CN1816634A - 保存溶液中目标的检测 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在醇保存溶液(preservativesolution)中检测目标物质和用于识别用于与这些目标结合的传感器(sensor)的方法、物品和组合物。该方法使得样品的充分固定和可检测的传感器与样品中感兴趣的目标的结合同时进行。一方面，本发明提供一种方法，其包括使怀疑含有目标的样品与已知与这种目标结合的可检测的传感器分子在醇保存溶液中接触。该方法可以以多重的形式(multiplexform)进行以同时分析多种目标。本发明还提供识别在醇保存溶液中能够与期望的目标结合的传感器的方法。本发明还提供含有一种或多种这种可检测的传感器的醇保存溶液。本发明还提供含有由这种方法提供的结合传感器的样品。本发明还提供用于这些方法的试剂盒。

Description

保存溶液中目标的检测

技术领域

本发明涉及用于在醇保存溶液(preservative solution)中检测目标物质和用于识别用于与这些目标结合的传感器(sensor)的方法、物品和组合物。

发明背景

医学诊断测试方法是病理状态早期检测的关键筛选工具。早期检测能够在更可能进行成功治疗的阶段确定这些病症。通常早期治疗也涉及较小破坏性或较小侵袭性的治疗方法，降低对患者的影响。除了常规筛选之外，诊断测试也有许多其他应用，包括生物活组织检查分析和监测进行中的医学治疗的结果。

分析样品如医学样品中存在的特定成分的典型方法可以包括多步处理步骤如固定、染色、透化、原位杂交以及其他酶学和/或化学处理，这取决于进行的具体测定法。

对可从样品获得的诊断信息量的限制因素包括可获得和易于操作的样品的数量、进行多重检测所需的处理时间、样品在不失去信号的情况下对多重处理步骤的耐受性以及进行多重分析方法的费用。

医学样品经常使用本领域已知的多种技术染色。许多染色液含有固定剂如醇，不过很多方法也需要固定步骤。通常希望获得关于各种存在于或可能存在于样品中的物质(species)的其它信息和/或获得关于较小成分如病毒或其它细胞成分或其它可能存在于样品中但通过染色方法不能充分检测的物质的信息。

使用更精确的分子技术如原位杂交可以从样品中提供比染色技术甚至更为详细的信息。但是，原位杂交需要对样品进行多重繁琐的操作，包括固定、转移至载玻片上、通过溶液梯度逐步操作、加盖玻片、过长的杂交步骤、洗涤、干燥和其它处理步骤。这些方法耗费时间，对多重步骤需要严格的注意。

本领域需要改进的样品分析方法以及改进的用于这些方法的组合物和物品的制备方法。

发明内容

本发明涉及用于在醇保存溶液中检测目标物质和用于识别用于与这些目标结合的传感器的方法、物品和组合物。该方法使得样品的充分固定和可检测的传感器与样品中感兴趣的目标的结合同时进行。一方面，本发明提供一种方法，其包括使怀疑含有目标的样品与已知与这种目标结合的可检测的传感器分子在醇保存溶液中接触。该方法可以以多重的形式(multiplex form)进行以同时分析多种目标。本发明还提供识别在醇保存溶液中能够与期望的目标结合的传感器的方法。本发明还提供含有一种或多种这种可检测的传感器的醇保存溶液。本发明还提供含有由这种方法提供的结合传感器的样品。本发明还提供用于这些方法的试剂盒。

附图简述

图1表示用50×油浸镜头和Omega FITC/Texas Red对偶滤波器观察到的与对金黄色葡萄球菌(S.aureus)rRNA特异的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的PNA探针杂交的金黄色葡萄球菌阴性表皮葡萄球菌(S.epidermitis)标本在PreservCyt溶液中杂交90分钟后的影像。

图2表示用50×油浸镜头和Omega FITC/Texas Red对偶滤波器观察到的与对金黄色葡萄球菌rRNA特异的FITC标记的PNA探针杂交的金黄色葡萄球菌阳性标本在PreservCyt溶液中杂交90分钟后的影像。

图3表示用50×油浸镜头和Omega对偶滤波器观察到的与对白色念珠菌(C.albicans)rRNA特异的FITC标记的PNA探针杂交的酵母阴性ThinPrep制备样品的影像。

图4表示用50×油浸镜头和Omega FITC/Texas Red对偶滤波器观察到的与对白色念珠菌rRNA特异的FITC标记的PNA探针杂交的酵母阳性ThinPrep制备样品的影像。该ThinPrep标本于1999年收集，在PreservCyt中储存四年后杂交。

具体实施方式

本发明的发明人有利地发现将传感器分子引入含醇保存溶液中允许多重细胞学操作在同一溶液中进行，从而减少处理样品所需的步骤数目和时间量并增加在给定时间内对于给定样品可以进行的测定法的数目。

例如，繁琐且需要多重步骤和操作的FISH方法如果在醇保存溶液例如含有传感器如检测核酸目标的PNA探针的PreservCyt中进行就可以被简化。这有利地消除对费时且不必要的固定步骤的需要，因为PreservCyt中的甲醇也能充当固定剂。

我们进行了研究，显示了通过FISH(荧光原位杂交)利用PNA探针对PreservCyt中的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌进行微生物检测。我们证明了使用PNA探针FISH可以在PreservCyt的溶液基质中有效地进行。在常规方法中，杂交事件在由血液培养物标本制备的载玻片上进行，为达到最佳效果血液培养物标本需要是新鲜的。由于PreservCyt具有保存性质因而很好地保持PNA目标(rRNA序列)的稳定性。我们的研究表明，在PreservCyt中rRNA的完整性至少保持四年且可被PNA FISH检测到。我们还确定了在室温下PreservCyt中的杂交事件至少在23日内保持稳定。这有利地提供了对以前采集的样品进行回顾分析的方法。因此，还提供了用于在醇保存溶液中对长期储存后的目标的检测方法。检测目标的方法可以在1、2或3周后，或者1、2、3、4、6或9个月后，或者1、2、3、4或更多年后进行。

虽然使用PNA FISH检测白色念珠菌和金黄色葡萄球菌作为模型系统来举例说明本发明，但本发明不限于检测这些微生物的方法。该方法可以用于检测其它感染或致病性物质(agent)(包括病毒)以及遗传分析如点突变或其它染色体异常的识别(即检测非整倍性的着丝粒探针)。

该方法还用于在醇保存溶液中进行分子测定，例如扩增反应如PCR，其包括使用一种或多种PNA探针阻断不期望的目标的扩增，例如检测特定选择的人乳头瘤病毒(HPV)的菌株如致病性菌株，而同时避免检测到其它未选择的菌株如非致病性菌株。该方法可以以多重的形式使用。该方法还可以用于测试候选传感器与期望的目标的结合能力，这种测试可以以多重的形式进行，例如使用化合物库如小分子、有机分子和/或无机分子或测试寡核苷酸的混合物来从混合物中识别具有希望的结合特征(profile)的适体(aptamer)。

癌症的病理诊断通常需要单细胞或组织活检物的显微镜检查以识别指示恶性的形态异常。辅助的实验室检查可以有助于形态学检查。这些检查包括以下检测：染色体异常(如扩增、缺失或易位)、表达异常的酶、蛋白质或脂质或碳水化合物。尽管为证实异常的细胞成分可以使用不同的分析方法，但它们的共同点是分析在与最初的形态学检查中所使用的细胞不同的组织切片、悬浮液或显微镜载玻片上的一组细胞中进行。这可能给诊断过程带来挑战。

本文所述的方法可以用于通过使用中心体特异的传感器分析样品中存在的中心体。目前中心体计数还没有在实际中用于对恶性肿瘤或其前体的辅助诊断。在一个实施方案中，本发明提供同时进行细胞形态学评价和中心体数目计数的方法，这样通过将两种因素的信息结合就可以更准确地确定正常或异常的分类。例如可以用保存的细胞制备ThinPrep载玻片，进行巴氏染色操作。可以使细胞在染色操作之前或之后与可检测的对中心体目标特异的传感器接触。通过特定的光波长检查载玻片以测定形态学特征和中心体特异的传感器的特异性结合。可以使用自动成像系统如ThinPrep成像系统根据可检测的传感器的结合而定量中心体的数目。

在保存溶液中接触传感器之后，可以对样品进行检测以确定传感器是否已经与目标结合。检测可以在含有于溶液中的样品的容器中进行，或者可以在将部分或全部样品转移至另一容器中或基材如滤纸、载玻片或盖玻片上之后再进行。可以用一种或多种特定的光波长测定样品的形态学特征和目标的特异性结合和传感器的存在来检测样品。

样品可以通过手动和/或通过合适的装置如自动成像系统来进行分析。自动成像系统的实例包括Cytyc Corporation的ThinPrepImaging System、TriPath FocalPoint^TM Profiler、ChromaVision AcisSystem、CompuCyt iCyte Imaging System、Applied ImagingCytoVision^TMSystem和Veracel Verasys Imaging System。诸如上述这些的装置可以经过改造引入一种或多种检测系统以检测引入含醇保存染色溶液中的传感器上使用的附加标记。例如可以使装置适用于检测和/或分析由加入保存溶液中的传感器(和/或它们的标记)所提供的一种或多种特定的波长。当目标是中心体时，可使用自动成像系统通过检测与样品结合的中心体特异的传感器的量或数目来定量中心体数目。

在进一步详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的具体方法、溶液或装置，因为这些方法、溶液或装置当然可以改变。还应理解本文使用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，而无意于限制本发明的范围。

若非另外明确指出，使用单数形式“一”、“这”或“那”包括复数的意思。因此，例如所指的“一个样品”包括多个样品，所指的“一个传感器”包括多个这种传感器，所指的“一个目标”包括多个目标等等。此外，若非另外明确指出，使用明确的复数形式如“两”、“三”等，以同主题中较大的数字为准。

若非另外明确指出，术语如“连接的(connected)”、“连接的(attached)”和“连接的(linked)”在本文中可互换地使用，并且包括直接以及间接的连接或缀合。当描述数值范围时，应理解任何介于该范围的所述上限和下限之间的整数值及其分数，以及在这些值之间的任何子范围也均被具体公开。任何范围的上限和下限可以独立地包含在该范围之内或排除于该范围之外，而且任何其中两个限值之一、两个限值都不包括或两个限值都包含的范围也包含在本发明的范围之内。当所讨论的值具有内在的限度时，例如当组分以0-100％的浓度存在时，或当水溶液的pH范围为1至14时，这些内在的限度被具体公开。当明确描述一个值时，应理解与所述值大约相同的量以及基于其的范围也在本发明的范围内。当公开一个组合时，该组合的元素的每个亚组合也被具体地公开且在本发明的范围内。相反，当公开不同元素或多组元素时，它们的组合也被公开。当公开一个发明的任何元素具有多种选择时，则其中各自的选择被单独排除或与其它选择的任意组合被排除的该发明的实例也在本文公开；一个发明中一种以上的元素可以具有这种排除，具有这种排除的元素的所有组合也在本文公开。

若非另外定义或上下文另外明确指出，本文使用的所有科技术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含意。虽然与本文所述相似或等价的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但现在描述的方法和材料是优选的。

本文使用的术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”可互换地使用，都指任何长度的多聚形式的核苷酸，而且可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。这些术语仅仅指该分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括例如通过烷基化和/或通过加帽的修饰和非修饰的多核苷酸形式。

本领域技术人员能够确定对于给定测定形式的合适杂交条件；可调节的非限制性参数包括测定成分的浓度、pH、使用的盐及它们的浓度、离子强度、温度等。

更具体地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、包括剪接或未剪接的tRNA、rRNA、hRNA和mRNA在内的多核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其它类型的为嘌呤碱基或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的多核苷酸和包括肽核酸(PNA)在内的含有其它骨架的其它聚合物以及其它合成的序列特异性核酸聚合物，条件是该聚合物含有使得如DNA和RNA中存在的那样的碱基配对和碱基堆积的构象的核碱基。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之间不存在有意的长度区别，这些术语在本文中可以互换使用。这些术语仅仅指该分子的一级结构。因此，这些术语包括例如3′-脱氧-2′，5′-DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3′P5′磷酰胺、2′-O-烷基-取代RNA、双链和单链DNA以及双链和单链RNA和它们的杂交体包括例如DNA和/或RNA和/或PNA和/或其它形式之间的杂交体，也包括多核苷酸或寡核苷酸的已知类型的修饰形式例如标记，烷基化，“帽”，用类似物取代一个或多个核苷酸，核苷酸间修饰例如具有负电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有侧基(pendant moiety)如蛋白质(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚左旋赖氨酸等)的那些、含有嵌入剂(如吖啶、补骨酯素等)的那些、含有螯合物(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等的螯合物)的那些、含有烷化剂的那些、具有修饰连接(如α异头核酸等)的那些，以及非修饰形式。

应理解，如本文所用，术语“核苷”和“核苷酸”包括那些不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基还含有其它已修饰的杂环碱基的基团。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其它杂环。修饰的核苷或核苷酸还可以包括糖基上的修饰，例如其中一个或多个羟基被卤素、脂族基替代或官能化为醚、胺等。术语“核苷酸单元”意于包括核酸和核苷酸。

此外，对核苷酸单元的修饰包括重排、添加(appending)、取代或改变嘌呤或嘧啶碱基上的与各自互补的嘧啶或嘌呤形成氢键的官能基。所得的修饰核苷酸单元任选可以与其它这样修饰的核苷酸单元形成碱基对，但是不与A、T、C、G或U形成碱基对。可以引入不妨碍多核苷酸功能的无碱基位点；优选多核苷酸不含无碱基位点。多核苷酸中的一部分残基或全部残基可以以一种或多种方式任选被修饰。

修饰核苷酸单元的实例包括吖丙啶基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、肌苷、N₆-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N₆-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(β-D-mannosylqueosine)、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N₆-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2，6-二氨基嘌呤和“锁定”核酸单元(LNA)及其类似物。Koshkin等，Tetrahedron Letters 1998 39：4381-4384；PCT Publ.No.WO99/14226。

在使得胸苷的N3-H和C4-氧基分别与腺苷的N1和C6-NH2之间以及胞苷的C2-氧基、N3和C4-NH2分别与鸟苷的C2-NH2、N′-H和C6-氧基之间形成氢键的条件下形成标准A-T和G-C碱基对。因此，例如鸟苷(2-氨基-6-氧基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)可以修饰成为异鸟苷(2-氧基-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。这种修饰导致将不再有效地与胞嘧啶形成标准碱基对的核酸碱基。但是，将胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧基-4-氨基-嘧啶)修饰成为异胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧基-嘧啶)导致将不能有效地与鸟苷形成碱基对但将与异鸟苷形成碱基对的修饰核苷酸。异胞嘧啶可以从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得；异胞苷可以通过Switzer等，(1993)Biochemistry 32：10489-10496及其中引用的参考文献中描述的方法制备；2′-脱氧-5-甲基-异胞苷可以通过Tor等，(1993)J.Am.Chem.Soc.115：4461-4467及其中引用的参考文献中描述的方法制备；以及异鸟嘌呤核苷酸可以通过Switzer等，(1993)同上和Mantsch等，(1993)Biochem.14：5593-5601中描述的方法或通过Collins等的美国专利5,780,610中描述的方法来制备。其它非天然碱基对可以通过Piccirilli等，(1990)Nature 343：33-37中描述的关于合成2，6-二氨基嘧啶及其互补体(1-甲基吡唑并-[4，3]嘧啶-5，7-(4H，6H)-二酮)的方法来合成。其它这样形成独特碱基对的修饰核苷酸单元是已知的，如Leach等，(1992)J.Am.Chem.Soc.114：3675-3683和Switzer等，同上中所描述的那些。

“互补的”或“基本互补的”是指核苷酸或核酸之间例如传感器肽核酸与目标多核苷酸之间杂交或形成碱基对的能力。互补核苷酸通常是A与T(或A与U)或C与G。对于两条单链多核苷酸或PNA的碱基，当以最佳方式排列和比较而且具有适当的插入或缺失时，一条链的碱基与另一条链的碱基至少约80％，通常至少约90％-95％，更优选约98％-100％配对时，则说这两条链是基本互补的。

或者，当多核苷酸或PNA在选择性杂交条件下与其互补体杂交时，则基本互补性存在。通常在至少14-25个碱基的长度内至少具有约65％、优选至少约75％、更优选至少约90％的互补时，会发生选择性杂交。参见M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12：203(1984)。

“优先结合”或“优先杂交”是指与样品中非互补的聚合物相比一个多核苷酸或PNA与样品中它的互补体增加的结合倾向性。

杂交条件通常包括盐浓度小于约1M，更通常小于约500mM，优选小于约200mM。在肽核酸或其它类似核酸与多核苷酸之间杂交的情况下，杂交可在几乎不含或不含盐的溶液中进行。杂交温度可以低至5℃，但通常高于22℃，更通常高于约30℃，优选高于约37℃。较长的片段对于特异性杂交可能需要较高的杂交温度。其它因素可能影响杂交的严谨性，其包括碱基组成和互补链的长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度，而所用的参数的组合比任一单独的参数的绝对值都重要。其它可以控制的杂交条件包括缓冲剂类型和浓度、溶液pH、降低背景结合的封闭试剂如重复序列或封闭蛋白溶液的存在和浓度、洗涤剂类型和浓度、增加多核苷酸相对浓度的分子如聚合物、金属离子及它们的浓度、螯合剂及它们的浓度以及本领域已知的其它条件。

本文使用的术语“适体”(或“核酸抗体”)是指通过其形状识别期望的目标分子并与之结合的单链或双链多核苷酸。参见例如PCT公开WO 92/14843、WO 91/19813和WO 92/05285。

“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，包括通过肽键连接的氨基酸分子链。该术语不指产物的具体长度。因此，“肽”、“寡肽”和“蛋白质”均包括在多肽的定义之内。该术语包括多肽的含有翻译后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化和硫酸化的多肽。此外，蛋白质片段、类似物(包括非遗传密码编码的氨基酸如高半胱氨酸、鸟氨酸、D-氨基酸和肌酸)、天然或人工突变体或变异体或它们的组合，融合蛋白、衍生残基(氨基烷基化、羧基乙酰化或酯化)等都包括在多肽的含意之内。

如本文所用，术语“结合对”是指以高于与样品中其它成分的亲和力彼此特异性结合的第一个和第二个分子。在结合对成员之间的结合通常是非共价结合。结合对的实例包括免疫学结合对(如任何半抗原或抗原复合物与相应的抗体或其结合部分或片段的组合，例如地高辛配基与抗地高辛配基、荧光素与抗荧光素、二硝基苯酚与抗二硝基苯酚、溴脱氧尿苷与抗溴脱氧尿苷、小鼠免疫球蛋白与羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫学结合对(如生物素-抗生物素蛋白、生物素-链霉抗生物素、激素(如甲状腺素和可的松)-激素结合蛋白、受体-受体激动剂或拮抗剂(如乙酰胆碱受体-乙酰胆碱或其类似物)、IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-辅酶、酶-酶抑制剂和能够形成核酸二倍体的互补多核苷酸对)等。结合对两成员之一可以或两者都可以与其它分子缀合。

如本文所用，术语“抗体”包括从多克隆和单克隆制备物获得的抗体以及杂交(嵌合)抗体分子(参见例如Winter等，(1991)Nature 349：293-299和美国专利4,816,567)；F(ab′)2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异二聚体，参见例如Inbar等，(1972)Proc Natl Acad Sci USA 69：2659-2662和Ehrlich等，(1980)Biochem 19：4091-4096)；单链Fv分子(sFv)(参见例如Huston等，(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-5883)；二聚和三聚抗体片段构建体；微型抗体(minibody)(参见例如Pack等，(1992)Biochem 31：1579-1584、Cumber等、(1992)JImmunology 149B：120-126)；人源化抗体分子(参见例如Riechmann等，(1988)Nature 332：323-327、Verhoeyan等，(1988)Science 239：1534-1536和1994年9月21日公开的英国专利GB 2,276,169)；以及从这些分子中获得的任何功能性片段，其中这种片段保留了母抗体分子的特异性结合性质。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指具有同种抗体群体的抗体组合物。该术语不限制抗体的种类或来源，也无意被其制备方式所限制。因此，该术语包括从鼠杂交瘤获得的抗体以及用人杂交瘤获得的或从小鼠表达的人免疫球蛋白链基因或其部分制备的鼠杂交瘤获得的人单克隆抗体。参见例如Cote等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，1985，p.77。

本文的“多重的”是指其中多种分析物可同时被测定的测定法或其它分析方法。

“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或情况可以发生或不发生，而且该描述包括该事件或情况发生的情况和该事件或情况不发生的情况。

样品

要分析的样品部分可以是可直接或间接从活生物体获得的任何来源的生物材料，包括细胞、组织或液体。样品的非限制性实例包括血液、尿、精液、乳汁、痰、粘液、胸腔液(plueral fluid)、盆腔液、滑膜液(sinovial fluid)、腹水、体腔灌洗液、眼刷物(eye brushing)、皮肤刮下物(skin scraping)、口腔拭物、阴道拭物、巴氏涂片物(papsmear)、直肠拭物、吸出物、穿刺活组织检查物(needle biospy)、例如通过手术或尸检获得的组织切片、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物、泪液、唾液、肿瘤、器官、微生物培养物、病毒和体外细胞培养物成分的样品。

样品可以是已知含有目标的对照样品。也可以使用阴性对照样品以用于确定是否一套给定的条件产生假阳性。

样品可以在如下所述的溶液中或基材上提供。可以在样品与传感器分子在保存溶液中接触之前或之后将样品转移至基材上。

基材

基材可以包含广范的材料，生物材料、非生物材料、有机材料、无机材料或这些材料的任意组合。例如基材可以是聚合的L-B膜、功能性玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO₂、SiN₄、改性硅或多种凝胶或聚合物如(聚)四氟乙烯、(聚)亚乙烯基二氟、聚苯乙烯、交联聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(丙交酯共乙交酯)、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯共乙酸乙烯酯)、聚硅氧烷、聚二氧化硅、胶乳、葡聚糖聚合物、环氧树脂、聚碳酸酯中的任一种或它们的组合。

基材可以是平面结晶基材如二氧化硅基基材(如玻璃、石英等)或例如半导体和微处理器工业中使用的结晶基材如硅、砷化镓等。

硅补强剂也可以用作基材，它可以通过本领域已知的方法制备。气凝胶基材可以用作独立的基材或作为另一种基材的表面涂层。

基材可以是任何形状，通常是板、载玻片、盖玻片、珠、小丸、圆盘、粒子、链、沉淀物、薄片、任选多孔的凝胶、大片、管、球、容器、毛细管、垫、片、膜、芯片、多孔板或盘、光纤等。虽然基材一般是无活性的(inanimate)形式，但是对于一些应用基材可以是硬质或半硬质的任何形式。

基材表面可以由与基材相同的材料组成或者可以由不同材料制成，可以通过化学或物理手段与基材偶联。这种偶联的表面可以由多种材料例如聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基材料、碳、金属、无机玻璃、膜或上面列出的基材中的任一种组成。在一种实施方案中，表面是光学透明的而且具有表面Si-OH官能团，如在二氧化硅表面上存在的那些。

目标

目标可以是期望视觉可见的样品中的任何成分。目标的非限制性实例包括可以针对其获得传感器的多核苷酸、蛋白质、多糖、粘多糖、蛋白聚糖、脂质、细胞、细胞类型(cell type)、生物体、病毒、结构或分子。该目标可以是亚细胞结构例如中心体或中心体成分或者是细胞外产物或成分。

当目标是细胞或细胞成分或产物时，该细胞可以是任何来源的，包括原核细胞、真核细胞或古细胞(archea)。该细胞可以是活的或死的。若来自于多细胞生物体，则该细胞可以是任何细胞类型。该细胞可以是培养的细胞系或原分离物，该细胞可以是哺乳动物细胞、两栖动物细胞、爬行动物细胞、植物细胞、酵母细胞、细菌细胞、螺旋体细胞或原生动物细胞。该细胞可以是人细胞、鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞、鸡细胞、鹑细胞或狗细胞。该细胞可以是正常细胞、突变细胞、遗传操作细胞、肿瘤细胞等。

来自多细胞生物体的细胞类型的实例包括嗜酸细胞、腺泡细胞、松果体细胞、脂肪细胞、成釉细胞、星形胶质细胞、基(干)细胞、嗜碱细胞、肝细胞、神经元、表面凸出细胞(bulging surface cell)、C细胞、心肌细胞、泡心细胞、主细胞、软骨细胞、克拉拉细胞、柱状上皮细胞、黄体细胞、蜕膜细胞、树突、内分泌细胞、内皮细胞、肠内分泌细胞、嗜酸细胞、红细胞、球外系膜细胞、胎儿成纤维细胞、胎儿红细胞、成纤维细胞、卵泡细胞、神经节细胞、巨大贝兹细胞、杯状细胞、毛细胞、内毛细胞、I型毛细胞、肝细胞、内皮细胞、莱迪希氏细胞、脂肪细胞、肝实质细胞、淋巴细胞、溶菌酶分泌细胞、巨嗜细胞、肥大细胞、巨核细胞、黑色素细胞、系膜细胞、单核细胞、肌上皮细胞、肌样细胞、颈粘液细胞、神经细胞、中性粒细胞、少突胶质细胞、卵母细胞、成骨细胞、破软骨细胞、破骨细胞、骨细胞、柱细胞、sulcal细胞、甲状旁腺细胞、壁细胞、胃蛋白酶分泌细胞、周细胞、松果体细胞、垂体细胞、浆细胞、血小板、足细胞、精母细胞、浦肯野细胞、锥体细胞、红细胞、网织红细胞、施万细胞、支持细胞、柱状细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、促生长素抑制素细胞、肠内分泌细胞、精子细胞、精原细胞、精子、星形细胞、支持戴特斯细胞、支持汉森细胞、表面细胞、表面上皮细胞、表面粘液细胞、汗腺细胞、T淋巴细胞、膜黄体细胞、胸腺细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺细胞、过渡上皮细胞、I型肺泡细胞和II型肺泡细胞。

肿瘤细胞的实例包括腺瘤、癌、腺癌、纤维腺瘤、成釉细胞瘤、星形细胞瘤、间皮瘤、胆管细胞癌、胆管纤维瘤、胆管瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、颅咽管瘤、囊腺癌、囊腺瘤、无性细胞瘤、室管膜瘤、上皮瘤、红细胞性白血病、纤维腺瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、神经节神经胶质瘤、神经节瘤、成神经节细胞瘤、神经胶质瘤、粒细胞性白血病、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、冬眠瘤、组织细胞瘤、角化棘皮瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、骨髓脂肪瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肌神经母细胞瘤、牙瘤、少突神经胶质瘤、骨软骨瘤、骨瘤、骨肉瘤、乳头状瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、松果体瘤、垂体细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、神经鞘瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、泡膜细胞瘤和胸腺瘤。

细菌的实例包括金黄色葡萄球菌、嗜肺菌团菌(Legionellapneuynophila)、大肠杆菌(Escherichia coli)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfrtazgens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、巴氏梭菌(Clostridium baratii)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、B型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae type b)、白喉杆菌(Corynebacteriurndiphtheriae)、微小棒状杆菌(Corynebacterium minutissimum)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)、痢疾致贺氏菌(Shigella dysenteriae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产黑素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)、梭杆菌属(Fusobacterium)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、杜氏嗜血杆菌(Hemophilus ducreyi)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、汉氏巴尔通氏体(Bartonella henselae)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形菌属(Proteus)和致贺氏菌属(Shigella)。

螺旋体的实例包括苍白密螺旋体(Treponemapallidum)、极细密螺旋体(Tpertenue)、斑点病密螺旋体(Tcarateum)、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、奋森氏疏螺旋体(B.vincentii)、布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)和出血黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)。

真菌的实例包括牛型放线菌(Actinomyces bovis)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色念珠菌、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、新型隐球菌(Cryptococcusenoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、申克氏孢子丝菌(Sporotrichum schenckii)、衣氏放线菌(Actinomyces israelii)、牛型放线菌、烟曲霉、皮炎芽生菌、白色念珠菌、粗球孢子菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

可以编码的原生动物和寄生虫的实例包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、痢疾内阿米巴(Entamoeba histolytica)、锥虫(trypansomes)、利什曼原虫(Leishmania)、刚地弓形虫(Toxpolasmagondii)、贾第鞭毛虫(Giardiala lamblia)和沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)。

当目标是多核苷酸时，该目标多核苷酸可以是单链、双链或更高级的，并可以是任何拓扑结构例如线性、环状、分支。单链目标多核苷酸的实例包括mRNA、DNA、tRNA、hnRNA、ssRNA或ssDNA病毒基因组，不过这些多核苷酸可以含有内部互补序列和显著的二级结构。双链目标多核苷酸的实例包括基因组DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、dsRNA或dsDNA病毒基因组、质粒、噬菌体和类病毒。

传感器

传感器可以是稳定、可溶且能在含醇保存溶液中与它的目标特异性结合的任何物质。传感器的非限制性实例包括小的有机化学物质、无机分子、上述的多核苷酸包括肽核酸和适体。也可以使用不同传感器的组合，其允许对样品中的多种目标进行检测和分析。传感器可以是一种被选择的与细胞成分如中心体或其子成分特异性结合的传感器。可以测试多种候选传感器分子例如化学物质库与期望的目标的结合，该测试可以在醇保存溶液中完成。

传感器必须是可以检测的，可以是自然可检测的或者可以是通过与标记偶联而使之成为可检测的。可以使用任何有效的检测方法，包括光学法、分光镜法、电法、压电法、磁法、拉曼散射法、表面等离子体共振法、放射显影法、比色法、量热法等。优选传感器对人和/或检测装置是光学可检测的或者可以使其变为光学可检测的。在一个实施方案中，通过使用发光二极管(LED)进行检测。

在一个实施方案中，传感器可以是与怀疑存在于样品中的目标多核苷酸特异性结合的PNA。PNA是一种合成核酸类似物，具有肽衍生结构。它具有由重复N-2-氨乙基甘氨酸单元组成的骨架，这些单元通过酰胺键而不是DNA中存在的糖-磷酸基连接(1)。PNA通常被称为“拟DNA”(DNA mimic)，因为它与互补的核酸目标杂交遵守沃森-克里克碱基配对法则(2)。但是由于它们具有肽骨架，PNA带中性电荷而且具有优于DNA的独特性质，包括热稳定性增加、杂交动力学速率快(为DNA：DNA杂交速率的50000倍)(3)和对蛋白酶和核酸酶的降解作用具有耐受性。另外，由于其疏水性(4)PNA可以容易地穿过生物体的细胞壁并找到它的核酸目标。这些特征使得PNA成为体外诊断特别是原位杂交的优异工具。

在另一个实施方案中，传感器可以是一种适体。与期望的目标结合的寡核苷酸的制备在Blackwell，T.K.等，Science(1990)250：1104-1110；Blackwell，T.K.等，Science(1990)250：1149-1152；Tuerk，C.和Gold，L.，Science(1990)249：505-510；Joyce，G.F.，Gene(1989)82：83-87；1993年12月14日授予Gold等的美国专利5,270,163中描述。这种寡核苷酸被称为“适体”。Tuerk和Gold描述了名为“systematicevolution ofligands by exponential enrichment”的方法的应用。在该方法中，通过固定于硝酸纤维素滤膜上的期望的核酸结合蛋白来对特定部位上完全随机的一组RNA进行结合选择。然后回收结合的RNA并扩增为能进行后续体外转录的双链DNA。然后将新转录的RNA通过这一方法循环以富集具有共有序列的寡核苷酸以与关连蛋白结合。然后可以对这样获得的寡核苷酸进行测序以用于进一步研究。Tuerk和Gold将该方法用于识别通过T4DNA聚合酶的RNA结合域结合的RNA寡核苷酸。

可以在醇保存溶液如PreservCyt中测试含有适体的传感器的结合，或者可以通过使用这种溶液的测定法进行。传感器适体可以通过已知的任何方法包括合成、重组和纯化方法制备，且可以单独使用或与其它对同一目标特异的适体组合使用。适体可以标记到和/或缀合于其它物质上。术语“适体”特别包括含有衍生自将两种或多种已知适体与给定目标相比较的共有序列的“二级适体”。适体的制备在1996年12月10日授予Toole等的美国专利5,582,981中有广泛的讨论。用作确定适体传感器的特异性结合序列的原料的寡核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA。原料寡核苷酸将含有随机序列部分，通常包括约10-400个核苷酸，更优选20-100个核苷酸。随机序列被引物序列侧翼，这允许将聚合酶链反应应用到从复合物中获得的寡核苷酸。可以将发现与目标结合的适体分离、测序然后再合成为常规DNA或RNA部分，或者可能是上述的“修饰的”多核苷酸。例如，通常存在的任一羟基可以被磷酸酯基、磷酸基替代、被标准保护基保护或被活化以准备与另外核苷酸的另外连接，或者可以与固体载体缀合。通常5′末端的OH是游离的但可以被磷酸化，3′末端的OH取代基也可以被磷酸化。羟基还可以衍生为标准保护基。一个或多个磷酸二酯键可以被另外的连接基替代。这些另外的连接基包括但不限于下述实施方案：其中P(O)O被P(O)S、P(O)NR₂、P(O)R、P(O)OR′、CO或CNR₂替代，其中R是H或烷基(1-20C)，而R′是烷基(1-20C)；此外，该基团可以通过O或S与相邻的核苷酸相连。连接并不需要都相同。可以确定对于任何期望目标例如中心体成分的适体。小分子如2002年4月9日授予Kong的美国专利6,368,818中描述结晶剂也可以用于与细胞器包括中心体、微管和/或细胞骨架结合。

细胞分裂过程涉及一系列受控、互相依赖的生化反应，首先产生染色体拷贝，之后是细胞分裂。称为有丝分裂的该过程开始时包括亚细胞器的形成，亚细胞器提供了细胞分裂所必需的结构骨架。一个重要的细胞器是中心体，其与相关成分一起起定位点的作用，微管蛋白网络可以从这个定位点将母细胞DNA与子细胞的分开。正常的静止细胞通常具有一个中心体，但在细胞分裂之前有中心体复制，因此形成两个定位点。癌细胞或导致癌症的前体细胞可能具有异常的中心体数目。因此中心体计数可以用来识别异常细胞。

在一种实施方案中，提供通过使样品与引入醇保存溶液中的中心体特异的传感器接触，之后将从该混合物中取出的样品进行定量成像而进行中心体计数的方法。因此，可以使用优先与中心体或中心体外周物质结合的传感器以允许通过视觉检查或通过计算机成像来进行中心体计数。中心体目标分子的实例包括剑蛋白、剑蛋白亚基(参见2002年8月6日授予Vale等的美国专利6,429,304)、eg5(参见2002年10月29日授予Uhlmann等的美国专利6,472,521)、Nlkl(参见美国专利6,476,193)、HSP90(参见2002年1月1日授予Gonzalez等的美国专利6,335,157)、trinectin、中心粒周蛋白(pericentrin)、cpl40、中心体蛋白、γ-微管蛋白、α-微管蛋白、β-微管蛋白(参见1999年10月26日授予Doxsey的美国专利5,972,626)、CENP-F(参见1997年2月4日授予Yen等的美国专利5,599,919)、aurora蛋白(参见美国专利6,207,401、5,972,676和5,962,312)和BTAK(参见美国专利6,352,858)。本文使用的术语“中心体”和“中心体的”等是指中心体外周区域以及中心体区域，因此例如术语“中心体目标”包括中心体外周目标以及中心体目标。传感器还可以包括可检测的中心体酶的底物，该底物在结合时可以是可检测的和/或在被中心体酶作用时可以产生可检测的反应产物。

标记

本文描述的用于本发明的标记包括与样品中存在的目标缔合的当传感器与目标结合时可以直接或间接被检测的任何物质。标记的实例包括发色团、发光团、荧光团、色原体、半抗原、抗原、放射性同位素、磁性颗粒、金属纳米颗粒如金或银纳米颗粒、酶、抗体或其结合部分或同等物、适体和结合对中的一员。

荧光团可以是吸收一种波长的光而发射另一种波长的光的任何物质。典型的荧光团包括荧光染料、半导体纳米晶体、镧系元素螯合物和绿色荧光蛋白。

荧光染料的实例包括荧光素6-FAM、罗丹明、德克萨斯红、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6G、arboxyrhodol、羧基罗丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy-Chrome、藻红蛋白、PerCP(多甲藻黄素叶绿素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4，5-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、荧光黄、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、AlexaFluor488、Alexa Fluor532、AlexaFluor546、Alexa Fluor568、AlexaFluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPYFL、BODIPYFL-Br₂、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPYR6G、BODIPYTMR、BODIPYTR、它们的缀合物和组合。镧系元素螯合物的实例有铕螯合物、铽螯合物和钐螯合物。

本领域已知多种荧光半导体纳米晶体(SCNC)，半导体纳米晶体的制备和使用方法在1999年5月27日公开的发明人为Bawendi等的PCT公开WO 99/26299、1999年11月23日授予Weiss等的美国专利5,990,479和Bruchez等，Science 281：2013，1998中有描述。可以获得具有峰发射波长明确的(well-defined)极窄发射带的半导体纳米晶体，这允许许多不同的SCNC在同一测定中作为信号发色团，任选与其它非SCNC型信号发色团组合使用。

术语“绿色荧光蛋白”既指天然水母绿色荧光蛋白也指已经确定的表现改变的荧光特征的突变型，改变的荧光特征包括改变的激发和发射最大波长以及不同的激发和发射光谱形状(Delagrave，S.等，(1995)Bio/Technology 13：151-154；Heim，R.等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：12501-12504；Heim，R.等，(1995)Nature 373：663-664)。Delgrave等分离了克隆Aequorea victoria GFP的激发光谱发生红移的突变型(Bio/Teclinology 13：151-154(1995)。Heim，R.等报道了具有蓝色荧光的突变型(Tyr66至His)(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 91：12501-12504)。

酶的实例包括在含醇保存溶液中稳定的酶。在这些条件下可以测试它们稳定性的酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、细菌荧光素酶、昆虫荧光素酶和海肾(sea pansy)荧光素酶(Renilla koellikeri)，它们在本领域已知的合适的底物的存在下和测定条件下可以产生可检测的信号。

半抗原和/或结合对成员的实例包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素、地高辛配基、生物素以及上述的那些。

保存溶液

保存溶液适用于在室温下保存细胞和组织。该溶液含有醇且优选含有缓冲剂，并可以用于生物活组织检查之后和染色或其它分析形式之前在室温下体外保存哺乳动物细胞。该溶液可以是如1993年10月26日授予Hurley等的美国专利5,256,571中描述的溶液。在一个实施方案中，该保存溶液提供用于相对长期的室温保存的介质。在另一个实施方案中，该保存溶液提供用于转运和除去样品溶液中不期望的成分例如蛋白质的介质。

更特别地，该保存溶液含有可与水混溶的醇且优选含有抗聚集剂和缓冲剂。醇组分以足以固定样品细胞或组织同时仍使得传感器与它的目标有可接受的结合的量存在。醇通常是低级烷基(C_1-6)醇，可以是C_1-4醇，可以选自甲醇、乙醇和异丙醇。在优选实施方案中，该醇是甲醇。

在本发明的一个实施方案中，醇以足以固定和保存感兴趣的样品成分的水平存在，可以以高于约40％且低于约60％的量存在，可以为约45％或以上，可以为约55％或以下。含约60％或以上醇的溶液倾向于表现聚集或凝结，这干扰了后续的将样品细胞有效染色的能力。相反，如果在该实施方案中醇浓度为40％或以下，那么细胞就不能充分固定以进行相对长期的保存，而是随时间引起细胞降解。在该实施方案中，该溶液含有占溶液的约50％的甲醇。

在本发明的另一个实施方案中，醇以占溶液的至少20％的量存在。尽管如上所述，这一浓度的醇不能够实现长期保存(即多于两日)，但它在该时间内充分地固定细胞以进行后续分析。或者，可以将细胞从该20％的实施方案溶液转移至较高浓度例如50％的醇溶液中以进行后续的于分析之前的长期保存。

抗聚集剂可以以足以防止细胞在溶液中聚集的量存在。可以使用在醇保存溶液中有效的任何合适的抗聚集剂，可以是例如螯合剂，该螯合剂选自例如乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐如二钠盐、三钾盐和四钠盐。认为可用作抗聚集剂的其它活性剂包括cuminin、肝素、链激酶以及存在于溶解或抗凝剂组合物中的活性剂。

可以使用能在使用期间将保存溶液维持在所期望的pH的任何缓冲剂。缓冲剂的实例包括PBS、Tris、乙酸钠和枸橼酸。EDTA及其盐也可以用作缓冲剂。优选在保存期间将溶液pH维持在约4至约7之间的缓冲剂。因此，优选的缓冲剂是乙酸盐缓冲剂如乙酸钠、乙酸镁、乙酸钙和它们的组合。虽然在本发明的溶液中也可以使用其它缓冲剂如磷酸盐或Tris缓冲剂，但是认为这些缓冲剂对在期望的pH处的有效缓冲范围不如乙酸盐广泛。

所使用的缓冲剂特别是长期储存所使用的缓冲剂优选具有大的缓冲范围以调节因悬浮于溶液中的样品细胞的自溶副产物所导致的任何pH变化。例如，颈细胞老化时它们释放改变悬浮溶液的pH平衡的自溶副产物。此外，保存不同的细胞类型可能需要不同酸度和不同pH范围的溶液。因此，具有宽的缓冲范围的溶液可以用于多种细胞类型。

在一个实施方案中，该保存溶液含有甲醇、作为酸的EDTA和乙酸钠。在该实施方案中，该溶液含有占约45-55％的甲醇、占约2-4％的EDTA和占约6-8％的乙酸钠缓冲剂。

在另一个实施方案中，该保存溶液含有甲醇、EDTA钠盐和钾盐的组合和乙酸盐缓冲剂。在另一个实施方案中，该溶液含有甲醇、乙酸镁、乙酸钙、氯化钾和氯化钠，其中醇占溶液的约20％，氯化钠占约0.1％，氯化钾为10mM，乙酸钙为2mM且乙酸镁为1mM。

该保存溶液适用于在约4℃至约8℃的环境温度下保存悬浮的细胞至少约三周。在这期间，细胞保留足以染色的结构而没有完整性的显著丢失。该溶液可以增强细胞的核结构的维持，因为它能维持细胞膜使之足以进行后续的细胞学染色。该溶液还可以破坏样品中的微生物病原体和抑制逆转录病毒的活性。该溶液可以除去样品中不期望的成分如蛋白质。

该持续期间可以被该溶液在环境细胞悬浮之前的储存时间、细胞取样与细胞悬浮之间的时间和含醇量所改变。例如，如果该溶液已储存了相当长的一段时间，无论是冷藏状态还是室温状态，那么该溶液剩下的保存细胞生存力都可能是有限的。

除了保存细胞之外，该溶液还可以杀死选择的病原体。例如，该溶液有效地杀死测试样品中的下列微生物：白色念珠菌、黑曲霉(Aspergillus niger)、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

在溶液中可以使用洗涤剂。该洗涤剂可以是非离子的、阳离子的、阴离子的或两性离子的。也可以使用洗涤剂的混合物。洗涤剂种类的实例包括醇醚硫酸盐、醇硫酸盐、烷醇酰胺、烷基磺酸盐、胺氧化物、两性洗涤剂、阴离子洗涤剂、甜菜碱衍生物、阳离子洗涤剂、二磺酸盐、十二烷基苯磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯助水溶物、月桂基硫酸盐、单酸甘油酯和甘油二酯、非离子洗涤剂、磷酸酯、季铵盐洗涤剂和脱水山梨糖醇衍生物。

试剂盒

本发明还提供可含有用于实施本发明方法的试剂的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒含有醇保存溶液和存在于溶液中时适于与样品中的中心体目标结合的可检测的传感器。该传感器可以与标记缀合，标记可以是包括荧光团在内的发色团。

试剂盒的组分可通过包装物(housing)来保存。使用试剂盒实施本发明方法的说明书也可以与试剂盒一同提供，它可以以任何固定媒介形式提供。该说明书可以在包装物之内或之外，可以印刷于使该说明书清楚易读的形成该包装物的任一表面的内面或外面上。该试剂盒可以是多重的形式，含有多种可以与样品中的相应的不同目标结合的一种或多种不同传感器。

实施例

阐述以下的实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整实施方式，而无意限制本发明的范围。虽然努力确保所使用数字的准确性(例如量、温度等)，但是应考虑存在一些实验误差和偏差。若非另外说明，部分是以重量计部分，温度是摄氏度，压力是或者接近于大气压，所有的材料均可商购获得。

实施例1

将50μl体积的PNA混合入含有一定体积的细胞PreservCyt(Cytyc Corp.)的ThinPrep小瓶(Cytyc Corp.)或微离心管中，杂交事件在溶液中使用55℃的水浴进行。或者，杂交事件在室温下进行过夜。杂交后，将标本以12000rpm离心5分钟，使细胞沉淀然后重悬于一定体积的洗涤缓冲液中。通过将样品置于55℃水浴中30分钟来洗涤细胞。洗涤后，将样品再次以如上所述的方法离心，再次重悬于一定体积的新洗涤缓冲液中，然后转移至载玻片上。将载玻片风干，盖上盖玻片并观察是否阳性(多个视野中存在一簇一簇的绿色荧光生物体)。或者，也可以通过在T2处理器上处理标本来洗涤标本，制备载玻片(T2操作的细胞收集处理期间除去未结合的探针)。这里制备的载玻片被T2处理器释放至含有1×洗涤缓冲液(AdvanDx)的收集小瓶中，然后在55℃的缓冲液中温育30分钟。

实施例2

建立了通过FISH(荧光原位杂交)使用PNA技术检测PreservCyt溶液中的微生物的方法。

这些研究中使用的PNA探针来自于AdvanDx，Inc。AdvanDx，Inc.经Boston Probes，Inc.许可生产检测金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的PNA试剂盒。期望用途是检测从血液培养物制备的涂片中的白色念珠菌和黄色葡萄球菌(仅供研究使用)。

在PreservCyt中的溶液内杂交步骤：

1.将50μl PNA探针加入500μl PreservCyt标本*中，涡旋混合。置于55℃水浴中(90min或过夜)杂交。

2.在T2处理器上处理标本以将细胞转移至ThinPrep载玻片上。制备好细胞点后，仪器会把载玻片释放入含有1×洗涤缓冲液(AdvanDx)的收集小瓶中。

3.将载玻片(浸没在1×洗涤缓冲液中)在55℃水浴中温育30分钟。

4.取出载玻片，风干。固定，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。通过多个视野中存在一簇一簇的绿色荧光生物体来确定阳性。

*该方法主要是使用加入了白色念珠菌或金黄色葡萄球菌的细胞PreservCyt来实施。但是，使用长达四年的白色念珠菌阳性ThinPrep标本(载玻片基)也已经证实了该测定法的性能。

常规方法(AdvanDx试剂盒插入页中所描述)

1.将一滴固定溶液(AdvanDx)置于显微镜载玻片(AdvanDx)上，然后加一滴血液培养物标本并混合。

2.通过将涂片在55-80℃下加热20分钟以固定。

3.将载玻片浸入80％或96％乙醇中5-10分钟，风干。

4.将一滴PNA探针加至固定的涂片上，盖上盖玻片，在55℃下温育90分钟杂交。

5.将载玻片置于55℃下预热的1×洗涤溶液中，移去盖玻片。在55℃的洗涤溶液中温育30分钟。

取出载玻片，风干。固定，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。通过多个视野中存在一簇一簇的绿色荧光生物体来确定阳性。

结论

在PreservCyt中进行溶液内杂交证实了用ThinPrep小瓶进行辅助分子测试的技术。这表明含有PNA探针的ThinPrep标本可以在FISH后在ThinPrep 2000处理器上进行处理，而不损害目标进行PNA杂交事件。细胞和目标生物体都被转移至载玻片上，形成比常规涂片法更容易解析的单层细胞。另外，ThinPrep处理器使从样品中除去未结合的PNA容易，使得制备的载玻片具有较低的背景噪音。在ThinPrep小瓶中进行杂交和在ThinPrep处理器上制备载玻片在使辅助分子测试的过程流线化的同时通过减少步骤而使FISH方法简化。

Claims (40)

1.一种测定方法，其包括：

提供怀疑含有中心体目标的样品；

提供可以在醇保存溶液中与所述中心体目标结合的可检测的传感器；

如果目标存在的话，使所述样品在所述传感器能够与所述目标结合的条件下在醇保存溶液中与所述传感器接触；

检测所述传感器是否与所述目标结合。

2.权利要求1的方法，其中所述样品选自血液；尿；精液；乳汁；痰；粘液；胸腔液；盆腔液；滑膜液；腹水；体腔灌洗液；眼刷物；皮肤刮下物；口腔拭物；阴道拭物；巴氏涂片物；直肠拭物；吸出物；穿刺活组织检查物；组织切片；血浆；血清；脊髓液；淋巴液；皮肤、呼吸道、肠道或泌尿生殖道的外分泌物；泪液；唾液；肿瘤；器官；和体外细胞培养物成分。

3.权利要求1的方法，其中所述传感器包括适体。

4.权利要求1的方法，其中所述传感器包括多核苷酸。

5.权利要求1的方法，其中所述传感器包括肽核酸。

6.权利要求1的方法，其中所述传感器包括锁定核酸。

7.权利要求1的方法，其中所述传感器与发色团缀合。

8.权利要求7的方法，其中所述发色团是荧光团。

9.权利要求8的方法，其中所述荧光团选自半导体纳米晶体、荧光染料和镧系元素螯合物。

10.权利要求9的方法，其中所述荧光团是半导体纳米晶体。

11.权利要求9的方法，其中所述荧光团是荧光染料。

12.权利要求11的方法，其中所述荧光染料是荧光素。

13.权利要求9的方法，其中所述荧光团是镧系元素螯合物。

14.权利要求1的方法，其中所述样品是细胞部分。

15.权利要求1的方法，其中所述样品被转移至基材上。

16.权利要求1的方法，其中所述基材是载玻片。

17.权利要求1的方法，其中所述基材是盖玻片。

18.权利要求1的方法，其中所述样品是活组织检查样品。

19.权利要求1的方法，其中所述样品是巴氏涂片物。

20.权利要求1的方法，其中所述样品进一步进行染色步骤。

21.权利要求1的方法，其中所述染色步骤是巴氏染色步骤。

22.权利要求1的方法，其进一步包括将从所述检测步骤得到的结果与从对照样品得到的结果相比较。

23.权利要求22的方法，其中所述对照样品是阳性对照。

24.权利要求22的方法，其中所述对照样品是阴性对照。

25.权利要求1的方法，其进一步包括在所述检测步骤之前洗涤所述样品。

26.权利要求1的方法，其中所述传感器与可检测的部分缀合。

27.权利要求1的方法，其中所述传感器本身是可检测的。

28.权利要求1的方法，其中所述方法为自动化的。

29.权利要求1的方法，其中所述方法手动完成。

30.权利要求28的方法，其中所述自动化方法通过自动化成像系统完成。

31.权利要求31的方法，其中所述自动化成像系统定量一部分样品中存在的中心体的数目。

32.权利要求1的方法，其中所述中心体目标选自剑蛋白、剑蛋白亚基、eg5、Nlkl、HSP90、trinectin、中心粒周蛋白、cpl40、中心体蛋白、γ-微管蛋白、α-微管蛋白、β-微管蛋白、CENP-F、aurora蛋白和BTAK。

33.一种识别与中心体目标特异性结合的传感器的方法，其包括：

使含有中心体的样品与可检测的传感器接触，其中所述接触在保存溶液中进行，所述保存溶液含有一定量的一种或多种有效地防止这种溶液被至少一种污染物污染的水溶性醇；和

检测所述传感器是否已经与中心体目标结合。

34.权利要求33的方法，其中所述方法对多种候选传感器进行。

35.一种保存传感溶液，其包含：

在样品存在下有效保持溶液对至少一种污染物的无菌性的量的水溶性醇；

缓冲溶液；

抗聚集剂；和

能够与该含醇溶液中的中心体目标特异性结合的可检测的传感器。

36.权利要求35的溶液，其中所述醇选自乙醇、异丙醇和甲醇。

37.权利要求35的溶液，其中所述醇是甲醇。

38.权利要求35的溶液，其中所述抗聚集剂是选自乙二胺四乙酸及其盐的螯合剂。

39.权利要求35的溶液，其中所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲剂、乙酸钠、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸盐、枸橼酸和枸橼酸盐。

40.权利要求35的溶液，其中所述缓冲剂是乙酸钠。

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