EP2697678A1 - Weitfeld-mikroskop-beleuchtungssystem und weitfeld-beleuchtungsverfahren - Google Patents

Weitfeld-mikroskop-beleuchtungssystem und weitfeld-beleuchtungsverfahren

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EP2697678A1
EP2697678A1 EP12714681.9A EP12714681A EP2697678A1 EP 2697678 A1 EP2697678 A1 EP 2697678A1 EP 12714681 A EP12714681 A EP 12714681A EP 2697678 A1 EP2697678 A1 EP 2697678A1
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EP
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illumination
illumination light
microscope
objective
predetermined
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Jonas FÖLLING
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Leica Microsystems CMS GmbH
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Leica Microsystems CMS GmbH
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison

Definitions

  • the invention relates to a wide-field microscope illumination system with a microscope objective, which has an optical objective axis, wherein the illumination light is transmitted through the objective to a sample viewed with a microscope, and to a corresponding illumination method.
  • This new branch of microscopy is also called localization microscopy.
  • the new method has in common that the structures to be imaged are prepared with markers which have two distinguishable states, namely a "bright” state and a "dark" state.
  • the bright state is a fluorescent state
  • the dark state is a non-fluorescent state.
  • a small subset of the markers is now repeatedly prepared in the bright state. This subset is referred to below as the active subset.
  • the active subset is to be chosen such that the mean distance between adjacent markers in the bright state is greater than the resolution limit of the imaging optical system.
  • the luminance signals of the active subset are imaged onto a spatially resolving light detector, eg a CCD camera. From Each marker is thus detected a light spot whose size is determined by the resolution limit of the imaging optical system.
  • the focal points of the light spots which represent the markers in the bright state are then determined in each raw data single image.
  • the focal points of the light spots determined from the raw data individual images are then compiled in an overall representation.
  • the high-resolution image resulting from this overall representation reflects the distribution of the markers.
  • a sufficient number of signals must be detected.
  • the number of markers in the respective active subset is limited by the minimum average distance that two markers in the bright state may have from each other, a large number of raw data frames must be taken in order to fully depict the structure. Typically, the number of raw data frames ranges from 10,000 to 100,000.
  • the time required for the acquisition of a raw data frame is limited downwards by the maximum image acquisition rate of the imaging detector. This leads to comparatively long total acquisition times for a series of raw data individual images required for the overall presentation. So the total recording time can be up to several hours.
  • the recording time of each single raw data image has to be kept as short as possible. This requires that the individual spots of light that make up the markers develop very quickly, and of course they must be bright for good localization. This means that when the markers are in the active state, they emit very many photons very quickly before they return to the inactive state. Now, if the Aufhahmezeit the single raw data images adapted to the average duration of the marker, resulting in the fastest possible recording.
  • Typical markers are (switchable or non-switchable) fluorescent molecules. These emit more photons within a certain period of time, the more photons they receive. Therefore, it is necessary to irradiate the molecules with high light intensities.
  • the molecule can typically change from the excited state to the dark state with a low probability and after a certain time will automatically return to the ground state, in which it can fluoresce again. By this fact, the molecule shows a flashing behavior: It emits photons until it spontaneously passes from the excited state to the dark state. These photons in their entirety form a light spot. The molecule now remains in the dark state until it spontaneously returns to the active state. In the dark state, the molecule does not emit photons and thus no detectable signal. Since the dark state can be very long-lived, but at high light intensity but the light spots arise very quickly, this behavior shows up as flashing.
  • the light intensity of the excitation light must be very high. Only then is it possible that almost all molecules are in the inactive state, because as soon as they spontaneously change to the active state, they send a fast sequence of photons due to the high intensity of the excitation light and disappear again "in a flash" Only a few molecules are visible at the same time, so that the high intensity of the excitation light not only enables fast image acquisition, but is also useful for setting a sufficiently small ratio of active to inactive markers.
  • the illumination of the sample usually takes place in the so-called "wide field” method, which means that a large area in the sample is illuminated as homogeneously as possible, namely exactly the area which is imaged onto the detector by the imaging optics same lens, which also collects the fluorescent light and images by means of appropriate further optics, the sample on the detector.
  • the light is focused in the rear focal plane of the objective.
  • the size of the illumination field results in the front focal plane, ie in the sample plane.
  • the entire excitation light is directed as a small beam of light into the lens.
  • the excitation light traverses the lenses in the objective as a relatively narrow beam.
  • the type of illumination used in this type of illumination does not exploit the entire aperture of the lenses, but the light always passes through the lenses only in a very thin bundle of rays. Since, as described above, very high light powers must be introduced into the sample in general, extremely high light intensities are achieved by the thin beam in the objective. For achieving these light intensities, therefore, laser light is often used for far-field illumination in localization microscopes.
  • More complex lenses or lens systems typically include different materials that can be damaged at high light intensities.
  • the "weakest” link is the optical putty, which is used to connect various lens parts together, but surface layers on the lens lenses or the lens itself can also be damaged in extreme cases.
  • the optics can be damaged, which can have a disadvantageous effect on the light path of the illumination as well as on the detection, for example, "blind spots” that occasionally cause the light to shine Absorb light, bend, or scatter strongly. Also conceivable are holes in the glasses, etc. Such damage can make a lens completely unusable. If, for example, a blind spot arises precisely in the illumination beam path (where it would be deliberately caused by the radiation exposure), the objective would no longer be usable because then no light or at least no clean illumination beam would emerge from the objective towards the sample. In addition, such damage would also have a negative effect on the detection beam path, as this also happened to the lens and the detection light would be affected at the damaged lens locations, for example, would be scattered.
  • a wide-field microscope illumination system comprising: a microscope objective having an optical objective axis; an illumination light source which transmits far-field illumination light along illumination beam paths with corresponding illumination axes, along which the illumination light penetrates into the microscope objective through illumination light entry sites lying within a predetermined illumination light entry surface; a spatially resolving light detector which detects detected light transmitted from a lit sample through the microscope objective along a detection light beam path; and a controlled by a control, automatic illumination light beam manipulation device which is arranged in the direction of the illumination light beam path in front of the microscope objective and by means of which illumination light beam manipulation device, the illumination axes automatically at time intervals to a plurality of illumination light entry points is movable.
  • this is accomplished by wide-field illumination techniques for illuminating samples viewed with a microscope, the microscope being provided with: a microscope objective having an optical objective axis; and an illumination light source which transmits far-field illumination light along illumination beam paths with corresponding illumination axes, along which the illumination light penetrates into the microscope objective through illumination light entry sites located within a predetermined illumination light entry surface; wherein the illumination method is provided with such repeated, automatic, parallel adjustment of the illumination axis relative to the optical objective axis at time intervals that a lateral displacement of the illumination axis relative to the objective axis is automatically adjusted, so that the illumination light entry point at such time intervals within the predetermined illumination light Entrance surface is adjusted so that the lens is protected from damage by illumination light.
  • the illumination axes are always parallel to the lens axis. Even if slightly differing angles of incidence into the objective lead to a lateral offset of the illumination to the object, this can either be neglected. be casual or even desirable for certain special applications. As a rule, however, the entry angle will be selected to be at least substantially parallel to the objective axis, at least if a compensation of a greater lateral offset of the illumination light exiting the objective relative to the sample is to be avoided.
  • the preferred embodiment includes the steps of aligning the illumination axes in parallel relative to the objective axis and maintaining this parallelism in automatically adjusting the lateral offset of the illumination axis relative to the objective axis.
  • the wide-field microscope illumination system is part of a localization microscope.
  • This particular application results from the fact that relatively high light intensities are transmitted through the objective as illumination light, whereby only a relatively small part of the aperture of the objective is utilized for the entrance of the illumination light beam into the objective, ie the beam cross section is relatively small compared to the total entrance surface of the lens, and under certain circumstances (but not necessarily) is only collimated when passing through the lens to a larger beam cross-section.
  • the application can also be done in other microscopes as localization microscopes, for example in light microscopes, when there find high light intensities for the illumination light application.
  • the microscope illumination system is part of a TIRF illumination system.
  • the illumination light beam manipulation device has optomechanics, acousto-optic modulators (AOM) or electro-optic modulators (EOM), which adjusts an adjustable beam offset and thus an illumination light entry point adjustable in relation to the objective optical axis.
  • AOMs and EOMs offer the possibility to accomplish a lateral offset of the illumination light beam path very quickly. Since, however, the lenses endure the radiation exposure for a certain period of time, opto-mechanics are sufficient with regard to the changeover speed.
  • the controller comprises a random number generator which controls an allowable adjustable beam offset in the area of the predetermined illumination light entrance surface for the illumination light into the lens, all the illumination light entry points allowed by the control being within this predetermined illumination light entry surface.
  • the random selection of the respective illumination light entry points of the illumination light within the predetermined illumination light entry surface and maintenance of these respective illumination light entry points over the respective time intervals until the respective next illumination light entry point within the predetermined illumination light Entry points is randomly selected.
  • different illumination light entry points can be approached according to a predetermined pattern, ie by selecting the respective illumination light entry points of the illumination light within the predetermined illumination light entry surface according to a predetermined pattern and maintaining these respective illumination light entry points over the respective time intervals until the respective next illumination light entry point within the predetermined illumination light entry points is selected according to the predetermined pattern.
  • the already approached illumination light entry points and the amount of radiation transmitted thereon are stored. From this, on the one hand, it can be deduced for the user when the lens is likely to be destroyed, so that it can be switched preventively.
  • the automatic illumination light adjusting device can always select the new illumination light penetration point when the illumination light penetration points change so that it falls within a range which has hardly been damaged compared to other locations. Consequently it is possible to achieve an even and thus life-prolonging effect, as in a purely randomly controlled adjustment.
  • a control interface is provided, by means of which a predetermined illumination light entering surface verstellender control command can be entered. This can be done either to set a different illumination mode, which is accompanied by a different predetermined illumination light entry surface, or to find other alternatives for preserving the lens, for example, a further away from the optical axis location, if that of the optical lens axis Nearby places are consumed by a too high radiation exposure, so to speak.
  • the predetermined illuminating light entry surface is a circular, circular segment-shaped, annular or ring segment-shaped surface.
  • any other arbitrary surface for example square, rectangular or triangular.
  • a measuring device which monitors the transmission of the lens and sends a control signal to the controller when the transmission falls below a predetermined limit. In other words, it becomes one
  • Measuring optical transmission of the lens for the respective illumination light entry points made and adjusting the time intervals is carried out according to a change in the optical transmission for the respective illumination light entry point over time. It follows that an adjustment of the illumination beam entry surface into the lens takes place only when the previous location is consumed, so to speak. This can be used to limit the number of changeover operations. However, since these disturbances are minimal and usually not noticed, the changeover can also take place at predetermined time intervals, or in adjustable by a control signal intervals.
  • the invention will be further described in detail.
  • the illumination beam path is automatically guided to a location in the optics located nearby, the destruction of the optics at the first location can be averted.
  • the new location can now be illuminated again for a corresponding time before the lighting the beam path again to another location.
  • the previously illuminated areas are damaged as described above only in optically negligible way.
  • you can illuminate many different points of the optics until shortly before the damage threshold The number of possible illuminable spots gives the factor by which the lifetime of the lens can be extended.
  • the optical path in the optics it is usually not possible in any way to move the optical path in the optics, because this has a change of the beam path in the subsequent area result. Nevertheless, with very small beam diameters and corresponding size of the optics concerned, there is often enough scope to approach many different positions and thus to increase the lifetime of the optics many times over.
  • the critical component in this case is the lens.
  • illumination such as epifluorescence illumination.
  • the excitation light is focused in the center of the rear focal plane. As a result, the light emerges collimated from the center of the lens and illuminates a large area in the sample. If now the illumination beam path is slightly offset, the light emerges from the objective at a certain angle. This angle increases the further one removes the beam from the center of the objective aperture.
  • the deflection of the beam in the sample is negligible. But they all take different paths within the lens.
  • Another type of illumination is the TIRF illumination, which is also very popular in the described microscopy technique.
  • the illumination beam path is moved to the edge of the objective aperture.
  • the exit angle at the lens is so large that with suitable samples total reflection occurs and the sample is illuminated only by the evanescent field.
  • background light can be hidden.
  • the penetration depth of the evanescent light depends on the angle.
  • the same exit angle results. In this respect, numerous points on this circle can be approached without changing the penetration depth in the sample.
  • the TIRF effect is very nonlinear. That is, the total reflection and thus the TIRF effect suddenly set in and the change of the penetration depth with change of the angle is then comparatively small and not of primary importance in many applications. It is mainly important that a TIRF effect is achieved at all. Whether the penetration depth is then 90nm or 200nm is secondary in many applications. Depending on their importance with regard to a specific penetration depth, areas with a smaller or larger radius can thus also be approached and still retain a TIRF effect. Thus, many more places are available in the lens that offer alternative beam paths.
  • optics, acousto-optics or opto-mechanics are usually already provided, which make it possible to design the illumination beam with regard to the required exit angles to manipulate a TIRF effect or for epifluorescence illumination.
  • This opto-mechanics can then also be used to achieve small beam offsets which achieve the effect described above.
  • the beam offset can take place according to various patterns, for example, the beam can automatically approach other points on the lens according to a predetermined pattern at suitable time intervals. It can also be done, for example, a random generator-driven approach, which illuminates a random other point in the lens, for example, at each measurement or after another appropriate time.
  • uniform radiation exposure is achieved. achieved by the lens.
  • the approached points should be in a range that is still tolerable with regard to the unwanted optical deviation for the ideal case.
  • the appropriate time for the arrival of a new point can be determined in various ways.
  • the position can be changed after relatively short periods of time, but each position can be approached several times over the life of the lens. Thus, the lens is irradiated uniformly over a longer period of time, which is desirable.
  • each position can be illuminated until shortly before reaching the destructive radiation dose and then be approached to another position.
  • the time of reaching the destructive radiation dose can be variously determined, for example, test measurements can determine the usual dose. It should then each point correspondingly far below the damage threshold be illuminated so that the lens does not damage sooner than necessary.
  • the achievement of the damage threshold can also be determined by measurements during the irradiation.
  • the change in the optics under the influence of radiation can be determined with sufficiently accurate measuring devices, e.g. in which the transmission of the optics decreases slightly at certain points. This transmission can be monitored during the measurements and then the illumination point can be changed from a certain limit transmission, which is shortly before the damage threshold.
  • Figure 1 is a schematic representation of a microscope according to the invention without lateral offset of the illumination light beam path relative to the optical axis of the lens.
  • FIG. 2 is a schematic representation of a microscope according to the invention with lateral offset of the illumination light beam path relative to the optical axis of the lens.
  • FIG. 3 shows a sectional illustration of the objective with different illumination light beam paths A, B, C, designated YZ in FIG.
  • FIG. 4 shows a plan view of the objective with different illuminating light beam paths A, B, C, designated by X in FIG.
  • Figure 5 is a side view of an object and slide with two different
  • FIG. 6 is a side view of an object and a slide with two different
  • Illumination light beam paths A and C wherein the illumination light beam path C demonstrates the special case of a TIRF illumination.
  • FIG. 1 schematically shows a microscope in which the widefield microscope illumination system according to the invention is incorporated as one component.
  • the schematic representation deviates relatively far from the actual scales.
  • the fundamental construction of the microscope shown is that of an inverted microscope in which the sample is at the top and the illumination beam is transmitted from the bottom to the top to hit the top of the sample and illuminate it. It will be understood that a conventional bottom down sample and top detector configuration may also be used.
  • a light source 1 for example a laser, transmits a first beam 2 into an illumination light beam manipulation device 21, for example consisting of a tiltable mirror 3 and a lens 4.
  • the beam 5 emerging from the illumination light beam manipulation device 21 is viewed at a dichroic mirror 6 reflected in the form of a converging beam 7 to the lens 8, which is shown here for the sake of simplicity as a simple lens.
  • the objective 8 collimates the beam and sends it as a collimated beam 9 in the object plane 10.
  • the detection light 11 to be detected is emitted by the object, not shown here.
  • the detection light 11 emanating from a point of the object is shown.
  • the object can also emit light at all other illuminated points.
  • the light to be detected passes through the objective 8 and the dichroic mirror 6 permeable in the direction of the detection beam path, and is directed by a tube lens 12 onto a detector 13, which permits location allocation for the received light intensities.
  • a tube lens 12 which permits location allocation for the received light intensities.
  • location-assigning detectors are CCD cameras or CMOS cameras.
  • the illumination light beam tangent manipulation device 21 has not set a lateral offset for the illumination light beam path, that is, the illumination light beam path is transmitted along the objective optical axis 14 to the objective 8, or in other words, the symmetry axis of the illumination light Beam path coincides with the optical see lens axis 14.
  • FIG. 2 shows a representation similar to that of FIG. 1, still with scales which greatly differ from reality.
  • the lateral offset of the illumination light beam 7 is clarified, whose axis of symmetry extends laterally offset from the optical lens axis 14.
  • the illumination light beam manipulation device 21 received a control command, whereupon the illumination light beam manipulation device 21 tilts the mirror 3 contained therein, so that the beam 2 originating from the light source 1 is changed in its direction in such a way that after the lens 4 of FIG Illuminating light beam manipulation device 21 is laterally offset and convergent, which is shown by the emerging from the illumination light beam manipulation device beam 5. Tilting of the mirror 3 can take place in two different tilting directions, i.
  • This lateral offset of the convergent beam 5 continues after reflection on the mirror 6 and, after passing through the objective 8, causes the illuminating light beam 9 emerging from the objective 8 to collapse and has an angle ⁇ to the optical objective axis 14.
  • this angle ⁇ is negligibly small for the effective illumination of the object 16.
  • the detection light 11 is emitted.
  • FIG. 1 only the light emitted by a point of the object 16 is shown here by way of example. It is understood that in reality several More points of the object 16 radiate light. This may be a mixture of the desired fluorescent light and reflected and scattered light from the sample. It is focused by the lens 8 in cooperation with the tube lens 12 on the detector 13.
  • the illuminating light beam 7 penetrating into the objective 8 has an even smaller cross-section in relation to the objective surface than shown in FIG. 2, that is, only a small percentage of the aperture or the objective surface is utilized.
  • FIG. 3 shows an example of an objective 8, which in FIGS. 1 and 2 was shown merely as a simple lens for the sake of simplicity.
  • Figure 3 shows a sectional view according to the section marked Y-Z in Figure 4 in a schematic representation.
  • a simple lens lenses are typically made of one more
  • Lens-containing lens assemblies which are often at least partially connected to each other with optical cement.
  • Typical cemented surfaces are designated by the reference numeral 22 in FIG. As mentioned above, these cemented surfaces 22 are particularly sensitive to excessive exposure to radiation for too long a period.
  • FIG. 4 shows a plan view of the objective 8. This plan view is designated X in FIG.
  • the illumination light arrives at an even greater angle ⁇ in the object planes 10, the farther the illumination light beam path A, B, C is laterally offset from the optical objective axis.
  • the illumination light beam path B the illumination light only impinges from the objective 8 in the object plane 10 in an exit angle which deviates very little from the optical axis.
  • the illuminated sample emits light in all directions, on the one hand fluorescent light, on the other hand reflected and scattered light.
  • fluorescent light of interest which can be filtered out, for example, with a color filter from the entire detection light, before the detection beam is sent to the location-assigning detector 13 (see Figure 2).
  • a small parallel offset of the illumination light beam path B also opens a plurality of illumination light entry points, namely in the form of a circular ring 23, which extends concentrically around the optical objective axis 14. It is understood that if an offset according to beam path B is still permissible, even smaller offsets are permissible because they lead to smaller deviations ⁇ . This results in a permissible illumination light entrance surface 24 on the objective 8, which can be predetermined and, depending on the application, can also be changed by a control signal.
  • the beam path C likewise with a plurality of beams corresponding to the wide-field illumination, is shown with a large angle deviating from the optical axis, as occurs in the case of a large offset of the illumination light entry point to the optical axis of the objective Figures 3 and 4 has been shown.
  • This special case of a large angle ⁇ can be used for so-called TIRF illumination.
  • the theoretically maximum possible offset between the optical objective axis and the illumination light entry point is determined by the aperture D.
  • the predetermined illuminating light entry surface which defines the illuminating light entry points allowed for TIRF illumination, therefore functions as an annular surface.
  • the predetermined illuminating light incident surface 24 allowed for the normal illumination may be a circular area (see Fig. 4) which is enclosed by the annular TIRF predetermined illumination light entrance surface.
  • the illumination light entry points are automatically changed, which can be done at fixed time intervals and a fixed pattern, but can also be done in response to measurement signals, for example, as shown in Figure 2 by measuring the transmission of the objective 8 with a measuring device 18, which can give a signal to a controller 20 via a signal line 19, and the illumination light entry point is then changed when the transmission falls below a certain limit.
  • Other criteria for changing the illumination light entry location as a function of time may be the radiation exposure that results from the product of radiation intensity and time for the respective illumination light entry location.
  • the changes tion of the temporal entry points done by a random number generator, which is part of the controller 20.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Weitfeld-Mikroskop-Beleuchtungssystem und ein Beleuchtungsverfahren. Beleuchtungslicht wird an innerhalb einer vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche liegenden Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen in das Mikroskopobjektiv gesendet. Diese Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen werden von einer gesteuerten, automatischen Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung automatisch in zeitlichen Abständen zu einer Mehrzahl von Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen geändert, um das Objektiv vor Schädigung durch Strahlenüberlastung zu bewahren.

Description

Weitfeld-Mikroskop-Beleuchtungssystem und Weitfeld-Beleuchtungsverfahren
Die Erfindung betrifft ein Weitfeld-Mikroskop-Beleuchtungssystem mit einem Mikroskopobjektiv, welches eine optische Objektivachse aufweist, wobei das Beleuchtungslicht durch das Objektiv auf eine mit einem Mikroskop betrachtete Probe gesendet wird, sowie ein entsprechendes Beleuchtungsverfahren.
In jüngerer Vergangenheit wurden lichtmikroskopische Verfahren entwickelt, mit denen sich basierend auf einer sequentiellen, stochastischen Lokalisierung von einzelnen Punktobjekten, insbesondere Fluoreszenzmolekülen, Bildstrukturen darstellen lassen, die kleiner sind als die beugungsbedingte Auflösungsgrenze klassischer Lichtmikroskope. Solche Verfahren sind beispielsweise beschrieben in WO 2006/127692 A2; DE 10 2006 021 317 B3; WO 2007/128434 AI, US 2009/0134342 AI; DE 10 2008 024 568 AI;„Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)", Nature Methods 3, 793- 796 (2006), M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang;„Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy using fast Single molecule photo-switching", Geisler C. et al, Appl. Phys. A, 88, 223- 226 (2007). Dieser neue Zweig der Mikroskopie wird auch als Lokalisierungsmikroskopie bezeichnet. Den neuen Verfahren ist gemein, dass die abzubildenden Strukturen mit Markern präpariert werden, die über zwei unterscheidbare Zustände verfügen, nämlich einen„hellen" Zustand und einen„dunklen" Zustand. Werden beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe als Marker verwendet, so ist der helle Zustand ein fluoreszenzfähiger Zustand und der dunkle Zustand ein nicht fluoreszenzfähiger Zustand. Zur Abbildung von Bildstrukturen mit einer Auflösung, die kleiner als die klassische Auflösungsgrenze des abbildenden optischen Systems ist, wird nun wiederholt eine kleine Untermenge der Marker in den hellen Zustand präpariert. Diese Untermenge wird im Folgenden als aktive Untermenge bezeichnet. Die aktive Untermenge ist dabei so zu wählen, dass der mittlere Abstand benachbarter Marker im hellen Zustand größer ist als die Auflösungsgrenze des abbildenden optischen Systems. Die Luminanzsignale der aktiven Untermenge wer- den auf einen räumlich auflösenden Lichtdetektor, z.B. eine CCD-Kamera, abgebildet. Von jedem Marker wird so ein Lichtfleck erfasst, dessen Größe durch die Auflösungsgrenze des abbildenden optischen Systems bestimmt ist.
Auf diese Weise wird eine Vielzahl von Rohdaten-Einzelbildern aufgenommen, in denen je- weils eine andere aktive Untermenge abgebildet ist. In einem Bildanalyse-Prozess werden dann in jedem Rohdaten-Einzelbild die Schwerpunkte der Lichtflecke bestimmt, welche die im hellen Zustand befindlichen Marker darstellen. Die aus den Rohdaten-Einzelbildern ermittelten Schwerpunkte der Lichtflecke werden dann in einer Gesamtdarstellung zusammengetragen. Das durch diese Gesamtdarstellung entstehende hochaufgelöste Bild spiegelt die Verteilung der Marker wieder. Für eine repräsentative Wiedergabe der abzubildenden Struktur müssen ausreichend viele Signale detektiert werden. Da jedoch die Anzahl an Markern in der jeweils aktiven Untermenge durch den minimalen mittleren Abstand, den zwei Marker im hellen Zustand voneinander haben dürfen, limitiert ist, müssen sehr viele Rohdaten-Einzelbilder aufgenommen werden, um die Struktur vollständig abzubilden. Typischerweise liegt die Anzahl an Rohdaten- Einzelbildern in einem Bereich von 10.000 bis 100.000.
Die für die Aufnahme eines Rohdaten-Einzelbildes benötigte Zeit ist nach unten hin durch die maximale Bildaufnahmerate des abbildenden Detektors limitiert. Dies führt zu vergleichsweise langen Gesamtaufnahmezeiten für eine für die Gesamtdarstellung benötigte Serie von Rohda- ten-Einzelbildern. So kann die Gesamtaufnahmezeit bis zu einigen Stunden betragen.
Um die gesamte Aufhahmezeit möglichst zu reduzieren und so kurz wie möglich zu halten, muss die Aufnahmezeit eines jeden Einzelrohdatenbildes so kurz wie möglich gehalten werden. Dazu ist es nötig, dass die einzelnen Lichtflecke, die die Marker erzeugen, sehr schnell entste- hen, wobei sie natürlich zwecks guter Lokalisierung dennoch hell sein müssen. Das bedeutet, dass die Marker, wenn sie im aktiven Zustand befindlich sind, sehr schnell sehr viele Photonen aussenden, bevor sie wieder in den inaktiven Zustand übergehen. Wird nun die Aufhahmezeit der Einzelrohdatenbilder entsprechend auf die mittlere Leuchtdauer der Marker angepasst, ergibt sich eine schnellstmögliche Aufnahme. Typische Marker sind (schaltbare oder nicht- schaltbare) fluoreszierende Moleküle. Diese senden in einem gewissen Zeitraum umso mehr Photonen aus, je mehr Photonen Anregungslicht sie erfassen. Daher ist es nötig, die Moleküle mit hohen Lichtintensitäten zu bestrahlen. Nur so lässt sich eine schnellstmögliche Bildaufnahme ermöglichen. Hohe Lichtintensitäten sind insbesondere dann von Vorteil, wenn als Marker ganz gewöhnliche, nicht schaltbare Fluoreszenzmoleküle verwendet werden. Diese haben gegenüber speziellen schaltbaren Farbstoffen den Vorteil, im Allgemeinen viel einfacher handhabbar zu sein und bessere Färbeergebnisse zu erzielen. Zudem stehen eine große Anzahl verschiedener Farbstoffe zur Verfügung. Spezielle schaltbare Farbstoffe sind in ihrer Zahl begrenzt und oft nicht einfach in der Handhabung. Der aktive Zustand dieser Standardfarbstoffe entspricht somit dem Molekül in seinem Grundzustand oder ersten angeregten Zustand, auf jeden Fall mit der Möglichkeit Photonen auszusenden. Der inaktive Zustand ist ein Dunkelzustand des Moleküls, wie ihn jedes gewöhnliche Fluoreszenzmolekül zeigt, beispielsweise ein Triplettzustand oder ein reduzierter oder oxidierter Zustand. Das Molekül kann typischerweise mit einer geringen Wahrscheinlichkeit aus dem angeregten Zustand in den Dunkelzustand wechseln und wird nach einer gewissen Zeit automatisch wieder in den Grundzustand übergehen, in welchem es wieder fluoreszieren kann. Durch diese Tatsache zeigt das Molekül ein Blinkverhalten: Es sendet so lange Photonen aus, bis es spontan aus dem angeregten Zustand in den Dunkelzustand übergeht. Diese Photonen in ihrer Gesamtheit bilden einen Lichtfleck. Das Molekül bleibt nun im Dunkelzustand, bis es spontan wieder in den aktiven Zustand übergeht. In der Zeit des Dunkelzustands sendet das Molekül keine Photonen und damit kein detektierbares Signal aus. Da der Dunkelzustand sehr langlebig sein kann, bei hoher Lichtintensität aber die Lichtflecken sehr schnell entstehen, zeigt sich dieses Verhalten als Blinken. Um unter diesen Umständen einen Zustand zu erreichen, in dem nur vereinzelte Moleküle sichtbar sind, also im aktiven Zustand, muss die Lichtintensität des Anregungslichtes sehr hoch sein. Nur so ist es möglich, dass fast alle Moleküle im inaktiven Zustand befindlich sind, denn sobald sie spontan in den aktiven Zustand wechseln, senden sie durch die hohe Intensität des Anregungslichts bedingt eine schnelle Folge von Photonen aus und verschwinden„blitzartig" wieder. Dadurch sind nur sehr wenige Moleküle gleichzeitig sichtbar. Die hohe Intensität des Anregungslichtes ermöglicht hier also nicht nur eine schnelle Bildaufnahme, sondern ist für das Einstellen eines ausreichend kleinen Verhältnisses aus aktiven zu inaktiven Markern dienlich.
Durch die obigen Erläuterungen ist deutlich geworden, dass eine hohe Lichtleistung in die Probe gebracht werden muss. Die Beleuchtung der Probe erfolgt üblicherweise im sogenannten„Weitfeld"- Verfahren. Das bedeutet, dass eine große Fläche in der Probe möglichst homogen beleuchtet wird, nämlich genau der Bereich, der durch die Abbildungsoptik auf den Detektor abgebildet wird. Die Beleuchtung erfolgt typischerweise durch das gleiche Objektiv, das auch das Fluoreszenzlicht aufsammelt und mittels entsprechender weiterer Optik die Probe auf den Detektor abbildet. Um einen großen Bereich der Probe möglichst homogen zu beleuchten wird das Licht in die hintere Fokalebene des Objektivs fokussiert. Je nach Größe des Fokus in der hinteren Fokalebene, ergibt sich in der vorderen Fokalebene, also in der Probenebene, die Größe des Ausleuch- tungsfeldes. Dabei gilt: Je kleiner der Fokus in der hinteren Fokalebene, desto größer das Aus- leuchtungsfeld und andersherum. Um einen entsprechend großen Bereich ausleuchten zu können, wird also das gesamte Anregungslicht als kleiner Lichtstrahl in das Objektiv gelenkt. Dies hat zur Folge, dass in typischen Objektiven das Anregungslicht die Linsen im Objektiv als relativ enges Strahlenbündel durchquert. Dabei gibt es Bereiche im Objektiv, in denen das Strah- lenbündel breiter oder schmaler ist. Generell wird typischerweise bei dieser Art der Beleuchtung aber eben nicht die die gesamte Apertur der Linsen ausgenutzt, sondern das Licht passiert die Linsen immer nur in einem sehr dünnen Strahlenbündel. Da generell, wie oben schon geschildert, sehr hohe Lichtleistungen in die Probe eingebracht werden müssen, werden durch das dünne Strahlenbündel im Objektiv extrem hohe Lichtintensitäten erreicht. Zum Erreichen dieser Lichtintensitäten wird für die Weitfeld-Beleuchtung in Lokalisierungsmikroskopen daher oft Laserlicht verwendet.
Kompliziertere Linsen oder Linsensysteme, wie sie in Objektiven auftreten, beinhalten typischerweise verschiedene Materialien, die bei hohen Lichtintensitäten Schaden nehmen können. Typischerweise ist das„schwächste" Glied hier der optische Kitt, mit dem etwa verschiedene Linsenteile miteinander verbunden werden. Jedoch können auch Oberflächenschichten auf den Gläsern der Linsen oder die Gläser selber im Extremfall Schaden nehmen.
Bei steigender„Belastung" der Optik durch die starke Beleuchtung kann es somit zu Schäden in der Optik kommen, die sich unvorteilhaft auf den Strahlengang der Beleuchtung, wie auch der Detektion auswirken können. So können zum Beispiel„blinde Flecke" entstehen, die punktuell das Licht absorbieren, beugen, oder stark streuen. Denkbar sind auch Löcher in den Gläsern, etc. Derartige Schäden können ein Objektiv komplett unbrauchbar machen. Entsteht z.B. ein blinder Fleck genau im Beleuchtungsstrahlengang (wo er durch die Strahlenbelastung vornehm- lieh entstehen würde), wäre das Objektiv nicht mehr zu verwenden, weil dann kein Licht oder zumindest kein sauberer Beleuchtungsstrahl mehr aus dem Objektiv in Richtung Probe austreten würde. Zudem würden sich derartige Schäden auch negativ auf den Detektionsstrahlengang auswirken, da dieser ebenfalls das Objektiv passiert und das Detektionslicht an den geschädigten Objektivstellen beeinflusst würde, beispielsweise gestreut würde. Auch wenn es bekannt ist, einfache optische Systeme ohne Kitt herzustellen, werden diese Systeme typischerweise mechanisch anfälliger und instabiler und auch hinsichtlich anderer optischer Eigenschaften sind Nachteile denkbar. Gegenüber der Strahlenbelastung werden diese Systeme jedoch deutlich stabiler, weil der strahlenbelastungsanfällige optische Kitt entfällt. Dennoch ist bei komplizierten optischen Systemen wie speziellen Objektiven eine Herstellung ohne optische Kitte nach heutigen technischen Maßstäben nicht oder nur unter erheblichem Mehraufwand möglich. Es ist somit von größter Wichtigkeit, auch bei verkitteten optischen Systemen derartige Schäden zu verhindern, da sonst die Lebensdauer der Objektive für den praktischen Gebrauch stark begrenzt ist. Dies gilt umso mehr, weil Objektive sehr aufwändige Bauteile und entsprechend teuer sind.
Es stellt sich bei genauerer Betrachtung der Problematik heraus, dass typische Strahlenschäden nach ähnlichem Muster ablaufen: Zumeist ergeben sich die Schäden nicht sofort bei erstmaligem Einschalten des Lichtes. Oftmals verwendet man Lichtleistungen, die die fraglichen opti- sehen Bauteile längere Zeit aushalten. Allerdings kann man häufig eine langsame Abnahme der Transmission der Optik feststellen. Dies ist bei gekitteter Optik vermutlich auf eine Veränderung des Kitts unter Einfluss des Lichts zurückzuführen. Nach einer gewissen Zeit jedoch ist eine kritische Schwelle erreicht und das fragliche Bauteil zeigt an der beleuchteten Stelle eine plötzliche Veränderung in Sekundenbruchteilen, die dazu führen kann, dass das Bauteil an der beleuchteten Stelle und ihrer Umgebung punktuell oder (bei entsprechender Heftigkeit der Reaktion) im Ganzen kein Licht mehr transmittiert oder dieses z.B. stark streut und somit unbrauchbar geworden ist.
Bevor diese plötzliche Veränderung aufgetreten ist, ist höchstens eine marginale Veränderung der optischen Eigenschaft erkennbar, die mit geeigneten und genauen Messmethoden messbar sein kann, aber üblicherweise zu vernachlässigen ist. Bis zu dem plötzlichen Eintreten der Veränderung ist die Optik also ganz normal benutzbar. Die Schädigung bzw. Zerstörung des Objektivs ist daher ein hochgradig nichtlinearer Prozess, was in der nachfolgenden Erfindung ausgenutzt wird.
Es versteht sich, dass das Problem nicht nur bei Lokalisierungsmikroskopen, sondern bei jeder Art von Mikroskopen auftritt, bei welchen eine hohe Beleuchtungslicht-Intensität verwendet wird, welche durch das Objektiv gesendet wird. Auch wenn dies besonders auf Fluoreszenzmikroskope zutrifft, kann dies auch bei Lichtmikroskopen der Fall sein. Es ist ein Aufgabe der Erfindung, bei einer Weitfeld-Beleuchtung, welche durch ein Mikroskopobjektiv erfolgt, auch bei hoher Lichtintensität des Beleuchtungslichts eine Schädigung des Objektivs zu verhindern. Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird dies erreicht durch ein Weitfeld-Mikroskop- Beleuchtungssystem mit: einem Mikroskopobjektiv, welches eine optische Objektivachse aufweist; einer Beleuchtungslichtquelle, welche Weitfeld-Beleuchtungslicht längs von Beleuchtungsstrahlengängen mit entsprechenden Beleuchtungsachsen sendet, längs welcher das Beleuchtungslicht durch innerhalb einer vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche liegende Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen in das Mikroskopobjektiv eindringt; einem räumlich auflösenden Lichtdetektor, welcher von einer beleuchteten Probe durch das Mikroskopobjektiv entlang eines Detektionslichtstrahlengangs gesendetes Detektionslicht detektiert; und einer von einer Steuerung gesteuerten, automatischen Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung, welche in Richtung des Beleuchtungslicht-Strahlengangs vor dem Mikroskopobjektiv angeordnet ist und mittels welcher Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung die Beleuchtungsachsen automatisch in zeitlichen Abständen zu einer Mehrzahl von Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen bewegbar ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird dies erreicht durch Weitfeld- Beleuchtungsverfahren zur Beleuchtung von mit einem Mikroskop betrachteten Proben, wobei das Mikroskop versehen ist mit: einem Mikroskopobjektiv, welches eine optische Objektivachse aufweist; und einer Beleuchtungslichtquelle, welche Weitfeld-Beleuchtungslicht längs von Beleuchtungsstrahlengängen mit entsprechenden Beleuchtungsachsen sendet, längs welcher das Beleuchtungslicht durch innerhalb einer vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche lie- gende Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen in das Mikroskopobjektiv eindringt; wobei das Beleuchtungsverfahren versehen ist mit derartigem wiederholtem, automatischem, parallelem Verstellen der Beleuchtungsachse relativ zur optischen Objektivachse in zeitlichen Abständen, dass ein seitlicher Versatz der Beleuchtungsachse relativ zur Objektivachse automatisch verstellt wird, so dass die Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle in derartigen zeitlichen Abständen innerhalb der vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche verstellt wird, dass das Objektiv vor Schädigung durch Beleuchtungslicht geschützt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verlaufen die Beleuchtungsachsen stets parallel zur Objektivachse. Auch wenn leicht abweichende Eintrittswinkel in das Objektiv zu einem seitlichen Versatz der Beleuchtung zum Objekt führen, kann dieser entweder vernach- lässigbar oder bei bestimmten Sonderanwendungen sogar erwünscht sein. In der Regel wird man aber den Eintrittswinkel zumindest im Wesentlichen parallel zur Objektivachse wählen, zumindest wenn eine Kompensation eines stärkeren seitlichen Versatzes des aus dem Objektiv austretenden Beleuchtungslichts relativ zur Probe vermieden werden soll. In Verfahrensschritten ausgedrückt enthält die bevorzugte Ausführungsform die Schritte paralleles Ausrichten der Beleuchtungsachsen relativ zu der Objektivachse und Beibehalten dieser Parallelität beim automatischen Verstellen des seitlichen Versatzes der Beleuchtungsachse relativ zur Objektivachse.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Weitfeld-Mikroskop- Beleuchtungssystem Bestandteil eines Lokalisierungsmikroskops. Diese besondere Anwendung ergibt sich daraus, dass als Beleuchtungslicht relative hohe Lichtintensitäten durch das Objektiv gesendet werden, wobei für den Eintritt des Beleuchtungslichtstrahls in das Objektiv nur ein relativ kleiner Teil der Apertur des Objektivs ausgenutzt wird, d.h. der Strahlquerschnitt relativ klein im Vergleich zur gesamten Eintrittsfläche des Objektivs ist, und unter Umständen (aber nicht zwingend) erst bei Durchlaufen des Objektivs zu einen größeren Strahlquerschnitt kolli- miert wird. Allerdings kann die Anwendung auch bei anderen Mikroskopen als Lokalisierungmikroskopen erfolgen, beispielsweise bei Lichtmikroskopen, wenn dort hohe Lichtintensitäten für das Beleuchtungslicht Anwendung finden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Mikroskop- Beleuchtungssystem Bestandteil eines TIRF-Beleuchtungssystems. Dies ist besonders deshalb von Vorteil, weil sich mit dem erfmdungsgemäßen Beleuchtungssystem durch relativ einfache Verwirklichung eines seitlichen Versatzes des Beleuchtungslichts relativ zur optischen Objektivachse verschiedene Beleuchtungswinkel in der Objektebene einstellen lassen. Das erfin- dungsgemäße Verfahren zeichnet sich gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung entsprechend dadurch aus, dass ein Auswählen der vorgegebenen Beleuchtungslicht- Eintrittsfläche aus wenigstens zwei unterschiedlichen Beleuchtungslicht-Eintrittsflächen erfolgt, welche unterschiedlichen Beleuchtungsmodi zugeordnet sind, welche vorteilhaft Epifluores- zenzbeleuchtung und TIRF-Beleuchtung sein können. Die Epifluoreszenzbeleuchtung kann dabei auch mit leicht von der optischen Achse abweichenden Winkeln erfolgen, welche Abweichung aber für die Ausleuchtung der Probe zu vernachlässigen sind. Obgleich man in der Praxis mit weitaus kleineren Abweichungen arbeiten kann, wäre selbst eine Abweichung von 30 Grad zur optischen Objektivachse für viele Anwendungen zum Zweck der Ausleuchtung der Probe zu vernachlässigen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung eine Optomechanik, Akustooptische Modulatoren (AOM) oder Elektrooptische Modulatoren (EOM) auf, welche einen verstellbaren Strahlenversatz und somit eine im Verhältnis zu optischen Objektivachse verstellbare Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle einstellt. Besonders AOMs und EOMs bieten die Möglichkeit, einen seitlichen Versatz des Beleuchtungslichtstrahlengangs sehr schnell zu bewerkstelligen. Da aber die Objektive schon über einen bestimmten Zeitraum die Strahlenbelastung aushalten, reicht hinsichtlich der Umstellgeschwindigkeit auch eine Optomechanik. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Steuerung einen Zufallsgenerator auf, welcher einen zugelassenen verstellbaren Strahlenversatz im Bereich der vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche für das Beleuchtungslicht in das Objektiv steuert, wobei alle von der Steuerung zugelassenen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen innerhalb dieser vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche liegen. In Form des erfindungsgemäßen Ver- fahrens ausgedrückt erfolgt vorteilhaft ein zufälliges Auswählen der jeweiligen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen des Beleuchtungslichts innerhalb der vorgegebenen Beleuchtungslicht- Eintrittsfläche und Beibehalten dieser jeweiligen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen über die jeweiligen zeitlichen Abstände bis die jeweilige nächste Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle innerhalb der vorgegebenen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen zufallig ausgewählt wird. Als Alterna- tive können verschiedene Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen nach einem vorgegebenen Muster angefahren werden, d.h. durch ein Auswählen der jeweiligen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen des Beleuchtungslichts erfolgt innerhalb der vorgegebenen Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche nach einem vorgegebenen Muster und Beibehalten dieser jeweiligen Beleuchtungslicht- Eintrittsstellen über die jeweiligen zeitlichen Abstände bis die jeweilige nächste Beleuchtungs- licht-Eintrittsstelle innerhalb der vorgegebenen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen nach dem vorgegebenen Muster ausgewählt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die bereits angefahrenen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen und die darauf gesendete Strahlungsmenge gespeichert. Hier- aus lässt sich einerseits für den Benutzer ableiten, wann das Objektiv vermutlich zerstört werden wird, so dass es präventiv gewechselt werden kann. Zudem kann durch diese Informationen die automatische Beleuchtungslicht- Versteileinrichtung bei einem Wechsel der Beleuchtungslicht- Eindringstellen die neue Beleuchtungslicht-Eindringstelle immer so auswählen, dass diese in einen Bereich fallt, der im Vergleich zu anderen Stellen noch wenig geschädigt wurde. Somit lässt sich eine noch gleichmäßige und dadurch lebensdauerverlängernde Wirkung erreichen, als bei einer rein zufallig gesteuerten Verstellung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eine Steuerungs-Schnittstelle vorgesehen, mittels welcher ein die vorbestimmte Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche verstellender Steuerbefehl eingebbar ist. Dies kann entweder erfolgen, um einen unterschiedlichen Beleuchtungsmodus einzustellen, welcher mit einer unterschiedlichen vorbestimmten Beleuch- tungslicht-Eintrittsfläche einhergeht, oder um weitere Alternativen zur Schonung des Objektivs zu finden, beispielsweise eine weiter von der optischen Achse entfernt liegende Stelle, wenn die der optischen Objektivachse nahen Stellen durch eine zu hohe Strahlenbelastung sozusagen verbraucht sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die vorbestimmte Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche eine kreisförmige, kreissegmentförmige, ringförmige oder ringsegmentför- mige Fläche. Es kann aber auch jede andere beliebige Fläche, beispielsweise quadratisch, rechteckig oder dreieckförmig gewählt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eine Messeinrichtung vorgesehen, welche die Transmission des Objektivs überwacht und ein Steuersignal an die Steuerung sendet, wenn die Transmission unter einen vorbestimmten Grenzwert fällt. In anderen Worten wird ein
Messen optischer Transmission des Objektivs für die jeweiligen Beleuchtungslicht- Eintrittsstellen vorgenommen und ein Einstellen der zeitlichen Abstände erfolgt entsprechend einer Veränderung der optischen Transmission für die jeweilige Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle über der Zeit. Daraus folgt, dass eine Verstellung der Beleuchtungsstrahl-Eintrittsfläche in das Objektiv erst dann erfolgt, wenn die vorherige Stelle sozusagen verbraucht ist. Damit lässt sich die Anzahl der Umstellvorgänge begrenzen. Da allerdings diese Störungen minimal sind und meist gar nicht bemerkt werden, kann die Umstellung auch in vorbestimmten Zeitintervallen erfolgen, oder in durch ein Steuersignal einstellbaren zeitlichen Abständen. Nachfolgend wir die Erfindung weiter im Detail beschrieben:
Wird nach einer gewissen Beleuchtungszeit, die jedoch unterhalb der Zerstörschwelle der Optik liegt, der Beleuchtungsstrahlengang automatisch an eine in der Nähe befindliche Stelle in der Optik geführt, kann die Zerstörung der Optik an der ersten Stelle abgewendet werden. Die neue Stelle kann nun wieder eine entsprechende Zeit beleuchtet werden, bevor man den Beleuch- tungsstrahlengang wieder an eine andere Stelle schiebt. Auf diese Weise werden die zuvor beleuchteten Stellen wie oben beschrieben nur in optisch vernachlässigbarer Weise geschädigt. Je nachdem, welchen Durchmesser der Lichtstrahl hat und wie groß der Bereich der Optik ist, auf dem man den Lichtstrahl verschieben kann, ohne unerwünschte Effekte im weiteren Verlauf des Strahlenganges zu bewirken, kann man sehr viele unterschiedliche Stellen der Optik bis kurz vor die Zerstörschwelle beleuchten. Die Anzahl der möglichen beleuchtbaren Stellen ergibt den Faktor, um den sich die Lebenszeit des Objektivs verlängern lässt.
Wie im obigen Absatz schon angedeutet, ist es üblicherweise nicht in beliebiger Art und Weise möglich, den Strahlengang in der Optik zu verschieben, denn dies hat eine Änderung des Strahlenganges im nachfolgenden Bereich zur Folge. Dennoch bietet sich bei sehr kleinen Strahldurchmessern und entsprechender Größe der betroffenen Optik oft ausreichend Spielraum, um viele unterschiedliche Positionen anfahren zu können und somit die Lebenszeit der Optik um ein vielfaches zu erhöhen. Dies wird am konkreten Beispiel der großflächigen Beleuchtung einer mikroskopischen Probe verdeutlicht. Das kritische Bauteil ist in diesem Fall das Objektiv. Es gibt verschiedene typische Beleuchtungsarten, beispielsweise die Epifluoreszenzbeleuch- tung. Hier wird das Anregungslicht in das Zentrum der hinteren Fokalebene fokussiert. Dies hat zur Folge, dass das Licht kollimiert aus dem Zentrum des Objektivs austritt und in der Probe einen großen Bereich beleuchtet. Wird nun der Beleuchtungsstrahlengang leicht versetzt, tritt das Licht unter einem bestimmten Winkel aus dem Objektiv aus. Dieser Winkel wird umso größer, je weiter man den Strahl vom Zentrum der Objektivapertur entfernt.
In der Praxis ist es für viele Proben jedoch völlig irrelevant, ob sie nun von einem senkrechten oder einem leicht schrägen Strahl durchleuchtet werden. Oftmals sind Proben nämlich sehr flach (z.B. Zellen auf Deckgläsern), so dass ein gewisser Winkel gar keine Rolle spielt. Tritt Licht unter einem von der Senkrechten, d.h. dem Verlauf der optischen Objektivachse leicht abweichenden Winkel auf die Probe, wird die Probe quasi identisch zur senkrechten Beleuchtung beleuchtet, obgleich im Objektiv selber eine andere Stellen bestrahlt wird. Insbesondere in der in der oben beschriebenen Mikroskopietechnik arbeitet man vor allem mit flachen Proben, da man bei dickeren Proben ohnehin das Problem hätte, nicht erwünschtes Hintergrundsignal zu erhalten. Insofern stehen zahlreiche mögliche alternative Beleuchtungsstrahlengänge zur Verfügung, die eine Vervielfachung der Objektivlebensdauer ermöglichen. Für alle Strahlengänge, die in das Objektiv innerhalb des Rings einfallen, ist die Ablenkung des Strahls in der Probe vernachlässigbar. Sie alle nehmen aber innerhalb des Objektivs unterschiedliche Wege. Eine weitere Beleuchtungsart ist die TIRF -Beleuchtung, die bei der beschriebenen Mikroskopietechnik ebenfalls sehr beliebt ist. Hier wird der Beleuchtungsstrahlengang an den Rand der Objektivapertur gefahren. Nun ist der Austrittswinkel am Objektiv so groß, dass bei geeigneten Proben Totalreflexion auftritt und die Probe nur vom evaneszenten Feld beleuchtet wird. Somit lässt sich Hintergrundlicht ausblenden. Die Eindringtiefe des evaneszenten Lichtes hängt vom Winkel ab. Jedoch ergibt sich für alle Punkte, die auf einem Kreis mit einem bestimmten Radius um das Zentrum der Apertur liegen, der gleiche Austrittswinkel. Insofern können zahlreiche Punkte auf diesem Kreis angefahren werden, ohne dass sich die Eindringtiefe in der Probe ändert. Zudem ist hier ein weiterer Effekt von zusätzlichem Nutzen: Auch der TIRF-Effekt ist sehr nichtlinear. D.h. die Totalreflexion und damit der TIRF-Effekt setzen plötzlich ein und die Änderung der Eindringtiefe mit Änderung des Winkels ist dann vergleichsweise gering und bei vielen Anwendungen nicht primär von Wichtigkeit. Es ist hauptsächlich wichtig, dass überhaupt eine TIRF-Effekt erreicht wird. Ob die Eindringtiefe dann 90nm oder 200nm beträgt ist bei vielen Anwendungen sekundär. Je nach Wichtigkeit bzgl. einer spezifischen Eindringtiefe kön- nen somit auch Bereiche mit einem kleineren oder größeren Radius angefahren werden und dennoch ein TIRF-Effekt erhalten bleiben. Somit stehen viele weitere Stellen im Objektiv zur Verfügung, die alternative Strahlengänge bieten.
Aus den obigen Erläuterungen lässt sich erkennen, dass durch die beschriebene Methodik gera- de in der beispielhaften Anwendung eine drastische Erhöhung der Lebenszeit eines Objektivs erreicht werden kann, ohne dass die Funktionalität des Mikroskops merklich eingeschränkt werden.
In den oben beschriebenen Anwendungen, gerade in der Weitfeld-Mikroskopie mit Epifluores- zenz- oder TIRF-Beleuchtung, ist in der Regel bereits eine Optik, Akustooptik oder Optome- chanik vorgesehen, die es erlaubt, den Beleuchtungsstrahl im Hinblick auf die nötigen Austrittwinkel für einen TIRF-Effekt bzw. für eine Epifluoreszenzbeleuchtung zu manipulieren. Diese Optomechanik kann dann auch verwendet werden, um kleine Strahlversatzweiten zu erreichen, welche die oben beschriebene Wirkung erzielen. Der Strahlversatz kann nach verschiedenen Mustern erfolgen, beispielsweise kann der Strahl nach einem vorher festgelegten Muster in geeigneten zeitlichen Abständen automatisch immer wieder andere Punkte auf dem Objektiv anfahren. Es kann auch z.B. eine zufallsgeneratorgesteuerte Anfahrt erfolgen, die z.B. bei jeder Messung oder nach einem anderen geeigneten Zeitpunkt einen zufälligen anderen Punkt im Objektiv beleuchtet. Somit wird über einen großen Zeitraum eine gleichmäßige Strahlenbelas- tung des Objektivs erreicht. Die angefahrenen Punkte sollten in einem Bereich liegen, der bzgl. der unerwünschten optischen Abweichung zum Idealfall noch tolerabel ist.
Den geeigneten Zeitpunkt für die Anfahrt eines neuen Punktes kann man auf verschiedene Wei- se feststellen. Einerseits kann nach relativ kurzen Zeiträumen die Position gewechselt werden, aber im Laufe der Lebenszeit des Objektivs jede Position mehrfach angefahren werden. So wird das Objektiv über einen längeren Zeitraum gesehen gleichmäßig bestrahlt, was wünschenswert ist. Andererseits kann auch jede Position bis kurz vor dem Erreichen der zerstörenden Strahlendosis beleuchtet werden und dann eine andere Position angefahren werden. Der Zeitpunkt des Erreichens der zerstörenden Strahlendosis kann verschiedentlich ermittelt werden, beispielsweise können Testmessungen die übliche Dosis ermitteln. Es sollte dann jeder Punkt entsprechend weit unterhalb der Zerstörschwelle beleuchtet werden, damit das Objektiv nicht früher als nötig Schaden nimmt.
Als eine andere Alternative kann das Erreichen der Zerstörschwelle auch durch Messungen während der Bestrahlung ermittelt werden. Wie schon erwähnt, lässt sich die Veränderung der Optik unter Strahleneinfluss mit hinreichend genauen Messgeräten bestimmen, z.B. in dem die Transmission der Optik punktuell geringfügig abnimmt. Diese Transmission kann während der Messungen überwacht werden und ab einer bestimmten Grenztransmission, die kurz vor der Zerstörschwelle liegt, kann dann der Beleuchtungspunkt gewechselt werden.
Die Erfindung wird nachfolgend näher anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung erläutert. In der Zeichnung zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops ohne seitlichen Versatz des Beleuchtungslicht-Strahlengangs relativ zur optischen Achse des Objektivs.
Figur 2 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit seitlichem Versatz des Beleuchtungslicht-Strahlengangs relativ zu optischen Achse des Objektivs. Figur 3 eine in Figur 4 mit Y-Z bezeichnete Schnittdarstellung des Objektivs mit unterschiedlichen Beleuchtungslicht-Strahlengängen A, B, C.
Figur 4 eine in Figur 3 mit X bezeichnete Draufsicht auf das Objektiv mit unterschiedlichen Beleuchtungslicht-Strahlengängen A, B, C.
Figur 5 eine Seitenansicht eines Objekts und Objektträgers mit zwei unterschiedlichen
Beleuchtungslicht-Strahlengängen A und B. Figur 6 eine Seitenansicht eines Objekts und Objektträgers mit zwei unterschiedlichen
Beleuchtungslicht-Strahlengängen A und C, wobei der Beleuchtungslicht- Strahlengang C den Sonderfall einer TIRF-Beleuchtung demonstriert.
Figur 1 zeigt schematisch ein Mikroskop, in welches als einen Bestandteil das erfindungsgemä- ße Weitfeld-Mikroskop-Beleuchtungssystem eingebaut ist. Zum Zweck der deutlicheren Darstellung weicht die schematische Darstellung relativ weit von den tatsächlichen Maßstäben ab. Der gezeigte grundsätzliche Aufbau des Mikroskops ist der eines invertierten Mikroskops in welchem sich die Probe oben befindet, und der Beleuchtungsstrahl von unten nach oben gesendet wird, um oben auf die Probe zu treffen und diese auszuleuchten. Es versteht sich, dass auch ein herkömmlicher Aufbau mit unten befindlicher Probe und oben befindlichem Detektor verwendet werden kann. Eine Lichtquelle 1, beispielsweise ein Laser, sendet ein erstes Strahlenbündel 2 in eine Beleuchtungslichtstrahlengang -Manipulationseinrichtung 21, zum Beispiel bestehend aus einem kippbaren Spiegel 3 und einer Linse 4. Das aus der Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung 21 austretende Strahlenbündel 5 wird an einem dichroiti- sehen Spiegel 6 in Form eines konvergierenden Strahlenbündels 7 zu dem Objektiv 8 reflektiert, welches hier der Einfachheit halber als eine einfache Linse dargestellt ist. Das Objektiv 8 kolli- miert das Strahlenbündel und sendet dieses als ein kollimiertes Strahlenbündel 9 in die Objektebene 10. Von hier aus wird das zu detektierende Detektionslicht 11 von dem hier nicht dargestellten Objekt ausgesendet. Hier ist nur beispielhaft das von einem Punkt des Objektes ausge- hende Detektionslicht 11 dargestellt. Natürlich kann das Objekt auch an allen anderen beleuchteten Punkten Licht emittieren. Das zu detektierende Licht passiert das Objektiv 8 und den in Richtung des Detektionsstrahlengangs durchlässigen dichroitischen Spiegel 6 und wird von einer Tubuslinse 12 auf einen Detektor 13 gelenkt, welcher eine Ortszuweisung für die empfangenen Lichtintensitäten zulässt. Beispiele für derartige ortszuweisende Detektoren sind CCD Kameras oder CMOS Kameras. Wie aus der Darstellung gemäß Figur 1 erkennen ist, fokussiert das Objektiv 8 im Zusammenspiel mit der Tubuslinse 12 das Detektionslicht auf den Detektor 13.
Strichpunktiert sind eine optische Objektivachse 14 und eine zusätzliche Symmetrieachse 15 der Beleuchtungslicht-Manipulationseinrichtung 21 dargestellt. Gemäß der Darstellung in Figur 1 wurde von der Beleuchtungslichtstrahlengang -Manipulationseinrichtung 21 kein seitlicher Versatz für den Beleuchtungslicht-Strahlengang eingestellt, das heißt der Beleuchtungslicht- Strahlengang wird entlang der optischen Objektivachse 14 in das Objektiv 8 gesendet, oder in anderen Worten, die Symmetrieachse des Beleuchtungslicht-Strahlengangs fällt mit der opti- sehen Objektivachse 14 zusammen. Dies ist der Sonderfall der Epifluoreszenzbeleuchtung, bei welcher das Beleuchtungslicht üblicherweise zentral durch das Objektiv 8 gesendet wird.
Figur 2 zeigt eine ähnliche Darstellung wie Figur 1, immer noch mit zur Verdeutlichung von der Wirklichkeit stark abweichenden Maßstäben. Hier wird der seitliche Versatz des Beleuchtungs- licht-Strahlenbündels 7 verdeutlicht, dessen Symmetrieachse seitlich versetzt zur optischen Objektivachse 14 verläuft. Zu diesem Zweck erhielt die Beleuchtungslichtstrahlengang- Manipulationseinrichtung 21 einen Steuerbefehl, worauf hin die Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung 21 den darin enthaltenen Spiegel 3 kippt, so dass der von der Lichtquelle 1 stammende Strahlenbündel 2 in seiner Richtung so geändert wird, dass er nach der Linse 4 der Beleuchtungslichtstrahlengang -Manipulationseinrichtung 21 seitlich versetzt und konvergent ist, was durch das aus der Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung austretende Strahlenbündel 5 gezeigt ist. Ein Verkippen des Spiegels 3 kann in zwei verschieden Kipprichtungen erfolgen, d.h. innerhalb der Zeichenebene, und aus der Zeichenebene heraus bzw. hinein. Durch 2 Kipprichtungen lassen sich beliebige Punkte auf der Objektivfläche anfah- ren. Als eine preisgünstige Lösung lässt sich auch nur eine Kipprichtung verwirklichen, wodurch der Beleuchtungsstrahl nur längs einer Linie seitlich zur optischen Objektivachse versetzt werden kann.
Dieser seitliche Versatz des konvergenten Strahlenbündels 5 setzt sich nach der Reflexion am Spiegel 6 fort und führt nach Durchlaufen des Objektivs 8 dazu, dass das aus dem Objektiv 8 austretende Beleuchtungslicht-Strahlenbündel 9 kollimiert ist und einen Winkel α zur optischen Objektivachse 14 aufweist. Dieser Winkel α ist jedoch für die wirksame Ausleuchtung des Objekts 16 vernachlässigbar klein. Von dem Objekt 16 wird das Detektionslicht 11 ausgesendet. Zum Zweck der klareren Darstellung ist hier wie in Figur 1 beispielhaft nur das von einem Punkt des Objekts 16 ausgesendete Licht dargestellt. Es versteht sich, dass in Wirklichkeit meh- rere Punkte des Objekts 16 Licht ausstrahlen. Dieses kann eine Mischung aus dem gewünschten Fluoreszenzlicht sowie von der Probe reflektiertem und gestreutem Licht sein. Es wird von dem Objektiv 8 im Zusammenspiel mit der Tubuslinse 12 auf den Detektor 13 fokussiert. Weil für die meisten Anwendungen, zumindest für die Anwendung in der Lokalisierungsmikroskopie, hauptsächlich das in alle Richtungen ausgestrahlte Fluoreszenzlicht detektiert werden soll und von dem Objekt reflektiertes und gestreutes Licht für die meisten Anwendungen sogar durch einen Farbfilter geblockt wird, ist der Winkel, in welchem das Beleuchtungslicht auf dem Objekt 16 auftrifft, besonders zu vernachlässigen, weil der Einfluss dieses Winkels auf die Refle- xionsrichtung die Auswertung nicht beeinflusst, wenn das reflektierte Licht ohnehin geblockt wird und nur das in ohnehin in alle Richtungen emittierte Fluoreszenzlicht detektiert wird.
In der Wirklichkeit weist das in das Objektiv 8 eindringende Beleuchtungslicht-Strahlenbündel 7 einen noch kleineren Querschnitt im Verhältnis zur Objektivfläche auf, als in Figur 2 dargestellt ist, das heißt es wird nur ein kleiner Prozentsatz der Apertur bzw. der Objektivfläche aus- genutzt.
In Figur 3 ist ein Beispiel für ein Objektiv 8 dargestellt, welches in Figuren 1 und 2 der Einfachheit halber lediglich als einfache Linse dargestellt war. Figur 3 stellt eine Schnittdarstellung gemäß dem in Figur 4 mit Y-Z bezeichneten Schnitt in schematischer Darstellung dar. Anstatt aus einer einfachen Linse bestehen in Wirklichkeit Objektive typischerweise aus einer mehrere
Linsen aufweisenden Linsenanordnungen, welche häufig zumindest teilweise mit optischem Kitt miteinander verbunden sind. Typische Kittflächen sind in Figur 3 mit dem Bezugszeichen 22 bezeichnet. Wie eingangs erwähnt sind diese Kittflächen 22 besonders empfindlich hinsichtlich zu hoher Strahlenbelastung über einen zu langen Zeitraum.
In der Darstellung gemäß Figur 3 sind drei verschiedene Strahlengänge dargestellt. Ein erster Strahlengang A ist mit der optischen Objektivachse identisch, ein zweiter Strahlengang B ist zur optischen Objektivachse etwas versetzt anordnet, und ein dritter Strahlengang C ist weit relativ zu der optischen Objektivachse 14 versetzt. Die Apertur ist mit D bezeichnet. Figur 4 stellt eine Draufsicht auf das Objektiv 8 dar. Diese Draufsicht ist in Figur 3 mit X bezeichnet.
Es versteht sich, dass längs der Strahlengänge A, B, C, welche in Fig. 3 nur durch ihren jeweiligen Beleuchtungsachsen dargestellt sind, in Wirklichkeit Strahlenbündel mit einem bestimmten Querschnitt in das Objektiv 8 gesendet und von diesem kollimiert werden, wie bereits anhand von Figur 1 und 2 dargestellt und erläutert wurde. Dies ist deshalb erforderlich, weil es sich um eine Weitfeld-Beleuchtung handelt, gemäß welcher das betrachtete Feld in der Objektebene 10 ausgeleuchtet wird.
Wie man aus Figur 3 deutlich erkennen kann, trifft das Beleuchtungslicht in einem umso größe- ren Winkel α in der Objektebenen 10 ein, je weiter der Beleuchtungslicht-Strahlengang A, B, C seitlich zur optischen Objektivachse versetzt ist. Gemäß dem Beleuchtungslicht-Strahlengang B trifft das Beleuchtungslicht nur in einem sehr gering von der optischen Achse abweichenden Austrittswinkel aus dem Objektiv 8 in der Objektebene 10 ein. Die ausgeleuchtete Probe strahlt in alle Richtungen Licht aus, einerseits Fluoreszenzlicht, andererseits reflektiertes und gestreu- tes Licht. Für Lokalisierungsmikroskope ist besonders das Fluoreszenzlicht von Interesse, welches beispielsweise mit einem Farbfilter aus dem gesamten Detektionslicht herausgefiltert werden kann, bevor der Detektionsstrahl auf den ortszuweisenden Detektor 13 (Siehe Figur 2) gesendet wird. Wie aus Figur 4 deutlich wird, eröffnet aber auch ein kleiner paralleler Versatz des Beleuchtungslicht-Strahlengangs B eine Mehrzahl von Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen, nämlich in Form eines Kreisrings 23, welcher sich konzentrisch um die optische Objektivachse 14 erstreckt. Es versteht sich, dass wenn ein Versatz gemäß Strahlengang B noch zulässig ist, auch kleinere Versätze zulässig sind, weil diese zu kleineren Abweichwinkeln α führen. Somit ergibt sich eine zulässige Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche 24 auf dem Objektiv 8, welche vorbestimmbar ist und je nach Anwendung auch durch ein Steuersignal geändert werden kann.
Eine weitere, besondere Anwendung der Erfindung ist in den Figuren 5 und 6 schematisch dargestellt. Auch in diesem Ausführungsbeispiel verläuft der Beleuchtungs-Strahlengang von unten nach oben, wie es beispielsweise in einem invertierten Mikroskop der Fall ist. Das Objekt 16 kann beispielsweise eine Zelle sein, welche auf einem Deckglas 17 anordnet ist. Mehrere Strahlen gemäß der Strahlengänge A und B, wie diese beispielsweise in den Figuren 3 und 4 erläutert wurden, sind auch in dieser Zeichnung dargestellt, wobei der Strahlengang B auf einem leichten Versatz relativ zu optischen Objektivachse beruht. Dass es sich um Weitfeld-Beleuchtung han- delt, wurde in dieser Darstellung gemäß Figur 5 dadurch Rechnung getragen, dass mehrere Strahlen gemäß der Strahlengänge A und B dargestellt sind, nicht nur die Beleuchtungsachsen der Strahlengänge A, B und C wie diese in Figur 3 dargestellt sind. Wie zu erkennen ist, ist für die Ausleuchtung des Objekts 16 ein leicht von der Epifluoreszenzbeleuchtung abweichender Winkel in der Praxis vernachlässigbar. Gemäß Figur 6 ist der Strahlengang C, ebenfalls mit mehreren Strahlen entsprechend der Weitfeld-Beleuchtung, mit einem großen von der optischen Achse abweichenden Winkel dargestellt, wie er sich bei einem großen Versatz der Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle zur optischen Achse des Objektivs einstellt, wie dies in den Figuren 3 und 4 dargestellt wurde. Dieser Sonderfall eines großen Winkels α kann für die sogenannte TIRF-Beleuchtung verwendet werden. Für diese Art der Beleuchtung nutzt man den Effekt der Totalreflexion an der Grenzfläche der Medien aus, was in diesem Fall voraussetzt, dass der Brechungsindex des Objekts 16, hier einer Zelle, kleiner ist als der Brechungsindex des Objektträgers, hier der Brechungsindex von dem Deckglas 17. Bei einem großen Winkel α tritt dann Totalreflexion an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas 17 und dem Objekt 16 auf. Eine Ausleuchtung des Objekts 16 tritt aber auch in diesem Fall dennoch auf, allerdings nur im evaneszenten Feld. Hieraus ergibt sich eine weitere Anwendung der Erfindung, nämlich die Möglichkeit einer Umschaltung zwischen normaler Ausleuchtung der Probe und einer TIRF -Beleuchtung. Für diese Umschaltung muss lediglich ein Steuerbefehl an die Steuerung 20 (Siehe Fig. 2) gegeben werden, mit welchem die vorbe- stimmte Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche geändert wird. Der theoretisch maximal mögliche Versatz zwischen der optischen Objektivachse und der Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle wird durch die Apertur D bestimmt. Da der Winkel α umso größer wird je größer der Versatz ist, ist der Winkel α kleiner, je kleiner der Versatz ist. Für die TIRF -Beleuchtung darf jedoch der Winkel α nicht unter den jeweiligen Winkel fallen, bei welchem Totalreflexion auftritt. Die vorbe- stimmte Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche, welche die für TIRF-Beleuchtung zulässigen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen definiert, gestaltet sich daher als eine kreisringförmige Fläche. Hingegen kann die für die normale Ausleuchtung zulässige, vorbestimmte Beleuchtungslicht- Eintrittsfläche 24 eine Kreisfläche sein (siehe Fig. 4), welche von der kreisringförmigen, vorbestimmten TIRF-Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche umschlossenen wird.
Innerhalb der für die jeweiligen Anwendungen zulässige, vorbestimmte Beleuchtungslicht- Eintrittflächen werden die Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen automatisch verändert, was in fest vorgegebenen Zeitintervallen und nach einem fest vorgegebenen Muster erfolgen kann, aber auch in Abhängigkeit von Messsignalen erfolgen kann, beispielsweise wie in Figur 2 dargestellt ist, durch Messung der Transmission des Objektivs 8 mit einer Messeinrichtung 18, welche über eine Signalleitung 19 ein Signal an einer Steuerung 20 geben kann, und die Beleuchtungslicht- Eintrittsstelle dann geändert wird, wenn die Transmission unter einen bestimmten Grenzwert fallt. Andere Kriterien für eine Änderung der Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle in Abhängigkeit von der Zeit kann die Strahlenbelastung sein, welche sich aus dem Produkt von Strahlenintensi- tät und Zeit für die jeweilige Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle ergibt. Auch kann die Verände- rung der zeitlichen Eintrittsstellen durch einen Zufallsgenerator erfolgen, welcher Bestandteil der Steuerung 20 ist.
Bezugszeichenliste
1 Lichtquelle
2 Strahlenbündel
3 Spiegel
4 Linse
5 Strahlenbündel (aus der Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung austretend)
6 dichroitischer Spiegel
7 Strahlenbündel (konvergierend, von dem dichroitischen Spiegel reflektiert)
8 Objektiv
9 Strahlenbündel (aus dem Objektiv als kollimiertes Beleuchtungslicht austretend)
10 Objektebene
11 Detektionslicht
12 Tubuslinse
13 Detektor
14 optische Objektivachse
15 zusätzliche Symmetrieachse
16 Objekt
17 Deckglas
18 Messeinrichtung
19 Signalleitung
20 Steuerung
21 Beleuchtungslichtstrahlengang -Manipulationseinrichtung
22 Kittflächen
23 Kreisring
24 zulässige Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche

Claims

Patentansprüche
1. Weitfeld-Mikroskop-Beleuchtungssystem mit:
einem Mikroskopobjektiv (8), welches eine optische Objektivachse (14) aufweist;
einer Beleuchtungslichtquelle (1), welche Weitfeld-Beleuchtungslicht längs von Beleuchtungsstrahlengängen (A,B,C) mit entsprechenden Beleuchtungsachsen sendet, längs welcher das Beleuchtungslicht durch innerhalb einer vorbestimmten Beleuchtungslicht- Eintrittsfläche (24) liegende Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen in das Mikroskopobjektiv (8) eindringt;
einem räumlich auflösenden Lichtdetektor (13), welcher von einer beleuchteten Probe durch das Mikroskopobjektiv (8) entlang eines Detektionslichtstrahlengangs gesendetes Detek- tionslicht (11) detektiert; und
einer von einer Steuerung (20) gesteuerten, automatischen Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung (21), welche in Richtung des Beleuchtungslicht-Strahlengangs vor dem Mikroskopobjektiv (8) angeordnet ist und mittels welcher Beleuchtungslichtstrahlengang-Manipulationseinrichtung (21) die Beleuchtungsachsen automatisch in zeitlichen Abständen zu einer Mehrzahl von Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen bewegbar ist.
2. Weitfeld-Mikroskop-Beleuchtungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsachsen stets parallel zur Objektivachse (14) verlaufen.
3. Mikroskop-Beleuchtungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Weitfeld-Mikroskop-Beleuchtungssystem Bestandteil eines Lokalisierungsmikroskops ist.
4. Mikroskop-Beleuchtungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop-Beleuchtungssystem Bestandteil eines TIRF-Beleuchtungssystems ist.
5. Mikroskop-Beleuchtungssystem nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungslichtstrahlengang -Manipulationseinrichtung (21) eine Optomechanik, Akustooptische Modulatoren (AOM) oder Elektrooptische Modulatoren (EOM) aufweist, wel- che einen verstellbaren Strahlenversatz und somit eine im Verhältnis zu optischen Objektivachse (14) verstellbare Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle einstellen.
6. Mikroskop-Beleuchtungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung (20) derart konfiguriert ist, dass diese nach einem vorgegebenen Muster automatisch einen zugelassenen verstellbaren Strahlenversatz im Bereich der vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche (24) für das Beleuchtungslicht in das Objektiv (8) steuert, wobei alle von der Steuerung (20) zugelassenen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen innerhalb dieser vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche (24) liegen.
7. Mikroskop-Beleuchtungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung (20) einen Zufallsgenerator aufweist, welcher einen zugelassenen verstellbaren Strahlenversatz im Bereich der vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche (24) für das Beleuchtungslicht in das Objektiv (8) steuert, wobei alle von der Steuerung (20) zugelassenen Be- leuchtungslicht-Eintrittsstellen innerhalb dieser vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche (24) liegen.
8. Mikroskop-Beleuchtungssystem nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Steuerungs-Schnittstelle, mittels welcher ein die vorbestimmte Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche (24) verstellender Steuerbefehl eingebbar ist.
9. Mikroskop-Beleuchtungssystem nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die vorbestimmte Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche (24) eine kreisförmige, kreisseg- mentförmige, ringförmige oder ringsegmentförmige Fläche ist.
10. Mikroskop-Beleuchtungssystem nach einem der Ansprüche 1-9, gekennzeichnet durch eine Messeinrichtung (18), welche Transmission des Objektivs (8) überwacht und ein Steuersignal an die Steuerung (20) sendet, wenn die Transmission unter einen vorbestimmten Grenzwert fällt.
11. Weitfeld-Beleuchtungsverfahren zum Beleuchtung von mit einem Mikroskop betrachteten Proben, wobei das Mikroskop versehen ist mit:
einem Mikroskopobjektiv, welches eine optische Objektivachse aufweist; und einer Beleuchtungslichtquelle, welche Weitfeld-Beleuchtungslicht längs von Beleuch- tungsstrahlengängen mit entsprechenden Beleuchtungsachsen sendet, längs welcher das Be- leuchtungslicht durch innerhalb einer vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche liegende Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen in das Mikroskopobjektiv eindringt; wobei
das Beleuchtungsverfahren versehen ist mit derartigem wiederholtem, automatischem, parallelem Verstellen der Beleuchtungsachse relativ zur optischen Objektivachse in zeitlichen Abständen, dass ein seitlicher Versatz der Beleuchtungsachse relativ zur Objektivachse automatisch verstellt wird, so dass die Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle in derartigen zeitlichen Abständen innerhalb der vorbestimmten Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche verstellt wird, dass das Objektiv vor Schädigung durch Beleuchtungslicht geschützt wird.
12. Beleuchtungsverfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch ein paralleles Ausrichten der Beleuchtungsachsen relativ zu der Objektivachse und Beibehalten dieser Parallelität beim automatischen Verstellen des seitlichen Versatzes der Beleuchtungsachse relativ zur Ob- jektivachse.
13. Beleuchtungsverfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch ein Auswählen der vorgegebenen Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche aus wenigstens zwei unterschiedlichen Beleuch- tungslicht-Eintrittsflächen, welche unterschiedlichen Beleuchtungsmodi zugeordnet sind.
14. Beleuchtungsverfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die unter- schiedlichen Beleuchtungsmodi Epifluoreszenzbeleuchtung und TIRF-Beleuchtung sind.
15. Beleuchtungsverfahren nach einem der Ansprüche 10 -13, gekennzeichnet durch ein zufalliges Auswählen der jeweiligen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen des Beleuchtungslichts innerhalb der vorgegebenen Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche und Beibehalten dieser jeweiligen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen über die jeweiligen zeitlichen Abstände bis die jeweilige nächste Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle innerhalb der vorgegebenen Beleuchtungslicht- Eintrittsstellen zufallig ausgewählt wird.
16. Beleuchtungsverfahren nach einem der Ansprüche 10 -13, gekennzeichnet durch ein Auswählen der jeweiligen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen des Beleuchtungslichts innerhalb der vorgegebenen Beleuchtungslicht-Eintrittsfläche nach einem vorgegebenen Muster und Beibehalten dieser jeweiligen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen über die jeweiligen zeitlichen Abstände bis die jeweilige nächste Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle innerhalb der vorgegebenen Beleuchtungslicht-Eintrittsstellen nach dem vorgegebenen Muster ausgewählt wird.
17. Beleuchtungsverfahren nach einem der Ansprüche 10 -13, gekennzeichnet durch ein Messen optischer Transmission des Objektivs für die jeweiligen Beleuchtungslicht- Eintrittsstellen und Einstellen der zeitlichen Abstände entsprechend einer Veränderung der optischen Transmission für die jeweilige Beleuchtungslicht-Eintrittsstelle über der Zeit.
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