Verwendung von Hydrophobin bei der nicht-permanenten Färbung von
Keratin
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobin bei der nicht- permanenten Färbung von Keratin und Keratin-haltigen Materialien, speziell von Haar, und eine entsprechende Methode zur nicht-permanenten Färbung von Keratin und Keratin-haltigen Materialien, speziell von Haar. Sie betrifft ferner Mittel zur nicht-permanenten Färbung von Keratin und Keratin-haltigen Materialien, speziell von Haar, welche Hydrophobin enthalten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mittel zur Färbung oder Tönung von Haaren werden nach Beständigkeit der Färbung klassifiziert. Es sind verschiedene Klassifizierungen bekannt. Meist erfolgt eine Unterteilung in drei Klassen: temporäre Haarfärbemittel (Tönungen im engeren Sinne), die nur 1-2 Haarwäschen überdauern (Stufe 1), semipermanente
Haarfärbemittel, die nach circa 6-10 Haarwäschen erneuert werden müssen (Stufe 2) und permanente Haarfärbemittel (Haarfärbungen im engeren Sinne), die nicht ausgewaschen werden können (Stufe 3). Eine andere, ebenfalls geläufige Unterteilung fasst als Tönungen alle Färbemittel zusammen, die auswaschbar sind und bis zu 10 Haarwäschen halten (Stufe 1), während Stufe 2 den demipermanenten Haarfarben zugeordnet wird, welche bis zu 24 Haarwäschen halten, und Stufe 3 ebenfalls die permanenten Haarfärbemittel bezeichnet. Auch eine Unterteilung in vier Klassen findet sich in der Literatur: Tönungen (1-2 Haarwäschen), semipermanente Färbungen (6-10 Haarwäschen), demipermanente Färbungen (bis zu 24 Haarwäschen) und permanente Färbungen (nicht auswaschbar).
Den Mitteln der Stufe 1 und 2 ist in allen Klassifizierungen gemeinsam, dass sie auswaschbar sind, sie werden also im folgenden zusammenfassend als auswaschbare oder nicht-permanente Färbungen bezeichnet. Semi- und demipermanente Färbungen werden im folgenden als Färbungen der Stufe 2 zusammengefasst, während als Tönungen der Stufe 1 bereits nach 1-2 Haarwäschen ausgewaschene Farben bezeichnet werden.
AlIe kommerziellen Produkte zur permanenten Färbung von Haaren der Stufe 3 enthalten einerseits einen "Entwickler", in der Regel eine oxidierende Chemikalie, und andererseits eine alkalische Komponente als Teil ihrer Färbepaste, üblicherweise Ammoniak oder einen Ammoniakersatzstoff wie z.B. Monoethanolamin. Diese Stoffe haben die Aufgabe, die Kutikula einer Haarfaser für die farblosen Farbstoffvorstufen durchlässig zu machen, die Entstehung des endgültigen Farbstoffs innerhalb des Haars zu erleichtern und gleichzeitig durch Einwirkung des Peroxids eine Aufhellung herbeizuführen. Sobald die Färbepaste, die den alkalischen Inhaltsstoffe enthält, mit dem Entwickler in Kontakt gebracht wird, wird das
Wasserstoffperoxid deprotoniert, diffundiert durch die Kutikula und erreicht das Innere des Haares, wo sich Melanin befindet. Das alkalische Peroxid zerstört das Melanin und oxidiert die anfangs farblosen Farbstoffvorstufen zu den endgültigen Farbmolekülen, die dann zu groß sind, um das Haar wieder zu verlassen. Permanent- Haarfärbemittel werden aufgrund dieses chemischen Prozesses auch als oxidative Haarfärbemittel bezeichnet. Zu den Permanent-Haarfärbungen gehören im Prinzip auch die so genannten "selbstoxidierenden Farbstoffe", die durch atmosphärischen Sauerstoff oxidiert werden.
Temporäre und semipermanente Haarfärbemittel (zusammenfassend im folgenden als nicht-permanente Färbemittel bezeichnet) wirken dagegen generell nichtoxidativ. Die Farbstoffmoleküle ordnen sich auf der Oberfläche des Keratins an oder dringen nur eine geringe Strecke in das Haar ein. Sie sind zu groß, um das Haar vollständig zu durchdringen. Die so entstehende Farbstoffschicht kann durch Waschen mit Haarshampoo entfernt werden.
Für temporäre Haarfarben (synonym: Tönungen, Direktzieher) der Stufe 1 werden in der Regel saure Farbstoffe verwendet, die nur eine geringe Affinität zum Haar haben und sich eher auf der Oberfläche des Haares anlagern.
Die Farbstoffe in Tönungen sind generell entweder positiv geladen und binden dann an negativ geladene Oberflächengruppen des Haars, oder sie sind kleine Moleküle, die in die Kutikula eindringen können. Der Haarschaft selbst wird durch temporäre Haarfarben nicht durchdrungen. Stattdessen bleiben diese Farbstoffe an die Kutikula gebunden und können häufig bereits mit einer einzigen Haarwäsche entfernt werden.
Dagegen können semipermanente Haarfarben (die im allgemeinen Sprachgebrauch oft ebenfalls als Tönungen, Intensivtönungen oder Direktzieher bezeichnet werden) in das Haar eindringen, da sie kleinere Farbmoleküle als die temporären Haar- tönungen enthalten. Deswegen halten semipermanente Haarfärbungen länger als temporäre Tönungen und müssen in der Regel erst nach 8 bis 10 Haarwäschen erneuert werden. Demipermanente Färbungen, deren Farbstoffe noch besser in das Haar eindringen, halten noch deutlich länger, meist bis zu 24 Wäschen.
Sowohl semi- also auch demipermanente Färbungen werden wegen ihrer
Auswaschbarkeit von den Anbietern als Tönungen bezeichnet, oftmals sogar als Tönungen der Stufe 1 , obwohl sie zutreffender als Stufe 2 klassifiziert werden sollten.
Haarfärbemittel werden normalerweise in Form von wässrigen, möglichst konzentrierten Lösungen oder Emulsionen verkauft und enthalten neben den eigentlichen Farbstoffen z.B. Fettsäurealkohole und/oder andere Ölkomponenten, Emulgatoren und oberflächenaktive Stoffe, und ggf. Alkohole. Tönungen und semipermanente Haarfärbemittel sind in verschiedenen Produktformen erhältlich, u.a. als Pasten, Spülungen, Shampoos, Gels und Sprays.
Nicht-permanente Haarfärbemittel haben einen geringeren Marktanteil als permanente Haarfarben. Sie sind dennoch von hohem wirtschaftlichem Interesse, weil sie das Haar weniger als permanente Haarfarben angreifen und weder Bleich-
mittel noch Ammoniak enthalten. Dazu kommt, dass Permanent-Haarfarben aufgrund einiger ihrer Inhaltsstoffe, insbesondere Wasserstoffperoxid und Ammoniak, schon seit geraumer Zeit in der Kritik stehen. Permanent-Farben, die nicht auf ihre Verträglichkeit geprüft wurden, werden sogar in der EU in Zukunft verboten werden.
Überdies greifen Permanent-Haarfärbemittel die Haarstruktur an, da sie die Schutzschicht des Haars durchdringen müssen. Zudem stehen permanente Haarfarben im Verdacht, Blasenkrebs auszulösen (A. Andres: Int J Cancer 2004; 109: 581-586).
Dies hat zu einem vermehrten Interesse an nicht-permanenten Alternativen zu permanenten Haarfärbemitteln geführt. Allerdings wird es von Verbraucher häufig als nachteilig empfunden, dass Tönungen oft nur eine einzige Haarwäsche überleben und Färbungen der Stufe 2 innerhalb weniger Wäschen verblassen.
Es besteht also das Bedürfnis nach nicht-permanenten Haarfärbemitteln und - methoden, die eine Alternative oder Verbesserung zu den bereits vorhandenen Mitteln und Methoden der nicht-permanenten Haartönung darstellen und die insbesondere eine stabilere Bindung des Farbstoffs an das Haar möglichst ohne gleichzeitige Schädigung des Haars ermöglichen.
Hydrophobine sind eine Klasse kleiner, cysteinreicher Proteine von etwa 100-150 Aminosäuren Länge, die in der Natur nur in fϊlamentösen Pilzen vorkommen. Sie sind amphiphil und können auf der Oberfläche eines Gegenstands eine wasserunlösliche Schicht ausbilden. Ihre natürlichen Funktionen umfassen u.a. die Beschichtung von Pilzsporen, so dass diese nicht miteinander verkleben, die Beschichtung von Lufthyphen zur Herabsetzung der Oberflächenspannung von Wasser und somit zur Erleichterung der Wasseraufnahme, und möglicherweise die
Signalübermittlung zwischen einem Pilz und seiner Umwelt (Whiteford, J.F. Spanu, P.D. (2001), Fungal Genet. Biol. 32(3): 159-168; Wösten et al. (1999) Current Biol. 19: 1985-88; Bell et al. (1992), Genes Dev. 6: 2382-2394).
Die erste Entdeckung und Reinigung von Hydrophobin erfolgte in Schizophyllum commune im Jahre 1999. Mittlerweile wurden Hydrophin-Gene in Ascomyceten, Deuteromyceten und Basiodiomyceten identifiziert. Manche Pilze enthalten mehr als ein Hydrophobin-Gen, z.B. Schizophyllum commune, Coprinus cinereus und Aspergillus nidulans.
Basierend auf Unterschieden hinsichtlich der Hydropathie und der biophysikalischen Eigenschaften der Hydrophobine sind diese in zwei Kategorien eingeteilt worden: Klasse I und Klasse IL Komplementierungsexperimente haben gezeigt, dass Hydrophobine der einen Klasse Hydrophobine der anderen Klasse bis zu einem gewissen Grade funktionell ersetzen können. Die verschiedenen Hydrophobine scheinen an verschiedenen Pilzentwicklungsstadien beteiligt zu sein und darin unterschiedliche Funktionen zu erfüllen (van Wetter et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:201-210; Kershaw et al. (1998) Fungal Genet. Biol. 23: 18-33).
Hydrophobine weisen in aller Regel acht Cystein- Einheiten auf. Sie können aus natürlichen Quellen isoliert werden, aber auch mittels gentechnischer Verfahren gewonnen werden, wie beispielsweise im WO 2006/082251 und WO 2006/131564 beschrieben.
Die Verwendung von Hydrophobin in kosmetischen Zubereitungen ist an sich bekannt. US 2003/0217419 Al beschreibt die Verwendung des Hydrophobins SC3 aus S. commune für die Behandlung von Keratin-haltigen Materialien.
Dabei bilden sich kosmetische Depots, die mehreren Wäschen mit Shampoo widerstehen sollen. Das Hydrophobin wird entweder gleichzeitig oder nach dem kosmetisch aktiven Inhaltsstoff aufgebracht, aber nicht vor Aufbringen des kosmetischen Wirkstoffes.
WO 2006/136607 A2 beschreibt die Verwendung von Hydrophobin und von Hydrophobin- Konjugaten in kosmetischen Zubereitungen zur Haarpflege. Gemäß WO 2006/136607 können Hydrophobine mit semi-permanenten oder permanenten Haarfarbstoffen verknüpft sein und deren Konzentration und Wirkung auf Haut und Haar erhöhen. Im Falle der permanenten Haarfarbstoffe ist eine der beiden Farbstoff- Komponenten an das Hydrophobin gebunden, während die andere Komponente nach Aufbringung des Konjugats auf das Haar zugegeben wird. Die oxidative Kupplung beider Komponenten geschieht dann direkt auf dem Haar. Die Verwendung von Hydrophobin zusammen mit temporären Haarfärbemitteln der Stufe 1 beschreibt WO 2006/136607 nicht.
WO 2006/082251 beschreibt Hydrophobin-Proteine, ihre Produktion und ihre Verwendung zur Oberflächenbeschichtung.
WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen u.a. als oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate und zur Herstellung von Haar- shampoos und Spülungen vor.
ZIEL DER ERFINDUNG
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Methoden und Zusammensetzungen zur Unterstützung der nicht-permanenten Färbung, insbesondere der Tönung oder semipermanenten Färbung von Keratin und Keratin- haltigen Materialien (wie z.B. Haar, Haut und Nägeln, aber auch Wolle, Leder und andere Keratin-haltige Textilien), speziell von Haar, bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung einer Methode zur Keratin-Färbung, speziell zur Haarfärbung, in der die Keratinfaser so wenig wie möglich beschädigt wird. Die durch die vorliegende Erfindung ermöglichte Färbung von Keratin sollte vorzugsweise nicht-permanent sein, aber in ihrer Beständigkeit und/oder Farbintensität die bislang verfügbaren nicht-permanenten, insbesondere die temporären Haarfärbungen übertreffen.
Ziel ist des weiteren, die Färbung von Keratin durch herkömmliche nicht-permanente Färbungsmittel zu verbessern, insbesondere die Farbintensität und/oder die Beständigkeit der Tönung oder Färbung gegen Auswaschen zu erhöhen, ohne dass hierfür der Einsatz von Oxidativfarbstoffen erforderlich wäre. Dieses Ziel wird vorzugsweise für Tönungen und semipermante Färbungen angestrebt. Hierdurch soll eine Alternative zu Permanentfärbemitteln geschaffen werden, die nicht die Nachteile dieser Färbemittel aufweist.
Diese und andere Ziele, wie sie aus der folgenden Beschreibung der Erfindung hervorgehen, werden durch die vorliegende Erfindung gemäß der unabhängigen Ansprüche gelöst. Besondere Ausführungsformen der Erfindung sind den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und den Beispielen zu entnehmen. Ferner umfasst die Erfindung auch Kombinationen dieser bevorzugten Ausführungsformen.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobin und Hydrophobin-enthaltenden Zusammensetzungen bei der nicht-permanenten Färbung von Keratin oder Keratin-haltigem Material, insbesondere von Haar. Sie betrifft des weiteren eine entsprechende Zusammensetzung zur Färbung von Keratin, speziell eine Tönung oder semi-permanente Färbung. Eine entsprechende Methode zur Färbung von Keratin unter Verwendung von Hydrophobin wird ebenfalls vorgestellt.
Die Verwendung von Hydrophobin führt bevorzugt zu einer höheren Farbintensität und längeren Auswaschzeit der Färbung, was auf eine verbesserte Aufnahme und/oder Anlagerung nicht-permanenter Farbstoffe in/an das Keratin schließen lässt. Dies betrifft insbesondere hydrophile Farbstoffe. Die Färbung wird dadurch intensiver und/oder länger haltbar.
Die Verwendung von Hydrophobin kann des weiteren zu einer verbesserter Aufnahme und/oder Anlagerung anderen kosmetischer Wirkstoffe (neben den nichtpermanenten Farbstoffen) in/an das Keratin führen. Dies betrifft bevorzugt hydrophile kosmetisch aktive Wirkstoffe, wie z.B. Panthenol. Die Wirkstoffe wirken dadurch intensiver, denn sie gelangen in höherer lokaler Konzentration an und/oder in das Keratin und/oder die Zeit bis zum kompletten Auswaschen dieser Stoffe verlängert sich. Das kann unter anderem Auswirkungen haben auf die Haardicke, Reißfestigkeit (Reißkraftverbesserung), Kämmbarkeit und Kämmkraft, Geschmeidigkeit und andere Eigenschaften des behandelten Keratins. Die jeweiligen quantitativen und qualitativen Auswirkungen werden durch die einzelnen kosmetischen Wirkstoffe und deren Anwendungsgebiet bestimmt.
Insbesondere weitere Bestandteile von Tönungen/Färbungen neben den Farbstoffen, z.B. Pflegestoffe, können durch die Anwesenheit von Hydrophobin ebenfalls intensiver wirken.
Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung folgende Gegenstände bzw. Ausführungsformen:
(1) Ein Verfahren zur nicht-permanenten Färbung von Keratin oder Keratin- haltigem Material, umfassend das Aufbringen mindestens eines nichtpermanenten Farbstoffs und mindestens eines Hydrophobins der Strukturformel (I) auf das Keratin oder Keratin- haltige Material;
(2) eine Zusammensetzung zur nicht-permanenten Färbung von Keratin oder Keratin-haltigem Material, enthaltend
(i) mindestens ein Hydrophobin der Strukturformel (I), und (ii) mindestens einen nicht-permanenten Farbstoff; (3) einen Kit zur nicht-permanenten Färbung von Keratin oder Keratin-haltigem
Material, umfassend zwei separate kosmetische Zusammensetzungen, nämlich
(i) eine Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Hydrophobin der Formel (I), und (ii) eine Zusammensetzung enthaltend mindestens einen nicht-permanenten
Farbstoff; und
(4) die Verwendung eines Hydrophobins der Strukturformel (I) bei der nichtpermanenten Färbung von Keratin oder Keratin-haltigem Material zur Erhöhung der Intensität der nicht-permanenten Färbung und/oder der Beständigkeit der nicht-permanenten Färbung gegen Auswaschen.
DEFINITIONEN
Die folgenden Begriffe, Definitionen und Abkürzungen werden verwendet: übliche Drei- und Ein-Buchstaben-Codes für Aminosäuren und Nukleotide.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung schließt die Singularform "ein(e)"auch den jeweiligen Plural mit ein, soweit sich aus dem Zusammenhang nichts anderes ergibt. Der Begriff „ein Hydrophobin" kann also auch mehr als ein Hydrophobin-Molekül umfassen, nämlich zwei, drei vier, fünf usw. Hydrophobine einer Sorte.
„Mindestens ein" bedeutet „ein oder mehrere", „mindestens" gefolgt von einem Zahlenwert bedeutet „dieser oder ein höherer Zahlenwert".
Der Begriff „etwa" oder „ca." im Zusammenhang mit einem Zahlenwert oder einer Parameterbereichsgrenze bezeichnet einen Unschärfebereich, in welchem nach Auffassung des Fachmanns der technische Effekt des betroffenen Merkmals immer noch gewährleistet ist. Der Begriff bedeutet typischerweise eine Abweichung vom angegebenen Zahlenwert um +/- 10 %, bevorzugt +/- 5 %.
Soweit nicht anders angegeben, liegen Säuren entweder als freie Säure oder als teilweises oder vollständiges Salz der Säure oder als eine Mischung der Säure mit ihrem Salz vor. Umgekehrt können Basen, insbesondere Amine, als freie Base oder als teilweises oder vollständiges Salz der Base oder als eine Mischung der Base mit ihrem Salz vorliegen.
"Nativ" ist synonym zu "Wildtyp-" und "natürlicherweise (vorkommend)". Eine "natürlicherweise" vorkommende Verknüpfung zweier Polypeptide ist eine Verknüpfung wie sie in naturam vorgefunden wird, also z.B. in einem Wildtyp- Protein. Ein Wildtyp- oder natives Protein oder Polpeptid ist - soweit nicht anders
angegeben - die üblicherweise natürlich vorkommende Form dieses Proteins/Po lypeptids .
"Rekombinant" bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung "hergestellt mit Hilfe oder das Ergebnis von gentechnischen Methoden".
Ein "Fragment" einer Aminosäuresequenz resultiert aus dem Fehlen einer oder mehrerer aufeinanderfolgender Aminosäuren am N- und/oder C-Terminus der genannten ursprünglichen Sequenz.
Ein "Homolog" einer Aminosäuresequenz im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Protein oder Polypeptid, das sich von der ursprünglichen Sequenz durch die Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheidet. Bevorzugt wird die Funktion und/oder Konformation des Proteins durch diese Substitution nicht beeinträchtigt. Besonders bevorzugt ist die Aminosäuresubstitution ein konservativer Aminosäureaustausch, die ausgetauschten Aminosäuren werden also durch Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften ersetzt, z.B. VaI durch AIa.
Besonders bevorzugt finden konservative Aminosäureaustausche zwischen den Mitgliedern der folgenden Gruppen statt: saure Aminosäuren (Aspartat und Glutaminsäure); basische Aminosäuren (Lysin, Arginin, Histidin); hydrophobe Aminosäuren (Leucin, Isoleucin, Methionin, Valin, Alanin); hydrophile Aminosäuren (Serin, Glycin, Alanin, Threonin); - Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten (Glycin, Alanin, Valin, Leucin,
Isoleucin);
Aminosäuren mit hydroxyaliphatischen Seitenketten (Serin, Threonin);
Aminosäuren mit Amid-Gruppen in der Seitenkette (Asparagin, Glutamin);
Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten (Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan);
Aminosäuren mit Schwefel in der Seitenkette (Cystein, Methionin). Spezifisch bevorzugte konservative Aminosäureaustausche sind:
Ursprüngliche Aminosäure Substitut
AIa Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn; GIn
He Leu; VaI
Leu He; VaI
Lys Arg; GIn; GIu
Met Leu; He
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
VaI He; Leu
Der Begriff "isoliert" bedeutet "getrennt oder gereinigt vom Ursprungsorganismus". Ein isoliertes Hydrophobin ist folglich nicht mehr Bestandteil des Pilzes, in welchem es in der Natur vorkommt. Auch rekombinant hergestellte Hydrophobine sind , ,iso lierte' ' Hydrophobine .
„Farbintensität" (Synonym: „Intensität der Färbung") ist die wahrgenommene Buntheit, die entweder durch subjektive Bewertung nach In-Augenschein-Nahme (ggf. im Vergleich mit einem nicht eingefärbten Standard), oder durch Vergleich optischer Messdaten bestimmt werden kann.
Solche Messdaten können z.B. mittels eines herkömmlichen Photometers oder Farbmessgerätes wie dem Konica Minolta CR-300, CR-310, CR-311 (Konica Minolta Sensing, Inc., Osaka, Japan), bevorzugt mit dem CR-300, bestimmt werden. Die Messdaten können dann z.B. nach dem a-b-L-System (synonym: Lab-System, CIELAB-System; L: Helligkeit; a: Farbton; b: Sättigung) oder nach dem L*a*b*- System (CIE 1976), bevorzugt nach dem L*a*b*-System, ausgewertet werden. Die Auswertung nach dem L*a*b*-System ist z.B. in der Bedienungsanleitung des Konica Minolta CR-300, CR-310, CR-311 (Konica Minolta Sensing, Inc., Osaka, Japan), deutsche Version, Versionsnummer 527 349/9.99 beschrieben.
Der Begriff „nicht-permanenter Farbstoff bezeichnet einen Farbstoff, dessen färbende Wirkung auf Keratin durch einfaches oder mehrfaches Auswaschen rückgängig gemacht werden kann, also einen Farbstoff zur nicht-permanenten Färbung von Keratin.
Die Begriffe „nicht-permanente/auswaschbare Färbung" bzw. „nichtpermanentes/auswaschbares (Haar)Färbemittel" umfassen im Kontext der vorliegenden Erfindung Tönungen, semi- und demipermanente Färbungen und Färbemittel für Keratin, also alle Färbungen und Färbemittel, die aus Keratin auswaschbar sind bzw. keine Permanent-Haarfärbemittel.
Der Begriff „Tönung" wird im Kontext der vorliegenden Erfindung synonym zu "temporäre Tönung", "temporäres Färbemittel", "temporäre Farbe", "temporärer Farbstoff verwendet. Er umfasst aufgrund des nicht einheitlichen Sprachgebrauchs der Hersteller (s. oben, Hintergrund) in seiner weiteren Bedeutung alle nichtpermanenten, auswaschbaren Haarfärbemittel, also temporäre Färbemittel (Tönungen im eigentlichen Sinne), semi- und demipermanente Färbemittel.
Im engeren, bevorzugten Sinne umfasst er Tönungen und semipermanente Färbemittel, im bevorzugtesten und engsten Sinne Tönungen im eigentlichen Sinne. Eine Tönung im eigentlichen Sinne ist ein Mittel zur nichtpermanenten Färbung von Haaren, das durch 1-2 Haarwäschen auswaschbar ist. Weitere Definitionen und Erläuterungen finden sich im Abschnitt „Hintergrund".
„ΔE" (synonym: Delta E") ist ein Maß für die Farbdifferenz bzw. den Farbabstand (DIN 5033-1 : 1979-03) zwischen einer Probefarbe und einer Vergleichsfarbe bzw, zwischen zwei Farben. ΔE kann photometrisch nach verschiedenen Industrienormen bestimmt werden, üblicherweise durch Messung nach der Norm DIN5033 und
Berechnung von ΔE nach DIN 6174. Die Messdaten können z.B. nach dem a-b-L- System (synonym: Lab-System, CIELAB-System; L: Helligkeit; a: Farbton; b: Sättigung) oder nach dem L*a*b*-System (CIE 1976) ausgewertet werden. Ein bevorzugtes Verfahren basiert auf dem von CIE 1976 definierten L*a*b* Farbraum. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ΔE bevorzugt nach der Norm DIN 5033-Teil 1 und DIN 6174 bestimmt, und zwar unter Zugrundelegung des L*a*b*- Farbraums, z.B. mit Hilfe eines Farbmessgerätes wie dem Konica Minolta CR-300, CR-310, CR-311 (Konica Minolta Sensing, Inc., Osaka, Japan), bevorzugt mit dem CR-300, und nach der in der Bedienungsanleitung des Konica Minolta CR-300, CR- 310, CR-311 (Konica Minolta Sensing, Inc., Osaka, Japan), deutsche Version,
Versionsnummer 527 349/9.99 beschriebenen Methode oder nach der in Beispiel 6 beschriebenen Methode.
Die ΔE- Werte für wahrnehmbare Farbunterschiede liegen in der Regel zwischen 2 und 5, bei sehr gutem Ergebnis oberhalb von 5, was einen mit bloßem Auge deutlichen Farbunterschied (das Vorliegen einer anderen Farbe) anzeigt (http://de.wikipedia.org/wiki/Delta E):
ΔE Bewertung
0,0 ... 0,5 kein bis fast kein Unterschied
0,5 ... 1,0 Unterschied kann für das geübte Auge bemerkbar sein 1,0 ... 2,0 merklicher Farbunterschied
2,0 ... 4,0 wahrgenommener Farbunterschied
4,0 ... 5,0 wesentlicher Farbunterschied, der selten toleriert wird oberhalb 5,0 die Differenz wird als andere Farbe bewertet.
Die Begriffe „hydrophil" und „hydrophob" haben die in der chemischen Fachsprache übliche Bedeutung. Ein "hydrophiler" Farbstoff ist also ein Farbstoff, der bevorzugt in Wasser oder polaren Lösemitteln löslich ist. Hydrophile Farbstoffe sind typischerweise polare Verbindungen, die entweder ionisch sind, ein Dipolmoment aufweisen und/oder elektronegative Gruppen enthalten. Ein „hydrophober" Farbstoff löst sich dagegen bevorzugt in unpolaren Medien und besitzt keine ionischen funktionellen Gruppen und nur schwach elektronegative funktionelle Gruppen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobin bei der nichtpermanenten Färbung von Keratin und Keratin-haltigen Materialien sowie entsprechende Hydrophobin-enthaltende kosmetische Zusammensetzungen und Kits.
Es wurde überraschend gefunden, dass die Intensität der nicht-permanenten Färbung und/oder die Beständigkeit der nicht-permanenten Färbung gegen Auswaschen bei erfindungsgemäßer Verwendung von Hydrophobin, insbesondere bei Verwendung in einem Verfahren nach Ausführungsform (1), im Vergleich zu einer nichtpermanenten Färbung ohne Verwendung des Hydrophobins erhöht ist. Dies gilt insbesondere bei einer Vorbehandlung des zu färbenden Keratins mit einer
Hydrophobin-enthaltenden Zusammensetzung vor Aufbringen des nichtpermanenten Färbemittels. Die Farbdifferenz zwischen Hydrophobin-behandeltem und unbehandeltem gefärbtem Haar, ausgedrückt als ΔE und bevorzugt bestimmt nach DIN 5033 und/oder berechnet nach DIN 6174, z.B. nach der in der Bedienungsanleitung des Konica Minolta CR-300, CR-310, CR-311 (Konica Minolta Sensing, Inc., Osaka, Japan), deutsche Version, Versionsnummer 527 349/9.99 beschriebenen Methode (vgl. Abschnitt „Definitionen" und Bsp. 6), kann dabei mehr als 2, bevorzugt mehr als 4, besonders bevorzugt mehr als 5 betragen. Diese Wirkung des Hydrophobins ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass das Hydrophobin die Hydrophilie einer Keratin- haltigen Oberfläche erhöhen kann, speziell die Oberfläche von Haar.
Das Verfahren gemäß Ausführungsform (1), die Zusammensetzungen gemäß Ausführungsform (2) und (3) und die Verwendung gemäß Ausführungsform (4) dienen bevorzugt lediglich der kosmetischen Färbung von Keratin und stellen somit keine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers dar.
Der Gegenstand der vorliegende Erfindung dient der Färbung von Keratin. Das Keratin liegt dabei entweder als reines Keratin vor oder ist Bestandteil Keratin- haltiger Materialien. Bevorzugte Keratine bzw. Keratin-haltige Materialien sind Haut, Haar, Nägel, Hörn, Wolle, Leder, Fell, Pelz und Federn. Besonders bevorzugt sind keratinische Fasern, insbesondere Haar und Wolle.
Ganz besonders bevorzugt wird das Verfahren gemäß Ausführungsform (1) zur Färbung von Haar, speziell von Haupthaar angewandt und sind die Zusammensetzungen gemäß Ausführungsform (2) und (3) sowie die Verwendung (4) zur Färbung von Haar, speziell von Haupthaar, geeignet.
Das erfindungsgemäß gefärbte Keratin kann menschlichen oder tierischen Ursprungs sein und ist bevorzugt menschlichen Ursprungs.
Das Verfahren gemäß Ausführungsform (1) und die Verwendung gemäß Ausführungsform (4) der vorliegenden Erfindung erfordert das Aufbringen mindestens eines Hydrophobins auf das zu färbende Keratin. Das mindestens eine Hydrophobin ist bevorzugt Bestandteil einer Zusammensetzung, die noch weitere kosmetisch akzeptable Inhaltsstoffe enthält.
Unter "Hydrophobin" bzw. "Hydrophobine" werden im Kontext aller Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt Polypeptide der allgemeinen Formel (I)
Xn-ci-xi.so-c^xo-s-c^xi.ioo-c^xi-ioo-c^xi-so-c^xo-s-c^xi-so-c8- Xm (I) verstanden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können die Reste X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren in der jeweiligen Teilsequenz X dar.
Die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen. Im Allgemeinen sind weder m noch n Null, sondern betragen in der Regel 1 oder mehr. Beispielsweise können m und n unabhängig voneinander von 1 bis 500 betragen. Bevorzugt sind m und n unabhängig voneinander von 15 bis 300.
Die mit C* bis C° benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens fünf, besonders bevorzugt mindestens sechs und insbesondere mindestens sieben der Positionen C* bis C° durch Cystein besetzt sein.
Cysteine an den Positionen C* bis C° können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden.
Bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die Ausbildung von mindestens einer, bevorzugt zwei, besonders bevorzugt drei und ganz besonders bevorzugt vier intramolekularen Disulfϊdbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die bei Vorliegen von Cys an den betroffenen Positionen intramolekulare Disulfϊdbrücken untereinander ausbilden können.
Falls an den mit X bezeichneten Positionen ebenfalls ein Cystein, Serin, Alanin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-Positionen in den allgemeinen Hydrophobin-Formeln entsprechend verändern. Zusätzliche Cysteine an X-Positionen sind ebenfalls zur Ausbildung von Disulfϊdbrücken in der Lage.
Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)
Xn-C1-X3.25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8- Xm (II) zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X und C sowie die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben. Die Indizes n und m stehen für natürliche Zahlen einschließlich der Zahl Null. Im Allgemeinen sind weder m noch n Null, sondern betragen in der Regel 1 oder mehr. Beispielsweise können m und n unabhängig voneinander von 1 bis 500 betragen.
Bevorzugt sind m und n unabhängig voneinander von 15 bis 300. Des weiteren bevorzugt handelt es sich bei mindestens sechs der mit C benannten Reste um Cystein, besonders bevorzugt bei allen Resten C um Cystein. Ganz besonders bevorzugt bilden mindestens ein Paar dieser Cysteine eine Disulfidbrücke, und die Ausbildung von mehr als einer Disulfidbrücke, also von 2, 3 oder 4 dieser Brücken, ist am meisten bevorzugt.
Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)
Xn-C1-X5.9-C2-C3-Xi i_39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-l8-C8-Xm (III) zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X und C sowie die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben. Insbesondere stehen die Indizes n und m für natürliche Zahlen von 1 bis 200. Im Allgemeinen handelt es sich bei mindestens sechs der mit C benannten Reste um Cystein. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein. Ganz besonders bevorzugt bilden mindestens ein Paar dieser Cysteine eine Disulfidbrücke, und die Ausbildung von mehr als einer Disulfidbrücke, also von 2, 3 oder 4 dieser Brücken, ist am meisten bevorzugt.
Bei den Gruppen Xn und Xm in jeder der Formeln (I) bis (III) kann es sich um
Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise mit den anderen Bestandteilen des Hydrophobins verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einer oder bei beiden Gruppen um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit den anderen Bestandteilen des Hydrophobins verknüpft sind. Darunter sind auch solche Gruppen Xn und/oder Xm zu verstehen, in denen eine natürlicherweise im Protein vorkommende Peptidsequenz durch eine nicht natürlicherweise im Protein vorkommende Peptidsequenz verlängert ist.
Die Gruppe Xn und/oder Xm kann ganz oder teilweise Peptidsequenzen enthalten, die nicht natürlicherweise im Hydrophobin-Protein vorkommen.
Die nicht natürlicherweise im Protein vorkommenden Peptidsequenzen, aus denen die Gruppe Xn und/oder Xm teilweise oder ganz bestehen kann, soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Diese Fusionspartner sind in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren lang. Es kann sich beispielsweise um Sequenzen aus von 20 bis 500, bevorzugt von 30 bis 400 und besonders bevorzugt von 35 bis 100 Aminosäuren handeln.
Geeignete Fusionspartner sind beispielsweise in WO 2006/082251, WO 2006/082253, WO 2006/131564 und WO 2007/014897 offenbart worden. Diese Fusionspartner sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte Fusionspartner. Der Fusionspartner kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es kann nur ein einziger Fusionspartner mit dem Rest des Polypeptids verknüpft sein, oder es können auch mehrere Fusionspartner mit dem Rest des Polypeptids verknüpft werden. Es können beispielsweise zwei Fusionspartner an einer der Positionen Xn oder Xm mit dem Rest des Polypeptids verknüpft werden, oder es befinden sich auf jeder der beiden Positionen einer oder mehrere Fusionspartner.
Besonders geeignete Fusionspartner sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, beovrzugt in Prokaryoten, insbesondere in Escherichia coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für besonders geeignete Fusionspartner sind die Polypeptide mit den Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251; SEQ ID NO: 15 bzw. 16 in WO 2007/014897), yaae (SEQ ID NO: 18 in WO
2006/082251), Ubiquitin und Thioredoxin. Insbesondere geeignet als Fusionspartner sind yaad und daraus abgeleitete verkürzte Sequenzen, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und in WO 2006/082251 und WO 2007/014897 beschrieben sind. Ganz besonders geeignet sind yaad und yaad40. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Homologe dieser genannten Sequenzen, die nur einen zusammenhängenden Teil, beispielsweise von 70 bis 99 %, bevorzugt von 5 bis 50 %, und besonders bevorzugt von 10 bis 40 % der Aminosäuren der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz ausgetauscht sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Gesamtanzahl der Aminosäuren bezieht. Bevorzugte Austausche sind oben unter „Definitionen" beschrieben.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Hydrophobin - gegebenenfalls bevorzugt neben einem der bereits genannten Fusionspartner - als eine der Gruppen Xn oder Xm oder als terminalen Bestandteil einer solchen Gruppe noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affinity tag / affϊnity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen wechselwirken und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affϊnitätsdomänen umfassen (His)k-, (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe)k- oder (Cys)k-
Gruppen, wobei k im allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt handelt es sich um eine (His)k-Gruppe, wobei k für eine der Zahlen vier bis sechs steht. Hierbei kann die Gruppe Xn und/oder Xm ausschließlich aus einer derartigen Affinitätsdomäne bestehen oder aber aus natürlicherweise oder nicht natürlicherweise mit dem Rest des Polypeptids verknüpften Aminosäuren oder Polypeptiden und einer derartigen Affinitätsdomäne. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Hydrophobin zusätzlich an seiner Polypeptidsequenz modifiziert, beispielsweise durch Glycosylierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.
Hydrophobine, ihre Sequenzen und ihre Herstellung sind beispielsweise in WO 2006/082251 offenbart, dessen diesbezügliche Inhalte hiermit ausdrücklich in die vorliegende Erfindung einbezogen werden. Die in WO2006/082251 beschriebenen
Hydrophobine sind für die Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, ganz besonders Hydrophobine des Typs dewA (in den Beispielen in den Fusionsproteinen
„Hydrophobin A" bzw. „Hydrophobin B" enthalten), hypA und hypB, insbesondere
Hydrophobine des Typs dewA.
Diese Hydrophobine und ihre Sequenzen sind beispielsweise in WO 2006/082251 und WO 2007/014897 offenbart, deren diesbezügliche Inhalte hiermit ausdrücklich in die vorliegende Erfindung einbezogen werden. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die nachfolgend angegebenen Sequenznamen und SEQ ID NOs auf in WO 2006/082251 offenbarten Sequenzen. Eine Übersichtstabelle mit den SEQ-ID- Nummern befindet sich in WO 2006/082251 auf Seite 20.
Erfindungsgemäß insbesondere geeignet sind Hydrophobine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO:20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO:22) und yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO:24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden
Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21, 23. Besonders bevorzugt kann yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20 in WO 2006/082251 bzw. SEQ ID NO: 19 und 20 WO 2007/014897) eingesetzt werden. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO:20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bevorzugt bis hin zu 5% aller Aminosäuren, besonders bevorzugt bis hin zu zehn, ganz besonders bevorzugt bis hin zu fünf Aminosäuren, ergeben, und welche die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die unten beschriebene Änderung des Kontaktwinkels und/oder die unten beschriebene Wirkung auf Keratin verstanden.
Besonders zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignete Hydrophobine sind des weiteren von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad- Fusionspartners abgeleitete Hydrophobine.
Anstelle des vollständigen yaad- Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürzter yaad-Rest eingesetzt werden.
Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 zusammenhängende Aminosäuren der yaad-Sequenz umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis 150 und ganz besonders bevorzugt 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden. Ein insbesondere geeignetes Protein ist yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO:25 und 26 in WO 2007/014897), welches einen auf 40 Aminosäuren verkürzten yaad-Rest aufweist.
Eine Spaltstelle zwischen dem Fusionspartner bzw. Fusionspartnern und dem Rest des Polypeptids kann dazu genutzt werden, den Fusionspartner abzuspalten (beispielsweise durch BrCN-Spaltung an Methionin, Faktor Xa-, Enterokinase-,
Thrombin-, TEV-Spaltung etc.). Besonders bevorzugt ist eine Xa-Schnittstelle, z.B. eine Schnittstelle der in den Beispielen verwendeten Hydrophobine.
Wie bereits oben dargestellt, sind Hydrophobine obenflächenaktive Polypeptide. Sie können aus natürlichen Quellen isoliert werden, können aber auch mittels gentechnischer Verfahren gewonnen werden. Prinzipiell sind sowohl Hydrophobine der einen wie der anderen Herkunft zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet.
Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.
Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.
Ein gentechnisches Herstellverfahren für Hydrophobine aus Talaromyces thermophilus, die keinen Fusionspartner enthalten, ist z.B. in US 2006/0040349 beschrieben.
Die Herstellung von Hydrophobinen, die einen Fusionspartner enthalten, kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Rest des Polypeptids codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren beispielsweise ist von WO 2006/082251 oder WO 2006/082253 offenbart. Die Fusionspartner erleichtern die Herstellung der Hydrophobine erheblich. Hydrophobine, die einen Fusionspartner enthalten, werden bei den gentechnischen Verfahren mit deutlich besseren Ausbeuten produziert als Hydrophobine, die keinen Fusionspartner enthalten.
Die nach dem gentechnischen Verfahren von den Wirtsorganismen produzierten Hydrophobine können in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgearbeitet und mittels bekannter chromatographischer Methoden gereinigt werden. Im Allgemeinen werden isolierte, insbesondere gereinigte Hydrophobine zur Ausführung der Erfindung genutzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das in WO 2006/082253, Seiten 11/12 offenbarte, vereinfachte Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren eingesetzt werden.
Hierzu werden die fermentierten Zellen zunächst aus der Fermetationsbrühe abgetrennt, aufgeschlossen und die Zelltrümmer von den Einschlusskörpern
(inclusion bodies) getrennt. Letzteres kann vorteilhaft durch Zentrifugieren erfolgen. Schließlich können die Einschlusskörper, beispielsweise durch Säuren, Basen und/oder Detergentien in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgeschlossen werden, um die Hydrophobine freizusetzen. Die Einschlusskörper mit den erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobinen können in der Regel schon unter Verwendung von 0,1 M NaOH innerhalb von ca. 1 h vollständig gelöst werden.
Die erhaltenen Lösungen können, gegebenenfalls nach Einstellen des gewünschten pH- Wertes, ohne weitere Reinigung zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden. Die Hydrophobine können aus den Lösungen aber auch als Feststoff isoliert werden. Bevorzugt kann die Isolierung mittels Sprühgranulieren oder Sprühtrocknen erfolgen, wie in WO 2006/082253, Seite 12 beschrieben. Die nach dem vereinfachten Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren erhaltenen Produkte umfassen neben Resten von Zelltrümmern in der Regel ca. 80 bis 90 Gew.% Proteine. Die Menge an Hydrophobinen beträgt je nach Fermentationsbedingungen in der Regel von 30 bis 80 Gew.% bezüglich der Menge aller Proteine. Die isolierten Hy drophobin- enthaltenden Produkte können als Feststoffe gelagert werden.
Die Hydrophobine können als solche oder auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners zur Ausführung dieser Erfindung verwendet werden. Eine Spaltung nimmt man vorteilhaft nach der Isolierung der Einschlusskörper und deren Auflösung vor.
Eine biologische Eigenschaft der Hydrophobine ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn eine Oberfläche, z.B. eine Glasoberfläche, mit Hydrophobin-Proteinen beschichtet wird. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell beispielsweise dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der
Beschichtung der Oberfläche mit den Proteinen gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen werden bei Raumtemperatur mit einem Wassertropfen von 5 μl und unter Verwendung von Glasplättchen als Substrat durchgeführt. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im Beispiel 10 der WO 2006/136607 dargestellt.
Unter den dort genannten Bedingungen können die verwendeten Hydrophobine den Kontaktwinkel vergrößern. So können die Hydrophobine den Kontaktwinkel beispielsweise um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30°; mindestens 40°; mindestens 45°; insbesondere mindestens 50° vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Wirkung von Hydrophobin auf die Bindung von Tönungsfarbstoffen und semipermanenten Farbstoffen an Haar. Die Bindung von Hydrophobin an Haut und Haar kann wie in Beispielen 1 bis 4 (identisch zu Beispielen 11 bis 14 der WO 2006/136607) beschrieben getestet werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gemäß Ausführungsform (2) und (3), und Zusammensetzungen zur Verwendung (4) im Verfahren nach Ausführungsform (1) enthalten das Hydrophobin bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 5 Gew%, besonders bevorzugt eine Menge von 0,005 bis 3 Gew%, ganz besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 Gew% Gesamt-Hydrophobin bezogen auf die Gesamt-
Zusammensetzung. Am meisten bevorzugt ist eine Hydrophobin-Konzentration von bis zu 0,2 Gew%, insbesondere von 0,01 bis 0,05 Gew%, vor allem von 0,025 Gew%. Das Gesamt-Hydrophobin ist die Gesamtmenge der Hydrophobin- Moleküle einer oder mehrerer Hydrophobin-Molekülarten in der Zusammensetzung. Diese Konzentrationsbereiche geben auch die bevorzugten Konzentrationen an, in denen das Hydrophobin im Verfahren nach Aus führungs form (1) auf das Keratin oder Keratin-haltige Material aufgebracht wird.
Die genannten Hydrophobin-Konzentrationen liegen entweder bereits in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gemäß Ausführungsform (2) und (3), bzw. den Zusammensetzungen zur Verwendung (4) im Verfahren nach Ausführungsform (1) vor, oder sie werden durch Verdünnen eines Konzentrats vor Verwendung der Zusammensetzung erhalten.
Zur erfϊndungsgemäßen Verwendung ist das Hydrophobin vorteihafterweise in einer Zusammensetzung enthalten, die bevorzugt auch ein kosmetisch akzeptables Trägermedium enthält. Diese Zusammensetzung kann nur ein Hydrophobin oder aber auch eine Kombination von verschiedenen Hydrophobinen enthalten, z.B. eine Zusammensetzung, die zwei oder drei Hydrophobine umfasst.
Die nicht-permanente Färbung von Keratin gemäß der vorliegenden Erfindung erfordert des weiteren das Aufbringen mindestens eines nicht-permanenten Farbstoffs, spezifischer eines nicht-permanenten Keratin-Farbstoffs, auf das zu färbende Keratin. Bevorzugt wird der nicht-permanente Farbstoff als Bestandteil einer Zusammensetzung (Färbemittel) enthaltend den Farbstoff aufgebracht. Die Zusammensetzung gemäß Ausführungsform (2) und der Kit gemäß Ausführungsform (3) betreffen ebenfalls ein derartiges Färbemittel.
Dieses Färbemittel enthält entweder einen oder mehrere nicht-permanente Farbstoffe, typischerweise mehrere nicht-permanente Farbstoffe, bevorzugt von 2 bis 20 oder jede dazwischenliegende natürliche Zahl, besonders bevorzugt von 4 bis 10 nichtpermanente Farbstoffe. Handelsübliche Tönungen und nicht-permanente Färbemittel enthalten in der Regel mehr als drei verschiedene nicht-permanente Farbstoffe, um eine bestimmte Farbtönung zu erzielen (vgl. die in den Beispielen verwendeten Färbemittel).
Bezüglich der erfindungsgemäß in den Färbemitteln einsetzbaren nicht-permanenten Farbstoffe wird ausdrücklich verwiesen auf die Monographie Ch. Zviak, The Science of Hair Care, Kapitel 7 (Seiten 248-250 ; direktziehende Farbstoffe), erschienen als Band 7 der Reihe'Oermatology" (Hrsg.: Ch., Culnan und H. Maibach), Verlag Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 1986, auf die online-Datenbank „Coslng" der Europäischen Union (http://ec.europa.eu/enterprise/cosmetics/cosing/), welche das "Europäische Inventar der Kosmetik-Rohstoffe", herausgegeben von der Europäischen Gemeinschaft umfasst, und innerhalb dieser Datenbank insbesondere
auf Substanzen mit der Funktion „Hair Dyeing", sowie auf das "Europäische Inventar der Kosmetik-Rohstoffe" selbst, herausgegeben von der Europäischen Gemeinschaft, erhältlich in Diskettenform vom Bundesverband Deutscher Industrie- und Handelsunternehmen für Arzneimittel, Reformwaren und Körperpflegemittel e. V., Mannheim. Ausdrücklich Bezug genommen wird des weiteren auf alle in Anhang IV, Teil 2 der EU-Richtlinie 76/768/EWG vom 27.7.1976 in der Fassung vom 30.8.2007 genannten „semipermanenten Haarfarbstoffe". Alle in diesen Werken genannten nicht-permanenten Farbstoffe sind zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignete nicht-permanente Farbstoffe. Nicht-permanente Farbstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt direktziehende Farbstoffe. Als direktziehende Farbstoffe können alle üblicherweise in der Haarfärberei eingesetzten Direktfarbstoffe verwendet werden. Solche direktziehenden Farbstoffe sind üblicherweise Nitrophenylendiamine, Nitroaminophenole, Azofarbstoffe, Anthrachinone, Trihpenylmethanfarbstoffe, Indoaniline oder Indophenole.
Bevorzugte direktziehende Farbstoffe sind die unter den internationalen Bezeichnungen bzw. Handelsnamen HC Yellow 2, HC Yellow 4, HC Yellow 5, HC Yellow 6, HC Yellow 9, HC Yellow 12, HC Yellow 13, Acid Yellow 1, Acid Yellow 10, Acid Yellow 23, Acid Yellow 36, HC Orange 1, Disperse Orange 3, Acid Orange 7, HC Red 1, HC Red 3, HC Red 10, HC Red 11, HC Red 13, Acid Red 33, Acid Red 52, HC Red BN, Pigment Red 57 : 1, HC Blue 2, HC Blue 12, Disperse Blue 3, Acid Blue 7, Acid Green 50, HC Violet 1, Disperse Violet 1, Disperse Violet 4, Acid Violet 43, Disperse Black 9, Acid Black 1, und Acid Black 52 bekannten Verbindungen sowie l,4-Diamino-2-nitrobenzol, 2-Amino-4-nitrophenol, l,4-Bis-(ß- hydroxyethyl)-amino-2-nitrobenzol, 3-Nitro-4-(ß- hydroxyethyl)-aminophenol, 2-(2'- Hydroxyethyl) amino-4, 6-dinitrophenol, 1- (2'-Hydroxyethyl) amino-4-methyl-2- nitrobenzol, l-Amino-4- (2'-hydroxyethyl)-amino-5-chlor-2- nitrobenzol, 4-Amino- 3-nitrophenol, 1 -(2'-Ureidoethyl)-amino-4-nitrobenzol, 4-Amino-2- nitrodiphenyiamin-2'-carbonsäure, 6-Nitro-l,2, 3, 4-tetrahydrochinoxalin, 2-
Hydroxy-1,4- naphthochinon, Pikraminsäure und deren Salze, 2-Amino-6-chloro-4- nitrophenol, 4-Ethylamino-3-nitrobenzoesäure und 2-Chloro-6-ethylamino-l- hydroxy-4-nitrobenzol.
Bevorzugte direktziehende Farbstoffe sind ferner kationische direktziehende Farbstoffe. Besonders bevorzugt sind dabei (a) kationische
Triphenylmethanfarbstoffe, wie beispielsweise Basic Blue 7, Basic Blue 26, Basic Violet 2 und Basic Violet 14, (b) aromatischen Systeme, die mit einer quaternären Stickstoffgruppe substituiert sind, wie beispielsweise Basic Yellow 57, Basic Red 76, Basic Blue 99, Basic Brown 16 und Basic Brown 17, sowie (c) direktziehende Farbstoffe, die einen Heterozyklus enthalten, der mindestens ein quaternäres
Stickstoffatom aufweist, wie beispielsweise Basic Yellow 87, Basic Orange 31 und Basic Red 51.
Die kationischen direktziehenden Farbstoffe, die unter der Marke Arianors® vertrieben werden, sind erfmdungsgemäß besonders bevorzugte kationische direktziehende Farbstoffe.
Ganz besonders bevorzugt ist der mindestens eine nicht-permanente Farbstoff in Ausführungsform (1) bis (4) der vorliegenden Erfindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Basic Red 51, Basic Red 76, HC Red No. 10, HC Red No.11, Basic Violet 2, Hydroxyethyl-2-nitro-p-toluidin, HC Blue No.2, HC Yellow No.9, HC Yellow No.13, HC Yellow No.2, 2-Amino-6-chloro-4nitrophenol, HC Blue No.12, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-nitro-p-phenylenediamine, Basic Blue 99, 4-Amino-3- nitrophenol, 4-Hydroxypropylamino-3-nitrophenol, 3-Nitro-p- hydroxyethylaminophenol, HC Blue No.11, Basic Brown 17, HC Red No.1, HC Red No.7, HC Red No.13, HC Orange No.l und HC Red No.3, insbesondere aus Basic Violet 2 und Hydroxyethyl-2-nitro-p-toluidin. Am bevorzugtesten enthält die
Zusammensetzung eine Kombination von mehreren der ganz besonders bevorzugten Farbstoffe, insbesondere eine Auswahl (beispielsweise die in den Beispielen
mehrfach verwendeten Farbstoffe) oder alle der in den Beispielen genannten Farbstoffe.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Zubereitungen auch in der Natur vorkommende Farbstoffe enthalten wie sie beispielsweise in Henna rot, Henna neutral, Henna schwarz, Kamillenblüte, Sandelholz, schwarzem Tee, Faulbaumrinde, Salbei, Blauholz, Krappwurzel, Catechu, Sedre und Alkannawurzel enthalten sind.
Der nicht-permanente Farbstoff kann grundsätzlich hydrophob oder hydrophil sein. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der nicht-permanente Farbstoff in den Ausführungsformen (1) bis (4) ein hydrophiler Farbstoff. Das Hydrophobin verbessert insbesondere dessen Bindung an die Oberfläche des Keratins, da es die Keratin-Oberfläche hydrophiler machen kann.
Auf der anderen Seite können hydrophobe Farbstoffe eine Hydrophobin- Schicht auf der Keratin-Oberfläche durchdringen und sich in die tieferen Schichten einlagern. Derart stabilisierte hydrophobe Farbstoffe verbleiben länger auf dem Haar. Ihre Verwendung als nicht-permanente Farbstoffe ist daher ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Die Verwendung zumindest eines hydrophilen Farbstoffs im Färbemittel wird jedoch bevorzugt. Besonders bevorzugt ist der größere Teil der nicht-permanenten im Färbemittel vorhandenen Farbstoffe hydrophil (mehr als 50 Gew.% bezogen auf die gesamten Farbstoffe), ganz besonders bevorzugt sind alle nicht-permanenten im Färbemittel vorhandenen Farbstoffe hydrophil.
Die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß angewandten Färbemittel enthalten die nicht-permanenten Farbstoffe bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 20 Gew.%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 10 Gew.%, ganz besonders bevorzugt von 0,1 bis 5 Gew.% bezogen auf das gesamte Färbemittel.
Es ist nicht erforderlich, dass die nicht-permanenten Farbstoffe jeweils einheitliche Verbindungen darstellen. Vielmehr können in den erfindungsgemäßen Haarfärbemitteln, bedingt durch die Herstellungsverfahren für die einzelnen Farbstoffe, in untergeordneten Mengen noch weitere Komponenten enthalten sein, soweit diese nicht das Färbeergebnis nachteilig beeinflussen oder aus anderen Gründen, z. B. toxikologischen, ausgeschlossen werden müssen.
Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeigneten Zusammensetzungen können auch einen oder mehrere permanenten Farbstoff bzw. deren Vorstufen enthalten. Die Verwendung von Zusammensetzungen ohne derartige Permanentfarbstoffe oder deren Vorstufen ist jedoch bevorzugt.
In einem bevorzugten Aspekt der Ausführungsformen (1) bis (4) ist der nichtpermanente Farbstoff Bestandteil eines Färbemittels, bevorzugt eines Haarfärbemittels, eines Hautfärbemittels oder eines Nagelfärbemittels, insbesondere zur Färbung von menschlichen Haaren, Haut oder Nägeln. Besonders bevorzugt ist das Färbemittel ein Haarfärbemittel, ganz besonders bevorzugt eine Haartönung, ein semi- oder ein demipermanentes Haarfärbemittel. Vor allem bevorzugt ist das Färbemittel eine Tönung oder ein semipermanentes Haarfärbemittel, am meisten bevorzugt ein semipermanentes Haarfärbemittel. Der nicht-permanenten Farbstoff wird im Verfahren (1) bevorzugt als Bestandteil einer solchen Zusammensetzung auf das Keratin oder Keratin-enthaltende Material aufgetragen.
Das Färbemittel enthält neben dem Farbstoff in der Regel zumindest ein kosmetisch akzeptables Trägermedium und kann daneben noch weitere in Kosmetika übliche Inhaltsstoffe enthalten.
Das Färbemittel kann - wie es oft handelsüblich ist - Ammoniak oder ein Ammoniaksalz wie z.B. NH4Cl enthalten. Für die erfindungsgemäße Färbung unter Verwendung von Hydrophobin ist jedoch die Anwesenheit von Ammoniak nicht zwingend erforderlich. Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen und die für das Verfahren gemäß Ausführungsform (1) sowie die Verwendung gemäß Ausführungsform (4) verwendeten Zusammensetzungen keinen Ammoniak bzw. kein Ammoniaksalz.
Das Hydrophobin und der nicht-permanente Farbstoff können getrennt voneinander (in getrennten Zusammensetzungen) oder als Kombination in einer einzigen Zusammensetzung auf das Keratin aufgetragen werden. Im Verfahren nach Ausführungsform (1) werden das Hydrophobin und der nicht-permanente Farbstoff bevorzugt getrennt voneinander bzw. in getrennten Zusammensetzungen aufgebracht. Das Hydrophobin und der nicht-permanente Farbstoff können weiters entweder gleichzeitig oder nacheinander auf das Keratin oder Keratin-haltige Material aufgetragen werden. Bevorzugt werden sie nacheinander aufgetragen.
Das Verfahren gemäß Ausführungsform (1) kann einen oder mehrere Schritte umfassen. Bevorzugt umfasst das Verfahren (1) mindestens die folgenden Schritte: (a) Aufbringen mindestens eines Hydrophobins der Strukturformel (I) auf das Keratin; und
(b) Aufbringen mindestens eines nicht-permanenten Farbstoffs auf das Keratin, wobei die Schritte (a) und (b) entweder gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden. In beiden Schritten ist das Hydrophobin bzw. der nicht-permanente Farbstoff bevorzugt in einer Zusammensetzung enthalten, die noch weitere kosmetisch akzeptable Inhaltsstoffe enthält.
Werden die Schritte (a) und (b) gleichzeitig durchgeführt, so wird nur eine Zusammensetzung auf das Haar aufgebracht, die dann sowohl das Hydrophobin als auch den nicht-permanenten Farbstoff enthält. Diese Zusammensetzung kann durch Vermischen zweier getrennter Zusammensetzungen, von denen die eine das Hydrophobin und die andere den nicht-permanenten Farbstoff enthält, hergestellt werden.
Werden die Schritte (a) und (b) nacheinander durchgeführt (also Schritt (a) vor Schritt (b)), so wird zunächst das Hydrophobin, bevorzugt in Form einer Hydrophobin- haltigen Zusammensetzung, auf das Haar aufgebracht. Diese Zusammensetzung wirkt eine gewisse Einwirkzeit lang auf das Keratin ein. Danach wird eine Zusammensetzung auf das Haar aufgetragen, die mindestens einen nichtpermanenten Farbstoff enthält. Der Auftrag der letztgenannten Zusammensetzung kann sich unmittelbar an die Einwirkzeit der Hydrophobin-haltigen Zusammensetzung anschließen, oder es werden zwischen Schritt (a) und (b) noch weitere Schritte (also einer oder mehrere Schritte) zur Behandlung des Keratins durchgeführt.
Diese weiteren Schritte können alle Maßnahmen sein, die zur kosmetischen Behandlung des Haares dienen, solange sie weder die Hydrophobinschicht entfernen noch das Endergebnis der Färbung beeinträchtigen. Bevorzugt sind diese weiteren Schritte ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: ein- oder mehrmaliges Auswaschen des Keratins, ein- oder mehrmaliges Trocknen des Keratins bei
Raumtemperatur oder durch Aufbringen warmer Luft, z.B. Luft mit einer Temperatur von > 300C, bevorzugt von 500C ± 5 0C, mittels einer Heißluftquelle wie z.B. einem Fön.
Besonders bevorzugt ist ein solcher weiterer Schritt des Verfahrens (1) das Trocknen des Keratins oder Keratin-haltigen Materials nach dem Aufbringen des
Hydrophobins. Besonders bevorzugt wird das Keratin zwischen Schritt (a) und (b) getrocknet.
In einem besonders bevorzugte Aspekt wird das Keratin zur Beendigung der Einwirkzeit der Hydrophobin-haltigen Zusammensetzung durch Aufbringen warmer Luft, z.B. Luft mit einer Temperatur von > 300C, bevorzugt von 500C ± 5 0C, mittels einer Heißluftquelle (wie z.B. einem Fön oder eine andere Heißluftquelle, die Temperaturen wie ein Fön erzeugen kann) oder bei Raumtemperatur getrocknet.
Ganz besonders bevorzugt wird das Keratin unmittelbar anschließend an die Einwirkzeit des Hydrophobins durch einen Fön getrocknet, wie es auch im Beispiel 5, Variante (b) der Fall ist, bevor der Farbstoff auf das Haar aufgebracht wird.
Nach Ende der Einwirkungszeit des Hydrophobins und vor Aufbringen des
Farbstoffs wird in einem weiteren bevorzugten Aspekt des Verfahrens (1) der nicht an das Keratin gebundenen Teil des aufgebrachten Hydrophobins von dem zu färbenden Keratin entfernt, insbesondere durch Auswaschen. Besonders bevorzugt wird der Rest der aufgebrachten Hydrophobin-haltigen Zusammensetzung zur Beendigung ihrer Einwirkzeit und/oder nach dem oben geschilderten Trocknen des Keratins zum Ende der Einwirkungszeit ausgewaschen, bevor Schritt (b) durchgeführt wird. Ganz besonders bevorzugt wird zusätzlich das Keratin nach den Auswaschen getrocknet, jedoch möglichst nicht erhitzt (also z.B. bei Raumtemperatur getrocknet), und erst dann die den Farbstoff enthaltende Zusammensetzung auf das Keratin aufgebracht.
In der bevorzugtesten Variante des Verfahrens (1) wird das Keratin unmittelbar im Anschluss an die Einwirkzeit des Hydrophobins getrocknet, bevor die nächsten Schritte durchgeführt werden. In dieser Variante erfolgt das Trocknen durch Aufbringen warmer Luft, z.B. Luft mit einer Temperatur von > 300C, bevorzugt von 500C ± 5 0C, mittels einer Heißluftquelle, bevorzugt mit einem Fön.
Der zeitliche Abstand zwischen dem Ende von Schritt (a) und dem Beginn von Schritt (b) sollte bei einer sequentiellen Durchführung ((b) nach (a)) durch diesen weiteren Schritt bzw. diese weiteren Schritte nicht unnötig vergrößert werden. Er beträgt bevorzugt maximal 2 Stunden, besonders bevorzugt von 2 bis 70 min, ganz besonders bevorzugt von 4 bis 30 min, und am bevorzugtesten von 5 bis 15 min.
Die Einwirkungszeit der Hydrophobin- enthaltenden Zusammensetzung kann bis zu 2 h betragen. Sie beträgt bevorzugt von 2 bis 90 Minuten, beispielsweise von 3 bis 70 min, von 4 bis 30 min, oder von 5 bis 15 min.
Die Färbung in Schritt (b) erfolgt bevorzugt mit einem handelsüblichen Färbemittel nach Herstellerangaben, kann jedoch auch mit anderen Zusammensetzungen enthaltend einen nicht-permanenten Farbstoff erfolgen.
Nach Ende der Färbezeit kann das Keratin nachgewaschen und getrocknet werden.
Die Schritte des Verfahrens (1) können auch mehrfach wiederholt werden.
Die Abfolge und Art der einzelnen Schritte in Beispiel 5 ist eine bevorzugte Art der Durchführung des erfmdungsgemäßen Verfahrens (1). Aus diesen Schritten kann auch eine Auswahl getroffen werden, soweit diese den oben genannten Vorgaben entspricht.
Sowohl der nicht-permanente Farbstoff als auch das Hydrophobin sind bevorzugt (getrennt oder als Kombination) in einer Zusammensetzung enthalten. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind bevorzugt kosmetische
Zusammensetzungen. Sie enthalten neben Hydrophobin und/oder nicht-permanentem Farbstoff in der Regel ein kosmetisch annehmbares Medium sowie geeignete weitere Inhaltsstoffe, die die kosmetische Wirkung unterstützen, insbesondere in Haarbehandlungsmitteln übliche Hilfsstoffe und Zusatzstoffe. Diese Bestandteile sollten das Färbeergebnis nicht nachteilig beeinflussen. Derartige Basisrezepturen für kosmetische Zusammensetzungen und die dafür geeigneten Inhaltsstoffe sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und in Kosmetik-Handbüchern zu finden, wie z.B. in Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Verlag, Heidelberg,
1989, oder Umbach, Kosmetik: Entwicklung, Herstellung und Anwendung kosmetischer Mittel, 2. erweiterte Auflage, 1995, Georg Thieme Verlag.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden i.a. als kosmetische Zubereitungen, beispielsweise als Cremes, Emulsionen, Gele oder auch tensidhaltige schäumende Lösungen, z.B. Shampoos, Schaumaerosole oder andere Zubereitungen, die für die Anwendung auf dem Haar geeignet sind, konfektioniert.
Übliche Bestandteile solcher wasserhaltiger kosmetischer Zubereitungen sind z. B. Netz- und Emulgiermittel, wie anionische, nichtionische und ampholytische Tenside, z. B. Fettalkoholsulfate, Alkansulfonate, α-Olefinsulfonate, Fettalkoholpolyglykolethersulfate, Ethylenoxidanlagerungsprodukte an Fettalkohole, Fettsäure und Alkylphenole, Sorbitanfettsäureester und Fettsäurepartialglyceride, Fettsäurealkanolamide sowie Verdickungsmittel, wie z. B. Methyl- oder Hydroxyethylcellulose, Stärke, Fettalkohole, Paraffinöle, Fettsäuren, ferner Parfumöle und haarpflegende Zusätze, wie z. B. wasserlösliche kationische ampholytische und anionische Polymere, Proteinderivate, Pantothensäure, Cholesterin, Farbstoffe, Wirkstoffe wie Panthenol, Allantoin, Pyrrolidoncarbonsäuren und deren Salze, Pflanzenextrakte und Vitamine, Lichtschutzmittel, Konsistenzgeber wie Zuckerester, Polyolester oder Polyolalkylether, Wachse, wie Bienenwachs und Montanwachs, Komplexbildner wie EDTA, NTA und Phosphonsäuren, Quell- und Penetrationsstoffe wie Glycerin, Propylenglykolmonoethylether, Carbonate, Hydrogencarbonate, Guanidine, Harnstoffe sowie primäre, sekundäre und tertiäre Phosphate, Perlglanzmittel wie Ethylenglykolmono- und -distearat, Treibmittel wie Propan-Butan-Gemische, N2O, Dimethylether, CO2 und Luft sowie Antioxidantien. Weitere übliche Bestandteile und die Zubereitung wasserhaltiger Kosmetika sind dem Fachmann bekannt und werden beispielsweise in Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Buch Verlag, Heidelberg, 2. Aufl., 1989, sowie in WO 2007/063024 und in WO 2006/136607 als kosmetisch geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe beschrieben.
Hierauf wird ausdrücklich Bezug genommen. Die Bestandteile der kosmetischen Träger werden zur Herstellung der erfϊndungsgemäßen Zusammensetzungen in für diese Zwecke üblichen Mengen eingesetzt, z. B. werden Emulgiermittel in Konzentrationen von 0,5 bis 30 Gew.-% und Verdickungsmittel in Konzentrationen von 0,1 bis 25 Gew.-% des gesamten Färbemittels eingesetzt.
Die erfϊndungsgemäßen Zusammensetzungen können unabhängig von der Art der kosmetischen Zubereitung z. B. als Creme, Gel oder Shampoo einen schwach sauren, neutralen oder alkalischen pH- Wert haben. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von 6 bis 8. Die Einstellung des pH- Wertes erfolgt mit Hilfe üblicher pH-Stellmittel, jedoch bevorzugt nicht mit Ammoniak oder anderen als schädlich angesehenen Chemikalien.
In einem bevorzugte Aspekt wird neben dem Hydrophobin und dem nichtpermanenten Farbstoff zusätzlich mindestens ein kosmetisch aktiver Inhaltsstoff, dessen Aufnahme und/oder Wirkung durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird, auf das Keratin aufgetragen. In diesem bevorzugte Aspekt enthalten entweder die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen neben entweder Hydrophobin oder nicht-permanentem Farbstoff oder neben einer Kombination der beiden genannten Inhaltsstoffe zusätzlich mindestens einen kosmetisch aktiven Inhaltsstoff, dessen Aufnahme und/oder Wirkung durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird, oder dieser kosmetisch aktive Inhaltsstoff wird separat (in Reinform oder als Bestandteil einer Zusammensetzung) aufgetragen.
Der zusätzliche kosmetisch aktive Inhaltsstoff ist bevorzugt hydrophil.
Bevorzugte kosmetisch aktive Inhaltsstoffe, deren Aufnahme durch Hydrophobin verbessert wird, sind in WO 2006/136607 als „Effektormoleküle" beschrieben, auf deren entsprechende Passagen hiermit ausdrücklich verwiesen wird.
In den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in einer Ausführung der vorliegenden Erfindung Effektormoleküle als kosmetisch aktive Inhaltsstoffe eingesetzt werden. Als Effektormoleküle werden im folgenden Moleküle verstanden, die eine bestimmte, vorhersehbare Wirkung aufweisen. Dies können entweder proteinartige Moleküle, wie Enzyme, oder auch nicht-proteinogene Moleküle wie Farbstoffe, Lichtschutzmittel, Vitamine und Fettsäuren, Zucker oder Metallionen-enthaltende Verbindungen sein.
Unter den Zuckern sind Glucane und insbesondere Zucker natürlichen Ursprungs, wie z.B. aus Honig oder Getreide, bevorzugt.
Unter den proteinartigen Effektormolekülen sind Enzyme, Peptide und Antikörper be-vorzugt.
Unter den Enzymen sind folgende als Effektormoleküle bevorzugt: Oxidasen, Peroxidasen, Proteasen, Tyrosinasen, metallbindende Enzyme, Lactoperoxidase, Lysozym, Amyloglycosidase, Glucoseoxidase, Superoxiddismutase, Photolyase, Calalase.
Gut geeignet als proteinartige Effektormoleküle sind auch Hydro lysate von Proteinen aus pflanzlichen und tierischen Quellen, beispielsweise Hydro lysate von Proteinen marinen Ursprungs, Milch- oder Seidenhydrolysate.
Besonders gut geeignet sind definierte Peptide, die zum Anti-Aging eingesetzt werden, wie Matrixyl (INCI Name Glycerin-Water-Butylene Glycol-Carbomer- Polysorbate 20-Palmitoyl Pentapeptide-4), Argireline (INCI Name Aqua, Acety- Hexapeptide-3), Rigin (INCI Name Water (and)-Glycerin (and) Steareth-20 (and)
Palmitoyltetrapeptide-7), Eyeliss (INCI Name Water-Glycerin-Hespiridin Methyl Chalcone-Steareth-20-Dipeptide-2-Palmitoyl Tetrapeptide-7) Regu-Age (INCI Name Oxido Reductases-Soy Peptides-Hydrolyzed Rice Bran Extract) und Melanostatin-5 (INCI Name Aqua-dextran-Nonapetide-1).
Unter den nicht-proteinartigen Effektormolekülen sind Nicht-Protein- Anti-Aging- Agents wie z.B. Koffein, und Antioxidantien als Effektormoleküle bevorzugt. Antioxidantien, die auch als Radikalfänger bezeichnet werden, sind in der Lage, sog. freie Radikale zu neutralisieren. Dies sind aggressive Verbindungen, die physiologischerweise bei zahlreichen Stoffwechselvorgängen und der
Energiegewinnung entstehen. Sie sind für Abwehrreaktionen des Körpers wichtig, können aber auch Schäden an der Erbsubstanz (DNA), den Zellmembranen und Körpereiweißen hervorrufen. Diese Schädigungen können zu vorzeitiger Gewebealterung, Gewebetod und Krebs führen. Zu den Antioxidantien zählen Carotinoide, Ascorbinsäure (Vitamin C, E 300) wie auch Natrium-L-Ascorbat (E 301) und Calcium-L-Ascorbat (E 302); Ascorbylpalmitat (E 304); Butylhydroxyanisol (E 320); Butylhydroxytoluol (E 321); Calcium-Dinatrium- EDTA (E 385); Gallat wie auch Propylgallat (E 310), Octylgallat (E 311) und Dodecylgallat (Laurylgallat) (E 312); Isoascorbinsäure (E 315) wie auch Natriumisoascorbat (E 316); Lecithin (E 322); Milchsäure (E 270); Mehrfach-
Phosphate wie Diphosphate (E 450), Triphosphate (E 451) und Polyphosphate (E 452); Schwefeldioxid (E 220) wie auch Natriumsulfit (E 221), Natriumbisulfit (E 222), Natriumdisulfϊt (E 223), Kaliumsulfit (E 224), Calciumsulfϊt (E 226), Calciumhydrogensulfϊt (E 227) und Kaliumbisulfit (E 228); Selen; Tocopherol (Vitamin E, E 306) wie auch Alpha-Tocopherol (E 307), Gamma-Tocopherol (E
308) und Delta-Tocopherol (E 309); Zinn-II-Chlorid (E 512); Zitronensäure (E 330) wie auch Natriumeitrat (E 331) und Kaliumeitrat (E 332); L-Gluthation, L-Cystein, Polyphenole, Phenolsäuren, Flavonoide, Phytoöstrogene, Gluthation und die antioxidativen Enzyme Superoxiddismutase, Glutathionperoxidase und Katalase.
Erfϊndungsgemäß wird als Antioxidans mindestens eine Verbindung aus der oben genannten Gruppe von Antioxidantien ausgewählt.
Weitere geeignete Effektormoleküle sind Carotinoide. Unter Carotinoiden sind erfϊn- dungsgemäß folgende Verbindungen zu verstehen: beta-Carotin, Lycopin, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin, Cryptoxanthin, Citranaxanthin, Canthaxanthin, Bixin, beta- Apo-4-carotinal, beta-Apo-8-carotinal, beta-Apo-8-carotinsäureester, einzeln oder als Mischung. Bevorzugt verwendete Carotinoide sind beta-Carotin, Lycopin, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin, Citranaxanthin und Canthaxanthin.
Unter Retinoide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Vitamin A Alkohol (Retinol) und seine Derivate wie Vitamin A Aldehyd (Retinal), Vitamin A Säure (Retinsäure) und Vitamin A Ester (z.B. Retinylacetat, Retinylpropionat und Retinylpalmitat) gemeint. Der Begriff Retinsäure umfasst dabei sowohl all-trans Retinsäure als auch 13 -eis Retinsäure. Die Begriffe Retinol und Retinal umfassen bevorzugt die all-trans Verbindungen. Als bevorzugtes Retinoid verwendet man all- trans-Retinol, im folgenden als Retinol bezeichnet.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind Vitamine, insbesondere Vitamin A, und deren Ester.
Vitamine sind essentielle organische Verbindungen, die entweder im tierischen und menschlichen Organismus nicht oder nur in unzureichenden Mengen synthetisiert werden. Aufgrund dieser Definition wurden 13 Komponenten oder Gruppen von Kompo-nenten als Vitamine klassifiziert. Zu den fettlöslichen Vitaminen gehören Vitamin A (Retinole), Vitamin D (Calciferole), Vitamin E (Tocopherole, Tocotrienole) und Vitamin K (Phylloquinone).
Zu den wasserlöslichen Vitaminen gehören Vitamin Bl (Thiamin), Vi-tamin B2 (Riboflavin), Vitamin B6 (Pyridoxalgruppe), Vitamin B 12 (Cobalamine), Vitamin C (L-Ascobinsäure), Panthotensäure, Biotin, Folsäure und Niacin.
Vitamine, Provitamine und Vitaminvorstufen aus den Gruppen A, C, E und F, insbesondere 3,4-Didehydroretinol, beta-Carotin (Provitamin des Vitamin A), Ascorbinsäure (Vitamin C), sowie die Palmitinsäureester, Glucoside oder Phosphate der Ascorbinsäure, Tocopherole, insbesondere a-Tocopherol sowie seine Ester, z.B. das Acetat, das Nicotinat, das Phosphat und das Succinat; weiterhin Vitamin F, worunter essentielle Fettsäuren, besonders Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure, verstanden werden.
Vitamin E ist ein Sammelbegriff für eine Gruppe von (bis heute) acht fettlöslichen Sub-stanzen mit antioxidativen und nicht-antioxidativen Wirkungen. Vitamin E ist Bestandteil aller Membranen tierischer Zellen, wird jedoch nur von photosynthetisch aktiven Organismen wie Pflanzen und Cyanobakterien gebildet. Vier der acht bekannten Vita-min E-Formen werden Tocopherole (alpha-Tocopherol, beta- Tocopherol, gamma-Tocopherol und delta-Tocopherol) genannt. Die anderen bisher bekannten vier Formen von Vitamin E werden Tocotrienole (alpha-Tocotrienol, beta- Tocotrienol, gamma-Tocotrienol und delta-Tocotrienol) genannt. Ferner können auch Derivate dieser Substanzen wie alpha-Tocopherylacetat vorteilhaft sein.
Vitamin A und seine Derivate und Provitamine zeigen vorteilhafterweise einen besonderen hautglättenden Effekt.
Zu den erfmdungsgemäß bevorzugt einzusetzenden Vitaminen, Provitaminen oder Vi-taminvorstufen der Vitamin B-Gruppe oder deren Derivaten sowie den Derivaten von 2-Furanon gehören unter anderem:
Vitamin Bl, Trivialname Thiamin, chemische Bezeichnung 3-[(4'-Amino-2'-methyl- 5 ' -pyrimidinyl)methyl] -5 -(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazo liumchlorid.
Vitamin B2, Trivialname Riboflavin, chemische Bezeichung 7,8-Dimethyl-10-(l-D- ribityl)-benzo[g]pteridin-2,4(3H,10H)-dion. In freier Form kommt Riboflavin z. B. in Mol-ke vor, andere Riboflavin-Derivate lassen sich aus Bakterien und Hefen isolieren. Ein erfmdungsgemäß ebenfalls geeignetes Stereoisomeres des Riboflavin ist das aus Fischmehl oder Leber isolierbare Lyxoflavin, das statt des D-Ribityl einen D-Arabityl-Rest trägt.
Vitamin B3. Unter dieser Bezeichnung werden häufig die Verbindungen Nicotinsäure und Nicotinsäureamid (Niacinamid) geführt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Nico-tinsäureamid.
Vitamin B5 (Pantothensäure und Panthenol). Bevorzugt wird Panthenol eingesetzt. Er-fmdungsgemäß einsetzbare Derivate des Panthenols sind insbesondere die Ester und Ether des Panthenols sowie kationisch derivatisierte Panthenole. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können zusätzlich zu Pantothensäure oder Panthenol auch Derivate des 2-Furanon eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Derivate sind die auch im Handel erhältlichen Substanzen
Dihydro-3-hydroxy-4,4-dimethyl-2(3H)-furanon mit dem Trivialnamen Pantolacton (Merck), 4-Hydroxymethyl-γ-butyrolacton (Merck), 3,3-Dimethyl-2-hydroxy-γ- butyrolacton (Aldrich) und 2,5-Dihydro-5-methoxy-2-furanon (Merck), wobei ausdrücklich alle Stereoisomeren eingeschlossen sind.
Vorteilhafterweise verleihen dies Verbindungen den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen feuchtigkeitsspendende und hautberuhigende Eigenschaften.
Vitamin B6, wobei man hierunter keine einheitliche Substanz, sondern die unter den Trivialnamen Pyridoxin, Pyridoxamin und Pyridoxal bekannten Derivate des 5 Hydro-xymethyl-2-methylpyridin-3-ols versteht.
Vitamin B7 (Biotin), auch als Vitamin H oder "Hautvitamin" bezeichnet. Bei Biotin handelt es sich um (3aS,4S, 6aR)-2-Oxohexahydrothienol[3,4-d]imidazol-4- valeriansäure.
Vitamin B9 und Vitamin B 12.
Erfindungsgemäß können geeignete Derivate von Vitaminen (Salze, Ester, Zucker, Nukleotide, Nukleoside, Peptide und Lipide) ebenfalls genutzt werden.
Auch Nukleinsäuren, wie DNA und RNA, können geeignete Effektormoleküle sein, z.B. als Feuchtigkeitsspender.
Als lipophile, öllösliche Antioxidantien aus dieser Gruppe sind Tocopherol und dessen Derivate, Gallussäureester, Flavonoide und Carotinoide sowie Butylhydroxytoluol/anisol bevorzugt. Als wasserlösliche Antioxidantien sind Aminosäuren, z. B. Tyrosin und Cystein und deren Derivate sowie Gerbstoffe, insbesondere solche pflanzlichen Ursprungs bevorzugt. Triterpene, insbesondere Triterpensäuren wie Ursolsäure, Rosmarinsäure, Betulinsäure, Boswelliasäure und Bryonolsäure.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind, bevorzugt niedrig dosierte, Fruchtsäuren (Alphahydroxysäuren) wie zum Beispiel Apfelsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Glykolsäure. Diese können in Konzentrationen von 0.1% bis 35%, bevorzugt 0.1% bis 10%, insbesondere 1% bis 10%, 1% bis 5% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung vorliegen.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind Harnstoff und Derivate davon, da diese die Kopfhaut pflegen können. Diese können in Konzentrationen von 0.1% bis 25%, bevorzugt 0.1% bis 10%, insbesondere 1% bis 10%, 1% bis 5% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung vorliegen. Harnstoff und seine Derivate sind dabei nicht gleichzusetzen mit Ammoniak, der in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren bevorzugt nicht zur Anwendung kommt.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind UV-Lichtschutzfilter, insbesondere die in WO 2006/136607 genannten UV-Filter.
Besonders bevorzugte derartige weitere kosmetisch aktive Inhaltsstoffe sind Keratin- Pflegestoffe und Hautpflegestoffe, insbesondere wasserlösliche Vitamine, Antioxidantien, UV-Filter, Glucane, Flavonoide, und Koffein.
Aus der Gruppe der wasserlöslichen Vitamine sind wiederum bevorzugt eines oder mehrere der Vitamine aus der Gruppe bestehend aus Vitamin C, Vitamin Bl, Vitamin B2, Niacin (Nicotinsäure, Vitamin B3), Pantothensäure und Panthenol (Vitamin B5), Vitamin B6, Biotin (Vitamin B7, Vitamin H), Vitamin B9 (Folsäure) und Vitamin B 12 oder deren Derivate.
Panthenol, Pantolacton, Nicotinsäureamid, Natriumascorbylphosphat, sowie Biotin sind erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt.
Aus der Gruppe der UV-Filter sind wasserlösliche UV-Filter bevorzugt, Uvinul MS 40, Uvinul P 25, Uvinul DS 49 und Z-COTE besonders bevorzugt, und Uvinul MS 40 und P 25 ganz besonders bevorzugt.
Aus der Gruppe der Antioxidantien sind Flavonoide, Phenolsäuren und Polyphenole bevorzugt.
Am meisten bevorzugt sind eine oder mehrere der kosmetisch aktiven Inhaltsstoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Panthenol, Ascorbinsäure und deren Derivate, wasserlösliche UV-Filter, Koffein.
Wässrige Extrakte von Früchten und Kräutern, also insbesondere Pflanzenextrakte, Fruchtextrakte oder Kräuterextrakte, wie z.B. aus Trauben, Limette, Grapefruit, Hafer, Weizen, Reis, Soja, Gingseng, Pefferminze etc., können ebenfalls Bestandteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sein.
Eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Kit (3). Dieser
Kit umfasst zwei separate kosmetische Zusammensetzungen, nämlich
(i) eine Zusammensetzung enthaltend ein Hydrophobin der Formel (I) wie oben beschrieben, und
(ii) eine Zusammensetzung enthaltend einen Farbstoff zur nicht-permanenten Färbung von Keratin wie oben beschrieben.
Die gleichzeitige Anwendung oder die Anwendung in der Reihenfolge (i)-(ü) der beiden Zusammensetzungen (i) und (ii) bewirkt eine Erhöhung der Farbintensität und/oder Farbbeständigkeit der Färbung im Vergleich zur alleinigen Anwendung der Zusammensetzung (ii).
In diesem Kit ist die Zusammensetzung (ii) bevorzugt ein konventionelles Färbemittel zur Tönung, semi- oder demipermanenten Färbung von Haaren.
In einem bevorzugten Aspekt enthält die Zusammensetzung (i) oder (ii) oder beide Zusammensetzungen im Kit zusätzlich mindestens einen kosmetisch aktiven Inhaltsstoff enthalten, dessen Aufnahme und/oder Wirkung durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird.
Alternativ oder zusätzlich kann der Kit auch eine weitere Zusammensetzung (iii) umfassen, die einen derartigen kosmetisch aktiven Inhaltsstoff enthält.
Einzelheiten zu den im Kit enthaltenen Stoffen, insbesondere zu bevorzugten Aspekten des Hydrophobins und des Farbstoffs, sind weiter oben beschrieben.
In Ausführungsform (4) wird Hydrophobin verwendet, um den Effekt einer nichtpermanenten Färbung von Keratin oder Keratin-haltigem Material zu verstärken. Das verwendete Hydrophobin ist dabei wie oben für die anderen Ausführungsformen beschrieben definiert. Auch der verwendete nicht-permanente Farbstoff ist wie oben definiert.
Einzelne Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Beispiele im Detail beschrieben. Diese Beispiele dienen lediglich der Illustration der Erfindung und dürfen nicht als Einschränkung des Gegenstands der Erfindung ausgelegt werden.
BEISPIELE
In den folgenden Beispielen wurden Standardmethoden zur Evaluierung von Haarfärbemitteln verwendet. Soweit nicht anderweitig angegeben, waren alle verwendeten Reagenzien von der höchstmöglichen kommerziell erhältlichen Reinheit und wurden alle kommerziell erhältlichen Haare, Tönungen, Reagentien, Geräte, Antikörper und Kits nach Herstellervorschrift verwendet.
Die in den Beispielen verwendeten Hydrophobine wurden gemäß der Beispiele aus Teil A der WO 2007/014897 hergestellt.
Die Sequenz des in den Beispielen verwendeten "Hydrophobin A" ist in der WO 2007/014897 unter SEQ ID NO: 19 und 20 angegeben. Bei diesen "Hydrophobin A" handelt es sich um das Hydrophobin dewA, das mit dem Protein yaad fusioniert wurde. Desweiteren enthält das Konstrukt noch eine Xa- Schnittstelle und einen His- tag (yaad-Xa-dewA-his).
Die Sequenz des in den Beispielen verwendeten "Hydrophobin B" ist in der WO 2007/014897 unter SEQ ID NO:25 und 26 angegeben. Bei diesen "Hydrophobin B" handelt es sich um das Hydrophobin dewA, das mit dem einem verkürztem Protein yaad fusioniert wurde. Desweiteren enthält das Konstrukt noch eine Xa-Schnittstelle und einen His-tag (yaad40-Xa-dewA-his).
Beispiel 1: Bindung an Haut 1 (qualitativ)
Es wurde ein visueller qualitativer Test entwickelt, um zu überprüfen, ob Hydrophobin an Haut bindet. Verwendete Lösungen: Blockierungslsg: DIG Wash+Bufferset 1585762 Boehringer MA (lOxLsg) in TBS verdünnt
TBS: 2OmM Tris; 15OmM NaCl pH 7,5 TTBS: TBS + 0,05% Tween20
Der erste Schritt ist der Transfer der äußeren Keratinschicht von der Haut auf einen stabilen Träger. Dazu wurde ein Klarsichtklebestreifen fest auf enthaarte menschliche Haut aufgebracht und wieder entfernt. Der Test kann direkt auf dem Klarsichtklebestreifen durchgeführt werden oder die anhaftende Keratinschicht durch
erneutes Aufkleben auf einen Glasobjektträger überführt werden. Der Nachweis von Bindung wurde wie folgt vorgenommen: zur Inkubation mit den verschiedenen Reagentien Transfer in ein
Falcongefäß - ggf. Zugabe von Ethanol zur Entfettung, Entfernung von Ethanol und
Trocknung der Objektträger
Ih bei Raumtemperatur inkubiert mit Blocking Puffer
2x 5 min gewaschen mit TTBS
1x 5 min gewaschen mit TBS - Inkubation mit dem zu testenden Hydrophobin (gekoppelt an tag - z.B.
His6, HA etc.) bzw. Kontrollprotein in TBS / 0,05% Tween 20 während 2-
4 h bei Raumtemperatur
Entfernung des Überstands
3x Waschen mit TBS - Ih bei Raumtemperatur Inkubation mit Monoclonal Anti-poly-Histidin
Antikörper, verdünnt 1 :2000 in TBS + 0,01% Blocking
2x 5min gewaschen mit TTBS
1x 5 min gewaschen mit TBS
Ih bei Raumtemperatur Inkubation mit Anti-Mouse IgG Alkalische- Phosphatase-Conjugate, verdünnt 1 :5000 in TBS + 0,01 % Blocking
2x 5 min gewaschen mit TTBS
1x 5 min gewaschen mit TBS
Zugabe von Phosphatasesubstrat (NBT-BCIP; Boehringer MA
1 Tablette/40 ml Wasser 2,5 min; Stopp: mit Wasser) - Optische Detektion des Farbniederschlages mit bloßem Auge oder im
Mikroskop. Ein blauer Farbniederschlag zeigt an, dass Hydrophobin an die Haut gebunden hat.
Die Bindung an Nägel kann analog ermittelt werden, indem die zu untersuchenden Hydrophobine direkt mit der Nageloberfläche inkubiert und entsprechend vermessen werden.
Beispiel 2: Bindung an Haut 2 (quantitativ)
Es wurde ein quantitativer Test entwickelt, mit dem sich die Haut-Bindungsstärke des Hydrophobins mit unspezifischen Proteinen vergleichen lässt (Abb. 2). Aus einem aufgetauten trockenem Stück Haut ohne Haare (human oder Schwein), wurde mit einem 5 mm Korkbohrer ein Stück herausgebohrt (bzw. bei einem Oberflächentest ein Stück Haut in ein Falcondeckel eingepasst). Die Hautprobe wurde dann auf eine Dicke von 2-3 mm gebracht um evt. vorhandenes Gewebe zu entfernen. Die Hautprobe wurde anschließend in ein Eppendorfgefäß (Protein- Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen (siehe auch Abbildung 2):
2x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Zugabe von 1 ml 1% BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen (900 rpm). Entfernung des Überstands - Zugabe von 100 μg Hydrophobin in PBS+0,05 % Tween 20; Inkubation 2 h bei Raumtemperatur und leichten Schwenkbewegungen (900 rpm). Entfernung des Überstands 3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA oder spezifischen KBD)-Antikörper mit Peroxidase Conjugate (1 :2000 in PBS
/ 0,05% Tween 20) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung (900 rpm) 3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Zugabe von Peroxidasesubstrat (ImI / Eppendorfgefäß; Zusammensetzung s.u.)
Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 1 :30 Minuten). Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen. - Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen.
Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzen):
0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig
Eine Steigerung der Absorption gegenüber einer Probe ohne Hydrophobin zeigt an, dass Hydrophobin an die Haut gebunden hat. Hintergrund siehe Bsp.3.
Analog kann auch die Bindung an Schleimhaut gemessen werden, indem man von Schleimhaut (beispielsweise menschlicher Mundschleimhaut) mittels eines
Klarsichtklebestreifens eine Probe entnimmt, die anschliessend auf Bindungswirkun^ untersucht werden kann.
Beispiel 3: Bindung an Haar (quantitativ)
Um die Bindungsstärke des Hydrophobins an Haar auch im Vergleich zu anderen Proteinen nachweisen zu können, wurde ein quantitativer Assay entwickelt (Abb. 2 in WO 2006/136607). Bei diesem Test wurde zunächst Haar mit Hydrophobin inkubiert und überschüssiges Hydrophobin abgewaschen. Anschließend wurde eine Antikörper-Peroxidase-Konjugat über das His-Tag des Hydrophobins gekoppelt. Nicht gebundene Antikörper-Peroxidase-Konjugat wurde erneut abgewaschen. Das gebundene Antikörper-Peroxidase-Konjugat [Mono-clonal Antipoly-Histidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] kann ein farbloses Substrat (TMB) in ein farbiges Produkt umsetzen, das photometrisch
bei 405 nm vermessen wurde. Die Stärke der Absorption zeigt die Menge an gebundenem Hydrophobin bzw. Vergleichsprotein an. Als Vergleichsprotein wurde z.B. YaaD aus B. subtilis gewählt, das ebenfalls - wie es für diesen Test nötig ist - ein His-Tag zur Detektion aufwies. Anstatt des His-Tag können auch andere, spezifische Antikörper konjugiert mit Peroxidase verwendet werden.
5 mg Haare (human) werden in 5 mm lange Stücke geschnitten und in Eppendorfgefäße (Protein-Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen: - Zugabe von 1 ml Ethanol zur Entfettung
Zentrifugation, Entfernung von Ethanol und Waschung der Haare mit
H2O
Zugabe von 1 ml 1% BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei
Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen. - Zentrifugation, Entfernung des Überstands
Zugabe des zu testenden Hydrophobins (gekoppelt an tag - z.B. HiS6, HA etc.) bzw. Kontrollprotein in 1 ml PBS / 0,05 % Tween 20; Inkubation für 16 h bei 4° C (oder mindestens 2 h bei Raumtemperatur) bei leichten Schwenkbewegungen. - Zentrifugation, Entfernung des Überstands
3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA)- Antikörper mit Peroxidase-Konjugat (1 :2000 in PBS / 0,05 % Tween 20) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung 3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20 Zugabe von Peroxidasesubstrat (1 ml / Eppendorfgefäß) Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 2 Minuten). - Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen.
Die Absorption wird bei 405 nm gemessen
Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzten):
0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig
BSA = Bovine serum albumin
PBS = Phosphat gepufferte Salzlösung
Tween 20 = Polyoxyethylene sorbitan monolaureate, n ca. 20
TMB = 3,5,3/5' Tetramethylbenzidin
Ein beispielhaft für Hydrophobin durchgeführter Bindungs-Test an Haar zeigte eine deutliche Überlegenheit der Bindung von Hydrophobin an Haar gegenüber einer wesentlichen schlechteren Bindung des Vergleichsproteins YaaD:
Tabelle 1 : Quantitativer Hydrophobin Aktivitäts-Test Haar: 1) Puffer; 2) Vergleichsprotein yaad; 3) Hydrophobin. Die Tabelle zeigt die gemessenen Absorptionswerte bei 405 nm.
Beispiel 4: Derivatisierung von Hydrophobin mit Farbstoff „Alexa" und Bindung an Haar
Eine Kopplung von Farbstoffen an Hydrophobine kann über die SH-Gruppen der Cysteine erfolgen. Vor Kopplung des Farbstoffes Alexa Fluor 532 werden die Disulfidbrücken des Hydrophobins gespalten:
Alexa Fluor 532
1 mg Hydrophobin
0,5 ml Puffer (75 mM Tris pH 8,0
2,5 mM EDTA 1 mM DTT)
Inkubation für 30 Minuten bei 37°C
Die Kopplung des Farbstoffes erfolgt nach Herstellerangaben (Alexa 532 Protein Labeling Kit; Molecular Probes; MP-A- 10236).
Die Beschichtung von human Haar mit Alexa-gekoppeltem Hydrophobin wird wie folgt durchgeführt:
10 mg human Haar mit 50 μg/ml Alexa-Hydrophobin bzw. Kontrollprotein yaad bzw. ungekoppeltem Farbstoff Alexa 532 in Puffer TBS 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren 2x waschen mit TBS/0,05% Tween 20 - Ix waschen mit TBS
Ix waschen mit TBS/1% SDS
Detektion im Fluoreszenzmikroskop (Abb. 4 der WO 2006/136607)
Beispiel 5: Verbesserte Aufnahme und Bindung der Farbstoffe von semipermanenten Haarfärbungen durch Hydrophobin-behandelte Haare
Es wurden in diesem Test Euro -Naturhaare blond der Firma Kerling International Haarfabrik GmbH, Deutschland, verwendet.
Es wurden handelsübliche Präparate (Stufe 2) zur semipermanenten Färbung von Haaren getestet, nämlich
- Londa, Londeston „Easy Colors 45, red flame", auswaschbar, hält laut Herstellerangaben 6-8 Haarwäschen (Stufe 2). Enthält die Farbstoffe Basic Red 76, HC Red No. 10, HC Red No.11, Basic Violet 2, Hydroxyethyl-2-nitro-p-to luidin.
- Schwarzkopf, Brillance Tönungscreme „T872 intensivrot", auswaschbar, zeigt laut Herstellerangaben „noch bis zu 90% Farbintensität nach 10 Wäschen" (Stufe 2).
Enthält die Farbstoffe HC Blue No.2, HC Yellow No.13, HC Yellow No.2, Hydroxyethyl-2-nitro-p-toluidin, 2-Amino-6-chloro-4nitrophenol, HC Blue No.12, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-nitro-p-phenylenediamine, Basic Blue 99, 4-Amino-3- nitrophenol, 4-Hydroxypropylamino-3-nitrophenol, 3-Nitro-p- hydroxyethylaminophenol, HC Blue No.11 , Basic Brown 17, HC Red No.1 , HC Red No.7, HC Red No.13, HC Orange No.l, Basic Violet No.2, HC Red No.3.
Die Tests wurden wie folgt durchgeführt:
1) Herstellung von Lösungen mit 0,00625 bis 0,2 Gew% „Hydrophobin A" oder „Hydrophobin B" (SEQ ID NOs:20 bzw. 26 in WO 2007/014897) in 50 mM NaH2PO4, pH 7.5. Die Lösungen wurden 1 h bei Raumtemperatur mit dem Magnetrührer gerührt.
2) Zusätzlich wurde eine Vergleichslösung ohne Hydrophobin hergestellt.
3) Inkubation der Haare für 1 h bei 32°C in den hergestellten Lösungen.
4) Variation (a): Weiterarbeit ohne Trocknen der Haare. Variation (b) Trocknen der Haare mit einem Fön bei 500C. 5) Auswaschen der Haare mit Trinkwasser und anschließendes Trocknen der Haare bei Raumtemperatur.
6) Anwendung der Haartönung nach Herstellerangaben.
7) Wiederholtes Waschen (1 Minute einschäumen, 1 Minute ausspülen, trocknen bei Raumtemperatur) mit einer Penaten Baby-Shampoolösung (1%), und anschließender visueller Beurteilung des Haars im getrockneten Zustand. Die Waschschritte wurden von 3- bis zu 8 -mal wiederholt.
Die Beurteilung des Haars erfolgte im Vergleich zu denjenigen Haaren, die mit der Vergleichslösung ohne Hydrophobin behandelt wurden. Besonders bei der Testvariante (b) konnte man bei den mit Hydrophobin A und B behandelten Haaren eine stärkere Farbintensität, die auf eine gegenüber dem mit Vergleichslösung behandelten Haar verstärkte Farb-Bindung und Farbstoffaufnahme schließen lässt, erkennen. Der Farbstoff blieb auch bei mehrmaligem Auswaschen länger im Haar erhalten als ohne Hydrophobin-Behandlung.
Bei Testvariante (a) war ebenfalls zu erkennen, dass der Farbstoff bei mehrmaligem Auswaschen länger im Haar erhalten blieb als ohne Hydrophobin.
Die Farbintensität war bei Testvariante (a) gegenüber den Vergleichslösung- behandelten Haaren ebenfalls erhöht.
Bei einem Test mit 8-mal Waschen und den Hydrophobin-Konzentrationen 0,2 Gew%, 0,1 Gew% und 0,05 Gew% war 0,05% die bessere Konzentration in Bezug auf das Färbeergebnis.
Bei einem Test mit 3-mal Waschen und den Hydrophobin-Konzentrationen 0,05 Gew%, 0,025 Gew% und 0,0125 Gew% war 0,025% die bessere Konzentration in Bezug auf das Färbeergebnis.
Bei einem Test mit 3-mal Waschen und den Hydrophobin-Konzentrationen 0,025 Gew%, 0,0125 Gew% und 0,00625 Gew% waren alle Färbeergebnisse mit Hydrophobin besser als ohne Hydrophobin.
Im Kontext der vorhergehenden Absätze bedeutet „besser", dass der Farbstoff bei mehrmaligem Auswaschen länger im Haar erhalten blieb und/oder dass die Farbintensität höher war als bei den Vergleichskonzentrationen. Meist waren beide Effekte zu beobachten.
Beispiel 6: Photometrische Bestimmung der Färbung
Es wurde in diesem Test vorgegangen wie in Beispiel 5 in der Variante mit Fönen. Verwendet wurde 0,1 Gew% „Hydrophobin B".
Die Hydrophobin B (SEQ ID NO:26 in WO 2007/014897)-behandelten und unbehandelten Haare wurden getönt mit L'Oreal Si-Naturelle Schaumtönung Nr. 01 (Zusammensetzung: Aqua, laureth-12, behentrimonium chloride, dimethyl ether, cetearyl alcohol, isobutane, glycol distearate, amodimethicone, butane, propane, HC red no.3, hydroxyethylcellulose, hydroxyanthraquinoneaminopropyl methyl morpholinium, methyosulfate, HC blue no.2, sodium lauryl sulfate, basic red 51, basic blue 99, trideceth-12, methylparaben, HC yellow no.9, cetrimonium chloride, butylparaben, ethylparaben, isobutylparaben, propylparaben, parfum).
Anschließend wurde das Haar getrocknet und die Haar-Farbintensität per Auge und mittels Minolta CR-300 und Process-Unit-Minolta DP-301 (Konica Minolta Sensing, Inc., Osaka, Japan) gemäß Herstellerangaben des Photometer-Herstellers (Bedienungsanleitung Chroma-Meter CR-300 / CR-310 / CR-331, Minolta, deutsche Version, Versionsnummer: 527 349/9.99) photometrisch bestimmt. Dazu wurden die Haare auf das Meßfeld des Photometers gelegt, so dass sie die ganze Breite des Meßfeldes bedeckten. Anschließend erfolgte die Farbmessung durch das Photometer. Bei Messung einer zweiten Haarprobe als Vergleich wurde der ΔE-Wert direkt durch das Photometer berechnet.
Ergebnis visuell: Es lässt sich erkennen, dass die Hydrophobin- vorbehandelten Haare intensiver gefärbt sind.
Ergebnis Photometer:
1) Farbmessung
Hydrophobin-behandelt unbehandelt
L* 35,68 40,66
a* + 28,45 + 22,17
b* + 19,49 + 17,45
Es lässt sich ein deutlicher Unterschied im L*a*b*-System nach CIE 1976 erkennen.
2) Farbdifferenzmessung zwischen Hydrophobin-behandeltem und unbehandeltem Haar:
ΔE = 5,15
ΔE ist ein Maß für den Farbabstand (synonym: Farbdifferenz) zwischen einer Probefarbe und einer Vergleichsfarbe, gemessen und berechnet nach CIE 1976,
DIN5033, DIN6174. Die ΔE-Werte wurden nach Herstellerangaben vollautomatisch durch das verwendete Photometer CR-300 gemäß der Bedienungsanleitung Chroma- Meter CR-300 / CR-310 / CR-331, Minolta, deutsche Version, Versionsnummer: 527 349/9.99 bestimmt.
Die ΔE-Werte liegen für wahrnehmbare Farbunterschiede in der Regel zwischen 2 und 5, bei sehr gutem Ergebnis oberhalb von 5, was einen mit bloßem Auge deutlichen Farbunterschied (das Vorliegen einer anderen Farbe) anzeigt (http://de.wikipedia.org/wiki/Delta_E):
ΔE Bewertung
0,0 ... 0,5 kein bis fast kein Unterschied
0,5 ... 1,0 Unterschied kann für das geübte Auge bemerkbar sein
1,0 ... 2,0 merklicher Farbunterschied 2,0 ... 4,0 wahrgenommener Farbunterschied
4,0 ... 5,0 wesentlicher Farbunterschied, der selten toleriert wird oberhalb 5,0 die Differenz wird als andere Farbe bewertet
Es ließ sich also eine deutliche Erhöhung der Farbdifferenz bei Verwendung von Hydrophobin feststellen.