EP2329036A1 - Modulateurs de fzd2 dans le traitement de l'alopecie - Google Patents

Modulateurs de fzd2 dans le traitement de l'alopecie

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Publication number
EP2329036A1
EP2329036A1 EP09747890A EP09747890A EP2329036A1 EP 2329036 A1 EP2329036 A1 EP 2329036A1 EP 09747890 A EP09747890 A EP 09747890A EP 09747890 A EP09747890 A EP 09747890A EP 2329036 A1 EP2329036 A1 EP 2329036A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
expression
gene
activity
alopecia
fzd2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09747890A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sandrine Rethore
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research and Development SNC filed Critical Galderma Research and Development SNC
Publication of EP2329036A1 publication Critical patent/EP2329036A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of modulator compounds of the transmembrane receptor F ⁇ zzled 2 (FZD2), for the treatment of alopecia. It also relates to methods for in vitro diagnosis or in vitro prognosis of this pathology.
  • FZD2 transmembrane receptor F ⁇ zzled 2
  • hair growth is cyclic and consists of three successive phases: the anagenous phase, the catagen phase and the telogen phase.
  • Each follicle of the hair is thus constantly renewed, cyclically and independently, to the adjacent follicles (Kligman 1959 , Montagna and Parakkal, 1974)
  • the phase anagene or phase of growth, during which the hair lengthen, lasts several years This phase recapitulates the morphogenesis of the hair and is divided into 7 different stages (anagene I to anagene VII) ( Muller-Rover et al, 2001)
  • the anagenic phase is generally reduced to three stages, each of which includes several early stages for stages I-III, anagenic medium for stages IV to V and late anagene for stages VI.
  • the catagen phase which follows the anagen phase is very short and lasts only a few weeks. This phase is divided into 8 different stages (catagene I to catagen VIII) (M uller-Rover et al, 2001) During this phase, the hair undergoes a revolution, the follicle atrophies and its dermal implantation appears more and more high.
  • the telogen phase which lasts a few months, corresponds to a period of rest follicle or hair eventually falls After this rest phase a new follicle is regenerated, on the spot, and a new cycle begins again (Montagna and Parakkal, 1974)
  • the hair follicles also have a cycle of renewal comprising the three phases anagen, catagen and telogene, cut into different stages.
  • the hair cycles of the young animals are often "synchronized". that is to say, in the same phase of the cycle at the same time in the sem of the same anatomical region (Muller-Rover et al, 2001)
  • the fall or natural loss of hair is a physiological phenomenon that occurs constantly and can be estimated, on average, a few hundred hairs a day for a normal physiological condition
  • alopecia Different causes can be the cause of alopecia
  • the main forms are •
  • hereditary androgenetic alopecia is the most common it is manifested by a decrease in the volume of the hair, even a baldness, and touches 70% of the men,
  • acute alopecia may be related to chemotherapy treatment, stress, severe nutritional deficiencies, iron deficiency, hormonal disorders, AIDS, acute radiation;
  • the hair loss is directly related to the hair cycle, the follicle no longer entering the anagen phase, or the anagen phase is not maintained, which implies that the follicle no longer produces hair shaft therefore more hair To fight against alopecia, it is necessary to restart the hair cycle by activating the anagen phase
  • the Applicant has now found that the gene encoding F ⁇ zzled 2 was expressed specifically in the keratmocytes of the hair follicle, and that its expression was induced at the time of entry into anagen, in vivo, in an induction model of entry in anagen by gonadectomy. It therefore proposes to target this gene or its expression product, to prevent or improve the phenomena of alopecia
  • Alopecia refers to all forms of alopecia, namely androgenetic alopecia, acute or areata
  • the F ⁇ zzled 2 gene (or "FZD2”) encodes a transmembrane protein serving as a receptor in the Wnt signaling pathway
  • the term "FZD2 gene” or “FZD2 nucleic acid” means the gene or nucleic acid sequence that encodes the FZD2 proteme. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention may also use cells expressing the Fnzzled 2 transmembrane receptor, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid encoding the receptor. transmembrane.
  • the human nucleic acid sequence (SEQ ID No. 1) and the human protein sequence (SEQ ID No. 2) of the transmembrane receptor FZD2 are reproduced in the appendix.
  • the Wnt signaling cascade is a pathway involved in cell proliferation and determination.
  • the cytoplasmic ⁇ -catemne protein associates with a destruction complex containing various proteins, axin, GSK-3 ⁇ kinase (Glycogen Synthase Kmase-3 ⁇ ) and APC (Adeomatosis Polyposis CoIi).
  • GSK-3 ⁇ kinase Glycogen Synthase Kmase-3 ⁇
  • APC Adeomatosis Polyposis CoIi
  • An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the evolution of alopecia in a subject, comprising comparing the expression or activity of Frizzled 2 (FZD2) protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a control subject
  • the expression of the protein can be determined by an assay of this FZD2 protein by an immunohistochemical test or immunoassay, for example by ELISA assay
  • Another method, in particular for measuring the expression of the gene is to measure the amount of corresponding mRNA, by any method as described above.
  • a dosage of the activity of the FZD2 transmembrane receptor may also be considered As part of a diagnosis, the subject "control" is a "healthy" subject
  • control subject refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of treatment (To).
  • This measure of the difference in expression or activity of the FZD2 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment, in particular treatment with a modulator of the transmembrane receptor FZD2 as contemplated above or by another treatment against alopecia. Such follow-up can reassure the patient of the appropriateness, or need, of continuing this treatment.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining a susceptibility of a subject to develop alopecia, comprising comparing the expression or activity of Fnzzled 2 protein (FZD2), expression of its gene or the activity of at least one of its promoters in a biological sample of a subject in relation to a control subject
  • FZD2 Fnzzled 2 protein
  • the expression of the protein can be determined by an assay of the FZD2 protein, by an immunohistochemical test or an immunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the gene is to measure the quantity corresponding mRNA by any method as described above
  • An assay of the activity of the FZD2 transmembrane receptor may also be envisaged
  • the tested subject is here an asymptomatic subject, having no hair disorder related to alopecia.
  • the subject "control”, in this method, means a "healthy” reference subject or population. Detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or an increased surveillance of the signs associated with the disease. alopecia.
  • the biological sample may test any sample of biological fluid or a sample of a biopsy
  • the sample may nevertheless be a preparation of skin cells obtained by example by hair removal or biopsy
  • Another object of the invention is an in vitro method for cabling candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of alopecia, comprising determining the ability of a compound to modulate the expression or activity of the alopecia.
  • Frizzled 2 transmembrane receptor (FZD2) or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters said modulation indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of alopecia.
  • the method therefore makes it possible to select compounds capable of modulating the expression or the activity of the transmembrane receptor FZD2, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
  • the invention relates to an in vitro method of c ⁇ blageing candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of alopecia, comprising the steps of: a preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the compounds to be tested; c measuring the expression or the activity of the FZD2 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures, the selection of compounds for which a modulation of the expression or the activity of the FZD2 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, is measured in the sample or the mixture treated in b )
  • “Modulation” means any effect on the level of expression or activity of the FZD2 transmembrane receptor, the expression of its gene or the activity of the FZD2 at least one of its promoters, namely possibly an inhibition, but preferably a stimulation, partial or complete
  • the compounds tested in step d) above preferably induce the expression or the activity of the FZD2 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
  • expression of a protein means the amount of that protein
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcnption of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding proteme)
  • the compounds tested can be of any type. They may be of natural origin or may have been produced by chemical synthesis. This may be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or undifferentiated substances, or a mixture of compounds.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the FZD2 gene, and step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • reporter The reporter gene may in particular encode an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase) II may The gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein) is also used.
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or of its activity is conventionally carried out, by colorimetric, fluorometric or multimiluminescence techniques, between other According to a second embodiment, the biological samples are cells expelling the gene coding for the transmembrane receptor FZD2, and step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It can be a cell expressing the FZD2 gene endogenously, such as for example a liver cell, a prostate cell, or even better a skin cell, keratinocytes. hair follicle or fibroblasts of the dermal papilla It is also possible to use organs of human or animal origin, such as for example hair, or hair follicles of vibnsses.
  • It may also be a cell transformed with a heterologous nucleic acid, encoding the transmembrane receptor FZD2, preferably human or mammalian.
  • a heterologous nucleic acid encoding the transmembrane receptor FZD2, preferably human or mammalian.
  • a wide variety of host cell systems may be used, such as, for example, 7, CHO, BHK, 3T3, HEK293.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to those skilled in the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
  • the expression of the FZD2 gene can be determined by measuring the transcription rate of said gene, or its rate of translation.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced by translation rate of a gene is understood to mean the amount of corresponding protein produced.
  • One skilled in the art is familiar with techniques for the quantitative or s quantitative mRNA of a gene of interest. The techniques based on the hybridization of mRNA with specific nucleotide probes are the most usual (Northern Blot, RT-PCR, Rnase protection). It may be advantageous to use detection markers, such as fluorescent agents. , radioactive, enzymatic or other drugs (eg avidme / biotin).
  • the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by protection with RNase.
  • protection with RNase is meant the detection of a known mRNA from poly (A) RNAs of a tissue which can be done using specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a complementary RNA (for example radioactive or enzymatic) mark of the messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage of RNA-poly (A) tissue or the sequence to be searched is incubated with this probe in slow hybridization conditions in a liquid medium.
  • RNA RNA hybrids are formed between the looking mRNA and the antisense probe.
  • the hybrid medium is then mcube with a mixture of single-stranded PARN-specific nbonucleases, so that only the hybrids formed with the probe can withstand this digestion. .
  • the digestion product is then deprotected and repurified, before being analyzed by electrophoresis.
  • the labeled hybrid RNAs are detected for example by autoradiography or cmmiolummescence.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • a polyclonal antibody anti-F ⁇ zzled 2 can, inter alia, be obtained by immunization of an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire protein The antiserum is removed and then exhausted by methods known per se by the skilled person.
  • a monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstem (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of making monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase, in a time or in two stages, in sandwich or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • solid phase it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays immunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general). In general, the proteins are isolated according to the methods known to those skilled in the art. prior to enzymatic digestion.
  • Peptide analysis in the form of hydrolyzate is carried out by peptide separation by HPLC (nano-HPLC) based on their physicochemical properties (reverse phase).
  • HPLC nano-HPLC
  • the determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art ( analysis in MALDI mode).
  • the proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot)
  • the transmembrane receptor FZD2 can be produced according to usual techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (e.g. E. coli or B. subtilis), yeasts (e.g. Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21. Modulators of the transmembrane receptor
  • alopecia is here described as a method of preventive and / or curative treatment of alopecia, comprising administering a therapeutically effective amount of a modulator of the transmembrane receptor FZD2 to a patient in need of such treatment.
  • modulators are activators (or inducers) of the transmembrane receptor FZD2
  • the invention comprises the use of FZD2 transmembrane receptor-inducing compounds, such as those identified by the screening method described above, for the preventive and / or curative treatment of alopecia.
  • the modulator compounds are formulated in the form of pharmaceutical compositions, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle. These compositions can be administered, for example, by the enteral, parenteral or topical route. Preferably, the pharmaceutical composition is applied topically orally.
  • pharmaceutical composition may be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polyme ⁇ que vesicles allowing controlled release
  • the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of the skin, the mucous membranes and the scalp and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels, sprays, lotions or suspensions It can also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid vesicles or polymeques or polymenic patches or hydrogels allowing controlled release
  • This composition for topical application can in a preferred form, the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion
  • the composition may comprise a modulator content of the Fnzzled 2 transmembrane receptor ranging from 0.001% to 10% by weight, especially from 0.01% to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as
  • UV-A and UV-B filters UV-A and UV-B filters
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquol or certain metal chelators.
  • Figure 1 illustrates the induction of passage to anagen by oophorectomy
  • Female mice whose hair follicles of the dorsal region were in telogen on Day 0, were subjected to ovanotomy or not (control) on day 1 of the study
  • a skin sample from the back region of the mice was taken on days 0 and 8 of the study.
  • Figure 1A represents a histological section of skin from the dorsal region of a mouse at day 0 of the study.
  • Figure 1B shows a histological section of skin from the dorsal region of an ovariectomized mouse at day 8 of the study.
  • Figure IC shows a histological section of skin from the dorsal region of a control mouse on Day 8 of the study Histological analysis clearly shows that ovariectomy induced anagen transfer (Figure IB)
  • FIG. 2 is a table which shows the modulation of the level of expression of the Fzd1 and Fzd2 receptors, as compared to Day 0 of the study, in the skin of the dorsal region of ova ⁇ ectomized mice at day 8 of the study and in the skin of the dorsal region of control mice (skin in telogenic phase) at day 8 of the study using the Affymetrix chip technology
  • Non-ovo-infected mice were retained as a control group.
  • a skin sample from the dorsal region of the sou ⁇ s was made on days 0 and 8 of the study.
  • RNAs were isolated and gene expression was analyzed by Affymetrix chip technology
  • Figure 3 shows the expression of the Fzd2 receptor in the skin of sou ⁇ s at the beginning of anagene and late anagen by in situ hybridization.
  • Figure 3A is the photograph of the black-field image of a section of mouse skin in anagen. early subject to hybridization m situ Using an antisense probe of Fzd2, the histological structures marked radioactively by the probe are revealed by the accumulation of luminous points (silver grams).
  • Figure 3B is the photograph of the same section histology of skin of mouse in early anagene counter-stained with Phematoxylin
  • FIG. 3C is the photograph of the dark-field image of a slice of late-agar mouse skin subjected to in situ hybridization using an Fzd2 antisense probe, the histological structures radiolabeled by the probe are revealed by the accumulation of light spots (silver gram)
  • Figure 3D is the photograph of the same section histology of mouse skin in late anagen contrasted with hematoxylin
  • FIG. 4 is a graph which shows the modulation of the level of expression of the Fzd1, Fzd2 and Fzd6 receptors in the dorsal region of mmoxidil treated telogen souks, expressed with respect to the level of expression in the mouse dorsal region.
  • telogen processed by ethanol vehicle Male sou ⁇ s, whose hair follicles in the dorsal region were in telogen, were treated with absolute ethanol or 25% mmoxidil in absolute ethanol
  • a sample of the skin of the dorsal region of the mice was performed 6 hours, 24 hours and 48 hours after the treatment
  • the RNAs were isolated and gene expression was analyzed by kRT PCR technology
  • Example 1 Expression of Fzd1 and Fzd2 during ovarianectomy-induced anagen entry by Affymetrix chip technology.
  • telogen Chase, 1954
  • Ovariectomy performed during the telogen phase causes within a week a massive entry of hair follicles from the dorsal region in the anagen phase (Chanda, 2000) whereas the hair follicles of the dorsal region of the control animals are still in telogen
  • Skin samples were taken in the dorsal region at 0, 6 and 8 of the study A part of the sample was used to confirm the passage to anagen by histological analysis. The other part of the sample was used to perform a transcnptome analysis by Affymet ⁇ x chip technology
  • RNAs isolated from the tissues are transcribed into cDNA from double-stranded cDNA, the biotin-labeled cRNAs are synthesized using T7 polymerase and a biotin-conjugated NTP precursor. The cRNAs are then fragmented into fragments. small sizes All Molecular biology steps are controlled using Agilent's "Lab on a chip” system to confirm the efficacy of enzymatic reactions.
  • the Affymetrix chip is hybridized with biotinyl, ⁇ ncee and subsequently fluorescently labeled cRNA using a conjugated fluorophore. After Streptavidme After different washes, the chip is scanned and the results are calculated using the MAS5 software provided by Affymetrix. An expression value is obtained for each gene as well as an indication of the presence or absence of the value obtained. The calculation of the sigmficativity of the expression is based on the analysis of the signals which are obtained following the hybridization of a cRNA of a given gene with a perfect match oligonucleotide versus an oligonucleotide which contains a mutation ("single mismatch") in the central region of the oligonucleotide
  • the histological analysis shows that the hair follicles of the dorsal region of the skin of the sou ⁇ s are in the telogenic phase (IA)
  • IA the hair follicles of the dorsal region of The skin follicles are in the early phase of the anagen (IB)
  • IB the hair follicles of the dorsal skin region of the control mice remain in the telogenic phase.
  • the ovanectomy induced the transition of the telogen phase to the anagen phase
  • the anagen phase is proven by histological analysis at day 8 of the study
  • the Fzdl and Fzd2 receptors are expressed in the telogenic phase and in the anagen phase of the hair cycle
  • Sense and antisense probes were prepared from the Sox4 transcription factor by incubation of the linearized gene (2 ⁇ g) with 63 ⁇ Ci of [ 35 S] UTP (1250 Ci / mmol, NEN, Massachusetts, USA) in the presence of RNA.
  • T7 or T3 polymerase In situ hybridization was performed on formaldehyde fixed tissue and wrapped in paraffin. Sections (4 ⁇ m wide) were then deparaffined in toluene and rehydrated in an alcohol gradient after drying.
  • the images (A to B) show hair follicles of back skin of sou ⁇ s at the beginning of anagen.
  • the images (C to D) show hair follicles of mouse back skin in anagenic environments.
  • Figure 3A shows that the Fzd2 receptor is expressed in the skin of mice Transcripts are specifically present at the level of hair follicles at the beginning of anagen More specifically, Fzd2 is present in keratmocytes in contact with the dermal papilla
  • Figure 3C shows that the Fzd2 receptor is expressed by specific way in hair follicles in anagenic media More specifically, Fzd2 is present in the internal epithelial game of hair follicles
  • mice with hair follicles in the dorsal region were treated with 50 ⁇ l ethanol mmoxidil 25% Minoxidil 25% treatment during the telogen phase causes rapid follicle entry hair of the dorsal region in anagen phase compared to control animals
  • Graph 1 shows that the Fzd1 receptor and, more particularly, the Fzd2 receptor are induced 24 hours after the minoxidil treatment. From 48 h, the level of expression of the Fzd1 and Fzd2 receptors returns to the level of expression in the skin of the control individuals. The Fzd6 receptor is induced 6 hours after the minoxidil treatment.
  • Example 1 shows that the Fzd1 and Fzd2 genes are expressed in the skin and induced during anagen entry.
  • Example 2 emphasizes that the Fzd2 gene is specifically expressed in hair follicle keratinocytes in anagen.
  • Example 3 indicates that treatment with minoxidil induces the expression of Fzd1, Fzd6 and more particularly Fzd2.

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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur transmembranaire Frizzled 2 (FZD2), ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de ce récepteur transmembranaire pour le traitement de l'alopécie. L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de cette pathologie.

Description

Modulateurs de FZD2 dans le traitement de l'alopécie
L'invention concerne 1 identification et l'utilisation de composes modulateurs du récepteur transmembranaire Fπzzled 2 (FZD2), pour le traitement de l'alopécie Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic m vitro ou pronostic m vitro de cette pathologie
Chez l'être humain, la croissance des cheveux est cyclique et comporte trois phases successives la phase anagene, la phase catagene et la phase telogene Chaque follicule de la chevelure se renouvelle donc en permanence, de façon cyclique et indépendante aux follicules adjacents (Kligman 1959, Montagna et Parakkal, 1974) La phase anagene ou phase de croissance, au cours de laquelle les cheveux s'allongent, dure plusieurs années Cette phase recapitule la morphogenese du cheveux et est divisée en 7 différentes stades (anagene I a anagene VII) (Muller-Rover et col , 2001) Pour simplifier, la phase anagene est généralement réduite a trois étapes qui regroupent chacune plusieurs stades précoce pour les étapes I-III, milieu d'anagene pour les étapes IV a V et anagene tardive pour les étapes VI et VII La phase catagene qui succède a la phase anagene est très courte et ne dure que quelques semâmes Cette phase est divisée en 8 différentes stades (catagene I a catagene VIII) (Muller- Rover et col , 2001) Au cours de cette phase, le cheveu subit une mvolution, le follicule s'atrophie et son implantation dermique apparaît de plus en plus haute La phase telogene, qui dure quelques mois, correspond a une peπode de repos du follicule ou le cheveu finit par tomber Apres cette phase de repos un nouveau follicule est régénère, sur place, et un nouveau cycle recommence (Montagna et Parakkal, 1974)
A chaque instant, tous les cheveux ne sont pas dans la même phase au même moment Ainsi, sur les 150 000 cheveux environ que comporte une chevelure, seuls 10% d'entre eux environ sont au repos et seront donc remplaces en quelques mois selon une horloge biologique propre a chaque cheveu (Montagna, 1974)
Chez la souris et les autres mammifères a fourrures, les follicules pileux possèdent également un cycle de renouvellement comportant les trois phases anagene, catagene et telogene, découpées en différents stades Par contre, les cycles pilaires des jeunes animaux sont souvent « synchronises », c'est-a-dire dans la même phase du cycle au même moment au sem d'une même région anatomique (Muller-Rover et col , 2001)
La chute ou perte naturelle des cheveux est un phénomène physiologique qui se produit en permanence et peut être estimée, en moyenne, a quelques cent cheveux par jour pour un état physiologique normal Cependant, il arrive que le cycle pilaire puisse se dérégler et que la chute des cheveux s'accelere et conduise a une perte temporaire ou définitive des cheveux appelée alopécie Différentes causes peuvent être a l'origine d'une alopécie II existe différentes types d'alopécie, les formes principales sont •
• l'alopécie androgénétique héréditaire est la plus fréquente elle se manifeste par une diminution du volume des cheveux, voire une calvitie, et touche 70% des hommes ,
• l'alopécie aiguë • elle peut être liée à un traitement par chimiothérapie, un stress, des carences alimentaires importantes, une carence en fer, des troubles hormonaux, au sida, une irradiation aiguë ;
• l'alopécie Areata qui semble être d'oπgine auto-immune (mécanisme de médiation cellulaire) qui se caractérise par une atteinte en "patch" plus ou moins gros et à un ou plusieurs endroits Cette forme de pelade peut atteindre toute la tête et on parle d'alopécie Totalis et parfois l'ensemble du corps c'est l'alopécie Universalis et dans ce cas il n'y a plus aucun poil ni cheveu sur l'ensemble du corps
Dans tous ces trois cas, la chute des cheveux est en relation directe avec le cycle pilaire, le follicule n'entrant plus dans la phase anagene, ou la phase anagène n'étant pas maintenue, ce qui implique que le follicule ne produit plus de tige pilaire donc plus de cheveux Pour lutter contre l'alopécie, il est donc nécessaire de relancer le cycle pilaire en activant la phase anagene
On recherche ainsi depuis de nombreuses années, dans l'industrie cosmétique ou pharmaceutique, des compositions permettant de supprimer ou de réduire l'alopécie, et notamment d'induire ou de stimuler l'entrée en phase anagene ou la croissance des cheveux
La demanderesse a maintenant trouvé que le gène codant pour Fπzzled 2 était exprimé spécifiquement dans les keratmocytes du follicule pileux, et que son expression était induite au moment de l'entrée en anagène, m vivo, dans un modèle d'induction de l'entrée en anagène par gonadectomie. Elle propose dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'alopécie
Par alopécie, on entend toutes les formes d'alopécie, à savoir notamment les alopécies androgénétiques, aiguë ou areata
FZD2
Le gène Fπzzled 2 (ou "FZD2") code pour une protéine transmembranaire servant de récepteur dans la voie de signalisation Wnt
Dans le contexte de l'invention, le terme « gène FZD2 » ou « acide nucléique FZD2 » signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la proteme FZD2. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel a des cellules exprimant le récepteur transmembranaire Fnzzled 2, par intégration genormque ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour le récepteur transmembranaire. La séquence nucléique humaine (SEQ ID No 1) et la séquence proteique humaine (SEQ ID No .2) du récepteur transmembranaire FZD2 sont reproduites en annexe
FZD2 est connu pour jouer un rôle important dans la cascade de signalisation Wnt. La cascade de signalisation Wnt est une voie impliquée dans la prolifération et la détermination cellulaire. En absence de signal Wnt, la protéine cytoplasmique β- catemne s'associe avec un complexe de destruction contenant diverses protéines, l'axine, la kinase GSK-3β (Glycogen Synthase Kmase-3β) et l'APC (Adeomatosis Polyposis CoIi). Par fixation sur ce complexe, la β-caténme est phosphorylee et ubiquitinée, ce qui entraîne sa dégradation. La fixation de Wnt à la surface de son récepteur Frz (Frizzled) entraîne l'activation de la protéine Dsh (Dishevelled) qui inhibe le complexe de destruction (Barker et Clevers, 2000, Reya et Clevers, 2005) Les protéines de β-caténine s'accumulent dans le cytoplasme et sont transloquées dans le noyau, ou elles agissent comme des co-activateurs transcπptionnels du facteur TCF (aussi connu comme le Lymphoid Enhancer Factor, LEF) (Bienz et Clevers, 2003) La voie Wnt est impliquée dans le développement des annexes tegumentaires (plumes poils glandes) mais joue également un rôle au court du cycle pilaire. L'expression spécifique de FZD2 dans les keratinocytes du poil et son induction au cours de l'entrée en anagene suggère qu'il joue un rôle important dans Fhomeostasie du follicule pileux.
Applications diagnostiques
Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Frizzled 2 (FZD2), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine FZD2 par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut Un dosage de l'activité du récepteur transmembranaire FZD2 peut être également envisage Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain »
Dans le cadre d'un suivi de l'évolution de l'alopécie, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet a un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To) Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine FZD2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du récepteur transmembranaire FZD2, tel qu'envisage plus haut ou par un autre traitement contre l'alopécie. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou a la nécessite, de poursuivre ce traitement. Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Fnzzled 2 (FZD2), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport a un sujet contrôle
Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine FZD2, par un test îmmunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut Un dosage de l'activité du récepteur transmembranaire FZD2 peut être également envisage
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble capillaire lié à une alopécie. Le sujet « contrôle », dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine » La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes lies a l'alopécie.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic m vitro, l'échantillon biologique teste peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par épilation de cheveux ou biopsie
Méthodes de criblage
Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de cπblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur transmembranaire Frizzled 2 (FZD2) ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l' utilité du compose pour le traitement préventif ou curatif de F alopécie La méthode permet donc de sélectionner les composes capables de moduler l'expression ou l'activité du récepteur transmembranaire FZD2, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de cπblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de F alopécie, comprenant les étapes suivantes : a préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composes à tester ; c mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine FZD2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels , d sélection des composes pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine FZD2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traite en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traite Par « modulation », on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité du récepteur transmembranaire FZD2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une inhibition, mais de préférence une stimulation, partielle ou complète
Ainsi, les composes testes a l'étape d) ci-dessus induisent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine FZD2, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;
Par « activité d'une proteme », on entend son activité biologique ;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcnption de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la proteme correspondante)
Les composes testes peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir ete produits par synthèse chimique II peut s'agir d'une banque de composes chimiques structurellement définis, de composes ou de substances non caractérises, ou d'un mélange de composes
Différentes techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composes et identifier les composes d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du récepteur transmembranaire FZD2.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lie de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène FZD2, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste a mesurer l'expression dudit gène rapporteur Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransferase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase) II peut également s'agir du gène de la luciferase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein) Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimetnques, fluorométnques, ou de cmmioluminescence, entre autres Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules expnmant le gène codant pour le récepteur transmembranaire FZD2, et l'étape c) décrite ci- dessus consiste a mesurer l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type II peut s'agir d'une cellule exprimant le gène FZD2 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule de prostate, ou encore mieux une cellule de la peau, des kératinocytes du follicule pileux ou des fïbroblastes de papille dermique On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple des cheveux, ou des follicules pileux de vibnsses
II peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour le récepteur transmembranaire FZD2, de préférence humaine ou de mammifère Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène FZD2 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite L'homme du métier est familier avec les techniques permettant la détection quantitative ou s emi- quantitative de FARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybndation de l'ARNm avec des sondes nucleotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT- PCR, protection a la Rnase) II peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres hgands (par exemple, avidme/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection a la RNase Par protection a la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire a l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marque (par exemple radioactif ou enzymatique) du messager a rechercher. Elle peut être construite a partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été clone dans un phage De l'ARN-poly(A) du tissu ou la séquence est à rechercher est incube avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybndes ARN:ARN entre l'ARNm recherche et la sonde antisens Le milieu hybride est alors mcube avec un mélange de nbonucleases spécifiques de PARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formes avec la sonde peuvent résister a cette digestion. Le produit de digestion est ensuite deprotemisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse Les ARN hybrides marqués sont détectes par exemple par autoradiographie ou cmmiolummescence. Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-Fπzzled 2 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de la protéine entière L' antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues par l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstem (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli).
Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène, en un temps ou en deux temps, en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des immunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale) De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement a la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) base sur leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi sépares est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectrometre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot)
Le récepteur transmembranaire FZD2 peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Il peut également être produit à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. Modulateurs du récepteur transmembranaire
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du récepteur transmembranaire FZD2 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la préparation d'un médicament destine au traitement préventif et/ou curatif de l' alopécie II est ainsi decπt ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie méthode comprenant l'administration d'une quantité therapeutiquement efficace d'un modulateur du récepteur transmembranaire FZD2, a un patient nécessitant un tel traitement
De préférence de tels modulateurs sont des activateurs (ou inducteurs) du récepteur transmembranaire FZD2
L'invention comprend 1 utilisation de composes inducteurs du récepteur transmembranaire FZD2, tels que ceux identifies par la méthode de criblage decπte plus haut, pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie
Les composes modulateurs sont formules au sem de compositions pharmaceutiques, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie enterale, parenterale, ou topique De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimes, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'emulsions, de suspensions de microspheres ou nanospheres ou de vésicules lipidiques ou polymeπques permettant une libération contrôlée Par voie parenterale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau, des muqueuses et du cuir chevelu et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibes, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microspheres ou nanospheres ou de vésicules lipidiques ou polymeπques ou de patchs polymenques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une emulsion Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion
La composition peut comprendre une teneur en modulateur du récepteur transmembranaire Fnzzled 2 allant de 0,001 a 10 % en poids, notamment de 0,01 a 5 % en poids par rapport au poids total de la composition La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que
- des agents mouillants,
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
- des agents stabilisants,
- des agents régulateurs d'humidité,
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique,
- des agents émulsioimants;
- des filtres UV-A et UV-B ,
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocopherol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, I'Ubiqumol ou certains chelatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée
Légende des figures :
La Figure 1 illustre l'induction du passage en anagène par ovariectomie Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovanotomie ou non (contrôle) au jour 1 de l'étude Un prélèvement de la peau de la région du dos des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. La Figure IA représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris au jour 0 de l'étude. La Figure IB représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris ovariectomisée au jour 8 de l'étude. La Figure IC représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris contrôle au jour 8 de l'étude L'analyse histologique montre clairement que l 'ovariectomie a induit le passage en anagène (Figure IB)
La Figure 2 est un tableau qui présente la modulation du niveau d'expression des récepteurs Fzdl et Fzd2, expπmes par rapport au Jour 0 de l'étude, dans la peau de la région dorsale de souris ovaπectomisees au jour 8 de l'étude et dans la peau de la région dorsale de souris contrôle (peau en phase telogene) au jour 8 de l'étude par utilisation de la technologie des puces Affymetrix Des souπs femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en telogene au Jour 0, ont ete soumises a une ovariotomie au jour 1 de l'étude Des souris non ovanectomisees ont ete conservées pour servir de groupe contrôle. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souπs a ete effectue aux jours 0 et 8 de l'étude. Les ARN ont ete isoles et l'expression des gènes a ete analysée par la technologie des puces Affymetrix
La Figure 3 montre l'expression du récepteur Fzd2 dans la peau de souπs en début d'anagene et anagène tardive par hybridation in situ La Figure 3A est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en anagène précoce soumise à une hybridation m situ utilisant une sonde anti-sens de Fzd2, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grams argentés). La Figure 3 B est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagene précoce contre-coloree a Phematoxyline
La Figure 3C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en anagène tardive soumise a une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens de Fzd2, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grams argentés) La Figure 3D est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène tardive contre-colorée a l'hématoxyline
La Figure 4 est un graphique qui présente la modulation du niveau d'expression des récepteurs Fzdl, Fzd2 et Fzd6 dans de la région dorsale de souπs en telogene traitées par mmoxidil , exprimes par rapport au niveau d'expression dans de la région dorsale de souris en télogène traitées par le véhicule éthanol Des souπs mâles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène, ont été traitées par de l'éthanol absolu ou mmoxidil à 2 5% dans de l'ethanol absolu Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a ete effectue 6 heures, 24 heures et 48 heures après le traitement Les ARN ont ete isoles et l'expression des gènes a ete analysée par la technologie de kRT PCR
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression de Fzdl et Fzd2 au cours de l'entrée en anagène induite par l'ovariectomie par la technologie des puces Affymetrix.
Méthodes :
Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en telogene (Chase, 1954) ont ete ovanectomisees ou non au jour 1 de l'étude L'ovariectomie pratiquée pendant la phase telogene provoque sous une semaine une entrée massive des follicules pileux de la région dorsale en phase anagene (Chanda, 2000 ) alors que les follicules pileux de la région dorsale des animaux contrôles sont toujours en telogene Des prélèvements de peau ont ete realises dans la région dorsale aux jours 0, 6 et 8 de l'étude Une partie du prélèvement a été utilisé pour confirmer le passage en anagène par analyse histologique. L'autre partie du prélèvement a été utilisé pour réaliser une analyse du transcnptome par la technologie des puces Affymetπx
L'expression des gènes a été analysée sur une station Affymetrix (module micro fluidique, four à hybndation, scanner, ordinateur) en suivant les recommandations du fournisseur. En résume, les ARN totaux isolés des tissus sont transcrits en ADNc A partir d'ADNc double brin, les ARNc marques a la biotme sont synthétises en utilisant la polymerase T7 et un précurseur NTP conjugué à la biotine Les ARNc sont ensuite fragmentes en fragments de petites tailles Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système « Lab on a chip » d'Agilent pour confirmer la bonne efficacité des reactions enzymatiques La puce Affymetrix est hybπdee avec l'ARNc biotinyle, πncee et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugue a la Streptavidme Apres différents lavages, la puce est scannee et les résultats sont calcules en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la présence ou l'absence de la valeur obtenue Le calcul de la sigmficativite de l'expression est base sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite a l'hybridation de 1 ARNc d'un gène donne avec un oligonucleotide hybπdant parfaitement (« perfect match ») versus un oligonucleotide qui contient une mutation (« single mismatch ») dans la région centrale de l' oligonucleotide
Résultats: Figure 1 :
En début d'étude au jour 0, l'analyse histologique montre que les follicules pileux de la région dorsale de la peau des souπs sont en phase telogene (IA) Chez les souris soumises a une ovanectomie, les follicules pileux de la région dorsale de peau sont en début de phase anagene (IB) A l'inverse, les follicules pileux de la région dorsale de peau des souris contrôles (non ovanectomisees) sont restes en phase telogene Ainsi, l' ovanectomie a induit la transition de la phase telogene a la phase anagene La phase anagene est avérée par l'analyse histologique au jour 8 de l'étude
Figure 2 :
Les récepteurs Fzdl et Fzd2 sont exprimes en phase telogene et en phase anagene du cycle pilaire
L'analyse différentielle entre l'expression au stade telogene a (JO) et anagene (J8 ovanectomise) montre que l'expression des transcrits des gènes Fzdl et Fzd2 est induite en anagene précoce par rapport au stade telogene, alors que chez les souris contrôles, l'expression de ces récepteurs n'est pas induite par rapport au début d'étude
Exemple 2 : Expression de Fzd2 dans la peau de souris par « hybridation in situ »
Méthodes :
Des sondes sens et antisens ont ete préparées a partir du facteur de transcription Sox4 par incubation du gène linéarisé (2μg) avec 63 μCi de [35S]UTP (1250 Ci/mmol , NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymerase T7 ou T3 L'hybridation in situ a ete réalisée sur un tissu de souπs fixe au formaldehyde et enveloppe dans de la paraffine Des sections (4μm de large) ont ensuite ete deparaffmees dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool Apres séchage, les différentes sections ont ete incubées dans un tampon de prehybπdation pendant deux heures L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de prehybπdation avec 1OmM DTT et 2X106 cpm ARN/μl 35S marque) a 53°C L'excès de sonde a ete élimine et les coupes ont ete inclinées dans une emulsion photographique LMl (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir a 4°C pendant au moins un mois Les coupes ont alors ete développées et contre-colorees avec de l'hematoxyhne et de l'eosme Suite a l'incubation en présence d'une emulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés) Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 4B et Figure 5B) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 3A et Figure 4A) utilisé comme contrôle négatif
Résultats: Figure 3
Les images (A a B) montrent des follicules pileux de peau de dos de souπs en début d'anagene Les images (C a D) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en milieux d'anagene La Figure 3A montre que le récepteur Fzd2 est exprime dans la peau de souris Les transcrits sont spécifiquement présent au niveau des follicules pileux en début d'anagene Plus particulièrement, Fzd2 est présent dans les keratmocytes au contact de la papille dermique La Figure 3C montre que le récepteur Fzd2 est exprime de façon spécifique dans les follicules pileux en milieux d'anagene Plus particulièrement, Fzd2 est présent dans la game epithehale interne des follicules pileux
Exemple 3 : Mise en évidence de l'activité de minoxidil sur l'expression de Fzdl, Fzd2 et Fzd6 dans la peau de souris par la technologie des kRT-PCR (Applied Biosysteni). Méthodes :
Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en telogene ont ete traitées avec 50 μl d'ethanol mmoxidil 2 5% Le traitement par minoxidil 2 5% pendant la phase telogene provoque une entrée rapide des follicules pileux de la région dorsale en phase anagene par rapport aux animaux contrôles
Des prélèvements de peau ont ete réalises dans la région dorsale aux temps 6 h, 24 h et 48 h de l'étude
L'expression des gènes a ete analysée par kRT-PCR en suivant les recommandations du fournisseur (Applied Biosystem) En résume, les ARN totaux isoles des tissus sont transcrits en ADNc Les ADNc sont incubes avec des pπmers spécifiques pour les gènes de Fzdl, Fzd2 et Fzd6 qui ont ete obtenus auprès d'Apphed Biosystem La kRT-PCR se déroule selon les conditions recommandées par le fournisseur Chaque point a ete fait en duphcate et chaque valeur de Ct a ete normalisée par rapport au Ct du gène 18S Pour chaque temps le niveau d'expression est calcule par rapport au niveau d'expression chez les individus contrôles Résultats: Figure 4
Le graphique 1 montre que le récepteur Fzdl et, plus particulièrement, le récepteur Fzd2 sont induit 24 h après le traitement minoxidil. A partir de 48 h, le niveau d'expression des récepteurs Fzdl et Fzd2 revient au niveau d'expression dans la peau des individus contrôles. Le récepteur Fzd6 est induit 6h après le traitement minoxidil.
Conclusion:
L'exemple 1 montre que les gènes Fzdl et Fzd2 sont exprimés dans la peau et induits au cours de l'entrées en anagène. L'exemple 2 souligne que le gène Fzd2 est exprimé de façon spécifique dans les kératinocytes des follicules pileux en anagène L'exemple 3 indique que le traitement par minoxidil induit l'expression des Fzdl, Fzd6 et plus particulièrement Fzd2.
L'ensemble de ces travaux permet de soutenir l'utilisation de modulateurs de l'expression des récepteurs Fzd, et plus particulièrement Fzd2, chez l'Homme pour obtenir une stimulation de la croissance des follicules pileux en induisant l'entrée en phase anagène. Egalement, ils soutiennent l'intérêt de l'utilisation des récepteurs Fzd, et plus particulièrement du récepteur Fzd2, pour diagnostiquer ou prognostiquer cette pathologie.

Claims

REVENDICATIONS
Méthode in vitro de cnblage de composes candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé a moduler l'expression ou l'activité de Fnzzled 2 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs
Méthode m vitro de cnblage de composes candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie selon la revendication 1 comprenant les étapes suivantes a Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges reactionnels , b Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges reactionnels avec un ou plusieurs des composés a tester , c Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine Fnzzled 2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges reactionnels , d Sélection des composes pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la proteme Fnzzled 2, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traite en b) par rapport a l'échantillon ou au mélange non traite
Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composes sélectionnes a l'étape d) activent l'expression ou l'activité de la proteme Fnzzled 2, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs
Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractensee en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectees avec un gène rapporteur lie de manière opérante a tout ou partie du promoteur du gène codant pour le récepteur transmembranaire Fnzzled 2, et en ce que l'étape c) consiste a mesurer l'expression dudit gène rapporteur
Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractensee en ce que les échantillons biologiques sont des cellules expnmant le gène codant pour le récepteur transmembranaire Fnzzled 2, et en ce que l'étape c) consiste a mesurer l'expression dudit gène Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont choisies parmi les keratinocytes et les fibroblastes de la papille dermique ou du derme
Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour le récepteur transmembranaire Frizzled 2
Méthode selon l'une des revendications 2 a 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène
Méthode selon l'une des revendications 2 a 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène
Utilisation d'un modulateur du récepteur transmembranaire Frizzled 2 susceptible d'être obtenu selon l'une des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie.
Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le modulateur est un activateur du récepteur transmembranaire Frizzled 2.
Utilisation cosmétique d'un modulateur du récepteur transmembranaire Frizzled 2 pour le traitement esthétique du cuir chevelu.
Méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Frizzled 2, ou de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport a un échantillon biologique d'un sujet contrôle
Méthode selon la revendication 13, dans laquelle l'expression de la protéine est déterminée par un dosage de cette protéine par un îmmunoessai.
Méthode selon la revendication 14, dans laquelle l'immunoessai est un dosage ELISA.
Méthode selon la revendication 13, dans laquelle l'expression du gène est déterminée par mesure de la quantité d'ARNm correspondant
Méthode m vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Frizzled 2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
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