883.1 , ACI71032.1 , YP_002406464.1 , EGB79412.1 , EFZ76765.1 , ZP_07145000.1 , ZP_07151031.1, EFZ56676.1 , ZP_06656148.1 , EGB35012.1, EGB71054.1, ZP_07183316.1, YP_002396328.1, YP_002327805.1, ZP_03027602.1, AAG54546.1, YP_001742341.1, ABE05764.1, EFX12717.1, ACI71029.1, NP_285938.2, ZP_07120505.1 , YP_539295.2, ZP_03049609.1, ZP_06652178.1, ABI99723.1, EGB60663.1, EFW71911.1, EGH38574.1, YP_668186.1 , ZP_02801146.2, ZP_08346491.1 , ZP_08362542.1 , AAN78852.1 , NP_752308.2, ZP_07173894.1, ZP_08357265.1 , ZP_08382276.1 , AAM28523.1 , ZP_07097521.1 ,
EGB41427.1, EGB41426.1, BAA07583.1 , ZP_07100038.1 , CAX20347.1
und besonders bevorzugt
NP_744048.1, YP_004700980.1, YP_001269130.1, ADR61321.1, YP_001667709.1,
YP_001748377.1, YP_258889.1, YP_349912.1, YP_002871500.1 , ZP_07774414.1 ,
YP_260045.1 , YP_002873091.1 , ZP_07775826.1 , CAC34855.1 , YP_001172167.1 ,
YP_004713921.1, AEA83572.1, AP_000876.1, BAA07583.1 , ZP_07594808.1.
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der
Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Eb generell insbesondere die Oxidation von Dodecanoyl-CoA-Thioester zu 2- Dodecenoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
Bestimmte Enzyme Ec
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in den erfindungsgemäßen Zellen das Enzym Ec eines darstellt, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
YP_003571780.1 , YP_445820.1 , YP_634556.1 , YP_004665862.1 , ZP_01461690.1 ,
YP_921666.1 , YP_002778910.1 , ZP_08550394.1 , YP_003384289.1 , YP_001 195727.1 , YP_702012.1 , ZP_04384437.1 , YP_0027651 10.1 , ZP_04996322.1 , ZP_08195144.1 ,
ZP_04700546.1 , YP_954595.1 , YP_004736804.1 , ADW07059.1 , YP_001827916.1 ,
ZP_04691466.1 , YP_001 109453.1 , ZP_08240125.1 , YP_003272226.1 , YP_004053469.1 , ZP_06272176.1 , YP_004491616.1 , YP_001 133991 .1 , YP_001071715.1 , YP_290295.1 , YP_003193744.1 , YP_001704317.1 , YP_004008413.1 , YP_004655806.1 , YP_640598.1 , ZP_08153802.1 , ZP_00995173.1 , ZP_05225674.1 , YP_888747.1 , YP_0031 141 1 1.1 ,
YP_004522832.1 , ZP_06848773.1 , ZP_08203814.1 , YP_001851901 .1 , EGO40578.1 , YP_003134974.1 , ZP_07282448.1 , YP_003770185.1 , YP_881295.1 , YP_004336131.1 , NP_961035.1 , YP_004164861 .1 , YP_003681 133.1 , ZP_04749633.1 , ZP_07718288.1 ,
ZP_01201898.1 , YP_004223976.1 , YP_1 18690.1 , YP_905275.1 , BAE47462.1 , YP_831622.1 , YP_003407476.1 , ZP_01 129477.1 , YP_003645654.1 , YP_004454693.1 , YP_002487953.1 , YP_004084231.1, YP_003836912.1, YP_004241154.1, ZP_07706098.1, YP_001855531.1, ΖΡ_08124588.1 , ΥΡ_947882.1 , ΒΑΕ47461.1 , ΥΡ_003327670.1 , ΥΡ_001363757.1 ,
ΥΡ_004601796.1, ΥΡ_001625220.1, ΥΡ_003638017.1, ΖΡ_06501585.1, ΥΡ_004404736.1, ΥΡ_062974.1, ΥΡ_002957230.1 , ΥΡ_003316209.1 , ΥΡ_003149881.1 , ΥΡ_001221553.1 , ΥΡ_003162313.1, ΖΡ_03978917.1, ΥΡ_001708860.1, ΖΡ_05912043.1, ΖΡ_06806059.1, ΥΡ_003155732.1, ΥΡ_002835700.1,ΥΡ_003916799.1, ΖΡ_03936415.1, ΖΡ_07090640.1, ΖΡ_08516453.1 , ΑΑΒ97825.1 , ΥΡ_004541029.1 , ΥΡ_004606508.1 , ΥΡ_001801238.1 , ΖΡ_07989876.1, ΥΡ_004761186.1, ΥΡ_002883572.1, ΖΡ_08023616.1, ΖΡ_05847263.1, ΥΡ_251740.1, ΖΡ_03394212.1, ΥΡ_001107648.1 , ΥΡ_002872770.1 , ΥΡ_001821654.1, ΖΡ_08233739.1 , AAD12170.1 , ΖΡ_08215859.1 , AAD40800.1 , ΖΡ_05005905.1 , ADW07311.1, ΥΡ_348592.1 , ΝΡ_824883.1 , ΝΡ_627459.1 , ΥΡ_001828149.1 , ΖΡ_05525554.1 ,
ΖΡ_08240364.1, ΖΡ_07299658.1 , ΖΡ_06582153.1, ΖΡ_06921827.1 , ΖΡ_04703961.1 , BAJ27090.1, ΖΡ_06592678.1, ΖΡ_04691265.1 , ΥΡ_001751500.1, BAJ31579.1,
bevorzugt ΥΡ_003571780.1, ΥΡ_445820.1, ΥΡ_634556.1, ΥΡ_004665862.1, ΖΡ_01461690.1 , ΥΡ_921666.1, ΥΡ_002778910.1, ΖΡ_08550394.1 , ΥΡ_003384289.1 , ΥΡ_001195727.1, ΥΡ_702012.1 , ΖΡ_04384437.1 , ΥΡ_002765110.1 , ΖΡ_04996322.1 , ΖΡ_08195144.1 ,
ΖΡ_04700546.1, ΥΡ_954595.1, ΥΡ_004736804.1, ADW07059.1, ΥΡ_001827916.1,
ΖΡ_04691466.1, ΥΡ_001109453.1, ΖΡ_08240125.1 , ΥΡ_003272226.1 , ΥΡ_004053469.1 , ΖΡ_06272176.1, ΥΡ_004491616.1 , ΥΡ_001133991.1, ΥΡ_001071715.1 , ΥΡ_290295.1, ΥΡ_003193744.1, ΥΡ_001704317.1, ΥΡ_004008413.1 , ΥΡ_004655806.1 , ΥΡ_640598.1, ΖΡ_08153802.1 , ΖΡ_00995173.1 , ΖΡ_05225674.1 , ΥΡ_888747.1 , ΥΡ_003114111.1,
ΥΡ_004522832.1, ΖΡ_06848773.1 , ΖΡ_08203814.1 , ΥΡ_001851901.1, EGO40578.1, ΥΡ_003134974.1 , ΖΡ_07282448.1 , ΥΡ_003770185.1 , ΥΡ_881295.1 , ΥΡ_004336131.1 , ΝΡ_961035.1, ΥΡ_004164861.1 , ΥΡ_003681133.1 , ΖΡ_04749633.1 , ΖΡ_07718288.1, ΖΡ_01201898.1, ΥΡ_004223976.1, ΥΡ_118690.1, ΥΡ_905275.1, ΒΑΕ47462.1 , ΥΡ_831622.1 , ΥΡ_003407476.1, ΖΡ_01129477.1, ΥΡ_003645654.1, ΥΡ_004454693.1, ΥΡ_002487953.1, ΥΡ_004084231.1, ΥΡ_003836912.1, ΥΡ_004241154.1, ΖΡ_07706098.1, ΥΡ_001855531.1, ΖΡ_08124588.1, ΥΡ_947882.1, ΒΑΕ47461.1, ΥΡ_003327670.1, ΥΡ_001363757.1,
ΥΡ_004601796.1, ΥΡ_001625220.1 , ΥΡ_003638017.1 , ΖΡ_06501585.1 , ΥΡ_004404736.1 , ΥΡ_062974.1, ΥΡ_002957230.1 , ΥΡ_003316209.1 , ΥΡ_003149881.1 , ΥΡ_001221553.1 , ΥΡ_003162313.1, ΖΡ_03978917.1 , ΥΡ_001708860.1 , ΖΡ_05912043.1 , ΖΡ_06806059.1 , ΥΡ_003155732.1, ΥΡ_002835700.1 , ΥΡ_003916799.1 , ΖΡ_03936415.1 , ΖΡ_07090640.1 , ZP_08516453.1 , AAB97825.1 , YP_004541029.1 , YP_004606508.1 , YP_001801238.1 , ZP_07989876.1 , YP_004761 186.1 , YP_002883572.1 , ZP_08023616.1 , ZP_05847263.1 , YP_251740.1 ,
und besonders bevorzugt YP_002835700.1 , ZP_03936415.1 , BAE47461 .1 , YP_001801238.1 , ZP_03978917.1 , ZP_03394212.1 , ZP_05847263.1 , ZP_08516453.1 , YP_004606508.1 , YP_251740.1 , ZP_07090640.1 , ZP_07989876.1 , YP_004761 186.1 ,
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Ec generell insbesondere die Oxidation von Dodecanoyl-CoA-Thioester zu 2- Dodecenoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
Bestimmte Enzyme Ed und Ee Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in den erfindungsgemäßen Zellen das Enzym Ed oder Ee eines darstellt, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
ZP_07164313.1 , N P_418288.1 , YP_003231641 .1 , EGM59778.1 , EFZ53307.1 , AAA23750.1 , ZP_07192215.1 , YP_001460638.1 , YP_001727088.1 , EGK16564.1 , ZP_08380619.1 ,
ZP_07136310.1 , CAB40809.1 , NP_839030.1 , ZP_07690617.1 , EGC97039.1 , ZP_07103516.1 , ZP_03027888.1 , ZP_07121980.1 , YP_002414996.1 , EGP22873.1 , EGJ82677.1 , EGB59499.1 , ZP_071 18761.1 , YP_002409078.1 , YP_002295407.1 , EGE62412.1 , EGB69560.1 ,
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ZP_04873109.1, CBJ03626.1 , ZP_08366395.1 , ZP_03066301.1 , BAI57243.1,
YP_001465330.1, YP_405325.1, NP_312801.1, EGI89589.1, EGC09628.1, EFW73050.1, ZP_07221474.1, EGB39932.1, EFW72281.1, ZP_07154547.1 , YP_002331616.1, EGB76756.1, EFZ75005.1, ZP_07449248.1, NP_756652.2, ZP_04006347.1 , NP_290476.1, EGH36687.1, YP_671920.1, ZP_08350773.1, EGC05062.1 , ZP_07174622.1 , CAP78309.1 , ZP_08361145.1 , YP_002400350.1, ZP_08386169.1, EFU60028.1 , ZP_02904283.1 , YP_859447.1 ,
YP_543379.2, NP_462868.1, ZP_02663494.1, ACY91152.1, ZP_03221347.1,
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Q668V1.2, ΥΡ_463621.1 , ΖΡ_05032523.1 , ΥΡ_363100.1 , ΥΡ_002490860.1 , ΥΡ_071146.1 , ΥΡ_003527951.1, ΥΡ_004615064.1 , ΖΡ_06702935.1 , ΥΡ_003277339.1 , ΖΡ_06729873.1 , ΥΡ_004552309.1 , ΖΡ_08178119.1 , ΥΡ_558747.1 , ΥΡ_003059322.1 , ΖΡ_04628689.1 ,
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ΥΡ_004147062.1 , ΥΡ_434583.1 , ΖΡ_06862658.1 , ΥΡ_003559491.1 , ΖΡ_07474361.1 ,
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ADP99705.1, ΖΡ_02883593.1 , ΥΡ_004228182.1 , ΥΡ_570677.1, ΖΡ_01225298.1 ,
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ΥΡ_004107339.1, ΥΡ_001203133.1, ΖΡ_01546752.1 , ΥΡ_002974094.1 , ΖΡ_02186892.1, ΥΡ_001989920.1, ΥΡ_002964466.1 , ΖΡ_03265887.1 , ΥΡ_555553.1, CBA26305.1,
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ΥΡ_002911224.1 , ΥΡ_047520.1 , ΥΡ_004688052.1 ,
insbesondere
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ΖΡ_07263341.1 , EGH10831.1 , ΖΡ_08142928.1 , ΥΡ_004701152.1 , ADR61111.1, EGH72107.1 , ΖΡ_07255969.1 , EGH76237.1 , EGH66371.1 , ΖΡ_07005687.1 , ΥΡ_001268914.1 , ZP_03397164.1, EGH45982.1, NP_793297.1, YP_236360.1, YP_001667915.1, EGH29726.1, YP_275370.1 , ABP88736.1 , ZP_06458302.1 , YP_001748526.1 , YP_002871195.1 ,
ZP_06478839.1, EGH95845.1, EGH21541.1, ZP_05638744.1 , Q9AHY3.2, YP_004352961.1 , YP_349607.1, YP_259059.1, YP_004713990.1, P28793.1 , YP_001172246.1 , AEA83639.1 , YP_004474976.1 , NP_251704.1 , ACP17923.1 , YP_004379416.1 , YP_001347517.1 ,
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YP_002414996.1, EGP22873.1, EGB59499.1 , ZP_07118761.1 , YP_002409078.1 ,
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ZP_03070699.1, ZP_07145404.1 , ZP_08376058.1 , EGB85466.1, ZP_07189176.1,
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NP_754768.1, ZP_08384609.1, YP_002408448.1, ZP_07187886.1, ZP_08374604.1,
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EFZ73229.1, EFU57443.1, YP_002398712.1 , YP_541623.1, ZP_07144040.1 , ZP_08349090.1 , CBG35413.1, ZP_02773221.1 , EGB40918.1, ZP_03050715.1, ZP_07787570.1,
ZP_08354786.1, YP_002403607.1, AEE57458.1, ZP_06658276.1, NP_288914.1,
YP_002392166.1, ZP_06654274.1 , ZP_07102361.1, EGB72544.1, ZP_03027319.1,
YP_670274.1, ZP_07097669.1, YP_001463687.1, BAI55757.1 , YP_003500399.1 ,
ZP_07121648.1, YP_002293925.1, ZP_03003629.1, YP_002387809.1, ZP_03043524.1,
YP_001724305.1, ZP_03068335.1, CBJ01980.1 , AEJ57562.1 , NP_416843.1 , ZP_07135079.1 , ZP_07247352.1, ZP_07590743.1, EFU96242.1, EFZ69715.1, und besonders bevorzugt
NP_744285.1 , YP_004701 152.1 , ADR61 1 1 1.1 , YP_001268914.1 , YP_001667915.1 ,
ABP88736.1 , YP_001748526.1 , Q9AHY3.2, YP_004713990.1 , YP_001 172246.1 , AEA83639.1 , AEA82038.1 , YP_001 170648.1 , YP_004712521.1 , YP_002871 195.1 , YP_349607.1 ,
YP_259059.1 , ZP_07774142.1 , NP_418288.1 , NP_416843.1 , ZP_07593201.1 ,
ZP_07590743.1 ,
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Ed und Ee generell insbesondere die Umsetzung von 2-Dodecenoyl-CoA-Thioester zu 3-Oxo-Dodecanoyl-CoA-Thioester verstanden wird.
Bestimmte Enzyme Ef Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in den erfindungsgemäßen Zellen das Enzym Ef eines darstellt, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus:
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ZP_06731844.1, YP_001897101.1, ZP_08388430.1 , YP_001166210.1 , YP_557015.1, ZP_06843809.1, EGP42659.1 , YP_002005592.1 , YP_002871766.1 , YP_555845.1 ,
ZP_05921114.1, NP_746745.1, NP_637343.1 , ZP_02243308.1 , YP_001267798.1 ,
ZP_02354510.1 , N P_841567.1 , ZP_08177693.1 , YP_004703877.1 , YP_001166143.1 , EGH73771.1 , ZP_06489206.1 , ZP_01892079.1 , YP_934562.1 , ADY81955.1 , EGB73439.1 , NP_520373.1 , YP_003905682.1 , EGH61062.1 , YP_001894311.1, ZP_02245330.1 ,
YP_918778.1 , YP_001120651.1 , YP_003612896.1 , YP_004125334.1 , ZP_07952596.1 , YP_001479268.1, ZP_07043083.1 , YP_003644271.1 , NP_421210.1, ZP_02882590.1, EGP25245.1, YP_233920.1, EGD00226.1, YP_004418315.1, ADY81914.1, ZP_04944762.1, YP_003603999.1 , YP_001060552.1 , ZP_03026966.1 , YP_441123.1 , YP_201177.1 ,
ZP_05117283.1 , YP_004232360.1 , YP_002802211.1, YP_106085.1 , YP_258448.1 ,
YP_001989549.1 , N P_945866.1 , ZP_03573123.1, YP_283604.1 , YP_004702122.1 ,
ZP_03398400.1 , YP_105310.1 , YP_001479310.1, CAC41637.1 , ZP_02372747.1 ,
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YP_110295.1, YP_002439726.1, YP_004361986.1, ZP_04946665.1, YP_003751825.1, YP_001061488.1, ZP_03545148.1 , ZP_01767462.1 , ZP_01769818.1 , YP_990241.1, YP_002382777.1, YP_002898389.1 , YP_003452421.1 , EGH66881.1 , CBW26817.1 , YP_004352451.1 , EGC07165.1 , ΥΡ_003982691.1 , ΖΡ_02906520.1 , ΥΡ_410799.1 ,
ΥΡ_001189077.1 , ΥΡ_004226900.1 , ADP96997.1 , ΥΡ_237079.1 , ΥΡ_002946310.1 ,
ΥΡ_004029037.1, ΝΡ_745423.1 , ΖΡ_08139209.1 , ΥΡ_004294989.1 , ΝΡ_251630.1,
EGH73592.1, ΖΡ_04934925.1, ΖΡ_03583227.1, ΖΡ_03584241.1, ΥΡ_004684330.1,
ΥΡ_004501533.1 , ΥΡ_001186637.1, ΥΡ_003980170.1, AEJ98540.1, ΥΡ_004688333.1 , ΥΡ_003276725.1 , EGH11975.1 , ΥΡ_276147.1 , ΥΡ_790233.1 , ΖΡ_01736635.1 ,
ΥΡ_002440908.1, ΥΡ_002230040.1 , ΥΡ_724980.1, ΥΡ_004231717.1, ΖΡ_01226775.1 , ΖΡ_03454556.1, ΖΡ_05586076.1, ΖΡ_02890239.1, ΥΡ_001172996.1, ΖΡ_02377875.1, ΖΡ_07202399.1, ΥΡ_774661.1, ΥΡ_440314.2, ΥΡ_443408.1 , ΖΡ_06878044.1 ,
ΖΡ_08274339.1, ΥΡ_001618203.1, ΖΡ_08631485.1 , ΖΡ_01545529.1 , ΖΡ_03267843.1 , ΖΡ_07797009.1 , ΥΡ_003376084.1 , EGH21143.1 , ΥΡ_003753513.1 , ΥΡ_004282234.1 , ΥΡ_726356.1, ΖΡ_06014951.1 , ΥΡ_109637.1, ΖΡ_06461447.1 , ΥΡ_001795795.1 ,
ΥΡ_621981.1 , ΖΡ_07794257.1 , ΖΡ_05060451.1 , ΥΡ_002919830.1 , ΥΡ_001796645.1 , ΝΡ_794063.1, ΖΡ_01365347.1 , ΥΡ_003610065.1, ΥΡ_001462757.1 , ΥΡ_001807185.1, ΖΡ_04928407.1 , ΥΡ_002229986.1 , ΖΡ_02883901.1 , ΥΡ_370284.1 , ΖΡ_05053491.1 ,
AAC24332.1, ΖΡ_04929241.1 , ΖΡ_00943679.1 , ΥΡ_001766064.1 , ΥΡ_001670661.1 ,
ΥΡ_003296167.1, ΥΡ_003773673.1 , ΝΡ_250691.1, ΖΡ_05823066.1, ΥΡ_004381309.1, ΥΡ_004714773.1, ΥΡ_746962.1, ΥΡ_002513585.1, ΥΡ_294674.1, ΥΡ_004593822.1 ,
ΥΡ_622032.1 , ΥΡ_001897940.1 , ΥΡ_001335713.1 , ΥΡ_001856626.1 , ΥΡ_791238.1 ,
ΥΡ_004140309.1, ΥΡ_001269802.1 , ΖΡ_06879064.1 , ΖΡ_01736318.1 , ΖΡ_02886139.1 , ΖΡ_04941413.1, ΥΡ_001670851.1, ΥΡ_371023.1, ΥΡ_002980343.1, ΥΡ_002795605.1, ΖΡ_06069679.1, ΖΡ_02463309.1 , ΖΡ_05785212.1 , ΥΡ_001793049.1, ΥΡ_003965283.1 , ΥΡ_001233153.1, ΥΡ_299776.1, ΖΡ_06498740.1 , AEJ99148.1, ΥΡ_004685690.1 ,
ΥΡ_003746771.1 , ΥΡ_004381943.1 , ΥΡ_004378973.1 , ΥΡ_004314684.1 , EGH79619.1 , ΖΡ_04882546.1, ΥΡ_347001.1, ΥΡ_347471.1, ΥΡ_001757758.1 , ΥΡ_002911324.1,
ΝΡ_518596.1, ΖΡ_00948908.1 , ΥΡ_442777.1, ΥΡ_002874183.1 , ΥΡ_002230989.1 ,
ΥΡ_004360850.1, ABC36127.1, ΥΡ_004696127.1, ΥΡ_002799527.1, ΥΡ_001631275.1, ΥΡ_626125.1 , ΖΡ_05090649.1 , ΖΡ_07774002.1 , ΖΡ_04940525.1 , ΑΕΚ60371.1 , ADR60119.1 , ΥΡ_102981.1, ΥΡ_003451423.1, ΝΡ_743536.1 , CAA45255.1 ,
insbesondere
ΥΡ_790159.1, ΖΡ_06877967.1, ΝΡ_251703.1, EGH66370.1, EGH10832.1, ΥΡ_349606.1, ΥΡ_236359.1, ΖΡ_07263340.1, EGH95844.1, ΝΡ_793296.1, 1WDK_C, Ρ28790.2, YP_259060.1 , ΖΡ_04587908.1 , EGH45981.1 , ΖΡ_07774144.1 , EGH84449.1 , ΥΡ_275369.1 , ΖΡ_07005686.1, ΥΡ_001172247.1, ΥΡ_004352962.1, ACP17922.1, ΥΡ_002871196.1,
ΖΡ_08142929.1, ΥΡ_004701153.1, ΥΡ_001667916.1, ΥΡ_001268913.1 , Q93Q11.1,
Q9R9W0.1, ΝΡ_744286.1,ΥΡ_001187077.1, ΥΡ_609234.1, ΥΡ_004379417.1,
ΥΡ_004474975.1 , ΑΒΡ88737.1 , EGH76239.1 , EGH29725.1 , ΖΡ_06499584.1 ,
ΥΡ_001749490.1, ABF82237.1, ΥΡ_004713534.1, CAD76924.1 , ΥΡ_608369.1 , ΑΕΑ83130.1 , ΥΡ_001171793.1, ΥΡ_788379.1, CAE45106.1, ΝΡ_248919.1, ΥΡ_001348923.1,
ΖΡ_07797976.1 , ΥΡ_001747677.1 , ΝΡ_250427.1 , AAR83740.1 , ΥΡ_001668851.1 ,
ΖΡ_06495825.1, ΥΡ_004379898.1, EGH60624.1, ΖΡ_04933402.1, ΥΡ_001345710.1,
Q8VPF1.1, ΥΡ_004473788.1, EGH77345.1, EGH44350.1, ΥΡ_001188713.1, ΥΡ_004380648.1, ΥΡ_001188079.1 , ΖΡ_08142248.1 , ΥΡ_004703691.1 , ΖΡ_04936650.1 , ΥΡ_606872.1 ,
ΥΡ_610092.1, ADR61907.1, ΖΡ_04934614.1 , ΖΡ_07262554.1 , ΥΡ_001747891.1 , Q51956.1, ΥΡ_002871766.1 , ΝΡ_746745.1 , ΥΡ_001267798.1 , ΥΡ_004703877.1 , EGH73771.1 ,
EGH61062.1 , ΥΡ_233920.1 , ΥΡ_258448.1 , ΥΡ_004702122.1 , ΖΡ_03398400.1 ,
ΥΡ_002439726.1 , EGH66881.1 , ΥΡ_004352451.1 , ΥΡ_001189077.1 , ΥΡ_237079.1 ,
ΝΡ_745423.1, ΖΡ_08139209.1, ΝΡ_251630.1, EGH73592.1 , ΖΡ_04934925.1 ,
ΥΡ_001186637.1 , EGH11975.1 , ΥΡ_276147.1 , ΥΡ_790233.1 , ΥΡ_002440908.1 ,
ΥΡ_001172996.1, ΖΡ_06878044.1, ΖΡ_07797009.1, EGH21143.1 , ΖΡ_06461447.1 ,
ΖΡ_07794257.1, ΝΡ_794063.1, ΖΡ_01365347.1, ΖΡ_04928407.1, AAC24332.1,
ΖΡ_04929241.1, ΥΡ_001670661.1, ΝΡ_250691.1 , ΥΡ_004381309.1 , ΥΡ_004714773.1 , ΥΡ_791238.1 , ΥΡ_001269802.1 , ΖΡ_06879064.1 , ΥΡ_001670851.1 , ΖΡ_06498740.1 ,
ΥΡ_004381943.1 , ΥΡ_004378973.1 , EGH79619.1 , ΥΡ_347001.1 , ΥΡ_347471.1 ,
ΥΡ_002874183.1 , ΖΡ_07774002.1 , ADR60119.1, ΝΡ_743536.1 , ΥΡ_001269653.1 ,
ΖΡ_06482365.1, ADI95330.1, ΖΡ_07003619.1, ΒΑΒ96553.1, ΖΡ_07777009.1, ΑΒΑ10831.1, ΥΡ_273131.1, ΥΡ_259428.1, EFW86233.1, EGH85840.1 , ΖΡ_07774597.1 , EGH54613.1, ΥΡ_004353129.1, ΥΡ_002871014.1, ΥΡ_001171232.1 , EGH67454.1, EFW82139.1,
ΖΡ_04590526.1, EGH58132.1, EGH06629.1, EGH99157.1 , ΖΡ_05638078.1 , ΝΡ_790796.1, ΑΕΕ59172.1 , ΥΡ_026272.1 , ΥΡ_002389323.1 , EGB30581.1 , ΥΡ_001460637.1 ,
ΥΡ_001727089.1, CAB40810.1 , ΖΡ_03049054.1 , ΖΡ_08356522.1 , ΖΡ_06664573.1 ,
ΑΑΑ67642.1 , ΥΡ_003236969.1 , ΖΡ_06659935.1 , ΝΡ_290475.1 , ΖΡ_03027945.1 , EFZ59092.1 , ΥΡ_002295406.1, CBG37050.1, EGP22872.1, EGE62411.1 , ΥΡ_002400349.1 , EGB59498.1, ΖΡ_08361144.1, ΥΡ_001465329.1, ΥΡ_002409079.1, ΖΡ_06655947.1, ΥΡ_002414995.1, EGB69559.1 , YP_859446.1 , ZP_08386168.1 , YP_543378.1 , ZP_08366394.1 ,
YP_001746177.1 , ZP_07154548.1 , ZP_03070708.1 , N P_756651 .1 , YP_671919.1 ,
YP_002331615.1 , ZP_07449249.1 , ZP_06938722.1 , ZP_03086141.1 , ZP_07189177.1 , ZP_07136312.1 , EFZ47010.1 , ZP_0713631 1 .1 , EFZ47009.1 , ZP_03026937.1 , EGB73439.1 , EGP25245.1 , ZP_03026966.1 , YP_001462757.1 , CAP76727.1 , YP_670163.1 ,
und besonders bevorzugt
YP_026272.1 , AAA67642.1 , ZP_07593202.1 , YP_004701 153.1 , YP_001667916.1 ,
YP_001268913.1 , Q9R9W0.1 , NP_744286.1 , ABP88737.1 , YP_001749490.1 ,
YP_001747677.1 , YP_001668851.1 , YP_004703691 .1 , ADR61907.1 , YP_001747891 .1 , Q51956.1 , NP_746745.1 , YP_001267798.1 , YP_004703877.1 , YP_004702122.1 ,
NP_745423.1 , AAC24332.1 , YP_001670661.1 , YP_001269802.1 , YP_001670851 .1 ,
ADR601 19.1 , NP_743536.1 , YP_001269653.1 , ADI95330.1 , BAB96553.1 , YP_001 172247.1 , YP_004713534.1 , AEA83130.1 , YP_001 171793.1 , YP_001 172996.1 , YP_004714773.1 , YP_001 171232.1 , YP_349606.1 , YP_259060.1 , ZP_07774144.1 , YP_002871 196.1 ,
ABF82237.1 , YP_002871766.1 , YP_258448.1 , YP_347001 .1 , YP_347471.1 , YP_002874183.1 , ZP_07774002.1 , ZP_07777009.1 , YP_259428.1 , ZP_07774597.1 , YP_002871014.1 , sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmmung der Aktivität des Enzyms Ef generell insbesondere die Reaktion von 3-Oxo-Dodecanoyl-CoA-Thioester und CoA zu Decanoyl-CoA-Thioester und Acetyl-CoA verstanden wird. Sechste gentechnische Modifikation zur Verstärkung der Acyl-ACP-Thioester-Synthese
Erfindungsgemäß weisen die Mikroorganismen eine sechste gentechnische Modifikation auf, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Acyl-ACP-Thioester aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Ein Überblick über entsprechend wünschenswerte gentechnische Modifikationen ist der Abb. 1 der WO20081 19082, Abschnitt 1 (Fatty Acid Production Increase / Product Production Increase) zu entnehmen.
Dies hat den technischen Effekt, dass die durch die erste gentechnische Modifikation verstärkte Bildung von Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester, aber auch von durch die zweite, dritte, vierte, fünfte oder siebte gentechnische Modifikation vermehrt gebildeten co-funktionalisierten Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern, noch weiter verstärkt wird.
Auch derart gestaltete, bevorzugte erfindungsgemäße Organismen sind ebenfalls hervorragend zur Herstellung von Verbindung geeignet, welche ausgewählt sind aus
α,ω-Alkandiole, α,ω-Alkandialdehyde, α-Οχο-ω-Hydroxy-Alkane und α,ω-Alkandiamine, da Verbindungen dieser Klassen neben den co-funktionalisierten Alkansäuren und co- funktionalisierten Alkansäure-Estern in signifikanten Mengen produziert werden.
Siebte gentechnische Modifikation zur Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäuren und co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern mit endständiger Doppelbindung
Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen lassen sich zusätzlich derart ausstatten, dass sie zur Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäuren und co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern mit endständiger Doppelbindung vorteilhaft geeignet sind. Dazu enthalten bevorzugte
Mikroorganismen eine siebte gentechnische Modifikation, die eine verglichen zu der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität eines Enzyms Exi umfasst, welches die Umsetzung von co-Carboxy-Carbonsäuren oder co-Carboxy- Carbonsäuren-Estern zu Carbonsäuren oder Carbonsäure-Estern mit endständiger
Doppelbindung katalysiert, ausgewählt aus der Gruppe
Exi) Cytochrom P450 Fettsäuredecarboxylase, welche die Umsetzung einer Alkansäure mit n Kohlenstoffatomen zu einem entsprechenden terminalen Olefin mit n-1 Kohlenstoffatomen, insbesondere von Dodecansäure zu Undec-10-en-Säure katalysiert. Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die erhalten werden, wenn die im folgenden gelisteten Mikroorganismen aufweisend eine im Sinne der Erfindung siebte gentechnische Modifikation als Ausgangspunkt eingesetzt werden, indem sie mit einer ersten und zweiten gentechnische Modifikation und gegebenenfalls mindestens einer weiteren gentechnischen Modifikationen im Sinne der Erfindung ausgestattet werden.
Die WO2009085278 A1 beschreibt insbesondere in den Abschnitten [0033] bis [0048], [0056] bis [0063] und [0188] bis [0202], der Abbildung 10, der Tabelle 8, den Ausführungsbeispielen 5 bis 18 sowie den Ansprüchen 28 bis 51 und 188 bis 195 erfindungsgemäß bevorzugte
Mikroorganismen, die eine siebte gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Fettsäuren und Fettsäurederivate, insbesondere Olefine, aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen. Die Schrift beschreibt auch erfindungsgemäß bevorzugte Enzyme Exi und deren Sequenzen insbesondere in den
Abschnitten [0021] bis [0032], [0051 ] bis [0055], [0081] bis [0084] und [0160] bis [0183], der Tabelle 8, den Ausführungsbeispielen 5 bis 18, den Ansprüchen 1 bis 25 und den Abbildungen 3,7 und 9.
Bestimmte Ausführungen bevorzugter Mikroorganismen und Enzyme
Erfindungsgemäß sind Mikroorganismen besonders bevorzugt ausgewählt aus denen, die eine erste und eine zweite gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite und eine fünfte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung, eine erste, eine zweite und eine dritte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung, eine erste, eine zweite, eine dritte und eine fünfte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite und eine vierte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung, eine erste, eine zweite, eine vierte und eine fünfte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine dritte und eine vierte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung, eine erste, eine zweite, eine dritte, eine vierte und eine fünfte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite und eine siebte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung, eine erste, eine zweite, eine fünfte und eine siebte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine dritte und eine siebte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung oder
eine erste, eine zweite, eine dritte, eine fünfte und eine siebte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung
eine erste, eine zweite und eine sechste gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung, eine erste, eine zweite, eine fünfte und eine sechste gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine dritte und eine sechste gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine dritte, eine fünfte und eine sechste gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine vierte und eine sechste gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine vierte, eine fünfte und eine sechste gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine dritte, eine vierte und eine sechste gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine dritte, eine vierte, eine fünfte und eine sechste gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine sechste und eine siebte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine fünfte, eine sechste und eine siebte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung,
eine erste, eine zweite, eine dritte, eine sechste und eine siebte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung oder
eine erste, eine zweite, eine dritte, eine fünfte, sechste und eine siebte gentechnische Modifikation im Sinne der Erfindung. aufweisen. Erfindungsgemäß sind Mikroorganismen besonders bevorzugt, die eine erste gentechnische Modifikation aufweisen, so dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäuren und Carbonsäure-Ester aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermögen, wobei die erste gentechnische Modifikation eine verglichen zu der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme E, oder eines der Enzyme mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 %
Aminosäurereste gegenüber den in der folgenden Tabelle durch Verweise angegebenen Sequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der jeweiligen Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang generell insbesondere die Hydrolyse eines ACP-Thioesters mit der in der folgenden Tabelle den einzelnen Enzymen E,
zugeordneten Kohlenstoffkettenlänge verstanden wird,
darstellt
und die Carbonsäure und Carbonsäure-Ester eine Kohlenstoffkettenlänge des Carbonsäureteils aufweisen, wie in der folgenden Tabelle dargestellt:
Die oben erwähnten Deletionen von Aminosäurereste gegenüber den in der obigen Tabelle durch Verweise angegebenen Sequenzen beziehen sich insbesondere auf Deletionen am N- und/oder C-Terminus, insbesondere am N-Terminus. Besonders bevorzugt handelt es sich bei vorgenanntem N-Terminus um den einer pflanzlichen Plastiden-Targeting-Sequenz. Solche pflanzlichen Plastiden-Targeting -Sequenzen lassen sich zum Beispiel mit Hilfe der durch das Vorhersage-Tool TargetP 1.1 (www.cbs.dtu.dk services/TargetP/) benutzten und in den folgenden Veröffentlichungen beschriebenen Algorithmen, bevorzugt ohne Verwendung von cutoffs, vorhersagen:
Predicting subcellular localization ofproteins based on their N-terminal amino acid sequence. Olof Emanuelsson, Henrik Nielsen, S0ren Brunak and Gunnar von Heijne.
J. Mol. Biol., 300: 1005-1016, 2000 und Identification of prokaryotic and eukaryotic Signal Peptides and prediction of their cleavage s/ies.Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, S0ren Brunak and Gunnar von Heijne. Protein Engineering, 10:1 -6, 1997.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von ω-Amino-Carbonsäuren und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP (Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41 ), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, FabI, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB.
Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden.
Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PfID, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, Fdnl, FdhF, FdoG, FdoH, Fdol, PrpC, PrpD, PrpF , PrpB , TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, llvB, llvM, llvN, llvG, llvl, llvH, AlsD, ButB, ThI, ThIA, ThIB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Ade, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, Dld, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von co-Amino-Carbonsäurenestern und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP (Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41 ), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, Fabl, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB.
Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden.
Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PfID, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, Fdnl, FdhF, FdoG, FdoH, Fdol, PrpC, PrpD, PrpF , PrpB , TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, llvB, llvM, llvN, llvG, llvl, llvH, AlsD, ButB, ThI, ThIA, ThIB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Ade, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, Dld, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von ω-Hydroxy-Carbonsäuren oder co-Oxo- Carbonsäuren und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP (Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41 ), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, Fabl, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB.
Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden.
Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PfID, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, Fdnl, FdhF, FdoG, FdoH, Fdol, PrpC, PrpD, PrpF , PrpB , TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, llvB, llvM, llvN, llvG, llvl, llvH, AlsD, ButB, ThI, ThIA, ThIB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Ade, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, DId, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von co-Hydroxy-Carbonsäureestern oder co-Oxo- Carbonsäureestern und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP (Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1.41 ), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, Fabl, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB.
Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden.
Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PfID, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, Fdnl, FdhF, FdoG, FdoH, Fdol, PrpC, PrpD, PrpF , PrpB , TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, llvB, llvM, llvN, llvG, llvl, llvH, AlsD, ButB, ThI, ThIA, ThIB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Ade, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, DId, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von co-Carboxy-Carbonsäuren und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP (Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1 .41 ), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, Fabl, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB.
Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden.
Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PfID, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, Fdnl, FdhF, FdoG, FdoH, Fdol, PrpC, PrpD, PrpF , PrpB , TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, llvB, llvM, llvN, llvG, llvl, llvH, AlsD, ButB, ThI, ThIA, ThlB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Adc, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, Dld, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte Mikroorganismen (abgekürzt MO) sind hervorragend geeignet für die Produktion von co-Carboxy-Carbonsäureestern und weisen in der folgenden Tabelle beschriebene erhöhte bzw. erniedrigte Enzymaktivitäten (abgekürzt E) auf, wobei diese zusätzlich vorteilhaft kombiniert sein können mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erhöhten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die 3-Ketoacyl-ACP (Acyl Carrrier Protein)-Synthase III (EC 2.3.1 .41 ), insbesondere jene aus Pflanzen, bevorzugt jene aus Pflanzen, deren Samen Fettsäuren mit Alkylresten kürzer als 14 C-Atome enthalten, und besonders bevorzugt jene aus Pflanzen der Gattungen Cuphea, Elaeis, Cocos, Umbellularia und Cinnamomum sowie Genprodukte ausgewählt aus AccA, AccB, AccC, AccD, AceE, AceF, Lpd, AcpP, FabA, FabB, FabD, FabF, FabG, FabH, FabI, FabZ, PanD, PanK, UdhA, PntA oder PntB. Es können beliebige Kombinationen von mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten vorteilhaft erhöht werden.
Zusätzlich vorteilhaft kann es des weiteren sein, wenn der Mikroorganismus mit einer verglichen zum Wildtyp des Mikroorganismus erniedrigten Enzymaktivität, welche beschrieben ist für die Genprodukte ausgewählt aus TdcE, PflA, PflB, PflC, PfID, PoxB, YgfG, AckA, AckB, TdcD, Pta, LdhA, AdhE, MgsA, FdnG, FdnH, Fdnl, FdhF, FdoG, FdoH, Fdol, PrpC, PrpD, PrpF , PrpB , TdcD, Pdc, PorA, PorB, PorC, PorD, AlsS, llvB, llvM, llvN, llvG, llvl, llvH, AlsD, ButB, ThI, ThIA, ThIB, PhaA, PhaB, Crt, BdhA, BdhB, Ade, Adh, CtfB, AtoA, AtoD, LdhL, GltA, FabR, FhuA, DId, LldA oder LldP, einzeln oder in beliebiger Kombination, ausgestattet ist.
Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der vorgenannten Mikroorganismen zur Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäuren und co- funktionalisierten Carbonsäure-Estern, insbesondere von solchen Carbonsäuren und
Carbonsäure-Estern, die oben im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen
Mikroorganismen als bevorzugte herausgestellt wurden, wobei als co-Funktionalisierung insbesondere die ω-Aminierung herauszustellen ist. Die Verwendung der vorgenannten Mikroorganismen zur Herstellung von co-Amino-Carbonsäuren und von co-Amino-Carbonsäure- Estern, insbesondere von co-Amino-Laurinsäure und von co-Amino-Laurinsäuremethyl- und - ethylester sowie ω-Amino-Capronsäure und von co-Amino-Capronsäuremethyl- und -ethylester ist besonders bevorzugt.
Im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Mikroorganismen als bevorzugte
Mikroorganismen herausgestellte sind im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen
Verwendung ebenfalls bevorzugt. Welche erfindungsgemäßen Organismen bevorzugt für bestimmte co-funktionalisierte Carbonsäuren oder ω-funktionalisierte Carbonsäure-Ester verwendet werden, ist im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Mikroorganismen bereits hervorgehoben.
Verfahren zur Herstellung von ω-funktionalisierten Carbonsäuren und von co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ω-funktionalisierten Carbonsäuren und von co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern aus einer einfachen Kohlenstoffquelle umfassend die Verfahrensschritte I) in Kontakt Bringen eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus mit einem Medium beinhaltend die einfache Kohlenstoffquelle,
II) Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die es dem Mikroorganismus ermöglichen aus der einfachen Kohlenstoffquelle die ω-funktionalisierten Carbonsäuren oder co- funktionalisierte Carbonsäure-Ester zu bilden und
III) gegebenenfalls Isolierung der gebildeten co-funktionalisierten Carbonsäuren oder co- funktionalisierten Carbonsäure-Ester.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können die erfindungsgemäßen Mikroorganismen kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch- Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion der co-funktionalisierten Carbonsäuren oder co-funktionalisierten Carbonsäure-Ester mit dem Nährmedium in Kontakt gebracht und somit kultiviert werden.
Denkbar ist auch ein semi-kontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von
Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 ) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugte erfindungsgemäße Mikoorganismen bevorzugt eingesetzt.
Als einfache Kohlenstoffquelle werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren die oben als bevorzugt genannten eingesetzt.
Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, Ammoniak, Ammoniumhydroxid oder
Ammoniakwasser verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogen-phosphat oder
Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie
Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der
Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses in einem Zwei- Phasen-System durchgeführt, beinhaltend
A) eine wässrige Phase, sowie
B) eine organische Phase,
wobei die Bildung der ω-funktionalisierten Carbonsäuren oder co-funktionalisierten Carbonsäure- Ester durch den Mikroorganismus im Verfahrensschritt II) in der wässrigen Phase erfolgt und sich die gebildeten co-funktionalisierten Carbonsäuren oder co-funktionalisierten Carbonsäure- Ester in der organischen Phase anreichern. Auf diese Weise ist es möglich, die gebildeten co- funktionalisierten Carbonsäuren oder co-funktionalisierten Carbonsäure-Ester in situ zu extrahieren.
Bevorzugte co-funktionalisierte Carbonsäuren oder co-funktionalisierte Carbonsäure-Ester, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, sind die oben im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Mikroorganismen und der erfindungsgemäßen Verwendung als bevorzugt genannten. Besonders bevorzugte co-funktionalisierte Carbonsäuren oder co-funktionalisierte Carbonsäure- Ester sind die
co-Amino-Carbonsäuren und co-Amino-Carbonsäure-Ester, insbesondere ω-Amino-Laurinsäure und co-Amino-Laurinsäuremethyl- und -ethylester sowie ω-Amino-Capronsäure und co-Amino- Capronsäuremethyl- und -ethylester, sowie
co-Hydroxy-Carbonsäuren und co-Hydroxy-Carbonsäure-Ester, insbesondere co-Hydroxy- Laurinsäure und ω-Hydroxy-Laurinsäuremethyl- und -ethylester sowie co-Hydroxy-Capronsäure und co-Hydroxy-Capronsäuremethyl- und -ethylester, sowie
ω-Carboxy-Carbonsäuren und co-Carboxy-Carbonsäure-Ester, insbesondere co-Carboxy- Laurinsäure und co-Carboxy-Laurinsäuremethyl- und -ethylester, sowie co-Carboxy-Capronsäure und co-Carboxy-Capronsäuremethyl- und -ethylester.
Welche erfindungsgemäßen Organismen bevorzugt in bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren für bestimmte co-funktionalisierte Carbonsäuren oder co-funktionalisierte Carbonsäure- Ester eingesetzt werden, ist im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Mikroorganismen bereits hervorgehoben.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von auf co-Amino-Carbonsäuren basierenden Polyamiden, umfassend die Verfahrensschritte: (a1 ) Herstellung von co-Amino-Carbonsäuren oder co-Amino-Carbonsäure-Estern durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung co-Amino-Carbonsäuren,
insbesondere durch die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von co-Amino- Laurinsäure, co-Amino-Laurinsäure-Methylester, co-Amino-Capronsäure oder co-Amino- Capronsäure-Methylester und gegebenenfalls Umwandlung der co-Amino-Carbonsäure-Ester in co-Amino-Carbonsäuren;
(a2) Polymerisation der co-Amino-Carbonsäure unter Erhalt eines Polyamids.
Im Verfahrensschritt (a2) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von auf co-Amino- Carbonsäuren basierenden Polyamiden können die co-Amino-Carbonsäure-Ester durch beliebige Verfahen, wie beispielsweis säure- oder basenkatalysierte Hydrolyse in die co-Amino- Carbonsäuren umgewandelt werden. Im Verfahrensschritt (a2) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von auf co-Amino- Carbonsäuren basierenden Polyamiden werden die im Verfahrensschritt (a1 ) erhaltenenen co- Amino-Carbonsäuren, insbesondere die im Verfahrensschritt (a1 ) erhaltene co-Amino- Laurinsäure in einer Polymerisation zu einem Polyamid umgesetzt, wobei gegebenenfalls auch Mischungen aus verschiedenen co-Amino-Carbonsäuren eingesetzt werden können, von denen mindestens ein Teil der co-Amino-Carbonsäuren, bevorzugt mindestens 50-Gew.% bezogen auf alle im Verfahren eingesetzten co-Amino-Carbonsäuren, gegebenenfalls aber auch alle co- Amino-Carbonsäuren durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von co-Amino- Carbonsäuren hergestellt wurden.
Die Herstellung der Polyamide aus den co-Amino-Carbonsäuren kann durch an sich bekannte Verfahren erfolgen, wie sie beispielsweise in L. Notarbartolo, Ind. Plast. Mod. 10 (1958) 2, S. 44, JP 01 -074224, JP 01 -051433, JP63286428, JP58080324 oder JP60179425 beschrieben sind. In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten
Ausführungsformen beschränkt sein soll. Beispiele:
Beispiel 1: Herstellung von Expressionsvektoren für die Gene fatB2 aus Cuphea palustris, ald aus Bacillus subtilis und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum
Zur Herstellung eines £. co//-Expressionsvektors für die Gene fatB2 (SEQ ID NR: 10) aus Cuphea palustris (Enzym E,), ald (SEQ ID NR: 1 1 ) aus Bacillus subitlis (Enzym E3) und
Cv_2025 (SEQ ID NR: 12) aus Chromobacterium violaceum (Enzym E2) wurden diese Gene nacheinander in den Vektor pJ294 (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA, USA) kloniert. Das Gen Cv_2025 wurde zusammen mit einem /acUV5-Promotor und dem Gen ald aus Bacillus sphaericus synthetisiert und gleichzeitig eine Schnittstelle stromaufwärts des Promotors und eine Schnittstelle stromabwärts des Terminators eingeführt. Das synthetisierte DNA-Fragment P/acuv5-ald_Bsp_TA_C.v.(Ct) (SEQ ID NR: 13) wurde mit den Restriktionsendonukleasen Pst\ und Xba\ verdaut und in den entsprechend geschnittenen Vektor pJ294 ligiert. Der fertiggestellte £. co//'-Expressionsvektor wurde als pJ294_alaD_Bsp_TA_C.v.(Ct) (SEQ ID NR: 14) bezeichnet. In diesem Vektor wurde das Bacillus sphaericus ald-Gen gegen das Gen ald aus Bacillus subtilis ausgetauscht. Das Gen ald wurde per PCR aus chromosomaler DNA des Stammes Bacillus subtilis str. 168 amplifiziert. Dabei kamen folgende Oligonukleotide zum Einsatz: alaDH_pCR22_fw: 5'-ATGATCATAGGGGTTCCTAAAGAG-3'
(SEQ ID NR: 15)
alaDH_pCR22_rev: 5'-TTAAGCACCCGCCACAGATG-3'
(SEQ ID NR: 16)
Folgende Parameter wurden für die PCR eingesetzt: 1x: initiale Denaturierung, 98 °C, 0:30 min; 35 x: Denaturierung, 98 °C, 0:10 min, Annealing, 65°C, 0:30 min; Elongation, 72 °C, 0:20 min; 1 x: terminale Elongation, 72 °C, 10 min. Für die Amplifikation wurde der Phusion™ High-Fidelity Master Mix von New England Biolabs (Frankfurt) entsprechend den Empfehlungen des
Herstellers verwendet. Jeweils 50 μΙ der PCR-Reaktionen wurden anschließend auf einem 1 %igen TAE-Agarosegel aufgetrennt. Die Durchführung der PCR, der Agarose- Gelelektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der PCR- Fragmentgrößen erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Das PCR-Fragment zeigte die erwartete Größe von 1 137 Basenpaaren und wurde mit dem Quick PCR Purification Kit von Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers aus dem PCR-Ansatz aufgereinigt. Für die Ligation des PCR Produktes mit dem Vektor wurden 5'-Phosphate mit Hilfe der
Polynukleotidkinase (New England Biolabs, Frankfurt) an das PCR-Produkt angehängt. Dabei wurde die Empfehlung des Herstellers befolgt.
Der Vektor wurde mit den Restriktionsendonukleasen Hind\\\ und Nde\ verdaut, wodurch das enthaltene Gen Bacillus sphaericus ald entfernt wurde. Der Ansatz des Restriktionsverdaus wurde auf einem 1 %igen TAE-Agarosegel aufgetrennt. Es konnten zwei Banden mit den Größen 5696 bp und 1 124 bp identifiziert werden. Zur Isolierung der Vektor-DNA aus dem Agarosegel wurde die DNA-Bande von 5696 bp mit einem Skalpell aus dem Gel isoliert und mit dem Quick Gel Extraction Kit von Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. Für die Erzeugung von glatten Enden wurden die 5'-Überhänge der aufgereinigten Vektor-DNA mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I (New England Biolabs, Frankfurt) aufgefüllt. Dabei wurden die Angaben des Herstellers befolgt. Das DNA-Fragment Bacillus subtilis ald mit 5'-Phosphatresten wurde in den Vektor mit glatten Enden ligiert. Der
fertiggestellte E. co//'-Expressionsvektor wurde als pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) (SEQ ID NR: 17) bezeichnet.
Zur Herstellung des vollständigen Expressionsvektors wurde das Gen fatB2 aus Cuphea palustris für die Expression in Escherichia coli codonoptimiert. Das Gen wurde zusammen mit einem iac-Promotor synthetisiert (DNA 2.0; Menlo Park, CA, USA) und gleichzeitig eine
Schnittstelle stromaufwärts des Promotors und eine Schnittstelle stromabwärts des Terminators eingeführt. Das synthetisierte DNA-Fragment Ptac-CpFatB2 (SEQ ID NR: 18) wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamH\ und Not\ verdaut und in den entsprechend geschnittenen Vektor pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) sowie den Vektor pJ294 ligiert. Die fertig gestellten Vektoren wurden als pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2] (SEQ ID NR: 19) sowie pJ294[Ptac-CpFATB2_optEc] (SEQ ID NR: 20) bezeichnet. Beispiel 2: LC-ESI/MS2 -basierte Quantifizierung von Produkten
Die Quantifizierung von Laurinsäuremethylester LSME, co-Hydroxy-Laurinsäuremethylester HLSME, co-Oxo-Laurinsäuremethylester OLSME, ω-Amino-Laurinsäuremethylester ALSME und ω-Carboxy-Laurinsäuremethylester DDSME, co-Amino-Laurinsäure ALS, co-Carboxy- Laurinsäure DDS, Laurinsäure LS, ω-Hydroxy-Laurinsäure HLS und ω-Oxo-Laurinsäure OLS in Fermentationsproben erfolgte mittels LC-ESI/MS2 anhand einer externen Kalibrierung für alle Analyten und unter Verwendung des internen Standards Aminoundekansäure (AUD).
Dabei kamen folgende Geräte zum Einsatz:
• HPLC Anlage 1260 (Agilent; Böblingen) mit Autosampier (G1367E), binärer Pumpe
(G1312B) und Säulenofen (G1316A)
· Massenspektrometer TripelQuad 6410 (Agilent; Böblingen) mit ESI-Quelle
• HPLC-Säule: Kinetex C18, 100 x 2,1 mm, Partikelgröße: 2,6 μηι, Porengröße 100 A (Phenomenex; Aschaffenburg)
• Vorsäule: KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter; 0,5 μηη Filtertiefe und 0,004 mm
Innendurchmesser (Phenomenex; Aschaffenburg)
Die Proben wurden vorbereitet, indem 1900 μί Lösungsmittel (Aceton/ 0,1 N HCI-Gemisch = 1 :1 ) und 100 μί Probe in ein 2-mL-Reaktionsgefäß pipettiert wurden. Das Gemisch wurde ca. 10 Sekunden gevortext und anschließend bei ca. 13000 rpm für 5 min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde mit einer Pipette entnommen und nach entsprechender Verdünnung mit Diluent (80 % (v/v) ACN, 20 % bidest. H20 (v/v), + 0.1 % Ameisensäure) analysiert. Zu je 900 μΙ_ Probe wurden 100 μΙ_ ISTD hinzupipettiert (10 μΙ_ bei einem Probenvolumen von 90 μΙ_). Die HPLC-T rennung erfolgte mit oben genannter Säule bzw. Vorsäule. Das Injektionsvolumen betrug 0,7 μΙ_, die Säulentemperatur 50°C, die Flussrate 0,6 mL/min. Die mobile Phase bestand aus Eluent A (0,1 %ige (v/v) wässrige Ameisensäure) und Eluent B (Acetonitril mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure). Folgendes Gradientenprofil wurde genutzt
Die ESI-MS2-Analyse erfolgte im positiven Modus mit folgenden Parametern der ESI-Quelle:
• Gastemperatur 280°C
• Gasfluss 1 1 l/min
· Nebulizerdruck 50 psi
• Kapillarspannung 4000 V
Die Detektion und Quantifizierung der einzelnen Verbindungen erfolgte mit den folgenden Parametern, wobei jeweils ein Produkt-Ion als Qualifier und eines als Quantifier genutzt wurde:
Beispiel 3: Produktion von Amino-Laurinsäure durch einen E. coli Stamm mit Deletion des Gens fadE und Expressionsvektoren für die Gene fatB2 aus Cuphea palustris, ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkT und alkL aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida.
Der verwendete Wirtsstamm £ coli JW5020-1 (CSGC, The coli genetic stock center, Yale University, New Häven, USA) ist ein £ coli BW251 13-Derivat, der eine Deletion des Gens fadE (kodierend für Enzym Eb) trägt. Das Gen fadE wurde durch eine Kanamycinkassette
ausgetauscht. Diese wurde vor der Ausstattung des Stammes mit den Expressionsvektoren mit Hilfe eines Helferplasmides, welches für die Flp-Rekombinase codiert, in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise entfernt (siehe Datsenko K.A. and Wanner B.L. (2000) PNAS
97(12):6640-6645), resultierend in Stamm £ coli JW5020-1 Kans. Zur Erzeugung eines £. coli- Stammes mit Expressionsvektoren für die Gene fatB2 aus Cuphea palustris (Enzym E,), ald aus Bacillus subtilis (Enzym E3), Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum (Enzym E2) in
Kombination mit dem Expressionsvektor pBT10_alkL (Sequenz und Herstellung vergleiche Beispiel 1 der PCT/EP201 1/053834 bzw. die dort aufgeführte Seq ID NR: 8) für die Gene alkB (Enzym E1a), alkG, alkT (Hilfsenzyme zu Enzym E1b) und alkL (kodierend für alkL-Genprodukt) aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida GPo1 wurden elektrokompetente Zellen von £ coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschah in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. Dieser wurde mit den Plasmiden pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2] und pBT10_alkL transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Ampicillin (100 g/ml) und Kanamycin (50 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten wurden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Auf diese Weise wurde der folgende Stamm konstruiert: E. coli JW5020-1 Kans pBT10_alkL /
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2].
Der Stamm wurde einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um dessen Fähigkeit zur
Produktion von Amino-Laurinsäure aus Glucose zu analysieren. Der zu untersuchende Stamm wurde zunächst als Vorkultur in M9-Medium mit 100 μg ml Ampicillin und 50 μg ml Kanamycin aus einer Glycerinkultur bei 37°C über Nacht angezogen. Das Medium, bestehend aus 38 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat, 22 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 8,6 mM
Natriumchlorid, 37 mM Ammoniumchlorid, 1 ,5 % (w/v) Glucose, 2 mM Magnesiumsulfat- Heptahydrat (alle Substanzen von Merck, Darmstadt) und 0,5 % (v/v) Spurenelemente-Lösung, wurde mit 25%iger Ammoniumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die zugegebene Spurenelemente-Lösung bestehend aus 9,7 mM Mangan(ll)chlorid-Tetrahydrat, 6,5 mM Zinksulfat-Heptahydrat, 2,5 mM Natrium-EDTA (Titriplex III), 4,9 mM Borsäure, 1 mM Natriummolybdat-Dihydrat, 32 mM Calciumchlorid-Dihydrat, 64 mM Eisen(ll)sulfat-Heptahydrat und 0,9 mM Kupfer(ll)chlorid-Dihydrat gelöst ist 37%iger Salzsäure (alle Substanzen von Merck, Darmstadt) wurde vor Zugabe in das M9-Medium sterilfiltriert. Der Fermenter wurde mit der Vorkultur so inokuliert, dass eine optische Dichte von 0,06 erreicht wurde. Die Kultivierung erfolgte bei einem pH-Wert von 6,8, geregelt mit 25 % Ammoniakwasser und 0,5 M
Schwefelsäure, einem Sauerstoffpartialdruck von 20 %, geregelt über eine
Rührergeschwindigkeit von 800 rpm/min und Luftzufluss von 0,4 vvm/min zu Beginn der Fermentation, und einer Temperatur von 37°C. Die Zufütterung von Glucose erfolgte nach Verbrauch der im Medium vorhandenen Glucose mit einem Zufluss von 5 g/l/h bezogen auf das Startvolumen. Bei Beginn des Glucose-Zuflusses nach 9 Stunden Fermentationsdauer wurde die Temperatur auf 30°C eingestellt. Die Genexpression wurde 2 Stunden nach Beginn des Glucose-Zuflusses durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid und 0,025 % Dicyclopropylketon induziert. Der Stamm wurde weitere 49 Stunden bei gleichbleibenden Bedingungen kultiviert. Während der Kultivierung wurden Proben von 1 ml entnommen und die Konzentration von Fettsäuren und co-funktionalisierten Fettsäuren mit der in Beispiel 2 beschriebenen Methode quantifiziert. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
Produktion von co-funktionalisierten Fettsäuren mit £ coli JW5020-1 Kans pBT10_alkL / pJ294[alaDH_Bs_TAcv(ct_Ptac-CpFATB2]. Angegeben sind die Konzentrationen von Laurinsäure und co-Carboxy-Laurinsäure, co-Hydroxy-Laurinsäure und ω-Amino-Laurinsäure nach 60 Stunden Fermentationsdauer:
Beispiel 4: Herstellung eines E. co\'\-Expressionsvektors für die Gene fadD aus Escherichia coli und atfA aus Acinetobacter sp. ADP1
Zur Herstellung des £ co//-Expressionsvektors für die Gene fadD (SEQ ID NR: 21 ) aus
Escherichia coli (kodierend für Enzym Evi) und atfA mit Terminator (SEQ ID NR: 22) aus Acinetobacter sp. ADP1 (kodierend für Enzym Ev) unter Kontrolle eines iac-Promotor wurden diese Gene aus chromosomaler DNA von £ coli W31 10 bzw. Acinetobacter calcoaceticus ADP1 per PCR unter Einbringung homologer Bereiche zur Rekombinationsklonierung amplifiziert. Der synthetische iac-Promotor (SEQ ID NR: 23) wurde mit Ribosombindungsstelle aus einem pJ294-Derivat (DNA 2.0; Menlo Park, CA, USA) unter Einbringung homologer Bereiche amplifiziert. Die Präparation der chromosomalen DNA von £. coli W31 10 bzw.
Acinetobacter calcoaceticus ADP1 erfolgte mittels DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers. Bei der Amplifikation der Gene fadD aus £ coli sowie atfA aus Acinetobacter sp. ADP1 mit chromosomaler DNA von £ coli W31 10 bzw.
Acinetobacter calcoaceticus ADP1 als Matrize, sowie der Amplifikation des synthetischen Promotors Ptac aus einem pJ294-Derivat kamen folgende Oligonukleotide zum Einsatz:
Ptac-
Folgende Parameter wurden für die PCR eingesetzt: 1 x: initiale Denaturierung, 103 °C, 3:00 min; 35 x: Denaturierung, 98 °C, 0:10 min, Annealing, 65°C, 0:15 min; Elongation, 72 °C, 0:45 min; 1 x: terminale Elongation, 72 °C, 10 min. Für die Amplifikation wurde der Phusion™ High- Fidelity Master Mix von New England Biolabs (Frankfurt) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Jeweils 50 μΙ der PCR-Reaktionen wurden anschließend auf einem 1 %igen TAE-Agarosegel aufgetrennt. Die Durchführung der PCR, der Agarose- Gelelektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der PCR- Fragmentgrößen erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
In allen Fällen konnten PCR-Fragmente der erwarteten Größe amplifiziert werden. Diese betrugen für den Promotorbereich Ptac 607 bp, für fadD 1778 bp und für atfA 1540 bp.
Zur Isolierung der DNA aus einem Agarosegel wurde die Ziel-DNA mit einem Skalpell aus dem Gel isoliert und mit dem Quick Gel Extraktion Kit von Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. Die aufgereinigten PCR-Produkte wurden mit dem EcoN\/Nde\ - geschnittenen Vektor pCDFDuet™-1 (71340-3, Merck, Darmstadt) mittels in v/'iro-Klonierung unter Verwendung des Geneart Seamless Cloning and Assembly Kit der Firma Invitrogen (Darmstadt) rekombiniert. Die Verwendung entsprach den Empfehlungen des Herstellers. pCDFDuet-1 ist ein £. co//-Vektor, der in dem Organismus eine Spectinomycin/Streptomycin- Resistenz vermittelt sowie einen ColDF13 Replikationsursprung trägt. Die Transformation chemisch kompetenter £. coli DH5a-Zellen (New England Biolabs, Frankfurt) erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
Die Richtigkeit des Plasmids wurde durch eine Restriktionsanalyse mit Xba\ kontrolliert. Die Authentizität der inserierten Fragmente wurde mittels DNA-Sequenzierung überprüft. Der fertiggestellte £ co//'-Expressionsvektor wurde als pCDF[fadD-atfA] (SEQ ID NR:30), bezeichnet.
Beispiel 5: Produktion von Amino-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäureethylester durch einen E. coli Stamm mit Deletion des Gens fadE und Expressionsvektoren für die Gene fatB2 aus Cuphea palustris, ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkT und alkL aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und atfA aus Acinetobacter sp. ADP1.
Zur Erzeugung eines £ co//-Stammes mit Expressionsvektoren für die Gene fatB2 aus Cuphea palustris (kodierend für Enzym Ε,), ald aus Bacillus subtilis (kodierend für Enzym E3), Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum (kodierend für Enzym E2) in Kombination mit einem
Expressionsvektor für die Gene alkB (kodierend für Enzym E1b), alkG, alkT (kodierend für Hilfsenzyme zu Enzym E1b) und alkL (kodierend für alkL-Genprodukt) aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida GPo1 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli (kodierend für Enzym Evi) und atfA aus Acinetobacter sp. ADP1 (kodierend für Enzym Ev) werden elektrokompetente Zellen von £. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. £ coli JW5020-1 Kans ist ein Derivat von £ coli JW5020-1 (CSGC, The coli genetic stock center, Yale University, New Häven, USA), dieser wiederum ein £ coli BW251 13-Derivat, der eine Deletion des Gens fadE (kodierend für Enzym Eb) trägt. Das Gen fadE wurde durch eine Kanamycinkassette ausgetauscht. Diese wurde vor der Ausstattung des Stammes mit den Expressionsvektoren mit Hilfe eines Helferplasmides, welches für die Flp-Rekombinase codiert, in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise entfernt (siehe Datsenko K.A. and Wanner B.L. (2000) PNAS 97(12):6640-6645), resultierend in Stamm £ coli JW5020-1 Kans. £ coli JW5020-1 Kans und £ coli W31 10 AfadE (Konstruktion in Beispiel 8 beschrieben) werden sequentiell mit den Plasmiden pBT10_alkL, pCDF[fadD-atfA] und pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2] transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Spectinomycin (100 Mg/ml) und Ampicillin (100 Mg/ml) ausplattiert.
Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Auf diese Weise werden die folgenden Stämme konstruiert: E. coli JW5020-1 Kans pBT10_alkL / pCDF[fadD-atfA] / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2] und E. coli W31 10 AfadE pBT10_alkL / pCDF[fadD-atfA] / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2].
Der Stamm wird einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um dessen Fähigkeit zur Produktion von Amino-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäurethylester aus Glucose zu
analysieren. Der zu untersuchende Stamm wird zunächst als Vorkultur in M9-Medium mit Kanamycin (50 Mg/ml), Spectinomycin (100 Mg/ml) und Ampicillin (100 Mg/ml) aus einer
Glycerinkultur bei 37°C über Nacht angezogen. Das Medium, bestehend aus 38 mM
Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat, 22 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 8,6 mM
Natriumchlorid, 37 mM Ammoniumchlorid, 1 ,5 % (w/v) Glucose, 2 mM Magnesiumsulfat- Heptahydrat (alle Substanzen von Merck, Darmstadt) und 0,5 % (v/v) Spurenelemente-Lösung, wird mit 25%iger Ammoniumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die zugegebene Spurenelemente-Lösung bestehend aus 9,7 mM Mangan(ll)chlorid-Tetrahydrat, 6,5 mM Zinksulfat-Heptahydrat, 2,5 mM Natrium-EDTA (Titriplex III), 4,9 mM Borsäure, 1 mM Natriummolybdat-Dihydrat, 32 mM Calciumchlorid-Dihydrat, 64 mM Eisen(ll)sulfat-Heptahydrat und 0,9 mM Kupfer(ll)chlorid-Dihydrat gelöst in 37%iger Salzsäure (alle Substanzen von Merck, Darmstadt) wird vor Zugabe in das M9-Medium sterilfiltriert. Der Fermenter wird mit der
Vorkultur so inokuliert, dass eine optische Dichte von 0,2 erreicht wird. Die Kultivierung erfolgt bei einem pH-Wert von 6,8, geregelt mit 25 % Ammoniakwasser und 0,5 M Schwefelsäure, einem Sauerstoffpartialdruck von 20 %, geregelt über die Rührergeschwindigkeit und den Luftzufluss, und einer Temperatur von 37°C. Die Zufütterung von Glucose erfolgt nach
Verbrauch der im Medium vorhandenen Glucose mit einem Zufluss von 5 g/l/h bezogen auf das Startvolumen. Bei Beginn des Glucose-Zuflusses wird die Temperatur auf 30°C eingestellt. Die Genexpression wird 2 Stunden nach Beginn des Glucose-Zuflusses durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid und 0,025 % Dicyclopropylketon induziert. Zeitgleich zur Induktion werden 2 % (v/v) Methanol oder 2 % (v/v) Ethanol als Methylgruppendonor oder Ethylgruppendonor für die Fettsäureveresterung zugegeben. Der Stamm wird mindestens weitere 48 Stunden bei gleichbleibenden Bedingungen kultiviert. Während der Kultivierung werden Proben von 1 ml entnommen und die Konzentration von Fettsäuremethylestern, Fettsäureethylestern, ω-funktionalisierten Fettsäuremethylestern und co-funktionalisierten Fettsäu reethylestern mit der in Beispiel 2 beschriebenen Methode quantifiziert. Es wird gezeigt, dass der Stämme £. coli JW5020-1 Kans pBT10_alkL / pCDF[fadD-atfA] /
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2] und £. coli W31 10 AfadE pBT10_alkL / pCDF[fadD-atfA] / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CpFATB2] bei Zugabe von 2 % (v/v) Methanol in der Lage ist Laurinsäuremethylester, ω-Hydroxy-Laurinsäuremethylester, co-Oxo- Laurinsäuremethylester, co-Amino-Laurinsäuremethylester und co-Carboxy- Laurinsäuremethylester bzw. bei Zugabe von 2 % (v/v) Ethanol in der Lage ist
Laurinsäureethylester, ω-Hydroxy-Laurinsäureethylester, co-Oxo-Laurinsäureethylester, ω-Amino-Laurinsäureethylester und ω-Carboxy-Laurinsäureethylester zu bilden.
Beispiel 6: Herstellung von Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ald aus Bacillus subtilis und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum
Zur Herstellung eines £. co//-Expressionsvektors für die Gene synUcTE (SEQ ID Nr. 31 ) aus Umbellularia californica (kodierend für ein Enzym Enzym E,), ald (SEQ ID Nr. 33) aus Bacillus subtilis (kodierend für ein Enzym E3) und Cv_2025 (SEQ ID Nr. 35) aus Chromobacterium violaceum (kodierend für ein Enzym E2) wurde das Gen synUcTE für die Expression in
Escherichia coli codonoptimiert und zusammen mit einem iac-Promotor (SEQ ID Nr. 37) synthetisiert. Während der Synthese wurde eine Schnittstelle stromaufwärts des Promotors und eine Schnittstelle stromabwärts des Terminators eingeführt. Das synthetisierte DNA-Fragment Ptac-synUcTE wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamH\ und Not\ verdaut und in den entsprechend geschnittenen Vektor pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) (SEQ ID Nr. 17) sowie den Vektor pJ294 (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA, USA) ligiert. Die fertiggestellten Vektoren wurden als pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38) sowie pJ294[Ptac- synUcTE] (SEQ ID Nr. 39) bezeichnet.
Beispiel 7: Herstellung von Expressionsvektoren für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 sowie atfA 1 aus Alcanivorax borkumensis
Zur Herstellung von Expressionsvektoren für die Gene fadD (SEQ ID Nr. 21 ) aus Escherichia coli und wax-dga T (SEQ ID Nr. 42) (kodierend für ein Enzym Ev) aus Acinetobacter sp. ADP1 bzw. atfA 1 (SEQ ID Nr. 44) (kodierend für ein Enzym Ev) aus Alcanivorax borkumensis SK2 wurden die Gene wax-dgaT und atfA 1 für die Expression in Escherichia coli codonoptimiert und in Kombination mit dem Gen fadD aus E.coli (kodierend für ein Enzym Evi) synthetisiert. Die synthetisierten DNA-Fragmente wax-dgaT_AsADP1-fadD_Ec (SEQ ID Nr. 46) und atfA1_Ab- fadD_Ec (SEQ ID Nr. 47) wurden unter Einbringung homologer Bereiche zur
Rekombinationsklonierung amplifiziert.
Für die Amplifikation des Fragmentes wax-dgaT_AsADP1-fadD_Ec kamen folgenden
Oligonukleotide zum Einsatz:
wax-dgaT_H 1_fw: 5'- ACAGGAGGTAAAACATATGCGTCCTCTGCACCCG-3'
(SEQ ID Nr. 51 )
fadD_H2_rv: 5'- GTTTCTTTACCAG ACTC GAGATTGTTTTCTCTTTAGTG G GC GTC-3 '
(SEQ ID Nr. 52) Für die Amplifikation des Fragmentes atfA1_Ab-fadD_Ec kamen folgende Oligonukleotide zum Einsatz:
atfA_Ab_fw_kurz: 5'- ACAGGAGGTAAAACATATGAAAGCGCTGTCCC-3'
(SEQ ID Nr. 53)
fadD_H2_rv_N: 5'-GTTTCTTTACCAGACTCGAGATTGTTTTCTCTTTAGTGGGC-3'
(SEQ ID Nr. 54)
Folgende Parameter wurden für die PCR eingesetzt: 1 x: initiale Denaturierung, 98 °C,
0:30 min; 35 x: Denaturierung, 98 °C, 0:10 min, Annealing, 70 °C, 0:20 min; Elongation, 72 °C,
1 min; 1 x: terminale Elongation, 72 °C, 10 min. Für die Amplifikation wurde der Phusion™ High- Fidelity Master Mix von New England Biolabs (Frankfurt) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Jeweils 50 μΙ der PCR-Reaktionen wurden anschließend auf einem 1 %igen TAE-Agarosegel aufgetrennt. Die Durchführung der PCR, der Agarose-Gel- Elektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der PCR-Fragmentgrößen erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise. In beiden Fällen konnten PCR-Fragmente der erwarteten Größe amplifiziert werden. Diese betrugen für wax-dgaT_AsADP1-fadD_Ec 3192 Basenpaare und atfA1_Ab-fadD_Ec 3189 Basenpaare. Zur Isolierung der DNA aus dem Agarosegel wurde die Ziel-DNA mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten und mit dem QiaQuick Gel extraction Kit nach Anleitung des Herstellers (Qiagen, Hilden) aufgereinigt. Die aufgereinigten PCR-Produkte wurden in ein Ndel- und X/?o/-geschnittenen pCDF-Derivat, das bereits einen synthetischen iac-Promotor (SEQ ID Nr. 50) enthält, mittels Rekombination unter Verwendung des Geneart® Seamless Cloning and Assembly Kit nach Anleitung des Herstellers (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) kloniert. Die Transformation chemisch kompetenter E.coli DH5a (New England Biolabs, Frankfurt) erfolgte nach dem Fachmann bekannter Art und Weise. Die korrekte Insertion der Zielgene wurde durch Restriktionsanalyse überprüft und die Autentizitat der eingebrachten Gene durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die entstandenen Expressionsvektoren wurden als pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 48) und pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 49) bezeichnet.
Beispiel 8: Produktion von Aminolaurinsäuremethylester durch einen E. coli Stamm mit Deletion im Gen fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkT und alkL aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfAI aus Alcanivorax borkumensis
Zunächst wurde ein E.coli Stamm mit Deletion im Gen fadE (SEQ ID Nr. 40) konstruiert. Zur Herstellung der Gendeletion wurde ein Plasmid konstruiert, welches die DNA-Sequenz AfadE (SEQ ID Nr. 55) trägt. Diese Sequenz wurde synthetisiert und besteht aus homologen
Bereichen 500 Basenpaare stromaufwärts und stromabwärts des fadE-Gens sowie der Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Not\ am 5'- und 3'-Ende. Die Sequenz AfadE wurde mit der Restriktionsendonuclease Not\ verdaut und in den entsprechend geschnittenen Vektor pK03 ligiert. Die Konstruktion des Stammes E.coli W31 10 AfadE erfolgte mit Hilfe des pK03-AfadE Konstruktes (SEQ ID Nr. 56) mit dem Fachmann bekannten
Methoden (siehe Link AJ, Phillips D, Church GM. J.Bacteriol. 1997. 179(20)). Die DNA-Sequenz von fadE nach Deletion ist in SEQ ID Nr. 57 wiedergegeben.
Zur Erzeugung eines £. co//-Stammes mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB (Enzym E1a), alkG, alkT
(Hilfsenzyme zu Enzym E1b) und alkL (kodierend für alkL-Genprodukt) aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida GPo1 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA1 aus Alcanivorax borkumensis SK2 wurden elektrokompetente Zellen von E. coli W31 10 AfadE hergestellt. Dies geschah in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. £. co// W31 10 AfadE wurde sequentiell mit den Plasmiden pBT10_alkL (Sequenz und Herstellung vergleiche Beispiel 1 der
PCT/EP201 1/053834 bzw. die dort aufgeführte Seq ID NR: 8),
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38) und pCDF[wax- dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 48) bzw. pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 49) transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 μg/ml) ausplattiert.
Transformanten wurden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Auf diese Weise wurden folgende Stämme konstruiert:
E. coli W31 10 AfadE pBT10_alkL / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax- dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
E. coli W31 10 AfadE pBT10_alkL / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Die Stämme wurden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um dessen Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy- Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wurde mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt.
Für die Fermentation wurden 1 L-Reaktoren verwendet, die mit Überkopf-Rührern und
Impellerturbinen ausgerüstet waren. Zur Prozessüberwachung wurden pH und p02 online gemessen. OTR/CTR Messungen dienten u.a. zur Abschätzung der Stoffwechselaktivität und Fitness der Zellen.
Die pH-Sonden wurden mittels einer Zwei-Punkt-Kalibration mit Maßlösungen von pH 4,0 und pH 7,0 laut technischer Referenz der Firma DASGIP kalibriert. Die Reaktoren laut technischer Referenz mit den nötigen Sensoren und Anschlüssen versehen und die Rührwelle montiert. Sie wurden mit 300 ml_ Wasser befüllt und 20 min bei 121 °C autoklaviert um Sterilität zu
gewährleisten. Anschließend wurden die p02 Sonden über Nacht nach Anschluss an die
Messverstärker polarisiert. Anschließend wurde das Wasser unter der Clean Bench entnommen und durch Hochzelldichtemedium bestehend aus (NH4)2SQ4 1 ,76 g/L, K2HPQ4 19,08 g/L, KH2P04 12,5 g/L, Hefeextrakt 6,66 g/L, Trinatriumcitrat dihydrat 1 1 ,2g, 17mL IL einer separat autoklavierten 1 %igen Ammoniumeisencitrat-Lösung, und 5 mL/L separat autoklavierten Spurenelement-Stammlösung (bestehend aus HCl (37 %) 36,50 g/L, MnCI2 *4H20 1 ,91 g/L, ZnS04 *7H20 1 ,87 g/L, Ethylendiamintetraessigsäure dihydrat 0,84 g/L, H3BO30,30 g/L.
Na2Mo04 *2H20 0,25 g/L, CaCI2 *2H20 4,70 g/L, FeS04 *7H20 17,80 g/L, CuCI2 *2H20 0,15 g/L) mit 15 g/L Glucose als Kohlenstoffquelle (zugesetzt durch Dosieren von 30 mL/L einer separat autoklavierten Feedlösung bestehend aus 500 g/L Glucose, 1 % (w/v) MgS04 *7H20 und 2,2 % (w/v) NH4CI) mit 100 mg/L Ampicillin, 50 mg/L Kanamycin und 100 mg/L Spectinomycin ersetzt. Im Folgenden wurden die p02-Sonden mit einer Einpunkt-Kalibration (Rührer: 600 rpm / Begasung: 10 sL/h Luft) kalibriert und die Feed-, Korrekturmittel- und Induktionsmittelstrecken mittels Cleaning-in-Place laut technischer Referenz gereinigt. Dazu wurden die Schläuche mit 70 % Ethanol, anschließend mit 1 M NaOH, dann mit sterilem VE-Wasser gespült und zuletzt mit den jeweiligen Medien befüllt.
Die Stämme W31 10 AfadE pJ294[alaDH_Bs/TAcv(ct)]{Ptac}[synUcTE] pBT10_alkL
pCDF[atfA_AsADP1 (co_Ec)/fadD] und W31 10 AfadE
pJ294[alaDH_Bs/TAcv(ct)]{Ptac}[synUcTE] pBT10_alkL pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)/fadD] wurde zuerst aus einer Cryokultur in LB-Medium (25mL in einem 100 mL Schikanekolben) mit 100 mg/L Ampicillin, 50 mg/L Kanamycin und 100 mg/L Spectinomycin über Nacht bei 37°C und 200 rpm für ca. 18h angezogen. Anschließend wurden 2 mL dieser Kultur für eine zweite Vorkultur- Stufe in 25 mL Hochzelldichtemedium bestehend aus (NH4)2S04 1 ,76 g/L, K2HP04 19,08 g/L, KH2P04 12,5 g/L, Hefeextrakt 6,66 g/L, Trinatriumcitrat dihydrat 1 1 ,2g, 17mL /L einer separat autoklavierten 1 %igen Ammoniumeisencitrat-Lösung, und 5 mL/L separat autoklavierten Spurenelement-Stammlösung (bestehend aus HCl (37 %) 36,50 g/L, MnCI2 *4H20 1 ,91 g/L, ZnS04 *7H20 1 ,87 g/L, Ethylendiamintetraessigsäure dihydrat 0,84 g/L, H3BO30,30 g/L.
Na2Mo04 *2H20 0,25 g/L, CaCI2 *2H20 4,70 g/L, FeS04 *7H20 17,80 g/L, CuCI2 *2H20 0,15 g/L) mit 15 g/L Glucose als Kohlenstoffquelle (zugesetzt durch Dosieren von 30 mL/L einer separat autoklavierten Feedlösung bestehend aus 500 g/L Glucose, 1 % (w/v) MgS04 *7H20 und 2,2 % (w/v) NH4CI) mit den bereits beschriebenen Antibiotika in einem 100 mL Schüttelkolben überführt und wiederum bei 37 °C / 200rpm für weitere 6 h inkubiert.
Um die Reaktoren mit einer optischen Dichte von 0,1 anzuimpfen wurde die OD der zweiten Vorkulturstufe gemessen und die zum Animpfen benötigte Kulturmenge berechnet. Die notwendige Kulturmenge wurde mit Hilfe einer 5 ml_ Spritze durch ein Septum in den temperierten und belüfteten Reaktor gegeben.
Folgendes Standardprogramm wurde verwendet:
Der pH-Wert wurde einseitig mit 12, 5%iger Ammoniak-Lösung auf pH 6,8 geregelt. Während Anzucht und Biotransformation wurde der Gelöstsauerstoff (p02 oder DO) in der Kultur über Rührerdrehzahl und Begasungsrate auf mindestens 30 % geregelt. Nach Animpfen fiel der DO von 100 % auf diese 30 %, wo er für den Rest der Fermentation stabil gehalten wurde.
Die Fermentation wurde als Fedbatch durchgeführt wobei der Feedstart als Eingang zur Fed- Phase mit 5 g/Lh Glucosefeed bestehend aus 500 g/L Glucose, 1 % (w/v) MgS04 *7H20 und 2,2 % (w/v) NH4CI über den das Ende der Batch-Phase indizierenden DO-Peak getriggert wurde. Mit Feedstart wurde auch die Temperatur von 37°C auf 30°C gesenkt.
Den Reaktoren wurden zu diesem Zeitpunkt 24 mL Ölsäure, eines Ölsäure/Hexadecan- (1 :1 (w/w)) oder eines 2-Hexyldecansäure/Hexadecan-Gemisches (1 :1 (w/w)) zugesetzt. 2 h nach Feedstart wurde durch die automatische Zugabe einer vorbereiteten IPTG-Lösung für 1 mM Endkonzentration im Reaktor die Expression der Gene fadD aus Escherichia coli und atfA aus Acinetobacter sp. ADP1 bzw. atfA1 aus Alcanivorax borkumensis SK2 induziert. Diese IPTG- Lösung enthielt außerdem 3 mL Methanol, das für die Veresterung der produzierten Fettsäuren benötigt wird. Die Induktion der alkBGT-Gene erfolgte durch die manuelle Zugabe von 0,025 % (v/v) DCPK 10h nach Feedstart.
Während der Kultivierung wurden Proben entnommen und die Konzentration von Fettsäuren und co-funktionalisierten Fettsäuren mit der im Folgenden beschriebenen Methode quantifiziert. Zur Probennahme wurden 2 mL Fermentationsbrühe aus dem Kessel entnommen und ein Teil davon 1/10 in einem Acetonitril-Ameisensäure-Gemisch (80 % (v/v) Aceton itril in Wasser; 0,1 % (v/v) Ameisensäure) verdünnt.
Die Quantifizierung von Laurinsäuremethylester LSME, co-Hydroxy-Laurinsäuremethylester HLSME, co-Oxo-Laurinsäuremethylester OLSME, ω-Amino-Laurinsäuremethylester ALSME und ω-Carboxy-Laurinsäuremethylester DDSME, ω-Amino-Laurinsäure ALS, co-Carboxy- Laurinsäure DDS, Laurinsäure LS, co-Hydroxy-Laurinsäure HLS und co-Oxo-Laurinsäure OLS in den Fermentationsproben erfolgte mittels LC-ESI/MS2 anhand einer externen Kalibrierung für alle Analyten (0.1 - 50 mg/L) und unter Verwendung der internen Standards
Aminoundekansäure (AUD), d4-ALSME, 13C-DDSME und d3-LSME.
Dabei kamen folgende Geräte zum Einsatz:
• HPLC Anlage 1260 (Agilent; Böblingen) mit Autosampier (G1367E), binärer Pumpe (G1312B) und Säulenofen (G1316A)
• Massenspektrometer TripelQuad 6410 (Agilent; Böblingen) mit ESI-Quelle
• HPLC-Säule: Kinetex C18, 100 x 2,1 mm, Partikelgröße: 2,6 μηι, Porengröße 100 A (Phenomenex; Aschaffenburg)
• Vorsäule: KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter; 0,5 μηη Filtertiefe und 0,004 mm
Innendurchmesser (Phenomenex; Aschaffenburg) Die Proben wurden vorbereitet, indem 1900 μΙ_ Lösungsmittel (80 % (v/v) ACN, 20 % bidest. H20 (v/v), + 0.1 % Ameisensäure) und 100 μΙ_ Probe in ein 2-mL-Reaktionsgefäß pipettiert wurden. Das Gemisch wurde ca. 10 Sekunden gevortext und anschließend bei ca. 13000 rpm für 5 min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde mit einer Pipette entnommen und nach entsprechender Verdünnung mit Diluent (80 % (v/v) ACN, 20 % bidest. H20 (v/v), + 0.1 % Ameisensäure) analysiert. Zu je 900 μΙ_ Probe wurden 100 μΙ_ ISTD hinzupipettiert (10 μΙ_ bei einem Probenvolumen von 90 μΙ_).
Die HPLC-T rennung erfolgte mit oben genannter Säule bzw. Vorsäule. Das Injektionsvolumen betrug 0,7 uL, die Säulentemperatur 50 °C, die Flussrate 0,6 mL/min. Die mobile Phase bestand aus Eluent A (0,1 %ige (v/v) wässrige Ameisensäure) und Eluent B (Acetonitril mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure). Folgendes Gradientenprofil wurde genutzt
Die ESI-MS2-Analyse erfolgte im positiven Modus mit folgenden Parametern der ESI-Quelle:
• Gastemperatur 280 °C
• Gasfluss 1 1 L/min
• Nebulizerdruck 50 psi
• Kapillarspannung 4000 V
Die Detektion und Quantifizierung der einzelnen Verbindungen erfolgte mit den folgenden Parametern, wobei jeweils ein Produkt-Ion als Qualifier und eines als Quantifier genutzt wurde:
Es wurde gezeigt, dass die Stämme £. co//' W31 10 AfadE pBT10_alkL /
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] und E. coli W31 10 AfadE pBT10_alkL / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol in der Lage sind,
Laurinsäuremethylester, co-Hydroxy-Laurinsäuremethylester, co-Oxo-Laurinsäuremethylester, co- Amino-Laurinsäuremethylester und co-Carboxy-Laurinsäuremethylester zu bilden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass beide Stämme unter diesen Bedingungen ebenso
Laurinsäure, co-Hydroxy-Laurinsäure, co-Oxo-Laurinsäure, co-Amino-Laurinsäure und co-Carboxy- Laurinsäure bilden.
Produktion von ω-funktionalisierten Fettsäuremethylestern. Angegeben sind die
Konzentrationen von Laurinsäuremethylester, co-Carboxy-Laurinsäuremethylester, co-Hydroxy- Laurinsäuremethylester, co-Oxo-Laurinsäuremethylester und co-Amino-Laurinsäuremethylester nach 38,33 Stunden Fermentationsdauer.
Beispiel 9: Produktion von Aminolaurinsäuremethylester durch einen E. coli Stamm mit Deletion des Gens fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA 1 aus Alcanivorax borkumensis
Zur Erzeugung eines £. co//-Stammes mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk- Operon von Pseudomonas putida GPo1 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder aff>47 aus Alcanivorax borkumensis SK2 werden elektrokompetente Zellen von £ coli W31 10 AfadE (Konstruktion in Beispiel 8 beschrieben) hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. £ co// W31 10 AfadE wird sequentiell mit den Plasmiden pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447),
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 5) und pCDF[wax- dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 16) bzw. pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 17) transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch
Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli W31 10 Afad E ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] · £. coli W31 10 Afad E ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Der Stamm wirde einer fed-bafc/7-Fermentation unterzogen, um dessen Fähigkeit zur
Produktion von Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy- Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass die Stämme £ coli W31 10 AfadE pBT10 /
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] und £ coli W31 10 AfadE ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol in der Lage sind Laurinsäure, Laurinsäuremethylester, ω-Hydroxy-Laurinsäuremethylester, co-Oxo- Laurinsäuremethylester, co-Amino-Laurinsäuremethylester und co-Carboxy- Laurinsäuremethylester zu bilden. Beispiel 10: Produktion von Aminohexansäuremethylester, Aminooctansäuremethylester, Aminodecansäuremethylester, Aminotetradecansäuremethylester und Amino-9- hexadecensäuremethylester durch E. coli Stämme ohne Deletion eines fad-Gens sowie mit Deletion eines der Gene fadA, fadB, fadD, fadE oder fadL und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ChFATB2 aus Cuphea hookeriana, CnFATB3 aus Cocos nucifera oder CPF_2954 aus Clostridium perfringens sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida und einem
Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA 1 aus Alcanivorax borkumensis
Zur Erzeugung von £ co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ChFATB2 aus Cuphea hookeriana (SEQ ID NR: 58), CnFATB3 aus Cocos nucifera (SEQ ID NR: 60) oder CPF_2954 aus Clostridium perfringens (SEQ ID NR: 62) sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida GPo1 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA1 aus Alcanivorax borkumensis SK2 werden elektrokompetente Zellen von £ coli BW251 13, JW5578-1 Kans, JW3822-1 Kans, JW1794-1 Kans, JW5020-1 Kans und JW2341 -1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
£ coli JW5578-1 Kans, JW3822-1 Kans, JW1794-1 Kans, JW5020-1 Kans und JW2341 -1 Kans sind Derivate von £. coli £ co/ JW5578-1 , JW3822-1 , JW1794-1 , JW5020-1 und JW2341 -1 (CSGC, The coli genetic stock center, Yale University, New Häven, USA), diese wiederum £ coli BW251 13-Derivate, die eine Deletion der Gene fadA (SEQ ID NR: 64; kodierend für Enzym Ef), fadB (SEQ ID NR: 66; kodierend für Enzym Ed und ein Enzym Ee), fadD (SEQ ID NR: 21 ; kodierend für Enzym Ea), fadE (SEQ ID NR: 40; kodierend für Enzym Eb) und fadL (SEQ ID NR: 68; kodierend für ein Enzym, dass den Transport von Fettsäuremethylestern über die äußere Membran katalysiert) tragen. Die Gene fadA, fadB, fadD, fadE und fadL werden durch eine Kanamycinkassette ausgetauscht. Diese wird vor der Ausstattung des Stammes mit den
Expressionsvektoren mit Hilfe eines Helferplasmides, welches für die FIp-Rekombinase codiert, in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise entfernt (siehe Datsenko K.A. and Wanner B.L. (2000) PNAS 97(12):6640-6645), resultierend in Stämmen JW5578-1 Kans, JW3822-1 Kans, JW1794-1 Kans, JW5020-1 Kans und JW2341 -1 Kans
BW251 13, JW5578-1 Kans, JW3822-1 Kans, JW1794-1 Kans, JW5020-1 Kans und JW2341 -1 Kans werden sequentiell mit den Plasmiden
1 . pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
pJ294[alaDH_ _B.s. _TA_C.v.(Ct)_ _Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38),
pJ294[alaDH_ _B.s. _TA_C.v.(Ct)_ _Ptac-ChFATB2] (SEQ ID Nr. 70),
pJ294[alaDH_ _B.s. _TA_C.v.(Ct)_ _Ptac-CnFATB3] (SEQ ID Nr. 71 ), oder
pJ294[alaDH_ _B.s. _TA_C.v.(Ct)_ _Ptac-CPF_2954] (SEQ ID Nr. 72),
und
3. pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 16) bzw. pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)- fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 17)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Die Plasmide pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] (SEQ ID Nr. 38),
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] (SEQ ID Nr. 70) und
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] (SEQ ID Nr. 71 ) werden ausgehend von dem Plasmid pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 72) erzeugt, indem das für die Thioesterase synUcTE kodierende Gen zusammen mit Ptac und einem 3'-flankierenden Bereich über Bam UNoü aus dem Vektor ausgeschnitten wird und durch die die Thioesterasen ChFATB2 (SEQ ID Nr. 59) CnFATB3 (SEQ ID Nr. 61 ) oder CPF_2954 (SEQ ID Nr. 63) kodierenden Genen (incl. Ptac und identischem 3'-flankierenden Bereich) ersetzt wird. Diese Fragmente werden durch Gensynthese erzeugt, wobei die für ChFATB2 und CnFATB3 kodierenden Bereiche für die Translation in E. coli codon-optimiert werden, der für CPF_2954 kodierende Bereich jedoch nicht codon-optimiert, sondern die wildtypische Sequenz verwendet wird.
Auf diese Weise werden unter Anderem folgende Stämme konstruiert:
· E. coli BW251 13 pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax- dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] • £ coli BW251 13 pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] · £ coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW3822-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• E. coli JW3822-1 Kans pBT 0 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £. coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] · £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Diese Stämme werden einer ed-bafch-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy- Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie Hydroxy- Tetradecansäuremethylester, Oxo-Tetradecansäuremethylester, Carboxy- Tetradecansäuremethylester und Amino-Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie
Tetradecansäuremethylester, Hydroxy-Tetradecansäuremethylester, Oxo- Tetradecansäuremethylester, Carboxy-Tetradecansäuremethylester und Amino- Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Weiterhin werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli BW251 13 ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[wax- dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli BW251 13 ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £. coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW3822-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW3822-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] • £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] · £ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £. coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Octansäuremethylester, Oxo-Octansäuremethylester, Carboxy- Octansäuremethylester und Amino-Octansäuremethylester sowie Hydroxy- Decansäuremethylester, Oxo-Decansäuremethylester, Carboxy-Decansäuremethylester und Amino-Decansäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Octansäuremethylester, Hydroxy-Octansäuremethylester, Oxo-Octansäuremethylester, Carboxy-Octansäuremethylester und Amino-Octansäuremethylester sowie
Decansäuremethylester, Hydroxy-Decansäuremethylester, Oxo-Decansäuremethylester, Carboxy-Decansäuremethylester und Amino-Decansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Weiterhin werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli BW251 13 ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[wax- dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli BW251 13 ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] • £ coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW3822-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW3822-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £. coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy- Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie Hydroxy- Tetradecansäuremethylester, Oxo-Tetradecansäuremethylester, Carboxy- Tetradecansäuremethylester und Amino-Tetradecansäuremethylester sowie Hydroxy-9- Hexadecensäuremethylester, Oxo-9-Hexadecensäuremethylester, Carboxy-9- Hexadecensäuremethylester und Amino-9-Hexadecensäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie
Tetradecansäuremethylester, Hydroxy-Tetradecansäuremethylester, Oxo- Tetradecansäuremethylester, Carboxy-Tetradecansäuremethylester und Amino- Tetradecansäuremethylester sowie 9-Hexadecensäuremethylester, Hydroxy-9- Hexadecensäuremethylester, Oxo-9-Hexadecensäuremethylester, Carboxy-9- Hexadecensäuremethylester und Amino-9-Hexadecensäuremethylester aus Glucose zu bilden. Schließlich werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli BW251 13 ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[wax- dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli BW251 13 pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] · £. coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW3822-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW3822-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] · £ coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] • £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Octansäuremethylester, Oxo-Octansäuremethylester, Carboxy- Octansäuremethylester und Amino-Octansäuremethylester sowie Hydroxy- Hexansäuremethylester, Oxo-Hexansäuremethylester, Carboxy-Hexansäuremethylester und Amino-Hexansäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Octansäuremethylester, Hydroxy-Octansäuremethylester, Oxo-Octansäuremethylester, Carboxy-Octansäuremethylester und Amino-Octansäuremethylester sowie
Hexansäuremethylester, Hydroxy-Hexansäuremethylester, Oxo-Hexansäuremethylester, Carboxy-Hexansäuremethylester und Amino-Hexansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Beispiel 11: Produktion von Aminohexansäure, Aminooctansäure, Aminodecansäure,
Aminotetradecansäure und Amino-9-hexadecensäure durch E. coli Stämme mit Deletion eines der Gene fadA, fadB, fadD, fadE oder fadL und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ChFATB2 aus Cuphea hookeriana, CnFATB3 aus Cocos nucifera oder CPF_2954 aus Clostridium perfringens (Genbank Acc. # ABG82470 SEQ-ID XY) sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem
Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida
Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ChFATB2 aus Cuphea hookeriana (SEQ ID NR: 58), CnFATB3 aus Cocos nucifera (SEQ ID NR: 60) oder CPF_2954 aus Clostridium perfringens (SEQ ID NR: 62) sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida GPo1 werden elektrokompetente Zellen von £ coli JW5578-1 Kans, JW3822-1 Kans, JW1794-1 Kans, JW5020-1 Kans und JW2341 -1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5578-1 Kans, JW3822-1 Kans, JW1794-1 Kans, JW5020-1 Kans und JW2341 -1 Kans werden sequentiell mit den Plasmiden
1 . pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
2. pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38),
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] (SEQ ID Nr. 70),
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] (SEQ ID Nr. 71 ), oder
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] (SEQ ID Nr. 72) transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml) und Ampicillin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische
Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft.
Auf diese Weise werden unter Anderem folgende Stämme konstruiert:
£ coli BW251 13 ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] · £ coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE]
£. coli JW3822-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE]
£ coli JW1794-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE]
£ coli JW5020-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE]
£ coli JW2341 -1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Laurinsäure, Oxo-Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino- Laurinsäure sowie Hydroxy-Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino-Tetradecansäure aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach
Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind, Laurinsäure, Hydroxy-Laurinsäure, Oxo- Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino-Laurinsäure sowie Tetradecansäure, Hydroxy- Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino- Tetradecansäure aus Glucose zu bilden.
Weiterhin werden folgende Stämme konstruiert:
£ coli BW251 13 ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2]
£ coli JW5578-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2]
£ coli JW3822-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2]
£. coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] · £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] /
£ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Octansäure, Oxo-Octansäure, Carboxy-Octansäure und Amino- Octansäure sowie Hydroxy-Decansäure, Oxo-Decansäure, Carboxy-Decansäure und Amino- Decansäure aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach
Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind, Octansäure, Hydroxy-Octansäure, Oxo- Octansäure, Carboxy-Octansäure und Amino-Octansäure sowie Decansäure, Hydroxy- Decansäure, Oxo-Decansäure, Carboxy-Decansäure und Amino-Decansäure aus Glucose zu bilden.
Weiterhin werden folgende Stämme konstruiert:
£ coli BW251 13 ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3]
£ coli JW5578-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3]
£ coli JW3822-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] · £ coli JW1794-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3]
£ coli JW5020-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] • £ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Laurinsäure, Oxo-Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino- Laurinsäure sowie Hydroxy-Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino-Tetradecansäure sowie Hydroxy-9-Hexadecensäure, Oxo-9-Hexadecensäure, Carboxy-9-Hexadecensäure und Amino-9-Hexadecensäure aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind, Laurinsäure, Hydroxy-Laurinsäure, Oxo- Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino-Laurinsäure sowie Tetradecansäure, Hydroxy- Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino- Tetradecansäure sowie 9-Hexadecensäure, Hydroxy-9-Hexadecensäure, Oxo-9- Hexadecensäure, Carboxy-9-Hexadecensäure und Amino-9-Hexadecensäure aus Glucose zu bilden.
Schließlich werden folgende Stämme konstruiert:
£. coli BW251 13 pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954]
£ coli JW5578-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954]
£ coli JW3822-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954]
£ coli JW1794-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954]
£ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] £ coli JW2341 -1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Octansäure, Oxo-Octansäure, Carboxy-Octansäure und Amino- Octansäure sowie Hydroxy-Hexansäure, Oxo-Hexansäure, Carboxy-Hexansäure und Amino- Hexansäure aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach
Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind, Octansäure, Hydroxy-Octansäure, Oxo- Octansäure, Carboxy-Octansäure und Amino-Octansäure sowie Hexansäure, Hydroxy- Hexansäure, Oxo-Hexansäure, Carboxy-Hexansäure und Amino-Hexansäure aus Glucose zu bilden.
Beispiel 12: Produktion von Aminolaurinsäuremethylester durch einen E. coli Stamm mit Deletion im Gen fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ald aus Bacillus subtilis, Psyr_4866 aus Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, PFL_5927 aus Pseudomonas protegens Pf-5, PSPPH_4896 aus Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A oder PSPTOT1_2473 aus Pseudomonas syringae pv. tomato T1 in
Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkT und alkL aus dem alk- Operon von Pseudomonas putida und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus
Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA1 aus Alcanivorax borkumensis Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ald aus Bacillus subtilis, Psyr_4866 aus Pseudomonas syringae pv. syringae B728a (SEQ ID Nr. 73), PFL_5927 aus Pseudomonas protegens Pf-5 (SEQ ID Nr. 75), PSPPH_4896 aus Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A (SEQ ID Nr. 77) oder PSPTOT1_2473 aus Pseudomonas syringae pv. tomato T1 (SEQ ID Nr. 79) in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida GPo1 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA1 aus Alcanivorax borkumensis werden elektrokompetente Zellen von E. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
2. pJ294[alaDH_B.s._TA_Psyr_4866_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 81 ),
pJ294[alaDH_B.s._TA_PFL_5927_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 82),
pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPPH_4896_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 83), oder
pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPTOT1_2473_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 84),
und 3. pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 16) bzw. pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)- fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 17) transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpraparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Die Plasmide pJ294[alaDH_B.s._Psyr_4866_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 81 ),
pJ294[alaDH_B.s._TA_PFL_5927_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 82),
pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPPH_4896_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 83) und
pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPTOT1_2473_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 84) werden ausgehend von dem Plasmid pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38) erzeugt, indem das für die Transaminase Cv_2025 kodierende Gen zusammen mit dem 3'-Ende des ald-Gens aus Bacillus subtilis und einem 3'-flankierenden Bereich über Bgl\\/Fse\ aus dem Vektor ausgeschnitten wird und durch die die Transaminasen Psyr_4866 (SEQ ID Nr. 74), PFL_5927 (SEQ ID Nr. 76), PSPPH_4896 (SEQ ID Nr. 78) oder PSPTOT1_2473 (SEQ ID Nr. 80) kodierenden Genen (incl. dem 3'-Ende des ald-Gens aus Bacillus subtilis und identischem 3'-flankierenden Bereich) ersetzt wird. Diese Fragmente werden durch Gensynthese erzeugt, wobei die für Psyr_4866, PFL_5927, PSPPH_4896 und PSPTOT1_2473 kodierenden Bereiche für die Translation in £ coli codon-optimiert werden.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._Psyr_4866_Ptac-synUcTE] /
pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._Psyr_4866_Ptac-synUcTE] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £. coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_PFL_5927_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_PFL_5927_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] • £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPPH_4896_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPPH_4896_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] · £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPTOT1_2473_Ptac-synUcTE]
/ pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £. coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPTOT1_2473_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur
Produktion von Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy- Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie Hydroxy- Tetradecansäuremethylester, Oxo-Tetradecansäuremethylester, Carboxy- Tetradecansäuremethylester und Amino-Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie
Tetradecansäuremethylester, Hydroxy-Tetradecansäuremethylester, Oxo- Tetradecansäuremethylester, Carboxy-Tetradecansäuremethylester und Amino- Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Beispiel 13: Produktion von Aminolaurinsäure durch einen E. coli Stamm mit Deletion im Gen fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ald aus Bacillus subtilis, Psyr_4866 aus Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, PFL_5927 aus Pseudomonas protegens Pf-5, PSPPH_4896 aus Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A oder PSPTOT1_2473 aus Pseudomonas syringae pv. tomato T1 in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkT und alkL aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida Zur Erzeugung von £ co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ald aus Bacillus subtilis, Psyr_4866 aus Pseudomonas syringae pv. syringae B728a (SEQ ID Nr. 73), PFL_5927 aus Pseudomonas protegens Pf-5 (SEQ ID Nr. 75), PSPPH_4896 aus Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A (SEQ ID Nr. 77) oder
PSPTOT1_2473 aus Pseudomonas syringae pv. tomato T1 (SEQ ID Nr. 79 in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida GPo1 werden elektrokompetente Zellen von £ coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
2. pJ294[alaDH_B.s._TA_Psyr_4866_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 81 ),
pJ294[alaDH_B.s._TA_PFL_5927_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 82),
pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPPH_4896_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 83), oder
pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPTOT1_2473_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 84)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml) und Ampicillin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische
Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._Psyr_4866_Ptac-synUcTE]
• £. coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_PFL_5927_Ptac-synUcTE]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPPH_4896_Ptac-synUcTE]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10pJ294[alaDH_B.s._TA_PSPTOT1_2473_Ptac-synUcTE] Diese Stämme werden einer fed-bafc/7-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur
Produktion von Hydroxy-Laurinsäure, Oxo-Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino- Laurinsäure sowie Hydroxy-Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino-Tetradecansäure aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach
Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind, Laurinsäure, Hydroxy-Laurinsäure, Oxo- Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino-Laurinsäure sowie Tetradecansäure, Hydroxy- Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino- Tetradecansäure aus Glucose zu bilden.
Beispiel 14: Produktion von Aminolaurinsäuremethylester durch einen E. coli Stamm mit Deletion im Gen fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, alr2355 aus Nostoc sp. PCC 7120, Rleg_1610 aus Rhizobium leguminasorum bv. trifolii WSM1325, blr1738 (aldA) aus Bradyrhizobium japonicum USDA 110 oder BMD_5199 aus Bacillus megaterium DSM 319 sowie Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkT und alkL aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA1 aus Alcanivorax borkumensis
Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, alr2355 aus Nostoc sp. PCC 7120 (SEQ ID Nr. 85), Rleg_1610 aus Rhizobium leguminasorum bv. trifolii WS M 1325 (SEQ ID Nr. 87), blr1738 (aldA) aus
Bradyrhizobium japonicum USDA 1 10 (SEQ ID Nr. 89) oder BMD_5199 aus Bacillus megaterium DSM 319 (SEQ ID Nr. 91 ) sowie Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk- Operon von Pseudomonas putida GPo1 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder aff>47 aus Alcanivorax borkumensis werden elektrokompetente Zellen von E. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
2. pJ294[alr2355_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 93),
pJ294[Rleg_1610_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 94),
pJ294[blr1738_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 95), oder
pJ294[BMD_5199_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 96), und
3. pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 16) bzw. pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)- fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 17)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpraparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Die Plasmide pJ294[alr2355_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 93),
pJ294[Rleg_1610_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 94),
pJ294[blr1738_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 95) und
pJ294[BMD_5199_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 96) werden ausgehend von dem Plasmid pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38) erzeugt, indem das für die Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis kodierende Gen zusammen mit dem Piacuvs und dem 5'-Ende des Cv_2025-Gens aus Chromobacterium violaceum über Pst\/EcoN\ aus dem Vektor ausgeschnitten wird und durch die die Alanin-Dehydrogenasen alr2355 (SEQ ID Nr. 86), Rleg_1610 (SEQ ID Nr. 88), blr1738 (SEQ ID Nr. 90) oder BMD_5199 (SEQ ID Nr. 92 kodierenden Genen (incl. Piacuvs und dem 5'-Ende des Cv_2025-Gens aus Chromobacterium violaceum) ersetzt wird. Diese Fragmente werden durch Gensynthese erzeugt, wobei die für alr2355, Rleg_1610, blr1738 und BMD_5199 kodierenden Bereiche nicht für die Translation in £ coli codon-optimiert, sondern die wildtypischen Sequenzen verwendet werden.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alr2355_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alr2355_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] · £. coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[Rleg_1610_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[Rleg_1610_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[blr1738_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] • £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[blr1738_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[BMD_5199_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] · £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[BMD_5199_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy- Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie Hydroxy- Tetradecansäuremethylester, Oxo-Tetradecansäuremethylester, Carboxy-
Tetradecansäuremethylester und Amino-Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie
Tetradecansäuremethylester, Hydroxy-Tetradecansäuremethylester, Oxo- Tetradecansäuremethylester, Carboxy-Tetradecansäuremethylester und Amino- Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Beispiel 15: Produktion von Aminolaurinsäure durch einen E. coli Stamm mit Deletion im Gen fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbeiiuiaria californica, alr2355 aus Nostoc sp. PCC 7120, Rleg_1610 aus Rhizobium leguminasorum bv. trifolii WSM1325, blr1738 (aldA) aus Bradyrhizobium japonicum USDA 110 oder BMD_5199 aus Bacillus megaterium DSM 319 sowie Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem
Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkl und alkL aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbeiiuiaria californica, alr2355 aus Nostoc sp. PCC 7120 (SEQ ID Nr. 85), Rleg_1610 aus Rhizobium leguminasorum bv. trifolii WS M 1325 (SEQ ID Nr. 87), blr1738 {aldA) aus
Bradyrhizobium japonicum USDA 1 10 (SEQ ID Nr. 89) oder BMD_5199 aus Bacillus megaterium DSM 319 (SEQ ID Nr. 91 ) sowie Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk- Operon von Pseudomonas putida GPo1 werden elektrokompetente Zellen von £ coli JW5020- 1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
2. pJ294[alr2355_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 93),
pJ294[Rleg_1610_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 94),
pJ294[blr1738_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 95), oder
pJ294[BMD_5199_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 96)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml) und Ampicillin (100 Mg/ml). Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alr2355_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE]
• £. coli JW5020-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[Rleg_1610_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] · £ coli JW5020-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[blr1738_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[BMD_5199_TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE]
Diese Stämme werden einer fed-bafc/7-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Laurinsäure, Oxo-Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino- Laurinsäure sowie Hydroxy-Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino-Tetradecansäure aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach
Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind, Laurinsäure, Hydroxy-Laurinsäure, Oxo- Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino-Laurinsäure sowie Tetradecansäure, Hydroxy- Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino- Tetradecansäure aus Glucose zu bilden. Beispiel 16: Produktion von Aminolaurinsäuremethylester durch einen E. coli Stamm mit Deletion im Gen fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem
Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkT und alkL aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfAI aus Alcanivorax borkumensis Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida GPo1 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder aff>47 aus Alcanivorax borkumensis werden elektrokompetente Zellen von E. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
2. pJ294[TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 97), und
3. pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 16), oder pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)- fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 17)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Das Plasmid pJ294[TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 97) wird ausgehend von dem Plasmid pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38) erzeugt, indem für die funktionelle Expression essentielle Teile des für die Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis kodierenden Gens mit Pme\/Sna \ aus dem Vektor ausgeschnitten und dieser anschließend religiert wird.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert: • £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[wax- dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec] Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy- Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie Hydroxy- Tetradecansäuremethylester, Oxo-Tetradecansäuremethylester, Carboxy- Tetradecansäuremethylester und Amino-Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie
Tetradecansäuremethylester, Hydroxy-Tetradecansäuremethylester, Oxo- Tetradecansäuremethylester, Carboxy-Tetradecansäuremethylester und Amino- Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Beispiel 17: Produktion von Aminolaurinsäure durch einen E. coli Stamm mit Deletion im Gen fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkT und alkL aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida Zur Erzeugung von £ co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida GPo1 werden elektrokompetente Zellen von £. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden 1 . ρΒΤΊ 0 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
2. pJ294[TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 97)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml) und Ampicillin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische
Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft.
Auf diese Weise wird folgender Stamm konstruiert:
• £. coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE]
Dieser Stamm wird einer fed-bafc/7-Fermentation unterzogen, um seine Fähigkeit zur
Produktion von Hydroxy-Laurinsäure, Oxo-Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino-
Laurinsäure sowie Hydroxy-Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino-Tetradecansäure aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach
Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass dieser Stamm in der Lage ist, Laurinsäure, Hydroxy-Laurinsäure, Oxo- Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino-Laurinsäure sowie Tetradecansäure, Hydroxy- Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino- Tetradecansäure aus Glucose zu bilden.
Beispiel 18: Produktion von Aminolaurinsäuremethylester durch einen E. coli Stamm mit
Deletion im Gen fadE und einem Expressionsvektor für das Gen synUcTE aus Umbellularia californica in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG, alkT und alkL aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA1 aus Alcanivorax borkumensis
Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit einem Expressionsvektor für das Gen synUcTE aus Umbellularia californica in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida GPo1 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA1 aus Alcanivorax borkumensis werden elektrokompetente Zellen von E. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
2. pJ294[Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 98),
und
3. pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 16), oder pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)- fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 17)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpraparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Das Plasmid pJ294[Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 98) wird ausgehend von dem Plasmid pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38) erzeugt, indem für die funktionelle Expression essentielle Teile der für die Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis und die Transaminase Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum kodierenden Gene mit Srf\/Sna \ aus dem Vektor ausgeschnitten und dieser anschließend religiert wird.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• E. coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[Ptac-synUcTE] / pCDF[wax- dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• E. coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[Ptac-synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)- fadD_Ec]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester und Carboxy- Laurinsäuremethylester sowie Hydroxy-Tetradecansäuremethylester, Oxo- Tetradecansäuremethylester und Carboxy-Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester und Carboxy-Laurinsäuremethylester sowie Tetradecansäuremethylester, Hydroxy- Tetradecansäuremethylester, Oxo-Tetradecansäuremethylester und Carboxy- Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu bilden. Beispiel 19: Produktion von Aminolaurinsäure durch einen E. coli Stamm mit Deletion im Gen fadE und einem Expressionsvektor für das Gen synUcTE aus Umbellularia californica in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene aikB, aikG, aikT und aikL aus dem alk- Operon von Pseudomonas putida
Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit einem Expressionsvektor für das Gen synUcTE aus Umbellularia californica in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene aikB, aikG und aikT aus dem alk-Operon von Pseudomonas putida GPo1 werden elektrokompetente Zellen von E. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
2. pJ294[Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 96)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml) und Ampicillin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische
Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft.
Auf diese Weise wird folgender Stamm konstruiert:
• £. coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[Ptac-synUcTE]
Dieser Stamm wird einer fed-bafc/7-Fermentation unterzogen, um seine Fähigkeit zur
Produktion von Hydroxy-Laurinsäure, Oxo-Laurinsäure und Carboxy-Laurinsäure sowie
Hydroxy-Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure und Carboxy-Tetradecansäure aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass dieser Stamm in der Lage ist, Laurinsäure, Hydroxy-Laurinsäure, Oxo- Laurinsäure und Carboxy-Laurinsäure sowie Tetradecansäure, Hydroxy-Tetradecansäure, Oxo- Tetradecansäure und Carboxy-Tetradecansäure aus Glucose zu bilden. Beispiel 20: Produktion von Aminohexansäuremethylester, Aminooctansäuremethylester, Aminodecansäuremethylester, Aminotetradecansäuremethylester und Amino-9- hexadecensäuremethylester durch E. coli Stämme mit Deletion des fadE-Gens und
Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ChFATB2 aus Cuphea hookeriana, CnFATB3 aus Cocos nucifera oder CPF_2954 aus Clostridium perfringens sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida und einem Expressionsvektor für das Gen Mmar_3356 aus
Mycobacterium marinum bzw. das Gen 'tesA* aus E. coli
Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, ChFA TB2 aus Cuphea hookeriana (SEQ ID NR: 58), CnFATB3 aus Cocos nucifera (SEQ ID NR: 60) oder CPF_2954 aus Clostridium perfringens (SEQ ID NR: 62) sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkB, alkG und alkT aus dem alk-Operon von
Pseudomonas putida GPo1 und einem Expressionsvektor für das Gen Mmar_3356 aus Mycobacterium marinum (SEQ ID NR: 99) bzw. das Gen 'tesA* aus £. coli (SEQ ID NR: 101 ) werden elektrokompetente Zellen von E. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
o pBT10 (Konstruktion beschrieben in Ausführungsbeispiel B.2 der PCT/EP2008/067447), und
o pJ294[alaDH_B.s ._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38),
pJ294[alaDH_B.s ._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] (SEQ ID Nr. 70),
pJ294[alaDH_B.s ._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] (SEQ ID Nr. 71 ), oder
pJ294[alaDH_B.s ._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CPF_2954] (SEQ ID Nr. 72),
und
o pCDF[Mmar_3356] (SEQ ID Nr. 103), oder
pCDF[Ec'tesA*] (SEQ ID Nr. 104)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpraparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Die Plasmide pCDF[Mmar_3356] (SEQ ID Nr. 103) und pCDF[Ec'tesA*] (SEQ ID Nr. 104) werden ausgehend von dem Plasmid pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 16) erzeugt, indem das wax-dga 7-Gen aus Acinetobacter sp. ADP1 und das fadD-Gen aus £ coli mit BamY\\IXho\ incl. Ptac und dem 3'-flankierenden Bereich von fadD aus dem Vektor ausgeschnitten und durch die die Fettsäure-O-Methyltransferase Mmar_3356 (SEQ ID Nr. 100) bzw. die Acyl-ACP: Methanol-O-Methyltransferase TesA* (SEQ ID Nr. 102) kodierenden Gene (incl. Ptac und dem zum 3'-flankierenden Bereich von fadD identischen Bereich) ersetzt werden. Diese Fragmente werden durch Gensynthese erzeugt, wobei der für die Fettsäure-O- Methyltransferase kodierende Bereich für die Translation in £ coli codon-optimiert wird, während der für die ThioesterTransesterase TesA* kodierende Bereich nicht für die Translation in £ coli codon-optimiert, sondern die wildtypische Sequenz verwendet wird.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• £. coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[Mmar_3356] · £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] /
pCDF[Mmar_3356]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] /
pCDF[Mmar_3356]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- CPF_2954] / pCDF[Mmar_3356]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] /
pCDF[Ec'tesA*]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] /
pCDF[Ec'tesA*] · £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] /
pCDF[Ec'tesA*]
• £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- CPF_2954] / pCDF[Ec'tesA*] Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Fettsäuremethylestern, Oxo- Fettsäuremethylestern, Carboxy- Fettsäuremethylestern und Amino- Fettsäuremethylestern aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass die Stämme £ coli JW5020-1 Kans pBT10 /
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[Mmar_3356] und £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] / pCDF[Ec'tesA*] in der Lage sind, bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy- Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie Tetradecansäuremethylester, Hydroxy- Tetradecansäuremethylester, Oxo-Tetradecansäuremethylester, Carboxy- Tetradecansäuremethylester und Amino-Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu bilden. Es wird gezeigt, dass die Stämme £ coli JW5020-1 Kans pBT10 /
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[Mmar_3356] und £. coli JW5020-1 Kans ρΒΤΊ Ο / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-ChFATB2] / pCDF[Ec'tesA*] in der Lage sind, bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Octansäuremethylester, Hydroxy- Octansäuremethylester, Oxo-Octansäuremethylester, Carboxy-Octansäuremethylester und Amino-Octansäuremethylester sowie Decansäuremethylester, Hydroxy- Decansäuremethylester, Oxo-Decansäuremethylester, Carboxy-Decansäuremethylester und Amino-Decansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Es wird gezeigt, dass die Stämme £ coli JW5020-1 Kans pBT10 /
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[Mmar_3356] und £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[Ec'tesA*] in der Lage sind, bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy-
Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie Tetradecansäuremethylester, Hydroxy- Tetradecansäuremethylester, Oxo-Tetradecansäuremethylester, Carboxy- Tetradecansäuremethylester und Amino-Tetradecansäuremethylester sowie 9- Hexadecensäuremethylester, Hydroxy-9-Hexadecensäuremethylester, Oxo-9-
Hexadecensäuremethylester, Carboxy-9-Hexadecensäuremethylester und Amino-9- Hexadecensäuremethylester aus Glucose zu bilden. Es wird gezeigt, dass die Stämme £ coli JW5020-1 Kans pBT10 /
pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[Mmar_3356] und £ coli JW5020-1 Kans pBT10 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-CnFATB3] / pCDF[Ec'tesA*] in der Lage sind, bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Octansäuremethylester, Hydroxy- Octansäuremethylester, Oxo-Octansäuremethylester, Carboxy-Octansäuremethylester und Amino-Octansäuremethylester sowie Hexansäuremethylester, Hydroxy- Hexansäuremethylester, Oxo-Hexansäuremethylester, Carboxy-Hexansäuremethylester und Amino-Hexansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Beispiel 21: Produktion von Aminolaurinsäuremethylester und
Aminotetradecansäuremethylester durch E. coli Stämme mit Deletion des Gens fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbeiiuiaria californica, sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkM, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Acinetobacter sp. ADP1 bzw. alkS, alkT, alkB1, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Marinobacter aquaeoli VT8 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA 1 aus Alcanivorax borkumensis Zur Erzeugung von £ co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbeiiuiaria californica sowie ald aus Bacillus subtilis und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit Expressionsvektoren für die Gene alkM, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Acinetobacter sp. ADP1 (SEQ ID Nr. 105) bzw. alkS, alkT, alkB1, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Marinobacter aquaeoli VT8 (SEQ ID Nr. 106) und einem
Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA 1 aus Alcanivorax borkumensis SK2 werden elektrokompetente Zellen von £. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
4. pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38),
5. pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 16) bzw. pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)- fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 17) 6. pCOMI O-AcalkMGT (SEQ ID Nr. 107)
pCOM10-MaalkST-B1 G (SEQ ID Nr. 108)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpraparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Die Plasmide pCOMI O-AcalkMGT (SEQ ID Nr. 107) und pCOM10-MaalkST-B1 G (SEQ ID Nr. 108) werden ausgehend von dem Plasmid pCOM10 (SEQ ID Nr. 109; Smits TH, Seeger MA, Witholt B, van Beilen JB. New alkane-responsive expression vectors for Escherichia coli and Pseudomonas. Plasmid. 2001. 46(1 ):16-24.) erzeugt. Dazu wird pCOM10 mit Xho\IBamH\ (pCOM10-MaalkST-B1 G) bzw. EcoR\ (pCOMI O-AcalkMGT) geschnitten und die Loci
Acinetobacter sp. ADP1 alkMGT bzw. Marinobacter aquaeoli VT8 alkST-alkB1 G in pCOM10 inseriert. Diese Loci werden durch Gensynthese erzeugt, wobei die für Acinetobacter sp. ADP1 AlkM (SEQ ID Nr. 1 10), AlkG (SEQ ID Nr. 1 1 1 ) und AlkT (SEQ ID Nr. 1 12) sowie die für Marinobacter aquaeoli VT8 AlkS (SEQ ID Nr. 1 13), AlkT (SEQ ID Nr. 1 14), AlkB1 (SEQ ID Nr. 1 15) und AlkG (SEQ ID Nr. 1 16) kodierenden Bereiche nicht für die Translation in £ coli codon- optimiert werden, sondern die wildtypische Sequenz verwendet wird.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli JW5020-1 Kans pCOMI O-AcalkMGT / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] · £. coli JW5020-1 Kans pCOMI O-AcalkMGT / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pCOM10-MaalkST-B1 G / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec]
• £ coli JW5020-1 Kans pCOM10-MaalkST-B1 G / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Fettsäuremethylestern, Oxo- Fettsäuremethylestern, Carboxy- Fettsäuremethylestern und Amino- Fettsäuremethylestern aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind, bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie
Tetradecansäuremethylester, Hydroxy-Tetradecansäuremethylester, Oxo- Tetradecansäuremethylester, Carboxy-Tetradecansäuremethylester und Amino- Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Beispiel 22: Produktion von Aminolaurinsäure und Aminotetradecansäure durch E. coli Stämme mit Deletion des Gens fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene alkM, alkG und alkT aus dem alk- Operon von Acinetobacter sp. ADP1 bzw. alkS, alkT, alkB1, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Marinobacter aquaeoli VT8
Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica sowie ald aus Bacillus subtilis und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit Expressionsvektoren für die Gene alkM, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Acinetobacter sp. ADP1 (SEQ ID Nr. 105) bzw. alkS, alkT, alkB1, alkG und alkT aus dem alk-Operon von Marinobacter aquaeoli VT8 (SEQ ID Nr. 106) werden
elektrokompetente Zellen von E. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem
Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38),
2. pCOM10-AcalkMGT (SEQ ID Nr. 107)
pCOM10-MaalkST-B1 G (SEQ ID Nr. 108)
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml) und Ampicillin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische
Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• E. coli JW5020-1 Kans pCOM10-AcalkMGT / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE] • £ coli JW5020-1 Kans pCOMI O-AcalkMGT / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE]
• £ coli JW5020-1 Kans pCOM10-MaalkST-B1 G / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE] · £ coli JW5020-1 Kans pCOM10-MaalkST-B1 G / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur
Produktion von Hydroxy-Fettsäuren, Oxo- Fettsäuren, Carboxy- Fettsäuren und Amino- Fettsäuren aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind Laurinsäure, Hydroxy-Laurinsäure, Oxo- Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino-Laurinsäure sowie Tetradecansäure, Hydroxy- Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino- Tetradecansäure aus Glucose zu bilden.
Beispiel 23: Produktion von Aminolaurinsäuremethylester und
Aminotetradecansäuremethylester durch E. coli Stämme mit Deletion des Gens fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbeiiuiaria californica, sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene ABO_0200, ABO_0201 und ABO_0203 aus Alcanivorax borkumensis SK2 und einem Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus
Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA 1 aus Alcanivorax borkumensis Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbeiiuiaria californica sowie ald aus Bacillus subtilis und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene ABO_0200, ABO_0201 und ABO_0203 aus Alcanivorax borkumensis SK2 (SEQ ID Nr. 1 17), kodierend für ein
Ferredoxin (ABO_0200; SEQ ID Nr. 1 18), eine CYP153-Monoxygenase (ABO_0201 ; SEQ ID Nr. 1 19) und eine Ferredoxin-Oxidoreduktase (ABO_0203; SEQ ID Nr. 120) und einem
Expressionsvektor für die Gene fadD aus Escherichia coli und wax-dgaT aus Acinetobacter sp. ADP1 oder atfA 1 aus Alcanivorax borkumensis SK2 werden elektrokompetente Zellen von £ coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38),
2. pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 16) bzw. pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)- fadD_Ec] (SEQ ID Nr. 17)
3. pCOM10-AbCYP153 (SEQ ID Nr. 121 )
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml), Ampicillin (100 Mg/ml) und Spectinomycin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpraparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft. Das Plasmid pCOM10-AbCYP153 (SEQ ID Nr. 121 ) wird ausgehend von dem Plasmid pCOM10 (SEQ ID Nr. 97; Smits TH, Seeger MA, Witholt B, van Beilen JB. New alkane- responsive expression vectors for Escherichia coli and Pseudomonas. Plasmid. 2001.
46(1 ):16-24.) erzeugt. Dazu wird pCOM10 mit EcoR\/Sal\ geschnitten und das Fragment enthaltend die Gene ABO_0200, ABO_0201 und ABO_0203 aus Alcanivorax borkumensis SK2 inseriert. Dieses Fragment wird durch Gensynthese erzeugt, wobei die für das Ferredoxin (ABO_0200; SEQ ID Nr. 106), die CYP153-Monoxygenase (ABO_0201 ; SEQ ID Nr. 107) und die Ferredoxin-Oxidoreduktase (ABO_0203; SEQ ID Nr. 108) kodierenden Abschnitte aus Alcanivorax borkumensis SK2 nicht für die Translation in £ coli codon-optimiert werden, sondern die wildtypische Sequenz verwendet wird.
Auf diese Weise werden folgende Stämme konstruiert:
• £ coli JW5020-1 Kans pCOM10-AbCYP153 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE] / pCDF[wax-dgaT_AsADP1 (co_Ec)-fadD_Ec] · £. coli JW5020-1 Kans pCOM10-AbCYP153 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE] / pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec]
Diese Stämme werden einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Hydroxy-Fettsäuremethylestern, Oxo- Fettsäuremethylestern, Carboxy- Fettsäuremethylestern und Amino- Fettsäuremethylestern aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Es wird gezeigt, dass diese Stämme in der Lage sind, bei Zugabe von 1 % (v/v) Methanol, Laurinsäuremethylester, Hydroxy-Laurinsäuremethylester, Oxo-Laurinsäuremethylester, Carboxy-Laurinsäuremethylester und Amino-Laurinsäuremethylester sowie
Tetradecansäuremethylester, Hydroxy-Tetradecansäuremethylester, Oxo- Tetradecansäuremethylester, Carboxy-Tetradecansäuremethylester und Amino- Tetradecansäuremethylester aus Glucose zu bilden.
Beispiel 24: Produktion von Aminolaurinsäure und Aminotetradecansäure durch E. coli Stämme mit Deletion des Gens fadE und Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica, sowie ald aus Bacillus subtilis, Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene ABO_0200, ABO_0201 und ABO_0203 aus Alcanivorax borkumensis SK2 Zur Erzeugung von £. co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene synUcTE aus Umbellularia californica sowie ald aus Bacillus subtilis und Cv_2025 aus Chromobacterium violaceum in Kombination mit einem Expressionsvektor für die Gene ABO_0200, ABO_0201 und ABO_0203 aus Alcanivorax borkumensis SK2 (SEQ ID Nr. 1 17), kodierend für ein
Ferredoxin (ABO_0200; SEQ ID Nr. 1 18), eine CYP153-Monoxygenase (ABO_0201 ; SEQ ID Nr. 1 19) und eine Ferredoxin-Oxidoreduktase (ABO_0203; SEQ ID Nr. 120) werden elektrokompetente Zellen von E. coli JW5020-1 Kans hergestellt. Dies geschieht in einer dem
Fachmann bekannten Art und Weise.
JW5020-1 Kans wird sequentiell mit den Plasmiden
1 . pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac-synUcTE] (SEQ ID Nr. 38)
und
2. pCOM10-AbCYP153 (SEQ ID Nr. 121 )
transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (50 Mg/ml) und Ampicillin (100 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische
Restriktionsanalyse bezüglich der Anwesenheit der korrekten Plasmide überprüft.
Auf diese Weise wird folgender Stamm konstruiert:
• £. coli JW5020-1 Kans pCOM10-AbCYP153 / pJ294[alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)_Ptac- synUcTE] Dieser Stamm wird einer fec/-öaic/?-Fermentation unterzogen, um seine Fähigkeit zur
Produktion von Hydroxy-Fettsäuren, Oxo- Fettsäuren, Carboxy- Fettsäuren und Amino- Fettsäuren aus Glucose zu analysieren. Dies wird mit einem 8-fach Parallelfermentationssystem der Firma DASGIP durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Es wird gezeigt, dass dieser Stamm in der Lage ist Laurinsäure, Hydroxy-Laurinsäure, Oxo- Laurinsäure, Carboxy-Laurinsäure und Amino-Laurinsäure sowie Tetradecansäure, Hydroxy- Tetradecansäure, Oxo-Tetradecansäure, Carboxy-Tetradecansäure und Amino- Tetradecansäure aus Glucose zu bilden.

Claims

Ansprüche 1. Mikroorganismus, der eine erste gentechnische Modifikation aufweist, so dass er
verglichen zu seinem Wildtyp mehr Carbonsäure oder Carbonsäure-Ester aus mindestens einer einfachen Kohlenstoffquelle zu bilden vermag,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Mikroorganismus eine zweite gentechnische Modifikation aufweist, welche umfasst, dass der Mikroorganismus eine im Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität
mindestens eines Enzyms E-i, welches die Umsetzung von Carbonsäuren oder
Carbonsäure-Estern zu den entsprechenden ω-Hydroxy-Carbonsäuren oder co-Hydroxy-Carbonsäure-Estern katalysiert,
aufweist. 2. Mikroorganismus gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym E-i
ausgewählt ist aus der Gruppe:
Eia P450 Alkanhydroxylasen und E1b AlkB Alkanhydroxylasen der EC 1 .14.15.3. 3. Mikroorganismus gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite gentechnische Modifikation zusätzlich umfasst, dass der Mikroorganismus eine im
Vergleich zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität ausgewählt aus
ein Enzym E2, welches die Umsetzung von co-Oxo-Carbonsäuren oder co-Oxo-
Carbonsäure-Estern zu den entsprechenden co-Amino-Carbonsäuren oder co-Amino-
Carbonsäure-Estern katalysiert,
ein Enzym E3, welches die Umsetzung einer α-Keto-Carbonsäure zu einer Aminosäure katalysiert,
ein Enzym E4, welches die Umsetzung von co-Hydroxy-Carbonsäuren oder co-Hydroxy-
Carbonsäure-Estern zu den entsprechenden ω-Oxo-Carbonsäuren oder co-Oxo-
Carbonsäure-Estern katalysiert, und
ein Enzym E5, welches die Umsetzung von ω-Oxo-Carbonsäuren oder co-Oxo-
Carbonsäure-Estern zu den entsprechenden ω-Carboxy-Carbonsäuren oder co-
Carboxy-Carbonsäure-Estern katalysiert, aufweist. 4. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die zweite gentechnische Modifikation eine Kombination gesteigerter Aktivitäten der Enzyme ausgewählt aus
E1E2E3, E1E2E3E4, E1E5, E1E4E5
umfasst. 5. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, dass
das Enzym E2 eine co-Transaminase,
das Enzym E3 eine Alanindehydrogenase der EC 1 .4.1.1 ,
das Enzym E4 eine Fettalkoholoxidase der EC 1 .1 .3.20, eine AlkJ Alkoholdehydrogenase der EC 1.1.99.- oder eine Alkoholdehydrogenase der EC 1 .1 .1 .1 oder EC 1.1.1 .2 und
das Enzym E5 eine Aldehyddehydrogenase der EC 1.2.1 .3, EC 1.2.1 .4 oder EC 1 .2.1.5 ist. 6. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass das Enzym E-ι die von alkBGT kodierte Alkanmonoxygenase aus Pseudomonas putida GPo1 ist sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen. 7. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die zweite gentechnische Modifikation zusätzlich umfasst, dass der Mikroorganismus verglichen zu seinem Wildtyp mehr alkL-Genprodukt bildet. 8. Mikroorganismus gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das alkL- Genprodukt kodiert wird von alkL-Genen aus Organismen gram-negativen Bakterien, insbesondere der Gruppe enthaltend, bevorzugt bestehend aus Pseudomonas sp., Azotobacter sp., Desulfitobacterium sp., Burkholderia sp., bevorzugt Burkholderia cepacia, Xanthomonas sp., Rhodobacter sp., Ralstonia sp., Delftia sp.und Rickettsia sp., Oceanicaulis sp., Caulobacter sp., Marinobacter sp. und Rhodopseudomonas sp., bevorzugt Pseudomonas putida, Oceanicaulis alexandrii, Marinobacter aquaeolei, insbesondere Pseudomonas putida GPo1 und P1 , Oceanicaulis alexandrii HTCC2633, Caulobacter sp. K31 und Marinobacter aquaeolei VT8. 9. Mikroorganismus gemäß mindestens Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das alkL-Genprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Proteine kodiert durch Seq ID Nr. 1 und Seq ID Nr. 3 und
Proteine mit Polypeptidsequenz Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 5, Seq ID Nr. 6 oder Seq ID Nr. 7 und
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, der Aminosäurereste gegenüber Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 5, Seq ID Nr. 6 oder Seq ID Nr. 7 durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, der Aktivität des Proteins mit der jeweiligen Bezugssequenz Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 5, Seq ID Nr. 6 oder Seq ID Nr. 7 besitzen. 1 0. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus
E. coli, Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida,
Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp., Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Cyanobakterien, Klebsiella sp., Klebsiella oxytoca, Salmonella sp., Rhizobium sp. und Rhizobium meliloti, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Clostridium sp., Corynebacterium sp., Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium sp., Chlorella sp. und Nostoc sp.. 1 1 . Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass es sich bei der ersten gentechnischen Modifikation um eine verglichen zu der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme handelt, ausgewählt aus der Gruppe Ei Acyl-ACP-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1.2.14 oder EC 3.1.2.22,
EN Acyl-CoA-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1 .2.2, EC 3.1 .2.18, EC 3.1.2.19, EC
3.1 .2.20 oder EC 3.1 .2.22,
Eiib Acyl-CoA:ACP-Transacylase,
Ei,, Polyketidsynthase, welche eine Reaktion katalysiert, die an der Synthese von
Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern mitwirkt, und
Eiv Hexansäuresynthase. 12. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass er eine dritte gentechnische Modifikation aufweist, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme Eiib, Ev, Evi oder Evii umfasst, welche an der Umsetzung von Carbonsäuren oder ω-funktionalisierten Carbonsäuren zu Carbonsäure- Estern oder co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern beteiligt ist, ausgewählt aus der Gruppe
Eüb Acyl-CoA:ACP-Transacylase, welche einen ACP-Thioester in einen CoA-Thioester bzw. einen CoA-Thioester in einen ACP-Thioester umwandelt,
Ev Wachsester-Synthase oder Alkohol-O-Acyltransferase, bevorzugt der EC 2.3.1.75 oder EC 2.3.1 .84, welche die Synthese eines Esters aus einem Acyl-Coenzym A- Thioester oder einem Acyl-ACP-Thioester und einem Alkohol katalysiert,
Evi Acyl-CoA (Coenzym A)-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1.3, welche die Synthese eines Acyl-Coenzym A-Thioesters katalysiert, und
Evii Acyl-Thioesterase, bevorzugt der EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.4, EC 3.1 .2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 oder EC 3.1.2.22, welche die Umsetzung eines Acyl-Thioesters mit einem Alkohol zu einem Carbonsäure-Ester katalysiert. 13. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die dritte gentechnische Modifikation eine Kombination gesteigerter Aktivitäten der Enzyme ausgewählt aus
Ev, Evü, EvEVi, EviEvü, EVjEVjjEjjb
umfasst.
14. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine vierte gentechnische Modifikation aufweist, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme ausgewählt aus der Gruppe
Eüb Acyl-CoA (Coenzym A):ACP (Acyl Carrier Protein)-!" ransacylase, welche einen
ACP-Thioester in einen CoA-Thioester bzw. einen CoA-Thioester in einen ACP-
Thioester umwandelt,
Evi Acyl-CoA (Coenzym A)-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1 .3, welche bevorzugt die
Synthese eines Acyl-Coenzym A-Thioesters katalysiert,
Eviü Acyl-CoA (Coenzym A)-Reduktase, bevorzugt der EC 1 .2.1 .42 oder EC 1.2.1 .50, welche bevorzugt die Reduktion eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Alkan-1 -al oder Alkan-1 -ol katalysiert
Eix Fettsäurereduktase (auch Fettaldehyd-Dehydrogenase oder Arylaldehyd-
Oxidoreduktase), bevorzugt der EC 1 .2.1.3, EC 1.2.1 .20 oder EC 1.2.1.48, welche bevorzugt die Reduktion einer Alkansäure zum entsprechenden Alkan-1 -al katalysiert, und
Ex) Acyl-ACP (Acyl Carrier Protein)-Reduktase, bevorzugt der EC 1 .2.1.80, welche bevorzugt die Reduktion eines Acyl-ACP-Thioesters zum entsprechenden Alkan-1 - al oder Alkan-1 -ol katalysiert,
umfasst. 1 5. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die zweite gentechnische Modifikation eine Kombination gesteigerter Aktivitäten der Enzyme ausgewählt aus
Eviü, Ejx, Ex, EV|EVjjj, EVjExEjjb
umfasst. 1 6. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass er eine fünfte gentechnische Modifikation enthält, die eine verglichen mit der enzymatischen Aktivität des Wildtyps des Mikroorganismus
verminderten Aktivität mindestens eines der Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe Ea Acyl-CoA-Synthetase, bevorzugt der EC 6.2.1.3, welche die Synthese eines Acyl- Coenzym A-Thioesters katalysiert,
Eb Acyl-CoA-Dehydrogenase, bevorzugt der EC 1.3.99.-, EC 1.3.99.3, oder EC
1 .3.99.13, welche die Oxidation eines Acyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Enoyl-Coenzym A-Thioester katalysiert,
Ec Acyl-CoA-Oxidase, bevorzugt der EC 1 .3.3.6, welche die Oxidation eines Acyl- Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden Enoyl-Coenzym A-Thioester katalysiert,
Ed Enoyl-CoA-Hydratase, bevorzugt der EC 4.2.1.17 oder EC 4.2.1.74, welche die Hydratisierung eines Enoyl-Coenzym A-Thioesters zum entsprechenden 3- Hydroxyacyl-Coenzym A-Thioester katalysiert,
Ee 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, bevorzugt der EC 1.1.1.35 oder EC 1 .1 .1.21 1 , welche die Oxidation eines 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Thioesters zum
entsprechenden 3-Oxoacyl-Coenzym A-Thioester katalysiert und
Ef Acetyl-CoA-Acyltransferase, bevorzugt der EC 2.3.1 .16, welche den Transfer eines Acetylrestes von einem 3-Oxoacyl-Coenzym A-Thioester auf Coenzym A überträgt und somit ein um zwei Kohlenstoffatome verkürzten Acyl-Coenzym A-Thioester erzeugt,
umfasst. 1 7. Verwendung eines Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche zur Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäuren und von co-funktionalisierten Carbonsäure-Estern, insbesondere eines Mikroorganismus gemäß Anspruch 3 oder 4, zur Herstellung von co-Amino-Carbonsäuren und von co-Amino-Carbonsäure-Estern, insbesondere von ω-Amino-Laurinsäure und von ω-Amino-Laurinsäuremethyl- und - ethylester sowie ω-Amino-Capronsäure und von ω-Amino-Capronsäuremethyl- und - ethylester. 1 8. Verfahren zur Herstellung von co-funktionalisierten Carbonsäuren und von
ω-funktionalisierten Carbonsäure-Estern aus einer einfachen Kohlenstoffquelle umfassend die Verfahrensschritte I) in Kontakt Bringen eines Mikroorganismus gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16 mit einem Medium beinhaltend die einfache Kohlenstoffquelle,
II) Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die es dem Mikroorganismus ermöglichen aus der einfachen Kohlenstoffquelle die ω-funktionalisierten Carbonsäuren oder co-funktionalisierten Carbonsäure-Ester zu bilden und
III) gegebenenfalls Isolierung der gebildeten co-funktionalisierten Carbonsäuren oder ω-funktionalisierten Carbonsäure-Ester. 19. Verfahren gemäß Anspruch 18 zur Herstellung von co-Amino-Carbonsäuren und von
co-Amino-Carbonsäure-Estern, insbesondere von co-Amino-Laurinsäure und von co-Amino- Laurinsäuremethyl- und -ethylester sowie co-Amino-Capronsäure und von co-Amino- Capronsäuremethyl- und -ethylester, aus einer einfachen Kohlenstoffquelle,
insbesondere mit einem Mikroorganismus gemäß mindestens einem der Ansprüche 3 bis 15 und 18. 20. Ein Verfahren zur Herstellung von auf co-Amino-Carbonsäuren, insbesondere auf
co-Amino-Laurinsäure oder auf co-Amino-Capronsäure, basierenden Polyamiden, umfassend die Verfahrensschritte:
(a1 ) Herstellung von co-Amino-Carbonsäuren durch ein Verfahren nach Anspruch 21 , (a2) Polymerisation von gegebenenfalls Mischungen aus verschiedenen co-Amino- Carbonsäuren, von denen mindestens ein Teil der co-Amino-Carbonsäuren, bevorzugt mindestens 50-Gew.% bezogen auf alle im Verfahren eingesetzten co-Amino-Carbonsäuren,
oder von co-Amino-Carbonsäuren aus Schritt (a1 )
unter Erhalt eines Polyamids. 21. Polyamid erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 20, insbesondere Polyamid 12 und Polyamid 6. 22. Verfahren gemäß Anspruch 18 zur Herstellung von co-Hydroxy-Carbonsäuren und von co-Hydroxy-Carbonsäure-Estern, insbesondere von co-Hydroxy-Laurinsäure und von ω-Hydroxy-Laurinsäuremethyl- und -ethylester sowie ω-Hydroxy-Capronsäure und von ω-Hydroxy-Capronsäuremethyl- und -ethylester, aus einer einfachen Kohlenstoffquelle, insbesondere mit einem Mikroorganismus gemäß mindestens einem der Ansprüche 3 bis 16.
23. Verfahren gemäß Anspruch 18 zur Herstellung von co-Carboxy-Carbonsäuren und von ω-Carboxy-Carbonsäure-Estern, insbesondere von co-Carboxy-Laurinsäure und von ω-Carboxy-Laurinsäuremethyl- und -ethylester sowie co-Carboxy-Capronsäure und von ω-Carboxy-Capronsäuremethyl- und -ethylester, aus einer einfachen Kohlenstoffquelle, insbesondere mit einem Mikroorganismus gemäß mindestens einem der Ansprüche 3 bis 18.
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