EP2055384A1 - Vorrichtung zum Nachweis von Bestandteilen in einem Fluid - Google Patents

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EP2055384A1
EP2055384A1 EP07021342A EP07021342A EP2055384A1 EP 2055384 A1 EP2055384 A1 EP 2055384A1 EP 07021342 A EP07021342 A EP 07021342A EP 07021342 A EP07021342 A EP 07021342A EP 2055384 A1 EP2055384 A1 EP 2055384A1
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EP
European Patent Office
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blood
measuring
filter
detection reagent
opening
Prior art date
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Withdrawn
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EP07021342A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Dr. Med. Dipl.-Ing. Margraf
Martin Prof. Dr. Scholz
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Leukocare AG
Original Assignee
Leukocare AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP08845028A priority patent/EP2205355A2/de
Priority to PCT/EP2008/009219 priority patent/WO2009056340A2/de
Priority to CN2008801144648A priority patent/CN101883634A/zh
Priority to JP2010531462A priority patent/JP2011501201A/ja
Priority to US12/740,817 priority patent/US20100261223A1/en
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
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    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and a method for the detection, in particular for the determination of the concentration, of constituents in blood or water. Furthermore, the present invention relates to the use of a device or a method for the determination of constituents in blood. Finally, the invention relates to a kit comprising the device and a DNA standard.
  • US 5,186,843 For example, a material for separating plasma or serum from blood is described.
  • the material includes glass microfibers, cellulosic fibers and synthetic textile staple fibers. This medium is used to obtain small amounts of plasma that collect within the separation layer. However, the still necessary collection and further handling of the liquid for a quick and clean diagnosis hinder.
  • US 4,816,224 describes a device for the separation of plasma or serum from whole blood, which can be designed differently. Glass fibers, which occupy a large volume, serve for separation.
  • the device may comprise a plurality of filter layers.
  • a device which allows the separation of plasma or serum from solid blood components by means of a filter membrane mounted in the device and pressure.
  • the corresponding device may include a detection strip that allows the detection of components in the blood by immunochemical detection methods. However, these strips do not allow direct detection without further steps to be carried out by the staff and without the use of further auxiliaries or auxiliaries.
  • the device is primarily intended for obtaining blood plasma or serum for further study.
  • devices as described above are primarily used to provide small amounts of plasma or serum for further analysis.
  • test strips only provide information on whether or not a substance is present within the detection capacity.
  • these methods or devices are often not suitable because only accurate measurements of the concentration or content of a substance in a fluid, eg, blood, provide information about the exact condition of the patient and appropriate treatment methods.
  • Further or additional objects of the present invention are the provision of a simple, safe and reliable device or method which allows, in particular, laypersons or non-medically trained personnel to provide a device which is simple and inexpensive to manufacture and / or store, and the provision of a corresponding kit.
  • the present invention preferably relates to a device for detecting, in particular for determining the concentration, of constituents in blood, having a measuring range, a filter and at least one detection reagent for interacting with the constituents.
  • detection of, for example, substances is meant in particular the determination of the presence or absence of a substance.
  • the detection limit of the measuring method determines the result within the scope of the desired accuracy.
  • fluids in blood is understood to mean, in particular, substances present in blood and / or dissolved substances.
  • the substances may in particular be organic or inorganic or a mixture of both.
  • components of other fluids can also be determined with the device of the present invention.
  • Fluids are to be understood as liquids with solid constituents or suspensions.
  • the fluid is a body fluid.
  • Body fluids include, for example, blood, cerebrospinal fluid, urine, serous fluids, saliva, sperm, or abnormally altered stool.
  • the fluid is water, in particular from lines, streams or lakes, etc.
  • it can be determined, for example, whether a measured DNA correlates with the load on the water by microorganisms.
  • a “measuring range” in the sense of the present invention is in particular a space, preferably with a defined or definable volume, in which at least one constituent of a fluid is determined. It is preferably at least partially transparent and particularly suitable for the determination of the substance or the constituent with preferably optical methods.
  • the measuring range is preferably for z. B. visible light and the light of the emission wavelengths permeable.
  • the filter in the present invention may include or include any material suitable for separation of blood or other solid-component fluids such exist.
  • the filter may comprise, for example, polyethylene terephthalate (sold, for example, by Sekisui in a serum recovery product) or BTSSP (sold by Pall).
  • the filter comprises glass fibers but is not completely made of glass fibers. Even more preferably, the volume or weight fraction of glass fibers is between 0% and 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% or 10%, or between about 5% and 50% % of the filter, preferably between about 10% and 50%. Most preferred is a filter material without glass fibers. For filtering blood, the filter material should not cause hemolysis or bind analytes.
  • the term "detection reagent” is used in particular to describe a substance with which the presence and / or concentration of another substance, preferably one in a fluid, eg. B. blood, plasma or water substance, detected or detected, understood.
  • a detection reagent preferably has the property under certain conditions to enable or condition a detectable reaction.
  • a detection reagent preferably interacts directly with the substance to be determined. It is either a covalent or a non-covalent bond with this substance.
  • the detection reagent fluoresces reinforced only by binding to the analyte.
  • the device according to the invention is preferably a ready-to-use or ready-to-use device which makes it possible to detect and in particular determine the concentration of the constituents in a simple and reliable manner without extensive preparatory measures.
  • the present invention proves to be particularly advantageous in that a device is provided which is small, can be read with commercially available devices and / or the separation of the solid constituents of fluids, preferably from Blood, with the simultaneous measurement of components in the liquid phase connects. In this way, not only the centrifugation step is saved, which was previously necessary, for example, to separate solid blood components from the serum or plasma, but it is possible by simple and safe handling even untrained personnel, the analysis of fluids in the context of diagnostic procedures.
  • the present device allows for the instantaneous measurement of the constituents of interest (ready-to-use) without further treatment and / or delay or other necessary measurement steps.
  • the device has an opening for introducing a fluid, wherein the filter between the opening and measuring range is arranged.
  • the device further comprises a fluid input region, which is preferably arranged between the opening and the measuring area, more preferably between the opening and the filter.
  • the area between the opening and the measuring area and / or the fluid channel, preferably comprising the fluid input area is also summarized under the term filter area.
  • the filter area preferably has a capacity of between about 200 and about 2000 ⁇ l. Depending on the fluid or, preferably, the amount and texture of the blood, up to 200 ⁇ l of plasma or serum can be obtained for measurement in the measuring range.
  • the device according to the invention preferably allows the provision of a volume to be measured in the measurement range between about 15 ⁇ l and about 80 ⁇ l, preferably between about 20 ⁇ l and about 60 ⁇ l and most preferably about 40 ⁇ l serum or plasma.
  • Pulsma is preferably understood to mean, in particular, the liquid phase of the blood which is separate from solid constituents such as cells (erythrocytes, white blood cells, etc.) and which can still coagulate.
  • “Serum” is preferably understood to mean, in particular, the liquid fraction of the blood which is obtained after coagulation of the blood by separation of the cellular constituents mixed with platelets and coagulation factors to form the blood cake.
  • each substance can be determined using suitable detection reagents.
  • the ingredient to be detected or determined is a substance found in organisms.
  • Organisms occurring substances may be organic or inorganic nature. Inorganic are, for example, minerals or mineral salts, trace elements, inorganic ions, metals and heavy metals, etc.
  • Organic substances can belong to different substance classes.
  • a group of substances form proteins, including enzymes. Enzymes convert their substrate into an end product. In the context of the present invention, preferably both the enzyme and the substrate and / or the end product can be determined. Also, non-enzyme proteins may preferably be detected or determined by the apparatus of the present invention.
  • Other groups of organic substances include vitamins and coenzymes, nucleic acids, cytokines, hormones, histones, peptides, sugars, etc.
  • nucleic acids comprising DNA and RNA in their single and / or double-stranded forms.
  • the component to be detected or determined is a biological molecule selected from the group comprising DNA, RNA, proteins, hormones, cytokines.
  • the latter substances may be free or associated be with other proteins.
  • DNA in plasma or serum may also occur as a complex with histones and / or elastase as well as microsatellites.
  • the component to be detected or to be determined is preferably the DNA / RNA of intact or intact bacteria, viruses and / or parasites from water samples contaminated with other particles. In this case, particles are retained by the filtration, while the nucleic acid contained in microorganisms can be made accessible to a measurement by suitable fluorescent dyes.
  • the ingredient to be detected or determined is a drug.
  • Drugs are substances which can be administered to an individual for controlling a pathological condition or disease. Drugs may also be the abovementioned biological molecules.
  • DNA is determined or measured.
  • the filter used in the present invention preferably binds little or no DNA.
  • the bound fraction is preferably less than 30%, preferably less than 20%, most preferably less than 10% of the DNA contained in the fluid or blood.
  • DNA can be detected in many ways. These include PCR as well as detection by detectable agents interacting specifically with DNA.
  • the present invention preferably permits the determination of non-cell-bound DNA. Non-cell-bound DNA can be determined by different methods. In addition to the measurement of the fluorescence after addition of an intercalating dye, the measurement of the UV absorption of DNA is also used to determine the concentration. The sample volumes required for this have now reached the low ⁇ l range (eg measurement by NanoDrop in the range from 2 ⁇ l). The lower measurement limit for DNA is z. At about 10 ng / ml for the fluorescence method.
  • ischemia / reperfusion disease After major operations, especially with heart-lung machine, but also after accidents with polytrauma, sepsis, burns and after ischemia / reperfusion disease (after arterial occlusion) there are strong, sometimes over-activations of the immune system.
  • exemplary, but not exclusive, disease states are surgery, polytrauma, soft tissue trauma, ischemia / reperfusion disease, infarct, ischemia, embolism, infection, sepsis, transplantation, intoxication, eclampsia, drug side effects or transfusions. These can cause temporary or permanent damage in organs, but can also lead to death.
  • the cellular component of this immune response is mediated by neutrophil granulocytes. To assess the consequences of activation, it is important to be up-to-date about the extent of the event.
  • the present invention provides an apparatus and method for detecting the NETs that are already released within minutes of activation of the granulocytes producing them. Proofing in patient samples can lead to timely responses from the attending physicians who can save lives.
  • More free DNA in the blood is released from dead cells. These cells may be dead by apoptotic or necrotic events.
  • some therapies for example of cancer with chemo- or Radiotherapy induces apoptosis of cells, including blood cells. The therapeutic success can thus be detected directly and finely graded with the present invention.
  • the presence and / or concentration of the component in the measuring range preferably depending on the detection reagent used, by means of luminescence, fluorescence, chemiluminescence, electrochemiluminescence, spectral absorption photometry, autofluorescence and / or bioluminescence determinable.
  • the filter is adapted to separate solid components of the fluid flowing through the filter, and in particular to separate the solid and liquid phases of the fluid from each other.
  • Some filter materials can be very brittle or fragile, so stabilization is necessary.
  • it may contain an element for stabilization.
  • Stabilizing elements are preferably stabilizing frames or frames or superimposed or integrated networks of a stable material, such as metal or plastic.
  • the fluid input region, which is preferably encompassed by the filter region, of the device is designed such that an above ambient pressure is exerted on the fluid.
  • the device is preferably designed such that such a pressure during the introduction of the fluid, preferably by a syringe or the like, is constructed.
  • the device is designed such that the fluid is introduced under pressure through the filter in the measuring range.
  • This pressure can preferably be exercised manually, for. B. by the piston of a syringe containing the unfiltered fluid to be measured.
  • the device is a pressure lying below the ambient pressure, preferably a vacuum. If the sample to be determined is brought into contact with the device, causes the low pressure or the vacuum that the sample is passed or sucked without externally applied force in the device and inside the device, the solid components are separated from the fluid.
  • the measuring range is preferably made of a preferably elastic material, which endeavors to assume a defined position or shape.
  • the device is made of elastic material that is deformed such that the inner volume of the measuring chamber is smaller than that of the defined position, so that it unfolds eg when introducing the sample or the sample is sucked in during deployment.
  • the measurement region is made of an inelastic material, wherein the region within the measurement region has a lower pressure than the ambient pressure before the sample enters the device.
  • the detection reagent is provided in the measuring area or in a cavity / lumen located just before the measuring area, which preferably extends between the filter and the measuring area.
  • the detection reagent is provided in the filter or in spatial proximity to the filter.
  • the detection reagent interacts directly or indirectly with the constituent to be determined. Direct interaction is preferably in the case of the determination of DNA with reagents that attach to the DNA. In this case, the attachment can be covalent or noncovalent. Certain substances integrate into double-stranded and single-stranded DNA without covalent binding with the DNA (intercalators). In part, the substances only gain the property of fluorescence. By accumulation in the DNA and irradiation with light of certain wavelengths, these substances emit light of different wavelengths, which is quantitatively measurable and correlated with the amount of DNA. Fluorescent dyes may also be other than intercalators and be contacted by chemical modification with the DNA to be measured. In a further preferred embodiment, the detection reagent is selected from the group comprising Pico-Green TM, Alexa or Sytox® dyes, ethidium bromide and SYBR® dyes.
  • a quantitative determination of a substance in the measuring range is carried out.
  • the detection reagent when interacting with the target molecule, it is advantageous for the detection reagent, when interacting with the target molecule, to change its properties such that it becomes detectable.
  • intercalators become detectable only upon incorporation into nucleic acids, whereas in the unbound state they do not exhibit this property.
  • the detection reagent used in the present invention may already be detectable prior to interaction with the target molecule, but preferably alters its pertinent properties upon interaction with the target molecule. This is preferably done by shifting the absorption maximum or the emission wavelength of a detection reagent.
  • the measurement of the non-cell-bound DNA preferably comprises the determination of the fluorescence emission after addition of a fluorescent dye to the plasma or serum.
  • fluorophores can be used within the scope of the invention.
  • suitable fluorophores 1.5 IAEDANS, 1,8-ANS, 4-methylumbelliferone, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, 5- (and-6) -carboxy-2' , 7'-dichlorofluorescein pH 9.0, 5-carboxy-2,7-dichlorofluorescein, 5 carboxyfluorescein (5-FAM), 5-carboxynapthofluorescein (pH 10), 5-carboxytetramethylrhodamine (5-TAMRA), 5-FAM (5-carboxyfluorescein ), 5-FAM pH 9.0, 5-HAT (hydroxy tryptamine), 5-hydroxy tryptamine (HAT), 5-ROX (5-carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt), 5-ROX (carboxy-X-rhodamine) , 5-ROX pH 9.0, 5-HAT (hydroxy tryptamine),
  • Particularly preferred here are 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, 7-AAD (7-aminoActinomycin D), acridine orange, DNA & RNA, acridine red, Alexa Fluor 594 TM, Alexa Fluor 610 R-Phycoerythrin streptavidin pH 7.2, Alexa Fluor 647 R-Phycoerythrin Streptavidin pH 7.2, Alexa Fluor 633 TM, Alexa Fluor 647 TM, Alexa Fluor 660 TM, Alexa Fluor 680 TM, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, allophycocyanin (APC), BOBO-3 DNA, BOBO TM -3, Bodipy 650/665-X, Cy5.5 TM , Cy5 TM , DAPI, DDAO, Draq5, ethidium bromide , Ethidium monoazide, ethidium homodimer, ethidium homodimer-1 (Eth
  • Pico-Green TM and / or SYTOX Green are preferred.
  • the dose of Pico-Green TM is preferably about 0.01 to 5 ⁇ l of reagent, preferably 0.05 to 2 ⁇ l, more preferably 0.1 to 0.5 ⁇ l of reagent, most preferably 0.15 to 0.3 ⁇ l Reagent per measurement at approx. 40 ⁇ l sample volume.
  • the amount of reagent used is adjusted to the sample volume.
  • the amount of solid in its content of detection reagent corresponds to the content of dissolved solid in o.g. Volumes.
  • the opening of the device has a one-way valve.
  • the opening has a Luer lock.
  • the filter area is formed or delimited by a, preferably elastic, film.
  • the film is preferably made of an artificial or natural polymer or mixed polymer.
  • the device is a disposable device.
  • the filter is designed to separate serum and / or plasma from the blood. In this case, preferably no lysis of the blood cells takes place, which can influence the measurement result.
  • Such substances may be, for example, titanium dioxides or colestyramine.
  • the device in particular with respect to their dimensions, compatible with commercially available detection devices.
  • detection devices include, in particular, commercially available photometers, such as, for example, the Picofluor, TBS380 (Turner Biosystems, USA) or the qubit (Invitrogen, USA).
  • the device and / or at least portions of the device to the dimensions of a commercially available cuvette and preferably has a diameter of about 10mm and / or a length of about 50 mm +/- 15 mm or by means of an adapter to the size of a commercially available cuvette customized.
  • the device in particular for use with the qubit device, a cuvette in the form of a PCR tube (preferably with a use volume of 0.5 ml) on.
  • the cuvette may be miniaturized, z. B. from a clear tube made of plastic or glass, with a filling volume of about 20-100 ul, a length of about 5-25mm and an inner diameter of about 1-4 mm.
  • the device has at least one venting device.
  • the venting takes place preferably by means of a narrow groove, a channel or a gap, preferably of a few mm length, which (r) opens into the measuring chamber or from this and the other end via a membrane of the outside air or environment is disconnected.
  • This membrane is preferably a semi-permeable membrane which is permeable to air or gas but not aqueous fluid.
  • the semipermeable membrane is particularly preferably attached to the lower end of the tube, preferably as a closure of the tube.
  • the present apparatus provides an apparatus having an integrated automatic size measurement chamber.
  • the measuring range preferably connects in the filling direction or flow direction of the fluid behind the filter and fills due to the design, arrangement and vent preferably free of air bubbles with filtrate or filtered fluid. This is preferably done in a precisely determinable and correct amount, suitable or matched to the amount of Detektionsreagenz so that after filling to the semipermeable membrane no further flow can take place.
  • the volume is determined by the volumes of the fluid spaces in the cuvette part.
  • the present invention thus allows, in particular, an automatic quantity measurement or quantity predetermination with the advantage that in particular pipetting or other fluid handling is not necessary.
  • the measuring region can also already be partially prefilled, wherein this prefilling can have a dilution buffer with a detection reagent.
  • the remaining fillable volume of the measuring range can then be filled with a quantity of filtered fluid limited by the residual volume and thus defined and can be measured after a short incubation time in a fluorescence photometer. After balancing the measured value thus obtained with a standard taking into account one blank value (or blanks), the amount of a substance that is contained in the fluid can be determined.
  • the venting device is connected to the measuring chamber by a narrow groove or a gap, which is arranged opposite to the inlet opening of the measuring chamber.
  • the measuring range is in the form of a conventional (PCR) tube, more preferably with a ventilation device, before or is designed as such, on which the remaining device is attached.
  • PCR PCR
  • the device preferably has at least one second measuring range. This enables the simultaneous determination of several measured values or the simultaneous determination of one or more calibration values. Preferably, the device has at least one further measuring range for providing a blank or calibration value.
  • the component to be determined interacts with two detection reagents.
  • the detection or the concentration determination is carried out with two detection reagents in a two-step reaction.
  • the first binding detection reagent interacts specifically with the constituent to be determined.
  • This first reagent is preferably coupled to a detectable substance.
  • the detectable substance preferably corresponds to one of the above-mentioned fluorescent dyes.
  • the second detection reagent is immobilized to a certain area in the measurement area.
  • the first detection reagent is preferably located in the device in an area in front of the measuring area, for example in a fluid channel, filter area or in a mixing chamber leading thereto.
  • the blood or the separated plasma or serum should come into contact with the first detection reagent, so that the latter can bind to the substance to be determined.
  • the complex of the substance to be determined and the first detection reagent then passes with the plasma or serum into the measurement area, where it binds to a second detection reagent which is in a certain range of the measurement range is immobilized. By accumulating the complex at this point, the constituent to be determined becomes detectable. Excess first detection reagent remains evenly distributed in serum or plasma.
  • a control value can be determined which reflects the concentration of the first detection reagent distributed throughout the solution.
  • This control value can also be programmed as a threshold or limit value into a suitable measuring instrument via software.
  • both reagents added for the detection are regarded as detection reagents, whereby the first detection reagent does not have to change its property of detectability upon binding of the constituent to be determined, as described above. However, it is preferred that the first detection reagent has this property.
  • Both detection reagents bind directly to the component to be determined, so that the actual detection or determination of the component by detection of the first detection reagent, while the second detection reagent fixes the antigen at a position and this position after enrichment as a result of a finite flow with antigen-containing Liquid is supplied to a photo-optical measurement.
  • the detection reagents are preferably antibodies or antibody fragments.
  • the antibody is coupled to a substance to be detected.
  • a substance to be detected for example, R-phycoerythrin (PE), fluorescein isothiocyanate (FITC), PE-Cy5 allophycocyanin (APC), PE-Texas Red TM , Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP), PerCP-Cy5.5, APC-Cy7, and / or Texas Red TM , etc.
  • Components to be determined in a two-step reaction are, for example, endogenous substances such as interleukin 6 (IL-6), hemoglobin, bilirubin, CRP, lactoferrin, procalcitonin, AT-III, protein C, p24 (HIV) or antibodies. Even foreign substances such as viruses, bacteria, drugs, toxins, drugs or fragments of the substances mentioned can thus be determined.
  • endogenous substances such as interleukin 6 (IL-6), hemoglobin, bilirubin, CRP, lactoferrin, procalcitonin, AT-III, protein C, p24 (HIV) or antibodies.
  • the device according to the invention thus enables the qualitative and / or quantitative determination of a blood component, in particular without further, manual or laboratory work steps.
  • the present invention also relates to a method for detecting, in particular, for determining the concentration of constituents in blood, preferably using a device of the present invention.
  • the method comprises the steps of (a) providing a device comprising a measurement region, a filter and a detection reagent, (b) introducing a fluid into the device, and (c) detecting the concentration of the component using the device.
  • the step of detecting the concentration of the component is preferably carried out using a conventional measuring device, preferably a fluorescence photometer.
  • the present invention also relates to the use of a device or method of the present invention for determining constituents in blood, such as, bilirubin, free hemoglobin, IL-6 or p24 (HIV protein), CRP. Further preferred is the use for the determination of cell-free DNA. Hemoglobin or bilirubin is preferably measured by measuring the photoabsorption using appropriate wavelengths or by measuring the intrinsic characteristic fluorescence of these substances.
  • the present invention further relates to a kit comprising at least one device according to the present invention, and a (fluorescence) standard of e.g. B. may contain DNA.
  • the kit preferably further comprises a syringe, preferably with accessories for taking blood from a patient, and / or a measuring device.
  • the kit preferably comprises a manual with interpretation aids.
  • the measuring device may further comprise a device, which is particularly suitable for measuring the samples which were produced with the device. This may include software that allows storage and management of the data. This may include an adapter cable. It may further include a battery pack that allows off-grid measurements.
  • the inventive device such as in FIG. 1 and 8th is used to detect and preferably determine the concentration of constituents in fluids.
  • the fluid is blood and the component to be determined is DNA.
  • the device after Fig. 1-7 comprises a measuring region 3 and a filter region 5 in fluid communication with the latter.
  • the filter region 5 and the measuring region 3 are preferably connected to one another via a first fluid channel 7.
  • the device 1 preferably further comprises an opening 9, which is preferably designed as a Luer-lock and further preferably with a one-way valve.
  • the opening 9 is preferably located directly at the fluid inlet region of the filter region 5 or is connected thereto via a tube 11, preferably comprising a polymer, preferably of polyvinyl chloride (PVC) or polyethylene (PE).
  • PVC polyvinyl chloride
  • PE polyethylene
  • the filter region 5 is preferably elastic and bag-like and further or additionally preferably made of soft PVC, PE, a mixed or composite polymer.
  • the opening 9 is preferably formed, for example by training as Luer-Lock, that a commercial syringe (not shown) can be connected to it.
  • a such syringe filled fluid, in particular blood introduced via the opening 9 and optionally the tube 11 in the filter area 5.
  • the filter region 5 is preferably designed such that it experiences a predetermined expansion when introducing a certain amount or a certain volume of fluid, which in turn causes a certain pressure on the interior of the filter region 5. Materials to be introduced or required volume and the like are preferably coordinated accordingly.
  • the formation of the opening 9 with a one-way valve prevents the escape of the pressurized, in the fluid input area of the or filter area (s) 5 existing fluid.
  • the fluid contained in it is forced through a filter, preferably a special membrane, which is furthermore preferably welded into the filter region 5.
  • the filter area 5 preferably has an outlet which opens into the fluid channel 7, which in turn leads to the measuring area 3.
  • the filter is preferably arranged in such a way that the pressurized fluid present in the filter region 5 is transported through the filter (not shown) into the fluid channel 7 and thus into the measuring region 3.
  • the fluid thus filtered preferably the blood plasma, and in particular preferably a predetermined volume of blood plasma, is thus provided in the measuring chamber 3.
  • the apparatus further comprises a detection reagent, preferably Pico-Green TM , which is provided in the measuring chamber 3 and / or in the fluid channel 7 in such a way that it collects with the blood plasma or serum flowing through the fluid channel and / or with that collected in the measuring chamber 3 Blood plasma or serum comes into contact and in particular interacts, preferably such that a detection, in particular a determination of the concentration of constituents in the fluid or blood plasma, is made possible.
  • a detection reagent preferably Pico-Green TM
  • the device and in particular the volumes of measuring area 3, filter area 5 and fluid channel 7 (respectively part 17) and the properties of the filter area 5 with respect to elasticity and pressure build-up and the filter with respect to the filter and passage properties are coordinated such that in the measuring chamber. 3 or in the fluid channel 7 (or part 17) a predetermined amount of blood plasma is present, which interacts with a predetermined amount of detection reagent.
  • the measuring chamber 3 and / or the fluid channel 7 (or part 17) is preferably coated on its interior area communicating with the blood plasma, at least partially with a detection reagent, which preferably contains or consists of Pico-Green TM or SytoxGreen. Furthermore, a rapidly dissolvable pellet which has a detection reagent can also be positioned in the region of the measuring chamber 3 or the fluid channel 7 (or part 17).
  • a channel descends from the measuring area 3.
  • a channel preferably opens into a vent opening or vent recess or recess 15, which is preferably arranged in the outer region of the device and is sealed with a semi-permeable membrane (not shown) from the environment.
  • a semi-permeable membrane (not shown) from the environment.
  • a membrane preferably has the property that, seen from the inside of the device, it is permeable to air or gaseous media, but not to liquid media or blood plasma.
  • the channel and the venting area 15 are designed to discharge excess air present outwardly into the environment when filling the filter area 5 or the fluid channel 7 and the measuring area 3 in the device 1, in other words to vent the device 1. This advantageously allows, in particular, the introduction of a defined volume of liquid into the measuring area.
  • the device 1 thus allows automatic filling of the measuring region 3 with a defined amount of blood plasma and mixing with a detection reagent.
  • the device and the fluid present in the measuring range preferably blood plasma, are accessible in particular to a photo-optical detection.
  • a photo-optical detection As described above, for example, for the purpose of detecting free DNA by means of an intercalating fluorescent dye such as Pico-Green TM .
  • the detection reagent is preferably applied to the inside of the measuring chamber 5 or the measuring channel, preferably via ink jet, and dried. Alternatively or additionally, the detection reagent is present as dust or pellet present in the measuring chamber or, for example, within the inflow channel as easily soluble material.
  • the device preferably has a diameter of about 10 mm and a length or height of about 50 mm +/- 15 mm.
  • the measuring area is preferably at least partially transparent or translucent, in particular in order to ensure an optical detection of the component to be detected or determined, preferably by means of a fluorescence measurement.
  • FIGS. 2 to 6 or 7
  • FIGS. 2 to 4 Devices that are basically related to the design and operation of FIG. 1
  • these devices have a plurality of measuring regions 3, and preferably 2 or 3 measuring regions, wherein these measuring regions can be arranged differently.
  • the general structure and the operation is on the above description of FIG. 1 directed.
  • Ventilation channels 13 and vent areas 15 are adapted to perform several parallel measurements, or evidence or determinations, each of the measuring ranges 3 and / or fluid channels 7 may have the same or different detection reagents.
  • At least one of the measuring ranges is provided for determining a blank value.
  • a blank or zero value is a value used to compare the sample to be measured.
  • blood plasma filtered as a blank can be measured without reagent in the blank measurement range, which then indicates approximately autofluorescence.
  • a calibration value can be formed, preferably with the measurement of a fluid of the same type, which is mixed with standardized amounts of the substance to be measured. More preferably, a calibration value can be formed by measuring a cuvette, which is filled, for example, with a fluid that is optically similar to the blood plasma or else a plastic and has a stable, defined fluorescence. Based on these values, the corresponding measured value of the sample (s) is evaluated. So you can z. B. make a standard daily measurement and make each of the patient a blank and a reading of the analyte of interest.
  • the corresponding preferred embodiments thus allow the simultaneous performance of parallel, identical measurements or parallel different measurements.
  • the preferred embodiments also have the same design as in FIGS. 2 to 6 (or 7), the volumes of measuring range 3, filter area 5 and fluid channels 7 and the properties of the Filter range 5 in terms of elasticity and pressure build-up and the filter with respect to the filter and passage properties matched to one another such that in the measuring chambers 3 and in the fluid channels 7, a predetermined amount of blood plasma is present, which interacts with a predetermined amount of Detektionsreagenz (ien).
  • FIG. 5 again shows a preferred embodiment according to the invention of a device having a measuring chamber, wherein only a modified, flow-optimized measuring region 3 (see FIG FIG. 5a, FIG. 5 ) is shown.
  • a modified, flow-optimized measuring region 3 see FIG FIG. 5a, FIG. 5 .
  • FIG. 6 shows a further preferred embodiment of a device according to the invention according to a mixing chamber 25, in which there is preferably a reagent which binds to the / to be measured component (s), a further chamber 20 is arranged downstream.
  • a detection reagent for example an antibody, is firmly bound to a substrate which preferably at least partially contains silicon dioxide (eg glass) or polystyrene or polyurethane.
  • a component to be measured for example an antigen
  • a component to be measured then combines in the filter region 5, mixing chamber 25 and / or the channel 7 with a first detection reagent, for example a fluorescence-labeled antibody, and on further flow in the chamber 20 by another to the substrate bound antibody to the substrate and thus determines the presence of the antigen and / or its concentration by fluorescence photometric measurement of the chamber 20.
  • a first detection reagent for example a fluorescence-labeled antibody
  • Both detection reagents can bind to different regions of the component to be determined, in the case of antibodies to different epitopes of the antigen.
  • FIG. 7 shows a schematic view of a preferred device according to the invention with a disc-shaped filter 16.
  • Fig. 7a shows a schematic plan view of the device and
  • Fig. 7b a schematic View of the device according to Fig. 7a from above from above Fig. 7a , The remaining arrangement shown corresponds to those already described.
  • FIG. 8 shows a schematic plan view of a preferred embodiment of a device according to the invention with a tube-like cuvette 17, which has a z. B. may contain pelleted, readily soluble reagent 23.
  • This device according to the invention also allows automatic filling of the measuring range with a defined amount of blood plasma and mixing with a detection reagent.
  • the part 17 is preferably provided with a semi-permeable membrane 15 as a closure.
  • the device and the fluid present in the measuring range, preferably blood plasma, are accessible in particular to a photo-optical detection.
  • the tube-like, translucent measuring cuvette has a length of about 20 mm, an inner diameter of about 1-4 mm and an outer diameter of about 2-6 mm;
  • FIG. 9 shows a schematic plan view of a preferred embodiment according to the invention of a device in a variant with two tube-like cuvettes 17, in which one can be provided with detection reagent while the other can be measured without reagent, a blank or blank,
  • FIG. 10 shows a schematic plan view of a preferred embodiment according to the invention of a device in a variant with a mixing chamber 20 which may contain a reagent, wherein the reagent in the chamber 20 particularly advantageously mixes with the filtrate.
  • FIG. 11 shows a schematic plan view of a preferred embodiment according to the invention of a device in a variant which allows the automatic filling of the measuring range with a defined amount of previously prepared by conventional methods blood plasma.
  • the tube or tube-like The cuvette has a length of approximately 20 mm and an outer diameter of approximately 2-6 mm and may contain a reagent in the region 19.
  • the present invention thus provides an advantageous apparatus, methods and kit that overcomes the disadvantages of the prior art.
  • the present invention allows separation of plasma or serum from whole blood and analysis of serum or plasma without the need for centrifugation or similar laboratory processing steps of the recovered serum or plasma.
  • the present invention provides a device, a method and a kit that are easy to handle, safe and reliable, and are particularly suitable for use by laymen or non-medically trained personnel as well as simple and inexpensive to manufacture to perform and / or store.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis, insbesondere zur Bestimmung der Konzentration, von Bestandteilen in Blut oder Wasser. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Vorrichtung bzw. eines Verfahrens zur Bestimmung von Bestandteilen in Blut. Schließlich bezieht sich die Erfindung auf einen Kit, umfassend die Vorrichtung und einen Fluoreszenz-Standard.
Die Vorrichtung nach Fig. 1-7 umfasst einen Messbereich (3) sowie einen mit diesem in Fluidverbindung stehenden Filterbereich (5). Der Filterbereich (5) und der Messbereich (3) sind vorzugsweise über einen ersten Fluidkanal (7) miteinander verbunden. Die Vorrichtung (1) weist vorzugsweise ferner eine Öffnung (9) auf, die vorzugsweise als Luer-Lock und weiterhin bevorzugt mit einem Ein-Wege-Ventil ausgebildet ist.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis, insbesondere zur Bestimmung der Konzentration, von Bestandteilen in Blut oder Wasser. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Vorrichtung bzw. eines Verfahrens zur Bestimmung von Bestandteilen in Blut. Schließlich bezieht sich die Erfindung auf einen Kit, umfassend die Vorrichtung und einen DNA-Standard.
  • Nachfolgend wird eine Reihe von Dokumenten zitiert. Der Inhalt dieser Dokumente inklusive Bedienungsanleitungen ist hiermit in seiner Gesamtheit durch Referenz inkorporiert.
  • Verfahren zur medizinischen Diagnose werden routinemäßig verwendet, um anhand der Bestimmung der Anwesenheit und/oder der Konzentration von im Blut gelösten Stoffen den klinischen Status von Patienten abschätzen zu können. Bislang müssen Analysen des Blutplasmas und/oder Serums mit einem Zentrifugationsschritt durchgeführt werden, damit das zu analysierende Blutplasma von den festen Blutbestandteilen getrennt werden kann. Offensichtlich existieren keine geeigneten alternativen Verfahren oder eine Vorrichtung zur Abtrennung der festen Blutbestandteile. Zentrifugation ist nicht nur zeitaufwändig, sondern stellt gerade auch in Entwicklungsgebieten eine große Hürde dar, weil dort oftmals nicht nur Mangel an geeigneten Zentrifugen sondern auch am Strom zu deren Betreibung herrscht. Außerdem gibt es in vielen Gebieten der Erde oftmals kein Fachpersonal, das ohne weiteres Blutanalysen mit bekannten Mitteln durchführen könnte.
  • Es besteht daher Bedarf an einer Vorrichtung bzw. einem Verfahren, die/das die Analyse von in Blutplasma und/oder Serum befindlichen Stoffen insbesondere ohne Zentrifugation ermöglicht. Überdies sollte eine entsprechende Vorrichtung oder ein Verfahren auch ungeübtem Personal ohne zeitaufwändige Einarbeitung den schnellen, sauberen und richtigen Umgang mit solchen Analysen ermöglichen.
  • In US 5,186,843 wird ein Material zur Trennung von Plasma oder Serum aus Blut beschrieben. Das Material umfasst Glasmikrofasern, Zellulosefasern und synthetische Textilspinnfasern. Dieses Medium wird verwendet, um geringe Mengen Plasma zu erhalten, das sich innerhalb der zur Abtrennung verwendeten Schicht sammelt. Dabei sind jedoch die weiterhin nötige Sammlung und weitere Handhabung der Flüssigkeit für eine schnelle und saubere Diagnose hinderlich.
  • In US 4,816,224 wird eine Vorrichtung zur Abtrennung von Plasma oder Serum von Vollblut beschrieben, die unterschiedlich gestaltet sein kann. Glasfasern, die ein großes Volumen einnehmen, dienen zur Abtrennung. Die Vorrichtung kann mehrere Filterschichten aufweisen.
  • In US 2006/0029923 wird eine Vorrichtung beschrieben, die mittels einer in der Vorrichtung angebrachten Filtermembran und Druck die Auftrennung von Plasma oder Serum von festen Blutbestandteilen ermöglicht. Die entsprechende Vorrichtung kann einen Detektionsstreifen enthalten, der den Nachweis von Bestandteilen im Blut durch immunochemische Nachweisverfahren ermöglicht. Diese Streifen ermöglichen allerdings keinen direkten Nachweis ohne weitere vom Personal auszuführende Schritte und ohne die Verwendung weiterer Hilfsmittel bzw. Hilfsstoffe. Die Vorrichtung ist primär zur Gewinnung von Blutplasma oder Serum zur weiteren Untersuchung gedacht.
  • Vorrichtungen wie oben beschrieben dienen also hauptsächlich zur Bereitstellung geringer Mengen von Plasma oder Serum für weitere Analysen.
  • Mit vorhandenen Verfahren und Vorrichtungen zur Untersuchung von Plasma oder Serum und/oder anderer Körperflüssigkeiten, die auf den schnellen Erhalt eines Messergebnisses ausgelegt sind, können oftmals nur Richtwerte erhalten werden und nicht selten nur Aussagen über das Vorhandensein oder die Abwesenheit von zu messenden Bestandteilen einer Flüssigkeit gemacht werden. So geben beispielsweise Teststreifen nur Auskunft darüber, ob ein Stoff im Rahmen der Nachweiskapazität vorhanden ist oder nicht. Im Rahmen der Diagnose bestimmter Krankheiten und/oder Zustände in Proben aus Patienten sind diese Verfahren bzw. Vorrichtungen jedoch oftmals nicht geeignet, da nur genaue Messwerte über die Konzentration oder den Gehalt eines Stoffes in einem Fluid, z.B. Blut, Aufschluss geben über den genauen Zustand des Patienten und geeignete Behandlungsmethoden.
  • Es ist somit eine der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik überwinden. Insbesondere ist es eine Aufgabe, eine Vorrichtung bereitzustellen, mittels derer die Trennung von Plasma oder Serum von Vollblut und eine Analyse von im Serum oder Plasma befindlichen Stoffen durchgeführt werden kann, ohne dass Zentrifugationsschritte oder ähnliche labortechnische Verarbeitungsschritte des gewonnenen Serums oder Plasmas notwendig sind. Weitere oder zusätzliche Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind die Bereitstellung einer einfach, sicher und zuverlässig zu handhabenden Vorrichtung bzw. eines einfach durchzuführenden Verfahrens, das insbesondere eine Verwendung bzw. Durchführung durch Laien bzw. nicht medizinisch geschultes Personal erlaubt, das Bereitstellen einer Vorrichtung, die einfach und kostengünstig herzustellen und/oder zu Lagern ist, sowie die Bereitstellung eines entsprechenden Kits.
  • Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen definierten Merkmale gelöst.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich vorzugsweise auf eine Vorrichtung zum Nachweis, insbesondere zur Bestimmung der Konzentration, von Bestandteilen in Blut, aufweisend einen Messbereich, ein Filter sowie mindestens ein Detektionsreagenz zum Wechselwirken mit den Bestandteilen.
  • Im Falle einer Messung von Autofluoreszenz oder Absorption von Fluidbestandteilen kann auch auf ein Detektionreagenz verzichtet werden.
  • Unter "Nachweis" von beispielsweise Stoffen versteht man insbesondere die Feststellung der An- oder Abwesenheit eines Stoffes. Dabei legt die Nachweisgrenze des Messverfahrens im Rahmen der erwünschten Genauigkeit das Ergebnis fest.
  • Die "Konzentration" von Stoffen ist, insbesondere im Gegensatz zur absoluten Stoffmenge, volumenunabhängig.
  • Unter "Bestandteilen in Blut" versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere in Blut vorhandene und/oder gelöste Stoffe. Die Stoffe können insbesondere organisch oder anorganisch oder eine Mischung aus beidem sein. Grundsätzlich lassen sich mit der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung auch Bestandteile aus anderen Fluiden bestimmen. Fluide sind hier als Flüssigkeiten mit festen Bestandteilen oder Supensionen zu verstehen. Vorzugsweise ist das Fluid eine Körperflüssigkeit. Körperflüssigkeiten sind zum Beispiel Blut, Liquor, Urin, seröse Flüssigkeiten, Speichel, Sperma oder krankhaft veränderter Stuhl.
    Vorzugsweise ist das Fluid Wasser, insbesondere aus Leitungen, Bächen oder Seen etc. Hier kann beispielsweise bestimmt werden, ob eine gemessene DNA mit der Belastung des Wassers durch Mikroorganismen korreliert.
  • Ein "Messbereich" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Raum, vorzugsweise mit einem definierten oder definierbaren Volumen, in dem mindestens ein Bestandteil eines Fluids bestimmt wird. Er ist vorzugsweise zumindest teilweise transparent und insbesondere für die Bestimmung der Substanz beziehungsweise des Bestandteils mit vorzugsweise optischen Verfahren geeignet.
  • Zur Verwendung mit bevorzugten Detektionsreagenzien, die bspw. durch Licht bestimmter Wellenlängenbereiche angeregt werden und Licht von bestimmten Wellenlängebereichen emittieren, ist der Messbereich vorzugsweise für z. B. sichtbares Licht sowie das Licht der Emissionswellenlängen durchlässig.
  • Das Filter in der vorliegenden Erfindung kann jedes zur Auftrennung von Blut oder anderen Fluiden mit festen Bestandteilen geeignete Material umfassen oder aus einem solchen bestehen. Das Filter kann zum Beispiel Polyethyleneterephthalat (vertrieben beispielsweise durch die Firma Sekisui in einem Produkt zur Gewinnung von Serum) oder BTSSP (vertrieben durch die Firma Pall) umfassen.
  • Bereits bekannte geeignete Filter und/oder Filtermaterialien sind z. B. in US 4,816,224 , US 5,186,843 oder US 2006/0029923 beschrieben.
  • Vorzugsweise umfasst das Filter Glasfasern, besteht jedoch nicht vollständig aus Glasfasern. Noch weiter bevorzugt liegt der Volumen- oder Gewichtsanteil an Glasfasern zwischen 0% und 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% oder 10% oder er liegt zwischen etwa 5% und 50% des Filters, bevorzugt zwischen etwa 10% und 50%. Am meisten bevorzugt ist ein Filtermaterial ohne Glasfasern. Für die Filtrierung von Blut sollte das Filtermaterial keine Hämolyse verursachen sowie keine Analyten binden.
  • Unter "Detektionsreagenz" im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird insbesondere eine Substanz, mit der die Anwesenheit und/oder die Konzentration einer anderen Substanz, bevorzugt einer in einem Fluid, z. B. Blut, Plasma oder Wasser befindlichen Substanz, nachgewiesen oder detektiert werden kann, verstanden. Dabei weist ein Detektionsreagenz vorzugsweise die Eigenschaft auf, unter bestimmten Bedingungen eine detektierbare Reaktion zu ermöglichen oder zu bedingen. Ein Detektionsreagenz interagiert vorzugsweise direkt mit der zu bestimmenden Substanz. Dabei geht es entweder eine kovalente oder eine nichtkovalente Bindung mit dieser Substanz ein. Bevorzugt fluoresziert das Detektionsreagenz verstärkt erst durch die Bindung an das Analyt.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vorzugsweise eine gebrauchsfertige oder ready-to-use Vorrichtung, die den Nachweis und insbesondere Bestimmung der Konzentration der Bestandteile auf einfache und zuverlässige Weise ohne umfangreiche vorbereitende Maßnahmen ermöglicht. Die vorliegende Erfindung erweist sich insbesondere dahingehend als vorteilhaft, dass eine Vorrichtung bereitgestellt wird, die klein ist, mit handelsüblichen Geräten ausgelesen werden kann und/oder die Trennung der festen Bestandteile aus Fluiden, vorzugsweise aus Blut, mit der gleichzeitigen Messung von in der flüssigen Phase befindlichen Bestandteilen verbindet. Auf diese Weise wird nicht nur der Zentrifugationsschritt eingespart, der bislang notwendig war, um z.B. feste Blutbestandteile vom Serum oder Plasma abzutrennen, sondern es wird durch einfache und sichere Handhabung auch ungeübtem Personal die Analyse von Fluiden im Rahmen von diagnostischen Verfahren ermöglicht. Ein weiterer Vorteil ist die nun mögliche genaue Bestimmung der Konzentration von Bestandteilen beispielsweise zur Abschätzung des Zustandes von Patienten nach Operationen oder bei bestimmten Krankheitszuständen. Schließlich ermöglicht die vorliegende Vorrichtung die sofortige Messung der interessierenden Bestandteile (ready-to-use) ohne weitere Behandlung und/oder Verzögerung oder weitere notwendige Messschritte.
  • Vorzugsweise weist die Vorrichtung eine Öffnung zum Einbringen eines Fluids auf, wobei das Filter zwischen Öffnung und Messbereich angeordnet ist.
  • Vorzugsweise weist die Vorrichtung ferner einen Fluideingangsbereich auf, der vorzugsweise zwischen der Öffnung und dem Messbereich, weiter bevorzugt zwischen Öffnung und Filter angeordnet ist.
  • Im folgenden wird der Bereich zwischen der Öffnung und dem Messbereich und/oder dem Fluidkanal, vorzugsweise umfassend den Fluideingangsbereich, auch unter dem Begriff Filterbereich zusammengefasst.
  • Der Filterbereich hat vorzugsweise ein Fassungsvermögen von zwischen ca. 200 und ca. 2000 µl. Dabei können je nach Fluid- bzw. bevorzugt Blutmenge und - beschaffenheit bis zu 200 µl Plasma oder Serum zur Messung im Messbereich gewonnen werden. Vorzugsweise erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung die Bereitstellung eines zu messenden Volumens im Messbereich zwischen ca. 15 µl und ca. 80 µl, bevorzugt zwischen ca. 20 µl und ca. 60 µl und am meisten bevorzugt von ca. 40 µl Serum oder Plasma.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgt vorzugsweise die Bestimmung von Bestandteilen in Serum oder Plasma bzw. Blutserum oder Blutplasma.
  • Unter "Plasma" versteht man vorzugsweise insbesondere die von festen Bestandteilen wie Zellen (Erythrozyten, weiße Blutzellen etc.) getrennte flüssige Phase des Blutes, die noch gerinnen kann.
  • Unter "Serum" versteht man vorzugsweise insbesondere den flüssigen Anteil des Blutes, der nach Gerinnung des Blutes durch Abtrennung der mit Thrombozyten und Gerinnungsfaktoren zum Blutkuchen vermischten zellulären Bestandteile erhalten wird.
  • Grundsätzlich kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Substanz mit geeigneten Nachweisreagenzien bestimmt werden. Vorzugsweise ist der nachzuweisende oder zu bestimmende Bestandteil eine in Organismen vorkommende Substanz. In Organismen vorkommende Substanzen können organischer oder anorganischer Natur sein. Anorganisch sind zum Beispiel Mineralien oder Mineralsalze, Spurenelemente, anorganische lonen, Metalle und Schwermetalle, etc.
  • Organische Substanzen können unterschiedlichen Substanzklassen angehören. Eine Gruppe von Substanzen bilden Proteine, zu denen auch Enzyme gehören. Enzyme wandeln ihr Substrat in ein Endprodukt um. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise sowohl das Enzym als auch das Substrat und/oder das Endprodukt bestimmt werden. Auch Nicht-Enzymproteine können vorzugsweise mit der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung nachgewiesen oder bestimmt werden. Weitere Gruppen von organischen Substanzen umfassen Vitamine und Coenzyme, Nukleinsäuren, Cytokine, Hormone, Histone, Peptide, Zucker, etc.
  • Eine weitere Gruppe von Substanzen bilden Nukleinsäuren, die DNA und RNA in ihren einzel- und/oder doppelsträngigen Formen umfassen.
  • Vorzugsweise ist der nachzuweisende oder zu bestimmende Bestandteil ein biologisches Molekül, ausgewählt aus der Gruppe umfassend DNA, RNA, Proteine, Hormone, Cytokine. Die letztgenannten Stoffe können frei oder vergesellschaftet sein mit anderen Proteinen. Beispielsweise kann DNA in Plasma oder Serum auch als Komplex mit Histonen und/oder Elastase sowie Mikrosatelliten auftreten. Weiterhin bevorzugt ist der nachzuweisende oder zu bestimmende Bestandteil die DNA/RNA von intakten oder nicht intakten Bakterien, Viren und/oder Parasiten aus mit sonstigen Partikeln verschmutzten Wasserproben. Hierbei werden Partikel durch die Filtrierung zurück gehalten, während die in Mikroorganismen enthaltene Nukleinsäure durch geeignete Fluoreszenzfarbstoffe einer Messung zugänglich gemacht werden kann.
  • Vorzugsweise ist der nachzuweisende oder zu bestimmende Bestandteil ein Arzneistoff. Arzneistoffe sind einem Individuum verabreichbare Stoffe zur Bekämpfung eines krankhaften Zustands oder einer Krankheit. Arzneistoffe können auch die oben genannten biologischen Moleküle sein.
  • Am meisten bevorzugt wird DNA bestimmt bzw. gemessen. Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Filter bindet bevorzugt nur wenig oder keine DNA. Der gebundene Anteil beträgt vorzugsweise weniger als 30%, bevorzugt weniger als 20%, am meisten bevorzugt weniger als 10% der im Fluid bzw. Blut enthaltenen DNA.
  • Qualitativ wie quantitativ lässt sich DNA auf vielerlei Art und Weise nachweisen. Dazu gehören PCR Verfahren ebenso wie der Nachweis durch spezifisch mit DNA interagierenden detektierbaren Agenzien. Die vorliegende Erfindung erlaubt bevorzugt die Bestimmung nicht zellgebundener DNA. Nicht zellgebundene DNA lässt sich mittels unterschiedlicher Verfahren bestimmen. Neben der Messung der Fluoreszenz nach Zugabe eines interkalierenden Farbstoffes wird auch die Messung der UV-Absorption von DNA zur Konzentrationsbestimmung herangezogen. Die hierfür notwendigen Probenvolumina sind inzwischen im niedrigen µl-Bereich angelangt (z. B. Messung mittels NanoDrop im Bereich ab 2 µl). Die untere Messgrenze für DNA liegt z. Zt. etwa bei 10 ng/ml für das Fluoreszenzverfahren.
  • Nach größeren Operationen, insbesondere auch mit Herz-Lungen-Maschine, aber auch nach Unfällen mit Polytraumen, Sepsis, Verbrennungen sowie nach Ischämie/Reperfusionskrankheit (nach arteriellem Verschluss) kommt es zu starken, mitunter überschießenden Aktivierungen des Immunsystems. Exemplarische, jedoch nicht abschließend, Krankheitszustände sind Operation, Polytrauma, Weichteiltrauma, Ischämie/Reperfusionskrankheit, Infarkt, Ischämie, Embolie, Infektion, Sepsis, Transplantation, Vergiftung, Eklampsie, Nebenwirkungen von Medikamenten oder von Transfusionen. Diese können vorübergehende oder bleibende Schäden in Organen verursachen, aber auch zum Tode führen. Die zelluläre Komponente dieser Immunantwort wird durch neutrophile Granulozyten vermittelt. Zur Abschätzung der Folgen der Aktivierung ist es wichtig, über das Ausmaß des Geschehens zeitnah im Bilde zu sein.
  • Wie in US 60/827,571 offenbart, steigt die Konzentration nicht zellgebundener von Granulozyten freigesetzter DNA im Blut bei Vorliegen bestimmter pathologischer Ereignisse, die nicht durch Krebs oder Pathogene bedingt sind, an. Diese nicht zellgebundene DNA könnte je nach pathologischem Zustand frei und/oder in Form von so genannten NETs vorliegen, mit Proteinen dekorierten DNA-Netzwerken, die in diesem Falle nicht nur für die Abwehr von Mikroorganismen produziert werden, sondern auch allgemein im Zuge von Immunantworten freigesetzt werden, die durch bestimmte pathologische Ereignisse verursacht werden. Während Teile dieser NETs an den Kapillaren kleben bleiben, reißt ein weiterer Teil infolge des Blutstroms ab und befindet sich im Plasma und Serum.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung und ein Verfahren bereit, die NETs nachzuweisen, die bereits innerhalb von Minuten nach Aktivierung der sie produzierenden Granulozyten freigesetzt werden. Der Nachweis in Proben von Patienten kann zu rechtzeitigen Reaktionen von Seiten der behandelnden Ärzte führen, die Leben retten können.
  • Weitere im Blut befindliche freie DNA wird aus abgestorbenen Zellen freigesetzt. Diese Zellen können durch apoptotische oder nekrotische Ereignisse abgestorben sein. Im Zuge mancher Therapien, zum Beispiel von Krebs mit Chemo- oder Strahlentherapie wird die Apoptose von Zellen, unter anderem von Blutzellen induziert. Der Therapieerfolg lässt sich somit direkt und fein abgestuft mit der vorliegenden Erfindung nachweisen.
  • Vorzugsweise ist das Vorhandensein und/oder die Konzentration des Bestandteils im Messbereich, vorzugsweise in Abhängigkeit des verwendeten Detektionsreagenz, mittels Lumineszenz, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Elektrochemilumineszenz, spektrale Absorptionsphotometrie, Autofluoreszenz und/oder Biolumineszenz bestimmbar.
  • Vorzugsweise ist das Filter ausgebildet, feste Bestandteile des das Filter durchfließenden Fluids abzutrennen, und insbesondere die feste und flüssige Phase des Fluids voneinander zu trennen. Einige Filtermaterialien können sich als sehr spröde oder brüchig erweisen, so dass eine Stabilisierung notwendig ist. Abhängig von der Beschaffenheit des Filters kann es ein Element zur Stabilisierung enthalten. Stabilisierungselemente sind vorzugsweise stabilisierende Umrandungen oder Rahmen oder aufgelagerte oder integrierte Netzwerke eines stabilen Materials, wie zum Beispiel Metall oder Kunststoff.
  • Vorzugsweise ist der Fluideingangsbereich, der vorzugsweise vom Filterbereich umfasst ist, der Vorrichtung derart ausgebildet, dass ein über Umgebungsdruck liegender Druck auf das Fluid ausgeübt wird. Die Vorrichtung ist vorzugsweise derart ausgebildet, dass ein solcher Druck beim Einbringen des Fluides, vorzugsweise durch eine Spritze oder dgl, aufgebaut wird.
  • Bevorzugt ist die Vorrichtung derart ausgebildet, dass das Fluid unter Druck durch das Filter in den Messbereich eingebracht wird. Dieser Druck kann vorzugsweise manuell ausgeübt werden, z. B. durch den Kolben einer Spritze, die das zu messende ungefilterte Fluid enthält.
  • Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform herrscht in der Vorrichtung ein unter dem Umgebungsdruck liegender Druck, vorzugsweise ein Vakuum. Wird die zu bestimmende Probe mit der Vorrichtung in Kontakt gebracht, bewirkt der niedrige Druck bzw. das Vakuum, dass die Probe ohne von außen ausgeübte Kraft in die Vorrichtung geleitet oder gesaugt wird und im Inneren der Vorrichtung die festen Bestandteile vom Fluid abgetrennt werden. Dabei ist der Messbereich vorzugsweise aus einem vorzugsweise elastischen Material, dass bestrebt ist, eine definierte Position oder Form einzunehmen. Vorzugsweise ist die Vorrichtung aus elastischem Material, das derart verformt ist, dass das Innenvolumen der Messkammer kleiner als das der definierten Position ist, so dass es sich z.B. beim Einleiten der Probe entfaltet bzw. die Probe beim Entfalten einsaugt. Weiterhin vorzugsweise ist der Messbereich aus einem unelastischen Material, wobei der Bereich innerhalb des Messbereichs einen niedrigeren Druck als den Umgebungsdruck aufweist, bevor die Probe in die Vorrichtung gelangt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Detektionsreagenz im Messbereich oder in einem kurz vor dem Messbereich befindlichen Hohlraum/ Lumen, der sich vorzugsweise zwischen Filter und Messbereich erstreckt, vorgesehen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Detektionsreagenz im Filter oder in räumlicher Nähe zum Filter vorgesehen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform interagiert das Detektionsreagenz direkt oder indirekt mit dem zu bestimmenden Bestandteil. Direkte Interaktion erfolgt vorzugsweise im Fall der Bestimmung von DNA mit Reagenzien, die sich an die DNA anlagern. Dabei kann die Anlagerung kovalent oder nichtkovalent erfolgen.
    Bestimmte Substanzen lagern sich in doppelsträngige und auch einzelsträngiger DNA ein, ohne eine kovalente Bindung mit der DNA einzugehen (Interkalatoren). Zum Teil gewinnen die Substanzen erst dadurch die Eigenschaft der Fluoreszenz. Durch die Akkumulation in der DNA und Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenlängen emittieren diese Substanzen Licht unterschiedlicher Wellenlänge, welches quantitativ messbar ist und mit der DNA-Menge korreliert. Fluoreszenzfarbstoffe können auch andere als Interkalatoren sein und durch chemische Modifikation mit der zu messenden DNA in Kontakt gebracht werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Detektionsreagenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend Pico-Green™, Alexa- oder Sytox®-Farbstoffen, Ethidiumbromid und SYBR®-Farbstoffe.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgt bevorzugt eine quantitative Bestimmung einer Substanz im Messbereich. Dazu ist es bei Vorhandensein nur eines Detektionsreagenzes vorteilhaft, dass das Detektionsreagenz bei Interaktion mit dem Zielmolekül seine Eigenschaften dahingehend ändert, dass es detektierbar wird. Wie weiter oben beschrieben, werden Interkalatoren erst bei Einlagerung in Nukleinsäuren detektierbar, wohingegen sie im ungebundenen Zustand diese Eigenschaft nicht aufweisen. Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Detektionsreagenz kann bereits vor Interaktion mit dem Zielmolekül detektierbar sein, ändert jedoch vorzugsweise seine dahingehenden Eigenschaften bei Interaktion mit dem Zielmolekül. Dies erfolgt vorzugsweise durch Verschiebung des Absorptionsmaximums oder der Emissionswellenlänge eines Detektionsreagenzes.
  • Vorzugsweise umfasst die Messung der nicht zellgebundenen DNA die Bestimmung der Fluoreszenzemission nach Zugabe eines Fluoreszenzfarbstoffes zum Plasma oder Serum.
  • Grundsätzlich können alle Fluorophore im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Die folgende nicht vollständige Liste gibt Beispiele für geeignete Fluorophore wieder: 1,5 IAEDANS, 1,8-ANS, 4-Methylumbelliferon, 4',6-Diamidino-2-phenylindol, 5-(and-6)-Carboxy-2', 7'-Dichlorofluorescein pH 9.0, 5-Carboxy-2,7-dichlorofluorescein, 5 Carboxyfluorescein (5-FAM), 5-Carboxynapthofluorescein (pH 10), 5-Carboxytetramethylrhodamin (5-TAMRA), 5-FAM (5-Carboxyfluorescein), 5-FAM pH 9.0, 5-HAT (Hydroxy Tryptamin), 5-Hydroxy Tryptamin (HAT), 5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamin, triethylammonium salz), 5-ROX (Carboxy-X-rhodamin), 5-ROX pH 7.0, 5-TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamin), 6 JOE, 6-Carboxyrhodamin 6G, 6-Carboxyrhodamin 6G pH 7.0, 6-Carboxyrhodamin 6G hydrochlorid, 6-CR 6G, 6-HEX, SE pH 9.0, 6-JOE, 6-TET, SE pH 9.0, 7-AAD (7-Amino-actinomycin D), 7-Amino-4-methylcoumarin, 7-Aminoactinomycin D (7-AAD), 7-Hydroxy-4-methylcoumarin, 9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridin, ABQ, Acid Fuchsin, ACMA, ACMA (9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridin), Acridin Homodimer, Acridinorange, Acridinorange + DNA, Acridinorange, DNA & RNA, Acridinrot, Acridingelb, Acriflavin, Acriflavin Feulgen SITSA, Aequorin, AFPs, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa Fluor 350™, Alexa Fluor 430 Antikörperkonjugat pH 7.2, Alexa Fluor 430™, Alexa Fluor 488 Antikörperkonjugat pH 8.0, Alexa Fluor 488 Hydrazidwasser, Alexa Fluor 488™, Alexa Fluor 532™, Alexa Fluor 546™, Alexa Fluor 568 Antikörperkonjugat pH 7.2, Alexa Fluor 568™, Alexa Fluor 594™, Alexa Fluor 610 R-phycoerythrin-Streptavidin pH 7.2, Alexa Fluor 647 R-phycoerythrin-Streptavidin pH 7.2, Alexa Fluor 633™, Alexa Fluor 647™, Alexa Fluor 660™, Alexa Fluor 680™, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, Alizarin Complexon, Alizarin Rot, Allophycocyanin (APC), AMC, AMCA-S, AMCA (Aminomethylcoumarin), AMCA-X, Aminoactinomycin D, Aminocoumarin, Aminomethylcoumarin (AMCA), Anilinblau, Anthrocylstearat, APC (Allophycocyanin), APC-Cy7, APTRA-BTC, APTS, Astrazon Brilliant Red 4G, Astrazon Orange R, Astrazon Red 6B, Astrazon, Yellow 7 GLL, Atabrin, ATTO-TAG™ CBQCA, ATTO-TAG™ FQ, Auramin, Aurophosphin, Aurophosphin G, BAO 9(Bisaminophenyloxadiazol), BCECF (high pH), BCECF (low pH), BCECF pH 5.5, BCECF pH 9.0, Berberinsulfat, Beta Lactamase, BFP, BFP/GFP FRET, Bimane, bis-Acridinorange, Bisbenzamid, Bisbenzimid (Hoechst), bis-BTC, Blancophor FFG, Blancophor SV, BOBO-3-DNA, BOBO™ -1, BOBO™ -3, Bodipy 492/515, Bodipy 493/503, Bodipy 500/510, Bodipy 505/515, Bodipy 530/550, Bodipy 542/563, Bodipy 558/568, Bodipy 564/570, Bodipy 576/589, Bodipy 581/591, Bodipy 630/650-X, Bodipy 650/665-X, Bodipy 665/676, Bodipy FI, Bodipy FL ATP, BODIPY FL conjugate, BODIPY FL, MeOH, Bodipy FI-Ceramid, Bodipy R6G SE, Bodipy TMR, Bodipy TMR-X Konjugat, Bodipy TMR-X, SE, Bodipy TR, Bodipy TR ATP, BODIPY TR-X Phallacidin pH 7.0, Bodipy TR-X SE, BODIPY TR-X, MeOH, BODIPY TR-X, SE, BOPRO-3, BO-PRO-3-DNA, BO-PRO™ -1, BO-PRO™ -3, Brilliant Sulphoflavin FF, BTC, BTC-5N, Calcein, Calceinblau, Calcein pH 9.0, Calcein/Ethidium Homodimer, Calcium Crimson, Calcium Crimson Ca2+, Calcium Crimson™, Calcium Green, Calcium Green-1, Calcium Green-1 Ca2+, Calcium Green-2, Calcium Green-5N, Calcium Green-C18, Calcium Orange, Calcofluor White, Carboxy-X-rhodamine (5-ROX), Cascade Blue, Cascade Blue BSA pH 7.0, Cascade Blue™, Cascade Yellow, Cascade Yellow antibody conjugate pH 8.0, Catecholamine, CCF2 (GeneBlazer), CFDA, CFP, CFP (Cyan Fluorescent Protein), CFP/YFP FRET, Chlorophyll, Chromomycin A, Chromomycin A, CI-NERF pH 2.5, CI-NERF pH 2.5, CI-NERF pH 6.0, CI-NERF pH 6.0, CL-NERF, CMFDA, Coelenterazin, Coelenterazin cp, Coelenterazin f, Coelenterazin fcp, Coelenterazin h, Coelenterazin hcp, Coelenterazin ip, Coelenterazin n, Coelenterazin O, Coumarin Phalloidin, C-phycocyanine, CPM, CTC, CTC Formazan, Cy2™, Cy3.1 8, Cy3.5™, Cy3™, Cy5.1 8, Cy5.5™, Cy5™, Cy7™, Cyan 3, Cyan 6" Cyan GFP, cyclic AMP Fluorosensor (FiCRhR), CyQuant, CyQUANT GR-DNA, Dabcyl, Dansyl, Dansylamin, Dansylcadaverine, Dansylchlorid, Dansyl DHPE, Dansylfluorid, DAPI, Dapoxyl, Dapoxyl 2, Dapoxyl 3, DCFDA, DCFH (Dichlorodihydrofluoresceindiacetat), DDAO, DHR (Dihydorhodamin 123), Di-4-ANEPPS, Di-8 ANEPPS, Di-8-ANEPPS (non-ratio), Di-8-ANEPPS-lipid, DiA (4-Di-16-ASP), Dichlorodihydrofluoresceindiacetat (DCFH), DiD, DIDS, Dihydorhodamin 123 (DHR), Dihydroethidium, DiI (DiIC18(3)), DiIC18 ("DiD") Dinitrophenol, DiO (DiOC18(3)), DiR, DiR (DiIC18(7)), DM-NERF (high pH), DM-NERF pH 4.0, DM-NERF pH 7.0, DNP, Dopamin, DsRed, Draq5, DTAF, DY-630-NHS, DY-635-NHS, EBFP, ECFP, eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein), EGFP, eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), ELF 97, Eosin, Eosin Antikörperkonjugat pH 8.0, Erythrosin, Erythrosin ITC, Ethidiumbromid, Ethidiummonoazid, Ethidium Homodimer, Ethidium Homodimer -1 (EthD-1), Ethidium Homodimer-1-DNA, Ethidium Homodimer-2, Euchrysin, EukoLight, Europium-(III)-chlorid, EYFP, eYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), Fast Blue, FDA, Feulgen (Pararosanilin), FIF (Formaldehyd Induced Fluorescence), FITC, FITC Antikörper, FITC Antikörperkonjugat pH 8.0, Flazo Orange, Fluo-3, Fluo-3 Ca2+, Fluo-4, Fluorescein, Fluorescein (FITC), Fluorescein 0.1 M NaOH, Fluorescein Antikörperkonjugat pH 8.0, Fluoresceindextran pH 8.0, Fluoresceindiacetat, Fluorescein pH 9.0, Fluoro-Emerald, Fluoro-Gold (Hydroxystilbamidin), Fluor-Ruby, FluorX, FM 1-43, FM 1-43 lipid, FM 1-43™, FM 4-64, Fura Red Ca2+, Fura Red, high Ca, Fura Red, low Ca, Fura Red™ (high pH), Fura Red™/Fluo-3, Fura-2, high calcium, Fura-2, low calcium, Fura-2/BCECF, Genacryl Brilliant Red B, Genacryl Brilliant Yellow 10GF, Genacryl Pink 3G, Genacryl Yellow 5GF, GeneBlazer (CCF2), GFP (S65T), GFP red shifted (rsGFP), GFP wild type, non-UV excitation (wtGFP), GFP wild type, UV excitation (wtGFP), GFPuv, Gloxalic Acid, Granular Blue, Haematoporphyrin, HcRed, Hexidium iodide, Hoechst 33258 (bis-benzimid), Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, HPTS, Hydroxycoumarin, Hydroxystilbamidin, Hydroxystilbamidin (FluoroGold), Hydroxytryptamin, Indo-1, high calcium, Indo-1, low calcium, Indodicarbocyanin (DiD), Indotricarbocyanin (DiR), Intrawhite, Cf, JC-1, JO-JO-1, JO-PRO-1, LaserPro, Laurodan, LDS 751, LDS 751 (DNA), LDS 751 (RNA), Leucophor PAF, Leucophor SF, Leucophor WS, Lissamine Rhodamine, Lissamine Rhodamine B, LIVE/DEAD Kit Animal Cells, , LOLO-1, LO-PRO-1, Lucifer Yellow, Lucifer Yellow, CH, Lyso Tracker Blue, Lyso Tracker Blue-White, Lyso Tracker Green, Lyso Tracker Red, Lyso Tracker Yellow, LysoSensor Blue, LysoSensor Green, LysoSensor Green pH 5.0, LysoSensor Yellow pH 3.0, LysoSensor Yellow/Blue, Mag Green, Magdala Red (Phloxin B), Mag-Fura Red, Mag-Fura-2, Mag-Fura-5, Mag-Indo-1, Magnesium Green, Magnesium Green Mg2+, Magnesiumorange, Malachitgrün, Marina Blue, Maxilon Brilliant Flavin 0 GFF, Maxilon Brilliant Flavin 8 GFF, Merocyanin, Methoxycoumarin, MitoTracker Green, Mitotracker Green FM, MitoTracker Green FM, MeOH, Mitotracker Orange, MitoTracker Red, MitoTracker Red, MeOH, Mitramycin, Monobromobiman, Monobromobiman (mBBr-GSH), Monochlorobiman, MPS (Methyl Green Pyronine Stilbene), MRFP, NBD, NBD Amin, NBD-X, NBD-X, MeOH, NeuroTrace 500/525, green fluorescent Nissl stain-RNA, Nile Blue, EtOH, Nilrot, Nilrot-lipid, Nissl, Nitrobenzoxadidol, Noradrenalin, Nuclear Fast Red, Nuclear Yellow, Nylosan Brilliant lavin E8G, OliGreen®, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 488 antibody conjugate pH 8.0, Oregon Green 488-X, Oregon Green 514, Oregon Green 514 antibody conjugate pH 8.0, Oregon Green™, Oregon Green™ 488, Oregon Green™ 500, Oregon Green™ 514, Pacific Blue, Pacific Blue Antikörperkonjugat pH 8.0, Pararosanilin (Feulgen), PBFI, PE-Cy5, PE-Cy7, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-TexasRed [Red 613], Phloxin B (Magdala Red), Phorwite AR, Phorwite BKL, Phorwite Rev, Phorwite RPA, Phosphin 3R, PhotoResist, Phycoerythrin B [PE], Phycoerythrin R [PE], PicoGreen dsDNA quantitation reagent, PKH26 (Sigma), PKH67, PMIA, Pontochrome Blue Black, POPO-1, POPO-1-DNA, POPO-3, POPO™-3 iodide, PO-PRO-1, PO-PRO-1-DNA, PO-PRO-3, Primulin, Procion Yellow, Propidiumiodid (PI), Propidiumiodid-DNA, PyMPO, Pyren, Pyronin, Pyronin B, Pyrozal Brilliant Flavin 7GF, QSY 7, Quinacrin Mustard, Red 613 [PE-TexasRed], Resorufin, RH 414, Rhod-2, Rhodamin, Rhodamin 110, Rhodamin 110 pH 7.0, Rhodamin 123, Rhodamin 123, MeOH, Rhodamin 5 GLD, Rhodamin 6G, Rhodamin B, Rhodamin B 200, Rhodamin B extra, Rhodamin BB, Rhodamin BG, Rhodamin Green, Rhodamin Phallicidin, Rhodamin Phalloidin, Rhodaminrot, Rhodamin WT, Rhodamingrün pH 7.0, Rhodol Green POPO-1-DNA pH 8.0, Ribogreen, Rose Bengal, R-phycocyanin, R-phycoerythrin (PE), R-Phycoerythrin pH 7.5, RsGFP, S65A, S65C, S65L, S65T, Sapphire GFP, SBFI, Serotonin, Sevron Brilliant Red 2B, Sevron Brilliant Red 4G, Sevron Brilliant Red B, Sevron Orange, Sevron Yellow L, sgBFP™, sgBFP™ (super glow BFP), sgGFP™ (super glow GFP), SITS, SITS (Primuline), SITS (Stilbene Isothiosulphonic Acid), SNAFL calcein, SNAFL-1, SNAFL-2, SNARF calcein, SNARF1, Sodium Green, Sodium Green Na+, Spectrum Red, SpectrumAqua, SpectrumGreen, SpectrumOrange, SPQ (6-methoxy-N-(3-sulfopropyl)quinolinium), Stilbene, Sulphorhodamine B can C, Sulphorhodamine G Extra, SYBR® Green, SYBR® Green I, SYBR® Green II, SYBR® Gold, SYBR® Safe DNA, SYPRO Ruby, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 13-DNA, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 45-DNA, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Blue-DNA, SYTOX Green, SYTOX Orange, Tetracyclin, Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas Red™, Texas Red-X POPO-1-DNA pH 7.2, Texas Red-X™ conjugate, Thiadicarbocyanin (DiSC3), Thiazinrot R, Thiazolorange, Thioflavin 5, Thioflavin S, Thioflavin TCN, Thiolyte, Tinopol CBS (Calcofluor White), TMR, TO-PRO®-1 iodide, TO-PRO®-3 iodide, TO-PRO-1, TO-PRO-1-DNA, TO-PRO-3, TO-PRO-5, TOTO-1, TOTO-1-DNA, TOTO-3, TriColor (PE-Cy5), TRITC TetramethylRodaminelsoThioCyanat, True Blue, TruRed, Ultralite, Uranin B, Uvitex SFC, wt GFP, WW 781, X-Rhod-1 Ca2+, X-Rhodamin, XRITC, Xylenorange, Y66F, Y66H, Y66W, Yellow GFP, YFP, YO-PRO®-1 iodide, YO-PRO-1, YO-PRO-1-DNA, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-1-DNA, YOYO-3
  • Besonders bevorzugt sind hierbei 4',6-diamidino-2-Phenylindol, 7-AAD (7-aminoActinomycin D), Acridineorange, DNA & RNA, Acridinrot, Alexa Fluor 594™, Alexa Fluor 610 R-Phycoerythrin Streptavidin pH 7.2, Alexa Fluor 647 R-Phycoerythrin Streptavidin pH 7.2, Alexa Fluor 633™, Alexa Fluor 647™, Alexa Fluor 660™, Alexa Fluor 680™, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, Allophycocyanin (APC), BOBO-3-DNA, BOBO™ -3, Bodipy 650/665-X, Cy5.5™, Cy5™, DAPI, DDAO, Draq5, Ethidiumbromid, Ethidiummonoazid, Ethidium Homodimer, Ethidium Homodimer-1 (EthD-1), Ethidium Homodimer-1-DNA, Ethidium Homodimer-2, Hoechst 33258, Hoechst 33342, LDS 751, LDS 751 (DNA), LOLO-1,MitoTracker Red, Nile Blue-EtOH, OliGreen®, PicoGreen dsDNA Quantifizierungsreagenz, POPO-1-DNA, PO-PRO-1-DNA, Propidiumiodid (PI), Propidiumiodid-DNA, Ribogreen, SYBR® Green I, SYBR® Green II, SYBR® Gold, SYBR® Safe DNA, SYPRO Ruby, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTOX Orange, Texas Red™, TO-PRO-1-DNA, TO-PRO-3, TO-PRO-5, TOTO-1-DNA, TOTO-3,YO-PRO-1-DNA, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-1-DNA und YOYO-3.
  • Am meisten bevorzugt ist Pico-Green™ und/oder SYTOX Green.
  • Dabei liegt die Dosis an Pico-Green™ vorzugsweise bei etwa 0,01 bis 5 µl Reagenz, bevorzugt bei 0.05 bis 2 µl, noch weiter bevorzugt 0,1 bis 0.5 µl Reagenz, am meisten bevorzugt bei 0,15 bis 0,3 µl Reagenz pro Messung bei ca. 40 µl Probenvolumen. Die Menge an verwendetem Reagenz wird dabei dem Probenvolumen angepasst. Bei Vorhandensein des Detektionsreagenzes in fester Form entspricht die Menge an Feststoff in ihrem Gehalt an Detektionsreagenz dem Gehalt an gelöstem Feststoff in o.g. Volumina.
  • Vorzugsweise weist die Öffnung der Vorrichtung ein Ein-Wege-Ventil auf.
    Weiterhin vorzugsweise weist die Öffnung ein Luer-Lock auf. Ferner bevorzugt ist der Filterbereich durch eine, vorzugsweise elastische, Folie ausgebildet bzw. abgegrenzt. Die Folie ist vorzugsweise aus einem künstlichen oder natürlichen Polymer oder auch Mischpolymer.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung eine EinwegVorrichtung.
  • Vorzugsweise ist das Filter ausgebildet, um Serum und/oder Plasma vom Blut abzutrennen. Hierbei findet bevorzugt keine Lyse der Blutzellen statt, die das Messergebnis beeinflussen kann.
  • Innerhalb des Filters können Stoffe vorhanden sein, welche Bilirubin, Hämoglobin oder dispergierte Lipide (auch Micellen) entfernen (binden) können. Solche Stoffe können beispielsweise Titandioxide oder Colestyramin sein.
  • Bei der Bestimmung von DNA können Restmengen an Thrombozyten vorhanden sein, ohne die Messung an sich nachteilig zu beeinflussen. Bei Messungen anderer Bestandteile ist eine vollständige Abtrennung der Thrombozyten von Vorteil, die mit einem Filtersandwich bestehend aus mehreren Lagen unterschiedlicher Filter an entsprechender Stelle in der Vorrichtung erfolgen kann.
  • Bevorzugt ist die Vorrichtung, insbesondere betreffend ihre Abmessungen, mit handelsüblichen Detektionsvorrichtungen kompatibel. Dazu gehören insbesondere handelsübliche Photometer, wie zum Beispiel das Picofluor, TBS380 (Turner Biosystems, USA) oder das Qubit (Invitrogen, USA).
  • Bevorzugt weist die Vorrichtung und/oder zumindest Teilbereiche der Vorrichtung die Maße einer handelsüblichen Küvette auf und hat vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 10mm und/oder eine Länge von etwa 50 mm +/-15 mm oder wird mittels eines Adapters an die Größe einer handelsüblichen Küvette angepasst.
  • Auch bevorzugt weist die Vorrichtung, insbesondere für eine Verwendung mit dem Qubit-Gerät, eine Küvette in Form einer PCR-Tube (bevorzugt mit einem Verwendungsvolumen von 0,5ml) auf.
  • Auch bevorzugt kann die Küvette miniaturisiert sein, z. B. aus einem klarem Röhrchen aus Kunststoff oder Glas bestehen, mit einem Füllvolumen von etwa 20-100 µl, einer Länge von etwa 5-25mm und einem Innendurchmesser von etwa 1-4 mm.
  • Vorzugsweise weist die Vorrichtung mindestens eine Entlüftungseinrichtung auf. Die Entlüftung findet vorzugsweise mittels einer schmalen Rinne, eines Kanals oder eines Spaltes, vorzugsweise von wenigen mm Länge, statt, welche(r) in die Messkammer mündet bzw. von dieser abgeht und deren/dessen anderes Ende über eine Membrane von der Außenluft beziehungsweise Umgebung getrennt ist. Diese Membran ist vorzugsweise eine semipermeable Membrane welche für Luft bzw. Gas, nicht jedoch wässriges Fluid durchlässig ist. Im Falle der Verwendung einer Küvette ist die semipermeable Membrane besonders bevorzugt am unteren Ende des Röhrchens, vorzugsweise als Verschluss des Röhrchens angebracht.
  • Die vorliegende Vorrichtung stellt eine Vorrichtung bereit, die eine integrierte Messkammer mit automatischer Mengenabmessung aufweist. Dabei schließt sich der Messbereich vorzugsweise in Einfüllrichtung bzw. Flussrichtung des Fluids hinter dem Filter an und füllt sich infolge der Konstruktion, Anordnung und Entlüftung vorzugsweise luftblasenfrei mit Filtrat beziehungsweise gefiltertem Fluid auf. Dies erfolgt vorzugsweise in einer genau bestimmbaren und korrekten Menge, passend oder abgestimmt auf die Menge des Detektionsreagenz, so dass nach Befüllung bis zur semipermeablen Membran kein weiterer Fluss stattfinden kann. Dabei ist das Volumen determiniert durch die Volumina der Fluidräume in dem Küvettenteil. Die vorliegende Erfindung erlaubt somit insbesondere eine automatische Mengenabmessung bzw. Mengenvorbestimmung mit dem Vorteil, dass insbesondere pipettieren oder sonstiges Fluidhandling nicht notwendig ist.
  • Der Messbereich kann auch bereits teilweise vorgefüllt sein, wobei diese Vorfüllung einen Verdünnungspuffer mit einem Detektionsreagenz aufweisen kann. Das verbleibende füllbare Volumen des Messbereichs kann dann mit einer durch das Restvolumen limitierten und damit definierten Menge an gefiltertem Fluid gefüllt und kann nach einer kurzen Inkubationszeit in einem Fluoreszenzphotometer gemessen werden. Nach Abgleich des so erhaltenen Messwertes mit einem Standard unter Berücksichtigung eins Leerwertes (oder Blanks) kann die Menge eines Stoffes, der in dem Fluid enthalten ist, bestimmt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Entlüftungseinrichtung mit der Messkammer durch eine schmale Rinne oder einen Spalt verbunden, der/die gegenüber der Eingangsöffnung der Messkammer angeordnet ist.
  • Vorzugsweise liegt der Messbereich in Form eines herkömmlichen (PCR-) Röhrchens, weiter bevorzugt mit einer Belüftungseinrichtung, vor bzw. ist als solches ausgebildet, auf das die verbleibende Vorrichtung aufgesteckt ist.
  • Vorzugsweise weist die Vorrichtung mindestens einen zweiten Messbereich auf. Damit werden die gleichzeitige Bestimmung von mehreren Messwerten oder die gleichzeitige Bestimmung eines oder mehrerer Eichwerte möglich. Vorzugsweise weist die Vorrichtung mindestens einen weiteren Messbereich zur Bereitstellung eines Leer- bzw. Eichwerts auf.
  • Vorzugsweise interagiert der zu bestimmende Bestandteil mit zwei Detektionsreagenzien. In diesem Falle erfolgt der Nachweis bzw. die Konzentrationsbestimmung mit zwei Detekionsreagenzien in einer Zweischrittreaktion. Dabei interagiert das zuerst bindende Detektionsreagenz spezifisch mit dem zu bestimmenden Bestandteil. Dieses erste Reagenz ist bevorzugt an eine detektierbare Substanz gekoppelt. Die detektierbare Substanz entspricht vorzugsweise einem der obengenannten Fluoreszenzfarbstoffe.
  • Vorzugsweise ist das zweite Detektionsreagenz an einen bestimmten Bereich im Messbereich immobilisiert.
  • Vorzugsweise befindet sich das erste Detektionsreagenz in der Vorrichtung in einem Bereich vor dem Messbereich, z.B. in einem dorthin führenden Fluidkanal, Filterbereich oder in einer Mischkammer. Vor Eintritt in den Messbereich soll das Blut bzw. das abgetrennte Plasma oder Serum mit dem ersten Detektionsreagenz in Kontakt gelangen, so dass letzteres an den zu bestimmenden Stoff binden kann. Der Komplex aus zu bestimmendem Stoff und erstem Detektionsreagenz gelangt dann mit dem Plasma oder Serum in den Messbereich, wo er an ein zweites Detektionsreagenz bindet, das in einem bestimmten Bereich des Messbereiches immobilisiert ist. Durch die Akkumulation des Komplexes an dieser Stelle wird der zu bestimmende Bestandteil nachweisbar. Überschüssiges erstes Detektionsreagenz bleibt gleichmäßig im Serum oder Plasma verteilt. Es kann ein Kontrollwert bestimmt werden, der die Konzentration des in der gesamten Lösung verteilten ersten Detektionsreagenzes widerspiegelt. Dieser Kontrollwert kann auch als Schwellen- oder Grenzwert in ein geeignetes Messgerät über eine Software einprogrammiert sein. Im Falle dieser Zweischrittreaktion betrachtet man beide zum Nachweis zugesetzten Reagenzien als Detektionsreagenzien, wobei das erste Detektionsreagenz nicht wie oben beschrieben seine Eigenschaft der Detektierbarkeit bei Bindung des zu bestimmenden Bestandteils ändern muss. Es ist jedoch bevorzugt, dass das erste Detektionsreagenz diese Eigenschaft aufweist. Beide Detektionsreagenzien binden direkt an den zu bestimmenden Bestandteil, so dass der eigentliche Nachweis bzw. die Bestimmung des Bestandteils durch Detektion des ersten Detektionsreagenz erfolgt, während das zweite Detektionsreagenz das Antigen an einer Position fixiert und diese Position nach einer Anreicherung infolge eines finiten Durchströmens mit antigenhaltiger Flüssigkeit einer fotooptischen Messung zugeführt wird.
  • In dieser Zweischrittreaktion sind die Detektionsreagenzien vorzugsweise Antikörper oder Antikörperfragmente. Im Falle des ersten Detektionsreagenzes ist der Antikörper an eine zu detektierende Substanz gekoppelt. Hierfür eignen sich z.B. R-Phycoerythrin (PE), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), PE-Cy5 Allophycocyanin (APC), PE-Texas Red™, Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP), PerCP-Cy5.5, APC-Cy7, und/oder Texas Red™, usw.
  • In einer Zweischrittreaktion zu bestimmende Bestandteile sind zum Beispiel körpereigene Stoffe wie Interleukin 6 (IL-6), Hämoglobin, Bilirubin, CRP, Lactoferrin, Procalcitonin, AT-III, Protein C, p24 (HIV) oder Antikörper. Auch körperfremde Stoffe wie Viren, Bakterien, Medikamente, Gifte, Drogen oder Fragmente der genannten Stoffe können so zur Bestimmung gelangen.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht so die qualitative und/oder quantitative Bestimmung eines Blutbestandteils, insbesondere ohne weitere, manuelle oder labortechnische Arbeitsschritte.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zum Nachweis, insbesondere zur Bestimmung der Konzentration, von Bestandteilen in Blut, vorzugsweise unter Verwendung einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren umfasst die Schritte (a) Bereitstellen einer Vorrichtung aufweisend einen Messbereich, ein Filter und ein Detektionsreagenz, (b) Einbringen eines Fluids in die Vorrichtung, und (c) Nachweisen des bzw. Messen der Konzentration des Bestandteils unter Verwendung der Vorrichtung. Der Schritt des Nachweisens des bzw. Messens der Konzentration des Bestandteils erfolgt vorzugsweise unter Verwendung einer herkömmlichen Messeinrichtung, vorzugsweise ein Fluoreszenzphotometer.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung einer Vorrichtung bzw. eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von Bestandteilen in Blut, wie z.B., Bilirubin, freiem Hämoglobin, IL-6 oder p24 (HIV-Protein), CRP. Weiter bevorzugt ist die Verwendung zur Bestimmung von zellfreier DNA. Hämoglobin oder Bilirubin wird vorzugsweise gemessen durch Messung der Photoabsorption bei Verwendung geeigneter Wellenlängen oder auch durch Messung der charakteristischen Eigenfluoreszenz dieser Stoffe.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Kit, umfassend mindestens eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, und einen (Fluoreszenz-) Standard der z. B. DNA enthalten kann. Der Kit umfasst weiterhin vorzugsweise eine Spritze, vorzugsweise mit Zubehör zur Entnahme von Blut von einem Patienten, und/oder eine Messeinrichtung. Weiterhin umfasst der Kit vorzugsweise eine Bedienungsanleitung mit Interpretationshilfen. Die Messeinrichtung kann weiterhin ein Gerät umfassen, welches besonders zur Messung der Proben, welche mit der Vorrichtung hergestellt wurden, geeignet ist. Dazu kann eine Software gehören, welche eine Speicherung und Verwaltung der Daten erlaubt. Hierzu kann ein Adapterkabel gehören. Es kann weiter ein Batteriepack dazugehören, welches netzunabhängige Messungen ermöglicht.
  • Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben. Hierbei zeigen:
    • Figur 1
    eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem Messbereich wobei Figur 1a eine schematische Draufsicht der Vorrichtung und Figur 1b einen schematischen Schnitt in einer Seitenansicht der bevorzugten Vorrichtung zeigt;
    Figur 2
    eine schematische Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung mit zwei parallelen Messbereichen;
    Figur 3
    eine schematische Draufsicht auf eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung mit zwei Messbereichen;
    Figur 4
    eine schematische Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung mit drei Messbereichen;
    Figur 5
    schematische Draufsichten auf weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wobei Figur 5a eine bevorzugte Ausführungsform mit einem flußoptimierten Messbereich und Figur 5b eine bevorzugte Ausführungsform mit anders flußoptimierten Messbereich darstellen;
    Figur 6
    eine schematische Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung mit integriertem Immunassay mit einem Plasma Reservoir;
    Figur 7
    eine schematische Ansicht einer bevorzugten erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem scheibenförmig ausgeführten Filter, wobei Fig. 7a eine schematische Draufsicht auf die Vorrichtung darstellt und Fig. 7b eine schematische Ansicht der Vorrichtung gemäß Fig. 7a aus Sicht von oben in Fig. 7a; Figur 8 eine schematisch Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung;
    Figur 9
    eine schematisch Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung;
    Figur10
    eine schematisch Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung; und
    Figur11
    eine schematisch Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung, wie beispielsweise in Figur 1 und 8 gezeigt, dient dem Nachweis und vorzugsweise der Bestimmung der Konzentration von Bestandteilen in Fluiden. Vorzugsweise ist das Fluid Blut und der zu bestimmende Bestandteil DNA.
  • Die Vorrichtung nach Fig. 1-7 umfasst einen Messbereich 3 sowie einen mit diesem in Fluidverbindung stehenden Filterbereich 5. Der Filterbereich 5 und der Messbereich 3 sind vorzugsweise über einen ersten Fluidkanal 7 miteinander verbunden. Die Vorrichtung 1 weist vorzugsweise ferner eine Öffnung 9 auf, die vorzugsweise als Luer-Lock und weiterhin bevorzugt mit einem Ein-Wege-Ventil ausgebildet ist. Die Öffnung 9 befindet sich vorzugsweise direkt am Fluideingangsbereich des Filterbereichs 5 oder ist mit diesem über einen Schlauch 11, vorzugsweise umfassend ein Polymer, vorzugsweise aus Polyvinylchlorid (PVC) oder Polyethylen (PE), verbunden.
  • Der Filterbereich 5 ist vorzugsweise elastisch und beutelartig ausgebildet und weiterhin oder zusätzlich vorzugsweise aus weichem PVC, PE, einem Misch- oder auch Compositpolymer. Die Öffnung 9 ist vorzugsweise derart ausgebildet, beispielsweise durch Ausbildung als Luer-Lock, dass eine handelsübliche Spritze (nicht dargestellt) mit ihr verbunden werden kann. Beispielsweise wird durch eine solche Spritze eingefülltes Fluid, insbesondere Blut, über die Öffnung 9 und gegebenenfalls den Schlauch 11 in den Filterbereich 5 eingebracht. Hierbei ist der Filterbereich 5 vorzugsweise derart ausgebildet, dass er beim Einbringen einer bestimmten Menge bzw. eines bestimmten Volumens an Fluid eine vorbestimmte Dehnung erfährt, die wiederum einen bestimmten Druck auf den Innenraum des Filterbereichs 5 bedingt. Materialien, einzubringendes bzw. benötigtes Volumen und dergleichen sind vorzugsweise dementsprechend aufeinander abgestimmt. Die Ausbildung der Öffnung 9 mit einem Ein-Wege-Ventil verhindert das Austreten des unter Druck stehenden, im Fluideingangsbereich des bzw. Filterbereich(s) 5 vorhandenen Fluids.
  • Durch den nun im Filterbereich 5 herrschenden Druck wird das in ihm enthaltene Fluid durch ein Filter, vorzugsweise eine Spezialmembran, die weiterhin bevorzugt in den Filterbereich 5 eingeschweißt ist, gedrückt.
  • Neben der Öffnung 9 weist der Filterbereich 5 vorzugsweise einen Ausgang auf, der in den Fluidkanal 7 mündet, der wiederum zum Messbereich 3 führt. Vorzugsweise ist das Filter derart angeordnet, dass das im Filterbereich 5 vorhandene, unter Druck stehende Fluid durch das Filter (nicht dargestellt) in den Fluidkanal 7 und damit in den Messbereich 3 transportiert wird. Das so gefilterte Fluid, vorzugsweise das Blutplasma und insbesondere vorzugsweise ein vorbestimmtes Volumen an Blutplasma wird so in der Messkammer 3 bereitgestellt.
  • Das vorgenannte gilt in Analogie ebenso für die bevorzugten Ausführungsformen nach Fig. 8-11, nur das die Teile Messbereich 3, Fluidkanal 7, Entlüftungskanal 13, wie im Zusammenhang mit den Figuren 1-6 beschrieben, in ein Teil 17 integriert wurden, welches vorzugsweise mit einer semipermablen Membrane 15 abgeschlossen wird.
  • Die Vorrichtung weist ferner ein Detektionsreagenz, vorzugsweise Pico-Green™ auf, das in der Messkammer 3 und/oder im Fluidkanal 7 derart vorgesehen ist, dass es mit dem durch den Fluidkanal fließenden Blutplasma oder Serum und/oder mit dem in der Messkammer 3 gesammelten Blutplasma oder Serum in Kontakt kommt und insbesondere interagiert, vorzugsweise derart, dass ein Nachweis, insbesondere eine Bestimmung der Konzentration von Bestandteilen im Fluid bzw. Blutplasma, ermöglicht wird.
  • Hierzu sind die Vorrichtung und insbesondere die Volumina von Messbereich 3, Filterbereich 5 und Fluidkanal 7 (respektive Teil 17) sowie die Eigenschaften des Filterbereichs 5 hinsichtlich Elastizität und Druckaufbau sowie des Filters hinsichtlich der Filter- und Durchlasseigenschaften derart aufeinander abgestimmt, dass in der Messkammer 3 beziehungsweise im Fluidkanal 7 (respektive Teil 17) eine vorbestimmte Menge an Blutplasma vorhanden ist, die mit einer vorbestimmten Menge an Detektionsreagenz interagiert.
  • Vorzugsweise ist die Messkammer 3 und/oder der Fluidkanal 7 (respektive Teil 17) auf ihrem, mit dem Blutplasma in Verbindung tretenden Innenbereich, zumindest teilweise mit einem Detektionsreagenz, welches vorzugsweise Pico-Green™ oder SytoxGreen enthält oder daraus besteht, beschichtet. Weiter kann auch ein schnell lösliches Pellet, das ein Detektionsreagenz aufweist, im Bereich der Messkammer 3 oder der Fluidkanal 7 (respektive Teil 17) positioniert werden.
  • Vorzugsweise geht vom Messbereich 3 ein Kanal, vorzugsweise ein Lüftungskanal 13 ab. Ein solcher Kanal mündet vorzugsweise in einer Entlüftungsöffnung bzw. Entlüftungsaussparung oder Vertiefung 15, die vorzugsweise im Außenbereich der Vorrichtung angeordnet ist und mit einer semipermeablen Membran (nicht dargestellt) gegenüber der Umgebung abgedichtet ist. Eine derartige Membran weist vorzugsweise die Eigenschaft auf, dass sie von der Innenseite der Vorrichtung her gesehen für Luft bzw. gasförmige Medien durchlässig ist, nicht aber für flüssige Medien bzw. Blutplasma. Dementsprechend sind der Kanal und der Entlüftungsbereich 15 dazu ausgebildet, beim Befüllen des Filterbereichs 5 bzw. des Fluidkanals 7 und des Messbereichs 3 in der Vorrichtung 1 vorhandene überschüssige Luft nach außen in die Umgebung abzuführen, in anderen Worten, um die Vorrichtung 1 zu entlüften. Dies erlaubt vorteilhafter Weise insbesondere das Einbringen eines definierten Flüssigkeitsvolumens in den Messbereich.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 erlaubt somit das automatische Füllen des Messbereichs 3 mit einer definierten Menge an Blutplasma und das Mischen mit einem Detektionsreagenz. Die Vorrichtung und das im Messbereich vorliegende Fluid, vorzugsweise Blutplasma, sind insbesondere einer photooptischen Erfassung zugänglich. Gemäß der obigen Beschreibung beispielsweise zum Zwecke der Erfassung freier DNA mittels eines interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffes wie beispielsweise Pico-Green™.
  • Das Detektionsreagenz ist vorzugsweise auf die Innenseite der Messkammer 5 oder des Meßkanals aufgetragen, vorzugsweise via Tintenstrahl, und getrocknet. Alternativ oder zusätzlich wird das Detektionsreagenz als Staub oder Pellet in der Messkammer vorliegend oder beispielsweise innerhalb der Zuflussrinne als leicht lösliches Material vorgesehen. Die Vorrichtung weist vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 10mm und eine Länge bzw. Höhe von etwa 50 mm +/- 15 mm auf.
  • Der Messbereich ist vorzugsweise zumindest teilweise durchsichtig bzw. durchscheinend ausgebildet, insbesondere um eine optische Erfassung des nachzuweisenden bzw. zu bestimmenden Bestandteils, vorzugsweise mittels einer Fluoreszenzmessung, zu gewährleisten.
  • Die vorangegangene Beschreibung, die insbesondere unter Bezug auf Figur 1 erfolgte, gilt entsprechend ebenfalls für die bevorzugten Ausführungsformen gemäß Figuren 2 bis 6 (bzw. 7). Hierbei zeigen die bevorzugten Ausführungsformen gemäß Figuren 2 bis 4 Vorrichtungen, die grundsätzlich hinsichtlich Aufbau und Funktionsweise der im Zusammenhang mit Figur 1 beschriebenen Vorrichtung entsprechen, die jedoch mehrere Messbereiche 3, und vorzugsweise 2 bzw. 3 Messbereiche aufweisen, wobei diese Messbereiche unterschiedlich angeordnet sein können. Betreffend den allgemeinen Aufbau und die Funktionsweise wird auf die obige Beschreibung von Figur 1 verwiesen. Bei der Ausbildung mit mehreren Messbereichen 3 ist lediglich darauf hinzuweisen, dass die unterschiedlichen Messbereiche bzw. die von dem gemeinsamen Filterbereich 5 abgehenden Fluidkanäle 7 und die in Fluidflussrichtung darauf folgenden Messbereiche 3, Lüftungskanäle 13 und Entlüftungsbereiche 15 dazu geeignet sind, mehrere parallele Messungen, bzw. Nachweise oder Bestimmungen durchzuführen, wobei jeder der Messbereiche 3 und/oder Fluidkanäle 7 das gleiche oder aber unterschiedliche Detektionsreagenzen aufweisen kann.
  • Die vorangegangene Beschreibung, die insbesondere unter Bezug auf Figur 1 erfolgte, gilt entsprechend ebenfalls für die bevorzugten Ausführungsformen gemäß Figuren 8-10. Hierbei zeigen die bevorzugten Ausführungsformen gemäß Figuren 8-10 Vorrichtungen, die grundsätzlich hinsichtlich Aufbau und Funktionsweise der im Zusammenhang mit Figur 1-7 beschriebenen Vorrichtung entsprechen,
  • Vorzugsweise ist mindestens einer der Messbereiche, auch als Leerwert-Messbereich bezeichnet, zur Bestimmung eines Leerwertes vorgesehen. Ein Leerwert oder Nullwert ist ein Wert, der zum Vergleich der zu messenden Probe herangezogen wird. Beispielsweise kann als Leerwert gefiltertes Blutplasma ohne Reagenz in dem Leerwert-Messbereich gemessen werden, welches dann etwa eine Autofluoreszenz angibt. Ein Eichwert kann gebildet werden vorzugsweise mit der Messung eines Fluids der gleichen Art, welches mit standardisierten Mengen der zu messenden Substanz versetzt ist. Weiter bevorzugt kann ein Eichwert gebildet werden durch Messung einer Küvette, welche beispielsweise mit einer dem Blutplasma in optischer Hinsicht ähnlichen Flüssigkeit oder aber auch einem Kunststoff gefüllt ist/besteht und eine stabile definierte Fluoreszenz aufweist. Basierend auf diesen Werten wird der entsprechende Messwert der Probe(n) evaluiert. So kann man z. B. täglich eine Standardmessung vornehmen und vom Patienten jeweils einen Leerwert und einen Messwert des interessierenden Analyts vornehmen.
  • Die entsprechenden bevorzugten Ausführungsformen erlauben somit das gleichzeitige Durchführen paralleler, identischer Messungen oder aber paralleler unterschiedlicher Messungen. Wie bereits im Zusammenhang mit der bevorzugten Vorrichtung der Messfigur 1 beschrieben sind auch bei den bevorzugten Ausführungsformen wie in Figuren 2 bis 6 (bzw. 7) dargestellt, die Volumina von Messbereich 3, Filterbereich 5 und Fluidkanälen 7 sowie die Eigenschaften des Filterbereichs 5 hinsichtlich Elastizität und Druckaufbau sowie des Filters hinsichtlich der Filter- und Durchlasseigenschaften derart aufeinander abgestimmt, dass in den Messkammern 3 bzw. in den Fluidkanälen 7 eine vorbestimmte Menge an Blutplasma vorhanden ist, die mit einer vorbestimmten Menge an Detektionsreagenz(ien) interagiert.
  • Figur 5 zeigt wiederum eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung mit einer Messkammer wobei lediglich beispielhaft ein veränderter, flussoptimierter Messbereich 3 (siehe Figur 5a, Figur 5) dargestellt ist. Hiermit soll verdeutlicht werden, dass die Geometrie des Messbereichs 3 nicht als einschränkend zu verstehen ist, sondern beliebige unterschiedliche Ausgestaltungen erfahren kann solange die beschriebene Funktionalität gewahrt ist.
  • Auch _Figur 6 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß der einer Mischkammer 25, in der sich bevorzugt ein Reagenz befindet, das an den/die zu messenden Bestandteil(e) bindet, eine weitere Kammer 20 nachgeordnet ist. In dieser Kammer 20 ist ein Detektionsreagenz, z.B. ein Antikörper, fest an ein Substrat, welches vorzugsweise wenigstens teilweise Siliziumdioxid (z.B. Glas) oder Polystyrol oder Polyurethan enthält, gebunden. Ein zu messender Bestandteil, z.B. ein Antigen, verbindet sich dann im Filterbereich 5, Mischkammer 25 und/oder dem Kanal 7 mit einem ersten Detektionsreagenz, z.B. einem Fluoreszenz markierten Antikörper, und wird bei weiterem Fluss in der Kammer 20 durch einen weiteren an das Substrat gebundenen Antikörper an das Substrat fixiert und damit das Vorhandensein des Antigens und/oder seine Konzentration durch eine fluoreszenzfotometrische Messung der Kammer 20 bestimmt. Beide Detektionsreagenzien können hierbei an unterschiedlichen Bereichen des zu bestimmenden Bestandteiles, im Falle von Antikörpern an unterschiedliche Epitope des Antigens, binden.
  • Figur 7 zeigt eine schematische Ansicht einer bevorzugten erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem scheibenförmig ausgeführten Filter 16. Fig. 7a zeigt dabei eine schematische Draufsicht auf die Vorrichtung und Fig. 7b eine schematische Ansicht der Vorrichtung gemäß Fig. 7a aus Sicht von oben in Fig. 7a. Die verbleibende dargestellte Anordnung entspricht den bereits beschriebenen.
  • Figur 8 zeigt eine schematische Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung mit einer röhrchenartigen Küvette 17, welche eine z. B. pelletierte, leicht lösliche Reagenz 23 enthalten kann. Auch diese erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt das automatische Füllen des Messbereichs mit einer definierten Menge an Blutplasma und das Mischen mit einem Detektionsreagenz. Hierbei ist vorteilhafterweise die Kombination der, bereits beschriebenen, Teile Messbereich 3, Fluidkanal 7, Entlüftungskanal 13 gemäß den in Figuren 1-6 dargestellten Ausführungsformen in das Teil 17 integriert bzw. in diesem angeordnet. Das Teil 17 ist vorzugsweise mit einer semipermeablen Membrane 15 als Verschluss versehen. Die Vorrichtung und das im Messbereich vorliegende Fluid, vorzugsweise Blutplasma, sind insbesondere einer photooptischen Erfassung zugänglich. Die röhrchen- bzw. schlauchartige, lichtdurchlässige Messküvette hat etwa eine Länge von 20mm, einen Innendurchmesser von etwa 1-4mm und einen Außendurchmesser von etwa 2-6 mm;
  • Figur 9 zeigt eine schematische Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung in einer Variante mit zwei röhrchenartigen Küvetten 17, bei der eine mit Detektionsreagenz versehen sein kann während mit der andere ohne Reagenz ein Blank- bzw. Leerwert gemessen werden kann,
  • Figur 10 zeigt eine schematische Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung in einer Variante mit einer Mischkammer 20 die ein Reagenz enthalten kann, wobei sich das Reagenz in der Kammer 20 besonders vorteilhaft mit dem Filtrat mischt.
  • Figur 11 zeigt eine schematische Draufsicht auf eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung in einer Variante welche das automatische Füllen des Messbereichs mit einer definierten Menge mit zuvor durch übliche Methoden hergestelltes Blutplasmas erlaubt. Die röhrchen- bzw. schlauchartige Messküvette hat etwa eine Länge von 20mm und einen Außendurchmesser von etwa 2-6 mm und kann im Bereich 19 ein Reagenz enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit eine vorteilhafte Vorrichtung, Verfahren sowie ein Kit bereit, die die Nachteile des Standes der Technik überwinden. Insbesondere erlaubt die vorliegende Erfindung die Trennung von Plasma oder Serum von Vollblut und eine Analyse von im Serum oder Plasma befindlichen Stoffen durchzuführen, ohne dass Zentrifugationsschritte oder ähnliche labortechnische Verarbeitungsschritte des gewonnenen Serums oder Plasmas notwendig sind. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung, ein Verfahren und ein Kit bereit, die einfach, sicher und zuverlässig zu handhaben bzw. durchzuführen sind, und sich insbesondere zur Verwendung bzw. Durchführung durch Laien bzw. nicht medizinisch geschultes Personal eignen sowie einfach und kostengünstig herzustellen, durchzuführen und/oder zu Lagern ist.

Claims (35)

  1. Vorrichtung zum Nachweis, insbesondere zur Bestimmung der Konzentration, von Bestandteilen in Blut, aufweisend einen Messbereich, ein Filter sowie mindestens ein Detektionsreagenz zum Wechselwirken mit den Bestandteilen.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung eine Öffnung zum Einbringen eines Fluids aufweist, wobei das Filter zwischen Öffnung und Messbereich angeordnet ist.
  3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Vorrichtung ferner einen Fluideingangsbereich aufweist, der vorzugsweise zwischen der Öffnung und dem Messbereich, weiter bevorzugt zwischen Öffnung und Filter angeordnet ist.
  4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der nachzuweisende oder zu bestimmende Bestandteil eine in Organismen vorkommende Substanz ist.
  5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der nachzuweisende oder zu bestimmende Bestandteil ein biologisches Molekül ist, ausgewählt aus der Gruppe umfassend DNA, RNA, Proteine, Hormone, Cytokine.
  6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der nachzuweisende oder zu bestimmende Bestandteil ein Arzneistoff ist.
  7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Vorhandensein und/oder die Konzentration des Bestandteils im Messbereich mittels Lumineszenz, Fluoreszenz, Autofluoreszenz, Chemilumineszenz, Elektrochemilumineszenz, spektrale Absorptionsphotometrie und/oder Biolumineszenz bestimmbar ist.
  8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Filter ausgebildet ist, feste Bestandteile des das Filter durchfließenden Blutes abzutrennen, und insbesondere die feste und flüssige Phase des Blutes voneinander zu trennen.
  9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Fluideingangsbereich ausgebildet ist, dass ein über Umgebungsdruck liegender Druck auf das Blut ausgeübt wird.
  10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung derart ausgebildet ist, dass das Blut unter Druck durch das Filter in den Messbereich eingebracht wird.
  11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in der Vorrichtung ein unter dem Umgebungsdruck liegender Druck herrscht.
  12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detektionsreagenz im Messbereich vorgesehen ist.
  13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detektionsreagenz direkt oder indirekt mit dem Bestandteil interagiert.
  14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detektionsreagenz seine optischen Eigenschaften bei Interaktion mit dem zu bestimmenden Bestandteil ändert.
  15. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detektionsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Pico-Green™, Pico-Green™, Alexa-Farbstoffen, Ethidiumbromid und SYBR® oder Sytox®-Farbstoffe.
  16. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Öffnung ein Ein-Wege-Ventil aufweist.
  17. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Öffnung ein Luer-Lock aufweist.
  18. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Fluideingangsbereich durch eine, vorzugsweise elastische, Folie ausgebildet bzw. abgegrenzt ist.
  19. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung eine Ein-Weg-Vorrichtung ist.
  20. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Filter ausgebildet ist, Serum oder Plasma vom Blut abzutrennen.
  21. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung mit handelsüblichen Detektionsvorrichtungen kompatibel ist.
  22. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung die Maße einer handelsüblichen Küvette oder eines sonstigen handelsüblichen Messgefäßes aufweist und vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 10mm und/oder eine Länge von etwa 50mm +/- 15 mm aufweist oder mittels eines Adapters an die Größe einer handelsüblichen Küvette angepasst wird.
  23. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung mindestens eine Entlüftungseinrichtung aufweist.
  24. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Entlüftungseinrichtung mit der Messkammer durch eine schmale Rinne oder einen Spalt verbunden ist.
  25. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Messbereich der Vorrichtung in Form eines Röhrchens, vorzugsweise mit einer Entlüftungseinrichtung vorliegt.
  26. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung mindestens einen zweiten Messbereich aufweist.
  27. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung mindestens einen Bereich zur Bereitstellung eines Leer- bzw. Eichwerts aufweist.
  28. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der zu bestimmende Bestandteil mit zwei Detektionsreagenzien interagiert.
  29. Vorrichtung nach Anspruch 28, wobei sich das erste Detektionsreagenz in der Vorrichtung vor dem Messbereich befindet.
  30. Vorrichtung nach Anspruch 28 oder 29, wobei das zweite Detektionsreagenz an einen bestimmten Bereich im Messbereich immobilisiert ist.
  31. Verfahren zum Nachweis, insbesondere zur Bestimmung der Konzentration, von Bestandteilen in Blut, vorzugsweise unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, aufweisend die Schritte Bereitstellen einer Vorrichtung mit einem Messbereich und einem Detektionsreagenz, Einbringen von Blut in die Vorrichtung, und Nachweisen des bzw. Messen der Konzentration des Bestandteils unter Verwendung der Vorrichtung.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Blut mittels einer Spritze in die Vorrichtung eingebracht wird, wobei vorzugsweise der zum Filtrieren erforderliche Druck aufgebracht wird.
  33. Verwendung einer Vorrichtung bzw. eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung von Bestandteilen in Blut.
  34. Kit, umfassend die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 30, und einen Fluoreszenz Standard.
  35. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der nachzuweisende oder zu bestimmende Bestandteil ein Protein ist.
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