EP2114997A2 - Gene mit einem einzigen exon, für neue bioaktive peptide kodierend - Google Patents

Gene mit einem einzigen exon, für neue bioaktive peptide kodierend

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EP2114997A2
EP2114997A2 EP07856590A EP07856590A EP2114997A2 EP 2114997 A2 EP2114997 A2 EP 2114997A2 EP 07856590 A EP07856590 A EP 07856590A EP 07856590 A EP07856590 A EP 07856590A EP 2114997 A2 EP2114997 A2 EP 2114997A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amino acid
seq
polypeptide chain
acid sequence
dna
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07856590A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eva Jung
Werner Dittrich
Sabine Scheidler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi Aventis France
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Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis France filed Critical Sanofi Aventis France
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the present invention relates to a novel bioactive peptide hormone, a process for producing the same and the use thereof.
  • the present invention identified a novel bioactive peptide precursor and salts thereof known as
  • Drugs for example, therapeutic polypeptides, ligands for characterizing relevant targets (eg GPCR) or targets for drug intervention.
  • the present invention relates to a novel bioactive peptide hormone, a process for producing the same and the use thereof. More particularly, the present invention relates to a method of identifying bioactive peptide hormones derived from precursor proteins and useful as therapeutic polypeptides, drug intervention targets, ligands for characterizing relevant targets (eg, GPCR dephosphaning), or biomarkers for disease surveillance ,
  • Peptide hormones are produced as precursors in various cell types and organs such as glands, neurons, intestines, brain, etc. Peptide hormones are generally synthesized as larger precursors or prohormones, and may undergo a series of post-translational modifications during transport through the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. They are processed and transported to their final destination, where they act as agents (First Messenger) to trigger cell reactions by binding to receptors on the cell surface.
  • Physiological processes that are important in many areas of biomedical research, such as diabetes (insulin), blood pressure regulation (angiotensin), anemia (erythropoietin- ⁇ ), Multiple sclerosis (interferon /?) And others.
  • Gene prediction usually refers to a field of bioinformatics that deals with the identification of sequences, usually genomic DNA, with biological functions using algorithms. These include in particular protein-coding genes, but other functional elements, such as RNA genes and regulatory regions, can also be detected. Gene prediction is one of the first and most important steps in understanding the genome of a species after its sequencing.
  • the target genome is screened for sequences similar to extrinsic indicia in the form of the known sequence of a messenger RNA (mRNA) or a protein product. It is crucial to deduce a unique genomic DNA sequence from which a given mRNA sequence has been transcribed. With a particular protein sequence, a set of possible coding DNA sequences can be deduced by reverse translation of the genetic code. Once a DNA sequence candidate is determined, it is only a matter of algorithm to efficiently examine a target genome for full or partial, exact or inexact hits.
  • BLAST is a widely used system developed for this purpose.
  • a high similarity with a known messenger RNA or a protein product is in many cases a good indication that a region of a target Genome is a gene coding for a protein.
  • a systematic use of this approach requires comprehensive sequencing of mRNA and protein products. Not only is this expensive, but in complex organisms only a portion of all genes in the genome of the organism are expressed at any one time, which means that in a single-cell culture, an extrinsic indication is not readily available for many genes.
  • To collect extrinsic evidence for most or all genes of a complex organism hundreds or thousands of different cell types need to be studied, which poses further difficulties. For example, some human genes can only be expressed during development in the embryo or fetus.
  • transcript and protein sequence databases have been generated for humans as well as other biology-important model organisms, such as mice and yeasts.
  • the RefSeq database contains transcript and protein sequences from many different species, and the Ensemble system maps these signs comprehensively to human and several other genomes.
  • ab initio gene prediction in which only one genomic DNA sequence is systematically screened for certain telltale signs of protein-encoding genes. These signs can be broadly classified as either signals, specific sequences that indicate the presence of a nearby gene, or content, statistical properties of the protein coding sequence itself.
  • Ab initio gene prediction can be described more accurately as a gene prophecy because extrinsic clues are generally required to convincingly demonstrate the viability of a putative gene.
  • the splicing mechanisms used in eukaryotic cells means that a particular protein coding sequence in the genome is subdivided into several parts (exons) separated by non-coding sequences (introns). Spliced sites, in turn, are signals identified by numerous eukaryotic gene prediction programs.
  • a typical human gene encoding human genes may be subdivided into as many as twelve exons, each less than two hundred base pairs in length, some of which may be as short as twenty or thirty. Thus, periodicities and other known content characteristics of the protein-encoding DNA of eukaryotes are much more difficult to recognize.
  • Advanced gene prediction programs for both prokaryotic and eukaryotic genomes typically resort to complex probability models, such as hidden Markov models
  • the mica system is a widely used and particularly accurate gene prediction program for prokaryotes.
  • eukaryotic ab initio gene prediction programs have had limited success; a renewed exception here is the program GENSCAN.
  • the present invention identified novel bioactive peptide hormone precursors by the identification of novel genes with a single exon responsible for
  • Encode peptide hormone precursor sequences To find new genes with a single exon, the human genome (NCBI 33 assembly, July 1, 2003) and the mouse genome (NCBI 30 assembly, July 1, 2003) were translated into all six reading frames using normal genetic code. There were only such Sequence fragments selected that started with the amino acid methionine and had a length of 50 to 200 amino acids. The human and murine sets were compared using the BLAST program to find closely related sequences in both organisms. Only sequences were selected that appeared in both organisms (human and murine). For the screening of secreted proteins, potential signal sequences were predicted using the SignalP program and the absence of potential membrane permeation regions was confirmed using the TMHMM program.
  • peptide hormones are characterized by their high specificity and efficacy in very low concentrations. Another characteristic of peptide hormones is that their corresponding mRNA is expressed in small numbers in specific tissues. An abundant expression pattern for peptide hormones is rarely observed in mammalian systems.
  • Bioactive peptide hormones are of paramount importance to biomedical research and therefore of interest to the pharmaceutical industry.
  • Various Peptide hormones are used to treat diseases.
  • WO2004039956 discloses several bioactive polypeptide sequences, reference is not made to identification methods and the use of such sequences.
  • the present invention identified novel genes encoding bioactive peptide hormone precursors.
  • Peptide hormones are characterized by their high specificity and their efficacy in very low concentrations. bioactive
  • Peptide hormones are of paramount importance to biomedical research. Various peptide hormones are used to treat diseases or to monitor disease states. Such polypeptide sequences can be used in therapeutically effective amounts as drugs and drugs for immune disorders.
  • the problem can be defined as the identification of novel hormone polypeptide sequences useful for the treatment of human disease.
  • the present invention solves this problem by providing eight novel peptide hormone precursors and fragments thereof which are useful for impairing physiological factors which increase the risk of arteriosclerosis, inflammation or uncontrolled cell division.
  • the invention provides a novel inventory of hormonal polypeptides useful in the treatment of human diseases in the field of biomedical research.
  • the present invention thus relates to a polypeptide chain which consists of an amino acid sequence according to SEQ ID Nos. 1-8 or an amino acid sequence resulting therefrom by deletion, substitution or insertion of at least one
  • Amino acid residue is derived, the amide or ester or a salt of the peptide consists.
  • One embodiment of the present invention relates to a polypeptide chain consisting of the following amino acid sequence:
  • Another embodiment of the present invention relates to a polypeptide consisting of the following amino acid sequence: MPKWRLAWPKQTRASSCGLSLPSISCASSCSASRNGGDRCSLRTTTTRHTR
  • An embodiment of the invention further provides a DNA comprising a nucleotide base sequence of SEQ ID NOs: 9-16 which encodes a polypeptide chain having an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1-8 or its amide, ester or salt including thereof.
  • This invention relates to a DNA consisting of a nucleotide base sequence according to SEQ ID NO: 9 which encodes a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or its amide, ester or a salt thereof.
  • the present invention relates to a DNA consisting of a nucleotide base sequence according to SEQ ID NO: 10 which encodes the polypeptide chain described in paragraph 1, which consists of an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or their amide, ester or a salt thereof.
  • a further embodiment of the present invention relates to a DNA consisting of a nucleotide base sequence according to SEQ ID NO: 11 which encodes a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence according to SEQ ID NO 3 or its amide, ester or a salt thereof.
  • Another embodiment of the present invention relates to a DNA consisting of a nucleotide base sequence according to SEQ ID NO: 12, which encodes a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 4 or its amide, ester or a salt thereof.
  • Another embodiment of the present invention relates to a DNA consisting of a nucleotide base sequence according to SEQ ID NO: 13, which encodes a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 5 or its amide, ester or a salt thereof.
  • a further embodiment of the present invention relates to a DNA which consists of a nucleotide base sequence according to SEQ ID No. 14 which encodes a polypeptide chain which consists of an amino acid sequence according to SEQ ID No. 6 or its amide, ester or a salt thereof.
  • Another embodiment of the present invention relates to a DNA consisting of a nucleotide base sequence according to SEQ ID NO: 15 which encodes a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 7 or its amide, ester or a salt thereof.
  • a further embodiment of the present invention relates to a DNA which consists of a nucleotide base sequence according to SEQ ID No. 16 which encodes a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence according to SEQ ID No. 8 or its amide, ester or a salt thereof.
  • the present invention relates to a method of producing a polypeptide, the method comprising the step of providing the amino acid, synthesizing the amino acid by solid phase or liquid phase synthesis, extracting the polypeptide, purifying the polypeptide.
  • the present invention also provides a process for producing the peptide, precursor or salt thereof, which comprises subjecting an amino acid or an amino-terminated peptide and an amino acid or a peptide with terminal carboxyl of a condensation, optionally followed by intramolecular disulfide bridge formation.
  • An embodiment of the invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active ingredient a polypeptide chain or a precursor or a pharmaceutically acceptable amide, ester or salt thereof, wherein the polypeptide chain consists of an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-8.
  • the present invention also relates to the use of a pharmaceutical
  • a composition comprising as active ingredient a polypeptide chain or a precursor or a pharmaceutically acceptable amide, ester or salt thereof, said polypeptide chain consisting of an amino acid sequence as shown in SEQ ID NOs: 1-8 and as therapeutic polypeptides, drug intervention targets, ligands to characterize relevant targets, biomarkers to monitor diseases.
  • the invention also provides the use of a peptide, precursor or salt of the invention in the manufacture of an agent for the treatment or prevention of cardiovascular disease, hormone-producing tumors
  • a hormone secretion inhibitor comprising at least one of the amino acid sequences defined in SEQ ID Nos. 1 to 8.
  • An embodiment of the invention also produces an antibody for a polypeptide chain according to paragraph 1, which comprises an amino acid sequence according to SEQ ID Nos. 1-8 or their amide, ester or salts thereof.
  • An antibody of the invention may also be used to detect a polypeptide of the invention present in a sample, such as a body fluid or tissue. It can also be used for the production of an antibody column for purifying a polypeptide according to the invention, for the detection of an inventive
  • polypeptides in each fraction during purification or analysis of the behavior of a polypeptide of the invention in a test cell.
  • polypeptide as used herein is to be understood to refer to any polymer consisting of covalently linked amino acids, which term also includes parts and fragments of full length proteins, such as For example, peptides, oligopeptides and shorter peptide sequences, which consist of at least 2 amino acids, in particular at least about 5 amino acid residues or more.
  • polypeptide includes all moieties containing one or more amino acids linked via peptide bonds. Moreover, within its scope, the term includes polymers of modified amino acids, including amino acids, post-translationally, for example, by chemical modification, including, but not limited to, glycosylation, phosphorylation, acetylation and / or sulfation reactions that effectively alter the basic peptide backbone were modified. Accordingly, a polypeptide may be derived from a naturally occurring protein and, in particular, it may be derived from a full length protein by chemical or enzymatic cleavage with reagents such as CNBr, or proteases such as trypsin or chymotrypsin, among others.
  • polypeptides may be derived by chemical synthesis using known peptide synthesis techniques.
  • amino acid sequence variants referred to herein as polypeptide variants. These may contain one or more, preferably conservative, amino acid substitutions, deletions or insertions in a naturally occurring amino acid sequence, leaving at least one essential property of the polypeptide, such as its biological activity, unchanged.
  • polypeptides can be synthesized by chemical polypeptide synthesis. Conservative amino acid substitutions are well known in the art. For example, one or more amino acid residues of a native protein may be conservatively substituted with an amino acid residue of similar charge, size or polarity, with the resulting polypeptide retaining full functionality as described herein.
  • conservative amino acid substitutions are those that are generally take place within an amino acid family, which are related via their side chains.
  • substitutions within each group are alternatives which have substitution of aspartate by glutamate or of threonine by serine or of any other amino acid residue by an amino acid residue having a related structure in general a negligible effect on the function of the polypeptide formed.
  • polypeptide includes amino acid sequence variants which are an unnatural modification such as, but not limited to, protection,
  • polypeptide includes a peptide whose biological activity is predictable because its amino acid sequence corresponds to a functional domain. Also included within the term “polypeptide” is a peptide whose biological activity is not predictable by analysis of its amino acid sequence.
  • An amino acid is any molecule that contains both a functional amino group and a functional carboxyl group.
  • An amino acid residue is the residue of an amino acid after loss of a water molecule (an H + from the nitrogen side and an OH from the carboxyl side) in the formation of a peptide bond, the chemical bond linking amino acid monomers to a protein chain.
  • Each protein has its own unique amino acid sequence known as its primary structure. Just as the letters of the alphabet can be put together in various ways to form an infinite variety of words, amino acids can interact with each other to form a vast variety be linked by proteins to different sequences. The unique form of each protein determines its function in the body.
  • a precursor is a substance from which another, normally more active, or more mature substance is formed.
  • a protein precursor is an inactive protein (or peptide) that can be converted into the active form by a post-translational modification.
  • the designation of a precursor of a protein often begins with pro or prepro. Precursors are often used by an organism when the actual protein poses a potential hazard but must be available within a short time and / or in large quantities.
  • polypeptide of the invention has hormonal activity.
  • polypeptides, precursors or salts of the invention are useful as drugs, for example, as a therapeutic polypeptide, as a ligand for characterizing relevant targets (e.g., GPCR), as targets for
  • Drug interventions eg targets for monoclonal antibodies or the like, receptor fragments
  • biomarkers for disease surveillance in combination with instrumental antibodies for detection of peptide fragments in body fluids
  • protein kinase inhibitors and substrates as protein kinase inhibitors and substrates
  • T cell epitopes as Peptide mimotopes of receptor binding sites, as a biomarker for the determination of the expression level.
  • the DNA encoding the peptide or precursor of the present invention is useful as, for example, an agent for gene therapy or for the treatment or prevention of cardiovascular disease, hormone-producing tumors, diabetes, gastric ulcer and the like, hormone secretion inhibitor, tumor growth inhibitor, neural Activity etc. useful. Further, the DNA of the present invention is useful as a means of genetically diagnosing diseases such as cardiovascular disease, hormone-producing tumors, diabetes, gastric ulcer and the like.
  • a vector is a vehicle for delivery of genetic material, such as DNA, to a human Cell.
  • DNA itself can be considered as a vector, for example, especially when used for cell transformation.
  • a vector in this sense is a DNA construct, such as a plasmid or an artificial bacterial chromosome, that contains an origin of replication.
  • An appropriate origin of replication causes a cell to copy the construct along with the chromosomes of the cell and deliver it to their offspring.
  • a single cell so transformed with a vector multiplies into a whole cell culture in which all contain the vector as well as each gene that was bound to it in the construct. Since the constructs can be extracted from cells by purification techniques, transformation with a vector provides the opportunity to multiply a small number of DNA molecules.
  • a vector may be an E.
  • coli -derived plasmid eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmid e.g., pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmid e.g. B. pSH19, pSH15
  • bacteriophage such as the [Iambda] phage
  • animal virus such as a retrovirus, vaccine virus, baculovirus, and the like.
  • the antibodies for the peptide according to the invention, the precursor according to the invention or the salt according to the invention can specifically recognize the peptide according to the invention, the precursor according to the invention or the salt according to the invention. It may also be used to prepare an antibody column for purifying a polypeptide of the invention, for detecting a polypeptide of the invention in each fraction during purification, or for analyzing the behavior of a novel polypeptide in a test cell. Thus, it can be used to assay the peptide of the present invention or its equivalent in test solutions.
  • SignalP Version 2.0 Task This program was used to detect potential signal sequences using a 0.98 cutoff score.
  • SignalP version 2.0 predicts the presence and location of signal peptide cleavage sites in the amino acid sequences of different organisms: the method contains a cleavage site prediction and a signal peptide / non-signal peptide prediction based on a combination of several artificial neural networks and hidden Markov models.
  • TMHMM version 2.0 is used to predict transmembrane helices in proteins. Predicted TM segments in the n-terminal region sometimes turn out to be signal peptides.
  • This program was used to detect potential cleavage sites in protein sequences. It was used with a score of 0.09. The program predicts arginine and lysine propeptide cleavage sites in eukaryotic protein sequences using a neural network ensemble. The default is a furin-specific prediction. It is also possible to make a general prediction for Proprotein Convertase (PC). The program is integrated with the SignalP program and predicts the presence and location of signal peptide cleavage sites.
  • PC Proprotein Convertase
  • InterPro is a database of protein families, domains, and functional sites, where identifiable features of known proteins can be applied to unknown protein sequences.
  • InterProScan is the program used to compare amino acid sequences with the InterPro database becomes.
  • the Basic Local Alignment Search Tool finds regions of local similarity between sequences.
  • the program compares nucleotide or protein sequences with sequences in the database and determines the statistical significance of matches.
  • BLAST can be used to elucidate functional and evolutionary relationships of sequences and to identify members of gene families.
  • BLAST uses Karlin-Altschul statistics to determine the statistical significance of the generated orders.
  • the basic algorithm can be implemented in a variety of ways and used in a variety of environments, including straightforward database searches in DNA and protein sequences, motif searches, gene identification searches, and analysis of multiple similar regions in long DNA sequences. In addition to the flexibility and formability of mathematical analysis, BLAST is an order of magnitude faster than existing sequence comparison tools of comparable sensitivity.
  • the biological role of the hormone peptides according to the invention was investigated by means of expression profile studies (FIGS. 1 to 6). It has been shown that the hormone peptides differ depending on the respective sequence in different tissues. The differential expression of hormone peptides of the invention in various tissues is considered to be a good indication of their important biological role. Adjustment of the concentration of one or more of the hormone peptides of the invention by increasing or decreasing the amount of such hormone peptides could have a pronounced effect on the treatment of a disease in which there is a need for lower or higher concentration of one or more of such hormone peptides (e.g., heart - Circulatory disease, metabolic disease, mental illness, cancer, by one Virus, a bacterial or a yeast-induced infection and others).
  • a disease e.g., heart - Circulatory disease, metabolic disease, mental illness, cancer, by one Virus, a bacterial or a yeast-induced infection and others.
  • Tissue expression analysis was performed using TaqMan gene expression analyzes.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Quantitative PCR is used to rapidly determine the amount of a PCR product (preferably in real time) and thus is an indirect method for quantifying the initial levels of DNA, cDNA or RNA. This is commonly used to determine the presence or absence of a sequence and, if present, the number of copies in a sample.
  • RNA samples of the tissues to be tested Various suppliers purchased RNA samples of the tissues to be tested.
  • Products for cDNA were purchased from Applera, reverse transcriptase kit (N8080234), RNase inhibitor (N8080119).
  • the cDNA synthesis was performed with 10 ⁇ g of RNA.
  • PCR Products for PCR were purchased from Applera. For each reaction, TaqMan Universal PCR Master Mix (4305719) was used. Target Forward Primer, Target Reverse Primer or Target Probe, labeled FAM on each gene (see Primer Sequence Table).
  • the PCR was performed using ABI Phsm 7900 (Applera) under the following PCR conditions: 2 minutes at 50 0 C, 10 minutes at 95 0 C, 40 cycles of 95 0 C for 15 s, and 1 min at 60 0 C.
  • the PCR was designed as a multiplex PCR with B2M as an endogenous control for normalization.
  • Fig. 1 shows the mRNA expression profile of AC105940 on ATAQ 1 for SEQ ID NO: 1
  • Fig. 2 shows the mRNA expression profile of AC005291 on ATAQ 1 for SEQ ID NO: 3
  • Fig. 3 shows the mRNA expression profile of AC090617 on ATAQ 1 for SEQ ID NO: 4
  • Fig. 4 shows the mRNA expression profile of AC114684 on ATAQ 1 for SEQ ID NO: 5
  • Fig. 5 shows the mRNA expression profile of AC063920 on ATAQ 1 for SEQ ID NO: 7
  • Fig. 6 shows the mRNA expression profile of AC074389 on ATAQ 1 for SEQ ID NO: 8
  • Fig. 7 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • Fig. 8 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • Fig. 9 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • Fig. 10 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • Fig. 11 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • Fig. 12 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • Figure 13 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • Figure 14 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • Figure 15 shows the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9
  • Figure 16 shows the nucleotide sequence of SEQ ID NO Fig. 17: shows the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11
  • Fig. 18 shows the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12
  • Fig. 19 shows the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13
  • Fig. 20 shows the nucleotide sequence of SEQ ID No. 14
  • Fig. 21 shows the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15
  • Fig. 22 shows the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16
  • Fig. 23 shows the nucleotide probe sequence of SEQ ID NO: 1
  • Fig. 24 shows the nucleotide forward primer sequence of SEQ ID NO: 1
  • Fig. 25 shows the nucleotide reverse primer sequence of SEQ ID NO: 1.
  • 1 Figure 26 shows the nucleotide probe sequence of SEQ ID NO: 2
  • Figure 27 shows the nucleotide forward primer sequence of SEQ ID NO: 2
  • Figure 28 shows the nucleotide reverse primer sequence of SEQ ID NO: 2
  • Figure 29 shows the nucleotide probe sequence of SEQ ID NO: 3
  • Figure 30 shows the nucleotide forward primer sequence of SEQ ID NO: 3
  • Figure 31 shows the nucleotide reverse primer sequence of SEQ ID No. 3
  • Fig. 32 shows the nucleotide probe sequence of SEQ ID NO: 4
  • Fig. 33 shows the nucleotide forward primer sequence of SEQ ID NO: 4
  • Fig. 34 shows the nucleotide reverse primer sequence of SEQ ID NO: 4
  • Fig. 35 shows the nucleotide probe sequence of SEQ ID NO: 4.
  • 5 Figure 36 shows the nucleotide forward primer sequence of SEQ ID NO: 5
  • 37 shows the nucleotide reverse primer sequence of SEQ ID NO: 5
  • 38 shows the nucleotide probe sequence of SEQ ID NO: 5
  • Fig. 39 shows the nucleotide forward primer sequence of SEQ ID NO: 6
  • Fig. 40 shows the nucleotide reverse primer sequence of SEQ ID NO: 6
  • Fig. 41 shows the nucleotide probe sequence of SEQ ID # 7 Fig.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues bioaktives Peptidhormon, ein Verfahren zur Herstellung desselben und die Verwendung desselben. Die vorliegende Erfindung identifizierte einen neuen bioaktiven Peptidvorläufer und Salze davon, die als Arzneimittel verwendbar sind, zum Beispiel therapeutische Polypeptide, Liganden zum Charakterisieren relevanter Targets (z. B. GPCR) oder Targets für Arzneimittelinterventionen.

Description

Gene mit einem einzigen Exon, die für neue bioaktive Peptide kodieren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues bioaktives Peptidhormon, ein Verfahren zur Herstellung desselben und die Verwendung desselben. Die vorliegende Erfindung identifizierte einen neuen bioaktiven Peptidvorläufer und Salze davon, die als
Arzneimittel verwendbar sind, zum Beispiel therapeutische Polypeptide, Liganden zum Charakterisieren relevanter Targets (z. B. GPCR) oder Targets für Arzneimittelinterventionen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues bioaktives Peptidhormon, ein Verfahren zur Herstellung desselben und die Verwendung desselben. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von bioaktiven Peptidhormonen, die von Vorläuferproteinen abgeleitet sind und die als therapeutische Polypeptide, Targets für Arzneimittelinterventionen, Liganden zum Charakterisieren relevanter Targets (z. B. GPCR-Deorphaning) oder Biomarker zur Überwachung von Krankheiten verwendbar sind.
Zahlreiche biologisch aktive Peptide haben entweder durch die Wachstumsstimulierung, die Wachstumshemmung oder die Regulierung kritischer Stoffwechselwege weitreichende Einflüsse auf sowohl die Gesundheit als auch Krankheiten.
Peptidhormone werden als Vorläufer in verschiedenen Zelltypen und Organen, wie Drüsen, Neuronen, Darm, Gehirn usw. produziert. Peptidhormone werden im Allgemeinen als größere Vorläufer oder Prohormone synthetisiert und können während des Transports durch das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat eine Reihe von posttranslationalen Modifikationen erfahren. Sie werden bearbeitet und zu ihrem endgültigen Bestimmungsort transportiert, wo sie als Wirkstoffe (First Messenger) das Auslösen von Zellreaktionen bewirken, indem sie an Rezeptoren an der Zelloberfläche binden. Bei physiologischen Prozessen, die für zahlreiche Bereiche biomedizinischer Forschung von Bedeutung sind, spielen sie eine wichtige Rolle, wie Diabetes (Insulin), Blutdruckregelung (Angiotensin), Anämie (Erythropoietin-σ), Multiple Sklerose (Interferon-/?) und andere.
Die kürzliche Sequenzierung des menschlichen Genoms hat ungefähr 30.000 Gene ergeben, deutlich weniger als aufgrund der Komplexität biologischer Prozesse beim Menschen vorhergesagt worden waren. Alternatives Spleißen dieser Gene vor der Translation würde wahrscheinlich bis zu 200.000 primäre Transkripte erzeugen. Heute ist allgemein anerkannt, dass posttranslationale Modifikationen von Proteinprodukten, die von diesen Genen kodiert werden, das zusätzliche Komplexitätsniveau darstellen, mit dem die Funktionsvielfalt erklärbar ist.
Die Genvorhersage bezieht sich in der Regel auf einen Bereich der Bioinformatik, der sich mit der Identifizierung von Sequenzen, üblicherweise genomischer DNA, mit biologischen Funktionen mithilfe von Algorithmen beschäftigt. Dazu gehören insbesondere Protein kodierende Gene, es können aber auch andere Funktionselemente, wie RNA-Gene und Regulierungsregionen, nachgewiesen werden. Die Genvorhersage ist einer der ersten und wichtigsten Schritte für das Verständnis des Genoms einer Spezies nach dessen Sequenzierung.
Mit extrinsischen Genvorhersagesystemen wird das Target-Genom auf Sequenzen untersucht, die extrinsischen Anzeichen in Form der bekannten Sequenz einer Messenger-RNA (mRNA) oder eines Proteinprodukts ähnlich sind. Es ist entscheidend, anhand einer vorgegebenen mRNA-Sequenz eine einmalige genomische DNA-Sequenz abzuleiten, von der diese transkribiert worden sein muss. Mit einer bestimmten Proteinsequenz kann mittels reverser Translation des genetischen Codes eine Reihe möglicher kodierender DNA-Sequenzen abgeleitet werden. Sobald ein DNA-Sequenzkandidat bestimmt ist, ist es nur eine Frage des Algorithmus, ein Target-Genom effizient auf vollständige oder partielle, exakte oder inexakte Treffer zu untersuchen. Hier ist BLAST ein zu diesem Zweck entwickeltes weit verbreitetes System.
Eine hohe Ähnlichkeit mit einer bekannten Messenger-RNA oder einem Proteinprodukt ist in vielen Fällen ein guter Anhaltspunkt dafür, dass eine Region eines Target- Genoms ein für ein Protein kodierendes Gen ist. Eine systematische Verwendung dieses Ansatzes verlangt jedoch eine umfassende Sequenzierung von mRNA und Proteinprodukten. Dies ist nicht nur teuer, in komplexen Organismen wird darüber hinaus nur ein Teil aller Gene im Genom des Organismus zu jedem beliebigen Zeitpunkt exprimiert, was bedeutet, dass in einer einzelligen Kultur ein extrinsischer Hinweis für zahlreiche Gene nicht ohne weiteres zur Verfügung steht. Um somit ex- trinsische Hinweise für die meisten oder alle Gene eines komplexen Organismus zu sammeln, müssen Hunderte oder Tausende unterschiedliche Zelltypen untersucht werden, was weitere Schwierigkeiten mit sich bringt. Beispielsweise können einige menschliche Gene nur während der Entwicklung im Embryo oder Fötus exprimiert werden.
Trotz dieser Schwierigkeiten wurden umfangreiche Transkript- und Proteinsequenzdatenbanken für den Menschen sowie andere in der Biologie wichtige Modellorganismen, wie Mäuse und Hefen, erzeugt. Die RefSeq-Datenbank enthält beispielsweise Transkript- und Proteinsequenzen zahlreicher unterschiedlicher Spezies und das Ensemble-System kartiert diese Anzeichen umfassend für menschliche und mehrere andere Genome.
Aufgrund der mit dem Erhalt von extrinsischen Anzeichen für viele Gene verbundenen Kosten und Schwierigkeiten muss auf eine Genvorhersage ab initio zurückgegriffen werden, bei der nur eine genomische DNA-Sequenz systematisch auf bestimmte verräterische Anzeichen für Protein kodierende Gene untersucht wird. Diese Anzeichen können allgemein als entweder Signale, spezifische Sequenzen, die die Gegenwart eines nahen Gens anzeigen, oder Inhalt, statistische Eigenschaften der Protein kodierenden Sequenz selbst, klassifiziert werden. Die Genvorhersage ab initio kann genauer als eine Genprophezeiung beschrieben werden, da im Allgemeinen extrinsische Hinweise erforderlich sind, um die Funktionsfähigkeit eines vermutlichen Gens überzeugend darzulegen.
Die Genvorhersage ab initio bei Eukaryoten, insbesondere komplexen Organismen wie Menschen, ist aus mehreren Gründen besonders schwierig. Zum Ersten sind die Promotoren und anderen Regulierungssignale dieser Genome komplexer und weniger gut erforscht wie in Prokaryoten, was eine zuverlässige Erkennung erschwert. Zwei klassische Beispiele für Signale, die mittels eukaryontischer
Genvorhersageprogramme identifiziert wurden, sind CpG-lnseln und Bindungsstellen eines Poly-(A)-Schwanzes.
Zum Zweiten bedeuten die in eukaryontischen Zellen verwendeten Spleißmechanismen, dass eine bestimmte Protein kodierende Sequenz im Genom in mehrere Teile (Exons) unterteilt wird, die durch nicht kodierende Sequenzen (Introns) getrennt sind. Gespleißte Stellen wiederum sind Signale, für deren Identifizierung zahlreiche eukaryontische Genvorhersageprogramme entwickelt wurden. Ein typisches Protein kodierendes Gen des Menschen kann in bis zu zwölf Exons mit jeweils einer Länge von weniger als zweihundert Basenpaaren, wobei einige so kurz wie zwanzig oder dreißig sein können, unterteilt sein. Somit sind Periodizitäten und an- dere bekannte Inhaltseigenschaften der Protein kodierenden DNA von Eukaryoten sehr viel schwieriger zu erkennen.
Fortgeschrittene Genvorhersageprogramme für sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Genome bedienen sich üblicherweise komplexer Wahr- scheinlichkeitsrechnungsmodelle, wie verborgenen Markow-Modellen, um
Informationen aus einer Vielfalt von verschiedenen Signal- und Inhaltsbestimmungen zu kombinieren. Das Glimmer-System ist ein weit verbreitetes und besonders genaues Genvorhersageprogramm für Prokaryoten. Im Vergleich dazu konnten eukaryontische ab initio Genvorhersageprogramme nur einen begrenzten Erfolg verzeichnen; eine rühmliche Ausnahme ist hier das Programm GENSCAN.
Die vorliegende Erfindung identifizierte neue bioaktive Peptidhormonvorläufer mittels Identifizierung neuer Gene mit einem einzigen Exon, die für
Peptidhormonvorläufersequenzen kodieren. Um neue Gene mit einem einzigen Exon zu finden, wurde das menschliche Genom (NCBI 33 assembly, 1. Juli 2003) und das Mausgenom (NCBI 30 assembly, 1. Juli 2003) unter Verwendung von normalem genetischen Code in alle sechs Leserahmen translatiert. Es wurden nur solche Sequenzfragmente selektiert, die mit der Aminosäure Methionin starteten und eine Länge von 50 bis 200 Aminosäuren aufwiesen. Der humane und der murine Satz wurden unter Verwendung des Programms BLAST miteinander verglichen, um eng verwandte Sequenzen in beiden Organismen zu finden. Es wurden nur Sequenzen selektiert, die in beiden Organismen (human und murin) auftraten. Zum Filtern von sezernierten Proteinen wurden potenzielle Signalsequenzen mithilfe des Programms SignalP vorhergesagt und das Fehlen potenzieller membrandurchdringender Regionen wurde mithilfe des Programms TMHMM bestätigt. Darüber hinaus wurde eine InterPro- Suche mit ausgewählten Sequenzen durchgeführt, um die Gegenwart von einfach zu beschreibenden Proteindomänen (z. B. der Kinasedomäne usw.) auszuschließen. Die Neuheit der übrig gebliebenen Sequenzen wurde durch einen Sequenzvergleich mit öffentlich zugänglichen Datenbanken, wie UNIPROT, bestätigt. Diese In-silico- Analysen legen die Entdeckung neuer sezemierter Proteine nahe, die keine zuvor beschriebenen Proteindomänen aufweisen.
Es ist allgemein anerkannt, dass Peptidhormone durch ihre hohe Spezifität und ihre Wirksamkeit in sehr niedrigen Konzentrationen gekennzeichnet sind. Ein weiteres Kennzeichen von Peptidhormonen ist, dass ihre entsprechende mRNA in einer geringen Anzahl in spezifischen Geweben exprimiert wird. Ein überall vorkommendes Expressionsmuster für Peptidhormone wird in Säugetiersystemen selten beobachtet.
Zur Bestimmung der Gewebe, die die acht neuen Gene im menschlichen Körper transkribieren, wurden üblicherweise verwendete in-vitro-Transkriptionsassays mit einer Serie menschlicher Gewebe durchgeführt (siehe Fig. 1-6). Unter Verwendung spezifischer Sonden/Primer-Sätze kann die das fragliche Gen kodierende mRNA nachgewiesen und quantifiziert werden. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die Genexpressionsdaten durch die Transkription von Genen beeinflusst sein können, die sich an derselben Stelle im Genom befinden. Ferner ist die in der vorliegenden Erfindung verwendete Gewebereihe nicht vollständig.
Bioaktive Peptidhormone sind für die biomedizinische Forschung von größter Bedeutung und deswegen für die Pharmaindustrie von Interesse. Verschiedene Peptidhormone werden zur Behandlung von Krankheiten verwendet.
WO2004039956 (Titel: "Compositions and methods for treatment of immune related diseases") offenbart zwar mehrere bioaktive Polypeptidsequenzen, es wird jedoch nicht auf Identifikationsverfahren und die Verwendung derartiger Sequenzen Bezug genommen.
Die vorliegende Erfindung identifizierte neue Gene, die für bioaktive Peptid- hormonvorläufer kodieren. Peptidhormone sind durch ihre hohe Spezifität und ihre Wirksamkeit in sehr niedrigen Konzentrationen gekennzeichnet. Bioaktive
Peptidhormone sind für die biomedizinische Forschung von größter Bedeutung. Verschiedene Peptidhormone werden zur Behandlung von Krankheiten oder zur Überwachung von Krankheitszuständen verwendet. Derartige Polypeptidsequenzen können in therapeutisch wirksamen Mengen als Arzneimittel und Medikamente für Immunkrankheiten verwendet werden.
Das Problem, wie es in dem am nächsten liegenden Stand der Technik (WO2004039956) dargelegt ist, kann als die Identifikation neuer Hormon- polypeptidsequenzen, die für die Behandlung menschlicher Krankheiten nützlich sind, definiert werden. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch Bereitstellung von acht neuen Peptidhormonvorläufern und Fragmenten davon, die zur Beeinträchtigung physiologischer Faktoren verwendbar sind, welche das Risiko von Arteriosklerose, Entzündung oder unkontrollierter Zellteilung erhöhen. Erfindungsgemäß wird ein neuer Bestand hormonaler Polypeptide bereitgestellt, die zur Behandlung von menschlichen Krankheiten im Bereich der biomedizinischen Forschung verwendbar sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine Polypeptidkette, die aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1-8 oder einer Aminosäuresequenz, die daraus durch Deletion, Substitution oder Insertion von mindestens einem
Aminosäurerest abgeleitet ist, deren Amid oder Ester oder einem Salz des Peptids besteht. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Polypeptidkette, die aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MYWMALRRISTLGSRWLGLSRVLLFRASKASFTFLSLRFSLSVAARRRSTDTDFLLHT LHAHGRHWPGQCSGVPSPLSSRGPGASGLRVSSVRS
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MGSGCARARLGLLSWLAASSGSEDALASSISVKLALELAEVAWSEGDEAEGLAPWLS
PLVQGRDSGEDREQLEAACLKRGSWAGAGKARELSPTAPKWLEEAEERLTLRSIPL
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MLLAMSSISIFSSLFSFSSFCFTRCRLSICSPSSATLSACFFLRVAAVASCCRVASSRSL
RIFWNSASLFLFISIWAEVAPLASSSLSLISSSSLARSERCFSILALSVCSASISSSSSSM RA
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MATSWAGSAAPPASAAKSWGTRPSRPGGPRSAWRRRRATLAAWTGPARAATATT TRAAARRPVAARTPARLAATSRATHARTWPMASPRASVTTCTCAFRAARASPALSS
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MPRSAPRAAAAPARAPAAAAVACACCPNSAPDFFMVCGGHVRSLAGKRLFSSPPRP ACSGPNDLRSSGVSGGAVRPAARTRRRAQGEVEEEASCGEKGRRTAERMGPVAAA RAGLDAAWARRCEVPKVTTIPTRQPRAPARPGAPRRI
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: MPKWRLAWPKQTRASSCGLSLPSISCASSCSASRNGGDRCSLRTTTTRHTR
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MSVWTFLKCRGNSSLLKNLLQVKVKAELLLLCLLVTHSLWSSTWSPPGVAAVRSAST VPEENCSGSKLYVCVAKSMNSPSMLLDSEMTWPLSSLSKAHWRVVLMRSDLGRSST VIPKSEVSTALCSLGLQLNMASPSRARFPQ
Eine andere Ausfϋhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MASAAGEPFSMYLASAAAALCTPTASARKARGLRTEPLDEVLARGGPAASTLWCRC RLWPKASLYPGARKPCLAASGSDSSTSGGSATDTGPDLTPWKEVDSDLSASMQLLM IWLTLSTSLAMVEISATELWLSGPGRPSSQSLRSGGSPVRTSM
Eine Ausführungsform der Erfindung stellt ferner eine DNA bereit, die eine Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 bis 16 umfasst, welche eine Polypeptidkette kodiert, die eine durch SEQ ID Nr. 1-8 dargestellte Amino- Säuresequenz oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon umfasst.
Diese Erfindung betrifft eine DNA, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 besteht, welche eine Polypeptidkette kodiert, die aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 10 besteht, welche die in Absatz 1 beschriebene Polypeptidkette kodiert, die aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon besteht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine DNA, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 11 besteht, welche eine Polypeptidkette kodiert, die aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon besteht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine DNA, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 12 besteht, welche eine Polypeptidkette kodiert, die aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon besteht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine DNA, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 13 besteht, welche eine Polypeptidkette kodiert, die aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon besteht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine DNA, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 14 besteht, welche eine Polypeptidkette kodiert, die aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 6 oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon besteht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine DNA, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 15 besteht, welche eine Polypeptidkette kodiert, die aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 7 oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon besteht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine DNA, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 16 besteht, welche eine Polypeptidkette kodiert, die aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 8 oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Verfahren den Schritt des Bereitsteilens der Aminosäure, des Synthetisierens der Aminosäure durch Festphasen- oder Flüssigphasensynthese, des Extrahierens des Polypeptids, des Reinigens des Polypeptids umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung des Peptids, Vorläufers oder Salzes davon bereit, das das Unterwerfen einer Aminosäure oder eines Peptids mit endständigem Amino und einer Aminosäure oder eines Peptids mit endständigem Carboxyl einer Kondensation, fakultativ gefolgt von intramolekularer Disulfidbrückenbildung umfasst.
Eine Ausführungsform der Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend als Wirkstoff eine Polypeptidkette oder einen Vorläufer oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Amid, einen derartigen Ester oder ein derartiges Salz davon, wobei die Polypeptidkette aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1-8 besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, umfassend als Wirkstoff eine Polypeptidkette oder einen Vorläufer oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Amid, einen derartigen Ester oder ein derartiges Salz davon, wobei die Polypeptidkette aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1-8 besteht und als therapeutische Polypeptide, Targets für Arzneimittelinterventionen, Liganden zum Charakterisieren relevanter Targets, Biomarker zur Überwachung von Krankheiten verwendbar ist.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Peptids, Vorläufers oder Salzes der Erfindung bei der Herstellung eines Mittels zur Behandlung oder Prävention einer Herz-Kreislauf-Krankheit, von Hormonen produzierenden Tumoren, eines
Hormonsekretionshemmers, eines Tumorwachstumshemmers bereit, das mindestens eine der in SEQ ID Nr. 1 bis 8 definierten Aminosäuresequenzen umfasst.
Eine Ausführungsform der Erfindung stellt auch einen Antikörper für eine Polypeptidkette gemäß Absatz 1 her, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1-8 oder deren Amid, Ester oder Salze davon umfasst. Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann auch zum Nachweis eines erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet werden, das in einer Probe, wie einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe, vorhanden ist. Er kann auch zur Herstellung einer Antikörpersäule zum Reinigen eines erfindungsgemäßen Polypeptids, zum Nachweis eines erfindungsgemäßen
Polypeptids in jeder Fraktion während der Reinigung oder zur Analyse des Verhaltens eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einer Testzelle verwendet werden. Der Begriff "Polypeptid", wie hierin verwendet, ist so zu verstehen, dass er sich auf jedes Polymer bezieht, das aus über kovalente Bedingungen verknüpften Aminosäuren besteht, wobei der Begriff in seiner Bedeutung auch Teile und Fragmente von Proteinen in voller Länge umfasst, wie beispielsweise Peptide, Oligopeptide und kürzere Peptidsequenzen, die aus mindestens 2 Aminosäuren, insbesondere mindestens etwa 5 Aminosäureresten oder mehr, bestehen.
Der Begriff "Polypeptid" schließt alle Gruppierungen ein, die eine oder mehrere über Peptidbindungen verknüpfte Aminosäuren enthalten. Darüber hinaus schließt der Begriff innerhalb seines Bedeutungsbereichs Polymere modifizierter Aminosäuren sein, einschließlich Aminosäuren, die beispielsweise durch chemische Modifikation, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Glykosylierungs-, Phosphorylierungs-, Acetylierungs- und/oder Sulfatierungsreaktionen die die basische Peptid hauptkette wirksam verändern, posttranslational modifiziert wurden. Demgemäß kann ein Polypeptid aus einem natürlich vorkommenden Protein abgeleitet sein und insbesondere kann es von einem Protein in vollständiger Länge durch chemische oder enzymatische Spaltung mithilfe von Reagentien, wie CNBr, oder Proteasen, wie unter anderem Trypsin oder Chymotrypsin, abgeleitet sein. Als Alternative können derartige Polypeptide durch chemische Synthese unter Verwendung bekannter Peptidsyn- theseverfahren abgeleitet sein. Ebenfalls in den Definitionsumfang eines "Polypeptids" fallen Aminosäuresequenzvarianten (hier als Polypeptidvarianten bezeichnet). Diese können eine oder mehrere, vorzugsweise konservative, Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen bei einer natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz enthalten, wobei wenigstens eine wesentliche Eigenschaft des Polypeptids, wie beispielsweise seine biologische Aktivität, unverändert bleibt. Derartige Polypeptide können durch eine chemische Polypeptidsynthese synthetisiert werden. Konservative Aminosäuresubstitutionen sind im Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise können ein oder mehrere Aminosäurereste eines nativen Proteins konservativ mit einem Aminosäurerest ähnlicher Ladung, Größe oder Polarität substituiert werden, wobei das gebildete Polypeptid, wie hier beschrieben, seine volle Funktionalität bewahrt. Regeln zur Durchführung derartiger Substitutionen sind gut bekannt. Genauer gesagt handelt es sich bei konservativen Aminosäuresubstitutionen um solche, die im Allgemeinen innerhalb einer Aminosäurenfamilie stattfinden, die über ihre Seitenketten verwandt sind. Genetisch kodierte Aminosäuren werden im Allgemeinen in vier Gruppen unterteilt: (1 ) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin und Histidin; (3) nicht polar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin und Tryptophan; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin und Tyrosin. Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan sind gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Eine oder mehrere Substitutionen innerhalb jeder Gruppe, wie beispielsweise die Substitution von Leucin durch Isoleucin oder Valin, sind Alternativen, die Substitution von Aspartat durch Glutamat oder von Threo- nin durch Serin oder von jedem anderen Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer verwandten Struktur hat im Allgemeinen eine unbedeutende Auswirkung auf die Funktion des gebildeten Polypeptids.
In den Definitionsumfang eines "Polypeptids" fallen Aminosäuresequenzvarianten, die eine unnatürliche Modifikation, wie, ohne darauf beschränkt zu sein, Schützen,
Carboxylieren und Derivatisieren mittels Amid- und Nichtamid-Bindungen, sowie eine kovalente und nicht kovalente Modifikation erfahren haben.
In den Definitionsumfang eines "Polypeptids" fällt ein Peptid, dessen biologische Aktivität vorhersagbar ist, da dessen Aminosäuresequenz einer funktionellen Domäne entspricht. Ebenfalls unter den Begriff "Polypeptid" fällt ein Peptid, dessen biologische Aktivität nicht durch die Analyse dessen Aminosäuresequenz vorhersagbar ist.
Eine Aminosäure ist ein beliebiges Molekül, das sowohl eine funktionelle Aminogruppe als auch eine funktionelle Carboxylgruppe enthält. Ein Aminosäurerest ist der Rest einer Aminosäure nach Verlust eines Wassermoleküls (ein H+ von der Stickstoffseite und ein OH- von der Carboxylseite) bei der Bildung einer Peptidbindung, der chemischen Bindung, die Aminosäuremonomere zu einer Proteinkette verknüpft. Jedes Protein hat seine eigene einmalige Aminosäuresequenz, die als dessen Primärstruktur bekannt ist. Genauso, wie die Buchstaben des Alphabets auf verschieden Weise zu einer unendlichen Vielfalt von Wörtern zusammengestellt werden können, können Aminosäuren miteinander unter Bildung einer riesigen Vielfalt von Proteinen zu verschiedenen Sequenzen verknüpft werden. Die einmalige Form jedes Proteins bestimmt dessen Funktion im Körper.
Ein Vorläufer ist eine Substanz, aus der eine andere, normalerweise aktivere oder reifere Substanz gebildet wird. Ein Proteinvorläufer ist ein inaktives Protein (oder Peptid), das durch eine posttranslationale Modifikation in die aktive Form verwandelt werden kann. Die Bezeichnung eines Vorläufers eines Proteins beginnt häufig mit Pro oder Präpro. Vorläufer werden häufig von einem Organismus verwendet, wenn das eigentliche Protein eine potenzielle Gefahr darstellt, aber innerhalb kurzer Zeit und/oder in großen Mengen verfügbar sein muss.
Das erfindungsgemäße Polypeptid, die Vorläufer oder Salze davon haben hormonelle Aktivität. Aus diesem Grund sind erfindungsgemäße Polypeptide, Vorläufer oder Salze als Arzneimittel nützlich, beispielsweise als ein therapeutisches Polypeptid, als Ligand zum Charakterisieren relevanter Targets (z. B. GPCR), als Targets für
Arzneimittelinterventionen (z. B. Targets für monoklonale Antikörper oder dergleichen, Rezeptorfragmente), als Biomarker zur Überwachung von Krankheiten (in Kombination mit instrumenteilen Antikörpern zum Nachweis von Peptidfragmenten in Körperflüssigkeiten), als Proteinkinasehemmer und -Substrate, als T-Zellen-Epitope, als Peptidmimotope von Rezeptorbindungsstellen, als Biomarker zur Bestimmung des Expressionsniveaus.
Die DNA, die für das erfindungsgemäße Peptid oder den erfindungsgemäßen Vorläufer kodieren, sind beispielsweise als Mittel für die Gentherapie oder zur Behandlung oder Prävention einer Herz-Kreislauf-Krankheit, von Hormone produzierenden Tumoren, Diabetes, Magengeschwüren und dergleichen, als Hormonsekretionshemmer, Tumorwachstumshemmer, neurale Aktivität usw. nützlich. Ferner sind die erfindungsgemäßen DNA als Mittel zur genetischen Diagnose von Krankheiten, wie Herz-Kreislauf-Krankheit, von Hormone produzierenden Tumoren, Diabetes, Magengeschwüren und dergleichen, nützlich.
Ein Vektor ist ein Vehikel zur Abgabe von genetischem Material, wie DNA, an eine Zelle. DNA selbst kann als Vektor betrachtet werden, beispielsweise insbesondere dann, wenn sie zur Zelltransformation verwendet wird. Ein Vektor in diesem Sinne ist ein DNA-Konstrukt, wie ein Plasmid oder ein künstliches bakterielles Chromosom, das einen Replikationsstartpunkt enthält. Ein geeigneter Replikationsstartpunkt sorgt dafür, dass eine Zelle das Konstrukt zusammen mit den Chromosomen der Zelle kopiert und dieses an ihre Nachkommen weitergibt. Eine einzige Zelle, die derart mit einem Vektor transformiert wurde, vermehrt sich zu einer ganzen Zellkultur, in der alle den Vektor sowie jedes Gen enthalten, das im Konstrukt daran gebunden war. Da die Konstrukte aus Zellen durch Reinigungstechniken extrahiert werden können, besteht durch die Transformation mit einem Vektor die Möglichkeit, eine kleine Anzahl DNA-Moleküle zu vervielfachen. Ein Vektor kann ein von E. coli abgeleitetes Plasmid (z. B. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), ein von Bacillus subtilis abgeleitetes Plasmid (z. B. pUB110, pTP5, pC194), ein von einer Hefe abgeleitetes Plasmid (z. B. pSH19, pSH15), ein Bakteriophage, wie der [Iambda]-Phage, sowie ein Tiervirus, wie ein Retrovirus, Impfvirus, Baculovirus und dergleichen sein.
Die Antikörper für das erfindungsgemäße Peptid, den erfindungsgemäßen Vorläufer oder das erfindungsgemäße Salz können das erfindungsgemäße Peptid, den erfindungsgemäßen Vorläufer oder das erfindungsgemäße Salz spezifisch erkennen. Er kann auch zur Herstellung einer Antikörpersäule zum Reinigen eines erfindungsgemäßen Polypeptids, zum Nachweis eines erfindungsgemäßen Polypeptids in jeder Fraktion während der Reinigung oder zur Analyse des Verhaltens eines neuen Polypeptids in einer Testzelle verwendet werden. Somit kann er zur Untersuchung des erfindungsgemäßen Peptids oder dessen Äquivalents in Testlösungen verwendet werden.
Ergebnisse
1.0 Beschreibung der Computerprogramme:
1.1 SignalP Version 2.0 Aufgabe: Dieses Programm wurde zum Nachweis potenzieller Signalsequenzen verwendet, wobei ein Cutoff-Score von 0,98 verwendet wurde. SignalP Version 2.0 sagt das Vorhandensein und die Position der Signalpeptid-Spaltungaufstellungsorte in den Aminosäuresequenzen von unterschiedlichen Organismen voraus: Die Methode enthält eine Vorhersage der Spaltungsorte und eine Signalpeptid/Nichtsignalpeptid- Vorhersage auf der Grundlage einer Kombination mehrerer künstlicher neuraler Netze und verborgener Markow-Modelle.
1.2 TMHMM Version 2.0
Aufgabe: Dieses Programm wurde zur Definition möglicher membrandurchdringender Regionen in Proteinsequenzen verwendet. TMHMM Version 2.0 wird zur Vorhersage von transmembranen Helices in Proteinen verwendet. Vorhergesagte TM-Segmente in der n-terminalen Region erweisen sich gelegentlich als Signalpeptide.
1.3 ProP Version 1.0
Aufgabe: Dieses Programm wurde zum Nachweis potenzieller Spaltungsaufstellungsorte in Proteinsequenzen verwendet. Es wurde mit einem Score von 0,09 verwendet. Das Programm sagt unter Verwendung eines Ensembles neuraler Netze Arginin- und Lysin-Propeptidspaltungsaufstellungsorte in eukaryontischen Proteinsequenzen voraus. Die Vorgabe ist eine furinspezifische Vorhersage. Es besteht auch die Möglichkeit, eine allgemeine Vorhersage für Proprotein-Konvertase (PC) durchzuführen. Das Programm ist mit dem SignalP-Programm integriert und sagt das Vorhandensein und die Position von Signalpeptid-Spaltungaufstellungsorten voraus.
1.4 I nterPro Version 12 in Kombination mit InterProScan
InterPro ist eine Datenbank für Proteinfamilien, -domänen und funktionellen Positionen, wobei identifizierbare Merkmale von bekannten Proteinen auf unbekannte Proteinsequenzen angewendet werden können. 1.5 InterProScan ist das Programm, das zum Vergleich von Aminosäuresequenzen mit der Datenbank InterPro verwendet wird.
1.6 BLAST Version 2.2.9
Das Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) findet Regionen lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen. Das Programm vergleicht Nukleotid- oder Proteinsequenzen mit Sequenzen in der Datenbank und ermittelt die statistische Signifikanz von Übereinstimmungen. BLAST kann dazu verwendet werden, funktionelle und evolutionäre Verwandtschaften von Sequenzen zu erschließen und die Mitglieder von Genfamilien zu identifizieren. BLAST bedient sich der Karlin-Altschul-Statistik, um die statistische Signifikanz der erzeugten Ordnungen zu ermitteln. Der grundlegende Algorithmus kann auf mehreren Wegen umgesetzt und in einer Vielfalt von Umgebungen eingesetzt werden, einschließlich unkomplizierter Datenbanksuchen in DNA- und Proteinsequenzen, Motivsuchen, Genidentifizierungssuchen und bei der Analyse von multiplen ähnlichen Regionen in langen DNA-Sequenzen. Neben der Flexibilität und Formbarkeit mathematischer Analysen ist BLAST um eine Größenordnung schneller als existierende Sequenzvergleichswerkzeuge vergleichbarer Empfindlichkeit.
Alle diese Programme sind, wie vorstehend erwähnt, über das Internet öffentlich zugänglich.
Die biologische Rolle der erfindungsgemäßen Hormonpeptide wurde mithilfe von Expressionsprofilstudien untersucht (Fig. 1 bis 6). Es konnte nachgewiesen werden, dass die Hormonpeptide in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz in verschiedenen Geweben unterschiedlich vorhanden sind. Die Differenzialexpression von erfindungsgemäßen Hormonpeptiden in verschiedenen Geweben gilt als gutes Anzeichen für ihre wichtige biologische Rolle. Die Einstellung der Konzentration eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Hormonpeptide durch Erhöhen oder Senken der Menge derartiger Hormonpeptide könnte eine ausgeprägte Auswirkung auf die Behandlung einer Krankheit haben, bei der ein Bedarf nach geringerer oder höherer Konzentration eines oder mehrerer derartiger Hormonpeptide besteht (z. B. Herz- Kreislauf-Krankheit, Stoffwechselkrankheit, psychische Krankheit, Krebs, durch einen Virus, eine Bakterie oder eine Hefe ausgelöste Infektionen und andere).
2.0 Expressionsprofile
2.1 ) Durchführung der Gewebeexpressionsanalyse
Die Gewebeexpressionsanalyse wurde mithilfe von TaqMan Genexpressionsanalysen durchgeführt.
PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine in medizinischen und biologischen
Forschungslabors übliche Technik, die bei einer Vielfalt von Aufgaben zur Anwendung kommt, wie dem Nachweis von Erbkrankheiten, der Identifizierung genetischer Fingerabdrücke, der Diagnose von Infektionskrankheiten, dem Klonen von Genen, Vaterschaftstests und DNA-Computing.
Die quantitative PCR wird zur schnellen Bestimmung der Menge eines PCR-Produkts (vorzugsweise in Echtzeit) verwendet und ist somit ein indirektes Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anfangsmengen an DNA, cDNA oder RNA. Dies wird üblicherweise dazu verwendet, das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Sequenz und, bei Vorhandensein, die Anzahl Kopien in einer Probe zu bestimmen.
Beschreibung der für die Genexpressionsstudien in der vorliegenden Erfindung verwendeten Protokolle:
Probenherstellung:
Von verschiedenen Lieferanten wurden RNA-Proben der zu prüfenden Gewebe erworben.
DNase-Abbau:
Alle Produkte wurden von Ambion erworben. DNA-freie DNase-Behandlung und Entfernungsreagentien (1906). Der DNase-Abbau wurde mit 50 μg RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.
cDNA-Synthese:
Produkte für cDNA wurden von Applera erworben, Reverse Transcriptase Kit (N8080234), RNase Inhibitor (N8080119). Die cDNA-Synthese wurde mit 10 μg RNA durchgeführt.
TaqMan-Reaktionsaufbau:
Produkte für das PCR wurden von Applera erworben. Für jede Reaktion wurde TaqMan Universal PCR Master Mix (4305719) verwendet. Target Forward Primer, Target Reverse Primer bzw. Target-Sonde, an jedem Gen mit FAM gekennzeichnet, (siehe Tabelle der Primer-Sequenzen). Die PCR wurde unter Verwendung von ABI Phsm 7900 (Applera) unter den folgenden PCR-Bedingungen durchgeführt: 2 Minuten bei 50 0C, 10 Minuten bei 95 0C, 40 Zyklen bei 95 0C über 15 s und 1 Minute bei 60 0C. Die PCR war als Multiplex-PCR mit B2M als endogener Kontrolle für die Normalisierung konzipiert.
2.3) Für ein Gen, das eine Peptidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 kodiert, wurden folgende Expressionsprofile erhalten (Fig. 7). Die Ergebnisse sind auch in Fig. 1 , allerdings in einem anderen Format, dargestellt.
2.4) Für ein Gen, das eine Peptidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, wurden folgende Expressionsprofile erhalten (Fig. 8). Die Ergebnisse sind auch in Fig. 2, allerdings in einem anderen Format, dargestellt.
2.5) Für ein Gen, das eine Peptidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 kodiert, wurden folgende Expressionsprofile erhalten (Fig. 9). Die Ergebnisse sind auch in Fig. 3, allerdings in einem anderen Format, dargestellt.
2.6) Für ein Gen, das eine Peptidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 kodiert, wurden folgende Expressionsprofile erhalten (Fig. 10). Die Ergebnisse sind auch in Fig. 4, allerdings in einem anderen Format, dargestellt.
2.7) Für ein Gen, das eine Peptidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 kodiert, wurden folgende Expressionsprofile erhalten (Fig. 11 ). Die Ergebnisse sind auch in Fig. 5, allerdings in einem anderen Format, dargestellt.
2.8) Für ein Gen, das eine Peptidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 6 kodiert, wurden folgende Expressionsprofile erhalten (Fig. 12). Die Ergebnisse sind auch in Fig. 6, allerdings in einem anderen Format, dargestellt.
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Beschreibung der Figuren:
Fig. 1 : zeigt das mRNA-Expressionsprofil von AC105940 auf ATAQ 1 für SEQ ID Nr. 1
Fig. 2: zeigt das mRNA-Expressionsprofil von AC005291 auf ATAQ 1 für SEQ ID Nr. 3
Fig. 3: zeigt das mRNA-Expressionsprofil von AC090617 auf ATAQ 1 für SEQ ID Nr. 4
Fig. 4: zeigt das mRNA-Expressionsprofil von AC114684 auf ATAQ 1 für SEQ ID Nr. 5 Fig. 5: zeigt das mRNA-Expressionsprofil von AC063920 auf ATAQ 1 für SEQ ID Nr. 7
Fig. 6: zeigt das mRNA-Expressionsprofil von AC074389 auf ATAQ 1 für SEQ ID Nr. 8
Fig. 7: zeigt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1
Fig. 8: zeigt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2
Fig. 9: zeigt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 Fig. 10: zeigt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4
Fig. 11 : zeigt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 5
Fig. 12: zeigt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 Fig. 13: zeigt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 7 Fig. 14: zeigt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8 Fig. 15: zeigt die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 9 Fig. 16: zeigt die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 10 Fig. 17: zeigt die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 11 Fig. 18: zeigt die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 12 Fig. 19: zeigt die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 13 Fig. 20: zeigt die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 14 Fig. 21 : zeigt die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 15 Fig. 22: zeigt die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 16
Fig. 23: zeigt die Nukleotidsondensequenz von SEQ ID Nr. 1 Fig. 24: zeigt die Nukleotid-Forward-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 Fig. 25: zeigt die Nukleotid-Reverse-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 Fig. 26: zeigt die Nukleotidsondensequenz von SEQ ID Nr. 2 Fig. 27: zeigt die Nukleotid-Forward-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 2 Fig. 28: zeigt die Nukleotid-Reverse-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 2 Fig. 29: zeigt die Nukleotidsondensequenz von SEQ ID Nr. 3 Fig. 30: zeigt die Nukleotid-Forward-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 Fig. 31 : zeigt die Nukleotid-Reverse-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 Fig. 32: zeigt die Nukleotidsondensequenz von SEQ ID Nr. 4
Fig. 33: zeigt die Nukleotid-Forward-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 4 Fig. 34: zeigt die Nukleotid-Reverse-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 4 Fig. 35: zeigt die Nukleotidsondensequenz von SEQ ID Nr. 5 Fig. 36: zeigt die Nukleotid-Forward-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 5 Fig. 37: zeigt die Nukleotid-Reverse-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 5 Fig. 38: zeigt die Nukleotidsondensequenz von SEQ ID Nr. 6 Fig. 39: zeigt die Nukleotid-Forward-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 6 Fig. 40: zeigt die Nukleotid-Reverse-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 6 Fig. 41 : zeigt die Nukleotidsondensequenz von SEQ ID Nr. 7 Fig. 42: zeigt die Nukleotid-Forward-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 7 Fig. 43: zeigt die Nukleotid-Reverse-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 7 Fig. 44: zeigt die Nukleotidsondensequenz von SEQ ID Nr. 8 Fig. 45: zeigt die Nukleotid-Forward-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 8 Fig. 46: zeigt die Nukleotid-Reverse-Primer-Sequenz von SEQ ID Nr. 8

Claims

ANSPRÜCHE
1. Polypeptidkette, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1-8 oder eine Aminosäuresequenz, die daraus durch Deletion, Substitution oder Insertion von mindestens einem Aminosäurerest abgeleitet ist, deren Amid oder Ester oder einem Salz des Peptids.
2. Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 , die aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: MYWMALRRISTLGSRWLGLSRVLLFRASKASFTFLSLRFSLSVAARRRSTDTDFLLHT LHAHGRHWPGQCSGVPSPLSSRGPGASGLRVSSVRS
3. Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 , die aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: MGSGCARARLGLLSWLAASSGSEDALASSISVKLALELAEVAWSEGDEAEGLAPWLS PLVQGRDSGEDREQLEAACLKRGSWAGAGKARELSPTAPKWLEEAEERLTLRSIPL
4. Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 , die aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: MLLAMSSISIFSSLFSFSSFCFTRCRLSICSPSSATLSACFFLRVAAVASCCRVASSRSL RIFWNSASLFLFISIWAEVAPLASSSLSLISSSSLARSERCFSILALSVCSASISSSSSSM RA
5. Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 , die aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MATSWAGSAAPPASAAKSWGTRPSRPGGPRSAWRRRRATLAAWTGPARAATATT TRAAARRPVAARTPARLAATSRATHARTWPMASPRASVTTCTCAFRAARASPALSS
6. Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 , die aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MPRSAPRAAAAPARAPAAAAVACACCPNSAPDFFMVCGGHVRSLAGKRLFSSPPRP ACSGPNDLRSSGVSGGAVRPAARTRRRAQGEVEEEASCGEKGRRTAERMGPVAAA RAGLDAAWARRCEVPKVTTIPTRQPRAPARPGAPRRI
7. Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 , die aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: MPKWRLAWPKQTRASSCGLSLPSISCASSCSASRNGGDRCSLRTTTTRHTR
8. Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 , die aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MSVWTFLKCRGNSSLLKNLLQVKVKAELLLLCLLVTHSLWSSTWSPPGVAAVRSAST VPEENCSGSKLYVCVAKSMNSPSMLLDSEMTWPLSSLSKAHWRWLMRSDLGRSST VIPKSEVSTALCSLGLQLNMASPSRARFPQ
9. Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 , die aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
MASAAGEPFSMYLASAAAALCTPTASARKARGLRTEPLDEVLARGGPAASTLWCRC RLWPKASLYPGARKPCLAASGSDSSTSGGSATDTGPDLTPWKEVDSDLSASMQLLM IWLTLSTSLAMVEISATELWLSGPGRPSSQSLRSGGSPVRTSM
10. DNA, umfassend eine Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 bis 16, welche eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 kodiert, die eine durch SEQ ID Nr. 1-8 dargestellte Aminosäuresequenz oder deren Amid, Ester oder ein Salz davon umfasst.
11. DNA gemäß Anspruch 10, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 besteht, die eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert.
12. DNA gemäß Anspruch 10, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 10 besteht, die eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 3 kodiert.
13. DNA gemäß Anspruch 10, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 11 besteht, die eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 4 kodiert.
14. DNA gemäß Anspruch 10, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 12 besteht, die eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 5 kodiert.
15. DNA gemäß Anspruch 10, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 13 besteht, die eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 6 kodiert.
16. DNA gemäß Anspruch 10, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 14 besteht, die eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 7 kodiert.
17. DNA gemäß Anspruch 10, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 15 besteht, die eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 8 kodiert.
18. DNA gemäß Anspruch 10, die aus einer Nukleotidbasensequenz gemäß SEQ ID Nr. 16 besteht, die eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 9 kodiert.
19. Verwendung einer DNA gemäß Anspruch 10 bis 18 zur Herstellung eins rekombinanten Vektors, wobei der rekombinante Vektor umfasst:
1. DNA gemäß Anspruch 10 bis Anspruch 18. 2. Einführen des rekombinanten Vektors gemäß Anspruch 19 (a) in eine
Wirtszelle.
20. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 , wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
i. Bereitstellen der Aminosäure ii. Synthetisieren der Aminosäure durch Festphasen- oder Flüssigphasensynthese 1. Extrahieren des Polypeptids iii. Reinigen des Polypeptids
21. Verfahren zur Herstellung des Peptids, Vorläufers oder Salzes davon gemäß Anspruch 1 , umfassend das Unterwerfen einer Aminosäure oder eines Peptids mit endständigem Amino und einer Aminosäure oder eines Peptids mit endständigem Carboxyl einer Kondensation, fakultativ gefolgt von intramolekularer Disulfidbrückenbildung.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als Wirkstoff eine Polypeptidkette oder einen Vorläufer oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Amid, eine derartigen Ester oder ein derartiges Salz davon, wobei die Polypeptidkette aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1-8 besteht.
23. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 21 , umfassend als Wirkstoff eine Polypeptidkette oder einen Vorläufer oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Amid, eine derartigen Ester oder ein derartiges Salz davon, wobei die Polypeptidkette aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1-8 besteht, zur Veränderung physiologischer Faktoren, welche das Risiko von Arteriosklerose, Entzündung doer unkontrollierter Zellteilung erhöhen.
24. Antikörper für eine Polypeptidkette gemäß Anspruch 1 , die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1-8 oder deren Amid, Ester oder Salze davon umfasst.
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