FR2899815A1 - Nouveaux medicaments pour les traitements contre les retrovirus - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un polysaccharide sulfaté ou phosphaté pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, y compris des souches de ces rétrovirus qui sont résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus; ce médicament agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers.

Description

NOUVEAUX MEDICAMENTS POUR LES TRAITEMENTS CONTRE LES RETROVIRUS

L'invention a pour objet de nouveaux médicaments pour les traitements contre les rétrovirus, en agissant sur leur cycle de réplication par inhibition de la RT. Il est rappelé que les rétrovirus appartiennent à une famille de virus dont le génome est constitué d'ARN.

La particularité des rétrovirus est de se répliquer dans une cellule hôte en passant par des étapes ADN, ce qui est rendu possible par la RT, désignée par RT dans ce qui suit et qui est une enzyme permettant la transcription de l'ARN viral en molécule d'ADN cornplémentaire appelée provirus. Le provirus est capable de se circulariser et de s'intégrer dans le génome de la cellule hôte. Les rétrovirus ainsi intégrés dans le génome de la cellule hôte peuvent soit utiliser la machinerie cellulaire pour se multiplier, soit demeurer à l'état latent dans la cellule hôte. A l'état de latence, leurs gènes sont transmis aux cellules descendantes à chaque mitose et sont temporairement silencieux ; l'organisme porteur du rétrovirus ne présente alors aucun signe pathologique. La famille des rétrovirus comporte trois sous-familles, à savoir les oncovirus, les lentivirus et les spumavirus. Les oncovirus sont responsables de cancers et, notamment, de certaines leucémies. Parmi les oncovirus provoquant des cancers, on peut citer le virus du sarcome de Roux ou VSR et parmi ceux qui sont à l'origine de leucémies chez l'homme, on trouve notamment le virus HTLV de type I et de type II (HTLV signifiant Human T cell Leukaemia Virus ) ; chez les félins, la leucémie est provoquée par le virus FTLV. Les lentivirus sont responsables d'infections virales à évolution lente telles que le syndrome d'immunodéficience acquise ou SIDA ; chez l'homme, les lentivirus responsables du SIDA font partie des HIV ou Human Immunodeficiency Virus ; chez le singe, il s'agit des SIV ("Simian Immunodeficiency Virus") et chez le chat des FIV (Feline Immunodeficiency Virus). Les spumavirus sont mal connus, tant au niveau de leur structure que du mode exact de leur intégration dans le génome cellulaire. Dans l'état actuel des connaissances., aucune maladie ne semble être associée aux spumavirus. Toutefois, leur responsabilité dans le déclenchement de certaines maladies auto-immunes semble probable. Sur le plan physiopathologique, les oncovirus transforment les cellules T qu'ils infectent et entraînent une prolifération non contrôlée de ces cellules ; les lentivirus détruisent les cellules qu'ils infectent. Concernant plus particulièrement les VIH, ils s'attaquent aux lymphocytes T4 auxiliaires qui expriment à leur surface la molécule CD4 (s'agissant d'une molécule glycoprotéique membranaire), qui est un récepteur permettant aux VIH de pénétrer à l'intérieur de ces cellules. Les V1H pénètrent dans un lymphocyte T4 par un système d'endocytose impliquant la reconnaissance mutuelle et la fixation de la molécule CD4 exprimée à la surface du lymphocyte T à une glycoprotéine de surface du rétrovirus dénommée gp120. L'expression d'un corécepteur membranaire présent sur les lymphocytes T4 est également nécessaire à la pénétration du virus. Comme indiqué plus haut, le rétrovirus, ici un VIH, se réplique à l'intérieur de la cellule hôte, ici le lymphocyte T4, sous l'action de la RT qui intervient de la manière indiquée ci-après. Dans un premier temps, le core du virus, une fois qu'il a pénétré à l'intérieur de la cellule hôte, libère deux copies d'ARN simple brin. Ces deux copies d'ARN simple brin sont associées à la RT ainsi qu'à d'autres protéines telles que la protéase et l'intégrase. Celle-ci synthétise un brin d'ADN complémentaire de l'ARN viral. Ensuite, une activité RNase associée à la RT dégrade le brin d'ARN, tandis qu'un deuxième brin d'ADN est synthétisé. L'ADN bicaténaire ainsi obtenu est ensuite circularisé puis intégré, grâce à une enzyme intégrase, dans le génome cellulaire pour donner un provirus. Ce provirus est constitué de 3 gènes de structure, à savoir les gènes gag (groupe antigène), pol (polymérase) et env (enveloppe) ; les gènes gag codent pour les protéines virales p24, les gènes pol pour la RT et ses activités associées qui sont les activités polymérase, RNase, intégrase et protéase, et les gènes env pour les glycoprotéines de l'enveloppe telles que la gp120. Lors de la phase de réplication virale, le provirus est transcrit en ARN messager en utilisant la machinerie du noyau de la cellule hôte, ce qui permet la production des protéines constitutives du rétrovirus d'une part et la réplication du matériel génomique viral d'autre part. L'ensemble constitue un nouveau virus produit par bourgeonnement de la membrane de la cellule hôte. Par ailleurs, des phénomènes de fusion se produisent entre les cellules infectées, qui présentent à leur surface notamment la protéine gp120 et les lymphocytes T4 non infectés, qui comportent à leur surface la molécule CD4. En effet, en raison de la grande affinité de la protéine gp 120 pour les récepteurs CD4, une cellule infectée peut fixer des Lymphocytes T4 non infectés sains et former ce qu'on appelle un syncytium, c'est-à-dire un agglomérat de lymphocytes infectés et non infectés, qui est incapable de survivre.

Une seule cellule infectée peut ainsi provoquer la mort de nombreux lymphocytes T4 sains. Il s'ensuit une diminution progressive de l'immunité cellulaire qui se traduit par le développement d'infections opportunistes, pouvant être accompagnées de certains types de tumeurs. D'autres cellules que les lymphocytes T4 comportent également la molécule CD4 à leur surface, et sont donc sensibles aux virus VI-I ; il s'agit des monocytes macrophages, de certaines cellules qui se trouvent dans les ganglions, la peau et d'autres organes, et de quelques lymphocytes B. Par ailleurs, les virus VI-I peuvent également s'attaquer à certaines cellules du système nerveux central SNC : ils provoquent dans ce cas des syndromes neurologiques.

D'autres molécules, localisées à la surface de la cellule et qui fonctionnent normalement comme récepteurs pour des chimiokines ont également été identifiées comme étant des co-récepteurs qui permettent l'entrée des virus VIH dans la cellule hôte.

Les rétrovirus responsables du SIDA, c'est-à-dire les lentivirus et notamment les VIH sont caractérisés par une extrême variabilité génétique et antigénique. On admet généralement que chez l'homme il existe deux types de virus responsables du SIDA, et désignés respectivement par HIV-I et HIV-II.

Des analyses génétiques ont montré qu'il existe trois groupes distincts de virus du type VIH-I ; ces trois groupes sont respectivement désignés par M (Majeur), O (Outlier) et N (New). La grande majorité des souches VIH-I appartient au groupe M (Majeur), qui comporte au moins dix sous-types ou clades (A, B, C, D,...) ; on rencontre ces clades dans des zones géographiques diverses. Au contraire, les souches VIH-I des groupes O et N n'ont jusqu'à présent été isolées que dans des populations africaines. La grande variabilité génétique de ces souches de virus VIH est principalement due au taux d'erreurs élevé de la RT. En effet, au cours des cycles de réplication successifs, des variants génétiques apparaissent. Les mutations se produisent en particulier sur le gène env et plus précisément sur la partie codante pour la gp120. Cette variabilité génétique se traduit par l'apparition de souches qui deviennent résistantes aux agents anti-rétroviraux connus.

Les traitements actuellement utilisés pour combattre les rétrovirus, notamment les lentivirus et tout particulièrement les VIH, visent à inhiber la RT et par conséquent bloquer leur cycle de réplication. Il est à remarquer que dans le cas des oncovirus associés à certains types de cancers, la RT est toujours essentielle à leur réplication. Et lorsque cette enzyme virale est inhibée, l'oncovirus ne peut plus se répliquer dans la cellule hôte.

Dans les traitements anti-rétroviraux, on met en oeuvre deux groupes d'agents anti-rétroviraux propres à inhiber la RT qui sont actuellement utilisés en clinique ; il s'agit d'une part des inhibiteurs nucléosidiques de la RT, et, d'autre part, des inhibiteurs non-nucléosidiques de la RT.

Parmi les inhibiteurs nucléosidiques de la RT, on peut citer l'AZT (ou 3'-azidothymidine), la didanosine et la stavudine (d4T, Zérit qui sont des analogues de la thymidine) ainsi que la ddC et le 3TC (qui sont des analogues de la cytidine). Ces inhibiteurs nucléosidiques entrent en compétition avec les nucléosides naturels et empêchent l'élongation de la chaîne d'ADN ; ils ont été les premiers à être utilisés comme inhibiteurs de la RT, seuls d'abord puis en association avec d'autres inhibiteurs de la RT ou d'enzymes virales telles que la protease et l'integrase. Cependant leurs effets indésirables sont connus et nombreux. Les inhibiteurs connus de la protéase sont des agents anti-rétroviraux puissants qui inhibent l'activité protéolytique de la protéase en s'attachant à son site actif ; à titre d'exemple, on peut citer l'amprenavir, le tipranavir, l'indinavir, le saquinavir, le lopinavir, le posanprenavir, le ritonavir, l'atazanavir et le nelfinavir. Les inhibiteurs non-nucléosidiques de la RT agissent comme antagonistes non compétitifs en se liant à une région hydrophobe adjacente au site catalytique de la RT, inhibant ainsi cette dernière ; parmi eux, on peut citer le ritonavir, le saquinavir, l'éfavirenz, le rescriptor, le sustiva et la viramune. L'apparition et la transmission, en particulier dans les pays industrialisés, de souches du VIH résistantes aux agents anti-rétroviraux connus a placé le monde médical devant un grave problème de santé publique.

Les échecs rencontrés dans le traitement des patients atteints du SIDA sont en effet principalement dus à des phénomènes de résistance virale, bien que d'autres facteurs tels que la toxicité des agents utilisés ainsi que certains effets secondaires influent également sur l'efficacité des traitements, même si c'est dans une moindre mesure.

C'est pour faire face à cette situation que de nombreuses recherches ont été et sont menées pour découvrir de nouveaux agents anti-rétroviraux capables d'inhiber la RT, en particulier parmi les polysaccharides. Ainsi, la demande de brevet européen 0 240 098 préconise l'utilisation comme agents anti-rétroviraux de polysaccharides sulfates synthétiques et naturels parmi lesquels sont exemplifiés notamment les sulfates de dextran, de lentinan et de pururan en ce qui concerne les premiers et les sulfates d'acide alginique, de chondroïtine, de keratane et d'héparine en ce qui concerne les seconds. La demande de brevet japonais publiée 01-103 601 décrit l'activité antivirale, notamment à l'égard du VIH, du sulfate de lentinan, de certains f3-1,3 glucans comme le curdlan, le pachymane, et ceux des parois cellulaires de la levure ainsi que ceux de la cellulose. Dans un article paru en novembre 1987 dans Jpn. J. Cancer Res/Gann n 78, pp. 1164.1168, Hideki Nakajima et al décrivent l'effet d'inhibition sur l'infectivité et la réplication du VIH de certains polysaccharides sulfatés tels que les sulfates de dextran, de xylofuranan et de ribofuranan ainsi que l'inhibition par ces produits de la RT du VIH. Enfin, lla demande de brevet japonais publiée 03-145 425 décrit l'activité antivirale, à l'égard du VIE, de certains laminarioligosaccharides sulfatés et notamment du laminaripentaose sulfaté. Les travaux décrits dans ces documents antérieurs n'ont toutefois conduit à aucune application pratique, ce qui pour le moins pour certains d'entre eux, s'agissant notamment des sulfates de l'héparine et du dextran, n'est pas étonnant au vu de l'importante activité anticoagulante de ces produits.

L'invention a donc pour but, surtout, de mettre à la disposition du corps médical de nouveaux médicaments à indice thérapeutique élevé pour la lutte contre les rétrovirus en général plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, ces médicaments qui sont également actifs contre des souches résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers.

Et il est du mérite des Inventeurs et de la Société Demanderesse d'avoir trouvé que, de façon surprenante et inattendue, ce but pouvait être atteint par le recours, pour la constitution d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, y compris des souches de ces rétrovirus qui sont résistants aux agents anti-rétroviraux déjà connus, aux représentants d'une famille particulière de polysaccharides, représentée par la formule X (I) OR2 1 OR2 'n OR2 ~. dans laquelle R1 et R2 peuvent être soit identiques et représentent alors un groupement sulfate ou phosphate, soit différents l'un de l'autre, R1 représentant alors une unité glucose sulfatée ou phosphatée liée, de préférence, par une liaison 13 de type (3.-1,6 à la structure saccharidique, X et/ou Y représentant un groupement mannitol et n un nombre entier de 11 à 30, plus particulièrement de 25 à 30, pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus en général, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, ce médicament qui est également actif contre des souches résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers.

Il s'ensuit que l'invention a pour objet l'utilisation d'un polysaccharide de formule I pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, ce médicament qui est également actif contre des souches résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers. Dans le cas des lentivirus et en particulier des VIH de type I et II, le médicament obtenu par utilisation conformément à l'invention du polysaccharide de formule I permet de traiter le syndrome de l'immunodéficience acquise chez l'homme. Dans le cas des oncovirus et en particulier des virus HTLV de type I et II, l'utilisation conformément à l'invention du polysaccharide de formule I permet de traiter les cancers associés à ces virus.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention vise l'utilisation de la laminarine sulfatée ayant un degré de sulfatation supérieur à 2 et de préférence de 2,2 à 2,4 pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus en général, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, ce médicament qui est également actif contre des souches résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention vise l'utilisation du phosphate de laminarine ayant un degré de phosphatation supérieur à 1 et de préférence de 1,5 à 2,5 pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus en général, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, ce médicament qui est également actif contre des souches résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers.

Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention vise l'utilisation d"un oligosaccharide, obtenu à partir de la laminarine sulfatée de degré de sulfatation supérieur à 2 et de préférence de 2,2 à 2,4, le degré de polymérisation de cet oligosaccharide étant de 11 à 28, pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus en général, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, ce médicament qui est également actif contre des souches résistantes aux agents antirétroviraux déjà connus agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention vise l'utilisation d'un oligosaccharide obtenu à partir du phosphate de laminarine de degré de phosphatation supérieur à 1 et de préférence de 1,5 à 2,5 pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus en général, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, ce médicament qui est également actif contre des souches résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers. Il est connu d'administrer aux patients atteints notamment du SIDA, dans le cadre des traitements désignés par le terme de "multithérapies" non seulement deux, voire trois agents antirétroviraux, mais également d'autres agents pharmacologiques destinés à lutter contre les pathogénies associées.

La prise de ces nombreux médicaments représente une servitude considérable pour les patients. Pour remédier à cet inconvénient et selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet l'utilisation pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus, plus particulièrement contre les lentivirus, et notamment contre les VIH ainsi que contre les pathogénies associées, - d'un polysaccharide de formule I dans lequel RI et R2 peuvent être soit identiques et représentent alors un groupement sulfate ou phosphate, soit différents l'un de l'autre, RI représentant alors une unité glucose sulfatée ou phosphatée liée, de préférence, par une liaison (3 de type r-1,6 à la structure saccharidique, X et/ou Y représentant un groupement mannitol et n un nombre entier de 11 à 30, plus particulièrement de 25 à 30, notamment de la laminarine sulfatée de degré de sulfatation supérieur à 2, de préférence de 2,2 à 2,4, ou du phosphate de laminarine de degré de phosphatation supérieur à 1, de préférence de 1,5 à 2,5. - d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant : • les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INRT), dont notamment l'AZT, le ddI, le ddC, le d4T, le 3TC et le ABC, • les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse 5 (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva, • les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra, • les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon), 10 • les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement - d'au moins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents anti-hyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents 15 pour traitements dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet une composition pharmacologique comprenant au titre de substance active une quantité efficace - d'un polysaccharide de formule I dans lequel RI et R2 peuvent être soit 20 identiques et représentent alors un groupement sulfate ou phosphate, soit différents l'un de l'autre, RI représentant alors une unité glucose sulfatée ou phosphatée liée, de préférence, par une liaison (3 de type R-1,6 à la structure saccharidique, X et/ou Y représentant un groupement mannitol et n un nombre entier de 11 à 30, plus particulièrement de 25 à 30, 25 notamment de laminarine sulfatée de degré de sulfatation supérieur à 2, de préférence de 2,2 à 2,4, ou de phosphate de laminarine de degré de phosphatation supérieur à 1, de préférence de 1,5 à 2,5 - d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant : • les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INRT), 30 dont notamment l'AZT, le ddl, le ddC, le d4T, le 3TC et le ABC., • les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva, • les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra, • les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon), • les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement d'au moins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents anti-hyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents pour traitements dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques. Ceci étant et quel que soit le mode de réalisation choisi, l'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui suit.

Se proposant par conséquent de mettre à la disposition du monde médical un nouveau médicament pour la lutte contre les rétrovirus, conformément à l'invention on s'y prend comme suit ou de façon équivalente. Pour préparer ce nouveau médicament destiné aux traitements contre les rétrovirus, en agissant sur leur cycle de réplication par inhibition de la RT, on a recours à l'un des polysaccharides de la famille des polysaccharides de formule I définie plus haut. Et c'est en rapport avec les polysaccharides sulfatés de formule I et plus précisément avec un représentant particulièrement préféré de ladite famille de polysaccharides de formule I, s'agissant de la laminarine sulfatée, que sont démontrés les avantages aussi exceptionnels qu'inattendus de l'invention. Pour préparer le sulfate de laminarine, on extrait d'abord la laminarine d'une matière première constituée par des algues brunes puis on procède à la sulfatation de la laminarine ainsi extraite. L'extraction de la laminarine peut être réalisée par mise en oeuvre du procédé décrit dans le brevet FR 92 08387.

La sulfatation de cette laminarine peut être effectuée par mise en oeuvre du procédé décrit dans la publication suivante : - Alban S, Kraus J, Franz G : Synthesis of laminarin sulfates with anticoagulant activity, Artzneim.Forsch./drug Res (1992) 42 ; 1005-1008.

Un procédé perfectionné de sulfatation de la laminarine est décrit dans la these de Susanne Alban, soutenue en 1993 à l'Université de Regensburg et portant le titre Synthese und physiologische Testung neuartiger Heparinoide . Ces procédés permettent d'obtenir un sulfate de laminarine hautement substitué, sans dégradation et avec une bonne reproductibilité sous de bonnes conditions du point de vue économique, tout en restant simples. Ces procédés peuvent être adaptés à la sulfatation des (3 1-3 glucanes en général. Pour aboutir à une sulfatation efficace de la laminarine sans dégradation des chaînes polysaccharidiques, la réaction de sulfatation doit être effectuée sous des conditions correspondant à une absence absolue d'eau. Avant la sulfatation, la laminarine est séchée, par exemple sur pentoxide de phosphore (P205) et ensuite dissoute dans du diméthylformamide ou DMF. De par ses effets alternatifs sur le polysaccharide, le DMF a une influence activante par la substitution. En effet, l'association du DMF polaire avec les groupes OH conduit à la coupure des liaisons hydrogène intra et inter moléculaires et à la désintégration des structures supérieures. Pour mettre en oeuvre la réaction de sulfatation, on peut avoir recours avantageusement au complexe SO3-pyridine. Par suite de la coordination de l'accepteur d'électrons SO3 avec le donneur d'électrons pyridine, la réactivité difficilement contrôlable du SO3 qui se traduit par des réactions fortement exothermiques entraînant des dégradations, se trouve réduite. Le complexe SO3-pyridine présente par rapport à d'autres complexes l'avantage d'être ni trop réactif ni trop stable c'est-à-dire trop lent du point de vue réaction.

En raison du fait que le degré de sulfatation obtenu est proportionnel à l'excès molaire en réactif de sulfatation et étant donné que l'on cherche à obtenir un degré de substitution supérieur à 2, on met avantageusement en œuvre une concentration de 6 moles de SO3- pyridine par mole de glucose. Pour garantir l'absence d'eau, on peut travailler sous atmosphère d'argon. De plus, dès le début de la réaction on ajoute de la pyridine au réactif de sulfatation et ce, en quantité équimolaire, en vue de capter directement l'acide sulfurique qui pourrait se former par réaction du complexe SO3-pyridine avec l'eau. Tant la concentration de la laminarine que celle du réactif de sulfatation doivent être aussi élevées que possible, la solubilité du polysaccharide et du réactif de sulfatation, étant limitants. Pour éviter au début de la réaction un refroidissement du mélange qui pourrait entraîner des problèmes de solubilité et pour obtenir une substitution la plus régulière possible, la solution du complexe SO3-pyridine dans le DMF pourrait ne pas être ajoutée en une seule fois mais de manière continue pendant une durée de 4 heures. La réaction de sulfatation peut être effectuée à une température de 20 à 60 C, de préférence d'environ 40 C. Des températures plus élevées entraînent une substitution plus efficace mais, également, une dégradation des chaînes. Après :l'addition du réactif de sulfatation, on continue à agiter le mélange pendant 6 heures à 60 C. A cette température, il se produit une substitution supplémentaire sans dégradation des chaînes.

Le surnageant du mélange est séparé par décantation. Le résidu est dissous dans 2,5 M de NaOH puis mélangé avec 10 fois son volume d'éthanol à 99%. Le précipité qui se produit à une température de 4-8 C pendant la nuit est isolé puis dissous dans de la soude diluée (solution de pH d'environ 9). La solution est dialysée pour enlever les sels et les molécules de bas poids moléculaire grâce à une membrane de type Spectrapor à seuil de coupure 1000 D puis amenée à un pH de 7,0 par addition de NaOH et ensuite lyophilisée. Le sulfate de laminarine résultant se présente sous forme de sel de sodium. Le degré de sulfatation est déterminé par voie de titration conductimétrique de l'acide libre du polysaccharide sulfaté en utilisant de la 30 soude 0,1N, ou par chromatographie ionique après hydrolyse en utilisant un système HPLC. La première méthode présente l'avantage d'être également propre à des recherches relatives à la stabilité (la consommation de soude s'accroît lorsque des groupes sulfates sont éliminés) alors que la méthode HPLC nécessite moins de substance et peut être automatisée. A titre de contrôle, il est possible de déterminer la teneur en soufre par analyse élémentaire.

Il est de plus possible de contrôler l'homogénéité de la sulfatation et la répartition des groupes sulfate sur les différentes positions dans la molécule de glucose par une forme modifiée de l'analyse de méthylation suivie d'un examen GC-MS (à savoir Chromatographie Gaz, Spectrométrie de Masse). La sulfatation est pratiquement totale, c'est-à-dire presque tous les groupes hydroxyle en position 6 sont sulfatés. Lors de la substitution des groupes OH secondaires, il n'y a pas de différence significative entre la sulfatation des groupes en position 2 et celle des groupes en position 4. Le degré de sulfatation obtenu en procédant comme indiqué ci-dessus est supérieur à 2, plus précisément de 2 à 2,5 et tout particulièrement de 2,2 à 2,4.

Le degré de polymérisation du sulfate de laminarine ainsi obtenu est de à 30, plus précisément de 23 à 28. L'étude in vitro de l'activitéanti-rétrovirale de la laminarine sulfatée ainsi obtenue a permis de trouver les résultats surprenants et inattendus mentionnés plus haut et exposés ci-après. 20 Cette étude vise à déterminer l'action du polysaccharide notamment sulfaté de formule I, en l'occurrence la laminarine sulfatée, dont l'obtention et les caractéristiques viennent d'être décrites, sur le cycle de réplication des rétrovirus par inhibition de la RT, cette inhibition de la RT pouvant être appréciée - soit par l'observation, en fonction de la quantité de polysaccharides sulfatés mis en oeuvre et du moment de cette mise en oeuvre qui peut avoir lieu avant, pendant ou après l'infection ou encore en permanence, de la diminution du nombre de syncitia, apparaissant dans une culture de cellules MT4 suite à l'infection par un rétrovirus VIH, - soit par appréciation de nouveau en fonction de la quantité de 30 polysaccharides sulfatés mis en oeuvre et du moment de cette mise en oeuvre qui peut avoir lieu avant, pendant ou après l'infection ou encore en permanence tout au long de l'infection, de l'inhibition de la RT qui se traduit par une diminution mesurable de l'activité, de cette dernière et qui reflète le ralentissement de la réplication du virus infectant dans une culture de cellules CEM infectées par un rétrovirus VIH, étant entendu qu' à titre de comparaison les mêmes expériences sont effectuées en utilisant comme produits de comparaison d'une part le sulfate de dextran et d'autre part l'agent anti-rétroviral bien connu qu'est la 3'-azidothymidine ou AZT. Les susdites cellules MT4 et CEM sont des lignées lymphoblastiques 10 humaines transformées par HTLV-1. Les rétrovirus mis en oeuvre sont constitués par - les souches de laboratoire BRU (clade B) et NDK (clade D), - le virus RTMC (clade B) connu comme étant résistant à l'agent antiviral AZT, 15 les isolats primaires RW92009 (clade A) et UG92029 (clade A), et - un isolat (PIC CH, clade B) issu d'un patient résistant à plusieurs agents antiviraux connus comrne le d4T et le Zérit. Les souches RTMC, RW92009 et UG92029 ont été obtenues auprès du AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID-20 NIH (USA) . Les cellules MT4 et CEM sont cultivées en milieu RPMI (provenance Cambrex) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (provenance Cambrex), 1% de Penicilline-Streptomycine (provenance Life Technologies), 2 mM de glutamine (provenance Invitrogen), 2 gg/ml de polybrène (provenance Sigma). 25 La laminarine sulfatée utilisée (dénommée PS3) a été fournie par la société GOEMAR (lot n G903) sous forme lyophilisée ; elle a été dissoute dans du PBS à la concentration de 12 mg/ml pour fournir une solution mère à partir de laquelle les dilutions dont il est question plus loin ont été effectuées. Le sulfate de dextran (provenance Sigma, D4911) a été dissous dans du 30 PBS à la concentration de 41,6 mg/ml (solution mère).

L'AZT (provenance Sigma A2169) est connu comme étant un inhibiteur de la RT. Il est dilué dans du PBS aux concentrations indiquées plus loin. Pour évaluer l'action du polysaccharide sulfaté et des produits de comparaison sur le nombre de syncitia dans une culture de cellules MT4 infectée par l'un des rétrovirus indiqués ci-dessus, on procède comme indiqué plus loin. Les cellules MT4 (3.105 cellules dans 50 l) sont pré-incubées pendant 1 heure à 37 C en atmosphère humide à 5% de CO2, avec les dilutions successives du polysaccharide sulfaté (50 111) et des produits de comparaison, en microplaque de 96 puits à fond en V. Chaque concentration de polysaccharide sulfaté et de produit de comparaison est testée en double. L'infection des cellules est réalisée en ajoutant dans chaque puits, sauf ceux correspondant aux témoins cellules, 50 l de dilution virale préalablement titrée.

Après une nouvelle heure d'incubation, la plaque est centrifugée et les surnageants contenant le virus résiduel sont éliminés. Deux rinçages sont réalisés ; les culots cellulaires sont ensuite transférés en plaque de 24 puits et cultivés à 3.105 cellules/ml en présence du polysaccharide sulfaté ou du produit de comparaison.

Après 3 jours de culture, les cellules sont diluées au demi et les syncytia sont observés au microscope inversé du jour 3 au jour 7 après remise en suspension. Cornme déjà précisé plus haut, on réalise quatre séries d'expériences visant à préciser l'effet du polysaccharide sulfaté en fonction du moment auquel il est mis en oeuvre dans la culture de cellules, c'est-à-dire - avant l'infection - pendant l'infection - après l'infection et - tout au long de l'infection.

Dans le premier cas, le polysaccharide sulfaté et les produits de comparaison sont amenés en contact avec les cellules pendant une heure, puis les cellules sont lavées deux fois pour éliminer les produits mis en oeuvre et enfin il est procédé à l'infection de la culture des cellules MT4. Dans le deuxième cas, le polysaccharide sulfaté et les produits de comparaison sont mis en oeuvre au moment auquel on procède à l'infection des cellules, la culture ainsi traitée est maintenue en l'état pendant une heure, puis il est procédé à deux lavages, ce qui conduit à l'élimination du polysaccharide sulfaté et des produits de comparaison ainsi que des virus qui n'ont pas pénétré dans les cellules. Dans le troisième cas, la culture de cellules MT4 est pré-incubée pendant une heure à 37 C, puis il est procédé à l'infection des cellules, l'ensemble est soumis à une incubation d'une heure à 37 C puis à une centrifugation avec élimination du surnageant qui contient les virus n'ayant pas pénétré dans les cellules, le culot cellulaire est rincé deux fois puis transféré sur plaque de 24 puits, puis cultivé à la concentration de 3.105 cellules/ml simultanément à l'introduction dans les mêmes puits du polysaccharide sulfaté et des produits de comparaison aux concentrations choisies. Dans le quatrième cas, on commence par mettre en contact le polysaccharide sulfaté et les produits de comparaison avec les cellules pendant une heure à 37 C, puis il est procédé à l'infection de la culture pendant une heure à 37 C. Ensuite il est procédé à deux lavages, ce qui conduit à l'élimination des virus qui n'ont: pas pénétré dans les cellules. Les culots cellulaires sont transférés dans des plaques de 24 puits, à raison de 3.105 cellules/ml par puits en présence du polysaccharide sul faté et des produits de comparaison aux concentrations choisies.

Les lavages et rinçages sont effectués avec du milieu de culture RPMI sans sérum de veau foetal. Dans le cas de chacun des quatre types d'expériences qui viennent d'être décrites et comme déjà indiqué plus haut, les cellules sont diluées au demi après trois jours de culture puis les syncytia sont observés au microscope inversé du jour J3 au jour J7.

Le résultat de ces observations est illustré par les figures 1 à 3, étant entendu que - la figure 1 montre une culture de cellules C1 non infectée : les cellules C1 restent distinctes les unes des autres ; il n'y a pas de syncytia ; - la figure 2 montre une culture de cellules infectées dans laquelle certaines cellules C1 s'agglutinent en syncytia repérés par S, et - la figure 3 montre sous un agrandissement plus important une culture de cellules C1 infectées, certaines des cellules C1 étant agglutinées en syncytia repérés par S.

Dans les expériences décrites plus en détail ci-après, l'absence de syncytia est notée par un signe û et les signes (+), +, ++, ++T indiquent une quantité croissante de syncitia dans chaque puits. L'indication T traduit la mort des cellules. Dans une première série d'expériences, le produit de comparaison a été l'AZT mis en oeuvre à la concentration de 0,01 m, le polysaccharide sulfaté PS3 ayant été mis en oeuvre à deux concentrations, respectivement de 5 et de 10 g/ml. Le virus utilisé pour l'infection des cellules MT4 a été le virus BRU (clade B) mis en oeuvre à la dilution virale de 105 qui correspond à la quantité de particules virales permettant d'infecter 80% des cultures MT4 (Tissue Culture Infections Dose 80% TCID80%). Les résultats observés du jour J3 au jour J4 dans les quatre types d'expériences définis plus haut sont réunis dans le tableau A.

TABLEAU A Agent Antirétroviral Quantité de syncytia dans la culture (puits) aux 'ours J3 à J7 Mise en oeuvre Nature Concentration J3 J4 J5 J6 J7 10 g/ml - - - - + En continu, PS3 - - - - - avant, pendant 5 g/ml - -(+) + et après - - (+) (+) ++ infection AZT 0,01 M - - - - - 10 g/m1 -(+)/+ ++ ++T ++T _ - +/++ ++ ++T - PS3 - Avant infection 5 gg/m1 - + +/++ ++T ++T - (+)/+ ++ ++T ++T AZT 0,01 M - (+) ++ ++T ++T - (+) + ++ ++T 10 g/ml - (+) + ++ ++T - (+) + ++ ++T PS3 - Pendant 5 g/ml (+) + ++ ++ ++T infection (+) + ++ ++ ++T AZT 0,01 M - (+) + ++ ++T - (+)/- + ++ ++T 10 g/ml - - - - - PS3 - - - - - Après infection 5 gg/ml - - - - - AZT 0,01 M - - - - - - - - - (+)/+ Absence d'agent antirétroviral - (+) + ++ ++T -(+) +/++ ++ ++T Absence de virus - - - - Absence d'agent antirétroviral _ Les résultats réunis dans le Tableau A permettent de faire les constatations exposées ci-après. Après 6 jours à compter de l'infection par la souche virale BRU, les cultures de cellules MT4 ne forment pas de syncitia lorsqu'elles sont traitées en continu, dès leur mise en culture (avant, pendant et après l'infection), avec des concentrations de 10 g,'ml de PS3. Les cultures de cellules MT4 ne forment pas de syncitia lorsqu'elles sont traitées avec des concentrations de 10 et 5 g/ml de PS3 après l'infection par la souche virale BRU. L'effet est observé dès le 3eme jour à compter de l'infection virale. Il est important de noter qu'aucun effet d'inhibition n'est observé lorsque les cellules MT4 sont traitées avant ou pendant l'infection par la souche virale. Il résulte également du tableau A que le PS3 est aussi efficace que l'AZT. Au vu de ces résultats, il apparaît que dans le cas du PS3 il s'agit d'un effet spécifique sur la réplication du virus et non d'un effet aspécifique, dû à la nature anionique du PS3, sur l'entrée du virus dans la cellule (il n'y a aucune action lorsque le PS3 est mis en contact uniquement avant infection).

Dans une deuxième série d'expériences, on a utilisé comme produits de comparaison l'AZT et le sulfate de dextran mis en oeuvre respectivement aux concentrations de 0,4 M et de 10 g/ml, cette dernière concentration étant également celle du PS3. Le virus utilisé est le virus NDK (clade D) mis en oeuvre à la dilution virale de 2,5.10-5 qui correspond à la quantité de particules virales permettant d'infecter 80% des cultures MT4 (Tissue Culture Infections Dose 80% TCID80o%). Les résultats observés du jour J3 au jour J6 sont réunis dans le tableau B.

TABLEAU B Agent Antirétroviral Quantité de syncytia dans la culture (puits) aux jours J3 à J6 Mise en oeuvre Nature Concentration J3 J4 J5 J6 finale PS3 10 g/ml - + ++ T - (+) + T Avant infection Dextran 10 pg/m1 - _ _ _ (sulfate) _ _ _ - AZT 0,4 g/ml - + ++ T _ - - (+) PS3 10 g/ml Dextran 10 g/ml - - - ++ Pendant infection (sulfate) (+) ++ T AZT 0,4 m PS3 10 g/ml Après infection Dextran 10 g/ml - - - _ (sulfate) - + ++ T AZT 0,4 m - - - - PS3 10 g/ml En continu, avant, Dextran 10 g/m1 - + ++ T pendant et après (sulfate) - + ++ T infection AZT 0,4 m - (+) ++ T Absence d'agent antirétroviral - (+)/+ ++ T .. -(+)/+ ++ T Absence de virus et d'agent antirétroviral - Les constatations qu'il est possible de faire au vu des résultats réunis dans le Tableau B sont comme suit. Au jour J5, après 5 jours à compter de l'infection par la souche virale NDK, les cultures de cellules MT4 ne forment pas de syncitia lorsqu'elles sont traitées en continu, pendant et après l'infection, avec une concentration de 10 p.g/ml de PS3. Cependant, aucun effet d'inhibition n'est observé lorsque les cellules MT4 sont traitées uniquement avant l'infection. Le sulfate de dextran a, au contraire, un effet optimal lorsque les cellules sont traitées avant l'infection virale (2 puits sur 2 inhibés). Il apparaît par ailleurs, et comme dans la série d'expériences illustrées par le Tableau A, que l'activité du PS3 est comparable à celle de l'AZT. Les conclusions générales exposées au vu des résultats réunis dans le Tableau A s'appliquent ici.

Pour évaluer l'action du polysaccharide sulfaté et des produits de comparaison sur la réptication du virus infectant par mesure de l'activité RT dans une culture de cellules constituées cette fois-ci par des cellules CEM, on a procédé comme suit. Le nombre de virus présents dans la culture est mis en évidence par la mesure de l'activité RT dans le surnageant de culture, la quantité détectée de l'activité de RT étant proportionnelle au nombre de virus produits. Le protocole expérimental est celui utilisé sur cellules MT4, à la différence près que les cellules CEM sont incubées avec le polysaccharide sulfaté ou le produit de comparaison puis cultivées à la concentration de 0,5. 106 cellules/ml. Tous les trois jours, les cellules sont comptées et les cultures sont diluées en vue d'une remise en culture à 0,5. 106 cellules/ml ; le dosage de l'activité RT est réalisé suivant le protocole décrit ci-après : Il comprend - la libération dans les échantillons de culture des enzymes virales et notamment de la RT, - la mise en réaction des échantillons avec un mélange réactionnel comportant de la 3H dTTp (thymidine) radioactive, - l'isolement de l'ADN synthétisé par suite de la réplication du rétrovirus, - la mesure de la radioactivité de l'ADN synthétisé, cette radioactivité étant proportionnelle à la quantité de thymidine tritiée incorporée dans ledit ADN synthétisé, qui elle-même est proportionnelle à l'activité RT et donc au nombre de virus produits par réplication. La préparation des échantillons de culture est effectuée en laboratoire protégé de type P3. Le contenu de chaque puits (1 ml) est centrifugé pendant 5 mn à 1500 rpm (centrifugeuse Jouan GR 422). Le surnageant de culture ainsi obtenu est ultracentrifugé à 4 C, 95000 rpm (ultracentrifugeuse Beckman TL100) pour obtenir le culot viral.

Le culot viral est repris dans un tube à essais contenant 10 pl de tampon NTE additionné de 0,1% de triton qui libère les enzymes virales et en particulier la RT ; le tube est vortexé, bouché au parafilm et maintenu 10 minutes à 4 C avant d'être congelé à -20 C. Le mélange réactionnel dont il est question plus haut est préparé en laboratoire de biochimie et comprend pour un tube à essais de 5 ml • Tampon de base 5X 10,0 pl • Poly rA 1 OD/ml (ARN) 12,5 pl • Oligo dT 1 OD/ml (Amorce) 12,5 pl • Eau distillée 2,5 pl • 3H dTTp (thymidine) 1 mCi/ml 2,5 pl total 40,0 l30 La composition du susdit tampon de base 5X est la suivante : Concentration finale - TRIS 1M pH 7,8 1,25 ml 0,25 M - MgC12 0,5 M 1,00 ml 0,10 M - KCl 1 M 0,50 m1 0,10 M - DTT 100 mM 0,50 ml 10 Mm - H2O 1,75 ml On prépare autant de tubes à essais contenant ce mélange réactionnel 10 qu'il y a d'échantillons à tester. En laboratoire de biochimie, ces échantillons de 10 gl préparés comme indiqué ci-dessus et qui contiennent le virus lysé par le triton 0,1% sont introduits dans autant de tubes contenant chacun 40 Ill de mélange réactionnel. Les tubes en question sont maintenus pendant une heure au bain-marie 15 à 37 C avec une agitation toutes les 15 minutes. La réaction est ensuite stoppée par introduction dans chaque tube de 1 ml de PPNa (pyrophosphate de sodium) 0,1 M préparé dans de l'acide trichloroacétique ou TCA à 5%. L'ADN synthétisé contenu dans le mélange est précipité à 4 C par 20 ajout de 3, 5 ml/tube d'acide trichloroacétique à 20%. L'ADN synthétisé et précipité comme indiqué ci-dessus est filtré sur filtres de nitrocellulose Millipore 0,45 p.. Pour ce faire, le contenu des tubes est versé dans les puits correspondants d'un collecteur d'échantillons (Millipore), puis les tubes et les 25 puits sont rincés trois fois avec du TCA à 5%. Les filtres sont déshydratés à l'alcool à 70% avant d'être séchés au four à 80 C pendant 20 minutes. Après refroidissement, les filtres sont déposés individuellement dans des fioles contenant un agent de scintillation ou scintillant (en l'occurrence celui 30 vendu sous la marque Emulsifier Safe cat. N 6013389 par la Société Perkin Elmer).5 Le comptage est ensuite effectué à l'aide d'un analyseur à scintillation liquide commercialisé sous la marque "PACKARD 2100T". Les résultats sont exprimés en dpm/ml (désintégration par minute et par ml de surnageant).

La quantité de radioactivité mesurée est proportionnelle à l'activité RT présente et, par conséquent, au nombre de virus produits par réplication. Dans une première série d'expériences, le polysaccharide sulfaté PS3 a été testé aux concentrations de 5 et de 10 g/ml et le produit de comparaison, d'AZT à la concentration 0,1 M.

Le virus utilisé pour l'infection des cellules CEM est le virus RTMC (clade B) qui a la particularité d'être résistant à lAZT et qui a été mis en oeuvre à la dilution de 5.10-4. Les résultats enregistrés aux jours J3, J7 et J10 sont réunis dans le tableau C, ces résultats comprenant pour chaque expérience l'activité RT exprimée en dpm/ml et le nombre de cellules exprimé en 106 cell/ml.

TABLEAU C Dilution Agent Antirétroviral Nombre de Quantité de RT mesurée et nombre cellules correspondant de cellules par ml aux jours J3, J7 virale et J10 RMTC - ù Nature Concentration Quantité RT J3 J7 J10 106 Cell./ml 0,2 3,6 0,2 0,8 1,7 3,2 10 g/ml RT (dpm/ml) 577 356 1056 951 3698 1737 PS3 - ù 106 Cell./ml 3,6 4,1 1,8 1,1 1,6 0,5 a 5 g/ml ù 5.10 RT (dpm/ml) 562 2439 57210 2001566 150149 557329 106 Cell./ml 2,7 3,3 2,1 0, 9 0,4 0,8 AZT 0,1 M RT (dpm/ml) 639 1832 37592 87550 282701 1322486 Absence d'agent 106 Cell./ml 4 5,7 1 0,6 0,6 0,6 Antirétroviral 4905 6393 1347767 1274569 1152701 52907 RT (dpm/ml) Absence de virus 106 Cell./ml 3,9 5 1,6 2,6 7 4,6 Absence d'agent RT (dpm/ml) 245 Q 1156 2090 1685 1195 Antirétroviral Pour mieux faire apparaître l'action du polysaccharide sulfaté PS3, on a transposé sur le graphique de la Fig. 4 et à partir des résultats réunis au Tableau C, l'évolution de l'activité RT exprimée en dpm/ml en fonction du temps (jours J3 à J10) pour les cellules traitées respectivement aux deux concentrations de PS3 et avec l'AZT ainsi que pour les cellules témoins (sans agent) la dilution virale étant 5.10-4.

L'examen du Tableau C et la Figure 4 permet de conclure qu'à la concentration de 101,tg/ml, le PS3 permet d'obtenir une inhibition proche de 100 % du virus RMTC à la concentration virale de 5.10-4. Il est ainsi démontré que le PS3 est efficace sur le virus RMTC qui est résistant à l'AZT, inhibiteur connu de la RT.

Dans une deuxième série d'expériences, l'action du polysaccharide sulfaté PS3 a été étudiée en fonction du moment de la mise en oeuvre (en continu, avant l'infection, pendant l'infection et après l'infection).

On a procédé comme indiqué plus haut en rapport avec les expériences réalisées sur cellules MT4. De nouveau, le PS3 est testé aux concentrations de 5 et 10 g/ml et l'AZT à la concentration de 0,1 11M, le virus mis en oeuvre étant, cette fois, le 5 virus NKD (clade D) à la dilution de 2,5.105. Les résultats des mesures réalisées aux jours J3 et J7 sont réunis dans le Tableau D, s'agissant de l'activité RT exprimée en dpm/ml et du nombre de cellules exprimé en 106 cell/ml.

TABLEAU D Agent Antirétroviral Nombre de Quantité de RT mesurée et nombre cellules correspondant de cellules aux jours Quantité RT J3 et J7 Mise en oeuvre Nature Concentration J3 J7 En continu, 10 g/ ml 106 Cell./mI 1,6 1,5 3,1 3,6 avant, pendant et après RT (dpm/ml) 471 603 1307 88808 PS3 5 g/ml 106 Cell./ml 1,1 1,6 3,3 3,4 RT (dpm/ml) 377 469 926 715 AZT 0 1 M 106 Cell./ml 1,7 1,3 3,6 3,2 RT (dpm/ml) 399 750 _ 48013 14988 Avant 10 g/ml 106 Cell./ml 0,9 2 1,4 1,7 infection RT (dpm/ml) 1321 2199 1543435 1480097 PS3 5 g/m1 106 Cell./ml 1,2 1,3 2,5 2,4 RT (dpm/ml) 713 245 285150 505929 AZT 0,1 M 106 Cell./ml 1,4 0,8 2 3,8 RT (dpm/ml) 1251 529 1381090 673 Pendant 10 g/ml 106 Cell./ml 1,3 1,4 2,5 2,4 infection RT (dpm/ml) 571 930 50601 1106 PS3 5 g/ml 106 Cell./ml 1,2 1,5 2 2,1 RT (dpm/ml) 756 761 1298585 1753853 AZT 0,1 M 106 Cell./ml 1,9 1,6 3,2 1,6 RT (dpm/ml) 1529 956 94848 1259346 Après 10 g/m1 106 Cell./ml 1,7 1,3 2, 6 - 2,4 - infection RT (dpm/ml) 441 741 1665 830254 PS3 5 g/ml 106 Cell. /ml 1,1 1 2,6 2,6 RT (dpm/ml) 1121 658 460595 1502670 AZT 0,1 M 106 Cell./ml 1,2 0,8 1,8 3,2 RT (dpm/ml) 1249 956 3096138 1098 106 Cell./ml 0,8 0,8 2, 7 2,6 Absence d'agent antirétroviral RT (dpm/ml) 341 241 1653978 905197 Absence de virus et d'agent 106 Cell./ml 0,6 0,9 3,2 3,6 antirétroviral RT (dpm/ml) 231 418 1362 351 A la Figure 5 qui illustre le Tableau D, on a reporté sur un graphique l'activité RT exprimée en dpm/ml mesurée au jour 7 dans le cas de l'AZT et des deux concentrations de PS3 ainsi que dans le cas des cellules témoin n'ayant pas été traitées avec un agent antirétroviral, et cela pour les quatre expériences correspondant à l'administration de l'agent antirétroviral en continu, avant, pendant et après l'infection par le virus NDK à la dilution de 2,5.105. A l'examen du Tableau D et de la Figure 5, il apparaît que le PS3 à la concentration de l01.tg/ml n'a aucune action lorsqu'il est incubé avant l'infection, qu'il est le plus efficace quand il est présent tout au long de l'expérience et qu'il a une action lorsqu'il est mis en oeuvre pendant et après l'infection. Toujours à la concentration de 10 g/ml, sa supériorité par rapport à l'AZT apparaît clairement. Il a également été procédé à un certain nombre d'expériences supplémentaires en vue d'étudier l'action inhibitrice directe du PS3 sur la RT des 15 virus RW92009, UG92029P, PIC CH et NDK. A cet effet, on a mesuré l'activité RT des quatre souches de virus qui viennent d'être identifiées et mises en présence du PS3, ainsi que dans certains cas, du sulfate de dextran à titre de produit de comparaison. Pour effectuer ces mesures, on a procédé de la manière décrite de façon 20 détaillée dans ce qui précède. Les résultats enregistrés à l'issue de ces mesures ont été reportés sur des graphiques qui sont montrés aux figures 6 à 9 ; sur ces graphiques, l'axe des ordonnées correspond au pourcentage d'inhibition de l'activité RT (cette activité est exprimée en dpm/rnl) mesurée pour différentes concentrations en PS3 ou en 25 sulfate de dex:tran qui sont indiquées sur l'axe des abscisses, ces concentrations étant exprimées en g/ml. Pour le virus RW92009, on a utilisé une concentration virale correspondant à une activité RT de 75 000 dpm ; les résultats obtenus apparaissent sur le graphique de la figure 6 à l'examen duquel on constate que le PS3 à la 30 concentration de 1,5 g/ml provoque une inhibition de la RT de 45%.

Pour le virus UG92029, on a utilisé une concentration virale correspondant à une activité RT de 220 000 dpm ; les résultats obtenus apparaissent sur le graphique de la figure 7 dont l'examen montre que le PS3 à la concentration de 2,5 g/ml provoque une inhibition de la RT de 35%, alors que le sulfate de dextran n'inhibe la RT que de 6% à la même concentration. On note par ailleurs qu'à la concentration de 3 gg/ml on obtient une inhibition de 74% pour le PS3 contre 8% pour le sulfate de dextran. Pour le virus PIC CH, on a utilisé une concentration virale correspondant à une activité RT de 105 000 dpm ; les résultats obtenus apparaissent sur le graphique de la figure 8 ; à l'examen de ce graphique, on constate que le PS3 à la concentration de 0,6 g/ml provoque une inhibition de la RT de 46% , alors que le sulfate de dextran ne provoque aucune inhibition à la même concentration ; à la concentration de 0,8 gg/ml, on obtient une inhibition de 65% dans le cas du PS3, alors que le sulfate de dextran ne provoque toujours aucune inhibition. Pour le virus NDK, on a utilisé une concentration virale correspondant à une activité RT de 81 000 dpm ; les résultats obtenus apparaissent sur le graphique de la figure 9 dont l'examen montre qu'à la concentration de 0,6 gg/ml, le PS3 provoque une inhibition de la RT de 43% contre seulement 11% dans le cas du sulfate de dextran ; à la concentration de 0,8 gg/ml on obtient respectivement une inhibition de 57% dans le cas du PS3 contre 18% dans le cas du sulfate de dextran. Les résultats des expériences illustrées par les figures 6 à 9 permettent de confirmer que le PS3 est un inhibiteur de la RT sur diverses souches de VIH, ce qui traduit l'inhibition précoce du cycle de réplication de ces souches. Le PS3 est particulièrement efficace sur la RT du virus PIC CH (clade B) qui est résistant à plusieurs agents antiviraux, ainsi que sur le virus NDK (clade D). Concernant les polysaccharides sulfatés et plus particulièrement la laminarine sulfatée utilisée conformément à l'invention pour la préparation d'un médicament destiné aux traitements contre les rétrovirus, on a également montré que son activité anticoagulante est suffisamment faible comparée à celle de l'héparine pour ne pas constituer un inconvénient dans le cadre de l'utilisation conforme à l'invention et qu'elle n'est pas cytotoxique aux concentrations les plus élevées susceptibles d'être mises en oeuvre.

L'activité anticoagulante du sulfate de laminarine en fonction de sa concentration a été déterminée en comparaison avec celle de l'héparine dans les tests de coagulations classiques APTT ou Aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit , de la durée de prothrombine, du test dit HEPTEST et de la durée de thrombine. L'APTT reflète une interaction avec le système intrinsèque de la coagulation alors que la durée de prothrombine reflète une interaction avec la coagulation extrinsèque ; le test dit HEPTEST est le test classique pour la mesure de l'activité inhibitrice de l'héparine à l'égard du facteur Xa et la durée de thrombine correspond à la dernière étape de la coagulation à savoir la formation de fibrines induites par la thrombine. Au contraire de celle de l'héparine, l'activité du sulfate de laminarine dans le test dit HEPTEST est plus de 20 fois plus faible. De même, en rapport avec la durée de prothrombine le sulfate de laminarine ne fait preuve d'aucun effet prononcé anticoagulant, comme dans le cas de l'héparine. L'activité spécifique (IU/mg) dans 1APTT représente 30% de l'activité de l'héparine et dans le cas de la durée de thrombine 60%. Pour empêcher totalement la coagulation, il convient d'appliquer dans le cas de LAPTT une concentration 4 fois plus grande et dans le cas de la durée de thrombine une concentration :20 fois plus élevée. Dans les tests spécifiques anti-facteur Xa et anti-thrombine en utilisant des substrats chromogènes on constate que le sulfate de laminarine au contraire de l'héparine ne présente ni une activité significative anti-facteur Xa dépendant de l'anti-thrombine ni une activité anti-thrombine. L'effet dans le cas de la durée de thrombine peut être considéré comme étant dû à une inhibition de thrombine dépendant du cofacteur II héparine. En raison d'une part de l'activité spécifique plus faible, d'autre part du profil dépendant de la concentration et d'autre part encore d'autres recherches relatives au mécanisme d'action, il est possible de considérer que dans le cas du sulfate de laminarine, le risque de saignement est sensiblement plus faible que dans le cas de l'héparine. Il s'ensuit que les propriétés inhibitrices de la RT du sulfate de laminarine pourront être avantageusement mises à profit sans crainte d'effets secondaires indésirables sur la coagulation. On a également déterminé la cytotoxicité in vitro du polysaccharide sulfaté simultanément à celle d'un produit de comparaison. Pour ce faire, des cellules CEM sontcultivées en plaque de 24 puits dans 1 ml de RPMI supplémenté par 10 % de sérum et veau foetal, 1 % de Penicilline- Streptomycine, 2mM de glutamine, 2 g/ml de polybrène et différentes concentrations de polysaccharide sulfaté PS3 et du produit de comparaison constitué par le sulfate de dextran. Les concentrations testées sont au nombre de quatre : 125 g/ml, 250 g/ml, 500 g/ml et 1000 g/ml.

La plus faible de ces concentrations est déjà très supérieure à la concentration de 10 g/ml dont l'efficacité a été montrée par les expériences qui précèdent. Tous les tests ont été réalisés en double. Les cellules sont comptées tous les jours et l'augmentation de leur nombre est comparée à celle d'une culture témoin constituée par des cellules CEM cultivées en l'absence de polysaccharide sulfaté ou de sulfate de dextran (Ogg/ml). Dans le Tableau E, on a réuni les résultats enregistrés aux premier, deuxième et troisième jours de l'expérience, c'est-à-dire le nombre de cellules dénombrées dans chaque culture.25 TABLEAU E Jour 1 Nombre de cellules CEM (x 106/ml) en présence de PS3 ou sulfate de dextran Concentration ( g/ml) PS3 Sulfate de dextran 1000 0,8 0,5 0,8 0,5 500 1 0,7 1 0,3 250 0,7 0,7 0,5 0,9 125 _ 0,6 0,5 0,5 0,9 Témoin - Absence d'agent 0,9 _ 0,9 _ antirétrovial 0,4 0,4 Jour 2 Nombre de cellules CEM (x 106/ml) en présence de PS3 ou sulfate de dextran Concentration ( g/ml) PS3 Sulfate de dextran 1000 1,3 1 1,3 1,7 500 1,4 1,5 1,3 1,7 250 1,2 1,4 1,3 1,4 125 0,9 1,1 1,5 1 Témoin - Absence d'agent 1,3 1,2 1,3 1,2 antirétrovial Jour 3 Nombre de cellules CEM (x 106/ml) en présence de PS3 ou sulfate de dextran Concentration ( g/ml) PS3 Sulfate de dextran 1000 2,4 2,8 2 2,7 500 3,2 2,3 2,1 1,5 250 2,4 2,2 1,9 1,9 125 2,4 2,3 2,3 2,1 Témoin - Absence d'agent 2,4 2 2,4 2 antirétrovial A la lumière de ces résultats réunis au Tableau E, il apparaît que le PS3, tout comme le sulfate de dextran ne présentent aucune cytotoxicité jusqu'à de très fortes concentrations, en l'occurrence 1 mg/ml. On a également recherché une éventuelle toxicité in vivo du polysaccharide sulfaté utilisé conformément à l'invention. Cette étude a été réalisée sur des lapins blancs de race New Zealand et sur des rats de race Sprague Dawley. Les lapins blancs ont été soumis d'une part au test d'irritation oculaire et d'autre part au test d'irritation cutanée primaire.

A l'issue du premier de ces tests il a été conclu à une action légèrement irritante et dans le deuxième à une action non irritante. Les rats ont été soumis d'une part à une étude de détermination de la toxicité dermique aigue et d'autre part à une étude de détermination de la toxicité orale aigue.

Dans le premier cas, la dose léthale dermique 50 est supérieure à 2 g/kg de poids du corps ce qui permet d'affirmer que le produit n'est pas toxique. Dans le deuxième cas, la toxicité aigue par voie orale peut être considérée comme supérieure à 2 g/kg de poids du corps ce qui permet, à nouveau, de classer le produit comme non toxique.

Les expériences qui ont permis d'aboutir à ces conclusions ont été réalisées sous la direction du Docteur R. SHRIVASTAVA au Service de Toxicologie de l'établissement dénommé Elevage Scientifique des Dombes (ESD) ROMANS 01400 CHATILLON SUR CHALARONNE

en respectant les lignes directrices de l'OCDE n 404 et 405 du 24 février 1987 pour autant qu'il s'agit des études effectuées sur les lapins blancs et les lignes directrices de l'OCDE n 401 est 402 (1987) ainsi que la directive CEE B-1 92/69 (1992) pour autant qu'il s'agit des études effectuées sur les rats Sprague Dawley.

La laminarine sulfatée testée provenait du lot PS3 8/2001 fourni par les Laboratoires Goëmar. Les rapports correspondants sont conservés dans les archives de la Société Demanderesse.

Suivant un mode de réalisation avantageux, le polysaccharide de formule I, plus particulièrement le polysaccharide sulfaté de formule I et, de préférence, la laminarine sulfatée et les oligosaccharides de degré de polymérisation de 11 à 28 obtenus à partir de la laminarine sulfatée sont utilisés pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus essentiellement par voie générale et de préférence par les voies orale, rectale, pulmonaire topique (incluant les voies transdermale, buccale et sublinguale) et parentérale (incluant les voies sous-cutanées :intramusculaire, intraveineuse, intra-dermale et intra-vitréale). La dose quotidienne est généralement de 0,01 à 250 mg par kilo de poids du patient et préférentiellement de 0,10 à 100 mg, plus préférentiellement encore de 0,5 à 30 mg, et tout particulièrement de 1,0 à 20 mg. Ces doses quotidiennes s'appliquent notamment dans le cas du sulfate de laminarine ; pour les autres sels et esters selon la formule I, les doses quotidiennes sont adaptées à chaque cas. La dose quotidienne peut être administrée par dose unitaire en une, deux, trois, quatre, cinq ou six fois ou plus à différents moments de la journée. Les doses unitaires peuvent comporter de 10 à 1000 mg, de 50 à 400 mg, et, préférentiellement, de 50 à 100 mg de substance active. Les médicaments obtenus, conformément à l'invention, en utilisant au moins un des polysaccharides de fonnule I, comportent les ingrédients de formulation classiques et éventuellement un ou plusieurs autres agents thérapeutiques. A titre d'exemples non limitatifs, correspondant à des modes de réalisation avantageux, on indique ci-après quelques formulations pharmaceutiques à base du médicament obtenu conformément à l'invention.30 ù Composition d'une crème

Eau déminéralisée 69,7% Glycérine 5,0% Sulfate de laminarine 1,0% PEG 100 stéarate 4,0% Alcool cétéarylique 2,0% Conservateur 1,0% PEG 40 stéarate 3,0% Acétate de vitamine E 0,5% C ù 12-15 alkyl benzoate 6,5% Caprylic/capric triglycerides 5,5% NaOH 0,1 N 1,8% 100%

Il est possible de prévoir 2 à 5 applications par jour. 20 2 ù Composition d'une solution pour aérosol

Sulfate de laminarine 2,5% Chlorure de sodium 9,0% Eau déminéralisée Pharmacopée Européenne 88,5% Il est possible d'administrer par jour une quantité d'aérosol correspondant à une quantité de 1000 à 10 000 gg de substance active. 36 25 30 3 ù Composition d'un suppositoire 5,0% Sel de potassium de sulfate d'oligo 1-3 glucan 95,0% Glycérines hémisynthétiques solides 10 Il est conseillé d'en administrer 1 ou 2 par jour. 5,0% 4 ù Composition d'une solution injectable Sel de sodium de sulfate d'oligolaminaritol (DP20) Bicarbonate de sodium 3,0% Eau ppi 92, 0% 15 Sur une durée de 24 heures il est possible d'administrer de 1000 à 3000 ml de la solution injectable. 5 ù Composition d'une solution vaginale (flacon unidose de 140 ml avec canule) 20 Sel de sodium de sulfate d'oligo (3 1-3 glucan (DP22) 0,1% Chlorure de sodium 9,0% Alcool éthylique à 95 5,0% Arôme rose 0,2% Eau purifiée 84,7% 25 Conservateurs (chlorure de benzalkonium) 0,2% Edétate de sodium 0,3% Polysorbate 20 0,5% 100% Il est possible de faire une ou deux applications par jour.

30 Au vu de l'ensemble des résultats expérimentaux décrits dans ce qui précède, il est possible de conclure que les polysaccharides de formule I et pour le moins les polysaccharides sulfatés de formule I et tout particulièrement la laminarine sulfatée présentent une activité anti-rétrovirale importante sur le cycle de réplication du VIH. Le moment de mise en oeuvre auquel le polysaccharide sulfaté est efficace démontre une action spécifique sur les événements précoces du cycle de réplication du virus. Aucune toxicité sur les cellules n'a été constatée aux doses inhibitrices 10 testées et même à 1 mg/ml. Les résultats obtenus avec le lot G 903 et exposés plus haut ont été confirmés par ceux obtenus avec d'autres lots, notamment le lot C 090701. L'absence de toxicité du sulfate de laminarine, même à 1 mg/ml sur les cellules CEM témoigne d'un indice thérapeutique supérieur à 200.

15 L'activité anti-rétrovirale des polysaccharides de formule I, notamment celle de la laminarine sulfatée, est non seulement meilleure que celle des produits précédemment utilisés, mais, de plus, elle s'exerce même sur des virus résistant à des inhibiteurs connus de la RT, s'agissant du virus PIC CH qui est résistant au d4T et au Zérit et du virus RTMC qui est résistant à l'AZT.

20 Les polysaccharides de formule I, et notamment les polysaccharides sulfatés de formule I, et tout particulièrement la laminarine sulfatée, inhibent la RT des virus isolés.

Claims (9)

1. REVENDICATIONS

   , 1. Utilisation pour la préparation d'un médicament pour les traitements contre les rétrovirus, plus particulièrement contre les lentivirus ainsi que les oncovirus, et notamment contre les VIH, y compris des souches de ces rétrovirus qui sont résistantes aux agents anti-rétroviraux déjà connus, d'un polysaccharide de formule dans laquelle RI et R2 peuvent être soit identiques et représentent alors un groupement sulfate ou phosphate, soit différents l'un de l'autre, RI représentant alors une unité glucose sulfatée ou phosphatée liée, de préférence, par une liaison f3 de type (3--1,6 à la structure saccharidique, X et/ou Y représentant un groupement mannitol et n un nombre entier de 11 à 30, plus particulièrement de 25 à 30, ce médicament agissant sur le cycle de réplication desdits rétrovirus par inhibition de la RT de ces derniers.
2. 2. Utilisation selon la revendication 1 au titre de polysaccharide de formule I de la laminarine sulfatée ayant un degré de sulfatation supérieur à 2 et de préférence (le 2,2 à 2,4.
3. 3. Utilisation selon la revendication 1 au titre de polysaccharide de formule I du phosphate de laminarine ayant un degré de phosphatation supérieur à 1 et de préférence de 1,5 à 2,5. (I) X20
4. 4. Utilisation selon la revendication 1 au titre de polysaccharide de formule I d'un oligosaccharide, obtenu à partir de la laminarine sulfatée de degré de sulfatation supérieur à 2 et de préférence de 2,2 à 2,4, le degré de polymérisation de cet oligosaccharide étant de I l à 28.
5. 5. Utilisation selon la revendication 1 au titre de polysaccharide de formule I d'un oligosaccharide obtenu à partir du phosphate de laminarine de degré de phosphatation supérieur à 1 et de préférence de 1, 5 à 2,5, le degré de polymérisation de cet oligosaccharide étant de 11 à 28.
6. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5 d'un polysaccharide de formule I pour la préparation d'un médicament permettant de traiter le syndrome de l'immunodéficience acquise ou SIDA chez l'homme. 15
7. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5 d'un polysaccharide de formule I pour la préparation d'un médicament permettant de traiter les cancers associés aux oncovirus.
8. 8. Utilisation pour la préparation d'un médicament pour les 20 traitements contre les rétrovirus, plus particulièrement contre les lentivirus, et notamment contre les VIH ainsi que contre les pathogénies associées, -d'un polysaccharide de formule I dans laquelle RI et R2 peuvent être soit identiques et représentent alors un groupement sulfate ou phosphate, soit différents l'un de l'autre, RI représentant alors une unité glucose sulfatée ou 25 phosphatée liée, de préférence, par une liaison (3 de type R-1,6 à la structure saccharidique, X et/ou Y représentant un groupement mannitol et n un nombre entier de 1l à 30, plus particulièrement de 25 à 30, notamment de la laminarine sulfatée de degré de sulfatation supérieur à 2, de préférence de 2,2 à 2,4, ou du phosphate de laminarine de degré de phosphatation supérieur à 1 et de préférence 30 de 1,5 à 2,5, - d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant : 10• les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INRT), dont notamment l'AZT, le ddI, le ddC, le d4T, le 3TC et le ABC, • les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva, • les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra, • les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon), • les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement d'au moins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents antihyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents pour traitements 15 dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques.
9. 9. Composition pharmacologique comprenant au titre de substance active une quantité efficace - d'un polysaccharide de formule I dans laquelle RI et R2 peuvent être soit 20 identiques et représentent alors un groupement sulfate ou phosphate, soit différents l'un de l'autre, RI représentant alors une unité glucose sulfatée ou phosphatée liée, de préférence, par une liaison 13 de type 13-1,6 à la structure saccharidique, X et/ou Y représentant un groupement mannitol et n un nombre entier de 11 à. 30, plus particulièrement de 25 à 30, notamment de laminarine 25 sulfatée de degré de sulfatation supérieur à 2, de préférence de 2,2 à 2,4, ou de phosphate de laminarine de degré de phosphatation supérieur à 1 et de préférence de 1,5 à 2,5. - d'au moins un agent antirétroviral choisi dans le groupe comprenant : • les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INRT), 30 dont notamment l'AZT, le ddI, le ddC, le d4T, le 3TC et le ABC, 10• les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), dont notamment le Viramune et le Sustiva, • les inhibiteurs de la protéase, dont notamment l'Agénérase et le Kaletra, • les inhibiteurs de la fusion, dont notamment l'enfuvirtide (Fuzeon), • les inhibiteurs d'entrée, dont notamment l'AMD-3100 et, éventuellement - d'au rnoins un agent pharmacologique choisi dans le groupe comprenant 10 les agents anti-nauséeux, les agents anti-diarrhéiques, les agents anti- hyperbilirubinémie, les agents anti-douleurs, les agents pour traitements dermatologiques, les agents anti-néphrotoxiques.