EP2007400A1 - Nouveaux medicaments pour les traitements contre les retrovirus - Google Patents

Nouveaux medicaments pour les traitements contre les retrovirus

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Publication number
EP2007400A1
EP2007400A1 EP07731297A EP07731297A EP2007400A1 EP 2007400 A1 EP2007400 A1 EP 2007400A1 EP 07731297 A EP07731297 A EP 07731297A EP 07731297 A EP07731297 A EP 07731297A EP 2007400 A1 EP2007400 A1 EP 2007400A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
agents
degree
polysaccharide
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07731297A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Claude Yvin
Jean-Claude Chermann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ASE AND BIO
Original Assignee
Laboratoire de la Mer SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratoire de la Mer SAS filed Critical Laboratoire de la Mer SAS
Publication of EP2007400A1 publication Critical patent/EP2007400A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the subject of the invention is new drugs for retrovirus treatments, by acting on their replication cycle by inhibition of RT.
  • Retroviruses belong to a family of viruses whose genome is made of RNA.
  • the peculiarity of retroviruses is to replicate in a host cell via DNA steps, which is made possible by the Reverse Transcriptase, or Reverse Transcriptase, designated by RT in what follows, and which is an enzyme allowing the transcription of I 1 viral RNA into complementary DNA molecule called provirus.
  • the provirus is able to circularize and integrate into the genome of the host cell.
  • the retroviruses thus integrated into the genome of the host cell can either use the cellular machinery to multiply, or remain latent in the host cell.
  • their genes are transmitted to the descending cells at each mitosis and are temporarily silent; the organism carrying the retrovirus does not present any pathological sign.
  • the retrovirus family has three subfamilies: oncoviruses, lentiviruses and spumaviruses.
  • Oncoviruses are responsible for cancers and, in particular, certain leukemias.
  • Cancer-causing oncoviruses include Roux sarcoma virus or VSR.
  • HTLV Roux sarcoma virus
  • HTLV Human T cell Leukemia Virus
  • felines leukemia is caused by the FTLV virus.
  • Lentiviruses are responsible for slow-growing viral infections such as acquired immunodeficiency syndrome or AIDS.
  • lentiviruses responsible for AIDS are part of HIV or "Human Immunodeficiency Virus” (type I, HIV-I or type II, HIV-II), or French HIV (Human Immunodeficiency Virus) ; in monkeys, these are SIV ("Simian Immunodeficiency Virus") and in FIV cat (Feline Immunodeficiency Virus).
  • Spumaviruses are poorly known, both in terms of their structure and the exact mode of their integration into the cellular genome. In the current state of knowledge, no disease seems to be associated with spumaviruses. However, their responsibility in triggering certain autoimmune diseases seems likely.
  • oncoviruses transform the T cells they infect and cause uncontrolled proliferation of these cells; lentiviruses destroy the cells they infect.
  • helper T4 cells that express on their surface the CD4 molecule (as a membrane glycoprotein molecule), which is a receptor that allows HIV to penetrate inside these cells. .
  • gp120 a surface glycoprotein of the retrovirus
  • the retrovirus here an HIV
  • the host cell here the T4 lymphocyte
  • the RT which intervenes in the manner indicated below.
  • the nucleus or core of the virus once it has penetrated inside the host cell, releases two copies of single-stranded RNA.
  • These two copies of single-stranded RNA are associated with RT as well as other proteins such as protease and integrase. This synthesizes a strand of DNA complementary to the viral RNA.
  • RT-associated RNase activity degrades the RNA strand, while a second strand of DNA is synthesized.
  • the double-stranded DNA thus obtained is then circularized and integrated, thanks to an integrase enzyme, into the cellular genome to give a provirus.
  • This provirus contains 3 structural genes, namely the gag (antigen group), pol (polymerase) and env (envelope) genes; gag genes code for p24 viral proteins, pol genes for RT and its associated activities which are polymerase, RNase, integrase and protease activities, and env genes for envelope glycoproteins such as gp120.
  • the provirus is transcribed into messenger RNA using the machinery of the nucleus of the host cell, which allows the production of the constitutive proteins of the retrovirus on the one hand and the replication of the viral genomic material on the other hand. go.
  • the whole constitutes a new virus produced by budding of the membrane of the host cell.
  • fusion phenomena occur between the infected cells, which have on their surface, in particular, the gp120 protein, and the uninfected T4 lymphocytes, which comprise on their surface the CD4 molecule.
  • an infected cell can bind healthy uninfected T4 cells and form what is called a syncytium, i.e. infected and uninfected lymphocytes, which is unable to survive.
  • a single infected cell can cause the death of many healthy T4 cells. This results in a gradual decrease in cellular immunity which results in the development of opportunistic infections, which may be accompanied by certain types of tumors.
  • T4 cells other cells also have the CD4 molecule on their surface, and are therefore sensitive to HIV viruses; these include macrophage monocytes, certain cells found in the ganglia, skin and other organs, and some B cells.
  • HIV viruses can also attack certain CNS central nervous system cells: in this case, they cause neurological syndromes.
  • chemokines Other molecules located on the surface of the cell that normally function as receptors for chemokines have also been identified as co-receptors that allow the entry of HIV viruses into the host cell.
  • the retroviruses responsible for AIDS that is to say lentiviruses and especially HIV are characterized by extreme genetic and antigenic variability.
  • HIV-I HIV-I
  • HIV-II HIV-II
  • HIV-1 strains belong to the group M (Major), which comprises at least ten subtypes or clades (A, B, C, D, ...); we meet these clades in various geographical areas.
  • M Major
  • clades A, B, C, D, ...
  • the HIV-1 strains of the O and N groups have so far been isolated only in African populations.
  • the high genetic variability of these HIV strains is mainly due to the high error rate of RT. Indeed, during successive replication cycles, genetic variants appear. Mutations occur in particular on the env gene and more precisely on the coding part for gp120.
  • RT is still essential for their replication. And when this viral enzyme is inhibited, the oncovirus can no longer replicate in the host cell.
  • RTs reverse transcriptase inhibitors
  • RT reverse transcriptase
  • nucleoside RT inhibitors include nucleoside RT inhibitors, non-nucleoside RT inhibitors and nucleotide analogues.
  • nucleoside inhibitors of RT mention may be made of AZT
  • nucleoside inhibitors compete with natural nucleosides and prevent elongation of the DNA chain; they were the first to be used as RT inhibitors, first alone and then in combination with other RT inhibitors or viral enzymes such as protease and integrase.
  • RT inhibitors first alone and then in combination with other RT inhibitors or viral enzymes such as protease and integrase.
  • side effects are known and numerous.
  • mutations of the reverse transcriptase confer resistance to INRTs that can be crossed between several INRTs.
  • Non-nucleoside RT inhibitors act as noncompetitive antagonists by binding to a hydrophobic region adjacent to the catalytic site of RT, thereby inhibiting RT; among them, ritonavir, saquinavir, efavirenz, rescriptor, sustiva and viramune may be mentioned.
  • the second therapeutic group is constituted by protease inhibitors (PIs).
  • PIs protease inhibitors
  • They are powerful anti-retroviral agents that inhibit the proteolytic activity of the viral protease; for example, amprenavir, tipranavir, indinavir, saquinavir, lopinavir, posanprenavir, ritonavir, atazanavir and nelfinavir.
  • the third therapeutic group corresponds to the fusion and entry inhibitors, of which several molecules are under study. Only enfuvirtide is currently on the market. It acts at the first stage of virus replication by preventing fusion between virus / cell by competitive inhibition.
  • AIDS is mainly due to viral resistance phenomena, although other factors such as the toxicity of the agents used as well as some side effects also affect the effectiveness of treatments, although to a lesser extent. It is to cope with this situation that much research has been and is being conducted to discover novel antiretroviral agents capable of inhibiting RT, particularly among polysaccharides.
  • EP 0240 098 recommends the use as antiretroviral agents of synthetic or natural sulfated polysaccharides via connector groups.
  • EP 0240 098 particularly described sulphates of chondroitin, dermatan, keratan, hyaluronic acid, carrageenan, fucoidan, heparin and dextran.
  • the patent application EP 0 464 759 also describes sulfated polysaccharides via a specific group intended for the long-term prophylaxis of diseases caused by viruses. These two patent applications, EP 0 240 098 and EP 0 464 759, have the major disadvantage of providing complex oligosaccharides to be synthesized due to the presence of an intermediate group necessary for sulfation.
  • Japanese Patent Application Publication 01-103601 describes the antiviral activity, especially with regard to HIV, lentinan sulfate, certain ⁇ -1, 3 glucans such as curdlan, pachymane, and those of the cell walls of yeast and those of cellulose.
  • the published Japanese patent application 03-145 425 describes the antiviral activity, with respect to HIV, of certain sulphated laminarioligosaccharides and in particular of sulphated laminaripentaose.
  • the problem to be addressed by the present invention is therefore the availability to the medical profession of new antiretroviral drugs with a high therapeutic index, particularly active against lentiviruses and oncoviruses, especially against HIV, as well as against strains resistant to certain antiretroviral agents already known, and having a low anticoagulant activity in vivo.
  • the subject of the present invention is therefore the use, for the manufacture of a medicament for the treatment of retroviral diseases, of a polysaccharide of formula (I)
  • R 1 represents either a hydrogen atom, a sulfate group or a phosphate group, or a sulfated or phosphate glucose preferably linked by a ⁇ -type bond (1 ⁇ 6) to the saccharide structure,
  • R 2 represents a hydrogen atom, a sulfate group or a phosphate group
  • R 1 and R 2 can not simultaneously represent a hydrogen atom
  • X and Y represent, each independently, an OH group, a glucose, a sulfated or phosphated glucose, a mannitol, or a sulfated or phosphated mannitol,
  • n represents an integer from 11 to 30, preferably from 20 to 30, more preferably from 25 to 30, said polysaccharide having a degree of sulfation greater than 2, preferably from 2.2 to 2.4, or a degree of phosphatation greater than 1, preferably from 1.5 to 2.5.
  • the polysaccharide used is a polysaccharide of formula (I) in which R 1 and R 2 may be identical and then represent a sulfate or phosphate group, or different from each other, Ri representing then a sulfated or phosphated glucose unit preferably linked by a ⁇ -1 ⁇ -bond to the saccharide structure, X and / or Y representing a mannitol group and n an integer of 11 to 30, more particularly of 25 to 30.
  • R 1 and R 2 may be identical and then represent a sulfate or phosphate group, or different from each other
  • Ri representing then a sulfated or phosphated glucose unit preferably linked by a ⁇ -1 ⁇ -bond to the saccharide structure
  • X and / or Y representing a mannitol group
  • n an integer of 11 to 30, more particularly of 25 to 30.
  • the drug manufactured using a polysaccharide of formula (I) acts on the retrovirus replication cycle by inhibiting the RT of the latter.
  • sulfation degree means the average number, per saccharide unit, of sulphated OH groups.
  • a degree of sulfation greater than 2 means that, on average, over the entire polysaccharide, more than 2 OH groups per saccharide unit are sulfated.
  • degree of phosphatation means the average number, per saccharide unit, of phosphate-containing OH groups. A degree of phosphatation greater than 1 means that, on average, over the entire polysaccharide, more than 1 OH group per saccharide unit is phosphated.
  • sulfate group means a group of the type (-SO 3 H).
  • phosphate group means a group of the type (-PO3H2).
  • Another subject of the invention is the use of one of the polysaccharides defined above for the implementation of a method for treating retroviral diseases.
  • the retroviral diseases are preferably chosen from those caused by lentiviruses and oncoviruses, more particularly by HIV, and by the strains of these retroviruses resistant to anti-retroviral RT inhibitors agents already known.
  • the drug obtained by use according to the invention of a polysaccharide of formula (I) makes it possible to treat the acquired immunodeficiency syndrome in humans.
  • a retroviral disease within the meaning of the invention is the acquired immunodeficiency syndrome or AIDS in humans.
  • polysaccharides of formula (I) as used according to the invention are also particularly active against oncoviruses, in particular against HTLV type I and II viruses.
  • the use according to the invention of a polysaccharide of formula (I) makes it possible to treat the cancers associated with these retroviruses.
  • the polysaccharide of formula (I) is a sulfated laminarine having a degree of polymerization of 11 to 28.
  • the polysaccharide of formula (I) is a laminarine of degree of sulfation equal to about 2.3, called "laminarin PS3".
  • the term "degree of polymerization” is intended to mean the number of monosaccharide units bonded to each other by ⁇ (1-> 3) -type bonds constituting the main linear chain.
  • a degree of polymerization of 11 to 28 means a polysaccharide composed of 11 to 28 saccharide units, in particular glucose, bound together by ⁇ (1-> 3) type bonds. This degree of polymerization does not take into account glucose units bound in ⁇ (1 ⁇ 6) to the main chain of the polysaccharide.
  • the degree of polymerization is equal to n + 2 when X and Y simultaneously represent OH, to n + 3 if only one of X or Y represents OH, and at n + 4 neither X nor Y represents OH.
  • sulphated laminarine having a degree of sulphation greater than 2, preferably of 2.2 to 2.4, and a degree of polymerization of 11 to 28, was particularly effective for the treatment of retroviral diseases, preferably selected from those caused by lentivirus and oncovirus, more particularly by HIV, and by strains of these retroviruses resistant to anti-retroviral agents RT inhibitors already known, particularly I 1 AZT .
  • This sulphated laminarine also had a low anticoagulant activity, thus confirming its great interest in the manufacture of a medicament intended for human or animal administration.
  • the invention relates to the use of a polysaccharide, obtained from sulphated laminarine with a degree of sulphation greater than 2 and preferably from 2.2 to 2.4, of degree of polymerization of 11 to 28, for the preparation of a medicament for the treatment of retroviral diseases, preferably chosen from those caused by lentiviruses and oncoviruses, more particularly by HIV, and by the strains of these retroviruses resistant to antiretroviral agents already known RT inhibitors.
  • the polysaccharide of formula (I) is a phosphatized laminarine having a degree of polymerization of 11 to 28.
  • the laminarin phosphate according to the invention has a degree of phosphatation greater than 1 and preferably from 1.5 to 2.5 and is particularly suitable for the treatment of retroviral diseases, preferably chosen from those caused by lentiviruses and oncoviruses, more particularly by HIV, and by strains of these retroviruses resistant to anti-retroviral RT inhibitors already known.
  • the invention relates to the use of a polysaccharide obtained from laminarine phosphate with a degree of phosphatation greater than 1 and preferably from 1.5 to 2.5, with a degree of polymerization of 11. at 28, for the preparation of a medicament for the treatment of retroviral diseases, preferably chosen from those caused by lentiviruses and oncoviruses, more particularly by HIV, and by the strains of these retroviruses resistant to inhibitory antiretroviral agents of the RT already known.
  • a particular embodiment of the invention relates to the use of a sulfated laminarine, characterized in that it has a degree of sulfation greater than 2, preferably from 2.2 to 2.4, and a degree of polymerization. from 11 to 28 for the manufacture of a medicament for the treatment of retroviral diseases.
  • Another particular embodiment of the invention relates to the use of a sulfated laminarine, characterized in that it has a degree of sulfation greater than 2, preferably from 2.2 to 2.4, and a degree of polymerization from 11 to 28, for the implementation of a method for treating retroviral diseases.
  • Another particular embodiment of the invention relates to the use of a phosphatized laminarine, characterized in that it has a degree of phosphatation greater than 1, preferably from 1.5 to 2.5, and a degree of polymerization from 11 to 28, for the manufacture of a medicament for the treatment of retroviral diseases.
  • Yet another particular embodiment of the invention relates to the use of a phosphatized laminarin, characterized in that it has a degree of phosphatation greater than 1, preferably from 1.5 to 2.5, and a degree of polymerization from 11 to 28, for the implementation of a method for treating retroviral diseases.
  • a phosphatized laminarin characterized in that it has a degree of phosphatation greater than 1, preferably from 1.5 to 2.5, and a degree of polymerization from 11 to 28, for the implementation of a method for treating retroviral diseases.
  • multi-therapies not only two or even three antiretroviral agents, but also other pharmacological agents intended to fight against the associated pathogenesis.
  • the use of these numerous drugs represents a considerable bond for patients.
  • the subject of the invention is also a combination product comprising an effective quantity
  • R 1 represents either a hydrogen atom, a sulphate group or a phosphate group, or a sulphated or phosphatic glucose bonded, preferably, by a ⁇ -type bond (1- 6) to the saccharide structure
  • R 2 represents a hydrogen atom, a sulfate group or a phosphate group
  • X and Y represent, each independently, an OH group, a glucose, a sulfated or phosphated glucose, a mannitol, or a sulfated or phosphated mannitol
  • n represents an integer from 11 to 30, preferably from 20 to 30, more preferably from 25 to 30, said polysaccharide having a degree of sulfation greater than 2, preferably from 2.2 to 2.4, or a degree of phosphatation greater than 1, preferably from 1.5 to 2.5
  • R 1 represents either a hydrogen atom, a sulphate group or a phosphate group, or a sulphated or phosphat
  • At least one antiretroviral agent chosen from the group comprising:
  • nucleoside reverse transcriptase inhibitors including I 1 AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC and ABC,
  • NRTIs non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
  • protease inhibitors including Agenerase and Kaletra
  • fusion inhibitors including enfuvirtide (Fuzeon)
  • Input inhibitors including, in particular, AMD-3100 and, optionally, at least one pharmacological agent chosen from the group comprising anti-nausea agents, anti-diarrheal agents, anti-hyperbilirubinemia agents, agents anti-pain agents for dermatological treatments, anti-nephrotoxic agents, for simultaneous, separate or spread over time.
  • pharmacological agent chosen from the group comprising anti-nausea agents, anti-diarrheal agents, anti-hyperbilirubinemia agents, agents anti-pain agents for dermatological treatments, anti-nephrotoxic agents, for simultaneous, separate or spread over time.
  • the skilled person is able to define the best adapted administration to obtain the best therapeutic index for the patient.
  • Each active substance in HAART can be administered sequentially, on different routes, or at the same time.
  • the term "effective amount" means an amount of active substance that is sufficient to obtain a therapeutic effect on a patient.
  • the subject of the invention is also the use of an effective amount of a polysaccharide of formula (I) as described above,
  • At least one antiretroviral agent chosen from the group comprising:
  • nucleoside reverse transcriptase inhibitors including I 1 AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC and ABC,
  • NRTIs non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
  • protease inhibitors including Agenerase and Kaletra
  • fusion inhibitors including enfuvirtide (Fuzeon)
  • Input inhibitors including, in particular, AMD-3100 and, optionally, at least one pharmacological agent chosen from the group comprising anti-nausea agents, anti-diarrheal agents, anti-hyperbilirubinemia agents, agents anti-pain agents for dermatological treatments, anti-nephrotoxic agents, for the manufacture of a medicament for the treatment of retroviral diseases, preferably caused by lentiviruses and oncoviruses, more preferably by HIV, in particular by the strains of these retroviruses resistant to antiretroviral agents already known.
  • pharmacological agent chosen from the group comprising anti-nausea agents, anti-diarrheal agents, anti-hyperbilirubinemia agents, agents anti-pain agents for dermatological treatments, anti-nephrotoxic agents, for the manufacture of a medicament for the treatment of retroviral diseases, preferably caused by lentiviruses and oncoviruses, more preferably by HIV, in particular by the strains of these retroviruses resistant
  • At least one antiretroviral agent chosen from the group comprising:
  • nucleoside reverse transcriptase inhibitors including AZT, ddl, ddC, d4T,
  • NRTIs non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
  • protease inhibitors including Agenerase and Kaletra
  • fusion inhibitors including enfuvirtide (Fuzeon),
  • input inhibitors including the AMD-3100 and possibly at least one pharmacological agent chosen from the group comprising anti-nausea agents, anti-diarrheal agents, anti-hyperbilirubinemia agents, anti-pain agents, agents for dermatological treatments, anti-nephrotoxic agents, the implementation of a method for treating retroviral diseases, preferably caused by lentiviruses and oncoviruses, more preferably by HIV, in particular by the strains of these retroviruses resistant to antiretroviral agents already known.
  • pharmacological agent chosen from the group comprising anti-nausea agents, anti-diarrheal agents, anti-hyperbilirubinemia agents, anti-pain agents, agents for dermatological treatments, anti-nephrotoxic agents, the implementation of a method for treating retroviral diseases, preferably caused by lentiviruses and oncoviruses, more preferably by HIV, in particular by the strains of these retroviruses resistant to antiretroviral agents already known.
  • the present invention also relates to a method for treating a retroviral disease, preferably caused by lentiviruses and oncoviruses, more preferably by HIV, in particular by the strains of these retroviruses resistant to antiretroviral agents already known, comprising administering, in a patient affected by said retroviral disease, an effective amount of a medicament comprising as active agent at least one polysaccharide of formula (I) as previously described; or a combination product as described above.
  • the term "patient” means any warm-blooded animal, particularly mammals and especially humans.
  • the present invention also relates to a treatment method as defined above, in which the polysaccharide of formula (I) is a sulfated laminarine, characterized in that it has a degree of sulfation greater than 2, preferably 2, 2 to 2.4, and a degree of polymerization of 11 to 28.
  • the subject of the present invention is also a treatment method as defined above, in which the polysaccharide of formula (I) is a phosphatized laminarine, characterized in that it has a degree of phosphatation greater than 1, preferably of 1, 5 to 2.5, and a degree of polymerization of 11 to 28.
  • a sulfation step is carried out preferably following the protocol described by Alban S, Kraus J, and Franz G in "Synthesis of laminarin sulfates with anticoagulant activity" , Artzneim.Forsch./drug Res (1992) 42; 1005-1008.
  • the sulfation reaction is advantageously carried out under conditions corresponding to an absolute absence of water.
  • the polysaccharide is therefore preferably dried, for example on phosphorus pentoxide (P 2 O 5 ) and then dissolved in dimethylformamide or DMF.
  • P 2 O 5 phosphorus pentoxide
  • DMF dimethylformamide
  • the SO 3 -pyridine complex can advantageously be used.
  • the S ⁇ 3 -pyridine complex has, compared to other complexes, the advantage of being neither too reactive nor too stable, that is to say, too slowly from the reaction point of view. Due to the fact that the degree of sulfation obtained is proportional to the molar excess of sulfation reagent and since it is sought to obtain a degree of substitution greater than 2, it is advantageously implemented a concentration of 6 moles of SO 3 - pyridine per mole of glucose.
  • pyridine is added to the sulfation reagent in an equimolar amount, in order to directly capture the sulfuric acid that may be formed by reaction of the complex S ⁇ 3 -pyridine with water .
  • concentration of the polysaccharide as that of the sulfation reagent should preferably be as high as possible, the solubility of the polysaccharide and sulfation reagent limiting the degree of final sulfation.
  • the solution of the S ⁇ 3-pyridine complex in DMF could not be added all at once but in a manner continue for a period of 4 hours.
  • the sulfation reaction can be carried out at a temperature of 20 to 60 ° C., preferably of approximately 40 ° C. Higher temperatures result in a more efficient substitution but also a degradation of the chains.
  • the mixture is preferably stirred for several hours around 60 ° C. At this temperature, an additional substitution occurs without degradation of the chains.
  • the supernatant of the mixture is then advantageously separated by decantation.
  • the residue is dissolved, preferably in NaOH, and then mixed with 10 times its volume of ethanol.
  • the precipitate which occurs at a temperature of 4-8 ° C overnight is isolated and then preferentially dissolved in dilute sodium hydroxide (pH solution of about 9).
  • the solution is dialysed to remove salts and low weight molecules molecularly then advantageously brought to a pH of 7.0 by addition of NaOH and then lyophilized.
  • the resulting sulfated polysaccharide is in the form of the sodium salt.
  • the degree of sulphation is preferably determined by conductimetric titration of the free acid of the sulphated polysaccharide, or alternatively by ion chromatography after hydrolysis using an HPLC type system.
  • the first method has the advantage of being also suitable for stability research (the consumption of soda increases when sulphate groups are eliminated) whereas the HPLC method requires less substance and can be automated. As a control, it is possible to determine the sulfur content by elemental analysis.
  • the degree of sulfation obtained by proceeding as indicated above is greater than 2, more precisely from 2 to 2.5 and especially from 2.2 to 2.4.
  • the polysaccharide of formula (I), and preferably sulphated laminarine are used for the preparation of a medicament for retrovirus treatments intended for general administration and preferably for oral, rectal, pulmonary topical (including transdermal, oral and sublingual) and parenteral (including subcutaneous intramuscular, intravenous, intradermal and intravitreous).
  • the daily dose is generally from 0.01 to 250 mg per kilogram of weight of the patient and preferably from 0.10 to 100 mg, more preferentially still from 0.5 to 30 mg, and more particularly from 1.0 to 20 mg.
  • the daily dose can be administered per unit dose in one, two, three, four, five or six times or more at different times of the day.
  • the unit doses can comprise from 10 to 1000 mg, from 50 to 400 mg, and preferably from 50 to 100 mg of active substance.
  • the medicaments obtained according to the invention, using at least one of the polysaccharides of formula (I), comprise the conventional formulation ingredients and optionally one or more other therapeutic agents.
  • the polysaccharide of the invention can be advantageously combined with other active substances.
  • Their mode of administration can be simultaneous or sequential. They can also be administered by different routes as previously described.
  • the laminarine was first dried over phosphorus pentoxide (P2O5) and then dissolved in dimethylformamide or DMF.
  • the supernatant was then decanted from the mixture, the residue dissolved in 2.5 M NaOH, and then mixed with 10 times its volume of 99% ethanol.
  • the resulting solution was then placed at a temperature of 4-8 ° C overnight and a precipitate was obtained which was isolated and then dissolved in dilute sodium hydroxide (pH solution of about 9).
  • the solution was then dialyzed using a 1000 D cutoff Spectrapor membrane and then brought to pH 7.0 by the addition of NaOH. Finally, the solution thus dialysed was lyophilized. A laminarin sulphate in the form of a sodium salt was obtained.
  • the degree of sulfation by conductimetric titration of the free acid of the sulfated polysaccharide was then determined using 0.1 N sodium hydroxide.
  • the degree of sulfation of the laminarine obtained was 2.3.
  • the degree of polymerization of the laminarin sulphate thus obtained was 23 to 28.
  • Example 2A or by observation, depending on the amount of sulfated polysaccharides used and the timing of this implementation that can take place before, during or after infection or permanently, the decrease in the number of syncitia , appearing in a culture of MT 4 cells following infection with an HIV retrovirus, (Example 2A) - either by evaluation as a function of the amount of sulfated polysaccharides used and the moment of this implementation that can take place before, during or after infection, or permanently throughout the infection, inhibition of RT, which results in a measurable decrease in RT activity, and which reflects the slowing down of the replication of the infecting virus in a culture of CEM cells infected with an HIV retrovirus, (Example 2B) it being understood that for comparison purposes the same experiments were carried out using as comparison products on the one hand the dextran ulfate and on the other hand 3'-azidothymidine or AZT.
  • the above-mentioned MT 4 and CEM cells are human
  • the retroviruses that have been implemented are constituted by
  • RTMC virus (clade B) known to be resistant to the AZT antiviral agent
  • PIC CH an isolate derived from a patient resistant to several antiviral agents known as d4T and Zerit.
  • PTA 1 at the concentrations indicated below was also diluted with AZT (Sigma origin A2169), widely known to be an inhibitor of RT.
  • Example 2A Measuring the number of syncitia
  • the cells were then infected by adding to each well, except those corresponding to the cell controls, 50 .mu.l of viral dilution previously titrated. After a further hour of incubation, the plate was centrifuged and the supernatants containing the residual virus removed.
  • the sulfated laminarin PS3 and the comparison products were brought into contact with the cells for one hour, then the cells were washed twice to eliminate the products used and finally the infection was carried out. of MT 4 cell culture.
  • the sulfated laminarin PS3 was contacted with the comparison products at the time when the cells were infected.
  • the culture thus treated was kept as it was for one hour, followed by two washes, which resulted in the removal of the sulfated laminarin PS3 and comparison products as well as viruses that did not penetrated into the cells.
  • the sulfated laminar PS3 and the comparison products were first contacted with the cells for one hour at 37 ° C, then the culture was infected for one hour at 37 ° C. . Then two washes were made, which led to the elimination of viruses that did not penetrate the cells. The cell pellets were then transferred to 24-well plates at 3.10 5 cells / ml per well in the presence of the sulfated laminarin PS3 and comparison products at the selected concentrations.
  • Washes and rinses were performed with RPMI culture medium without fetal calf serum.
  • Ci uninfected cell culture
  • FIG. 2 shows an infected cell culture in which certain Ci cells agglutinate in syncytia identified by S, and
  • FIG. 3 shows, at a larger magnification, a culture of infected Ci cells, some of the Ci cells being agglutinated in syncytia identified by S.
  • AZT was used as a comparison product at a concentration of 0.01 ⁇ m
  • sulphated laminarin PS3 was used at two concentrations of 5 and 10 ⁇ g / ml, respectively.
  • the BRU (clade B) virus was used for the infection of MT 4 cells at a viral dilution of 10 5 which corresponds to the amount of virus particles that can infect 80% of the MT4 cultures (Tissue Culture Infections Dose 80% TCID 8 %).
  • the results observed from day D3 to day D4 in the four types of experiments previously defined are shown in Table A.
  • MT 4 cell cultures do not form syncitia when treated continuously, as soon as they are cultured (before, during and after infection), with concentrations of 10 ⁇ g / ml of PS3.
  • MT 4 cell cultures do not form syncitia when treated with concentrations of 10 and 5 ⁇ g / ml PS3 after infection with the BRU viral strain. The effect is observed from the 3rd day after the viral infection.
  • ⁇ ZT and dextran sulphate were used as comparison products respectively at concentrations of 0.4 ⁇ M and 10 ⁇ g / ml, the latter concentration also being that of PS3.
  • the NDK virus (clade D) used was used at the viral dilution of 2.5 ⁇ 10 -5, which corresponds to the amount of viral particles that can infect 80% of the MT4 cultures (Tissue Culture Infections Dose 80% TCID 80 % The results observed from D3 to D6 are collated in Table B. TABLE B
  • MT 4 cell cultures do not form syncitia when treated continuously, during and after infection, with a concentration of 10. ⁇ g / ml of PS3.
  • Dextran sulphate on the other hand, has an optimal effect when the cells are treated before viral infection (2 out of 2 wells inhibited).
  • Example 2B Measurement of inhibition of RT activity
  • the number of viruses present in the culture was demonstrated by measuring RT activity in the culture supernatant, the detected amount of RT activity being proportional to the number of viruses produced.
  • Example 2A The same experimental protocol as that used in Example 2A was used on MT 4 cells, except that the CEM cells were incubated with the sulphated laminarin PS3 or the comparison product and then cultured at the same time. concentration of 0.5 ⁇ 10 6 cells / ml. Every three days, the cells were counted and the cultures were diluted for culture at 0.5. 10 6 cells / ml; the RT activity was assayed according to a protocol comprising:
  • the culture samples were made in a protected P3 laboratory.
  • each well (1 ml) were centrifuged for 5 min at 1500 rpm (Jouan GR 422 centrifuge), and then ultracentrifuged the culture supernatant thus obtained at 40 ° C., 95000 rpm (Beckman TL100 ultracentrifuge) to obtain the viral pellet. .
  • the viral pellet was then taken up in a test tube containing 10 ⁇ l of NTE buffer supplemented with 0.1% triton, which releases the viral enzymes and in particular the RT; the tube was then vortexed, capped with parafilm and kept for 10 minutes at 4 ° C. and then frozen at -20 ° C.
  • reaction mixture previously discussed in the biochemistry laboratory was prepared and this mixture comprises for a 5 mL test tube.
  • composition of the aforesaid 5X base buffer is as follows
  • the tubes in question were held for one hour in a water bath at 37 ° C with stirring every 15 minutes. The reaction was then stopped by introducing into each tube 1 ml of 0.1 M NaP (sodium pyrophosphate) prepared in trichloroacetic acid or 5% TCA.
  • NaP sodium pyrophosphate
  • the synthesized DNA contained in the mixture was precipitated at 4 ° C. by addition of 3.5 ml / tube of 20% trichloroacetic acid and then filtered through 0.45 ⁇ Millipore nitrocellulose filters. To do this, the contents of the tubes were poured into the corresponding wells of a sample collector (Millipore), and the tubes and wells were rinsed three times with 5% TCA.
  • the filters were then dehydrated with 70% alcohol before being dried in the oven at 80 ° C. for 20 minutes. After cooling, the filters were individually placed in flasks containing a scintillation or scintillating agent sold under the tradename Emulsifier Safe cat. N 0 6013389 by Perkin Elmer Company. The count was then carried out using a liquid scintillation analyzer marketed under the trademark "PACKARD 2100T", the results of which are expressed in dpm / ml (disintegration per minute and per ml of supernatant).
  • the amount of radioactivity measured is proportional to the RT activity present and, consequently, to the number of viruses produced by replication.
  • the sulphated laminarine PS3 was tested at concentrations of 5 and 10 ⁇ g / ml and the comparison product of AZT at the concentration of 0.1 ⁇ M.
  • the RTMC virus (clade B) was used for the infection of the CEM cells, which has the particularity of being resistant to AZT and which has been used at a dilution of 5.10 -4 .
  • results recorded on days 3, 7 and 10 are collated in Table C. These results include, for each experiment, the RT activity expressed in dpm / ml and the number of cells expressed in 10 6 cells / ml.
  • the viral dilution being 5.10 -4 .
  • PS3 was tested at concentrations of 5 and 10 ⁇ g / ml and I 1 AZT at a concentration of 0.1 ⁇ M, the virus used being, this time, the NKD virus (clade D) at dilution. 2.5.10 "5 .
  • FIG. 5 which illustrates Table D
  • the RT activity expressed in dpm / ml measured at day 7 in the case of I 1 AZT and the two concentrations of PS3, as well as in the case of the cells was plotted on a graph. control not having been treated with an antiretroviral agent, for the four experiments corresponding to the administration of the antiretroviral agent continuously, before, during and after the infection with the NDK virus at a dilution of 2.5.10 "5 .
  • a viral concentration corresponding to a RT activity of 220,000 dpm was used; the results obtained appear on the graph of FIG. 7, the examination of which shows that PS3 at the concentration of 2.5 ⁇ g / ml causes an inhibition of RT of 35%, whereas dextran sulfate does not inhibit RT than 6% at the same concentration.
  • NDK virus For the NDK virus, a viral concentration corresponding to a RT activity of 81,000 dpm was used; the results obtained appear on the graph of FIG. 9, the examination of which shows that at the concentration of 0.6 ⁇ g / ml, the PS3 causes an inhibition of the RT of 43% compared to only 11% in the case of the sulphate of dextran; to the concentration of 0.8 ⁇ g / ml is obtained 57% inhibition respectively in the case of PS3 against 18% in the case of dextran sulfate.
  • PS3 is particularly effective on the RT of the CH CH virus (clade B) which is resistant to several antiviral agents, as well as on the NDK virus (clade D).
  • the anticoagulant activity of the laminar sulfate PS3 obtained in Example 1 was determined as a function of its concentration in comparison with that of heparin in conventional APTT coagulation tests or "Partial Activator Thromboplastin-Zeit", the duration of prothrombin, the test called “HEPTEST” and the duration of thrombin.
  • the APTT reflects an interaction with the intrinsic coagulation system while the prothrombin time reflects an interaction with extrinsic coagulation;
  • the so-called "HEPTEST” test is the standard test for the measurement of heparin inhibitory activity with respect to factor Xa and the duration of thrombin corresponds to the last stage of coagulation, namely the formation of fibrins induced by thrombin. It has been found that unlike heparin, the activity of laminar sulfate PS3 in the test called “HEPTEST" is more than 20 times lower. Similarly, in relation to the duration of prothrombin sulfate laminarine PS3 showed no pronounced anticoagulant effect, as in the case of heparin.
  • the specific activity (ILJ / mg) in the APTT represents 30% of the activity of heparin and in the case of the thrombin time 60%.
  • the concentration of APTT was 4 times higher and, in the case of thrombin time, 20 times higher.
  • laminar sulfate PS3 unlike heparin, does not exhibit either a significant anti-thrombin-dependent anti-factor Xa activity. an anti-thrombin activity.
  • the effect in the case of thrombin time may be considered to be due to heparin cofactor II-dependent thrombin inhibition.
  • the inhibitory properties of RT of laminarin sulfate PS3 can be advantageously exploited without fear of undesirable side effects on coagulation.
  • Example 1 The in vitro cytotoxicity of the sulfated laminar PS3 obtained in Example 1 was determined simultaneously with that of a comparison product.
  • 24-well plate CEM cells were cultured in 1 ml of RPMI supplemented with 10% fetal serum and calf, 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM glutamine, 2 ⁇ g / ml polybrene and different concentrations of sulphated laminarine PS3 and the comparison product consisting of dextran sulphate.
  • the cells were counted daily and the increase in number was compared to that of a control culture consisting of cultured CEM cells in the absence of sulphated PO3 laminarin or dextran sulfate (O ⁇ g / ml).
  • the white rabbits were tested on the one hand for ocular irritation and on the other hand for the primary skin irritation test. The outcome of the first of these tests led to the conclusion that the action was slightly irritating and in the second to a non-irritating action.
  • the rats were then subjected to an acute dermal toxicity test and to an acute oral toxicity study.
  • the dermal lethal dose 50 is greater than 2 g / kg of body weight, which makes it possible to affirm that the product is not toxic.
  • the acute oral toxicity may be considered greater than 2 g / kg of body weight which again allows the product to be classified as nontoxic.
  • Example 9 Composition of an Aerosol Solution Based on Sulphated Laminarine PS3
  • EXAMPLE 10 Composition of a suppository based on a sulfate of 3 1-3 qlucan
  • a suppository based on sulfate of a ⁇ 1-3 glucan having the following composition:
  • Example 11 Composition of a Laminaritol Sulphate Injectable Solution An injectable solution based on laminaritol sulphate having the following composition was prepared:
  • Example 12 Composition of a Vaginal Solution Based on a ⁇ 1-3 Glucan Sulfate
  • vaginal solution based on ⁇ 1-3 glucan sulfate having the following composition was produced:
  • the time of implementation at which sulfate laminar PS3 is effective demonstrates a specific action on the early events of the replication cycle of the virus.
  • the anti-retroviral activity of the polysaccharides of formula (I), in particular that of sulphated laminarine, is not only better than that of the products previously used, but, moreover, it is exerted even on viruses resistant to known inhibitors. of the RT, which is resistant to d4T and Zerit and CHT virus that is resistant to AZT.
  • the polysaccharides of formula (I), and especially sulfated laminarine inhibit the RT of isolated viruses, which seems to rule out the hypothesis of a mechanism of action related to the simple anionic nature of the sulfated polysaccharides of the invention.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un polysaccharide sulfaté ou phosphaté pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, y compris des souches de ces rétrovirus qui sont résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus; ce médicament agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers.

Description

POLYSACCHARIDES SULFATES OU PHOSPHATES POUR LES TRAITEMENTS CONTRE LES RETROVIRUS
L'invention a pour objet de nouveaux médicaments pour les traitements contre les rétrovirus, en agissant sur leur cycle de réplication par inhibition de la RT.
Les rétrovirus appartiennent à une famille de virus dont le génome est constitué d'ARN. La particularité des rétrovirus est de se répliquer dans une cellule hôte en passant par des étapes ADN, ce qui est rendu possible par la Reverse Transcriptase, ou Transcriptase Inverse, désignée par RT dans ce qui suit, et qui est une enzyme permettant la transcription de I1ARN viral en molécule d'ADN complémentaire appelée provirus.
Le provirus est capable de se circulariser et de s'intégrer dans le génome de la cellule hôte.
Les rétrovirus ainsi intégrés dans le génome de la cellule hôte peuvent soit utiliser la machinerie cellulaire pour se multiplier, soit demeurer à l'état latent dans la cellule hôte. A l'état de latence, leurs gènes sont transmis aux cellules descendantes à chaque mitose et sont temporairement silencieux ; l'organisme porteur du rétrovirus ne présente alors aucun signe pathologique.
La famille des rétrovirus comporte trois sous-familles : les oncovirus, les lentivirus et les spumavirus.
Les oncovirus sont responsables de cancers et, notamment, de certaines leucémies. Parmi les oncovirus provoquant des cancers, on peut citer le virus du sarcome de Roux ou VSR. Parmi ceux qui sont à l'origine de leucémies chez l'homme, on trouve notamment le virus HTLV de type I et de type II (HTLV signifiant « Human T cell Leukaemia Virus ») ; chez les félins, la leucémie est provoquée par le virus FTLV. Les lentivirus sont quant à eux responsables d'infections virales à évolution lente telles que le syndrome d'immunodéficience acquise ou SIDA. Chez l'homme, les lentivirus responsables du SIDA font partie des HIV ou « Human Immunodeficiency Virus » (de type I, HIV-I ou de type II, HIV-II), ou en français VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine) ; chez le singe, il s'agit des SIV ("Simian Immunodeficiency Virus") et chez le chat des FIV (Féline Immunodeficiency Virus).
Les spumavirus sont mal connus, tant au niveau de leur structure que du mode exact de leur intégration dans le génome cellulaire. Dans l'état actuel des connaissances, aucune maladie ne semble être associée aux spumavirus. Toutefois, leur responsabilité dans le déclenchement de certaines maladies auto-immunes semble probable.
Sur le plan physiopathologique, les oncovirus transforment les cellules T qu'ils infectent et entraînent une prolifération non contrôlée de ces cellules ; les lentivirus détruisent les cellules qu'ils infectent.
Concernant plus particulièrement les VIH, ils s'attaquent aux lymphocytes T4 auxiliaires qui expriment à leur surface la molécule CD4 (s'agissant d'une molécule glycoprotéique membranaire), qui est un récepteur permettant aux VIH de pénétrer à l'intérieur de ces cellules.
Les VIH pénètrent dans un lymphocyte T4 par un système d'endocytose impliquant la reconnaissance mutuelle et la fixation de la molécule CD4 exprimée à la surface du lymphocyte T à une glycoprotéine de surface du rétrovirus dénommée gp120. L'expression d'un corécepteur membranaire présent sur les lymphocytes T4 est également nécessaire à la pénétration du virus.
Comme indiqué précédemment, le rétrovirus, ici un VIH, se réplique à l'intérieur de la cellule hôte, ici le lymphocyte T4, sous l'action de la RT qui intervient de la manière indiquée ci-après.
Dans un premier temps, le noyau ou core du virus, une fois qu'il a pénétré à l'intérieur de la cellule hôte, libère deux copies d'ARN simple brin. Ces deux copies d'ARN simple brin sont associées à la RT ainsi qu'à d'autres protéines telles que la protéase et l'intégrase. Celle-ci synthétise un brin d'ADN complémentaire de l'ARN viral.
Ensuite, une activité RNase associée à la RT dégrade le brin d'ARN, tandis qu'un deuxième brin d'ADN est synthétisé. L'ADN bicaténaire ainsi obtenu est ensuite circularisé puis intégré, grâce à une enzyme intégrase, dans le génome cellulaire pour donner un provirus.
Ce provirus contient 3 gènes de structure, à savoir les gènes gag (groupe antigène), pol (polymérase) et env (enveloppe) ; les gènes gag codent pour les protéines virales p24, les gènes pol pour la RT et ses activités associées qui sont les activités polymérase, RNase, intégrase et protéase, et les gènes env pour les glycoprotéines de l'enveloppe telles que la gp120.
Lors de la phase de réplication virale, le provirus est transcrit en ARN messager en utilisant la machinerie du noyau de la cellule hôte, ce qui permet la production des protéines constitutives du rétrovirus d'une part et la réplication du matériel génomique viral d'autre part. L'ensemble constitue un nouveau virus produit par bourgeonnement de la membrane de la cellule hôte.
Par ailleurs, des phénomènes de fusion se produisent entre les cellules infectées, qui présentent à leur surface notamment la protéine gp120, et les lymphocytes T4 non infectés, qui comportent à leur surface la molécule CD4.
En effet, en raison de la grande affinité de la protéine gp 120 pour les récepteurs CD4, une cellule infectée peut fixer des Lymphocytes T4 non infectés sains et former ce qu'on appelle un syncytium, c'est-à-dire un agglomérat de lymphocytes infectés et non infectés, qui est incapable de survivre.
Une seule cellule infectée peut ainsi provoquer la mort de nombreux lymphocytes T4 sains. Il s'ensuit une diminution progressive de l'immunité cellulaire qui se traduit par le développement d'infections opportunistes, pouvant être accompagnées de certains types de tumeurs. Outre les lymphocytes T4, d'autres cellules comportent également la molécule CD4 à leur surface, et sont donc sensibles aux virus VIH ; il s'agit notamment des monocytes macrophages, de certaines cellules qui se trouvent dans les ganglions, la peau et d'autres organes, et de quelques lymphocytes B.
Par ailleurs, les virus VIH peuvent également s'attaquer à certaines cellules du système nerveux central SNC : ils provoquent dans ce cas des syndromes neurologiques.
D'autres molécules, localisées à la surface de la cellule et qui fonctionnent normalement comme récepteurs pour des chimiokines ont également été identifiées comme étant des co-récepteurs qui permettent l'entrée des virus VIH dans la cellule hôte.
Les rétrovirus responsables du SIDA, c'est-à-dire les lentivirus et notamment les VIH sont caractérisés par une extrême variabilité génétique et antigénique.
On admet généralement que chez l'homme il existe deux types de virus responsables du SIDA, et désignés respectivement par HIV-I (ou VIH-I) et HIV-II (ou VIH-II).
Des analyses génétiques ont montré qu'il existe trois groupes distincts de virus du type VIH-I ; ces trois groupes sont respectivement désignés par M (Majeur), O (Outlier) et N (New).
La grande majorité des souches VIH-I appartient au groupe M (Majeur), qui comporte au moins dix sous-types ou clades (A, B, C, D,...) ; on rencontre ces clades dans des zones géographiques diverses. Au contraire, les souches VIH-I des groupes O et N n'ont jusqu'à présent été isolées que dans des populations africaines.
La grande variabilité génétique de ces souches de virus VIH est principalement due au taux d'erreurs élevé de la RT. En effet, au cours des cycles de réplication successifs, des variants génétiques apparaissent. Les mutations se produisent en particulier sur le gène env et plus précisément sur la partie codante pour la gp120.
Cette variabilité génétique se traduit par l'apparition de souches qui deviennent résistantes aux agents anti-rétroviraux connus. Les traitements actuellement utilisés pour combattre les rétrovirus, notamment les lentivirus et tout particulièrement les VIH, visent à inhiber la RT et par conséquent bloquer leur cycle de réplication.
Il est à remarquer que dans le cas des oncovirus associés à certains types de cancers, la RT est toujours essentielle à leur réplication. Et lorsque cette enzyme virale est inhibée, l'oncovirus ne peut plus se répliquer dans la cellule hôte.
Les traitements anti-rétroviraux actuels mettent en œuvre trois groupes thérapeutiques majeurs : les inhibiteurs de la transcriptase inverse (RT), les inhibiteurs des protéases, et les inhibiteurs de fusion et d'entrée.
Parmi les inhibiteurs de la transcriptase inverse (RT), trois sous groupes de molécules sont actuellement utilisés en clinique. Il s'agit d'une part des inhibiteurs nucléosidiques de la RT, d'autre part, des inhibiteurs non-nucléosidiques de la RT et enfin des analogues nucléotidiques. Parmi les inhibiteurs nucléosidiques de la RT, on peut citer l'AZT
(ou 3'~azidothymidine), la didanosine et la stavudine (d4T, Zérit qui sont des analogues de la thymidine) ainsi que la ddC et le 3TC (qui sont des analogues de la cytidine). Ces inhibiteurs nucléosidiques entrent en compétition avec les nucléosides naturels et empêchent l'élongation de la chaîne d'ADN ; ils ont été les premiers à être utilisés comme inhibiteurs de la RT, seuls d'abord puis en association avec d'autres inhibiteurs de la RT ou d'enzymes virales telles que la protease et l'integrase. Cependant leurs effets indésirables sont connus et nombreux. En particulier, les mutations de la transcriptase inverse confèrent une résistance aux INRT qui peut être croisée entre plusieurs INRT. Ces composés sont tous neutres ou réducteurs, à l'exception de l'AZT qui est un oxydant ; Les inhibiteurs non-nucléosidiques de la RT agissent comme antagonistes non compétitifs en se liant à une région hydrophobe adjacente au site catalytique de la RT, inhibant ainsi cette dernière ; parmi eux, on peut citer le ritonavir, le saquinavir, l'éfavirenz, le rescriptor, le sustiva et la viramune.
Le deuxième groupe thérapeutique est consititué par les inhibiteurs des protéases (IP). Ce sont des agents anti-rétroviraux puissants qui inhibent l'activité protéolytique de la protéase virale ; à titre d'exemple, on peut citer l'amprenavir, le tipranavir, l'indinavir, le saquinavir, le lopinavir, le posanprenavir, le ritonavir, l'atazanavir et le nelfinavir.
Enfin le troisième groupe thérapeutique correspond aux inhibiteurs de fusion et d'entrée, dont plusieurs molécules sont à l'étude. Seul l'enfuvîrtide est actuellement sur le marché. Il agit au premier stade de la réplication du virus en empêchant la fusion entre le virus/cellule par inhibition compétitive.
L'apparition et la transmission, en particulier dans les pays industrialisés, de souches du VIH résistantes aux agents anti-rétroviraux connus a placé le monde médical devant un grave problème de santé publique. Les échecs rencontrés dans le traitement des patients atteints du
SIDA sont en effet principalement dus à des phénomènes de résistance virale, bien que d'autres facteurs tels que la toxicité des agents utilisés ainsi que certains effets secondaires influent également sur l'efficacité des traitements, même si c'est dans une moindre mesure. C'est pour faire face à cette situation que de nombreuses recherches ont été et sont menées pour découvrir de nouveaux agents anti-rétroviraux capables d'inhiber la RT, en particulier parmi les polysaccharides.
La demande de brevet européen 0 240 098 préconise l'utilisation comme agents anti-rétroviraux de polysaccharides synthétiques ou naturels sulfatés par l'intermédiaire de groupes connecteurs. EP 0240 098 décrit en particulier des sulfates de chondroitine, dermatane, keratane, acide hyaluronique, carrageenane, fucoidane, heparin et dextran.
La demande de brevet EP 0 464 759 décrit également des polysaccharides sulfatés par l'intermédiaire d'un groupement spécifique, destinés à la prophylaxie à long terme de maladies causées par des virus. Ces deux demandes de brevets, EP 0 240 098 et EP 0 464 759, présentent l'inconvénient majeur de proposer des oligosaccharides complexes à synthétiser du fait de la présence d'un groupe intermédiaire nécessaire à la sulfatation. La demande de brevet japonais publiée 01-103 601 décrit l'activité antivirale, notamment à l'égard du VIH, du sulfate de lentinan, de certains β-1 ,3 glucans comme le curdlan, le pachymane, et ceux des parois cellulaires de la levure ainsi que ceux de la cellulose.
Dans un article paru en novembre 1987 dans Jpn. J. Cancer Res/Gann n° 78, pp. 1164-1168, Hideki Nakajima et al décrivent l'effet d'inhibition sur l'infectivité et la réplication du VIH de certains polysaccharides sulfatés tels que les sulfates de dextran, de xylofuranan et de ribofuranan ainsi que l'inhibition par ces produits de la RT du VIH.
La demande de brevet japonais publiée 03-145 425 décrit l'activité antivirale, à l'égard du VIH, de certains laminarioligosaccharides sulfatés et notamment du laminaripentaose sulfaté.
Les travaux décrits dans ces documents n'ont toutefois conduit à aucune application pratique, en particulier du fait que les oligosaccharides décrits, même s'ils possèdent une activité antirétrovirale potentielle, présentent une forte activité anticoagulante, comme par exemple les sulfates de dextran et d'héparine, ce qui les rend inutilisables in vivo dans le cadre d'une thérapie.
Le problème auquel se propose de répondre la présente invention est donc la mise à disposition du corps médical de nouveaux médicaments antirétroviraux à indice thérapeutique élevé, particulièrement actifs contre les lentivirus et les oncovirus, notamment contre les VIH, ainsi que contre des souches résistantes à certains agents anti-rétroviraux déjà connus, et présentant une faible activité anticoagulante in vivo.
De manière surprenante et inattendue, ce problème a été résolu par la société Demanderesse, qui a pu déterminer que des polysaccharides sulfatés ou phosphatés de formule (I), telle que décrite ci après, possédaient une forte activité antirétrovirale, en particulier contre les lentivirus et les oncovirus, notamment contre le VIH, et contre les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents antirétroviraux inhibiteurs de la RT déjà connus, et ne possédaient pas d'activité anticoagulante incompatible avec une administration in vivo.
La présente invention a donc pour objet, l'utilisation, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies rétrovirales, d'un polysaccharide de formule (I)
G) dans laquelle
- R1 représente soit un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, soit un glucose sulfaté ou phosphaté lié, de préférence, par une liaison de type β(1→6) à la structure saccharidique,
- R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, R1 et R2 ne pouvant pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, - X et Y représentent, chacun indépendamment, un groupement OH, un glucose, un glucose sulfaté ou phosphaté, un mannitol, ou un mannitol sulfaté ou phosphaté,
- n représente un nombre entier de 11 à 30, préférentiellement de 20 à 30, plus préférentiellement de 25 à 30, ledit polysaccharide ayant un degré de sulfatation supérieur à 2, préférentiellement de 2,2 à 2,4, ou un degré de phosphatation supérieur à 1 , préférentiellement de 1 ,5 à 2,5.
Selon un autre mode de réalisation, le polysaccharide utilisé est un polysaccharide de formule (I) dans laquelle R1 et R2 peuvent être soit identiques et représentent alors un groupement sulfate ou phosphate, soit différents l'un de l'autre, Ri représentant alors une unité glucose sulfatée ou phosphatée liée, de préférence, par une liaison β de type β-1 ,6 à la structure saccharidique, X et/ou Y représentant un groupement mannitol et n un nombre entier de 11 à 30, plus particulièrement de 25 à 30.
Conformément à l'invention, le médicament fabriqué par utilisation d'un polysaccharide de formule (I) agit sur le cycle de réplication des rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers.
Au sens de la présente invention, on entend par « degré de sulfatation », le nombre moyen, par unité saccharidique, de groupements OH sulfatés. Un degré de sulfatation supérieur à 2 signifie que, en moyenne, sur l'ensemble du polysaccharide, plus de 2 groupements OH par unité saccharidique sont sulfatés.
Au sens de la présente invention, on entend par « degré de phosphatation », le nombre moyen, par unité saccharidique, de groupements OH phosphatés. Un degré de phosphatation supérieur à 1 signifie que, en moyenne, sur l'ensemble du polysaccharide, plus de 1 groupement OH par unité saccharidique est phosphaté.
Au sens de l'invention, on entend par « groupement sulfate », un groupement du type (-SO3H). Au sens de l'invention, on entend par « groupement phosphate », un groupement du type (-PO3H2).
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'un des polysaccharides défini précédemment pour la mise en œuvre d'une méthode de traitement des maladies rétrovirales.
Au sens de l'invention, les maladies rétrovirales sont choisies de préférence parmi celles causées par les lentivirus et les oncovirus, plus particulièrement par les VIH, et par les souches de ces retrovirus résistantes aux agents anti-rétroviraux inhibiteurs de la RT déjà connus. Dans le cas des lentivirus et en particulier des VIH de type I et II, le médicament obtenu par utilisation conformément à l'invention d'un polysaccharide de formule (I) permet de traiter le syndrome de l'immunodéficience acquise chez l'homme. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, une maladie rétrovirale au sens de l'invention est le syndrome d'immunodéficience acquise ou SIDA chez l'homme.
Les polysaccharides de formule (I) tels qu'utilisés selon l'invention sont également particulièrement actifs contre les oncovirus, en particulier contre les virus HTLV de type I et II. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'utilisation conformément à l'invention d'un polysaccharide de formule (I) permet de traiter les cancers associés à ces retrovirus.
Dans un mode réalisation particulier de l'invention, le polysaccharide de formule (I) est une laminarine sulfatée ayant un degré de polymérisation de 11 à 28.
Préférentiellement, le polysaccharide de formule (I) est une laminarine de degré de sulfatation égal à environ 2,3, appelée « laminarine PS3 ».
Par « degré de polymérisation » on entend, au sens de l'invention, le nombre d'unités monosaccharidiques liées entre elles par des liaisons de type β(1-»3) composant la chaîne linéaire principale. Un degré de polymérisation de 11 à 28 signifie un polysaccharide composé de 11 à 28 unités saccharidiques, notamment glucose, liées entre elles par des liaisons de type β(1-»3). Ce degré de polymérisation ne tient pas compte des unités glucoses liées en β(1→6) à la chaîne principale du polysaccharide. Ainsi, le degré de polymérisation est égal à n+2 lorsque X et Y représentent simultanément OH, à n+3 si seulement l'un de X ou Y représente OH, et à n+4 ni X ni Y ne représente OH.
De manière étonnante et surprenante, la Demanderesse a pu démontrer que la laminarine sulfatée, ayant un degré de sulfatation supérieur à 2, de préférence de 2,2 à 2,4, et un degré de polymérisation de 11 à 28, était particulièrement efficace pour le traitement des maladies rétrovirales, de préférence choisies parmi celles causées par les lentivirus et les oncovirus, plus particulièrement par les VIH, et par les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents anti-rétroviraux inhibiteurs de la RT déjà connus, en particulier I1AZT. Cette laminarine sulfatée présentait en outre une faible activité anticoagulante, confirmant ainsi son grand intérêt pour la fabrication d'un médicament destiné à une administration humaine ou animale.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation d'un polysaccharide, obtenu à partir de la laminarine sulfatée de degré de sulfatation supérieur à 2 et de préférence de 2,2 à 2,4, de degré de polymérisation de 11 à 28, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies rétrovirales, de préférence choisies parmi celles causées par les lentivirus et les oncovirus, plus particulièrement par les VIH, et par les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents anti- rétroviraux inhibiteurs de la RT déjà connus. Dans un autre mode réalisation particulier de l'invention, le polysaccharide de formule (I) est une laminarine phosphatée ayant un degré de polymérisation de 11 à 28. Le phosphate de laminarine selon l'invention, possède un degré de phosphatation supérieur à 1 et de préférence de 1 ,5 à 2,5 et est particulièrement adapté au traitement des maladies rétrovirales, de préférence choisies parmi celles causées par les lentivirus et les oncovirus, plus particulièrement par les VIH, et par les souches de ces retrovirus résistantes aux agents anti-rétroviraux inhibiteurs de la RT déjà connus.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation d'un polysaccharide obtenu à partir du phosphate de laminarine de degré de phosphatation supérieur à 1 et de préférence de 1 ,5 à 2,5, de degré de polymérisation de 11 à 28, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies rétrovirales, de préférence choisies parmi celles causées par les lentivirus et les oncovirus, plus particulièrement par les VIH, et par les souches de ces retrovirus résistantes aux agents anti- rétroviraux inhibiteurs de la RT déjà connus.
Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne l'utilisation d'une laminarine sulfatée, caractérisée en ce qu'elle possède une degré de sulfatation supérieur à 2, de préférence de 2,2 à 2,4, et un degré de polymérisation de 11 à 28, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies rétrovirales.
Un autre mode de réalisation particulier de l'invention concerne l'utilisation d'une laminarine sulfatée, caractérisée en ce qu'elle possède une degré de sulfatation supérieur à 2, de préférence de 2,2 à 2,4, et un degré de polymérisation de 11 à 28, pour la mise en œuvre d'une méthode de traitement des maladies rétrovirales.
Un autre mode de réalisation particulier de l'invention concerne l'utilisation d'une laminarine phosphatée, caractérisée en ce qu'elle possède une degré de phosphatation supérieur à 1 , de préférence de 1 ,5 à 2,5, et un degré de polymérisation de 11 à 28, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies rétrovirales.
Encore un mode de réalisation particulier de l'invention concerne l'utilisation d'une laminarine phosphatée, caractérisée en ce qu'elle possède une degré de phosphatation supérieur à 1 , de préférence de 1 ,5 à 2,5, et un degré de polymérisation de 11 à 28, pour la mise en œuvre d'une méthode de traitement des maladies rétrovirales. II est connu d'administrer aux patients atteints notamment du SIDA, dans le cadre des traitements désignés par le terme de "multithérapies" non seulement deux, voire trois agents antirétroviraux, mais également d'autres agents pharmacologiques destinés à lutter contre les pathogénies associées. La prise de ces nombreux médicaments représente une servitude considérable pour les patients. Pour remédier à cet inconvénient et selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention a également pour objet un produit de combinaison comprenant une quantité efficace
- d'un polysaccharide de formule (I) dans laquelle R1 représente soit un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, soit un glucose sulfaté ou phosphaté lié, de préférence, par une liaison de type β(1-»6) à la structure saccharidique, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, X et Y représentent, chacun indépendamment, un groupement OH, un glucose, un glucose sulfaté ou phosphaté, un mannitol, ou un mannitol sulfaté ou phosphaté, n représente un nombre entier de 11 à 30, préférentiellement de 20 à 30, plus préférentiellement de 25 à 30, ledit polysaccharide ayant un degré de sulfatation supérieur à 2, préférentiellement de 2,2 à 2,4, ou un degré de phosphatation supérieur à 1 , préférentiellement de 1 ,5 à 2,5,
- d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant :
• les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INRT), dont notamment I1AZT, le ddl, le ddC, le d4T, le 3TC et le ABC,
• les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva,
• les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra, • les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon),
• les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement - d'au moins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents anti-hyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents pour traitements dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. En effet, l'homme du métier est à même de définir l'administration la mieux adaptée permettant d'obtenir le meilleur indice thérapeutique pour le patient. Chaque substance active de la multithérapie peut être administrée de manière séquentielle, voie par des routes différentes, ou alors en même temps. Par « quantité efficace », au sens de l'invention, on entend une quantité de substance active suffisante pour obtenir un effet thérapeutique sur un patient.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une quantité efficace - d'un polysaccharide de formule (I) tel que décrit précédemment,
- d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant :
• les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INRT), dont notamment I1AZT, le ddl, le ddC, le d4T, le 3TC et le ABC,
• les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva,
• les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra, • les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon),
• les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement - d'au moins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents anti-hyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents pour traitements dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies rétrovirales, de préférence causées par les lentivirus et les oncovirus, plus préférentiellement par le VIH, notamment par les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus.
Un autre objet de la présente invention est l'utilisation d'une quantité efficace
- d'un polysaccharide de formule (I) tel que décrit précédemment,
- d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant :
• les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INRT), dont notamment l'AZT, le ddl, le ddC, le d4T, le
3TC et le ABC,
• les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva, • les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra,
• les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon),
• les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement - d'au moins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents anti-hyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents pour traitements dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques, pour la mise en œuvre d'un méthode de traitement des maladies rétrovirales, de préférence causées par les lentivirus et les oncovirus, plus préférentiellement par le VIH, notamment par les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus.
La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement d'une maladie rétrovirale, de préférence causée par les lentivirus et les oncovirus, plus préférentiellement par le VIH, notamment par les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus, comprenant l'administration, chez un patient atteint par ladite maladie rétrovirale, d'une quantité efficace d'un médicament comprenant à titre d'agent actif au moins un polysaccharide de formule (I) tel que décrit précédemment ; ou d'un produit de combinaison tel que décrit précédemment .
Au sens de la présente invention, par « patient » on entend tout animal à sang chaud, particulièrement les mammifères et notamment les êtres humains.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement telle que définie précédemment, dans laquelle le polysaccharide de formule (I) est une laminarine sulfatée, caractérisée en ce qu'elle possède une degré de sulfatation supérieur à 2, de préférence de 2,2 à 2,4, et un degré de polymérisation de 11 à 28.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement telle que définie précédemment, dans laquelle le polysaccharide de formule (I) est une laminarine phosphatée, caractérisée en ce qu'elle possède une degré de phosphatation supérieur à 1 , de préférence de 1 ,5 à 2,5, et un degré de polymérisation de 11 à 28. Pour préparer un polysaccharide de formule (I) sulfaté au sens de l'invention, on effectue une étape de sulfatation en suivant de préférence le protocole décrit par Alban S, Kraus J, et Franz G dans « Synthesis of laminarin sulfates with anticoagulant activity », Artzneim.Forsch./drug Res (1992) 42 ; 1005-1008. Ce procédé a été perfectionné dans la thèse de Susanne Alban, soutenue en 1993 à l'Université de Regensburg et portant le titre « Synthèse und physiologische Testung neuartiger Heparinoide ». Ces procédés sont adaptables à la sulfatation des polysaccharides de formule (I) de l'invention et permettent d'obtenir un polysaccharide sulfaté hautement substitué, sans dégradation, et avec une bonne reproductibilité, d'une manière simple et peu onéreuse.
Pour aboutir à une sulfatation efficace du polysaccharide sans dégradation des chaînes polysaccharidiques, la réaction de sulfatation est avantageusement effectuée sous des conditions correspondant à une absence absolue d'eau. Avant la sulfatation, le polysaccharide est donc de préférence séché, par exemple sur pentoxide de phosphore (P2O5) et ensuite dissout dans du diméthylformamide ou DMF. De par ses effets alternatifs sur le polysaccharide, le DMF a une influence activante par la substitution. En effet, l'association du DMF polaire avec les groupes OH conduit à la coupure des liaisons hydrogène intra et inter moléculaires et à la désintégration des structures supérieures.
Pour mettre en œuvre la réaction de sulfatation, on peut avoir recours avantageusement au complexe SO3-pyridine.
Par suite de la coordination de l'accepteur d'électrons SO3 avec le donneur d'électrons pyridine, la réactivité difficilement contrôlable du SO3 qui se traduit par des réactions fortement exothermiques entraînant des dégradations, se trouve réduite. Le complexe Sθ3-pyridine présente par rapport à d'autres complexes l'avantage d'être ni trop réactif ni trop stable c'est-à-dire trop lent du point de vue réaction. En raison du fait que le degré de sulfatation obtenu est proportionnel à l'excès molaire en réactif de sulfatation et étant donné que l'on cherche à obtenir un degré de substitution supérieur à 2, on met avantageusement en œuvre une concentration de 6 moles de SO3- pyridine par mole de glucose.
Avantageusement, pour garantir l'absence d'eau, on peut travailler sous atmosphère d'argon.
De préférence, on ajoute dès le début de la réaction de la pyridine au réactif de sulfatation et ce, en quantité équimolaire, en vue de capter directement l'acide sulfurique qui pourrait se former par réaction du complexe Sθ3-pyridine avec l'eau. La concentration du polysaccharide que celle du réactif de sulfatation doivent être de préférence aussi élevées que possible, la solubilité du polysaccharide et du réactif de sulfatation limitant le degré de sulfatation final. Pour éviter au début de la réaction un refroidissement du mélange qui pourrait entraîner des problèmes de solubilité et pour obtenir une substitution la plus régulière possible, la solution du complexe Sθ3-pyridine dans le DMF pourrait ne pas être ajoutée en une seule fois mais de manière continue pendant une durée de 4 heures.
La réaction de sulfatation peut être effectuée à une température de 20 à 6O0C, de préférence d'environ 4O0C. Des températures plus élevées entraînent une substitution plus efficace mais, également, une dégradation des chaînes.
Après l'addition du réactif de sulfatation, le mélange est de préférence agité pendant plusieurs heures autour de 6O0C. A cette température, il se produit une substitution supplémentaire sans dégradation des chaînes.
Le surnageant du mélange est alors avantageusement séparé par décantation. Le résidu est dissous, de préférence dans du NaOH, puis mélangé avec 10 fois son volume d'éthanol. Le précipité qui se produit à une température de 4-8°C pendant la nuit est isolé puis préférentiellement dissous dans de la soude diluée (solution de pH d'environ 9). La solution est dialysée pour enlever les sels et les molécules de bas poids moléculaire puis avantageusement amenée à un pH de 7,0 par addition de NaOH et ensuite lyophilisée. Le polysaccharide sulfaté résultant se présente sous forme de sel de sodium.
Le degré de sulfatation est préférentiellement déterminé par voie de titration conductimétrique de l'acide libre du polysaccharide sulfaté, ou par alternativement par chromatographie ionique après hydrolyse en utilisant un système du type HPLC. La première méthode présente l'avantage d'être également propre à des recherches relatives à la stabilité (la consommation de soude s'accroît lorsque des groupes sulfates sont éliminés) alors que la méthode HPLC nécessite moins de substance et peut être automatisée. A titre de contrôle, il est possible de déterminer la teneur en soufre par analyse élémentaire.
Il est de plus possible de contrôler l'homogénéité de la sulfatation et la répartition des groupes sulfate sur les différentes positions dans la molécule de glucose par une forme modifiée de l'analyse de méthylation suivie d'un examen GC-MS (à savoir Chromatographie Gaz, Spectrométrie de Masse).
Le degré de sulfatation obtenu en procédant comme indiqué ci- dessus est supérieur à 2, plus précisément de 2 à 2,5 et tout particulièrement de 2,2 à 2,4.
Suivant un mode de réalisation avantageux, le polysaccharide de formule (I), et, de préférence, la laminarine sulfatée, sont utilisés pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus destiné à une administration par voie générale et de préférence par les voies orale, rectale, pulmonaire topique (incluant les voies transdermique, buccale et sublinguale) et parentérale (incluant les voies sous-cutanées intramusculaire, intraveineuse, intra-dermique et intra-vitréale).
La dose quotidienne est généralement de 0,01 à 250 mg par kilo de poids du patient et préférentiellement de 0,10 à 100 mg, plus préférentiellement encore de 0,5 à 30 mg, et tout particulièrement de 1 ,0 à 20 mg.
Ces doses quotidiennes s'appliquent notamment dans le cas du sulfate de laminarine ; pour les autres sels et esters selon la formule (I), les doses quotidiennes sont adaptées à chaque cas.
La dose quotidienne peut être administrée par dose unitaire en une, deux, trois, quatre, cinq ou six fois ou plus à différents moments de la journée.
Les doses unitaires peuvent comporter de 10 à 1000 mg, de 50 à 400 mg, et, préférentiellement, de 50 à 100 mg de substance active.
Les médicaments obtenus, conformément à l'invention, en utilisant au moins un des polysaccharides de formule (I), comportent les ingrédients de formulation classiques et éventuellement un ou plusieurs autres agents thérapeutiques. De plus, comme mentionné précédemment, le polysaccharide de l'invention peut être avantageusement combiné avec d'autres substances actives. Leur mode d'administration peut être simultané ou séquentiel. Elles peuvent également être administrées par différentes voies telles que décrites précédemment.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs suivants.
Exemple 1 : Préparation d'un sulfate de laminarine PS3 On a extrait la laminarine d'une matière première constituée par des algues brunes puis on a procédé à la sulfatation de la laminarine ainsi extraite, en suivant le protocole décrit dans le brevet FR 92 08387.
Une fois la laminarine extraite, on a effectuée une sulfatation en suivant le protocole décrit par Alban S, Kraus J, et Franz G dans Synthesis of laminarin sulfates with anticoagulant activity,
Artzneim.Forsch./drug Res (1992) 42 ; 1005-1008, perfectionné par la thèse de Susanne Alban, soutenue en 1993 à l'Université de Regensburg et portant le titre « Synthèse und physiologische Testung neuartiger Heparinoide ».
On a d'abord séché la laminarine sur du pentoxide de, phosphore (P2O5) puis on l'a dissoute dans du diméthylformamide ou DMF.
Ensuite, pour mettre en œuvre la réaction de sulfatation, on a eu recours au complexe Sθ3-pyridine sous atmosphère d'argon : on a ajouté en une seule fois mais de manière continue pendant une durée de 4 heures de la Sθ3-pyridine dans le DMF en quantité équimolaire. On a réalisé la réaction de sulfatation à une température de 400C. Après l'addition du réactif de sulfatation, on a continué à agiter le mélange pendant 6 heures à 6O0C.
On a ensuite séparé le surnageant du mélange par décantation, dissous le résidu dans 2,5 M de NaOH, puis on l'a mélangé avec 10 fois son volume d'éthanol à 99%. On a alors placé la solution obtenue à une température de 4-8°C pendant la nuit et on a obtenu un précipité que l'on a isolé puis dissous dans de la soude diluée (solution de pH d'environ 9). Ensuite on a dialyse la solution à l'aide d'une membrane Spectrapor à seuil de coupure 1000 D puis amené le pH à 7,0 par addition de NaOH. Enfin, on a lyophilisé la solution ainsi dialysée. On a obtenu un sulfate de laminarine se présentant sous forme de sel de sodium.
On a ensuite déterminé le degré de sulfatation par voie de titration conductimétrique de l'acide libre du polysaccharide sulfaté en utilisant de la soude 0,1 N. Le degré de sulfatation de la laminarine obtenu était de 2,3. Le degré de polymérisation du sulfate de laminarine ainsi obtenu était de 23 à 28.
On a nommé ce polysacharide sulfaté « laminarine PS3 », ou encore « PS3 ».
Exemple 2 : Activité anti-rétrovirale de la laminarine sulfatée PS3 On a déterminé l'action de la laminarine sulfatée PS3 sur le cycle de réplication des rétrovirus par inhibition de la RT, cette inhibition de la RT ayant été appréciée
- soit par l'observation, en fonction de la quantité de polysaccharides sulfatés mis en œuvre et du moment de cette mise en œuvre qui peut avoir lieu avant, pendant ou après l'infection ou encore en permanence, de la diminution du nombre de syncitia, apparaissant dans une culture de cellules MT4 suite à l'infection par un rétrovirus VIH, (exemple 2A) - soit par appréciation en fonction de la quantité de polysaccharides sulfatés mis en œuvre et du moment de cette mise en œuvre qui peut avoir lieu avant, pendant ou après l'infection ou encore en permanence tout au long de l'infection, de l'inhibition de la RT qui se traduit par une diminution mesurable de l'activité de cette dernière, et qui reflète le ralentissement de la réplication du virus infectant dans une culture de cellules CEM infectées par un rétrovirus VIH, (exemple 2B) étant entendu qu'à titre de comparaison on a effectué les mêmes expériences en utilisant comme produits de comparaison d'une part le sulfate de dextran et d'autre part la 3'-azidothymidine ou AZT. Les susdites cellules MT4 et CEM sont des lignées lymphoblastiques humaines transformées par HTLV-1.
Les rétrovirus que l'on a mis en œuvre sont constitués par
- les souches de laboratoire BRU (clade B) et NDK (clade D),
- le virus RTMC (clade B) connu comme étant résistant à l'agent antiviral AZT,
- les isolats primaires RW92009 (clade A) et UG92029 (clade A), et
- un isolât (PIC CH, clade B) issu d'un patient résistant à plusieurs agents antiviraux connus comme le d4T et le Zérit.
Les souches RTMC, RW92009 et UG92029 ont été obtenues auprès du « AIDS Research and Référence Reagent Program, Division of AIDS, NIAID-NIH (USA) ». On a cultivé les cellules MT4 et CEM en milieu RPMI
(provenance Cambrex) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal
(provenance Cambrex), 1 % de Pénicilline-Streptomycine (provenance Life
Technologies), 2 mM de glutamine (provenance Invitrogen), 2 μg/ml de polybrène (provenance Sigma).
On a utilisé de la laminarine sulfatée PS3 sous forme lyophilisée obtenue par le procédé tel que décrit dans l'exemple 1 , que l'on a dissous dans du PBS à la concentration de 12 mg/ml pour fournir une solution mère. D'autre part, on a dissous le sulfate de dextran (provenance
Sigma, D4911 ) dans du PBS à la concentration de 41 ,6 mg/ml (solution mère).
On a également dilué dans du PBS1 aux concentrations indiquées plus loin, de l'AZT (provenance Sigma A2169), largement connu comme étant un inhibiteur de la RT.
Exemple 2A : Mesure du nombre de syncitia
On a évalué l'action de la laminarine PS3 et des produits de comparaison sur le nombre de syncitia dans une culture de cellules MT4 infectée par l'un des rétrovirus indiqués ci-dessus, en procédant comme suit.
On a tout d'abord préincubé les cellules MT4 (3.105 cellules dans 50 μl) pendant 1 heure à 37CC en atmosphère humide à 5% de CO2, avec les dilutions successives de laminarine sulfatée PS3 (50 μl) et des produits de comparaison, en microplaque de 96 puits à fond en « V ». Chaque concentration de laminarine sulfatée PS3 et de produit de comparaison est testée en double.
On a réalisé ensuite l'infection des cellules en ajoutant dans chaque puits, sauf ceux correspondant aux témoins cellules, 50 μl de dilution virale préalablement titrée. Après une nouvelle heure d'incubation, on a centrifugé la plaque et on a éliminé les surnageants contenant le virus résiduel.
On a réalisé deux rinçages, puis on a transféré les culots cellulaires en plaque de 24 puits ou l'on a cultivé les cellules à la concentration de 3.105 cellules/ml en présence de laminarine PS3 ou du produit de comparaison.
Après 3 jours de culture, on a dilué les cellules au demi et on a observé les syncytia au microscope inversé du jour 3 au jour 7 après remise en suspension. Comme déjà précisé précédemment, on a réalisé quatre séries d'expériences visant à préciser l'effet de la laminarine sulfatée PS3 en fonction du moment auquel il est mis en œuvre dans la culture de cellules, c'est-à-dire
- avant l'infection - pendant l'infection
- après l'infection et
- tout au long de l'infection.
Dans le premier cas, on a amené la laminarine sulfatée PS3 et les produits de comparaison en contact avec les cellules pendant une heure, puis on a lavé les cellules deux fois pour éliminer les produits mis en œuvre et enfin on a procédé à l'infection de la culture des cellules MT4.
Dans le deuxième cas, on a mis en contact la laminarine sulfatée PS3 et les produits de comparaison au moment auquel on procède à l'infection des cellules. On a maintenu la culture ainsi traitée en l'état pendant une heure, puis on a procédé à deux lavages, ce qui a conduit à l'élimination de la laminarine sulfatée PS3 et des produits de comparaison ainsi que des virus qui n'ont pas pénétré dans les cellules.
Dans le troisième cas, on a préincubé la culture de cellules MT4 pendant une heure à 370C, puis on a procédé à l'infection des cellules, et on a soumis l'ensemble à une incubation d'une heure à 370C puis à une centrifugation avec élimination du surnageant contenant les virus n'ayant pas pénétré dans les cellules. On a ensuite rincé le culot cellulaire deux fois puis on l'a transféré sur plaque de 24 puits, puis cultivé à la concentration de 3.105 cellules/ml simultanément à l'introduction dans les mêmes puits de la laminarine sulfatée PS3 et des produits de comparaison aux concentrations choisies.
Dans le quatrième cas, on a commencé par mettre en contact la laminarine sulfatée PS3 et les produits de comparaison avec les cellules pendant une heure à 37°C, puis on a procédé à l'infection de la culture pendant une heure à 37°C. Ensuite on a procédé à deux lavages, ce qui conduit à l'élimination des virus qui n'ont pas pénétré dans les cellules. On a alors transféré les culots cellulaires dans des plaques de 24 puits, à raison de 3.105 cellules/ml par puits en présence de la laminarine sulfatée PS3 et des produits de comparaison aux concentrations choisies.
On a effectué les lavages et rinçages avec du milieu de culture RPMI sans sérum de veau fœtal.
Dans le cas de chacun des quatre types d'expériences qui viennent d'être décrites et comme déjà indiqué précédemment, on a dilué les cellules au demi après trois jours de culture puis on a observé les syncytia au microscope inversé du jour J3 au jour J7. Le résultat de ces observations est illustré par les figures 1 à 3, étant entendu que
- la figure 1 montre une culture de cellules Ci non infectée : les cellules Ci restent distinctes les unes des autres ; il n'y a pas de syncytia ;
- la figure 2 montre une culture de cellules infectées dans laquelle certaines cellules Ci s'agglutinent en syncytia repérés par S, et
- la figure 3 montre sous un agrandissement plus important une culture de cellules Ci infectées, certaines des cellules Ci étant agglutinées en syncytia repérés par S.
Dans les expériences décrites plus en détail ci-après, l'absence de syncytia est notée par un signe - et les signes (+), +, ++, ++T indiquent une quantité croissante de syncitia dans chaque puits. L'indication T traduit la mort des cellules.
Dans une première série d'expériences, on a utilisé l'AZT comme produit de comparaison à la concentration de 0,01 μm, et on a mis en œuvre la laminarine sulfatée PS3 à deux concentrations, respectivement de 5 et de 10μg/ml.
On a utilisé le virus BRU (clade B) pour l'infection des cellules MT4 à la dilution virale de 105 qui correspond à la quantité de particules virales permettant d'infecter 80% des cultures MT4 (Tissue Culture Infections Dose 80% TCID8o%). Les résultats observés du jour J3 au jour J4 dans les quatre types d'expériences définis précédemment sont réunis dans le tableau A.
TABLEAU A
Les résultats réunis dans le Tableau A permettent de faire les constatations exposées ci-après.
Après 6 jours à compter de l'infection par la souche virale BRU, les cultures de cellules MT4 ne forment pas de syncitia lorsqu'elles sont traitées en continu, dès leur mise en culture (avant, pendant et après l'infection), avec des concentrations de 10 μg/ml de PS3.
Les cultures de cellules MT4 ne forment pas de syncitia lorsqu'elles sont traitées avec des concentrations de 10 et 5 μg/ml de PS3 après l'infection par la souche virale BRU. L'effet est observé dès le 3eme jour à compter de l'infection virale.
Il est important de noter qu'aucun effet d'inhibition n'est observé lorsque les cellules MT4 sont traitées avant ou pendant l'infection par la souche virale.
Il résulte également du tableau A que le PS3 est aussi efficace que I1AZT.
Au vu de ces résultats, il apparaît que dans le cas du PS3 il s'agit d'un effet spécifique sur la réplication du virus et non d'un effet aspécifique, dû à la nature anionique du PS3, sur l'entrée du virus dans la cellule (il n'y a aucune action lorsque le PS3 est mis en contact uniquement avant infection).
Dans une deuxième série d'expériences, on a utilisé comme produits de comparaison l'ÂZT et le sulfate de dextran mis en œuvre respectivement aux concentrations de 0,4 μM et de 10 μg/ml, cette dernière concentration étant également celle du PS3.
On a utilisé le virus NDK (clade D) mis en œuvre à la dilution virale de 2,5.10"5 qui correspond à la quantité de particules virales permettant d'infecter 80% des cultures MT4 (Tissue Culture Infections Dose 80% TCID80%). Les résultats observés du jour J3 au jour J6 sont réunis dans le tableau B. TABLEAU B
Les constatations qu'il est possible de faire au vu des résultats réunis dans le Tableau B sont comme suit.
Au jour J5, après 5 jours à compter de l'infection par la souche virale NDK, les cultures de cellules MT4 ne forment pas de syncitia lorsqu'elles sont traitées en continu, pendant et après l'infection, avec une concentration de 10 μg/ml de PS3.
Cependant, aucun effet d'inhibition n'est observé lorsque les cellules MT4 sont traitées uniquement avant l'infection.
Le sulfate de dextran a, au contraire, un effet optimal lorsque les cellules sont traitées avant l'infection virale (2 puits sur 2 inhibés).
Il apparaît par ailleurs, et comme dans la série d'expériences illustrées par le Tableau A, que l'activité du PS3 est comparable à celle de I1AZT.
Les conclusions générales exposées au vu des résultats réunis dans le Tableau A s'appliquent ici.
Exemple 2B : Mesure de l'inhibition de l'activité de la RT
Pour évaluer l'action de la laminarine PS3 et des produits de comparaison sur la réplication du virus infectant par mesure de l'activité RT dans une culture de cellules constituées cette fois-ci par des cellules CEM, on a procédé comme suit.
On a mis en évidence le nombre de virus présents dans la culture par la mesure de l'activité RT dans le surnageant de culture, la quantité détectée de l'activité de RT étant proportionnelle au nombre de virus produits.
On a utilisé le même protocole expérimental que celui utilisé dans l'exemple 2A sur cellules MT4, à la différence près que l'on a incubé les cellules CEM avec la laminarine sulfatée PS3 ou le produit de comparaison puis on les a cultivées à la concentration de 0,5.106 cellules/ml. Tous les trois jours, on a compté les cellules et on a dilué les cultures en vue d'une remise en culture à 0,5. 106 cellules/ml ; on a réalisé le dosage de l'activité RT suivant un protocole comprenant:
- la libération dans les échantillons de culture des enzymes virales et notamment de la RT,
- la mise en réaction des échantillons avec un mélange réactionnel comportant de la 3H dTTp (thymidine) radioactive,
- l'isolement de l'ADN synthétisé par suite de la réplication du rétrovirus, - la mesure de la radioactivité de l'ADN synthétisé, cette radioactivité étant proportionnelle à la quantité de thymidine tritiée incorporée dans ledit ADN synthétisé, qui elle-même est proportionnelle à l'activité RT et donc au nombre de virus produits par réplication.
On a effectué la préparation des échantillons de culture en laboratoire protégé de type P3.
On a centrifugé le contenu de chaque puits (1 ml) pendant 5 mn à 1500 rpm (centrifugeuse Jouan GR 422), puis ultracentrifugé le surnageant de culture ainsi obtenu à 40C, 95000 rpm (ultracentrifugeuse Beckman TL100) pour obtenir le culot viral. On a ensuite repris le culot viral dans un tube à essais contenant 10 μl de tampon NTE additionné de 0,1% de triton qui libère les enzymes virales et en particulier la RT ; on a alors vortexé le tube, bouché au parafilm et maintenu 10 minutes à 40C puis on l'a congelé à -200C.
On a préparé le mélange réactionnel dont il est question précédemment en laboratoire de biochimie et ce mélange comprend pour un tube à essais de 5 mL
• Tampon de base 5X 10,0 μl
• Poly rA 1 OD/ml (ARN) 12,5 μl
• Oligo dT 1 OD/ml (Amorce) 12,5 μl • Eau distillée 2,5 μl
• 3H dTTp (thymidine) 1 mCi/ml 2,5 ul total 40,0 μl
La composition du susdit tampon de base 5X est la suivante
Concentration finale
- TRIS 1M pH 7,8 1 ,25 ml 0,25 M
- MgCI2 0,5 M 1 ,00 ml 0.10 M
- KCI 1 M 0,50 ml 0,10 M
- DTT IOO mM 0,50 ml 10 Mm
- H2O 1 ,75 ml
On a préparé autant de tubes à essais contenant ce mélange réactionnel que d'échantillons à tester. En laboratoire de biochimie, on a introduit ces échantillons de 10 μl préparés comme indiqué ci-dessus et qui contiennent le virus lysé par le triton 0,1% dans autant de tubes contenant chacun 40 μl de mélange réactionnel.
On a maintenu les tubes en question pendant une heure au bain-marie à 37°C avec une agitation toutes les 15 minutes. On a ensuite stoppé la réaction par introduction dans chaque tube de 1 ml de PPNa (pyrophosphate de sodium) 0,1 M préparé dans de l'acide trichloroacétique ou TCA à 5%.
Ensuite, on a précipité l'ADN synthétisé contenu dans le mélange à 4°C par ajout de 3,5 ml/tube d'acide trichloroacétique à 20%, puis on l'a filtré sur filtres de nitrocellulose Millipore 0,45 μ. Pour ce faire, on a versé le contenu des tubes dans les puits correspondants d'un collecteur d'échantillons (Millipore), puis on a rincé les tubes et les puits trois fois avec du TCA à 5%.
On a alors déshydraté les filtres à l'alcool à 70% avant d'être séchés au four à 800C pendant 20 minutes. Après refroidissement, on a déposé individuellement les filtres dans des fioles contenant un agent de scintillation ou scintillant vendu sous la marque Emulsifier Safe cat. N0 6013389 par la Société Perkin Elmer. On a ensuite effectué le comptage à l'aide d'un analyseur à scintillation liquide commercialisé sous la marque "PACKARD 2100T", dont les résultats sont exprimés en dpm/ml (désintégration par minute et par ml de surnageant).
La quantité de radioactivité que l'on a mesurée est proportionnelle à l'activité RT présente et, par conséquent, au nombre de virus produits par réplication.
Dans une première série d'expériences, on a testé la laminarine sulfatée PS3 aux concentrations de 5 et de 10 μg/ml et le produit de comparaison, d'AZT à la concentration 0,1 μM.
On a utilisé le virus RTMC (clade B) pour l'infection des cellules CEM qui a la particularité d'être résistant à l'AZT et qui a été mis en œuvre à la dilution de 5.10"4.
Les résultats enregistrés aux jours J3, J7 et J10 sont réunis dans le tableau C, ces résultats comprennent pour chaque expérience l'activité RT exprimée en dpm/ml et le nombre de cellules exprimé en 106 cell/ml.
TABLEAU C
Pour mieux faire apparaître l'action de la laminarine sulfatée PS3, on a transposé sur le graphique de la Fig. 4 et à partir des résultats réunis au Tableau C1 l'évolution de l'activité RT exprimée en dpm/ml en fonction du temps (jours J3 à J10) pour les cellules traitées respectivement aux deux concentrations de PS3 et avec I1AZT ainsi que
10 pour les cellules témoins (sans agent) la dilution virale étant 5.10"4.
L'examen du Tableau C et la Figure 4 permet de conclure qu'à la concentration de 10μg/ml, le PS3 permet d'obtenir une inhibition proche de 100 % du virus RMTC à la concentration virale de 5.10"4.
Il est ainsi démontré que le PS3 est efficace sur le virus RMTC
15 qui est résistant à l'AZT, inhibiteur connu de la RT. Exemple 3 : Etude de l'action de la PS3 sulfatée en fonction du moment de sa mise en œuyre.
On a étudié l'action de la laminarine sulfatée PS3 en fonction du moment de sa mise en œuvre (en continu, avant l'infection, pendant l'infection et après l'infection).
On a procédé comme indiqué précédemment en rapport avec les expériences réalisées sur cellules MT4, c'est-à-dire comme dans l'exemple 2A.
De nouveau, on a testé la PS3 aux concentrations de 5 et 10 μg/ml et I1AZT à la concentration de 0,1 μM, le virus mis en œuvre étant, cette fois, le virus NKD (clade D) à la dilution de 2,5.10"5.
Les résultats des mesures réalisées aux jours J3 et J7 sont réunis dans le Tableau D, s'agissant de l'activité RT exprimée en dpm/ml et du nombre de cellules exprimé en 106 cell/ml.
TABLEAU D
Sur la Figure 5, qui illustre le Tableau D, on a reporté sur un graphique l'activité RT exprimée en dpm/ml mesurée au jour 7 dans le cas de I1AZT et des deux concentrations de PS3 ainsi que dans le cas des cellules témoin n'ayant pas été traitées avec un agent antirétroviral, et cela pour les quatre expériences correspondant à l'administration de l'agent antirétroviral en continu, avant, pendant et après l'infection par le virus NDK à la dilution de 2,5.10"5.
A l'examen du Tableau D et de la Figure 5, il apparaît que le PS3 à la concentration de 10μg/ml n'a aucune action lorsqu'il est incubé avant l'infection, qu'il est le plus efficace quand il est présent tout au long de l'expérience et qu'il a une action lorsqu'il est mis en œuvre pendant et après l'infection.
Toujours à la concentration de 10 μg/ml, son activité supérieure par rapport à l'AZT apparaît clairement.
Exemple 4 : Action inhibitrice directe de la PS3
On a également procédé à un certain nombre d'expériences supplémentaires en vue d'étudier l'action inhibitrice directe du PS3 sur la RT des virus RW92009, UG92029P, PIC CH et NDK. A cet effet, on a mesuré l'activité RT des quatre souches de virus qui viennent d'être identifiées et mises en présence du PS3, ainsi que dans certains cas, du sulfate de dextran à titre de produit de comparaison.
Pour effectuer ces mesures, on a procédé de la manière décrite de façon détaillée dans ce qui précède (exemple 2).
On a reporté les résultats enregistrés à l'issue de ces mesures sur des graphiques qui sont montrés aux figures 6 à 9 ; sur ces graphiques, l'axe des ordonnées correspond au pourcentage d'inhibition de l'activité RT (cette activité est exprimée en dpm/ml) mesurée pour différentes concentrations en PS3 ou en sulfate de dextran qui sont indiquées sur l'axe des abscisses, ces concentrations étant exprimées en μg/ml.
Pour le virus RW92009, on a utilisé une concentration virale correspondant à une activité RT de 75 000 dpm ; les résultats obtenus apparaissent sur le graphique de la figure 6 à l'examen duquel on a constaté que le PS3 à la concentration de 1 ,5 μg/ml provoque une inhibition de la RT de 45%.
Pour le virus UG92029, on a utilisé une concentration virale correspondant à une activité RT de 220 000 dpm ; les résultats obtenus apparaissent sur le graphique de la figure 7 dont l'examen montre que le PS3 à la concentration de 2,5 μg/ml provoque une inhibition de la RT de 35%, alors que le sulfate de dextran n'inhibe la RT que de 6% à la même concentration.
On note par ailleurs qu'à la concentration de 3 μg/ml on obtient une inhibition de 74% pour le PS3 contre 8% pour le sulfate de dextran.
Pour le virus PIC CH, on a utilisé une concentration virale correspondant à une activité RT de 105 000 dpm ; les résultats obtenus apparaissent sur le graphique de la figure 8 ; à l'examen de ce graphique, on constate que le PS3 à la concentration de 0,6 μg/ml provoque une inhibition de la RT de 46% , alors que le sulfate de dextran ne provoque aucune inhibition à la même concentration ; à la concentration de 0,8 μg/ml, on obtient une inhibition de 65% dans le cas du PS3, alors que le sulfate de dextran ne provoque toujours aucune inhibition.
Pour le virus NDK, on a utilisé une concentration virale correspondant à une activité RT de 81 000 dpm ; les résultats obtenus apparaissent sur le graphique de la figure 9 dont l'examen montre qu'à la concentration de 0,6 μg/ml, le PS3 provoque une inhibition de la RT de 43% contre seulement 11 % dans le cas du sulfate de dextran ; à la concentration de 0,8 μg/ml on obtient respectivement une inhibition de 57% dans le cas du PS3 contre 18% dans le cas du sulfate de dextran.
Les résultats des expériences illustrées par les figures 6 à 9 permettent de confirmer que le PS3 est un inhibiteur de la RT sur diverses souches de VIH, ce qui traduit l'inhibition précoce du cycle de réplication de ces souches.
Le PS3 est particulièrement efficace sur la RT du virus PIC CH (clade B) qui est résistant à plusieurs agents antiviraux, ainsi que sur le virus NDK (clade D).
Exemple 5 : Mesure de l'activité anti-coaqulatante de la laminarine sulfatée PS3
On a montré que l'activité anticoagulante de la laminarine sulfatée PS3 est suffisamment faible comparée à celle de l'héparine pour ne pas constituer un inconvénient dans le cadre de l'utilisation conforme à l'invention et qu'elle n'est pas cytotoxique aux concentrations les plus élevées susceptibles d'être mises en œuvre.
Pour cela, on a déterminé l'activité anticoagulante du sulfate de laminarine PS3 obtenu à l'exemple 1 en fonction de sa concentration en comparaison avec celle de l'héparine dans les tests de coagulations classiques APTT ou « Aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit », de la durée de prothrombine, du test dit « HEPTEST » et de la durée de thrombine. L'APTT reflète une interaction avec le système intrinsèque de la coagulation alors que la durée de prothrombine reflète une interaction avec la coagulation extrinsèque ; le test dit « HEPTEST » est le test classique pour la mesure de l'activité inhibitrice de l'héparine à l'égard du facteur Xa et la durée de thrombine correspond à la dernière étape de la coagulation à savoir la formation de fibrines induites par la thrombine. On a pu constater qu'au contraire de celle de l'héparine, l'activité du sulfate de laminarine PS3 dans le test dit « HEPTEST » est plus de 20 fois plus faible. De même, en rapport avec la durée de prothrombine le sulfate de laminarine PS3 n'a fait preuve d'aucun effet prononcé anticoagulant, comme dans le cas de l'héparine. L'activité spécifique (ILJ/mg) dans l'APTT représente 30% de l'activité de l'héparine et dans le cas de la durée de thrombine 60%. Pour empêcher totalement la coagulation, on a dû appliquer dans le cas de l'APTT une concentration 4 fois plus grande et dans le cas de la durée de thrombine une concentration 20 fois plus élevée.
Dans les tests spécifiques anti-facteur Xa et anti-thrombine en utilisant des substrats chromogènes on a constaté que le sulfate de laminarine PS3 au contraire de l'héparine ne présente ni une activité significative anti-facteur Xa dépendant de l'anti-thrombine ni une activité anti-thrombine. L'effet dans le cas de la durée de thrombine peut être considéré comme étant dû à une inhibition de thrombine dépendant du cofacteur II héparine. En raison d'une part de l'activité spécifique plus faible, d'autre part du profil dépendant de la concentration et d'autre part encore d'autres recherches relatives au mécanisme d'action, il est possible de considérer que dans le cas du sulfate de laminarine PS3, le risque de saignement est sensiblement plus faible que dans le cas de l'héparine. II s'ensuit que les propriétés inhibitrices de la RT du sulfate de laminarine PS3 pourront être avantageusement mises à profit sans crainte d'effets secondaires indésirables sur la coagulation.
Exemple 6 : Mesure de la cvtotoxicté in vitro de la laminarine sulfatée PS3
On a déterminé la cytotoxicité in vitro de la laminarine sulfatée PS3 obtenue à l'exemple 1 simultanément à celle d'un produit de comparaison.
Pour ce faire, on a cultivé des cellules CEM en plaque de 24 puits dans 1 ml de RPMI supplémenté par 10 % de sérum et veau fœtal, 1 % de Pénicilline-Streptomycine, 2mM de glutamine, 2 μg/ml de polybrène et différentes concentrations de laminarine sulfatée PS3 et du produit de comparaison constitué par le sulfate de dextran.
On a testé quatre concentrations différentes de laminarine sulfatée PS3: 125 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml et 1000 μg/ml. La plus faible de ces concentrations est déjà très supérieure à la concentration de 10 μg/ml dont l'efficacité a été montrée par les expériences qui précèdent.
Tous les tests ont été réalisés en double.
On a compté les cellules tous les jours et on a comparé l'augmentation de leur nombre à celle d'une culture témoin constituée par des cellules CEM cultivées en l'absence de laminarine sulfatée PS3 ou de sulfate de dextran (Oμg/ml).
Dans le Tableau E, on a réuni les résultats enregistrés aux premier, deuxième et troisième jours de l'expérience, c'est-à-dire le nombre de cellules dénombrées dans chaque culture.
A la lumière de ces résultats réunis au Tableau E, il apparaît que le PS3 ne présente aucune cytotoxicité jusqu'à de très fortes concentrations, en l'occurrence 1 mg/ml.
TABLEAU E
Exemple 7 : Mesure de la cvtotoxicité in vivo de la laminarine sulfatée PS3
On a recherché une éventuelle toxicité in vivo de la laminarine sulfatée PS3 utilisée conformément à l'invention. On a réalisé cette étude sur des lapins blancs de race New Zealand et sur des rats de race Sprague Dawley.
On a soumis les lapins blancs d'une part au test d'irritation oculaire et d'autre part au test d'irritation cutanée primaire. L'issue du premier de ces tests a permis de conclure à une action légèrement irritante et dans le deuxième à une action non irritante.
On a ensuite soumis les rats d'une part à une étude de détermination de la toxicité dermique aigϋe et d'autre part à une étude de détermination de la toxicité orale aigϋe.
Dans le premier cas, la dose létale dermique 50 est supérieure à 2 g/kg de poids du corps ce qui permet d'affirmer que le produit n'est pas toxique.
Dans le deuxième cas, la toxicité aiguë par voie orale peut être considérée comme supérieure à 2 g/kg de poids du corps ce qui permet, à nouveau, de classer le produit comme non toxique.
Les expériences qui ont permis d'aboutir à ces conclusions ont été réalisées sous la direction du Docteur R. SHRIVASTA VA au Service de Toxicologie de l'établissement dénommé
Elevage Scientifique des Dombes (ESD)
ROMANS 01400 CHATILLON SUR CHALARONNE
en respectant les lignes directrices de l'OCDE n° 404 et 405 du 24 février 1987 pour autant qu'il s'agit des études effectuées sur les lapins blancs et les lignes directrices de l'OCDE n° 401 est 402 (1987) ainsi que la directive CEE B-1 92/69 (1992) pour autant qu'il s'agit des études effectuées sur les rats Sprague Dawley.
Exemple 8 : Composition d'une crème à base de laminarine sulfatée PS3 On a réalisé une crème à base de laminarine sulfatée PS3 présentant la composition suivante :
Eau déminéralisée 69,7%
Glycérine 5,0%
Sulfate de laminarine PS3 1 ,0%
PEG 100 stéarate 4,0%
Alcool cétéarylique 2,0%
Conservateur 1 ,0%
PEG 40 stéarate 3,0%
Acétate de vitamine E 0,5%
C - 12-15 alkyl benzoate 6,5%
Caprylic/capric triglycérides 5,5%
NaOH 0,1 N 1 ,8%
100%
II est possible de prévoir 2 à 5 applications par jour.
Exemple 9 : Composition d'une solution pour aérosol à base de laminarine sulfatée PS3
On a réalisé une solution pour aérosol à base de laminarine sulfatée PS3 présentant la composition suivante :
Sulfate de laminarine PS3 2,5%
Chlorure de sodium 9,0% Eau déminéralisée Pharmacopée Européenne 88,5% II est possible d'administrer par jour une quantité d'aérosol correspondant à une quantité de 1000 à 10 000 μg de substance active.
Exemple 10 : Composition d'un suppositoire à base d'un sulfate de 3 1-3 qlucan
On a réalisé un suppositoire à base de sulfate d'un β 1-3 glucan présentant la composition suivante :
Sel de potassium de sulfate de β 1-3 glucan
(DP=22-24, Degré de sulfatation de 2,4) 5,0% Glycérines hémisynthétiques solides 95,0%
II est conseillé d'en administrer 1 ou 2 par jour.
Exemple 11 : Composition d'une solution injectable à base de sulfate de laminaritol On a réalisé une solution injectable à base de sulfate de laminaritol présentant la composition suivante :
Sel de sodium de sulfate de laminaritol
(DP20 et degré de sulfatation de 2,4) 5,0%
Bicarbonate de sodium 3,0% Eau ppi 92,0%
Sur une durée de 24 heures il est possible d'administrer de 1000 à 3000 ml de la solution injectable.
Exemple 12 : Composition d'une solution vaginale à base d'un sulfate de β 1-3 glucan
On a réalisé une solution vaginale à base de sulfate de β 1-3 glucan présentant la composition suivante :
Sel de sodium de sulfate de β 1-3 glucan
(DP22 et degré de sulfatation de 2,4) 0,1 % Chlorure de sodium 9,0%
Alcool éthylique à 95° 5,0% Arôme rosé 0,2%
Eau purifiée 84,7%
Conservateurs (chlorure de benzalkonium) 0,2%
Edétate de sodium 0,3% Polysorbate 20 0,5%
100% II est possible de faire une ou deux applications par jour.
Au vu de l'ensemble des résultats expérimentaux décrits dans ce qui précède, il est possible de conclure que les polysaccharides de formule (I) et tout particulièrement la laminarine sulfatée présentent une activité anti-rétrovirale importante, en particulier sur le cycle de réplication du VIH.
Le moment de mise en œuvre auquel la laminarine sulfatée PS3 est efficace démontre une action spécifique sur les événements précoces du cycle de réplication du virus.
Aucune toxicité sur les cellules n'a été constatée aux doses inhibitrices testées et même à 1 mg/ml.
De plus, l'absence de toxicité du sulfate de laminarine, même à 1 mg/ml sur les cellules CEM témoigne d'un indice thérapeutique supérieur à 200.
L'activité anti-rétrovirale des polysaccharides de formule (I), notamment celle de la laminarine sulfatée, est non seulement meilleure que celle des produits précédemment utilisés, mais, de plus, elle s'exerce même sur des virus résistant à des inhibiteurs connus de la RT, s' agissant du virus PIC CH qui est résistant au d4T et au Zérit et du virus RTMC qui est résistant à l'AZT. Les polysaccharides de formule (I), et tout particulièrement la laminarine sulfatée, inhibent la RT des virus isolés, ce qui semble écarter l'hypothèse d'un mécanisme d'action lié au simple caractère anionique des polysaccharides sulfatés de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un polysaccharide de formule (I)
(I) dans laquelle
- R1 représente soit un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, soit un glucose sulfaté ou phosphaté lié, de préférence, par une liaison de type β(1— >6) à la structure saccharidique,
- R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, R1 et R2 ne pouvant pas représenter simultanément un atome d'hydrogène,
- X et Y représentent, chacun indépendamment, un groupement OH, un glucose, un glucose sulfaté ou phosphaté, un mannitol, ou un mannitol sulfaté ou phosphaté,
- n représente un nombre entier de 11 à 30, préférentiellement de 20 à 30, plus préférentiellement de 25 à 30, ledit polysaccharide ayant un degré de sulfatation supérieur à 2, préférentiellement de 2,2 à 2,4, ou un degré de phosphatation supérieur à 1 , préférentiellement de 1 ,5 à 2,5, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies rétrovirales.
2. Utilisation d'un polysaccharide de formule (I)
(I) dans laquelle
- R1 représente soit un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, soit un glucose sulfaté ou phosphaté lié, de préférence, par une liaison de type /?(1->6) à la structure saccharidique,
- R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, R1 et R2 ne pouvant pas représenter simultanément un atome d'hydrogène,
- X et Y représentent, chacun indépendamment, un groupement OH, un glucose, un glucose sulfaté ou phosphaté, un mannitol, ou un mannitol sulfaté ou phosphaté,
- n représente un nombre entier de 11 à 30, préférentiellement de 20 à 30, plus préférentiellement de 25 à 30, ledit polysaccharide ayant un degré de sulfatation supérieur à 2, préférentiellement de 2,2 à 2,4, ou un degré de phosphatation supérieur à 1 , préférentiellement de 1 ,5 à 2,5, pour la mise en œuvre d'une méthode de traitement des maladies rétrovirales.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que le polysaccharide de formule (I) est une laminarine sulfatée ayant un degré de polymérisation de 11 à 28.
4. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que le polysaccharide de formule (I) est une laminarine phosphatée ayant un degré de polymérisation de 11 à 28.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les maladies rétrovirales sont préférentiellement choisies parmi celles causées par les lentivirus et les oncovirus, plus particulièrement par les VIH, et par les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la maladie rétrovirale est le syndrome d'immunodéficience acquise ou SIDA chez l'homme.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les maladies rétrovirales sont les cancers associés aux oncovirus.
8. Produit de combinaison comprenant une quantité efficace - d'un polysaccharide de formule (I) dans laquelle R1 représente soit un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, soit un glucose sulfaté ou phosphaté lié, de préférence, par une liaison de type β(1->6) à la structure saccharidique, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, X et Y représentent, chacun indépendamment, un groupement OH, un glucose, un glucose sulfaté ou phosphaté, un mannitol, ou un mannitol sulfaté ou phosphaté, n représente un nombre entier de 11 à 30, préférentiellement de 20 à 30, plus préférentiellement de 25 à 30, ledit polysaccharide ayant un degré de sulfatation supérieur à 2, préférentiellement de 2,2 à 2,4, ou un degré de phosphatation supérieur à
1 , préférentiellement de 1 ,5 à 2,5, - d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant :
• les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INRT), dont notamment I1AZT1 le ddl, le ddC, le d4T, le 3TC et le ABC,
• les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva,
• les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra,
• les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon),
• les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement - d'au moins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents anti-hyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents pour traitements dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
9. Utilisation d'une quantité efficace
- d'un polysaccharide de formule (I) dans laquelle R1 représente soit un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, soit un glucose sulfaté ou phosphaté lié, de préférence, par une liaison de type β(1-»6) à la structure saccharidique, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, X et Y représentent, chacun indépendamment, un groupement OH, un glucose, un glucose sulfaté ou phosphaté, un mannitol, ou un mannitol sulfaté ou phosphaté, n représente un nombre entier de 11 à 30, préférentiellement de 20 à 30, plus préférentiellement de 25 à 30, ledit polysaccharide ayant un degré de sulfatation supérieur à 2, préférentiellement de 2,2 à 2,4, ou un degré de phosphatation supérieur à 1 , préférentiellement de 1 ,5 à 2,5,
- d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant : • les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse
(INRT), dont notamment l'AZT, le ddl, le ddC, le d4T, le 3TC et le ABC,
• les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva,
• les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra,
• les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon), « les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement
- d'au moins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents anti-hyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents pour traitements dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies rétrovirales, de préférence causées par les lentivirus et les oncovirus, plus préférentiellement par le VIH, notamment par les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus.
10. Utilisation d'une quantité efficace
- d'un polysaccharide de formule (I) dans laquelle R1 représente soit un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, soit un glucose sulfaté ou phosphaté lié, de préférence, par une liaison de type β(1→6) à la structure saccharidique, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, X et Y représentent, chacun indépendamment, un groupement OH, un glucose, un glucose sulfaté ou phosphaté, un mannitol, ou un mannitol sulfaté ou phosphaté, n représente un nombre entier de 11 à 30, préférentiellement de 20 à 30, plus préférentiellement de 25 à 30, ledit polysaccharide ayant un degré de sulfatation supérieur à 2, préférentiellement de 2,2 à 2,4, ou un degré de phosphatation supérieur à 1 , préférentiellement de 1 ,5 à 2,5,
- d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant : • les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse
(INRT), dont notamment I1AZT, le ddl, le ddC, le d4T, le 3TC et le ABC,
• les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva,
• les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra,
• les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon), • les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement
- d'au moins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents anti-hyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents pour traitements dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques, pour la mise en œuvre d'un méthode de traitement des maladies rétrovirales, de préférence causées par les lentivirus et les oncovirus, plus préférentiellement par le VIH, notamment par les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus.
11. Méthode de traitement d'un maladie rétrovirale, de préférence causée par les lentivirus et les oncovirus, plus préférentiellement par le VIH, notamment par les souches de ces rétrovirus résistantes aux agents anti- rétroviraux déjà connus, comprenant l'administration, chez un patient atteint par ladite maladie rétrovirale, d'une quantité efficace d'un médicament comprenant à titre d'agent actif au moins un polysaccharide de formule (I)
(I) dans laquelle R1 représente soit un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, soit un glucose sulfaté ou phosphaté lié, de préférence, par une liaison de type β(1— >6) à la structure saccharidique, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement sulfate ou un groupement phosphate, X et Y représentent, chacun indépendamment, un groupement OH, un glucose, un glucose sulfaté ou phosphaté, un mannitol, ou un mannitol sulfaté ou phosphaté, n représente un nombre entier de 11 à 30, préférentiellement de 20 à 30, plus préférentiellement de 25 à 30, ledit polysaccharide ayant un degré de sulfatation supérieur à 2, préférentiellement de 2,2 à 2,4, ou un degré de phosphatation supérieur à 1 , préférentiellement de 1 ,5 à 2,5 ; ou d'unproduit de combinaison tel que revendiqué dans la revendication 8.
12. Méthode de traitement selon la revendication 11 , dans laquelle le polysaccharide de formule (I) est une laminarine sulfatée, caractérisée en ce qu'elle possède une degré de sulfatation supérieur à 2, de préférence de 2,2 à 2,4, et un degré de polymérisation de 11 à 28.
13. Méthode de traitement selon la revendication 11 , dans laquelle le polysaccharide de formule (I) est une laminarine phosphatée, caractérisée en ce qu'elle possède une degré de phosphatation supérieur à 1 , de préférence de 1 ,5 à 2,5, et un degré de polymérisation de 11 à 28.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110698569B (zh) * 2019-11-22 2021-05-25 福建拓天生物科技有限公司 一种猴头菇孢子粉中多糖的提取工艺
WO2023129738A2 (fr) * 2021-12-30 2023-07-06 Sigilon Therapeutics, Inc. Polymères de polysaccharide modifiés, compositions associées et procédés correspondants

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4739046A (en) * 1985-08-19 1988-04-19 Luzio Nicholas R Di Soluble phosphorylated glucan
EP0240098A3 (fr) * 1986-04-04 1989-05-10 Kabushiki Kaisha Ueno Seiyaku Oyo Kenkyujo Oligo et Polysaccharides pour le traitement des maladies causées par des rétrovirus
JPH03145425A (ja) * 1989-10-30 1991-06-20 Dainippon Ink & Chem Inc 抗ウィルス剤
DE4021066A1 (de) * 1990-07-03 1992-01-09 Hoechst Ag Langzeitprophylaxe gegen erkrankungen, die durch viren oder durch unkonventionelle viren verursacht werden
US6290946B1 (en) * 1999-05-13 2001-09-18 Geltex Pharmaceuticals, Inc. Anionic polymers as toxin binders and antibacterial agents
FR2816213B1 (fr) * 2000-11-03 2005-04-22 Goemar Lab Sa Medicament anti-inflammatoire et cicatrisant
US6660722B2 (en) * 2001-11-30 2003-12-09 Laboratoires Goemar S.A. Therapeutical treatments

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