KR101926871B1 - 인체면역결핍바이러스의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

인체면역결핍바이러스의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체면역결핍바이러스의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 키토산 올리고당과 아미노산이 결합된 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는 인체면역결핍바이러스의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 신규 화합물은 숙주-바이러스 막간의 상호작용을 방해하여 HIV 초기 감염을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, HIV의 역전사효소 및 프로테아제(protease) 억제 활성을 통해 우수한 항-HIV 효과를 가진다. 따라서 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 우수한 HIV 예방 또는 치료/개선 효과를 나타낼 수 있어 기능성 의약품 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 신규 화합물은 천연 유래의 키토산올리고당에 아미노산 또는 디펩티드를 결합하여 합성한 결합체로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

인체면역결핍바이러스의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Prevention or Treatment of Human Immunodeficiency Virus}
본 발명은 인체면역결핍바이러스의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 키토산 올리고당과 아미노산/또는 디펩티드가 결합된 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는 인체면역결핍바이러스의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 건강기능식품에 관한 것이다.
HIV(Human Immunodeficiency Virus)는 1981년 최초의 AIDS 환자가 보고된 후, 1984년 AIDS 환자로부터 AIDS 바이러스인 HIV를 분리함으로써 HIV가 AIDS의 중요한 병원인으로 확인되었다.
HIV는 분류학상 레트로바이러스에 속하며, 그 중에서도 렌티바이러스 (lentivirus) 그룹으로 세분되어진다. HIV 입자는 직경이 10 마이크론 정도로서 외부는 일반 세포막과 같이 인지질(phospholipid)로 싸여 있고, 내부에는 RNA로 된 바이러스 게놈 2개가 단백질 주머니(capsid, core protein) 안에 보호되어 있다. 이러한 HIV 게놈은 10개의 유전자로 구성되어 있는데, 이는 게놈 전체 크기에 비해 많은 유전자를 가지고 있는 편이다.
HIV 감염은 바이러스 표면에 있는 표피 단백질(envelop protein: gp120)과 표적세포 표면에 있는 수용체가 접합됨으로써 이루어진다. 이 수용체는 CD4 항원으로 불리는 세포 표면 단백질 분자로서, 세포 표면에 이 CD4 항원을 많이 포함하고 있는 CD4 세포(helper T cell)나 마크로파지가 HIV의 주요 표적이 되는 원인이다. 이 바이러스와 세포의 접합에 의해 바이러스의 인지질 껍질은 세포 표면에 융합되고, 바이러스의 게놈과 핵 단백질은 세포 안으로 들어가게 된다. 이때, 바이러스 게놈은 바이러스 입자에 있던 역전사 효소에 의해 RNA에서 DNA로 바뀐 후, 세포핵 내로 운송되어 숙주세포의 게놈 속으로 삽입된다. 이 과정은 레트로바이러스만 가지는 특성 중의 하나이다. HIV는 숙주 세포 내 가장 안전한 곳에 이렇게 은신하면서 생장에 필요한 모든 기작과 자원을 세포로부터 지원받는다. 또한 상황과 조건에 따라 증식을 억제 또는 촉진하면서 면역체 등으로부터 자신을 보호하며 생존한다.
AIDS 바이러스는 크게 HIV-1과 HIV-2의 두 종류로 나뉜다. HIV-1은 한국을 포함한 여러 국가의 환자들에게서 발견되므로 AIDS 바이러스의 대명사로 불린다. HIV-2는 서아프리카 지역 환자들에게 주로 발견되며, 게놈의 염기배열이 HIV-1과는 55% 정도만 동일하고, 원숭이 AIDS 바이러스인 SIV(Simian Immunodeficiency Virus)와 오히려 더 유사하다. HIV-2의 독성은 HIV-1보다 대체로 약하다고 알려져 있다. HIV는 유전적으로 뿐만 아니라 생물학적으로도 매우 다양하다. 여러 AIDS 환자들에게서 분리해 낸 HIV의 염기서열이 각각 다른 것은 물론, 동일한 환자에게 채취한 것이라도 병의 진행 상태에 따라 바이러스의 염기서열이 서로 다르다. 심지어는, 바이러스를 일정한 시간에 동일한 환자로부터 분리할 경우, 조직부위에 따라 염기서열이 다른 바이러스가 검출된다. 이렇게 다양한 염기서열은 바이러스의 다양한 생물학적 특성을 결정짓는데 많은 연관이 있다. 염기서열이 다른 바이러스마다 특정 세포에 대한 감염 선호성, 증식율, 바이러스 생산 정도, 세포에 대한 독성, 다핵거대세포 형성율, 잠복기와 활성유기, 중화항체에 대한 민감도 등이 각각 다르다. 이렇게 다양한 생물학적 특성과 AIDS 발병과의 연관성에 대한 현재까지의 연구결과에 따르면, 초기 환자에게서 분리된 바이러스는 대개 다핵거대세포를 형성하지 않으며(NSI; Nonsyncytia-Inducing), 마크로파지를 선호해서 감염한다. 그러나 AIDS 말기로 진행될수록 다핵 거대세포 형성 능력(SI; Syncytia-Inducing)이 증가하고, 마크로파지 대신 헬퍼 T 세포를 선호해서 감염하는 바이러스로 변한다. 이는 HIV의 생물학적 특성과 병 발생은 무관하지 않다는 것을 시사한다.
HIV에 감염된 후 1주일 정도에 바이러스의 증식이 왕성해져 환자의 혈액에서 쉽게 바이러스가 검출될 수 있다. 이 단계를 바이러스혈증(viremia)이라고 한다. 이 바이러스는 1~2주일 내에 분리가 어려울 정도로 급격히 감소된다. 이런 잠복기 상태를 상당기간 유지하다가 AIDS로 진행되면서 다시 바이러스 증식이 활발해져서 바이러스 혈증 상태로 된다. 최근 폴리머라제 연쇄중합반응을 이용한 연구 결과, 잠복기 중에서도 계속해서 바이러스가 만들어진다는 보고가 있어 주목받고 있다. CD4 세포는 처음 바이러스혈증 기간 중에 갑자기 그 숫자가 줄었다가, 바이러스 증식이 줄어들면서 다시 일정치로 회복하게 된다(건강한 사람: 500-1000 CD4 cells/㎣). 이후 여러 해에 걸쳐 CD4 세포가 서서히 감소하여 혈액 1㎣ 당 200개 이하로 떨어지게 되면 ARC(AIDS-related Complex)나 AIDS로 진행된다. AIDS 환자에게는 기회성 감염의 확률이 높아져서 주폐포자층(Pneumocysitis carinii) 폐렴 등에 걸려 죽게 된다. 감염초기 증식이 증가되었던 HIV가 급속히 감소되는 시기와 CD8 세포가 증가하는 시기가 일치하는데, CD8 T 세포는 세포의 생장을 억제시키거나 바이러스에 감염된 세포를 선별해서 죽이는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 초기 감염된 바이러스에 대해서는 CD8 세포가 중요한 면역효과를 나타내는 것으로 보여진다. 항체는 시기적으로 바이러스가 감소된 이후에 생성된다. 감염 초기부터 AIDS 발병까지 계속해서 CD8 세포와 항체 등이 존재하지만 이미 그 기능을 잃었거나 변질되었고, 심지어는 바이러스 감염을 오히려 촉진시키기도 한다. 감염 초기 항바이러스 효과가 분명히 있었던 면역체계가 어떻게 그 기능을 잃게 되는가는 아직도 풀어야할 숙제이다. 인간에게만 발병되는 AIDS의 특수성 때문에 HIV의 발병원인에 대한 이해는 지극히 초보적인 단계라 할 수 있다. CD4 세포의 감소가 면역결핍증을 일으키는 직접적인 원인이 된다는 것에는 학자들 모두가 공감하나, HIV가 CD4 세포를 어떻게 감소시키는가에는 많은 이견이 있다. 그 감소에 대한 설명으로 다핵거대세포 형성, 삽입되지 않은 바이러스 DNA의 축적, 숙주세포막 구조에 영향, 프로그램된 세포사멸을 유기, 감염세포로부터 독성물질의 분비, 자기면역에 의한 세포파괴 등 많은 이론들이 제시되어 있다. 그러나 생체 내에서 실제로 일어나는 사실로 증명된 것은 아직 아무것도 없다. 원숭이와 원숭이 AIDS 바이러스 SIV를 이용하여 HIV 병발생 과정에 대해 많은 연구가 진행되고 있지만 괄목할 만한 새로운 발견은 없다.
현재 가장 널리 사용되고 있는 AIDS 치료제로는 HIV 역전사효소의 기능을 억제하는 AZT(Zidovudine)가 있으며, 그 효과에 대해서도 가장 많이 연구되어 있다. 그러나 AZT를 감염 초기에 사용할 경우, 임상상태를 어느 정도 호전시키기는 하였으나, 환자의 생명을 연장시키는데는 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 즉, 골수에 독성을 미치는 등의 부작용이 있고, 장기간 사용시 내성을 갖춘 바이러스가 출현하는 등 AIDS 치료제로서의 한계성이 드러났다. AZT와 같은 기능의 약으로서 FDA의 승인을 받은 DDI, DDC, d4T 등도 역시 내성 바이러스가 생겼으나, 독성은 AZT보다 덜한 것으로 나타났다.
이외에도 바이러스 생장을 억제하기 위해 많은 방법들이 개발되어 효능을 검증 중에 있다. 예를 들어, 바이러스가 세포에 접합하는 것을 억제하는 방법, 바이러스에 감염된 세포만 선별해서 죽이는 방법, 바이러스 생장에 중요한 효소기능을 억제하는 약(예를 들어, 프로테아제, 인테그라제, tat 저해제, rev 저해제)을 사용하는 방법, 사이토카인을 이용한 치료법, CD8 세포를 주입하는 법, 유전자 치료법 등이다. HIV의 백신 개발에도 많은 진전이 있었다. 죽은 바이러스 또는 살아있지만 병발생 능력을 없앤 바이러스(attenuated virus)를 사용하는 방법, 유전공학적 방법을 이용하여 바이러스의 특정 단백질을 발현시킨 후 이를 사용하는 방법(subunit vaccine), 항이디오타입 항체, DNA 유전자를 직접 주사하는 법 등 매우 다양하게 개발되고 있다. 그러나 백신 개발의 근본적인 문제점은 바이러스가 지나치게 다양하다는 것에 있다. 예를 들면 예방 접종 후, 백신 개발을 위해 사용하였던 원래의 바이러스를 사용하여 도전시키면 항체에 의해 바이러스의 생장이 억제되나, 환자에게서 새롭게 채취한 감염세포나 바이러스로 도전시킬 때는 전혀 억제하지 못하였다. 이러한 바이러스의 다양성을 극복해야 하는 것이 숙제로 남아 있다.
따라서 상기한 AIDS 치료제의 부작용 및 내성 바이러스의 출현 등과 같은 문제점을 극복하여 대체할 수 있는 AIDS 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 키틴(chitin), 키토산(chitosan)은 천연에 존재하는 다당류 고분자 물질로서 최근에 신기능성 소재로서 주목을 받고 있는 재료이다. 키틴의 화학적 구조는 셀룰로우즈의 글루코피라노즈 C-2 위치의 -OH기 대신 N-아세틸아마이드(-NHCOCH3)기가 치환되어 있는 N-아세틸글루코사민(β-1,4 결합)이 무수히 결합된 다당류의 고분자로서 키틴의 아세틸기를 탈아세틸화시킨 것을 키토산이라 한다.
키토산은 새우 및 게 등의 갑각류로부터 산출되는 매우 유용한 생체물질로 그 화학명은 (1→4)2-아미노-2-데옥시-β-D-글루코사민으로 불려진다. 이러한 키토산은 그 자체로서 혈중 콜레스테롤 감소 및 지방 흡수 저해 효과, 항암 효과, 면역력 강화 효과, 항당뇨 효과, 상처치료 효과 및 항균 활성 등의 다양한 생리 활성을 갖고 있으며, 특히 구강, 비강 및 장강 등의 점액질 층에 결합하여 약물의 흡수를 촉진시키는 효과를 나타내기 때문에 단백질 약물이나 난흡수성 약물의 경구 및 여러 제형에 있어서 흡수 촉진제로의 응용도 활발하게 연구되고 있다.
특히, 키토산올리고당 (Chitooligosaccharides; COS)(이하 ‘COS'로 칭함)은 키토산 유도체 (글루코사민 단위(unit)를 포함하는 다가 양이온 중합체)이며, 키토산의 화학적 또는 효소적 가수분해를 통해 생성될 수 있다. COS는 무독성이며, 높은 가용성 성분으로 항균, 항암, 항산화, 안지오텐신-전환 효소 억제 및 면역증진 효과를 포함하는 다양한 생리활성을 나타내므로, 현재 의학 및 약학 분야에서 많은 관심을 받고 있다.
이에 본 발명자들은 천연물질로부터 유래되어 인체에 안정하면서도, 탁월한 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있는 소재를 찾고자 모색하던 중, 키토산올리고당(COS)에 주목하여 키토산올리고당과 아미노산/또는 디펩티드가 결합된 신규 화합물(결합체)을 합성하였으며, 이들의 항-HIV 활성을 실험하였다. 그 결과 본 발명의 신규 화합물(결합체)이 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해에 의한 HIV 감염 억제 활성을 가질 뿐만 아니라, HIV의 역전사효소 및 프로테아제(protease) 억제 활성을 통해 우수한 항-HIV 효과를 가진다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2007-0013747호
따라서 본 발명의 목적은 인체에 안정하면서 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 치료에 효과적인 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인체에 안정하면서 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 치료에 효과적인 HIV 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인체에 안정하면서 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 개선에 효과적인 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure 112012082663338-pat00001
상기 식에서,
x는 하기 표의 구조식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
Figure 112012082663338-pat00002
n은 2 내지 6의 정수이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 x가 구조식 1 또는 구조식 5인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 HIV의 역전사효소 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 x가 구조식 3 또는 구조식 4인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해에 의한 HIV 감염 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 가질 수 있다.
또한 본 발명은 상기 x가 구조식 2인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 HIV의 프로테아제(protease) 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 x가 구조식 6 내지 8 중 선택된 1종인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 HIV의 역전사효소 억제 활성 및 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해에 의한 HIV 감염 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 조성물에 0.01 내지 10 mg/ml의 농도로 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 HIV 억제제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 x가 구조식 1 또는 구조식 5인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 HIV의 역전사효소 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 x가 구조식 3 또는 구조식 4인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해에 의한 HIV 감염 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 x가 구조식 2인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 HIV의 프로테아제(protease) 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 x가 구조식 6 내지 8 중 선택된 1종인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 HIV의 역전사효소 억제 활성 및 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해에 의한 HIV 감염 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 떡류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 주류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 신규 화합물은 숙주-바이러스 막간의 상호작용을 방해하여 HIV 초기 감염을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, HIV의 역전사효소 및 프로테아제(protease) 억제 활성을 통해 우수한 항-HIV 효과를 가진다. 따라서 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 우수한 HIV 예방 또는 치료/개선 효과를 나타낼 수 있어 기능성 의약품 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 신규 화합물은 천연 유래의 키토산올리고당에 아미노산 또는 디펩티드를 결합하여 합성한 결합체로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.
도 1은 아미노산 20종의 구조, 특징 및 약어를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 키토산 올리고머-아미노산 결합체의 결합 메커니즘을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 COS-D의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다(NMR solvent: DMSO-d6).
도 4는 본 발명의 COS-D의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다(NMR solvent: DMSO-d6).
도 5는 본 발명의 COS-E의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 COS-E의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 COS-N의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 COS-N의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 COS-T의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 COS-T의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 COS-Y의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 COS-Y의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 COS-TD의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 COS-TD의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 COS-TY의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 COS-TY의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 17은 C8166 세포주에 본 발명의 키토산 올리고머-아미노산 결합체 20종을 각각 전처리(0.5mg/ml)하고 HIV-1IIIB로 감염시킨 후 시간경과에 따른 세포생존율을 측정한 그래프이다.
도 18 및 도 19는 C8166 세포주에 본 발명의 키토산 올리고머-아미노산 결합체 20종을 각각 전처리(0.5mg/ml)하고 HIV-1RF로 감염시킨 후 합포체 형성 정도를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 20은 C8166 세포주에 본 발명의 키토산 올리고머-아미노산 결합체 6종(COS-D, COS-E, COS-G, COS-N, COS-T, COS-Y)) 및 키토산 올리고머-디펩티드 결합체 2종(COS-TD, COS-TY)을 각각 전처리(0.5mg/ml)하고 HIV-1IIIB로 감염시킨 후 시간경과에 따른 세포생존율을 측정한 그래프이다.
도 21은 C8166 세포주에 본 발명의 키토산 올리고머-디펩티드 결합체 2종을 각각 전처리(0.5mg/ml)하고 HIV-1RF로 감염시킨 후 합포체 형성 정도를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 22는 C8166 세포주에 본 발명 7종의 결합체(COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY) 각각을 전처리(0.5mg/ml)하고 HIV-1RF로 감염시킨 후 2일이 경과한 시점에서 형성된 합포체 수를 나타낸 그래프이다.
도 23은 본 발명 7종의 결합체(COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY) 각각의 HIV-1 역전사효소 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 24는 본 발명 7종의 결합체(COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY) 각각의 HIV-1 프로테아제(protease) 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 25는 saquinavir 저항성 세포주인 HIV-1saq에서 본 발명 7종의 결합체(COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY) 각각의 HIV-1 프로테아제(protease) 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 26은 본 발명 COS-D의 다양한 농도(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml)에서의 HIV-1 역전사효소 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 27은 본 발명 COS-Y의 다양한 농도(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml)에서의 HIV-1 역전사효소 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 28은 본 발명 COS-N의 농도별(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/ml) 처리에 따른 합포체 형성 억제율(% of control)을 나타낸 그래프이다.
도 29는 본 발명 COS-T의 농도별(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/ml) 처리에 따른 합포체 형성 억제율(% of control)을 나타낸 그래프이다.
도 30은 본 발명 COS-E의 다양한 농도(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml)에서의 HIV-1 프로테아제(protease) 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 31은 HIV-1IIIB로 감염된 H9 세포에 본 발명의 COS-E를 농도별로 처리한 다음 5일 동안 인큐베이션시킨 후 세포 상청액에 존재하는 p24 생성량 억제 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 32는 감염되지 않은 C8166 세포주 및 HIV-1IIIB이 감염된 H9 세포의 공배양법에서 본 발명 COS-TD의 농도별(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/ml) 처리에 따른 합포체 형성 억제율(% of control)을 나타낸 그래프이다.
도 33은 감염되지 않은 C8166 세포주 및 HIV-1IIIB이 감염된 H9 세포의 공배양에서 본 발명 COS-TY의 농도별(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/ml) 처리에 따른 합포체 형성 억제율(% of control)을 나타낸 그래프이다.
도 34는 본 발명 COS-TD 및 COS-TY 각각의 농도별(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml) 처리에 따른 세포내 p24 단백질 양을 웨스턴 블랏법을 통해 측정한 것이다.
도 35는 본 발명 COS-TD 및 COS-TY 각각의 농도별(0.05, 0.1, 0.5, 1mg/ml) 처리에 따른 HIV-1 유전자(Vif, Env, Gag) 발현양을 RT-PCR을 통해 측정한 것이다.
도 36은 8E5 및 MOLT-4 세포주 공배양에서 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY를 각각 처리(0.5mg/ml)한 후 시간 경과에 따른 합포체 형성 수를 나타낸 그래프이다.
도 37은 CEM-SS 세포를 HIV-1로 감염시킨 후 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY를 각각 지연첨가(delayed addition)하여, 감염된 세포에서 p24 항원 생성량 측정한 것이다.
도 38은 유전자 리포터 에세이를 통해 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY 각각의 HIV-1 숙주 게놈 복제 저해능을 측정한 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 인체면역결핍바이러스의 예방 또는 치료(개선)용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
<화학식 1>
Figure 112012082663338-pat00003
상기 식에서,
x는 하기 표의 구조식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
Figure 112012082663338-pat00004
n은 2 내지 6의 정수이다.
본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은 키토산 올리고머에 일련의 과정을 거쳐 아미노산 또는 디펩티드를 결합시킴으로써 합성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 키토산 올리고머의 알코올 그룹을 보호하는 단계; 알코올 그룹이 보호된 키토산 올리고머에 Boc-보호된 아미노산/또는 디펩티드를 반응시켜 키토산 올리고머-아미노산/또는 디펩티드 결합체를 합성하는 단계; 및 상기 결합체에서 THP-ether 와 Boc 보호기를 순차적으로 제거하는 단계를 통해 수득할 수 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 키토산 올리고머-아미노산 결합체 및 키토산 올리고머-디펩티드 결합체 총 22종을 합성하였으며(표 1 참조), 그 중 항-HIV 활성이 높은 7종의 결합체를 선별하여(표 2 참조), 이를 각각 COS-D(x: 구조식 1), COS-E(x: 구조식 2), COS-N(x: 구조식 3), COS-T(x: 구조식 4), COS-Y(x: 구조식 5), COS-TD(x: 구조식 6 및 구조식 7) 및 COS-TY(x: 구조식 8)라 명명하였다.
특히 본 발명자들은 상기 7종의 결합체들이 숙주-바이러스 막간의 상호작용을 방해하여 HIV 초기 감염을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, HIV의 역전사효소 및 프로테아제(protease) 억제 활성을 통해 우수한 항-HIV 효과를 가짐을 확인함으로써, 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 치료(개선)에 효과적이라는 사실을 최초로 규명하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 하기 실시예 3에서는 상기 7종의 결합체(COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY)의 항-HIV 활성 기작을 조사한 결과, COS-D는 및 COD-Y는 역전사효소 억제 활성이 강한 것으로 나타났으며(표 3 및 도 23 참조), COS-E는 프로테아제(protease) 억제 활성이 강한 것으로 나타났고(도 24 및 도 25참조), COD-N 및 COD-T의 경우 합포체 형성을 효과적으로 억제하는 결과를 통해 바이러스 감염 초기의 세포 융합 억제효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다(도 22 참조). 또한 COS-TD 및 COS-TY는 바이러스 초기 감염 및 역전사효소 억제 효과를 동시에 가지는 것을 실험을 통해 확인할 수 있었다(표 4 참조).
또한 하기 실시예 <4-1> 및 실시예 <4-2>에서는, 본 발명의 COS-D 및 COS-Y각각의 다양한 농도(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml)에 따른 HIV 역전사효소 억제 활성을 살펴본 결과, 본 발명의 COS-D 및 COS-Y 각각은 농도 의존적으로 HIV 역전사효소를 억제하는 것으로 나타났다(도 26 및 도 27참조).
또한 하기 실시예 <4-3> 및 실시예 <4-4>에서는, 본 발명의 COS-N 및 COS-T각각의 다양한 농도(0.2, 0.4, 0.6, 0.8 1mg/ml) 처리에 따른 합포체 형성 억제 효과를 살펴본 결과, 본 발명의 COS-N 및 COS-T 각각을 처리한 실험군에서 농도 의존적으로 합포체 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 28 및 도 29참조).
또한 하기 실시예 <4-5>에서는, 본 발명의 COS-E의 다양한 농도(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml)에 따른 HIV-1 프로테아제(protease) 억제 효과를 살펴본 결과, 본 발명의 COS-E는 농도 의존적 HIV-1 프로테아제를 억제하는 것으로 나타났다(도 30 참조).
또한 하기 실시예 5에서는, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY의 다양한 농도에 따른 항-HIV 활성을 살펴본 결과, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY 각각을 처리한 실험군에서 농도 의존적으로 합포체 형성 억제(도 32 및 도 33 참조); p24 항원 생산 억제(도 34 참조); HIV-1 유전자(Vif, Env, Gag) 발현양 감소(도 35 참조); 및 HIV-1 숙주 게놈의 복제 저해가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다(도 38 참조).
이와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 상기 7종의 결합체(COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY) 각각이 다양한 기작을 통해 항-HIV 활성을 가진다는 사실을 실험적으로 입증하였으며, 특히 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY는 숙주세포와의 상호작용을 통해 HIV-1이 숙주세포에 결합하는 것을 차단함과 동시에 HIV-1 역전사효소 활성 억제를 통해 HIV-1 게놈의 복제도 저해할 수 있으므로 HIV 예방 또는 치료(개선)에 효과적이라는 사실을 실험적으로 입증하였다.
본 발명에서는 상기 7종의 결합체를 상기 화학식 1의 화합물로서 나타내었다. 따라서 본 발명에서 화학식 1의 신규 화합물은 상기 7종의 결합체와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은 조성물에 0.01 내지 10 mg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물은 AIDS의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
또한 본 발명은 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 및 치료(개선)용 의약 또는 식품의 제조를 위한 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 HIV의 예방 및 치료(개선)용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 복강내, 국소, 피내, 흡입 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
시약
키토산 올리고머(분자량 1kDa 이하)는 키토라이프에서 제공받았으며; Dihydropyran (DHP), p-Toluene sulfonic acid (pTSA), Hunig’s base ((iPr)2NEt), Hydrochloric acid (aqueous form), tert-butoxycarbonyl(Boc-) protected amino acids, dipeptides 및 Amberlyst H15는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고; Benzene (PhH), Tetrahydrofuran (THF), Methanol (MeOH), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) 는 Junsei Chemical(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 모든 시약은 분석등급을 사용하였다.
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약과 dimethyl sulfoxide (DMSO) 는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며; 세포배양에 필요한 RPMI 1640 배지, 페니실린/스트렙토마이신, 우혈청 세럼 (FBS)은 Gibco BRL에서 구입하였고; H9, H9/HIV-1IIIB, MOLT-4 및 8E5 세포주는 American Type of Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, CEM-SS 세포주는 EU Programme EVA 센터의 P. Nara 박사로부터, C8166 세포주는 G. Farrar박사로부터 제공받았다.
세포배양
H9, H9/HIV-1IIIB, CEM-SS, Jurkat, 8E5, MOLT-4, C8166 새포주는 37℃, 5% CO2 하에서 10% FBS를 첨가한 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, 이때 ml당 100μg 의 스트렙토마이신과 100 U 의 페니실린을 첨가해 주었다. 모든 세포주는 세포배양 플라스크인 T25 또는 T75에서 배양하였다. 세포는 주당 2-3회씩 계대 배양하였으며 이때 세포 밀도는 1×105 cells이 되도록 하였다.
< 실시예 1>
각각의 아미노산과 디펩티드가 결합된 키토산 올리고머 합성
본 발명자들은 키토산 올리고머-아미노산 결합체 및 키토산 올리고당-디펩티드 결합체를 합성하였다.
<1-1> 키토산 올리고머 -아미노산 결합체 합성
먼저, 키토산 올리고머의 알코올그룹을 보호하기 위하여 하이드록실기와 tetrahydropyranyl (THP-) ethers의 디하이드로파이란과 반응시켰다. 자세하게는, 0.4g(8.4 mmol 의 -NH2)의 키토산 올리고머(1 kDa 이하)를 PhH 용매 하에 DHP (4.0 eq.)를 첨가하고 pTSA의 산촉매 하에서 환류시키며 반응시켰다. 8시간 동안 교반하고 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음 메탄올을 이용하여 3번 세척하는 과정을 통해 미반응한 키토산 올리고머를 제거하였다. 또한, 과량의 DHP는 진공 회전증발기(BUCHI Labortechnik, Switzerland)를 이용하여 제거하였다.
그런 다음, 상기 과정을 통해 제조된 THP-ether 보호된 키토산 올리고머에 20종의 아미노산(도 1 참조)을 결합시켰다. 키토산 올리고머와 아미노산의 결합은 키토산 올리고머의 NH2 체인과 Boc-보호된 아미노산의 카르복시말단 사이에 펩타이드 결합으로 형성된다. 자세하게는, 첫 번째 THP-ether 보호된 키토산 올리고머를 4당량의 Boc-보호된 아미노산고 함께 THF에서 반응시켰다(THF에서 아미노산이 녹지 않는다면, dimethylformamide를 사용함). 아마이드 결합의 활성화 시약으로는 EDC.HCl (1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)이 Hunig’s base로 사용되었다. 혼합물은 12시간 동안 교반하고 3,000 rpm 에서 10분간 원심분리한 다음 반응혼합물을 과량의 물로 3회 세척하였다.
마지막으로, 키토산 올리고머-아미노산 결합체에서 THP-ether 와 Boc 보호기를 순차적으로 제거하였다. THP-ether 보호는 메탄올에서 산성알콜 촉매인 Amberlyst H15 로 제거하였다(이때 pH 범위는 2.0~3.0임). 과량의 용매는 회전증발기(rotary evaporator)로 제거하고 반응 혼합물은3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 제거하였다. 그런 다음, Boc그룹을 제거하기 위하여 샘플을 메탄올에서 1M 염산과 함께 4시간 동안 반응시킨 후, 반응 혼합물에서 과량의 용매를 회전증발기로 제거하고 물에 분산시킨 다음 3,000 rpm 에서 10분간 원심분리하였다. 반응 혼합물의 중화를 위해 1M NaOH 용액으로 3회 세척하였다. 그 다음 탈염기(Micro Acilyzer G3, Asahi Chemical Industry Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 탈염시킨 후 동결건조 하였다. 도 2에서는 본 발명의 키토산 올리고머-아미노산 결합체의 결합 메카니즘을 간략하게 나타내었다.
이렇게 수득한 키토산 올리고머-아미노산 결합체는 실리카(Si)겔 60 (70-230 mesh, Merck, Germany) 컬럼에 로딩한 다음 용매 (MeOH:H20 = 1:1)를 이용 크로마토그래피를 실시하여 정제하였으며 최종적으로 밝은 갈색 파우더를 얻을 수 있었다. 각 샘플들은 키토산 올리고머에 결합된 아미노산의 대문자 약어로 표시하였으며, 하기 실험에서 샘플로 이용하였다.
<1-2> 키토산 올리고머 - 디펩티드 결합체 합성
본 발명자들은 키토산 올리고머-디펩티드 결합체 합성을 시도하였다. 합성방법은 상기 실시예 <1-1>의 아미노산을 키토올리고머에 결합시키는 방법과 동일하였으며 Boc-보호된 디펩타이드를 아미노산 대신 첨가하였다.
그러나 단지 2가지의 디펩티드만(TD 와 TY)이 키토산 올리고머와 결합체를 형성할 수 있었다.
<1-3> 합성 여부 분석
합성 여부는 분광분석 1H-NMR 과 13C-NMR (JNM-ECP-400 NMR Spectrometer, JEOL, Japan) 및 TLC 분석과 같은 분광분석법을 통해 합성 여부를 평가하였다(도 3 내지 16 참조). 또한, 키토산 올리고머는 다당류로서 각 치환률은 원소분석을 통해 각각의 아미노산 결합 정도를 계산하였다. 하기 표 1은 본 실험에서 수득한 키토산 올리고머-아미노산 결합체 및 키토산 올리고머-디펩티드 결합체의 종류, 약어, 수득율 및 치환율을 나타낸 것이다.
본 발명의 합성된 키토산 올리고머-아미노산/디펩티드 결합체
물질 약어 수율(g) 치환율(%)
키토산 올리고머-알라닌 COS-A 0.268 84
키토산 올리고머-아르기닌 COS-R 0.291 32
키토산 올리고머-아스파라긴 COS-N 0.324 68
키토산 올리고머-아스파트산 COS-D 0.421 71
키토산 올리고머-시스테인 COS-C 0.282 67
키토산 올리고머-글루탐산 COS-E 0.357 74
키토산 올리고머-글루타민 COS-Q 0.405 76
키토산 올리고머-글리신 COS-G 0.217 91
키토산 올리고머-히스티딘 COS-H 0.185 59
키토산 올리고머-이소류신 COS-I 0.253 53
키토산 올리고머-류신 COS-L 0.316 64
키토산 올리고머-리신 COS-K 0.231 36
키토산 올리고머-메티오닌 COS-M 0.312 50
키토산 올리고머-페닐알라닌 COS-F 0.342 61
키토산 올리고머-프롤린 COS-P 0.266 57
키토산 올리고머-세린 COS-S 0.413 87
키토산 올리고머-트레오닌 COS-T 0.354 81
키토산 올리고머-트립토판 COS-W 0.293 41
키토산 올리고머-티로신 COS-Y 0.215 72
키토산 올리고머-발린 COS-V 0.227 89
키토산 올리고머-트레오닌-아스파트산 COS-TD 0.527 66
키토산 올리고머-트레오닌-티로신 COS-TY 0.485 68
< 실시예 2>
본 발명의 키토산 올리고머 -아미노산 결합체/ 디펩티드의 항- HIV 활성 측정
<2-1> 키토산 올리고머 -아미노산 결합체(총 20종)의 항- HIV 활성 측정
본 발명자들은 상기 실시예 1을 통해 합성한(제조한) 키토산 올리고머-아미노산 결합체 중 항-HIV 활성을 갖는 물질을 선별하게 위하여, C8166 세포주(Human T cell leukaemia)에 본 발명의 결합체를 전처리한 후 HIV-감염에 따른 C8166 세포 용해로부터 세포 보호효과 및 합포체 형성 억제 효과를 살펴보았다.
① HIV -1의 용균 활성으로부터 세포 보호 효과
상기 실시예 1을 통해 합성한(제조한) 키토산 올리고머-아미노산 결합체 20종의 HIV-1 용균 활성으로부터 세포 보호 효과를 살펴보기 위하여, C8166 세포주(Human T cell leukaemia)에 본 발명의 결합체 20종 각각을 전처리한 후 HIV-1로 감염시키고, 시간 경과에 따른 세포독성을 MTT 에세이를 통해 조사하였다.
C8166 세포주는 HIV-1 복제의 용균 효과에 민감한 특징을 가지므로, 본 실험에서는 HIV-1 감염으로 인한 용균 활성에서 C8166 세포의 민감성을 바탕으로 HIV-1 복제의 억제 정도를 평가하였다.
자세하게는, 48-웰 플레이트에 1×105 C8166 세포를 300μl씩 3반복 분주하고 실시예 1을 통해 합성한(제조한) 키토산 올리고머-아미노산 결합체 시료(0.5 mg/ml)를 100μl를 첨가하였다. 그런 다음, HIV-1IIIB 의 상등액을 배지에 희석시켜 각 웰당 100μl씩 첨가하여 세포를 감염시켰다. 상기 과정을 거친 세포들은 37 ℃에서 24 시간, 48 시간, 72 시간 동안 배양하였으며, 이후에 500 μg/ml 농도의 MTT 용액을 100μl 첨가한 뒤 4시간동안 반응시켰다. 포마잔 염은 50% DMSO 와 4% triton X-100이 포함된 산성화된 프로판올을 이용하여 용해시켰다. 흡광도는 540 nm에서 GENios 마이크로플레이트 판독기(Tecan, Austria GmbH, Austria)를 이용하여 측정하였고 아무것도 처리하지 않은 세포에서 형성된 포마잔의 양을 100%로 계산하였다.
그 결과 도 17에서 나타낸 바와 같이, 대조군(시료 무처리군)에서는 HIV-1에 감염된 C8166 세포들은 시간 경과에 의존적으로 세포 사멸이 증대되고 5일 이내에 90% 가량이 사멸하는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 키토산 올리고머-아미노산 결합체를 전처리한 실험군에서는 세포 사멸이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 참고로, HIV-1에 감염된 후 24시간에 경과한 시점에서의 세포 생존율 측정을 통해 키토산 올리고머-아미노산 결합체 자체의 세포독성이 없음을 평가할 수 있었다.
한편, 본 발명자들은 48시간이 경과한 시점에서 세포 생존율 측정을 통해 각각의 실험군들의 항-HIV 활성을 평가하였다. HIV-1에 감염되지 않은 blank 그룹과 비교하여 70% 이상의 세포 생존율을 보이는 실험군이 항-HIV 활성이 우수할 것으로 판단하였으며, 그 결과 COS-D, COS-L, COS-E, COS-N, COST 및 COS-Y 각각의 처리군에서 세포 생존율이 78.8, 81.3, 70.4, 71.2, 72.3 및 84.9%로 나타나, 이들을 항-HIV 활성을 가진 물질로서 1차 선별할 수 있었다.
② 합포체 형성( syncytia formation ) 억제 효과
상기 실시예 1을 통해 합성한(제조한) 키토산 올리고머-아미노산 결합체 20개의 합포체 형성 억제 효과를 살펴보기 위하여, C8166 세포주(Human T cell leukaemia)에 본 발명의 결합체 20종 각각을 전처리한 후 HIV-1RF(X4 tropic HIV-1 strain)로 감염시켜 합포체 형성 정도를 현미경으로 관찰하였다.
인간 T 세포주의 CD4+ 리셉터의 HIV-1 감염으로 세포 합포체가 형성되며, 세포 사멸은 초기의 여러 개의 핵을 가진 거대세포 및 합포체 형성으로 구분되며, 단일 세포는 부풀면서 결국 사멸에 이르게 된다. 세포 융합을 촉진하는 바이러스 감염을 분석할 때 바이러스 감염을 조사하기 위해 합포체 형성을 시험한다. HIV-1에 감염된 세포들은 HIV-1 결합에 특이적인 멤브레인 단백질을 높은 비율로 생성하며, 이들은 다른 감염된 세포와 결합 및 융합되어 결과적으로는 합포체라는 거대세포를 형성하게 된다.
자세하게는, 48-웰 플레이트에 1×105 C8166 세포를 300μl씩 3반복 분주하고 100 μl의 시료(키토산 올리고머-아미노산 결합체 각각)를 첨가하였다. 이때 시료는 RPMI-1640에 5% FBS가 첨가된 배지를 이용하여 희석하였으며, 2시간 후 세포에 100 μl의 HIV-1RF 상등액(200 CCID50 (μg/ml)) 을 첨가하여 세포의 50%를 감염시켰다. 플레이트를 37℃ 에서 48시간 동안 배양하였으며 합포체의 형성은 현미경을 (Leica Microsystems, Germany)이용하여 관찰하였다.
그 결과 도 18 및 도 19에서 나타낸 바와 같이, 상기 1차 선별된 6종의 결합체 중 COS-L을 제외한 5종의 결합체(COS-D, COS-E, COS-N, COST 및 COS-Y) 모두에서 합포체 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명자들은 높은 항-HIV 활성을 가진 키토산 올리고머-아미노산 결합체로 COS-D, COS-E, COS-N, COST 및 COS-Y를 최종 선별하였다.
<2-2> 키토산 올리고머 - 디펩티드 결합체(총 2종)의 항- HIV 활성 측정
본 실험에서 키토산 올리고머-디펩티드 결합체의 항-HIV 활성은 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방식으로 분석하였으며, 그 결과는 도 20 및 도 21에서 나타내었다.
도 20은 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY의 전처리에 따른 HIV-1 용균 활성으로부터 세포 보호효과를 살펴본 것으로서, COS-TD 및 COS-TY 각각을 처리한 실험군에서 높은 세포보호 효과를 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명의 COS-TD를 전처리한 실험군에서는 HIV-1 감염 후 48시간 경과한 시점에서 C8166 세포의 세포생존율이 94.6%로 나타나, 실시예 1을 통해 합성된 결합체중 가장 높은 세포보호 효과를 확인할 수 있었다.
또한, 도 21은 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY의 전처리에 따른 합포체 형성 억제 효과를 살펴본 것으로서, 대조군과 비교하여 COS-TD 및 COS-TY 각각을 처리한 실험군 모두에서 합포체 형성이 거의 일어나지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY가 우수한 합포체 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<2-3> 높은 항- HIV 활성을 갖는 본 발명의 키토산 올리고머 -아미노산/ 디펩티드 결합체(총 7종)
본 발명자들은 상기 실시예<2-1> 및 <2-2>를 통해 높은 항-HIV 활성을 갖는 물질로서 7종의 결합체를 선별할 수 있었으며, 이를 하기 표 2에서 정리하였다.
본 발명의 높은 항-HIV 활성을 갖는 7종의 결합체
종류 구조
COS-D
Figure 112012082663338-pat00005
COS-E
Figure 112012082663338-pat00006
COS-N
Figure 112012082663338-pat00007
COS-T
Figure 112012082663338-pat00008
COS-Y
Figure 112012082663338-pat00009
COS-TD ⅰ ⅱ
Figure 112012082663338-pat00010
Figure 112012082663338-pat00011
COS-TY
Figure 112012082663338-pat00012
* n= 2~6
< 실시예 3>
키토산 올리고머 -아미노산/ 디펩티드 결합체의 항- HIV 활성 기작 규명
본 발명자들은 상기 실시예 2를 통해 높은 항-HIV 활성을 갖는 물질로서 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY를 선별하였는바, 본 실험에서는 이들의 항-HIV 활성이 어떠한 기작으로 이루어지는지 구체적으로 살펴보았다.
<3-1> 합포체 수 측정
실시예 2에서는 본 발명의 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 각각의 처리에 따른 합포체 형성 정도를 현미경으로 측정하였으나, 본 실험에서는 이를 좀 더 명확히 확인하기 위하여 상기 물질들의 처리에 따른 합포체 형성된 숫자를 각 웰 당 계산하여 그래프로 나타내었다.
48-웰 플레이트에 1×105 C8166 세포를 300μl씩 3반복 분주하고 0.5mg/ml 농도의 시료(COS-D, COS-E, COS-N, COST, COS-Y, COS-TD 또는 COS-TY) 100μl을 첨가하였다. 이때 시료는 RPMI-1640에 5% FBS가 첨가된 배지를 이용하여 희석하였다. 상기 세포에 100μl의 HIV-1RF 상등액(200 CCID50 (μg/ml))을 첨가하여 2시간 동안 세포의 50%를 감염시켰다. 플레이트는 37℃ 에서 48시간 동안 배양하고, 각 월당 형성된 합포체 수를 카운팅하였다.
그 결과 도 22에서 나타낸 바와 같이, 대조군과(시료 무처리군) 비교하여 시료(COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 또는 COS-TY) 처리군에서 모두 합포체 형성이 두드러지게 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 COS-TD 및 COS-TY에서 더욱 억제되는 것을 알 수 있었다.
<3-2> 역전사효소 ( reverse transcriptase ) 활성 저해 효과
HIV는 유전적 물질의 복제 및 새로운 바이러스 생산을 위해 역전사효소(RT)를 사용한다. HIV 복제에 역전사효소(RT)의 역할이 중요하기 때문에, 종래 역전사효소(RT) 억제제들을 HIV 치료제로 사용되었다. 본 실험에서는 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 각각의 항-HIV 활성 기작으로서 역전사효소(RT) 억제 효과를 살펴보았다.
바이러스 세포 용리물 중의 HIV-1 역전사효소의 활성을 형광 RT 분석 키트(fluorescence RT assay kit; InvitroGen)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 평가하였다. 간략하게 설명하면, 주형/프라이머 하이브리드, poly(A)/d(T)16, 및 트리포스페이트 기재로서 dTTP를 함유한 반응 혼합물 20 μL를 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 웰에 가하고, 다양한 농도의 본 발명의 시료(COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 또는 COS-TY [0.5 mg/ml])를 함유한 바이러스 용리물과 혼합하였다. 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 각 반응에 200 mM EDTA 2 μL를 사하여 반응을 중단시켰다. 단일-가닥(singlestranded) 핵산 또는 유리 뉴클레오타이드 상에서 sDNA 또는 DNA-RNA 헤테로듀플렉스(heteroduplexes)에 선택적으로 결합하는 형광 피코그린리에이젼트(PicoGreenreagent) 173 μL를 가한 후, 제니스마이크로플레이트 리더기(GENiosmicroplate reader; Tecan Austria GmbH, Austria)를 이용하여 480 nm (여기) 및 520 nm (방출)에서형광 강도를 측정하였다. 이때, 바이러스 세포주는 2개(HIV-1RF/HIV-1IIIB)의 다른 세포주를 이용하여 RT 활성 저해 효과를 측정하였다. 한편, 양성대조군으로는 RT 억제제로 잘 알려진 zidovudine(AZT) 2μM를 사용하였다.
그 결과 하기 표 3 및 도 23에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-D, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY가 역전사효소(RT) 활성을 효과적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 각각의 RT 억제 % 및 IC50값
Compound RT Inhibition (%) IC50(mg/ml)
COS-D 83.4 0.213
COS-E 32.7 1.036
COS-N 41.8 0.954
COS-T 55.3 0.761
COS-Y 83.5 0.213
COS-TD 85.1 0.207
COS-TY 85.8 0.192
AZT 82.6 0.081
* 상기 값들은 HIV-1RF 및 HIV-1IIIB 세포주에서 독립적으로 측정된 값들의 평균값으로 나타낸 것임.
<3-3> 프로테아제( Protease ) 억제 효과
HIV-1 프로테아제는 레트로바이러스의 아스파틸 프로테아제이며 HIV 라이프 사이클을 위하여 필수적인 효소로서, HIV의 유전자에 의해 발현된 자기 자손의 단백질 껍질들의 구성물을 다듬기위한 효소로 이용된다. 따라서 HIV 프로테아제를 억제하는 경우, 바이러스 복제를 차단시킬 수 있다. 본 실험에서는 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 각각의 항-HIV 활성 기작으로서 HIV 프로테아제 억제 효과를 살펴보았다.
HIV-1 프로테아제 활성을 검증하기 위해 fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide를 포함하는 SensoLyte520 HIV-1 프로테아제 시험 키트(Anaspec, CA, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 평가하였다. FRET peptide의 아미노산 서열은 전구체 Gag 단백질 상에 있는 HIV-1 프로테아제에 의한 분해부위 p17/p24를 모방해서 만들어진 것이다. FRET peptide는 HIV-1 프로테아제에 의해서 분해되면, 형광을 발산한다.
바이러스의 HIV-1 프로테아제 희석액 40μl에 시료(COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 또는 COS-TY [0.5 mg/ml]) 10μl를 첨가하여 37℃에서 15분간 전배양시켰다. 그런 다음 같은 온도, 같은 시간 동안 전배양시킨 HIV-1 프로테아제 기질 50μl를 첨가하고, 30~60초 동안 서서히 완전하게 잘 섞은 후 Ex/Em = 340 nm/490 nm에서 형광을 측정하고, 저해제가 포함되지 않은 시료의 형광을 100으로 하고 이에 대한 상대적인 수치로서 저해율을 평가하였다. 이때, 바이러스 세포주는 2개(HIV-1RF/HIV-1IIIB)의 다른 세포주를 이용하여 프로테아제 활성 저해 효과를 측정하였다. 한편, 양성대조군으로는 프로테아제 억제제로 잘 알려진 saquinavir(saq) 2μM를 사용하였다.
그 결과 도 24에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 중에서 단지 COS-E만이 효과적으로 HIV-1 프로테아제를 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 실시예<3-2>의 RT 억제 효과와 비교하여, COS-E는 RT 억제 효과가 아닌 HIV-1 프로테아제 억제 효과로서 바이러스로부터 세포를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 본 발명자들은 HIV-1의 또 다른 세포주를 이용하여 HIV-1 프로테아제 억제 효과를 실험하였는데, 이는 saquinavir에 저항성을 갖는 세포주로서 HIV-1saq를 이용하였다. saquinavir는 항-레트로바이러스 의약품으로 시장에서 상업적으로 잘 알려진 프로테아제 억제제이나, 본 약물에 내성을 지닌 HIV-1의 변종의 출연으로 saquinavir를 대체할 수 있는 다른 종류의 HIV-1 프로테아제 억제제가 요구되고 있는 실정이다.
따라서 본 발명자들은 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 각각이 saquinavir 저항성 세포주인 HIV-1saq에도 프로테아제 억제 효과를 나타내는지를 실험하였다. 실험 방법은 상기와 동일하게 상용화된 SensoLyte520 HIV-1 프로테아제 시험 키트(Anaspec, CA, USA)를 구입하여 제조업자의 지시에 따라 측정하였다. 양성대조군으로는 saquinavir를 사용하였다.
그 결과 도 25에서 나타낸 바와 같이, 양성대조군은 프로테아제 억제 활성이 거의 없는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 COS-E 처리군에서는 HIV-1 프로테아제 억제가 효과적으로 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 토대로, 본 발명의 COS-E는 약품 저항성이 없는 세포주(HIV-1RF/HIV-1IIIB) 뿐만 아니라, 약품 저항성을 가지는 HIV-1saq 세포주에서도 효과적인 HIV-1 프로테아제 억제 활성을 가지며, 이러한 특성으로 인해 saquinavir에 약품 저항성을 보이는 환자에게 유용하게 사용될 수 있을 것이라 판단되었다.
<3-4> 키토산 올리고머 -아미노산/ 디펩티드 결합체의 항- HIV 활성 기작
상기 실시예 <3-1> 내지 <3-3>에서 규명된 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 각각의 항-HIV 활성 기작은 모두 동일한 것은 아니며, 각각의 특성이 있는 것으로 조사되었다.
즉, COS-D는 및 COD-Y는 RT 억제 활성이 강한 것으로 나타났으며, COS-E는 프로테아제 억제 활성이 강한 것으로 나타났고, COD-N 및 COD-T의 경우 합포체 형성을 효과적으로 억제하는 결과를 통해 바이러스 감염 초기의 세포 융합 억제효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 또한 COS-TD 및 COS-TY는 바이러스 초기 감염 및 RT 억제 효과를 동시에 가지는 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명자들은 상기 결과를 종합적으로 판단하여 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 각각의 항-HIV 활성 기작이 하기 표 4와 같을 것으로 예측하였다.
COS-D, COS-E, COS-N, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 각각의 항-HIV 활성 기작
compound proposed mechanism
COS-D RT Inhibition
COS-E Protease Inhibition
COS-N HIV-1 infection Inhibition
COS-T HIV-1 infection Inhibition
COS-Y RT Inhibition
COS-TD HIV-1 infection & RT Inhibition
COS-TY HIV-1 infection & RT Inhibition
< 실시예 4>
키토산 올리고머 -아미노산 결합체 각각의 항- HIV 활성 효과
본 발명자들은 상기 실시예 3을 통해 COS-D, COS-E, COS-N, COS-T 및 COS-Y 각각의 항-HIV 활성 기작을 확인하였는바, 본 실험에서는 이들 각각을 다양한 농도에서 실험함으로써 상기 실시예 3에서 확인한 항-HIV 활성 기작을 더욱 자세히 살펴보았다.
<4-1> COS -D
본 발명의 COS-D는 역전사효소(RT) 억제 활성을 통해 항-HIV 활성을 가지는 것으로 판단되었으므로, 본 실험에서는 다양한 농도별(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml) COS-D에 따른 역전사효소 억제 활성을 살펴보았다.
IV-1 역전사효소의 활성은, HIV-1RF로 급성 감염된 C8166 및 CEM-SS 두 개의 세포주 용리물을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예<3-2>와 동일하게 측정되었다.
결과 도 26에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-D는 농도 의존적 역전사효소 억제 활성을 보였다. 한편, 0.05mg/ml의 농도에서는 역전사효소 억제 활성이 거의 없는 것으로 나타났는데, 이를 통해 COS-D는 역전사효소의 기능을 불활성화 시키는 것이 아닌, 역전사효소의 활성부위와 상호작용으로 RT 효소의 활성을 차단하는 것이라 판단되었다.
<4-2> COS -Y
본 발명의 COS-Y는 역전사효소 억제 활성을 통해 항-HIV 활성을 가지는 것으로 판단되었으므로, 본 실험에서는 다양한 농도별(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml) COS-Y에 따른 역전사효소 억제 활성을 살펴보았다.
HIV-1 역전사효소의 활성 측정은 상기 실시예<4-1>과 동일한 방법으로 측정되었다.
그 결과 도 27에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-Y는 농도 의존적 역전사효소 억제 활성을 보였다. 다만, COS-Y의 역전사효소 억제 활성 패턴은 COS-D의 역전사효소 억제 패턴과 몇몇 차이를 나타냈는데, 가장 큰 차이로는 COS-D에서는 0.05 및 0.1mg/ml의 농도에서 역전사효소 억제 활성이 거의 없는 것으로 나타난 반면, COS-Y에서는 상기 낮은 농도에서도 역전사효소 억제 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 COS-Y가 COS-D에 비해 역전사효소 활성화 부위에 더욱 특이적으로 상호 작용할 수 있으며, 따라서 COS-Y가 COS-D에 비해 역전사효소 억제 활성이 효과적일 수 있는 것을 의미한다.
<4-3> COS -N
본 발명의 COS-N은 바이러스 초기 감염 억제효과를 통해 항-HIV 활성을 가지는 것으로 판단되었으므로, 본 실험에서는 다양한 농도별(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/ml) COS-N에 따른 합포체 억제 효과를 살펴보았다.
48-웰 플레이트에 1×105 C8166 세포를 300μl씩 3반복 분주하고 농도별 COS-N 시료를 100 μl 첨가하였다. 이때 COS-N 시료는 RPMI-1640에 5% FBS가 첨가된 배지를 이용하여 희석하였으며, 2시간 후 세포에 100 μl의 HIV-1RF 상등액(200 CCID50 (μg/ml)) 을 첨가하여 세포의 50%를 감염시켰다. 플레이트를 37℃ 에서 96시간 동안 배양하였으며 형성된 합포체의 수는 현미경을(Leica Microsystems, Germany)이용하여 관찰하였다. 양성대조군으로는 합포체 형성 억제 효과가 보고된 덱스트란 설페이트(dextran sulfate)를 사용하였다.
그 결과 도 28에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-N는 농도 의존적으로 합포체 형성을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 양성대조군과 비교하여 더욱 효과적인 것으로 나타났다.
<4-4> COS -T
본 발명의 COS-T는 바이러스 초기 감염 억제효과를 통해 항-HIV 활성을 가지는 것으로 판단되었으므로, 본 실험에서는 다양한 농도별(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/ml) COS-T에 따른 합포체 억제 효과를 살펴보았다.
합포체 억제 효과 측정은, 상기 실시예<4-3>과 동일하게 측정되었다.
그 결과 도 29에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-T는 농도 의존적으로 합포체 형성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 다만 유사한 효과를 보이는 COS-N과 비교하여, COS-T는 0.5mg/ml 농도 이상에서 합포체 형성 억제 활성이 매우 급속히 증대되는 것을 확인할 수 있었다.
<4-5> COS -E
본 발명의 COS-E는 HIV-1 프로테아제 억제 활성을 통해 항-HIV 활성을 가지는 것으로 판단되었으므로, 본 실험에서는 다양한 농도별(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml) COS-E에 따른 HIV-1 프로테아제 억제 효과 및 세포배양 상청액의 p27 단백질의 생산 억제율을 살펴보았다.
HIV의 p24 단백질은 바이러스 코어단백질로서 HIV-1 프로테아제 생산에 중요한 역할을 한다. 그러므로 p24 단백질 생산량 측정을 통해 HIV-1 프로테아제 억제 정도를 더욱 확실하게 판단할 수 있다.
먼저, HIV-1 프로테아제 억제 활성은, HIV-1RF로 급성 감염된 C8166 및 CEM-SS 두 개의 세포주의 프로테아제 희석액을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예<3-3>와 동일하게 측정되었다.
그 결과 도 30에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-E는 농도 의존적 프로테아제를 억제 활성을 보였다.
또한 바이러스가 방출하는 p24 양을 측정하기 위해, H9 세포(3×106 cells/ml)를 37℃에서 1 시간 동안 HIV-1IIIB의 존재 하에 배양하였다. 세포를 세척하여 결합하지 않은 바이러스를 제거하고, 배양 배지 중에 3×105cells/mL로 재현탁시켰다. 분취액 1 mL를 COS-E 시료를 갖는 동일한 부피의 배지를 함유한 24-웰 플레이트에 주입하였다. 배지로 방출된 바이러스의 양을 측정하기 위하여, 상업용 키트(Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 HIV-1 p24 항원 캡쳐 ELISA를 수행하였다.
그 결과 도 31에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-E는 농도에 의존적으로 p24 방출량(생성량)을 효과적으로 저해할 수 있음을 보여주었다.
< 실시예 5>
키토산 올리고머 - 디펩티드 결합체 각각의 항- HIV 활성 효과
본 발명자들은 상기 실시예 3을 통해 COS-TD 및 COS-TY 각각의 항-HIV 활성 기작을 확인하였는바, 본 실험에서는 항-HIV 활성 기작을 더욱 자세히 살펴보고자 이들 각각을 다양한 농도에서 HIV-1 감염 억제 활성, HIV-1 바이러스 입자 생산 억제 활성, p24 단백질 생산 억제 활성 및 유전자 리포터 에세이를 실시하였다.
<5-1> HIV -1 감염 억제 활성
상기 실시예 3에 의하면, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY는 키토산 올리고머에 단지 하나의 아미노산이 결합된 결합체와는 달리 두 개의 아미노산을 가지므로, 이로 인해 두 종류의 아미노산에 따른 특징을 모두 갖는 특성을 보였다. 먼저, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY는 곁사슬인 트레오닌(T)으로 인해 바이러스막(viral envelope) 보다는 숙주 세포막에 대한 효과를 가질 수 있는데, 이는 COS-TD 및 COS-TY의 합포체 억제 효과로서 입증되었다(실시예<3-4> 참조).
이에, 본 실험에서는 이러한 HIV-1 감염 억제 활성이 COS-TD 및 COS-TY가 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해를 통해 이루어지는지를 살펴보고자, 감염되지 않은 C8166 세포주 및 HIV-1IIIB이 감염된 H9 세포의 공배양법을 이용하였다.
감염되지 않은 3×104 C8166 세포에 다양한 농도(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1mg/ml)의 시료(COS-TD 또는 COS-TY)를 처리하고 2시간이 경과한 다음, HIV-1IIIB로 감염된 3× 103 H9 세포(ratio-1:10)를 37℃ 에서 공배양하였다. 96시간 뒤 형성된 합포체를 현미경(100×)을 이용하여 카운팅하였다. 양성대조군으로는 합포체 형성 억제 효과가 보고된 덱스트란 설페이트(dextran sulfate)를 사용하였다.
그 결과 도 32 및 도 33에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY를 각각 처리한 실험군에서 처리 농도에 의존적으로 합포체 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 양성대조군과 비교하여 더욱 효과적인 것으로 나타났다.
<5-2> HIV -1 바이러스 입자 생산 억제 활성
일반적으로 바이러스 입자 검출을 통해 HIV-1 바이러스 감염을 진단할 수 있는데, HIV-1 바이러스의 경우 숙주 내로 삽입되어 자신의 새로운 바이러스 형성을 위해 바이러스 입자들이 필요하기 때문이다. 이에, 본 실험에서는 COS-TD 및 COS-TY가 성공적으로 HIV-1 감염을 억제할 수 있는지를 평가하기 위하여, 생산되는 p24 항원 양 및 Vif, Env, Gag와 같은 HIV-1 유전자 발현 분석을 실시하였다.
① p24 항원 생산량 분석
본 발명의 COS-TD 및 COS-TY 처리에 따른 세포내 p24 단백질 양을 웨스턴 블랏법을 통해 측정하였다. 먼저, HIV-1IIIB로 감염된 H9 세포에 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY 시료 각각을 농도별(0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml)로 처리한 후 4일 동안 배양하였다. 배양된 총 세포를 RIPA 완충용액(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, USA)에 용균시켜 원심분리한 후에, 세포 용균물의 총 단백질량을 Lowry method (BioRad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 측정하였다. 동량의 단백질(15μg)을 함유하는 분취량의 상청액을 10% 또는 12% SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 니트로셀룰로 스막 (Amersham Pharmacia Biotech., England, UK)으로 옮긴 후, 0.1% Tween 20 (TBS-T)을 함유하는 TBS에 용해된 5% 스킴밀크로 적어도 1시간 동안 차단시키고 일차 항체로서 마우스 항-p24 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA)와 혼성화시켰다. 모든 일차 모노클로날 항체를 1:1000 비율로 TBS-T로 희석시켰다. 결합된 항체를 실온에서 1시간 동안 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 이차 항체로 검출하고 면역반응성 단백질을화학형광 ECL 검정 키트(Amersham Pharmacia Biosciences, England, UK)를 제조업자의 지시사항에 따라 사용하여 검출하였다. 웨스턴 블롯 밴드를 LAS3000발광 이미지 분석(Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)을 사용하여 시각화하였다.
그 결과 도 34에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY를 각각 처리한 실험군에서 처리 농도에 의존적으로 p24 항원 생산이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
② HIV -1 유전자( Vif , Env , Gag ) 발현 분석
본 발명의 COS-TD 및 COS-TY 처리에 따른 세포내 HIV-1 유전자(Vif, Env, Gag) 발현양을 RT-PCR을 통해 측정하였다. 먼저, HIV-1IIIB로 감염된 H9 세포에 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY 시료 각각을 농도별(0.05, 0.1, 0.5, 1mg/ml)로 처리한 후 4일 동안 배양하였다. 배양된 총 세포의 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen Co., CA, USA)을 사용하여 분리하였다. 2μg의 분리된 RNA를 올리고-(dT) 프라이머(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 표적 cDNA를 포워드 및 리버스 프라이머 서열을 사용하여 증폭시켰다 (하기 표 5-7 참조). PCR 산물을 100V에서 10분 동안 1.5% 아가로스겔 상에서 전기영동하여 분리하였다. 겔을 1 mg/ml의 EtBr로 염색한 후 AlphaEase겔 이미지 분석 소프트웨어 (Alpha Innotech., San Leandro, CA, USA)를 사용하여 UV 조명하에서 사진촬영하였다.
그 결과 도 35에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY를 각각 처리한 실험군에서 처리 농도에 의존적으로 Vif, Env, Gag 유전자 모두의 발현이 감소되는 것으로 나타났으며, 특히 Env의 유전자 발현이 COS-TD 및 COS-TY의 처리 농도가 높아질수록 두드러지게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
RT-PCR 시험에 사용된 시약 및 반응 배합
PCR 시약 사용량 저장 농도
MMLV reverse transcriptase 0.5 μl 200 U/μl
dNTP mixture 1 μl 10 mM
DTT 1 μl 100 mM
5X reaction buffer 4 μl -
RNase inhibitor 0.5 μl 80 U/μl
RT-PCR 조건
온도 시간
42℃ 1시간 30분
95℃ 5분
4℃ 반응종료
HIV-1 유전자 프라이머 서열
유전자 프라이머 서열
HIV-1 Vif 포워드 5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’
리버스 5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’
HIV-1 env 포워드 5’-CCTCAGCCATTACACAGGCC-3’
리버스 5’-CCTTGGTGGGTGCTACTCCT-3’
HIV-1 gag 포워드 5’-GGCACATCAAGCAGCCATGC-3’
리버스 5’-TAGTTCCTGCTATGTCACTTCC-3’
인간 GAPDH 포워드 5’-GGTACAGTGCAGGGAAAGA-3’
리버스 5’-CTTGCCACACAATCATCACC-3’
<5-3> 공배양법을 통한 COS - TD 및 COS - TY 의 세포 합포체 억제 효과 측정
본 실험에서는 COS-TD 및 COS-TY가 숙주세포막 리셉터에 상호작용하는지 살펴보고자, 변이된 숙주세포막 리셉터를 갖는 두 개의 세포주(8E5, MOLT-4) 공배양법을 이용하였다. 즉, 8E5 및 MOLT-4 세포주는 각각 숙주세포막 리셉터인 CXCR4 및 CD4+가 변이되어 있는데, 이들을 함께 공배양하는 경우, HIV-1 감염 없이도 합포체가 형성되며 바이러스HIV-1 용균 효과와 유사한 세포 사멸적 특징을 갖는다. 따라서 상기 두 개의 세포주 공배양을 통해, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY가 바이러스에 상호 작용 없이, 숙주세포막과의 상호작용을 통해 항-HIV 활성을 가지는 것인지를 확인할 수 있다.
0.5mg/ml 농도의 COS-TD 및 COS-TY 시료 존재 하에서, 감염되지 않은 1×104 MOLT-4와 8E5(HIV-감염된 CEM 세포로부터 유래된 클로날 세포주: HIV-1 바이러스 입자가 만성적으로 삽입된 형태의 세포주)를 함께 배양하였으며, 시간 경과에 따라 형성된 합포체 수를 측정하였다. Mock은 시료가 처리되지 않은 실험군이며, AZT-Saq는 AZT 및 saquinavir가 동시 처리된 양성대조군을 의미한다.
그 결과 도 36에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY를 각각 처리한 실험군에서 많은 시간이 경과하여도 형성되는 합포체의 수가 거의 증가하지 않는 것으로 나타난 반면, 무처리군(Mock)에서는 40시간이 경과한 시점에 합포체 형성이 급속도로 증가하며 72시간이 경과한 시점에는 HIV-1 용균 효과로서 세포들이 모두 사멸된 것으로 나타났다. 또한 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY 처리군은 양성대조군과 비교하여 더욱 높은 합포체 형성 억제 효과를 보여주었다. 이와 같은 결과를 통해, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY는 바이러스와의 상호작용에 상관없이 숙주세포막과 상호작용한다는 것을 입증할 수 있었다.
<5-4> COS - TD 및 COS - TY 가 HIV -1 감염 후기에 미치는 영향
본 실험에서는 COS-TD 및 COS-TY가 HIV-1 감염 후기에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보고자, 세포를 HIV-1로 감염시킨 후 시료(COS-TD 또는 COS-TY)를 지연첨가(delayed addition)하여, 감염된 세포에서 p24 항원 생성량 측정을 통해 평가하였다. 이러한 방법은, COS-TD 및 COS-TY가 새로운 바이러스 생산에 필요한 바이러스 입자 양을 감소시킴으로써 이미 감염된 세포의 증식을 차단할 수 있는지를 평가할 수 있다.
감염되지 않은 CEM-SS 세포를 48-웰 마이크로플레이트에서 각 웰당 400μl 배지 안에 3×104 cells/well밀도로 분주하였다. 희석된 HIV-1IIIB 저장 상등액(100 μl)을 각각의 웰에 첨가하고 최종 M.O.I 의 1.0 (CCID50)이 되도록 하였다. 바이러스 첨가 후 100 μl 의 시료(COS-TD 또는 COS-TY) 각각을 0.5mg/ml 농도로 처리하였다. 4일 후 p24 생성을 측정하였다. 바이러스가 방출하는 p24 양을 측정하기 위해, 상업용 키트(Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 HIV-1 p24 항원 캡쳐 ELISA를 수행하였다.
그 결과 도 37에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY 각각을 처리한 실험군에서 6시간이 경과할 때까지 p24 항원 생산을 억제할 수 있었으나, 처리 후 시간이 경과할수록 p24 생산 억제 활성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 감염된 숙주세포가 증가할수록 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY가 숙주세포에 상호작용할 수 없으며, 이러한 감염된 숙주세포는 새로운 비리온으로서 p24를 계속적으로 생산하기 때문인 것으로 판단되었다.
<5-5> 유전자 리포터 에세이
본 실험에서는 COS-TD 및 COS-TY의 HIV-1 숙주 게놈의 복제 저해능을 평가하기 위하여, TZM-bl 세포를 이용하여 루시퍼라아제와 베타-갈락토시다아제 유전자 리포터 시험으로 측정하였다. TZM-bl 세포는 HeLa 세포의 클론으로 CD4, CCR5, CXCR4가 발현되는 세포주이다.
5×104 TZM-bl 세포를 24-웰 플레이트에 분주하여 24시간 배양한 후, 상기 세포에 100μl의 HIV-1IIIB 상등액(100 CCID50 (μg/ml))을 첨가하여 세포의 50%를 감염시켰다. 그런 다음, 다양한 농도(0.05, 0.1, 0.5, 1mg/ml)의 시료(COS-D, COS-T, COS-Y, COS-TD 또는 COS-TY) 각각을 상기 세포에 처리하여 48시간동안 배양하였다. 배양 후 세포는 차가운 PBS를 이용하여 세척하고 300 의 용해 버퍼를 이용하여 용해시켰다 (Promega Corp., Madison, WI). 20 의 세포 용리액은 100 의 루시퍼라아제 기질과 (Promega)혼합하였고 빛 방출은 10초간, 루미노메터를 사용하여 측정하였다 (Tecan Austria GmbH, Austria). 베타-갈락토시다아제 시험의 경우, 100 의 X-gal기질을 세포 용리액과 혼합하고 550 nm에서 흡광도를 측정하하여 HIV-1 복제 저해능을 평가하였다.
그 결과 도 38에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 COS-D, COS-T, COS-Y, COS-TD 및 COS-TY 각각은 농도에 의존적으로 HIV-1 복제를 저해하는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중 COS-TD 및 COS-TY가 더욱 효과가 좋은 것으로 나타났다.
결과적으로 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY는 숙주세포와의 상호작용을 통해 HIV-1이 숙주세포에 결합하는 것을 차단할 수 있으며, 동시에 HIV-1 역전사효소 활성 억제를 통해 HIV-1 게놈의 복제를 저해하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 COS-TD 및 COS-TY는 항-HIV 의약품 소재로 유용하게 사용될 수 있다고 판단되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물;
    <화학식 1>
    Figure 112012082663338-pat00013

    상기 식에서,
    x는 하기 표의 구조식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    Figure 112012082663338-pat00014

    n은 2 내지 6의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 x가 구조식 1 또는 구조식 5인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 HIV의 역전사효소 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 x가 구조식 3 또는 구조식 4인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해에 의한 HIV 감염 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 x가 구조식 2인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 HIV의 프로테아제(protease) 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 x가 구조식 6 내지 8 중 선택된 1종인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 HIV의 역전사효소 억제 활성 및 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해에 의한 HIV 감염 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 조성물에 0.01 내지 10 mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  7. 제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 HIV 억제제.
  8. 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 인체면역결핍바이러스(HIV)의 예방 또는 개선용 건강기능식품;
    <화학식 1>
    Figure 112012082663338-pat00015

    상기 식에서,
    x는 하기 표의 구조식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    Figure 112012082663338-pat00016

    n은 2 내지 6의 정수이다.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 x가 구조식 1 또는 구조식 5인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 HIV의 역전사효소 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 x가 구조식 3 또는 구조식 4인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해에 의한 HIV 감염 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 x가 구조식 2인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 HIV의 프로테아제(protease) 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 x가 구조식 6 내지 8 중 선택된 1종인 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 HIV의 역전사효소 억제 활성 및 숙주-바이러스 막간의 상호작용 방해에 의한 HIV 감염 억제 활성을 통해 항-HIV 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 떡류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 주류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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