EP2670837A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von 2,3-butandiol - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von 2,3-butandiol

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Publication number
EP2670837A1
EP2670837A1 EP12701152.6A EP12701152A EP2670837A1 EP 2670837 A1 EP2670837 A1 EP 2670837A1 EP 12701152 A EP12701152 A EP 12701152A EP 2670837 A1 EP2670837 A1 EP 2670837A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
production
butanediol
acetoin reductase
klebsiella
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP12701152.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wacker Chemie AG filed Critical Wacker Chemie AG
Publication of EP2670837A1 publication Critical patent/EP2670837A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01004—R,R-butanediol dehydrogenase (1.1.1.4)

Definitions

  • the invention relates to a process for the fermentative preparation of 2,3-butanediol (2,3-BDL) by means of an improved microorganism strain which has a 3.6 to 34.8 fold increased acetoin reductase (equivalent to 2, 3-butanediol dehydrogenase) activity relative to the non-improved parent strain.
  • acetoin reductase equivalent to 2, 3-butanediol dehydrogenase
  • Examples of basic chemical substances (so-called chemical synthesis building blocks) from renewable raw materials are ethanol (C2 building block), glycerol, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol (C3 building blocks) or succinic acid, 1-butanol, 2-butanol, 1,4-butanediol or 2, 3-butanediol (C blocks).
  • These chemical building blocks are the biogenic starting compounds from which further basic chemicals can be produced chemically. The prerequisite for this is the cost-effective fermentative production of the respective synthesis building blocks from renewable raw materials.
  • Decisive cost factors include the availability of suitable cheaper renewable raw materials as well as efficient microbial fermentation processes, which efficiently convert these raw materials into the desired chemical raw material. It is crucial that the microorganisms used produce the desired product in high concentration and with low by-product formation from the biogenic raw material. Optimization of the productivity and economic viability of the microorganisms known as production strains is achieved, for example, by metabolic engineering,
  • a C4 building block accessible by fermentation is 2,3-butanediol.
  • the state of the art for the fermentative 2,3- Butanediol production is summarized in Celinska and
  • 3-Butanediol is a possible starting material for petrochemical products with four carbon atoms (C blocks) such as acetoin, diacetyl, 1,3-butadiene, 2-butanone (methyl ethyl ketone, EK).
  • C blocks carbon atoms
  • products with two carbon atoms (C2 units) such as acetic acid (DE 102010001399) and derived therefrom, acetaldehyde, ethanol and also ethylene are accessible.
  • C2 units such as acetic acid (DE 102010001399) and derived therefrom, acetaldehyde, ethanol and also ethylene are accessible.
  • C8 compounds are also conceivable, the use of e.g. as a fuel in the aviation sector.
  • acetoin reductase (2, 3-butanediol dehydrogenase): NADH-dependent reduction of acetoin to 2,3-butanediol.
  • 2,3-butanediol Various natural producers of 2,3-butanediol are known, e.g. B. from the genera Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Lactococcus etc. But also yeasts are known as producers ⁇ eg bakers yeast ⁇ .
  • Production strains from the biological safety level S1 are strains of the species Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, strains of the genus Bacillus (or Paenibacillus) such as Bacillus polymyxa or Bacillus licheniformis.
  • Bacillus or Paenibacillus
  • the species Klebsiella terrigena and Klebsiella planticola synonymously as Raoultella terrigena and Raoultella are also called planticola due to a taxonomic designation , These are strains of the same species.
  • WO 2009/151342 discloses the production of 2,3-BDL by anaerobic fermentation with the bacterium Clostridium autoethanogenum and ohlenmonoxide as C source. Maximum achieved 2,3-BDL yields were 9.27 g / l after a fermentation period of 14 days. In the genetically unmodified strains, the level of expression of JolS was 2.3 réelle
  • Butanediol dehydrogenase in 2,3-BDL-producing batches (caused by excess carbon monoxide fumigation) compared to an acetate-producing batch (limited carbon monoxide fumigation) and an induction of the RNA of the wild-type gene of 2,3-butanediol dehydrogenase by a factor of 7.64 ( corresponding to a 2,3-BDL production of 8.67 g / l after 13 days).
  • the induction of gene expression was achieved by increased fumigation with carbon monoxide. It was not disclosed whether gene expression also involved an increase in acetoin reductase enzyme activity and how high the supposed increase in enzyme activity was compared to baseline.
  • autoethanogenum does not provide general guidance for production under aerobic or microaerobic conditions to increase 2,3-butanediol production due to the combination of fumigation with Carbon monoxide and an increased 2, 3-butanediol dehydrogenase activity derived.
  • 2,3-BDL yields of 8.67 g / l in 13 days are far from adequate for economical production, especially considering an increased engineering effort of large scale anaerobic fermentation.
  • WO 99/54453 discloses lactic acid bacteria with 10-fold increased activity of either diacetyl reductase, acetoin reductase, or 2,3-butanediol dehydrogenase, respectively. Surprisingly, only an influence on the diacetyl content of the lactic acid bacteria used as starter cultures in the food industry was observed. However, it was not disclosed whether an increased activity of acetoin reductase, or 2,3-butanediol dehydrogenase on the 2,3-BDL content of the lactic acid bacterial cultures had an effect.
  • Butanediol included. It is therefore not obvious to the person skilled in the art that an increase in acetoin reductase activity necessarily results in an increased 2,3-BDL yield.
  • the object of the invention was to provide production strains for the production of 2, 3-butanedoxol, which allow significantly higher 2,3-Butandiolausbeuten than the parent strain.
  • the problem was solved by a production strain which can be produced from a parent strain, characterized in that the parent strain is selected from the genus Klebsiella, Raoultella, Paenibacillus and Bacillus and the production strain at least 3.6 to 34.8 times above the parent strain has underlying acetoin reductase activity.
  • the parent strain may be a wild-type strain that is not further optimized but capable of generating 2,3-butanediol or an already optimized wild-type strain.
  • an already further optimized wild-type strain ⁇ e.g. by genetic engineering
  • the acetoin reductase activity is not affected by the optimization.
  • a production strain is to be understood as meaning an initial strain which has been optimized with respect to the production of 2,3-butanediol and which has an increased activity of the enzyme acetoin reductase in comparison to the starting strain
  • the production strain is made from the parent strain. If an already optimized starting strain is to be further improved by an increase in the acetoin reductase activity, it is of course also possible first to increase the acetoin reductase activity in an unimpaired strain and then to introduce further improvements.
  • the increase in the acetoin reductase activity in the production strain can be caused by any mutation in the genome of the parent strain (eg a promoter activity-increasing mutation), an enzyme activity-increasing mutation in the acetoin reductase gene or by overexpression of a mologen or else heterologous Acetoinreduktasegens in the parent strain.
  • the acetoin reductase activity is preferably increased by at least the factor 3.6 to 20 and more preferably by the factor 3.6 to 10.
  • This increased acetoin reductase activity is particularly preferably achieved by an increased expression of a homologous or heterologous gene coding for an acetoin reductase enzyme compared with the starting strain.
  • the parent strain may be any 2,3-butanediol-producing strain of security level S1.
  • It is preferably a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa or Bacillus licheniformis with a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena or Klebsiella (Raoultella) planticola being even more preferred
  • it is a parent strain and a production strain classified in the security level Sl and of these, more preferably, strains of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena or Klebsiella (Raoultella) planticola.
  • the yield of 2,3-butanediol can be significantly increased.
  • the increased acetoin reductase activity is achieved by recombinant overexpression of an acetoin reductase in a production strain.
  • an over-expression of the acetoin reductase by a factor of 3.6 up to a factor of 34.8 is suitable for the 2,3-butanediol yield (determined as volume yield 2,3 Butanediol in g / l) in the fermentation by more than 20%, preferably more than 30%, more preferably more than 40% and especially preferably more than 100%.
  • the recombinant overexpression of acetoin reductase also allows an increase of the 2, 3 -Butandiolausbeute in shake flasks by 20 - 29%.
  • the acetoin reductase (AR) may be any gene-encoded enzyme that, according to formula (III), causes the synthesis of 2,3-butanediol from acetoin by oxidation of the cofactor NADH (or NADPH) to NAD (or NADP) ,
  • the gene of the acetoin reductase is derived from a bacterium of the genus Klebsiella (Raoultella) or Bacillus (Paenibacillus).
  • the gene of the acetoin reductase is derived from a strain of the species Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Bacillus polymyxa or Bacillus
  • strains including the strain Klebsiella terrigena DSM 2687 used in the present invention, are all commercially available, e.g. at the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (Braunschweig).
  • the strain according to the invention thus makes it possible to increase the fermentative production of 2,3-butanediol.
  • the invention thus, not only the production of 2,3-butanediol but also the production of other metabolites, which can be derived from the 2,3-butanediol.
  • These metabolites include diacetyl, acetoin, ethanol and acetic acid.
  • a production strain according to the invention is also characterized in a preferred embodiment by being prepared from a parent strain as defined in the application and producing an acetoin reductase in recombinant form with the result that its 2,3-BDL production (volume production expressed in g / 1 2,3-BDL) is increased by at least 20%, preferably 30%, more preferably 40% and especially preferably by 100% compared to the non-genetically optimized starting strain, wherein the 2,3-butanediol yield of the starting strain is at least 80 g / 1.
  • the production strain of the invention is preferably prepared by introducing a gene construct into one of said parent strains.
  • the gene construct in its simplest form is defined as consisting of the acetoin reductase structural gene operatively linked to a promoter upstream.
  • the gene construct may also comprise a terminator, which is connected downstream of the aceto-inuctuctase structural gene.
  • Preferred is a strong promoter, which leads to a strong transcription.
  • the strong promoters preferred is the so-called.
  • the expert from the molecular biology of E. coli familiar "tac promoter ⁇ .
  • the gene construct can be present in a manner known per se in the form of an autonomously replicating plasmid, it being possible for the copy number of the plasmid to vary.
  • a variety of plasmids are known to those skilled in the art, depending on their genetic
  • the gene construct can also be integrated in the genome of the production strain, with each gene location along the genome being suitable as integration site.
  • the gene construct either in plasmid form or with the aim of genomic integration, is introduced into the production strain in a manner known per se by genetic transformation.
  • Various methods of genetic transformation are known to those skilled in the art (Aune and Aachmann, Ap, Microbiol, Biotechol., (2010) 85: 1301-1313), including, for example, US Pat
  • the gene construct contains, likewise in a known manner, a so-called selection marker for the selection of transformants with the desired gene construct.
  • selection markers are selected from so-called antibiotic resistance markers or from the auxotrophy complementary selection markers.
  • antibiotic resistance markers more preferably those which confer resistance to antibiotics selected from ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol or zeocin.
  • the gene construct integrated either in plasmid or in the genome and produces a Aceto "inreduktase enzyme in recombinant form.
  • the recombinant acetone reductase enzyme is able to produce 2,3-butanediol from acetoin under oxidation of NADH (or alternatively also NADPH) to NAD (or alternatively to NADP) .It has now surprisingly been found that by suitable recombinant overexpression of the Acetoxnreduktase enzyme in the production strain, the 2,3-butanediol yield compared to the parent strain can be significantly increased.
  • the parent strain may be a non-optimized wild type strain.
  • the parent strain may already be have been previously optimized, or further optimized as erfindungsgetnässer ace- toinreductase producing production strain.
  • the optimization of an inventive production of acetoin reductase by means of the invention can on the one hand be carried out by mutagenesis and selection of mutants with improved production properties.
  • the optimization can also be carried out by genetic engineering by additional expression of one or more genes which are suitable for improving the production properties. Examples of such genes are the already mentioned 2, 3-butanediol biosynthesis genes acetolactate synthase and acetolactate decarboxylase.
  • genes can be expressed in a manner known per se as separate gene constructs in each case or also combined as an expression unit (as a so-called operon) in the production strain. It is known, for example, that in Klebsiella terrigena all three biosynthesis genes of 2,3-butanediol (so-called BUD-Operon, Blomqvist et al., J. Bacteriol. (1993) 175: 1392-1404), or in strains of the genus Bacillus genes of acetolactate synthase and acetolactate decarboxylase are organized in an operon (Renna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863-3875).
  • the production strain can be optimized by inactivating one or more genes whose gene products adversely affect 2,3-butanediol production.
  • genes whose gene products are responsible for by-product formation include, for example, lactate dehydrogenase (formation of lactic acid), acetaldehyde dehydrogenase (formation of ethanol) or else phosphotrane acetylase, or acetate kinase (acetate formation).
  • the invention comprises a process for the production of 2,3-butanediol with the aid of a production strain according to the invention.
  • the process is characterized in that cells of a production strain according to the invention, which produce acetoin reductase, are cultivated in a growth medium.
  • biomass of the production strain and on the other hand the Product 2,3-BDL formed.
  • the formation of biomass and 2,3-BDL can be time correlated or temporally decoupled from each other.
  • the cultivation takes place in a manner familiar to the person skilled in the art. This can be done in shake flasks (laboratory scale) or by fermentation (production scale).
  • Cultivation media are familiar to those skilled in the practice of microbial cultivation. They typically consist of a carbon source (C source), a nitrogen source (N source), and additives such as vitamins, salts, and trace elements, which optimize cell growth and 2,3-BDL product formation.
  • C sources are those that can be used by the production strain for 2,3-BDL product formation. These include all forms of monosaccharides, including CS sugars such as. Glucose, matmose or fructose, as well as C5 sugars, e.g. Xylose, arabinose, ribose or galactose.
  • the production process according to the invention also comprises all C sources in the form of disaccharides, in particular sucrose, lactose, maltose or cellobiose.
  • the production process according to the invention furthermore also comprises all C sources in the form of higher saccharides, glycosides or carbohydrates with more than two sugar units, such as, for example, As maltodextrin, starch, cellulose, hemicellulose, pectin or by hydrolysis ⁇ enzymatically or chemically) released monomers or oligomers.
  • the hydrolysis of the higher C sources may precede the production process according to the invention or take place in situ during the production process according to the invention.
  • Other useful C sources other than sugars or carbohydrates are acetic acid (or acetate salts derived therefrom), ethanol, glycerol, citric acid (and its salts), lactic acid (and salts thereof) or pyruvate ⁇ and its salts).
  • gaseous carbon sources such as carbon dioxide or carbon monoxide are also conceivable.
  • the C sources which are affected by the production process according to the invention comprise both the isolated pure substances or else, to increase the economic efficiency, not further purified mixtures of the individual C sources, such as can be obtained as hydrolyzates by chemical or enzymatic digestion of the vegetable raw materials.
  • These include, B.
  • Preferred C sources for the production of the production strains are glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose, arabinose and vegetable hydrolysates, which can be obtained from starch, lignocellulose, sugar cane or sugar beet.
  • a particularly preferred C source is glucose, either in isolated form or as part of a vegetable hydrolyzate.
  • N sources are those that can be used by the production strain for biomass formation. These include ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH or else its salts such. For example, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate or ammonium nitrate. Furthermore, suitable N-source are the known nitrate salts such. B. KN0 3 , NaN0 3 , ammonium nitrate, Ca (N0 3 ) 2, Mg (N0 3 ) 2 and other N sources such as eg urea.
  • the N sources also include complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or dried as so-called CSD) as well as NZ amines and Yeast Nitrogen Base.
  • complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or dried as so-called CSD) as well as NZ amines and Yeast Nitrogen Base.
  • the cultivation can take place in the so-called batch mode, wherein the growth medium is inoculated with a starter culture of the production strain and then the cell growth takes place without further feeding of nutrient sources.
  • Cultivation can also take place in the so-called fed-batch mode, with additional nutrient sources being fed in after an initial phase of growth in batch mode (feed) in order to compensate for their consumption.
  • the feed can consist of the C source, the N source, one or more important for the production of vitamins, or trace elements or a combination of the aforementioned.
  • the Feeäkomponenten can together as a mixture or separately in individual
  • Feed lines are added.
  • other media components as well as specific 2,3-BDL production enhancing additives may be added to the feed.
  • the feed can be fed continuously or in portions (batchwise) or else in a combination of continuous and discontinuous feed.
  • Preferred C sources in the feed are glucose, sucrose, molasses, or vegetable hydrolysates, which can be obtained from starch, lignocellulose, sugar cane or sugar beet.
  • Preferred N sources in the feed are ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH and its salts ammonium sulfate, ammonium phospha, ammonium acetate and ammonium chloride, furthermore urea, NO 3 , NaNO 3 and ammonium nitrate, yeast extract, proteose peptone, malt extract, soya peptone , Casamino acids, corn steep liquor (Corn Steep Liquor ⁇ as well as NZ-Amine and Yeast Nitrogen Base.
  • N sources in the feed are ammonia or ammonium salts, urea, yeast extract, soya peptone, malt extract or corn steep liquor (in liquid or in dried form).
  • the cultivation takes place under pH and temperature conditions which favor the growth and the 2,3-BDL production of the production strain.
  • the useful pH range is from pH 5 to pH 8, Preferred is a pH range of pH 5, 5 to pH 7.5. Particularly preferred is a pH range of pH 6.0 to pH 7,
  • the preferred temperature range for the growth of the product ion strain is 20 ° C to 40 ° C. Particularly preferred is the temperature range of 25 ° C to 35 ° C.
  • the growth of the production strain can optionally take place without oxygen supply (anaerobic cultivation) or else with oxygen supply (aerobic cultivation). Preference is given to aerobic cultivation with oxygen, the oxygen supply being ensured by introduction of compressed air or pure oxygen. Particularly preferred is the aerobic cultivation by entry of compressed air.
  • the cultivation time for 2,3-BDL production is between 10 h and 200 h. Preferred is a cultivation period of 20 h to 120 h. Particularly preferred is a cultivation time of 30 h to 100 h.
  • Cultivation batches obtained by the method described above contain the 2,3-BDL product, preferably in the culture supernatant.
  • the 2,3-BDL product contained in the cultivation mixtures can either be used directly further without further work-up or else be isolated from the cultivation mixture.
  • known process steps are available, including centrifugation, decantation, filtration, extraction, distillation or crystallization, or precipitation. These process steps can be combined in any desired form in order to isolate the 2,3-BDL product in the desired purity. The degree of purity to be achieved depends on the further use of the 2,3-BDL product.
  • the figures show the plasmids mentioned in the examples. 1 shows the 3.65 kb acetoin reductase expression vector pBudCkt prepared in Example 1.
  • FIG. 2 shows the 3.67 kb acetoin reductase expression vector pARbl prepared in Example 1.
  • Fig. 3 shows the plasmid pACYC184 used in Example 1.
  • FIG. 4 shows the 5.1 kb expression vector pBudCkt-tet prepared in Example 1.
  • Fig. 5 shows the prepared in Example 1 5, 1 kb large exposition vector pARBL-tet.
  • the acetoin reductase genes from K. terrigena and B.licheniformis were used.
  • the DNA sequence of the acetoin reductase gene from K. terrigena is disclosed in the "GenBank” gene database under accession number L04507, bp 2671-3440. It was isolated in a PCR reaction (Taq DNA polymerase, Qiagen) from genomic K. terrigena DNA ⁇ Strain DSM 2687, commercially available from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) with the primers BUD7f and BUD9r as a DNA fragment of 0.78 kb size isolated. The DNA sequence of the B.
  • licheniformis acetoin reductase gene is disclosed in the "GenBank” gene database under accession number NC_006322.1, under which the entire genome sequence of B. licheniformis is disclosed
  • the acetoin reductase gene is there in a complementary form from bp 2007068 - It was isolated in a PCR reaction (Taq DNA polymerase, Qiagen) from genomic B. licheniformis DNA (strain DSM 13, commercially available from DSMZ GmbH) with the primers BLar-lf and BLar-2r as DNA Fragment of 0.78 kb size isolated.
  • the genomic DNA used for the PCR reactions was previously in a conventional manner with a DNA isolation kit (Qiagen) from cells of the culture of. terrigena DSM 2687 and B. licheniformis DSM 13 in LB medium (10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl).
  • the PCR products were post-digested with Eco RI (contained in primer BUD7f and BLar-lf) and Hind III (contained in primer BUD9r) or Pst I (contained in primer BLar-2r) and expressed in the expression cloned onsvektor pKKj.
  • Eco RI obtained in primer BUD7f and BLar-lf
  • Hind III obtained in primer BUD9r
  • Pst I obtained in primer BLar-2r
  • the expression vector pKKj is a derivative of the expression vector pKK223 ⁇ 3.
  • the expression vectors pBudCkt and pARbl were modified by incorporation of an expression cassette for the tetracycline resistance gene.
  • the tetracycline resistance gene was first isolated from the plasmid pACYC184 (FIG. 3).
  • the DNA sequence of pACYC184 is available in the "Genbank” gene database under accession number X06403.1.)
  • PCR Transcription DNA polymerase, Qiagen
  • Bgl II cleavage sites contained in the primers tetlf and tet2r
  • the tetracycline expression cassette was isolated as a 1.45 kb fragment from pACYC184 and then cloned into the pBudCkt and pARbl vectors respectively cut with Bam HI, resulting in the expression vectors pBudCkt-tet (FIG.
  • a clone was selected in each of which the tetracycline and the acetoin reductase expression cassettes were oriented in the same direction, respectively.
  • Primer tetlf (SEQ ID NO: 5) and tet2r (SEQ ID NO: 6) had the following DNA sequence:
  • Plasmid DNA of the expression vectors pBudCkt-tet and pARbl-tet was transformed according to methods known per se into E. coli strain JM105.
  • the control was E. coli JM105 transformed with the vector pACYClS4.
  • One clone each was selected and cultured in a ScblinlkolJoenanzucht.
  • a preculture was prepared in LB tet- edium (10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl, 15 pg / ml tetracycline) (cultivation at 37 ° C. and 120 rpm overnight).
  • acetoin reductase expression 50 ml of the E. coli cells were centrifuged (10 min 15000 rpm, Sorvall RC5C centrifuge equipped with a SS34 rotor), the cell pellet in 2 ml KPi buffer (0.1 M potassium phosphate, 0.1 M NaCl, pH 7.0), in a manner known per se with a so-called.
  • KPi buffer 0.1 M potassium phosphate, 0.1 M NaCl, pH 7.0
  • acetoin reductase activity The determination of the acetoin reductase activity was carried out in a manner known per se. The substrate acetoine is reduced by AR in an NADH-dependent reaction. It produces 2, 3-butanediol and NADH is consumed in stoichiometric amounts. The consumption of NADH is determined photometrically at 340 nm. 1 U acetoin reductase activity is defined as the amount of enzyme that reduces 1 pmol acetoin / min under test conditions.
  • acetoin reductase in Klebsiella terrigena starting strain was Klebsiella terrigena DSM 2687.
  • the transformation with the plasmids pBudC, pBudCkt-tet, pARbl and pARbl TM tet was carried out in a manner known per se analogously to the methods for the transformation of E. coli known to the person skilled in the art.
  • the control strain used was the non-transformed strain strain Klebsiella terrigena DSM 2687.
  • Tran formants were isolated and tested for acetoin reductase activity by shake flask culture.
  • 50 ml of FM2amp medium (plasmids pBudCkt and pARbl), or FM2tet medium (plasmids pBudCkt-tet and pARbl-tet), or FM2 medium without antibiotics (K. terrigena wild-type control strain) were inoculated with a transformant and Incubated for 24 h at 30 ° C and 140 rpm (Infors shaker).
  • FM2 medium contained glucose 60 g / l; 10g / 1; Yeast Extract (Oxoid) 2.5 g / 1; Ammonium sulfate 5 g / 1; NaCl 0.5 g / 1; FeS0 4 x 7 H 2 O 75 mg / l; Na 3 citrate x 2 H 2 0 1 g / 1; CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O 14.7 mg / 1; MgS0 4 x 7 H 2 0 0.3 g / 1; KH 2 P0 4 1.5 g / 1; Trace element mix 10 ml / 1 and, im Case of FM2amp, ampicillin 100 mg / 1, or in the case of
  • FM2tet, tetracycline 15 mg / l The pH of the FM2tet medium was adjusted to 6.0 before starting the culture.
  • the trace element mix had the composition H 3 B0 3 2.5 g / l; CoCl 2 x 6 H 2 O 0.7 g / 1; CuSO 4 X 5 H 2 O 0.25 g / 1; MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O 1.6 g / 1; ZnS0 4 ⁇ 7 H 2 0 0.3 g / 1 and Na 2 Mo0 4 ⁇ 2 H 2 0 0.15 g / 1.
  • the cells were analyzed as described in Example 2 for E. coli. Klebsiella cells were disrupted with the "French Press ®” and examines the cell extracts on Acetoinreduktase activity. The specific Acetoinreduktase activity in crude extracts of different strains (determined as described in Example 2) is shown in Table 1.
  • Table 2 BDL production in the shake flask of acetoin reductase over-expressing Klebsiella terrigena transformants
  • the determination of the 2,3-butanediol content in culture supernatants was carried out in a manner known per se by .sup.1 H-NMR.
  • an aliquot of the culture was centrifuged (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) and 0.1 ml of the culture supernatant with 0.6 ml of TSP (3- (trimethylsilyl) propionic acid 2,2,3,3-d 4 sodium salt) standard solution defined content (internal standard, typically 5 g / 1) in D 2 0 mixed.
  • TSP trimethylsilyl
  • Strains used in the fermentation were the Klebsiella terrigena wild type strain ⁇ control strain of the 3rd and 4th examples) and the acetoin reductase overproducing strains
  • Klebsiella terrigena pBudCkt-tet and Klebsiella terrigena pARbl-tet were prepared from pBudCkt-tet and Klebsiella terrigena pARbl-tet (see 3rd and 4th examples).
  • Batch fermentation medium was FM2tet medium (see 3rd example, medium without tetracycline for the K. terrigena wild type control strain).
  • the cell density OD600 as a measure of the biomass formed was determined photometrically at 600 nm (BioRad photometer SmartSpec TM 3000).
  • the glucose content was determined as described in Example 4.
  • the 2, 3 -BDL content was determined by NMR as described in Example 4.
  • Table 3 shows the time-dependent 2, 3 -BDL formation in the K. terrigena control strain and in the acetoin reductase overproducing, recombinant Klebsiella terrigena strains.
  • the strain Klebsiella terrigena-pBudCkt-tet was fermented (see 4th and 5th examples).
  • Preparation of an inoculum for the pre-fermenter An inoculum of Klebsiella terrigena pBudCkt ⁇ tet in LBtet medium (see Example 2) was prepared by adding 2 ⁇ 100 ml LBtet medium, each in a 1 1 Erlenmeyer flask, each containing 0.25 ml of a Glycerol culture (overnight culture of the strain in LBtet medium, treated with glycerol in a final concentration of 20% v / v and stored at -20 ° C) were inoculated.
  • the cultivation was carried out for 7 h at 30 ° C and 120 rpm on an infus orbital shaker (cell density OD S00 / ml of 0.5 - 2.5). 100 ml of the preculture were used to inoculate 8 liters of fermentation medium. Inoculated were two Vorfermenter with 8 1 fermenter medium. Prefermenters: The fermentation was performed three fermenters the company Sartorius BBI Systems GmbH in two Biostat ® C-DCU. Fermentation medium was FM2tet ⁇ see 3rd example). The fermentation took place in the so-called batch mode.
  • the regulation of the oxygen partial pressure was carried out via the stirring speed (stirrer speed 200-500 rpm).
  • Struktol J673 (20-25% v / v in water) was used.
  • glucose consumption was reduced by off-line glucose
  • the analysis of the fermentation parameters was carried out as described in the 5th example.
  • the content of 2,3-butanediol and the by-products acetoin, ethanol and acetate was determined by NMR (see Example 4)
  • the lactate content was determined in a manner known per se (see, for example, US 2010/0112655) by HPLC.
  • the production process of the fermentation is shown in Table 4.
  • the yield of 128.8 g / l of 2,3-butanediol achieved with the strain Klebsiella terrigena pBudCkt ⁇ tet according to the invention was unexpectedly high and was more than 40% higher than the yield of about 10% customarily achieved with a Klebsiella terrigena wild-type strain. 90 g / 1 (see 5th example).

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Description

Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2 , 3-Butandiol
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2 , 3-Butandiol (2,3-BDL) mittels eines verbesserten Mikroorganismenstammes, der eine 3,6 bis 34,8 fach erhöhte Ace- toinreduktase (gleichbedeutend mit 2 , 3-Butandioldehydrogenase) Aktivität gegenüber dem nicht verbesserten Ausgangsstamm aufweist . Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstellungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverf hren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2- Baustein) , Glycerin, 1,3-Propanäiol, 1, 2~Propanäiol (C3- Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2-Butanol, 1,4- Butandiol oder auch 2, 3-Butandiol (C -Bausteine) . Diese chemischen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits effiziente mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Dabei ist ent- scheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen das gewünschte Produkt in hoher Konzentration und unter geringer Nebenprodukt- bildung aus dem biogenen Rohstoff herstellen. Die Optimierung der als ProduktionsStämme bezeichneten Mikroorganismen in Bezug auf Produktivität und Wirtschaf lichkeit wird beispielsweise erreicht durch Metabolie Engineering,
Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4-Baustein ist 2,3- Butandiol . Der Stand der Technik zur fermentativen 2,3- Butandiol Herstellung ist zusammengefasst in Celinska und
Grajek (Biotechnol . Advances (2009) 27: 715-725). 2 , 3 -Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen (C -Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1,3- Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, EK) . Ausserdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2-Bausteine) wie Essigsäure (DE 102010001399) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von , 3 -Butandiol sind auch C8 -Verbindungen denkbar, die Verwendung z.B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosynthetische Weg zu 2, 3 -Butandiol ist bekannt (siehe Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725) und führt vom zentralen Stoffwechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2 , 3 -Butandiol ;
Reaktion der Acetolactatsynthase : Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von C02.
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase : Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
Reaktion der Acetoinreduktase (2, 3-Butandioldehydrogenase) : NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2 , 3 -Butandiol . Verschiedene natürliche Produzenten von 2 , 3 -Butandiol sind bekannt, z. B. aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Entero- bacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacil- lus, Lactobacillus , Lactococcus etc. Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt {z.B. Bäckerhefe}. Die meisten bakteriellen Produzenten sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also grosstechnisch nicht ohne aufwendige und teuere technische Sicherheitsmassnahmen eingesetzt werden (dazu und zu weiteren mikrobiellen 2 , 3-Butandiolproduz;enten siehe Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances {2009) 27: 715-725) , Dies würde ebenso für bisher nicht beschriebene gen- technisch optimierte Produktionsstamme basierend auf diesen Stämmen gelten.
Für eine kosteneffiziente großtechnische 2,3-BDL Produktion kommen also nur Produktionsstamme der biologischen Sicherheits- stufe Sl in Frage. Für diese wurden jedoch bisher keine ausrei- chend hohen 2,3-BDL Ausbeuten beschrieben. Bekannte 2,3-BDL-
Produktionsstämme aus der biologischen Sicherheitsstufe Sl sind Stämme der Arten Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Bacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis . In der Fachliteratur (Drancourt et al . , Int. J. Syst. Evol . Microbiol . (2001), 51: 925-932) werden infolge einer taxonomischen ümbenennung die Arten Klebsiella terrigena und Klebsiella planticola synonym auch als Raoultella terrigena und Raoultella planticola bezeichnet. Es handelt sich dabei um Stämme der gleichen Art.
Für diese in der Sicherheitsstufe Sl eingestuften Stämme wurden bisher 2 , 3 -Butandiolausbeuten von nicht mehr als 57 g/1 (637 mM, Produktionsdauex- 60 h) berichtet (Nakashimada et al . , J. Bioscience and Bioengineering (2000) 90: 661-664). Diese Aus- beuten sind für eine wirtschaftliche Produktion bei weitem zu gering. Als minimale Fermentationsausbeute für eine wirtschaftliche Produktion werden >80 g/1 2 , 3-Butandiol (Fermentations- dauer maximal 72 h) , bevorzugt >100 g/1 2 , 3 -Butandiol angesehen .
Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sic er- heitsstufe" und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z.B. in „Biosafety in Microbiological and Bio- medical Laboratories", S. 9ff. (Tabelle 1), Genters for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
Herausgeber: U.S. Dept . of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010) ; ISBN- 10: 0160850428.
Die Steigerung der Acetoinreduktaseaktivität (bzw. 2,3-Butan- dioldehydrogenaseaktivität) in Bakterien wird beschrieben in US 2010/0112655, WO 2009/151342 und WO 99/54453.
Die heterologe Expression eines Gens in Milchsäurebakterien z.B. der Art Lactobacillus plantarum, das für ein Protein mit Butandioldehydrogenaseaktivität kodiert, ist in US 2010/0112655 beschrieben. Voraussetzung für eine erfolgreiche 2 , 3-Butandiol- produktion ist dabei jedoch, dass der Produktionsstamm frei von Aktivität des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH) ist. Fig. 3 in US 2010/0112655 zeigt, dass ein rekombinanter, Acetoinreduktase aus Klebsiella pneumoniae (Bud C) und Alkoholdehydrogenase (Sad B) aus Achromobacter xylosoxidans exprimierender L. plantarum Stamm kein 2 , 3 -Butandiol produziert, ebenso wenig wie eine L. plantarum Mutante mit einer LDH Deletion. Erst die Kombination einer rekombinanten L. plantarum Mutante mit LDH Deletion und gleichzeitig heterologer Expression von Bud C und Sad B führt zur Produktion von geringen Mengen 2 , -Butandiol mit einer Ausbeute von 80 mM (entspricht 7,2 g/1). Bezogen auf die gesamte in Molarität bestimmte Ausbeute an gebildeten Produkten (siehe Fig. 3 in US 2010/0112655) betrug der Anteil an 2 , 3 -Butandiol 49 Mol % der gemessenen Produkte, die aus Glucose gebildet wurden. Die Selektivität der Umwandlung von Glucose in 2,3- Butandiol ist damit vergleichsweise gering. Für den Fachmann ergibt sich daraus, dass die einfache Überexpression einer Acetoinreduktase nicht zur Steigerung der 2,3- Butandiolausbeute in einem Produktionsstamm führt, sondern dass dazu zuvor eine aufwändige Stammoptimierung erforderlich ist, bei der einerseits eine oder mehrere störende LDH-Aktivitäten (im Fall von L. plantarum Ldh P und Ldh LI) entfernt und zusätzlich eine Alkoholdehydrogenaseaktivität rekombinant eingeführt werden muss. Darüber hinaus ist eine Ausbeute von 49 Mol % 2 , 3-Butandiol für eine wirtscha tliche Verwertung zu gering, da mehr als die Hälfte der verwerteten Glucose in der Bildung von Nebenprodukten resultiert.
WO 2009/151342 offenbart die Produktion von 2,3-BDL durch anaerobe Fermentation mit dem Bakterium Clostridium autoethanogenum und ohlenmonoxid als C-Quelle. Maximal erzielte 2,3-BDL Ausbeuten betrugen 9,27 g/1 nach einer Fermentationsdauer von 14 Tagen. In den genetisch nicht veränderten Stämmen wurde, als Mass der Expressionsstärke, der RülS-Gehalt der 2,3»
Butandioldehydrogenase in 2,3-BDL produzierenden Ansätzen {her- vorgerufen durch Kohlenmonoxidbegasung im Überschuss) im Vergleich zu einem Acetat produzierenden Ansatz (limitierte Kohlenmonoxidbegasung) bestimmt und eine Induktion der RNS des Wildtypgens der 2 , 3 -Butandioldehydrogenase um den Faktor 7,64 (entspechend einer 2,3-BDL Produktion von 8,67 g/1 nach 13 Ta- gen) gemessen. Die Induktion der Genexpression wurde durch verstärkte Begasung mit Kohlenmonoxid erreicht. Es wurde nicht offenbart, ob mit der Genexpression auch eine Steigerung der Acetoinreduktase Enzymaktivität verbunden war und wie hoch die vermeintliche Steigerung der Enzymaktivität im Vergleich zum Ausgangszustand war. Dem Fachmann ist bekannt, dass zwischen Transkription (RNS-Gehalt) und Translation (Enzymgehalt) kein linearer Zusammenhang besteht, sodass eine 7,64-fache Steigerung der Acetoinreduktase RNS in WO 2009/151342 nicht zwingend einer 7, 6 -fachen Steigerung der Acetoinreduktase Enzymaktivi- tät entspricht. Bei dem gewählten Ansatz kann nicht unterschieden werden, ob die erhöhte 2,3-BDL Produktion durch den verstärkten Eintrag der C-Quelle Kohlenmonoxid erfolgte oder durch verstärkte Expression des 2 , 3-Butandioldehydrogenase Enzyms. Kohlenmonoxid ist unter Bedingungen des aeroben Stoffwechsels toxisch, so dass sich aus der speziellen Situation der anaeroben Fermentation von C. autoethanogenum keine allgemeine Anleitung für eine Produktion unter aeroben oder mikroaeroben Bedin- gungen zur Steigerung der 2 , 3 -Butandiolproduktion infolge der Kombination aus Begasung mit Kohlenmonoxid und einer gesteigerten 2 , 3 -Butandioldehydrogenase Aktivität ableiten lässt. Darüber hinaus sind 2,3-BDL Ausbeuten von 8,67 g/1 in 13 Tagen für eine wirtschaftliche Produktion bei weitem ungenügend, speziell unter Berücksichtigung eines erhöhten technischen Aufwands einer anaeroben Fermentation im großtechnischen Maßstab.
WO 99/54453 offenbart Milchsäurebakterien mit 10 fach erhöhter Aktivität entweder der Diacetylreduktase, der Acetoinreduktase, bzw. 2 , 3 -Butandioldehydrogenase . Überraschenderweise wurde dabei nur eine Beeinflussung des Diacetylgehalts der als Starterkulturen in der Lebensmittelindustrie benutzten Milchsäurebakterien beobachtet. Es wurde jedoch nicht offenbart, ob sich eine erhöhte Aktivität der Acetoinreduktase, bzw. 2,3- Butandioldehydrogenase auf den 2,3-BDL Gehalt der Milchsäurebakterienkulturen auswirkte. Weder wurde offenbart, ob die in der Erfindung offenbarten Stämme überhaupt 2,3-BDL produzieren noch, ob die 10 -fache Überexpression der Acetoinreduktase in einer Steigerung der 2,3-BDL Produktion resultierte. Wie be- reits für US 2010/0112655 diskutiert, produzieren Milchsäurebakterien in Gegenwart des Milchsäure produzierenden Enzyms Lactatdehydrogenase kein 2,3-BDL auch nach Überexpression der Acetoinreduktase, so dass der Fachmann auch für die in WO
99/54453 offenbarten MiIchsäurestamme keine signifikante Pro- duktion von 2,3-BDL erwartet.
Die in WO 99/54453 offenbarte Erfindung ist beschränkt auf Milchsäurebakterien. Es handelt es sich um neuartige Starterkulturen für die Lebensmittelindustrie und die daraus herge- stellten Lebensmittel sollen keinen erhöhten Gehalt an 2,3-
Butandiol enthalten. Für den Fachmann ist es deshalb nicht offensichtlich, dass eine Steigerung der Acetoinreduktaseaktivi- tät zwingend in einer erhöhten 2,3-BDL Ausbeute resultiert. Aufgabe der Erfindung war es, Produktionsstämme zur Herstellung von 2 , 3-Butandxol bereitzustellen, die deutlich höhere 2,3- Butandiolausbeuten ermöglichen als der Ausgangsstamm.
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen Produktionsstamm der aus einem Ausgangsstamm herstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ausgewählt ist aus der Gattung Klebsiella, Raoultella, Paenibacillus und Bacillus und der Produktions- stamm eine mindestens 3,6 bis 34,8 fach über dem Ausgangsstamm liegende Acetoinreduktase Aktivität aufweist.
In der vorliegenden Erfindung wird unterschieden zwischen einem Ausgangsstamm und einem Produktionsstamm. Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten, aber zur 2,3- Butandiolproduktion befähigten Wildtypstamm oder einen bereits weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Bei einem bereits weiter optimierten Wildtypstamm { z.B. durch einen gentechnischen Eingriff erfolgt) ist jedoch nicht die Acetoinreduktase Aktivi- tat von der Optimierung betroffen.
Unter einem Produktionsstamm im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein bezüglich der 2 , 3-Butandiolproduktion optimierter Ausgangsstamm zu verstehen, der durch eine im Vergleich zum Ausgangsstamm erhöhte Aktivität des Enzyms Acetoinreduktase
(AR) gekennzeichnet ist. Vorzugsweise ist der Produktionsstamm aus dem Ausgangsstamm hergestellt. Wenn ein bereits optimierter Ausgangsstamm durch eine Erhöhung der Acetoinreduktase Aktivität nochmals verbessert werden soll, so ist es natürlich ebenso möglich zunächst in einem unverbesserten Stamm die Acetoinreduktase Aktivität zu erhöhen und anschließend weitere Verbesserungen einzubringen.
Die Erhöhung der Acetoinreduktaseaktivitat im Produktionsstamm kann dabei hervorgerufen sein durch eine beliebige Mutation im Genom des AusgangsStammes (z.B. eine die Promotoraktivität steigernde Mutation) , eine die Enzymaktivität steigernde Mutation im Acetoinreduktasegen oder durch Überexpression eines ho- mologen oder aber auch heterologen Acetoinreduktasegens im Ausgangsstamm.
Bevorzugt ist die Überexpression eines homologen oder eines he- terologen Acetoinreduktasegens im Au gangsstamm.
Bevorzugt ist die Acetoinreduktase Aktivität um mindestens den Faktor 3,6 bis 20 und besonders bevorzugt um den Faktor 3,6 bis 10 erhöht.
Besonders bevorzugt wird diese erhöhte Acetoinreduktase Aktivität durch eine gegenüber dem Ausgangsstamm erhöhte Expression eines homologen oder heterologen, für ein Acetoinreduktaseenzym kodierendes Gen erreicht.
Bei dem Ausgangsstamm kann es sich um einen beliebigen 2,3- Butandiol produ ierenden Stamm der Sicherheitsstufe Sl handeln.
Bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis wobei ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella} terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola nochmals bevorzugt ist. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Ausgangsstamm und einen Produktionsstamm eingestuft in der Sicherheitsstufe Sl und von diesen, darüber hinaus bevorzugt, Stämme der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola .
Entsprechend dem Stand der Technik (siehe US 2010/0112655, WO 2009/151342 und WO 99/54453} musste der Fachmann davon ausgehen, dass die Überexpression der Acetoinreduktase keine Verbesserung der 2 , 3-Butandiol Produktion in einem Produktionsstamm bewirken kann. Im Rahmen von Versuchen, die zur vorliegenden
Erfindung führten, wurde überraschend gefunden, dass durch eine begrenzte (3,6 bis 34,8 fach) erhöhte Acetoinreduktase Aktivität in einem Produktionsstamm die Ausbeute an 2 , 3 -Butandiol signifikant gesteigert werden kann. Vorzugsweise wird die erhöhte Acetoinreduktase Aktivität durch rekombinante Überexpression einer Acetoinreduktase in einem Produktionsstamm erreicht. Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist eine Überexpression der Acetoinreduktase um den Faktor 3,6 bis bis zu einem Faktor 34,8 (siehe 3. Beispiel) dazu geeignet, die 2 , 3 -Butandiolausbeute (bestimmt als Volumenausbeute 2,3- Butandiol in g/1) in der Fermentation um mehr als 20 %, bevor- zugt mehr als 30 %, besonders bevorzugt mehr als 40 % und insbesondere bevorzugt um mehr als 100 % zu steigern.
Wie im 4. Beispiel weiter offenbart, ermöglicht die rekombinante Überexpression der Acetoinreduktase auch eine Erhöhung der 2 , 3 -Butandiolausbeute im Schüttelkolben um 20 - 29 %.
Bei der Acetoinreduktase (AR) kann es sich um jedes genkodierte Enzym handeln, das nach Formel (III) durch Oxidation des Cofa - tors NADH (oder auch NADPH) zu NAD (oder NADP} die Synthese von 2, 3-Butandiol aus Acetoin bewirkt.
In einer bevorzugten Ausführung stammt das Gen der Acetoinreduktase aus einem Bakterium der Gattung Klebsiella (Raoultella) oder Bacillus (Paenibacillus) .
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das Gen der Acetoinreduktase aus einem Stamm der Art Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Bacillus polymyxa oder Bacillus
licheniformis und insbesondere aus einem Stamm der Art Klebs- iella terrigena, Klebsiella planticola oder Bacillus
licheniformis . Diese Stämme, darunter auch der in der vorliegenden Erfindung verwendete Stamm Klebsiella terrigena DSM 2687, sind alle käuflich erhältlich z.B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren GmbH (Braun- schweig) .
Der erfindungsgemäße Stamm ermöglicht somit die Steigerung der fermentativen Produktion von 2 , 3 -Butandiol . Die Erfindung er- möglicht somit nicht nur die Produktion von 2 , 3 -Butandiol sondern auch die Produktion anderer StoffWechselprodukte, die sich vom 2 , 3 -Butandiol ableiten lassen. Zu diesen Stoffwechselpro- dukten gehören Diacetyl, Acetoin, Ethanol und Essigsäure.
Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm ist in einer bevorzugten Ausführungsform auch dadurch charakterisiert, dass er aus einem Ausgangsstamm, wie in der Anmeldung definiert, hergestellt wurde und eine Acetoinreduktase in rekombinanter Form produziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion (Volumenproduktion ausgedrückt in g/1 2,3-BDL) gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm um mindestens 20 %, bevorzugt 30 %, besonders bevorzugt 40 % und insbesondere bevorzugt um 100 % gesteigert wird, wobei die 2 , 3 -Butandiol Ausbeute des Ausgangs- Stammes mindestens 80 g/1 beträgt.
Der erfindungsgemäße Produktionsstamm wird vorzugsweise hergestellt durch Einbringen eines Genkonstruktes in einen der genannten Ausgangsstämme .
Das Genkonstrukt in seiner einfachsten Form ist definiert als bestehend aus dem Acetoinreduktase Strukturgen, dem operativ verbunden, ein Promotor vorgeschaltet ist. Gegebenenfalls kann das Genkonstrukt auch einen Terminator umfassen, der dem Aceto- inreduktase Strukturgen nachgeschaltet ist. Bevorzugt ist ein starker Promotor, der zu einer starken Transkription führt. Unter den starken Promotoren bevorzugt ist der sog. dem Fachmann aus der Molekularbiologie von E. coli geläufige „Tac-PromotorΛ . Das Genkonstrukt kann in an sich bekannter Weise in Form eines autonom replizierenden Plasmids vorliegen, wobei die Kopienzahl des Plasmids variieren kann. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Plasmiden bekannt, die abhängig von ihrer genetischen
Struktur in einem gegebenen Produktionsstamm in autonomer Form replizieren können. Das Genkonstrukt kann jedoch auch im Genom des Produktionsstammes integriert sein, wobei jeder Genort entlang des Genoms als Integrationsort geeignet ist. Das Genkonstrukt , entweder in Plasmidform oder mit dem Ziel der genomischen Integration, wird in an sich bekannter Weise durch genetische Transformation in den Produktionsstamm eingebracht. Verschiedene Methoden der genetischen Transformation sind dem Fachmann bekannt (Aune and Aachmann, Ap l . Microbiol . Biotech- nol . (2010) 85: 1301 - 1313), darunter beispielsweise die
Elektroporation .
Zur Selektion transformierter Produktionsstämme enthält das Genkonstrukt, ebenfalls in bekannter Weise, einen sog. Selekti- onsmarker zur Auswahl von Transformanten mit dem gewünschten Genkonstrukt. Bekannte Selektionsmarker sind ausgewählt aus sog. Antibiotika-Resistenzmarkern oder aus den eine Auxotrophie kom lementierenden Selektionsmarkern . Bevorzugt sind Antibiotika-Resistenzmarker, besonders bevorzugt solche, die Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt aus Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol oder Zeocin verleihen. Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm enthält somit in einer bevorzugten Ausführungsform das Genkonstrukt, entweder in Plasmidform oder in das Genom integriert und produziert ein Aceto» inreduktase Enzym in rekombinanter Form. Das rekombinante Ace~ toinreduktase Enzym ist in der Lage, unter Oxidation von NADH (bzw. alternativ auch NADPH} zu NAD (bzw. alternativ zu NADP) aus Acetoin 2 , 3 -Butandiol zu produzieren. Nun wurde überraschend gefunden, dass durch geeignete rekombinante überexpres- sion des Acetoxnreduktase Enzyms im Produktionsstamm die 2,3- Butandiol Ausbeute gegenüber dem Ausgangsstamm in signifikanter Weise gesteigert werden kann.
Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Der Ausgangsstamm kann jedoch bereits vorher optimiert worden sein, bzw. als erfindungsgetnässer Ace- toinreduktase produzierender Produktionsstamm weiter optimiert werden. Die von der Erfindung umfasste Optimierung eines erfin- dungsgemässen Acetoinreduktase produzierenden Produktionsstam- mes kann einerseits durch Mutagenese und Selektion von Mutanten mit verbesserten Produktionseigenschaften erfolgen. Die Optimierung kann jedoch auch gentechnisch erfolgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Beispiele solcher Gene sind die bereits genannten 2, 3-Butandiol Biosynthesegene Acetolactatsynthase und Acetolactatdecarboxylase. Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Genkon- strukte oder aber auch kombiniert als eine Expressionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. So ist beispielsweise bekannt, dass in Klebsiella terrigena alle drei Biosynthesegene des 2 , 3 -Butandiols (sog. BUD-Operon, Blomqvist et al., J. Bacteriol . (1993} 175: 1392 - 1404), bzw. in Stämmen der Gattung Bacillus die Gene der Acetolactatsynthase nd der Acetolactatdecarboxylase in einem Operon organisiert sind (Ren- na et al . , J. Bacteriol (1993) 175: 3863 - 3875).
Weiterhin kann der Produktionsstamm dadurch optimiert werden, dass ein oder mehrere Gene inaktiviert werden, deren Genprodukte sich negativ auf die 2 , 3-Butandiol Produktion auswirken.
Beispiele dafür sind Gene, deren Genprodukte für die Nebenproduktbildung verantwortlich sind. Dazu zählen , B. die Lactat- dehydrogenase (Milchsäurebildung) , die Acetaldehyddehydrogenase (Ethanolbildung) oder aber auch die Phosphotransacetylase , bzw. die Acetatkinase (Acetatbildung) .
Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Produktion von 2 , 3 -Butandiol mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Produkti- onsStammes . Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Zellen eines er- findungsgemäßen, Acetoinreduktase produ ierenden Produktionsstammes in einem Anzuchtmedium kultiviert werden. Dabei wird einerseits Biomasse des Produktionsstammes und andererseits das Produkt 2,3-BDL gebildet. Die Bildung von Biomasse und 2,3-BDL kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (La- bormaßstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmaßstab) .
Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmaßstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmaßstab ein Fermentationsvolumen größer 10 1 besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen größer 300 1 insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiellen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle) , einer Stickstoffquelle (N-Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die 2,3-BDL Produktbildung optimiert werden. C-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur 2,3-BDL Produktbildung genützt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend CS-Zucker wie z. B. Glu- cose, Matmose oder Fructose sowie C5-Zucker wie z.B. Xylose, Arabinose, Ribose oder Galactose.
Das erfindungsgemäße Produktionsverfahren umfasst jedoch auch alle C-Quellen in Form von Disacchariden, insbesondere Saccharose, Lactose, Maltose oder Cellobiose.
Das erfindungsgemässe Produktionsverfahren umfasst weiterhin auch alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Malto- dextrin, Stärke, Cellulose, Hemicellulose , Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse {enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Monomere oder Oligomere. Dabei kann die Hydrolyse der höheren C- Quellen dem erfindungsgemässen Produktionsverfahren vorgeschal- tet sein oder aber in situ während des erfindungsgemässen Produktionsverfahrens erfolgen. Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze) , Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) , Milchsäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat {und dessen Salze) . Es sind aber auch gasförmige C-Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmo- noxid denkbar.
Die vom erfindungsgemässen Produktionsverfahren betroffenen C- Quellen umfassen sowohl die isolierten Reinsubstanzen oder aber auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufgereinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydroly- sate durch chemischen oder enzymatischen Aufschluss der pflanzlichen Rohstoffe gewonnen werden können. Dazu gehören , B.
Hydrolysate der Stärke {Monosaccharid Glucose) , der Zuckerrübe (Monosaccharide Glucose, Fructose und Arabinose) , des Zuckerrohrs (Disaccharid Saccharose) , des Pektins {Monosaccharid Ga~ lacturonsäure) oder auch der Lignozellulose (Monosaccharid Glucose aus Cellulose, Monosaccharide Xylose, Arabinose, Mannose, Galactose aus Hemicellulose sowie das nicht zu den ohlehydra- ten gehörende Lignin) . Weiterhin können als C-Quellen auch Abfallprodukte aus dem Aufschluss pflanzlicher Rohstoffe dienen, so z. B. Melasse (Zuckerrübe) oder Bagasse (Zuckerrohr) .
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstämme sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose, Arabinose sowie pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können.
Besonders bevorzugte C-Quelle ist Glucose, entweder in isolier- ter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomasse™ bildung genützt werden können. Dazu gehören Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des weiteren sind als N- Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KN03, NaN03, Ammoniumnitrat, Ca(N03 ) 2 , Mg(N03 ) 2 sowie andere N-Quellen wie z.B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Aminosäuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.
Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed) , um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C- Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feeäkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen
Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die 2,3-BDL Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed.
Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Saccharose, Melasse, oder pflanzliche Hydrolysate , die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Am- moniumphospha , Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, N03, NaN03 und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwas- ser (Corn Steep Liquor} sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base .
Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Am- moniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form) .
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die 2,3-BDL Produktion des ProduktionsStammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8, Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5 , 5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7,
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produkt!- onsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 35°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung) . Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die SauerstoffVersorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft.
Die Kultivierungsdauer zur 2,3-BDL Produktion beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das 2,3-BDL Produkt, vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene 2,3-BDL Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterve wendet werden oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des 2,3-BDL Produkts stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zent- rifugation, Dekantierung, Filtration, Extraktion, Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebiger Form kombiniert werden, um das 2,3-BDL Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung des 2,3-BDL Produkts.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifi ierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades des 2,3-BDL Produktes sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Korabination aus diesen Analysemethoden.
Die Figuren zeigen die in den Beispielen genannten Plasmide. Fig. 1 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 3,65 kb grossen Acetoinreduktase Expessionsvektor pBudCkt .
Fig. 2 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 3,67 kb grossen Acetoinreduktase Expessionsvektor pARbl .
Fig. 3 zeigt das in Beispiel 1 genutzte Plasmid pACYC184.
Fig. 4 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 5,1 kb grossen Ex- pessionsvektor pBudCkt-tet.
Fig. 5 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 5 , 1 kb grossen Expessionsvektor pARbl-tet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläu- tert:
1. Beispiel:
Herstellung von Acetoinreduktase Expressionsvektoren Verwendet wurden die Acetoinreduktase Gene aus K. terrigena und B. licheniformis . Die DNS-Sequenz des Acetoinreduktasegens aus K. terrigena ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer L04507, bp 2671 - 3440. Es wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS-Polymerase , Qiagen) aus genomischer K. terrigena DNS {Stamm DSM 2687, käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) mit den Primern BUD7f und BUD9r als DNS-Fragment von 0,78 kb Grösse isoliert. Die DNS-Sequenz des Acetoinreduktase Gens aus B. licheniformis ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer NC_006322.1, unter der die gesamte Genomsequenz von B. licheniformis offenbart ist. Das Acetoinreduktase Gen ist dort in komplementärer Form von bp 2007068 - 2007850 zu finden. Es wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS-Polymerase , Qiagen) aus genomischer B. licheniformis DNS (Stamm DSM 13, käuflich erhältlich bei der DSMZ GmbH) mit den Primern BLar-lf und BLar-2r als DNS-Fragment von 0,78 kb Grösse isoliert.
Die für die PCR-Reaktionen verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von . terrigena DSM 2687 und B. licheniformis DSM 13 in LB~Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl) gewonnen worden.
Primer BUD7f (SEQ ID NO: 1) und BUD9x (SEQ ID NO: 2) hatten folgende DNS-Sequenzen:
SEQ ID NO; 1:
5' -GAA TTC ATG CAA AAA GTC GCA CTT GTC ACC-3
SEQ ID NO: 2:
5'-AAG CTT TTA GTT GAA TAC CAT GCC GCC GTC- 3*
Primer BLar-lf (SEQ ID NO: 3) und BLar~2r (SEQ ID NO: 4) hatten folgende DNS-Sequenze : SEQ ID NO: 3 :
5' -GAA TTC ATG AGT AAA GTA TCT GGA AAA ATT G-3V
SEQ ID NO : 4 :
5' -CTG CAG TTA ATT AAA TAC CAT TCC GCC ATC- v
Die PCR-Produkte wurden mit Eco RI (in Primer BUD7f und BLar-lf enthalten) und Hind III (in Primer BUD9r enthalten) , bzw. Pst I (in Primer BLar-2r enthalten) , nachverdaut und in den Expressi- onsvektor pKKj kloniert. Dabei entstanden die jeweils 4,9 kb grossen Acetoinreduktase Expessionsvektoren pBudCkt (Fig. 1} und pARbl (Fig. 2) . Der Expressionsvektor pKKj ist ein Derivat des Expressionsvek- tors pKK223~3. Die DNS-Sequenz von pKK223-3 ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugri fnummer M77749.1. Aus dem 4,6 kb Plasmid wurden ca. 1,7 kb entfernt (bp 262 - 1947 der in 77749.1 offenbarten DNS-Sequenz) , wodurch der 2,9 kb Express ionsvektor pKKj entstand.
Die Expressionsvektoren pBudCkt und pARbl wurden durch Einbau einer Expressionskassette für das Tetracyclin Resistenzgen modifiziert. Dazu wurde das Tetracyclin Resistenzgen zuerst aus dem Plasmid pACYC184 (Fig. 3) isoliert. Die DNS-Sequenz von pACYC184 ist zugänglich in der „Genbank" Gendatenbank unter der Zugangnummer X06403.1). Durch PCR (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit den Primern tetlf und tet2r und anschlieSendem Verdau mit Bgl II (Schnittstellen enthalten in den Primern tetlf und tet2r) wurde die Tetracyclin Expressionskassette als 1,45 kb Fragment aus pACYC184 isoliert und dann in die jeweils mit Bam HI geschnittenen Vektoren pBudCkt und pARbl kloniert . Dadurch entstanden die jeweils 6 kb grossen Expressionsvektoren pBudCkt-tet (Fig. 4) und pARbl-tet (Fig. 5) . Wie in Fig. 4 und Fig. 5 dargestellt, wurde jeweils ein Klon ausgewählt, bei dem die Tetracyclin- und die Acetoinreduktase Expressionskassetten jeweils in der gleichen Richtung orientiert waren.
Primer tetlf (SEQ ID NO: 5} und tet2r (SEQ ID NO: 6) hatten folgende DNS-Sequenze :
SEQ ID NO: 5:
5'-TCA TGA GAT CTC AGT GCA ATT TAT CTC TTC-3 SEQ ID NO: 6:
5'-TCA TGA GAT CTG CCA AGG GTT GGT TTG CGC ATT C-3'
2. Beispiel: Expressionsanalyse in E. coli
Plasmid-DNS der Expressionsvektoren pBudCkt-tet und pARbl~tet wurde nach an sich bekannten Methoden in den E. coli Stamm JM105 transformiert. Als Kontrolle diente E. coli JM105, transformiert mit dem Vektor pACYClS4. Jeweils ein Klon wurde ausgewählt und in einer SchüttelkolJoenanzucht kultiviert. Von den E. coli-Stäm en wurde in LBtet- edium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl, 15 pg/ml Tetracyclin) eine Vorkultur her- gestellt (Anzucht bei 37°C und 120 rpm über Nacht) . Je 2 ml Vorkultur wurden als Inokulum einer Hauptkultur von 100 ml LBtet Medium (300 ml Erlenmeyerkolben) verwendet. Die Hauptkulturen wurden bei 30°C und 180 rpm geschüttelt, bis eine Zelldichte OD600 von 2,0 erreicht wurde. Dann wurde der Induktor IPTG (Isopropyl-ß-thiogalactosid, 0,4 mM Endkonzentration) zugegeben und über Nacht bei 30°C und 180 rpm geschüttelt.
Zur Analyse der Acetoinreduktase Expression wurden 50 ml der E. coli Zellen zentrif giert (10 min 15000 rpm, Sorvall Zentrifuge RC5C, ausgestattet mit einem SS34 Rotor) , das Zellpellet in 2 ml KPi~Puffer (0,1 M Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl , pH 7,0) aufgenommen, in an sich bekannter Weise mit einem sog.
„French®Press" Hochdruckhomogenisator (SLM-AMINCO) aufgeschlossen und ein Zellextrakt durch Zentrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor} isoliert. Aliquots der Zellextrakte wurden zur spektralphotometrischen Bestimmung der Acetoinreduktase Aktivität verwendet. Während im Kontrollstamm keine Aktivität gemessen werden konnte, betrug die spezifische Acetoinreduktase Aktivität in Zellextrakten, abhängig vom jeweiligen Konstrukt, zwischen 70 und 122 U/mg Protein.
Spektralphotometrische Bestimmung der Acetoinreduktase Aktivität: Die Bestimmung der Acetoinreduktase Aktivität wurde in an sich bekannter Weise durchgeführt. Dabei wird das Substrat Ace- toin durch AR in einer NADH-abhängigen Reaktion reduziert. Es entsteht 2 , 3-Butandiol und NADH wird in stöchiometrischen Mengen verbraucht. Der Verbrauch von NADH wird photometrisch bei 340 nm bestimmt. 1 U Acetoinreduktase Aktivität ist definiert als die Enzymmenge, die 1 pmol Acetoin/min unter Testbedingungen reduziert.
Der Messansats von 1 ml Volumen zur photometrischen Bestimmung von AR-Aktivität war zusammengesetzt aus Messpuffer (0,1 M IC- Phosphat, pH 7,0; 0,1 NaCl; 1 mM MgC12 x 7 H20) , 10 μΐ Aceto- in, 0,2 mM NADH und AR-haltigem Zellextrakt. Messtemperatur war 25°C. Der Messansatz wurde durch Zugabe des AR~haltigen Zellextrakts gestartet und die Extinktionsabnähme infolge des Ver- brauchs von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen (Extinktionskoeffizient NADH: ε = 0,63 x 104 1 x Mol"1 x cm"1) .
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkon¬ zentration der Zellextrakte in an sich bekannter Weise mit dem sog. „BioRad Proteinassay" der Fa. BioRad bestimmt.
3. Beispiel:
Expression von Acetoinreduktase in Klebsiella terrigena Ausgangsstamm war Klebsiella terrigena DSM 2687. Die Transformation mit den Plasmiden pBudC, pBudCkt - tet , pARbl und pARbl™ tet erfolgte in an sich bekannter Weise analog der dem Fachmann geläufigen Methoden zur Transformation von E. coli. Als Kontrollstamm wurde der nicht transformierte ildtyp Stamm Klebs- iella terrigena DSM 2687 verwendet.
Tran formanten wurden isoliert und durch Schüttelkolbenanzucht auf Acetoinreduktase Aktivität getestet. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2amp-Medium (Plasmide pBudCkt und pARbl) , bzw. FM2tet- Medium (Plasmide pBudCkt-tet und pARbl-tet) , bzw. FM2~Medium ohne Antibiotikum (K. terrigena Wildtyp Kontrollstamm) mit einer Transformante beimpft und 24 h bei 30 °C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert. FM2-Medium enthielt Glucose 60 g/1; 10 g/1; Hefeextrakt (Oxoid) 2,5 g/1; Ammoniumsulfat 5 g/1; NaCl 0,5 g/1; FeS04 x 7 H20 75 mg/1; Na3Citrat x 2 H20 1 g/1; CaCl2 x 2 H20 14,7 mg/1; MgS04 x 7 H20 0,3 g/1; KH2P04 1,5 g/1; Spurenelementemix 10 ml/1 und, im Falle von FM2amp, Ampicillin 100 mg/1, bzw. im Falle von
FM2tet, Tetracyclin 15 mg/1. Der pH des FM2tet Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt. Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H3B03 2,5 g/1; CoCl2 x 6 H20 0,7 g/1; CuS04 X 5 H20 0,25 g/1; MnCl2 x 4 H20 1,6 g/1; ZnS04 x 7 H20 0,3 g/1 und Na2Mo04 x 2 H20 0,15 g/1.
Die Zellen wurden, wie im 2. Beispiel für E. coli beschrieben, analysiert. Klebsiella Zellen wurden mit der „French®Press" aufgeschlossen und die Zellextrakte auf Acetoinreduktase Aktivität untersucht. Die spezifische Acetoinreduktase Aktivität in Rohextrakten der verschiedenen Stämme (bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben) ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Vergleich der Acetoinreduktase Aktivität in rekombi- nanten K. terrigena Stämmen
4. Beispiel:
2,3-BDL-Produktion durch Schüttelkolbenanzucht rekombinanter K. terrigena Stämme
Die Kultivierung der mit dem Plasmiden pBudCkt-tet und pARbl- tet transformierten K. terrigena Stämme erfolgte wie im 3. Beispiel beschrieben. Die Kultivierungsdauer betrug jedoch 72 h. Dabei wurde die Glucosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Glucoseanalysator 7100MBS der Fa. YSI) und Glucose bei Bedarf aus einer 40 % (w/v) Stocklösung nachgefüttert. Nach einer Kultivierungsdauer von 48 h und 72 h wurden Proben auf ih- ren 2,3-BDL Gehalt untersucht. Das Ergebnis der 2,3-BDL Produktion ist in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: BDL- roduktion im Schüttelkolben von Acetoinredukta- se überexprimierenden Klebsiella terrigena Transformanten
Wie in Tabelle 2 ersichtlich, resultierte die Üb rexpression der Acetoinreduktase Gene aus K. terrigena, bzw. B. lichenifor- mis in Klebsiella terrigena in einer unerwartet hohen Steige- rung der 2,3-BDL Produktion in der SchüttelkoIbenanzucht um 20 - 29 %. Die Steigerung der 2 , 3-Butandiolproduktion wird offensichtlich durch Überexpression der Acetoinreduktase bewirkt.
Die Bestimmung des 2 , 3-Butandiolgehalts in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch ^-H-NMR. Dazu wurde ein Aliquot der Anzucht sentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des KulturüberStandes mit 0,6 ml TSP (3- (Trimethylsilyl) Propionsäure-2 , 2 , 3 , 3-d4 Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischer- weise 5 g/1) in D20 gemischt. Die XH-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 N R Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert :
TSP: 0,140 - 0,145 ppm (9H)
2,3-Butandiol: 1,155 - 1,110 ppm (6H) Ethanol : 1, 205 1,157 ppm (3H)
Essigsäure : 2,000 1,965 ppm (3H)
Acetoin: 2, 238 2,200 ppm (3H) 5. Beispiel:
2,3-BDL Produktion mit Acetoinreduktase überexprimierenden K. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation
Verwendet wurden „Labfors II" Fermenter der Fa. Infor . Das Ar- beitsvolumen betrug 1,5 1 (3 1 Fermentervolumen) . Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des p02 und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlö- sung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Com- puterprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fermentationsparameter Rührerdrehzahl {rpm) , Belüftung {Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentati - onsmedium pro Minute) , p02 {Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100 % kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt) , pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenter- hersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (74 % Glucose, w/v) wurde entsprechend dem Glucoseverbrauch über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fett- säureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei Schill & Seilacher (20-25 % v/v in Wasser verdünnt), verwendet.
In der Fermentation eingesetzte Stämme waren der Klebsiella terrigena Wildtyp Stamm {Kontrollstamm aus dem 3. und 4. Beispiel) und die Acetoinreduktase überproduzierenden Stämme
Klebsiella terrigena-pBudCkt-tet und Klebsiella terrigena- pARbl-tet (siehe 3. und 4. Beispiel). Batch-Fermentationsmedium war FM2tet Medium (siehe 3. Beispiel, Medium ohne Tetracyclin für den K. terrigena Wildtyp Kontrollstamm) .
1,35 1 des Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüt- telkolbenanzucht in Batch-Fermentationsmedium hergestellt. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,0. In regelmässigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD600 als Mass der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec™ 3000) .
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Drei achbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert , das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichts- konstanz getrocknet.
Der Glucosegehalt wurde bestimmt wie im 4. Beispiel beschrieben. Der 2 , 3 -BDL-Gehalt wurde durch NMR bestimmt wie im 4. Beispiel beschrieben.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) eine 74 % {w/v) Glucoselösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose Verbrauchsrate bestimmt.
Tabelle 3 zeigt die zeitabhängige 2 , 3 -BDL-Bildung im K. terri- gena Kontrollstamm und in den Acetoinreduktase überproduzierenden, rekombinanten Klebsiella terrigena Stämmen.
Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (4. Beispiel) , führt die Überexpression der Acetoinreduktase mit den Expressionsplasmiden pBudCkt-tet und pARbl~tet zu einer signifikanten Steigerung der 2 , 3 -Butandiolproduktion um 34,2 % (heterologes AR-Gen) - 43,7 % {homologes AR-Gen) , bezogen auf die Maximalausbeute bei 72 h Fermentationsdauer. Die Produkti- onsverläufe sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
Produktion von 2, 3 -BDL in K. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation
6. Beispiel:
2,3-BDL Fermentation im 330 1 Maßstab
Fermentiert wurde der Stamm Klebsiella terrigena-pBudCkt-tet (siehe 4. und 5. Beispiel). Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter : Ein Inokulum von Klebsiella terrigena-pBudCkt~tet in LBtet Medium (siehe 2. Beispiel) wurde hergestellt, indem 2 x 100 ml LBtet Medium, jeweils in einem 1 1 Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LBtet Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20 % v/v versetzt und bei -20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte ODS00/ml von 0,5 - 2,5). 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 1 Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 1 Fermentermedium. Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet {siehe 3. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus.
2 x 8 1 FM2tet wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstan- ten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoff artialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoff- partialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450 - 1.000 rpm) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD60o/rol von 30 - 40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet .
Hauptfermente : Die Fermentation wurde in einem Biostat® D 500 Fermenter {Arbeitsvolumen 330 1, Kesselvolumen 500 1) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet (siehe 3. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus. ISO 1 FM2tet wurden mit 16 1 Inokulum beimpft. Fermentations- temperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm (siehe 4. Beispiel, bezogen auf das An- fangsvolumen) . Der Sauerstoff artialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartial- druckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200 - 500 rpm) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermen- tation wurde der Glucoseverbrauch durch off-line Glucose-
Messung mit einem Glucose-Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 4. Beispiel). Sobald die Glucosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/1 betrug (8 - 10 h nach Inokulation) , wurde die Zudosierung einer 60% w/w Glucose Feedlösung gestartet. Die Flußrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Glucosekonzentration von 10 - 20 g/1 eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 330 1.
Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 5. Beispiel beschrieben. Der Gehalt an 2,3-Butandiol und der Nebenprodukte Acetoin, Ethanol und Acetat wurde durch NMR bestimmt (siehe 4. Beispiel} . Der Lactatgehalt wurde in an sich bekannter Weise (siehe z.B. US 2010/0112655) durch HPLC bestimmt.
Der Produktionsverlauf der Fermentation ist in Tabelle 4 dargestellt. Die mit dem erfindungsgemässen Stamm Klebsiella terri- gena-pBudCkt~tet erzielte Ausbeute von 128,8 g/1 2,3-Butandiol war unerwartet hoch und war mehr als 40 % höher als die mit einem Klebsiella terrigena Wildtypstamm üblicherweise erzielte Ausbeute von ca. 90 g/1 (siehe 5. Beispiel) . Tabelle 4
Produktion von 2,3-BDL durch Fed-Batch Fermentation im 330 1 Massstab
Nach Beendigung der Fermentation (70,5 h) wurde die Fermenter brühe auf den Gehalt weiterer bekannter Fermentationsprodukte untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst . Der 2,3-Butandiol Anteil, bezogen auf die molare Ausbeute der analytisch nachweisbaren Produkte, betrug 77,6 % und war damit signifikant höher als die in US 2010/0112655 offenbarte Ausbeute von 49 %. Tabelle 5
Analyse der Fermentationsprodukte des Stammes . terrigena- pBudCkt-tet
Produkt Gehalt Gehalt Mol-Gehalt bezogener
(g/D (mM) Produktanteil (%)
2 , 3 -Butandiol 128, 8 1431 77, 6
Acetoin 8,8 100 5,4
Diacetyl 0 0 0
Acetat 4 , 7 78, 3 4,2
Ethanol 6 , 1 132, 6 7,2
Lactat 9,1 101, 1 5,5

Claims

Patentansprüche :
1. Produktionsstamm zur Herstellung von 2 , 3-Butandiol herstellbar aus einem Ausgangsstamm dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ausgewählt ist aus der Gattung
Klebsiella, Raoultella, Paenibacillus und Bacillus und der Produktion stamm eine mindestens 3,6 bis 34,8 fach über dem Ausgangsstamm liegende Acetoinreduktase Aktivität aufweist .
2. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass er eine um den Faktor 3,6 bis 20, besonders bevorzugt um den Faktor 3,6 bis 10 erhöhte Acetoinreduktase Aktivität aufweist.
3. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Acetoinreduktase Aktivität durch eine gegenüber dem Ausgangsstamm erhöhte Expression eines für das Acetoinreduktaseenzym kodierenden Gens erreicht wird.
4. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) plantico- la, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis verwendet wird und bevorzugt ein Stamm der
Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola verwendet wird und es sich besonders bevorzugt um einen Stamm der Sicherheitsstufe Sl handelt. 5. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, dass das Gen der Acetoinreduktase aus einem Bakterium der Gattung Klebsiella (Raoultella) oder Bacillus stammt. 6. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm hergestellt wurde und eine Acetoinreduktase in rekombinanter Form produziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion (Volumenproduktion, ausgedrückt in g/1 2,3-BDL) gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm um mindestens 20 %, bevorzugt 30 %, besonders bevorzugt 40 % und insbesondere bevorzugt um 100 % gesteigert wird, wobei die 2 , 3-Butandiol Ausbeute des AusgangsStammes mindestens 80 g/1 beträgt.
7. Verfahren zur Herstellung von 2 , 3-Butandiol, dadurch gekennzeichnet, dass ein Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 bis 6 in einem Anzuchtmedium kultiviert wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C und anaerob oder aerob mit einer Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff erfolgt und eine Kultivierungsdauer zur 2,3-BDL Produktion zwischen 10 h und 200 h vorliegt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7, oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem Fermentationsvolumen größer als 300 1 erfolgt.
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