CN109601010A - 用于样品加工的溶液 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及溶液和使用该溶液的方法，第一种溶液包括聚合物、多元醇和缓冲剂。第二种溶液包括聚合物、多元醇和醇。

Description

用于样品加工的溶液
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月3日提交的美国临时申请号62/331,331和2016年7月28日提交的美国临时申请号62/367,801的权益。
技术领域
本公开一般涉及分析混悬液的方法，且具体地涉及用于覆盖基底上样品的溶液。
背景
目前的诊断方法和技术依赖于解释组织学和细胞学样品。在这些解释中的一个重要方面在于对样品适当成像以便随后分析和加工。可以在随后的加工时从样品获得有价值的诊断信息，这归因于采集的图像的质量。
详细描述
本公开涉及溶液和使用该溶液的方法，第一种溶液包括聚合物、多元醇和醇。第二种溶液包括聚合物、多元醇和缓冲剂。
在以下描述中，术语“样品”用于描述所分析的样本。该样本可以是混悬液、混悬液部分或混悬液成分。例如，当所述混悬液是抗凝全血时，所述样品可以是抗凝全血(即混悬液)、血沉棕黄层(即混悬液部分)或细胞，例如循环肿瘤细胞(即混悬液成分)。
溶液
第一种溶液包括聚合物、多元醇和缓冲剂。聚乙烯醇(“PVA”)或聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)这样的聚合物的最终浓度可以具有第一种溶液的约5-20质量％的终浓度。聚合物可以使第一种溶液从含水状态转变为硬化状态。然而，与多元醇一起起作用，聚合物和多元醇可以使第一种溶液保持凝胶状或凝胶样状态。此外，聚合物例如PVA或PVP不会立即(例如，在至多12小时内)或显著(例如，将发射百分比降低超过50％)淬灭量子点。
多元醇(包括但不限于甘油、丙二醇、季戊四醇)可以具有第一种溶液的约5-30质量％的终浓度。多元醇防止在储存期间冻结并具有高折射率(更接近玻璃而不是水)。
缓冲剂的成分可具有约0.1-100毫摩尔的单独终浓度。将第一种溶液保持在所需pH范围内的缓冲剂可包括但不限于tris-EDTA缓冲剂(“TE缓冲剂”)或磷酸盐缓冲剂。例如，当使用TE缓冲剂时，三(羟甲基)氨基甲烷(“tris”)和乙二胺四乙酸(“EDTA”)可各自分别具有1-100毫摩尔和0.1-10毫摩尔的终浓度。当使用磷酸盐缓冲剂时，磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾各自具有0.1-100毫摩尔的终浓度。在一个实施方案中，第一种溶液可具有以下配方：10质量％的甘油，10质量％的PVA，20mM tris和2mM EDTA。
第二种溶液包括至少一种聚合物、多元醇和醇。所述至少一种聚合物例如聚乙烯醇(“PVA”)或聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)可具有约为第二种溶液0.1-5体积％的终浓度。聚合物可以使第一种溶液从含水状态转变为硬化状态。然而，与多元醇一起起作用，聚合物和多元醇可以使第一种溶液保持粘性、凝胶状或凝胶样状态。此外，聚合物如PVA或PVP不会立即(例如，在至多12小时内)或显著(例如，将发射百分比降低超过50％)淬灭量子点。当使用两种聚合物PVA和PVP时，每种可具有第二种溶液的约0.1-5体积％的终浓度。
多元醇(包括但不限于甘油、丙二醇、季戊四醇)可具有第二种溶液的约0.1-5体积％的终浓度。多元醇可防止在储存期间冻结并具有高折射率(更接近玻璃而不是水)。
醇如乙醇和甲醇可以具有第二种溶液的约70-90体积％的终浓度。醇可以加速干燥并且允许均匀扩散(例如，醇可以降低表面张力和粘度)。
第二种溶液还可以包括将第一种溶液保持在所需pH范围内的缓冲剂，其可以包括但不限于tris-EDTA缓冲剂(“TE缓冲剂”)或磷酸盐缓冲剂。
第一种和第二种溶液还可以包括水，例如蒸馏水或去离子水。
第一种和第二种溶液可以与任何适当的分析方法或技术兼容，但更具体地为细胞外和细胞内分析，包括免疫荧光标记和成像；细胞内蛋白质标记；显色染色；分子分析；基因组分析或核酸分析，包括但不限于基因组测序，DNA阵列，表达阵列，蛋白质阵列和DNA杂交阵列；原位杂交(“ISH”——用于分析DNA和/或RNA的工具，例如基因拷贝数变化)；聚合酶链反应(“PCR”)；逆转录PCR；或分支DNA(“bDNA”——用于分析DNA和/或RNA的工具，例如mRNA表达水平)分析。可以被标记的一些细胞内蛋白质包括但不限于细胞角蛋白(“CK”)，肌动蛋白，Arp2/3，冠蛋白，肌营养不良蛋白，FtsZ，肌球蛋白，膜收缩蛋白，微管蛋白，胶原蛋白，组织蛋白酶D，ALDH，PBGD，Akt1，Akt2，c-myc，胱天蛋白酶，存活蛋白，p27kip，FOXC2，BRAF，磷酸-Akt1和2，磷酸-Erk1/2，Erk1/2，P38MAPK，波形蛋白，ER，PgR，PI3K，pFAK，KRAS，ALKH1，Twist1，Snail1，ZEB1，纤连蛋白，Slug，Ki-67，M30，MAGEA3，磷酸化受体激酶，修饰的组蛋白，染色质相关蛋白和MAGE。
第一和第二种溶液可以与任何适当的染色剂相容，包括有机染料和量子点，因为丙烯酸介质由于脱水过程而损坏有机染料，而水性介质淬灭量子点。换句话说，第一和第二种溶液不会显著降解或影响任何染色剂，无论是否至少部分地归因于第一和第二种溶液的成分或加入第一和第二种溶液的方法。例如，当前述冷冻时，染色剂在与本文公开的溶液接触24小时后可保持至少75％的发射，或者在与本文公开的溶液接触72小时后可保留至少50％的发射。与后续发射相比较的100％的发射是当样品在没有溶液的情况下成像时相应染色剂的发射。
方法
为了获得样品，可以直接从受试者取出样品，或者可以从悬浮液中富集和/或分离样品。可以通过任何适当的富集过程富集样品，包括但不限于基于密度的分离，顺序密度分级分离，磁激活细胞分选，荧光激活细胞分选，差异裂解，耗尽过滤器等。顺序密度分级分离是通过逐步或顺序过程将悬浮液分成级分或将一部分悬浮液分成亚级分的过程，使得每个步骤或顺序导致不同级分或亚级分从上述和随后步骤或顺序中采集或分离。通过用拾取装置例如细胞挑选器、移液器、注射器等选择样品可以从其他悬浮液成分中获得样品。
在获得样品后，可以将样品置于基底上或基底中。此外，可以将样品粘附到基底上，例如用粘附溶液。例如，可以将样品重新悬浮在容器中的粘附溶液中。或者，可以将粘附溶液添加到样品中或与样品混合。将包括至少一部分粘附溶液的重新悬浮样品通过分配器(例如移液器或重复移液器)分配到基底上或分配到基底中，并铺展在基底上。然后，如果适合，可以将样品通过涂布器例如刮板、移液器尖端、刀片包括刀片和基部的两件式涂布器铺展在基底上。或者，可以通过离心、润湿或下垂基底将样品铺展在基底上。将重新悬浮的样品固化以将重新悬浮的样品粘附到基底上。或者，可以将重新悬浮的样品分配到基底上并固化而不铺展在基底上。固化可以在空气中进行，例如在室温下进行；在环境控制室中进行，例如在37℃等。此外，在完成固化步骤之后，样品可以经历额外的固定步骤，例如在福尔马林或任何适合的固定剂中。然后可以对样品进行染色，例如在自动染色器内或通过手动染色。
目标分析物和非目标分析物可具有位于表面上或分析物内的许多不同类型的受体分子。每种类型的受体是能够连接特定连接分子的分子。结果，连接分子能够用于对目标分析物和/或非目标分析物进行分类，并通过将连接到具有一种特殊荧光探针的特定受体的连接分子与之结合来确定悬浮液中存在的目标分析物和/或非目标分析物的特定类型。可以基于各种标记物对分析物进行分类，包括核标记物，细胞内标记物，细胞外标记物(例如膜标记物)和排除标记物。
染色剂是用于标记包括荧光探针和连接分子的生物材料的化合物。荧光探针是在经受光或电磁辐射激发后发光的化合物。荧光探针可以用作示踪剂，用作某些结构的标记，用作生物标记物的标记等。荧光探针可以是分布式的，或者可以通过以下方式标记合适的结构或生物标记物，包括但不限于摄取，选择性摄取，扩散和与连接分子的连接。连接分子可以是结合抗原的抗体，生物标记物，化学引诱物分子，蛋白质等。在适当的情况下，连接分子可以允许荧光探针与目标分析物或甚至非目标分析物的缀合。键和相关的吸引力可以是共价的或非共价的，包括键合，例如离子，偶极-偶极相互作用，伦敦分散力，范德华力，疏水相互作用和氢键。例如，荧光探针可以连接至EpCAM抗体，从而形成EpCAM抗体-荧光探针复合物。当EpCAM抗体-荧光探针复合物与EpCAM生物标记物一起被导入目标材料时，EpCAM生物标记物和EpCAM抗体可以彼此吸引和结合，从而将荧光探针连接到目标材料上。在另一个实例中，荧光探针可以连接到抗生物素蛋白，例如链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白，从而形成抗生物素蛋白-荧光探针复合物。当将抗生物素蛋白-荧光探针复合物引入外表面上具有生物素分子的目标材料时，生物素和抗生物素蛋白彼此吸引并结合，从而将荧光探针连接到目标材料上。
包括至少两种染色剂并且可以包括至多4、6、8、10或以上种的染色剂组可以用于多重目标材料，使得每种染色剂结合目标材料上或内的不同抗原。例如，当施加适当的刺激(例如具有较短波长的光)时，每种类型的荧光探针发射电磁波谱的窄波长范围内的光。发射具有绿色通道中的波长的光的第一荧光探针可以连接至第一连接分子上，该第一连接分子特异性地结合第一类型的受体，而发射具有红色通道中的波长的光的第二荧光探针可以连接至第二连接分子，该第二连接分子特异性地结合第二类型的受体。作为刺激相应荧光探针的结果，基于所发射的波长的观察到的颜色鉴定受体的类型，并且因为受体对于特定目标分析物和/或非目标分析物是独特的，所以颜色也能够用于鉴定目标颗粒。这允许在任何给定时间检测目标材料上的多个受体。
荧光探针可以是活性染料、有机染料、荧光蛋白、量子点(包括QD500、QD525、QD625和QD800)、非蛋白质有机分子等。荧光探针可以包括但不限于1,5IAEDANS；1,8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘并荧光素(5-Carboxynapthofluorescein)；5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素)；5-HAT(羟基色胺)；5-羟基色胺(HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；吖啶黄；吖啶黄Feulgen SITSA；水母荧光素(发光蛋白)；自发荧光蛋白；Alexa Fluor 350TM；Alexa Fluor 430TM；Alexa Fluor 488TM；AlexaFluor 532TM；Alexa Fluor 546TM；Alexa Fluor 568TM；Alexa Fluor 594TM；Alexa Fluor633TM；Alexa Fluor 647TM；Alexa Fluor 660TM；Alexa Fluor 680TM；茜素络合酮；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC；AMCA-S；AMCA(氨基甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(AMCA)；苯胺蓝；Anthrocyl stearate；APC(别藻蓝蛋白)；APC-Cy7；APTRA-BTC；APTS；Astrazon Brilliant Red 4G；Astrazon Orange R；Astrazon Red 6B；Astrazon Yellow 7 GLL；米帕林；ATTO-TAGTM CBQCA；ATTO-TAGTM FQ；金胺；AurophosphineG；Aurophosphine；BAO 9(双氨基苯基噁二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸小檗碱；β-内酰胺酶；BFP蓝移GFP(Y66H；蓝色荧光蛋白)；BFP/GFP 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GreenTM；Oregon GreenTM 488；Oregon GreenTM 500；Oregon GreenTM 514；Pacific Blue；碱性副品红(Feulgen)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-Texas Red(Red 613)；Phloxin B(Magdala Red)；Phorwite AR；Phorwite BKL；PhorwiteRev；Phorwite RPA；膦3R；PhotoResist；藻红蛋白B；藻红蛋白R；PKH26(Sigma)；PKH67；PMIA；Pontochrome Blue Black；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；Primuline；ProcionYellow；碘化丙啶(PI)；芘；Pyronine；Pyronine B；Pyrozal Brilliant Flavin 7GF；QSY7；芥子喹吖因；Red 613(PE-Texas Red)；Resorufin；RFP；RH 414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B；罗丹明B 200；纯罗丹明B；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明Phallicidine；罗丹明鬼笔环肽；罗丹明红；罗丹明WT；RoseBengal；R-phycocyanine；R-藻红蛋白；rsGFP(红移GFP(S65T))；S65A；S65C；S65L；S65T；Sapphire GFP；SBFI；5-羟色胺；Sevron Brilliant Red 2B；Sevron Brilliant Red 4G；Sevron Brilliant Red B；Sevron Orange；Sevron Yellow L；sgGFPTM(super glow GFP；SITS(Primuline)；SITS(均二苯乙烯异硫氰酸)；SNAFL钙黄绿素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF钙黄绿素；SNARF1；钠绿；SpectrumAqua；SpectrumGreen；SpectrumOrange；Spectrum Red；SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉鎓)；Stilbene；Sulphorhodamine B can C；Sulphorhodamine G Extra；SYTO 11；SYTO 12；SYTO 13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO 16；SYTO17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO 21；SYTO 22；SYTO 23；SYTO 24；SYTO 25；SYTO 40；SYTO 41；SYTO 42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO 45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO 62；SYTO 63；SYTO64；SYTO 80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO 84；SYTO 85；SYTOX Blue；SYTOX Green；SYTOX Orange；SYTOX Red；四环素；四甲基罗丹明(TRITC)；Texas RedTM；Texas Red-XTM缀合物；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；Thiazine Red R；Thiazole Orange；Thioflavin 5；Thioflavin S；Thioflavin TCN；Thiolyte；Thiozole Orange；Tinopol CBS(CalcofluorWhite)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；四甲基罗丹明异硫氰酸酯；True Blue；TruRed；微管蛋白TrackerTM绿；Ultralite；荧光素钠B；UvitexSFC；wt GFP(野生型GFP)；WW 781；X-罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄GFP(黄移)；绿色荧光蛋白；YFP(黄色荧光蛋白)；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；YOYO-3；及其组合和衍生物。
染色后，然后可将第一或第二种溶液加入到基底和相关(associated)样品中。为此，可以将溶液直接添加到样品的上部并且可以分散在其中，或者可以将溶液添加到样品中，然后盖上盖玻片，使得用盖玻片覆盖样品将溶液吸过样品，例如通过毛细管作用。在固化后，例如5分钟至24小时，可以将包括样品和第一或第二种溶液的基底冷冻至-80℃，包括-20℃或可以成像。此外，可以通过第一或第二种溶液挑选样品的目标分析物，例如通过拾取装置，包括移液器尖端、液压拾取器或机械拾取器。
基底可以是显微镜载玻片、带正电的显微镜载玻片、涂覆的显微镜载玻片、多孔载玻片、微孔载玻片、孔板、盖玻片、细胞微阵列等。基底可以是任何适合的材料，包括但不限于玻璃、塑料、陶瓷、金属等。
出于解释的目的，上述描述使用特定术语来提供对本公开的透彻理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，为了实施本文所述的系统和方法，不需要具体细节。出于示例和描述的目的，通过实例呈现了特定实施方案的上述描述。它们并非旨在穷举或将本公开限制于所描述的精确形式。鉴于上述教导，许多变型和变化都是可能的。示出和描述实施方案是为了最好地解释本公开的原理和实际应用，从而使得本领域的其他技术人员能够最好地利用本公开和具有适合于预期的特定用途的具有各种变型的实施方案。旨在由所附权利要求及其等效方案限定本公开的范围。

Claims (20)

1.溶液，包含：
具有5-30质量％的浓度的多元醇；
具有5-20质量％的浓度的聚乙烯醇(“PVA”)；和
缓冲剂。
2.权利要求1的溶液，其中所述多元醇是甘油、丙二醇或季戊四醇。
3.权利要求2的溶液，其中所述缓冲剂是tris-EDTA缓冲剂(“TE缓冲剂”)或磷酸盐缓冲剂。
4.权利要求1的溶液，其中所述缓冲剂是TE缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
5.权利要求1的溶液，其中所述多元醇是甘油并且具有10质量％的浓度，其中PVA具有10质量％的浓度，其中所述缓冲剂是TE缓冲剂并且tris具有20mM的浓度且EDTA具有2mM的浓度。
6.系统，包含：
溶液，其包含：
具有5-30质量％的浓度的多元醇；
具有5-20质量％的浓度的聚乙烯醇(“PVA”)；和
缓冲剂；和
染色剂组，其包含：
至少一种量子点；和
至少一种荧光团。
7.权利要求6的系统，其中所述多元醇是甘油、丙二醇或季戊四醇。
8.权利要求7的系统，其中所述缓冲剂是tris-EDTA缓冲剂(“TE缓冲剂”)或磷酸盐缓冲剂。
9.权利要求6的系统，其中所述缓冲剂是TE缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
10.权利要求6的系统，其中所述多元醇是甘油并且具有10质量％的浓度，其中PVA具有10质量％的浓度，其中所述缓冲剂是TE缓冲剂并且tris具有20mM的浓度且EDTA具有2mM的浓度。
11.方法，包括：
提供包含目标材料的样品；
用染色剂组标记目标材料，所述染色剂组包含：
至少一种量子点；和
至少一种荧光团；并且
使用溶液覆盖所述样品，所述溶液包含：
具有5-30质量％的浓度的多元醇；
具有5-20质量％的浓度的聚乙烯醇(“PVA”)；和
缓冲剂，
其中所述覆盖步骤在标记步骤后进行。
12.权利要求11的方法，还包含下列步骤：
使样品成像，
其中成像步骤在覆盖步骤之后进行。
13.权利要求12的方法，其中染色剂组在接触所述溶液24小时后保留至少75％的发射，并且其中100％的发射是所述样品在不使用所述溶液成像时染色剂组的发射。
14.权利要求13的方法，其中所述多元醇是甘油、丙二醇或季戊四醇。
15.权利要求14的方法，其中所述缓冲剂是tris-EDTA缓冲剂(“TE缓冲剂”)或磷酸盐缓冲剂。
16.权利要求12的方法，其中染色剂组在接触所述溶液72小时后保留至少50％的发射，并且其中100％的发射是所述样品在不使用所述溶液成像时染色剂组的发射。
17.权利要求16的方法，其中所述多元醇是甘油、丙二醇或季戊四醇。
18.权利要求17的方法，其中所述缓冲剂是tris-EDTA缓冲剂(“TE缓冲剂”)或磷酸盐缓冲剂。
19.权利要求11的方法，其中所述缓冲剂是TE缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
20.权利要求11的方法，其中所述多元醇是甘油并且具有10质量％的浓度，其中PVA具有10质量％的浓度，其中所述缓冲剂是TE缓冲剂并且tris具有20mM的浓度且EDTA具有2mM的浓度。
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