EP1789085A2 - Änderung des beladungszustandes von mhc-molekülen - Google Patents

Änderung des beladungszustandes von mhc-molekülen

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Publication number
EP1789085A2
EP1789085A2 EP05796212A EP05796212A EP1789085A2 EP 1789085 A2 EP1789085 A2 EP 1789085A2 EP 05796212 A EP05796212 A EP 05796212A EP 05796212 A EP05796212 A EP 05796212A EP 1789085 A2 EP1789085 A2 EP 1789085A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
och
mhc molecules
nhc
ligands
mhc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05796212A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kirsten Falk
Olaf RÖTZSCHKE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Original Assignee
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft filed Critical Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Publication of EP1789085A2 publication Critical patent/EP1789085A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to methods for changing the loading state of MHC molecules with ligands, wherein the change in the loading state is catalyzed by a compound of the formulas I, IA, II, IN or IV1 to IV3.
  • the invention furthermore relates to the use of compounds of the formulas I, IA, II, III or IV1 to 1V3 or to the use of ligand-loaded MHC molecules preparable by a method according to the invention for the treatment of diseases or conditions, which are linked to various pathologically excessive or absent immune responses, as well as to trigger tumor-specific, pathogen-specific or autoreactive immune responses.
  • the invention also relates to the use of these compounds for the treatment and diagnosis of cancer, infectious diseases, autoimmune diseases and for the attenuation of aggressive immune reactions, as well as the production of a vaccine or a pharmaceutical composition for the treatment of said diseases or conditions.
  • MHC major histocompatibility complex
  • TCR T-cell receptors
  • HLA-DM is a transmembrane protein that is also encoded in the MHC class II gene locus and accelerates ligand exchange by binding to the peptide / MHC complex.
  • the major histocompatibility complex (MHC) gene locus controls a variety of important immunological functions. It lies on the short arm of chromosome 6 of the human genome and encodes several classes of MHC molecules. In humans, the major histocompatibility complex (MHC) is referred to as HLA (human leukocyte antigen) (Wake, CT, 1986. Molecular biology of the HLA class I and class II genes, Mol Bio / Med3: ⁇ -11).
  • HLA human leukocyte antigen
  • HLA-A HLA-A
  • -B -B
  • -C Class I molecules are referred to as HLA-A, -B and -C. They describe a group of membranous, highly polymorphic glycoproteins that are used in the
  • MHC class I chains HLA-A, -B or -C
  • ⁇ 2m ⁇ 2 microglobulin
  • the heavy ⁇ chains have a short cytoplasmic domain, a transmembrane domain and three extracellular domains non-covalently linked to ß2m.
  • the antigens bound by MHC class I are peptides which almost exclusively have a length of 9-1 1 amino acids.
  • the peptide binding site is formed solely by the ⁇ -chain and consists of an eight-stranded ⁇ -sheet on which the peptides are trapped between two ⁇ -helices and bound at both ends by hydrogen bonds between the N- or C-termini of the bound Peptide and the MHC complex can be fixed.
  • Class II molecules also describe a group of highly polymorphic membrane-bound glycoproteins used for antigen presentation. Unlike MHC class I molecules, however, these are normally only expressed in a group of special antigen-presenting cells (APC) and are used predominantly for the presentation of peptides from exogenously absorbed proteins.
  • APC antigen-presenting cells
  • the formed ⁇ heterodimers consist of an ⁇ and a ⁇ chain, both of which are encoded in the MHC. Both chains have a short cytoplasmic domain, a transmembrane domain, and two extracellular domains ( ⁇ 1 and ⁇ 2, and ⁇ 1 and ⁇ 2, respectively).
  • the peptide binding cavity is formed by the ⁇ 1 and ⁇ 1 domains of both chains (Brown, JH, TS Jardetzky, JC Gorga, LJ Stern, RG Urban, JL Strominger, and DC Wiley 1993. Three-dimensional structure of the human class H histocompatibility antigen HLA-DR1, Nature 364: 33-39). Similar to class I molecules, the peptide is also bound on a ⁇ -sheet between several ⁇ -helical structures. However, unlike MHC class I molecules, the ends of the peptide binding site are open so that the peptides can protrude from the complex (Rajnavolgyi, E., A. Horvath, P. Gogolak, GK Toth, G.
  • destabilizing detergents Another alternative to loading MHC molecules with antigens is the use of destabilizing detergents, which are believed to accelerate the loading of MHC class II molecules, presumably because of their complex destabilizing effect (see Roof et al., Proc. Natl. Acad , 1990, 87: 1735-9; Avva and Cresswell, Immunity, 1994, 1: 763-74).
  • Destabilizing detergents show only a relatively low activity in the loading of MHC molecules and have the obvious disadvantage that after addition, they are no longer or only extremely difficult to separate from the MHC molecules.
  • the object underlying the present invention is therefore to provide a method for changing the loading state of MHC molecules with ligands, which is both an efficient loading of the MHC molecules with ligands, the exchange of ligands on the surface of MHC molecules, the reduction or Removal of ligands on the surface of MHC molecules, as well as their subsequent in vivo use allows.
  • a further object of the present invention is the provision of therapeutics or diagnostic agents or methods that can be carried out with these therapeutics or diagnostic agents for the treatment or detection of diseases or conditions that are linked to various pathologically exaggerated or absent immune responses.
  • the object underlying the invention is achieved by a method for changing the loading state of MHC molecules with ligands.
  • This procedure includes the following steps: a) providing a composition containing MHC molecules; and b) adding a catalyst selected from a compound of formula I or IA having the structure:
  • R 0 , R 00 , R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 12 , R 44 R 66 , R 77 , R ", R 1010 and R 1111 may be a bond or independently selected from a group consisting of:
  • CONHCH 3 C 3 H 6 OH, C (NH 2 ) (CH 2 ) n (OH), OCONH (CH 2 ) n CH 3 ; OCONH (CH 2) n CH 3 ; OCONH (CH) n (CH 2) n CH 3;
  • R 15 and R 16 are independently selected from a group consisting of
  • RO pOO p1 p7 p8 p9 pi0 p11 p12 p44 p66 p77 p99, K, K, K, K, K, K, K, K, K, K, KK, K, K , R 1010 and R 1111 are independently selected from the group consisting of a branched or unbranched C 1 -C 30 alkyl, C 1 -C 30 alkylene, Q-Qo heteroalkyl, C r C 30 heteroalkenyl, C 1 -C 30 -alkoxy, C 1 -C 30 -alkene, C 1 -C 30 , C 3 -C 8 -cycloalkyl, C 3 -C 8 -cycloalkenyl, C 5 -C 30 -aryl, C 5 -C 30 Heteroaryl, arylalkyl, arylalkenyl, C 5. 20 -aryloxy, heteroarylalkyl, heteroarylalkhen
  • R 0 , R 00 , R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R “, R 12 , R 44 R 66 , R 77 , R “, R 1010 and R 1111 may be selected together or independently from a group consisting of:
  • R 13 and R 14 are independently selected from a group consisting of
  • R 15 and R 16 are independently selected from a group consisting of H, O, S, N,
  • the compounds of the formulas I or IA are defined by the following structures I 1 to I 36:
  • the compounds covered by the formulas I and IA are also generically referred to as adamantyl compounds in the present invention, since they are based on a preferably substituted adamant basic structure.
  • any substituted adamant base structure can be used to carry out any of the processes disclosed herein. All of these conceivable substituted adamantine basic structures are adamantyl compounds.
  • the spherically symmetric adamantine basic structure may be monosubstituted, disubstituted, trisubstituted or higher, and may also be substituted on all carbon atoms forming the adamantine basic structure (10 in total).
  • the adamant-based structure has various types of carbon atoms, namely carbons coordinated twice or three times in the backbone. While only one substituent can occur on the tri-coordinated carbons, two of these can also be used on the two-coordinate carbons Be substituents. However, it is preferred to introduce only one substituent on the carbon atoms which are doubly coordinated in the skeleton. Thus, although a total of 16 substitutions may be provided in the basic adamant structure to provide compounds for methods of the invention, for example, for loading alteration or diagnosis, those substituted adamantyl structures having one, two or three substituents are preferred in the present invention different carbon atoms.
  • a long-chain substituent in the context of this invention is typically characterized by at least 8 atoms connected to one another via covalent bonds, for example a C 8 -alkyl or C 8 -alkoxy or else 8 atoms linked to one another via amide-type linkages. If further substituents occur, preferably on at least one further carbon atom in the adamant skeleton, these are preferably short-chain and typically have 6 or fewer carbon atoms connected together in chain form. Particularly preferred are monosubstituted adamantyl compounds having a substituent of at least 8 atoms in chain length.
  • the underlying object is achieved by a method for changing the loading state of MHC molecules with ligands, comprising the following steps: a) providing a composition comprising MHC molecules; and b) adding a catalyst selected from a compound of formula II having the structure: formula
  • R 1 ' , R 2' , R 3 ' and R 4 may be a bond or independently selected from a group consisting of:
  • R 13 ' and R 14' are independently selected from a group consisting of H, O, S, N,
  • R 15 ' and R 16' are independently selected from a group consisting of
  • R 1 ' , R 2' , R 3 ' and R 4' are independently selected from a group consisting of a branched or
  • Heteroarylalkyl heteroarylalkhenyl, heterocycloalkyl,
  • Tetrahydropyran piperidine, pyrrole, furan, thiophene, pyridine, Quinoline, indole, pyrimidine, pyrazine, purine, imidazole, pteridine, acridine, chroman, chromene, and coumarin (chromene-2-one), adamantane, pyrazole, diazole, tetrazole, triazole, and / or
  • R 1 'and R 2' may form together a bridged structure selected from a branched or unbranched C 1 - C 8 alkyl-Al, C 1 -C 8 -alkenyl Al, QQ-heteroalkyl, C 1 -C 8 - heteroalkenyl , C 1 -C 8 -alkoxy, C 1 -C 8 -alkyl kenoxy, C 1 -C 8 -acyl, C 3 - C 8 cycloalkyl, C 3 -C 8 -Cyc loa I -alkenyl, C 5 -C 8 -Aryl, C 5 -C 8 - heteroaryl, arylalkyl, arylalkenyl, C 5 . 8- aryloxy, heteroarylalkyl,
  • Diazole, tetrazole, triazole it being possible for each of the atoms of the bridged structure, preferably 1 to 12 atoms, independently of one another to have one or 2 substituents selected from R 1 ' or R 2' (described individually above),
  • R 1 ' , R 2' , R 3 ' or R 4' may be a bond or together or independently selected from a group consisting of:
  • R 13 ' and R 14 are independently selected from a group consisting of H, O, S, N,
  • R 1 and R 2 may together form a bridged structure selected from a branched or unbranched C 1 -
  • the object underlying the present invention is achieved by a method for changing the loading state of MHC molecules with ligands, comprising the following steps: a) providing a composition comprising MHC molecules; and b) adding a catalyst selected from a compound of formula III having the structure: Formula III
  • R 1 "and R 2" may be a bond or independently selected from a group consisting of:
  • R 13 " and R 14" are independently selected from the group consisting of H, O, S, N, OH, OR 15 " , SH, SO, SO 2 , SO 3 , HSO 3 , SR 15” , SR 15 " R 15” ,
  • X halogen, CN, CO, COOH, COOCH 3 , COOR 15 " , NH, NH 2 , NHR 13" , NR 1S “ R 16” , NO, NO 2 , NOH, NOR 15 " , CH 3 / (CH 2 ) n , (CH 2 ) n CH 3 / (CH 2 ) n R 15 " , OCH 3 , O (CH 2 ) n , O (CH 2 ) n CH 3 ;
  • R 15 " and R 16" are independently selected from a group consisting of
  • R 1 " and R 2" are independently selected from a group consisting of a branched or unbranched C 1 -C 30 alkyl, C 1 -C 30 alkylene, C r C 30 heteroalkyl, C r C 30 - Heteroalkenyl, C 1 -
  • R 3 " and R 4" are either as defined for R 1 " and R 2" or may be a bond or are independently selected from a group consisting of:
  • R 13 " and R 14" are selected independently of each other
  • R 15 " and R 16" are independently selected from a group consisting of
  • R 3 ' and R 4 " can be independently selected from a group consisting of a branched or unbranched C 1 -C 30 -alkyl, C 1 -C 30 -alkyl -alkenyl, Q-Qo-heteroalkyl, C 1 - C 30 -Heteroalkenyl, C 1 -C 30 -alkoxy, Q-Qo-alkenoxy, C r C 30 Acyl, C 3 -C 8 cycloalkyl, C 3 -C 8 cycloalkenyl, C 3 -C 30 aryl, C 5 -C 30 heteroaryl, arylalkyl, arylalkenyl, C 5 . 3 o-aryloxy, heteroarylalkyl, heteroarylalkenyl, heterocycloalkyl, heterocycloalkenyl,
  • R 3 ' and R 4 " together can form a bridged structure selected from a branched or unbranched C 1 -C 8 -alkyl, C r C 8 -alkenyl, C 1 -
  • R 1 " and R 2" may be a bond or together or independently selected from a group consisting of:
  • X halogen, CN, CO, COOH, COOCH 3 , COOR 15 " , NH, NH 2 , NHR 13" , NR 15 " R 16" , NO, NO 2 , NOH, NOR 15 " , CH 3 , (CH 2 ) n , (CH 2 ) n CH 3 , (CH 2 ) n R 15" , OCH 3 , O (CH 2 ) n , O (CH 2 ) n CH 3 ; O (CH 2 ) n R 15 " , (CH 2 ) n OH, C 6 H 4 CH 3 , C 6 H 9 ,
  • R 15 " and R 16" are independently selected from a group consisting of
  • R 3 " and R 4" are either as defined for R 1 " or R 2" or may be a bond or independently selected from a group consisting of:
  • R 13 " and R 14" are selected independently of each other
  • NHC (O) (C 4 H 2 O (CH 3 )), CH 2 (C 2 N 2 H 5 (CO) 2 ), SCFCF 3 COOCH 3 , SCH 2 (C 2 NSH (NH 2 )), C 3 N 2 H 3 , C (CH 3 ) C (O) NHC (O) CH 2 , C (CH 3 ) CH 2 NHC (O) S, C 6 H 5 , NHC (O) CHNOH, S (CH 2 J 2 (C 5 H 4 N),
  • R 15 and R 15 are independently selected from a group consisting of H, O, S, N,
  • R 3 " and R 4" together form a bridged structure selected from a branched or unbranched C 1 -C 8 -
  • the compounds of formula III are selected from the following structures:
  • the object underlying the present invention is achieved by a method for changing the loading state of MHC molecules with ligands, comprising the following steps: a) providing a composition comprising MH C-Mo I ekü Ie; and b) adding a catalyst selected from a compound of formulas IV1 to IV3; and
  • Molecules with ligands can be in any order or in parallel.
  • steps (b) and (c) may take place in parallel. Also, instead of providing the composition containing MHC molecules, first of all
  • Catalyst preferably in solution, are presented in a process step (a) and then the respective other substances are added.
  • An alkyl according to the present invention comprises linear, branched or cyclic C 1 -C 30, preferably C 1 -C 20 , more preferably C 1 -C 6 hydrocarbon structures and combinations thereof.
  • “Lower Alkyle” refer to alkyl groups of 1-6 carbon atoms. Examples of lower alkyl groups include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, s and t-butyl and the like. Cycloalkyls are a subset of the alkyls and include cyclic hydrocarbon groups of 3 to 8 carbon atoms. Examples of cycloalkyl groups include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, norbornyl and the like.
  • An alkenyl according to the present invention comprises linear, branched or cyclic unsaturated C 1 -C 30, preferably C 1 -C 20 , more preferably C 1 -C 6 hydrocarbon structures and combinations thereof.
  • “Lower alkenyls” refer to alkenyl groups of 1-6 carbon atoms, examples of lower alkenyl groups include methenyl, ethenyl, propenyl, isopropenyl, butenyl, s and t-butenyl, and the like, and cycloalkenyls are a subgroup of Alkenyls and include cyclic hydrocarbon groups of 3 to 20 carbon atoms, preferably 3 to 8 carbon atoms Examples of cycloalkenyl groups include cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl and the like.
  • a heteroalkyl or heteroalkenyl of the instant compound comprises an alkyl or alkenyl as defined above in which one or two carbons are replaced by a heteroatom such as oxygen, nitrogen or sulfur.
  • Alkoxy or alkoxyl groups according to the present invention relate to groups of 1 to 30 hydrocarbon atoms, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 8 carbon atoms, a straight, a branched or a cyclic configuration and combinations thereof, via a
  • Oxygen atom are linked to the main compound. Close examples
  • Lower alkoxy or alkoxyl groups refer to
  • Alkenoxy or alkenoxyl groups refer to groups of 1 to 30 carbon atoms, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 8 carbon atoms, unbranched, branched or cyclic unsaturated configuration, as well as combinations thereof via a Oxygen atom are linked to the main compound. Examples include methenoxy, ethenoxy, propenoxy, isopropenoxy, cyclopropenyloxy, cyclohexenyloxy and the like. Lower alkenoxy or alkenoxyl groups refer to groups of 1 to 4 carbon atoms.
  • Aryls and heteroaryls according to the present invention refer to a 5 or 6 membered aromatic or heteroaromatic ring containing 0-3 heteroatoms selected from O, N, or S; a bicyclic 9- or 10-membered aromatic or heteroaromatic ring system containing 0-5 heteroatoms selected from O, N, or S; or a tricyclic 13-or 14-membered aromatic or heteroaromatic ring system containing 0-7 heteroatoms selected from O, N, or S.
  • the aromatic 6- to 14-membered ring systems include, for example, benzene, naphthalene, indane, tetralin, and fluorene and the 5- to 10-membered aromatic heterocyclic rings include, for example, an imidazole, pyridine, indole, thiophene, benzopyranone, thiazole, furan, benzimidazole, quinoline, isoquinoline, quinoxaline, pyrimidine, pyrazine, tetrazole and pyrazole.
  • An arylalkyl or aralkyl according to the present invention means an alkyl radical as defined above bonded to an aryl as defined above.
  • aralkyl radicals examples are benzyl, phenethyl and the like.
  • Heteroarylalkyl means an alkyl radical as defined above attached to one as defined above
  • Heteroaryl ring is bound.
  • Heteroarylalkenyl means one as defined above
  • Alkylene moiety bonded to a heteroaryl ring as defined above examples include pyridinylmethyl, pyrimidinylethyl and the like.
  • a heterocycle according to the present invention represents a cycloalkyl or aryl radical as defined above in which one or two carbons are replaced by a heteroatom such as oxygen, nitrogen or sulfur.
  • Heteroaryls form a subgroup of heterocycles.
  • heterocycles falling within the scope of this invention include pyrrolidine, pyrazole, pyrrole, indole, quinoline, isoquinoline, tetrahydroisoquinoline, benzofuran, benzodioxane, benzodioxole (commonly referred to as methylenedioxyphenyl if it occurs as a substituent), tetrazole, morpholine, thiazole , Pyridine, pyridazine, pyrimidine, thiophene, furan, oxazole, oxazoline, isoxazole, dioxane, tetrahydrofuran, and the like.
  • Acyle according to the present invention refers to groups of 1 to 30, preferably 1 to 20 hydrocarbon atoms of the form RCO, more preferably from 1 to 8 carbon atoms, wherein R may be any of the above groups.
  • Exemplary acyl groups of the present invention are methanoyl, acetyl, ethanoyl, propanoyl, butanoyl, malonyl, benzoyl, and the like.
  • alkyl, alkenyl, heteroalkyl, heteroalkenyl, alkoxy, alkenoxy, acyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, arylalkenyl, aryloxy, heteroarylalkyl, heteroarylalkenyl, heterocycloalkyl, heterocycloalkenyl, carboxamido, acylamino, amidino, adamantyl or heteroaryloxy according to the present invention may be substituted.
  • alkenyl, heteroalkyl, heteroalkenyl, alkoxy, alkenoxy, acyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, arylalkenyl, aryloxy, heteroarylalkyl, heteroarylalkenyl, heterocycloalkyl, heterocycloalkenyl, carboxamido, acylamino, amidino, adamantyl or heteroaryloxy radicals refer to alkyl, alkenyl, heteroalkyl, heteroalkenyl, alkoxy, alkenoxy, acyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, arylalkenyl, aryloxy, heteroarylalkyl, heteroarylalkenyl, heterocycloalkyl, heterocycloalkenyl, carboxamido, acyla
  • a halogen X typically comprises the halogens F, Cl, Br, and I.
  • the pseudohalogens CN or CO can also be used.
  • All compounds described in accordance with the present invention may contain one or more asymmetric centers and thus form enantiomers, diastereomers, and other stereomeric forms designated (R) -or (S) - according to the terms of absolute stereochemistry.
  • the present invention includes such possible isomers as well as their pure and racemic forms.
  • Optically active (R) or (S) isomers can be prepared using Synthosan or chiral reagents or resolved using standard techniques. If the compounds described herein contain olefinic double bonds or other centers of geometrical asymmetry, unless otherwise stated, geometric E and Z isomers are also included. In an analogous manner, all tautomeric forms are included according to the invention.
  • Substance libraries are isolated.
  • small molecules have been made from a
  • MHC molecules used in a method according to the present invention can be obtained from various natural sources or via recombinant methods.
  • natural sources of MHC molecules are, for example, cells or tissues of human or animal origin, even more preferably endogenous or non-body-specific dendritic cells, such as mature and non-matured dendritic cells, and also B cells or macrophages or other antigens presenting cells.
  • Natural sources of MHC molecules within the meaning of the present invention also preferably comprise body fluids containing the previously defined cells, for example blood, lymph, or tissue, etc.
  • MHC molecules derived from natural sources and used in a method according to the present invention can be used in isolated form or together with the cells with which they are associated.
  • MHC molecules can be obtained from natural sources, ie from cells, body fluid, lymph, etc., and isolated by means of biochemical purification methods, for example chromatographic methods, centrifugation methods, dialysis methods, antibody binding methods, etc. This is done, for example, by splitting off the extracellular portion of the contained therein cells by washing steps and / or cleavage with proteases from the example contained in body fluids or lymph cells associated with MHC molecules. Subsequently, the MHC molecules are preferably isolated from the extracellular fraction split off by biochemical purification methods, for example via antibody binding methods. These isolated MHC molecules thus obtained can then be used in a method according to the invention.
  • biochemical purification methods for example chromatographic methods, centrifugation methods, dialysis methods, antibody binding methods, etc. This is done, for example, by splitting off the extracellular portion of the contained therein cells by washing steps and / or cleavage with proteases from the example contained in body fluids or lymph cells associated with MHC molecules.
  • MHC molecules can be used from natural sources together with their associated cells without further isolation of the MHC molecules in a method according to the invention.
  • the cells are isolated as such together with the MHC molecules.
  • Methods for obtaining cells are known to a person skilled in the art.
  • 'the present invention from natural sources can be a patient preferably dendritic cells, more preferably graduated and / or Vietnamese dendritic cells, or B cells or macrophages, or other MHC molecules expressing cells separately for the extraction of MHC molecules within the meaning or in collections of several cells and purified. Cell purification procedures are also known to those skilled in the art.
  • the components of a cell or tissue sample from a natural source are subjected to separation by density. Separation based on the density can be carried out by means of chromatographic methods, for example by exclusion chromatography or FPLC, or by means of centrifugation, preferably a density gradient centrifugation, for example via a Ficoll separation solution.
  • the cells are typically enriched by adhesion of the desired target cells to a matrix or a solid phase, for example to nylon wool, and unwanted cells are depleted.
  • a solid phase or a matrix in the sense of the present method is any surface to which MHC molecules can bind directly, via a linker, a label or via their affinity.
  • the cells can enriched by chromatographic methods / for example by chromatographic exclusion or FPLC method. If necessary, after a first enrichment, the number of cells present in the cell suspension can be determined. Subsequently, the lines are typically separated from the resulting cell suspension by chromatographic methods, by binding to a solid phase, by magnetic sorting using a MACS method (Magnetic Activated Cell Sort), or by comparable methods. For example, magnetic sorting of cells allows the quantitative yield of high purity cell populations from different tissues.
  • the cells are preferably sorted negatively in the separation, ie all unwanted cells are depleted from the cell mixture.
  • the desired cells can also preferably be sorted positively directly from the cell mixture.
  • the cells may preferably be labeled with a cell-type-specific monoclonal antibody which may be bound to a solid phase or to particles, such as superferromagnetic particles (m / crobeads).
  • a first specific monoclonal antibody can be recognized by a second antibody which is bound to a solid phase, usually microbeads, and recognizes the Fc portion of the first antibody.
  • the cells may be separated from the column or solid phase, typically by elution. After magnetic sorting by means of a MACS method and binding to microbeads, the cells can typically be separated in a magnetic field via a column.
  • the purification of the cells typically takes place at any time with cooling, preferably with cooling on ice. If necessary, the obtained cell suspensions are washed once or several times with suitable buffer solutions, for example PBS, at any time during the purification. After purification, the cells obtained are either stored or used directly. The cells are usually stored in a buffer containing the cells under physiological conditions Conditions and does not cause any osmotic pressure.
  • Suitable buffers include PBS buffer, RSA-PBS buffer (BBS with bovine serum albumin (RSA)), FKS-PBS buffer (PBS buffer with fetal calf serum (FKS)), phosphate buffer, TRIS-HCl buffer, Tris Phosphate buffer, or other suitable buffers, such as Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) or RPMI with 5-10% FCS., The latter two are particularly suitable for storage of cells.
  • the cells can be stored in nutrient medium and / or used, for example FKS / 10% DMSO.
  • MHC molecules for use in any of the methods of the invention may also be provided by recombinant methods.
  • Methods for the recombinant production of MHC molecules are known to a person skilled in the art (see, for example, J. Sambrook, EF Fritsch, T. Maniatis, 2001, "Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbor, NY: CoId Spring Harbor Laboratory Press).
  • vectors encoding MHC molecules are introduced into suitable line expression systems that express MHC molecules, then harvested, and the MHC molecules are purified by biochemical purification techniques, such as chromatographic, centrifugation, dialysis, etc.
  • MHC molecules used in a method according to the invention are typically MHC monomers or multimers, preferably MHC monomers or multimers of classes I and II.
  • MHC molecules which are obtained via a recombinant method are typically present in a monomeric form.
  • MHC molecules derived from a natural source are also usually monomeric.
  • MHC molecules isolated or recombinantly produced from natural sources can be biotinylated and subsequently bound. The binding of the biotinylated MHC molecules to fluorescently labeled streptavidin molecules results in multimeric MHC complexes, preferably tetrameric complexes, since four binding sites for biotin exist on the streptavidin.
  • MHC molecules can be multimerized isolated from natural sources or recombinantly produced MHC molecules, preferably in MHC tetramers or pentamers of the classes I and II.
  • a self-assembling "coiled-coil domain // is preferably together with a recombinant MHC molecule co-expressed.
  • any further known method for the multimerization of MHC molecules can be used. One skilled in the art knows of such methods.
  • Another possibility of multimerization is the covalent or non-covalent binding of the molecules to surfaces, such as culture plates or so-called microbeads.
  • MHC multimers loaded with ligands by a method according to the present invention are preferably capable of selectively binding to T cells whose T cell receptor specifically recognizes the ligand loaded on the complex.
  • MHC molecules used in a method of the invention may be labeled.
  • the MHC molecules whose loading state is changed according to a method of the present invention preferably MHC multimers, are preferably labeled prior to the change of their loading state.
  • the MHC molecules contain labels that allow the generation of a directly or indirectly detectable signal.
  • radioactive modifications eg radioactive phosphorylation or radioactive labeling with sulfur, hydrogen, carbon, nitrogen,
  • colored groups e.g., digoxygenin, etc.
  • fluorescent groups e.g., fluorescein, etc.
  • immobilization groups on a solid phase e.g., biotin, streptag, antibodies, antigens, etc.
  • MHC molecules used in a method of the invention typically occur in a closed, unloaded, non-receptive, or open-receptive conformation.
  • the MHC molecule In the closed non-receptive conformation, the MHC molecule is preferably incapable of accepting or donating ligands.
  • a transition between these different conformations of an MHC molecule typically occurs through a corresponding shift in the equilibrium of the reaction, ie, an equilibrium shift between the closed, unloaded, non-receptive conformation; the open, unladen, receptive conformation; and the open, loaded, receptive conformation.
  • the MHC molecules are preferably converted from a closed, unloaded, non-receptive conformation into an open, uncharged, receptive conformation by the compounds of formulas I, IA, II, III and IV1 to IV3 used.
  • the MHC molecules are directly transferred from a closed, unloaded, non-receptive conformation to an open, loaded, receptive conformation.
  • the MHC molecules can be loaded with ligands or it can an exchange of ligands take place at the MHC molecule.
  • the MHC molecule in the open, unloaded, receptive conformation is preferably capable of accepting a ligand.
  • the ligand of an MHC molecule can be exchanged in the open, loaded, receptive conformation.
  • loading of the MHC molecule with ligands from the closed, unloaded, non-receptive conformation can also be performed directly using the compounds of the formulas I, IA, II, III and IV1 to IV3 according to the invention.
  • Monomers or multimeric MHC molecules used in a method of the invention may be uncharged or already loaded with ligands.
  • the MHC molecules are typically uncharged after their purification.
  • MHC molecules isolated from natural sources or the MHC molecules isolated together with their associated cells may also be uncharged after purification.
  • Such uncharged MHC molecules can be loaded with desired ligands by a method according to the present invention.
  • a change in the loading state of MHC molecules with ligands in this case therefore preferably means the loading of (previously uncharged) MHC molecules with ligands.
  • MHC molecules may already be loaded with ligands both after their recombinant production and after their isolation from natural sources.
  • the number of ligands on the surface of such loaded MHC molecules can be reduced in a method according to the invention or the ligands can be completely removed.
  • Changing the loading state of MHC molecules with ligands in this case therefore preferably means decreasing the loading state of (previously loaded) MHC molecules with ligands, optionally complete removal of ligands from (previously loaded) MHC molecules.
  • ligands of (previously loaded) MHC molecules can be exchanged for other desired ligands using the methods of the invention.
  • a change in the loading state of MHC molecules with ligands In this case, therefore, preference is given to exchanging ligands of (previously loaded) MHC molecules for desired ligands.
  • For this purpose preceded by a removal or reduction of existing ligands on the MHC molecule according to a method of the invention, and then the reloading of MHC molecules with desired ligands according to a method of the invention.
  • ligands of MHC molecules are native and non-native compounds that bind to MHC molecules under physiological conditions.
  • Particularly preferred in this context are ligands of MHC molecules, antigens, in particular tumor- or pathogen-specific antigens, peptide antigens, tissue-specific self-antigens, antigens of autoreactive T cells or fragments of such antigens, preferably with a length of 8-25 amino acids, more preferably with a length from 8-15 amino acids.
  • composition provided in a process according to the invention can be described in
  • Step (a) be an aqueous composition.
  • buffers for example pH 5.0-8.5, preferably pH 7.0-8.0, 50-200 mM NaCl, preferably about 137.0 mM NaCl, 0.5-5 mM KCl, preferably 2.7 mM KCl, preferably 1-10 mM Na 2 HPO 4 , preferably 4.3 mM
  • PBS buffer for example pH 5.0-8.5, preferably pH 7.0-8.0, 50-200 mM NaCl, preferably about 137.0 mM NaCl, 0.5-5 mM KCl, preferably 2.7 mM KCl, preferably 1-10 mM Na 2 HPO 4 , preferably 4.3 mM
  • bovine serum albumin preferably pH 5.0-8.0, 50-200 mM NaCl, preferably about 137.0 mM NaCl , 0.5-5 mM KCl, preferably 2.7 mM KCl, preferably 1-10 mM Na 2 HPO 4 , preferably 4.3 mM Na 2 HPO 4 , 0.1-5 mM KHPO 4, preferably 1.4 mM KHPO 4 ),
  • FKS-PBS buffer for example pH 5.0-8.5, 1-15 wt% bovine serum albumin (RSA), preferably pH 5.0-8.0, 50-200 mM NaCl, preferably about 137.0 mM NaCl , 0.5-5 mM KCl, preferably 2.7 mM KCl, preferably 1-10 mM Na 2 HPO 4 , preferably 4.3 mM Na 2 HPO 4 , 0.1-5 mM KHPO 4, preferably 1.4 mM KHPO 4 ),
  • FKS-PBS buffer for example pH
  • fetal calf serum preferably pH 5.0-8.0, 50-200 mM NaCl, preferably about 137.0 mM NaCl, 0.5-5 mM KCl, preferably 2.7 mM KCl, preferably 1-10 mM Na 2 HPO 4 , preferably 4.3 mM Na 2 HPO 4 , 0.1-5 mM KHPO 4, preferably 1.4 mM KHPO 4 ), phosphate buffer (for example pH 5.0-8.5, preferably pH 7.0, 20-80 mM Na 2 HPO 4 , preferably 57.7 mM Na 2 HPO 4 , 10-60 mM NaH 2 PO 4, preferably 42.3 mM NaH 2 PO 4 ), TRIS-HCl buffer (for example 0.5-3.0 M TRIS with HCK conc.), Preferably 1 -1, 5 M TRIS adjusted to pH 6.8-8.0 with HCl (conc.)), Tris-phosphate buffer (for example
  • the concentrations mentioned are preferably the concentrations in the buffer solutions before their addition to the composition. Typically, 0 to 15.0% by volume is added to the composition.
  • the composition provided in the process of the invention may also contain organic solvents. Organic solvents are preferably selected from the following group: DMSO, ethanol, methanol, acetone and the like, more preferably 0.1-1% DMSO.
  • the pH of the composition is typically 6.0-8.5, preferably 6.5-7.5.
  • the composition may contain, in addition to the aqueous solution or the organic solvent, a polar solvent, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), TFE (tetrafluoroethylene), hexamethylphosphoric trisamide (HMPT), hexamethylphosphoramide (HMPA), or the like.
  • a polar solvent for example, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), TFE (tetrafluoroethylene), hexamethylphosphoric trisamide (HMPT), hexamethylphosphoramide (HMPA), or the like.
  • the final concentration of the polar solvent in the composition may preferably be 0.05-15% by weight, more preferably 0.1-5% by weight, and even more preferably 0.5-2% by weight.
  • the loading is carried out in DMEM or RPMI buffers.
  • the molar ratio of MHC molecule to ligand is 0.1: 10 to 10: 0.1.
  • the molar ratio of ligand to MHC molecule is 0.5: 5 to 5: 0.5, more preferably 0.75: 2.5 to 2.5: 0.75.
  • the inventive method is loading the MHC molecules with ligands or ligand exchange of MHC molecules preferably at a temperature of 20-40 0 C, even more preferably at a temperature of 24-39 ° C, preferably at most a temperature of 36-38 ° C.
  • the amount of the ligand charged or exchanged for an MHC molecule by the method according to the invention is preferably controlled.
  • a loading state can be achieved which results in an equal loading, an increase or, alternatively, a decrease in the loading of MHC molecules with ligands compared to the loading of MHC molecules in vivo Conditions, or in comparison to the loading of the MHC molecules contained in the composition before carrying out the method according to the invention.
  • the change in the loading state of MHC molecules with ligands to a reload of previously uncharged MHC molecules, to a partial or complete removal of existing ligands, or to exchange existing ligands against other desired ligands to lead.
  • step (c) a change in the loading state of (non-loaded) MHC molecules with ligands by addition of potential ligands, in particular peptides, for example peptide ligands, to the composition containing MHC molecules according to method step (A), and compounds of formulas I, IA, II, III and IV1 to IV3 (catalyst) according to process step (b) achieved.
  • concentrations of MHC molecules, ligands and catalysts are preferred as above described.
  • the method steps (a), (b) and (c) of the method according to the invention for changing the loading state of MHC molecules with ligands described herein can be carried out in any order or in parallel.
  • steps (b) and (c) may take place in parallel.
  • steps (b) and (c) may take place in parallel.
  • the compounds of the formulas 1, IA, 11, 111 or 1V1 to 1V3, preferably in solution are presented in one process step and then the respective other process steps are carried out, such as Addition of ligands and / or MHC molecules.
  • all steps (a), (b) and (c) can be performed simultaneously.
  • a change in the loading state of MHC molecules already loaded with ligands is achieved by a partial or complete exchange of ligands already present on the MHC molecule for other desired ligands.
  • Microbeads, etc., or immobilized via linkers available in the art, such as tags such as a His tag, can be used in the washing steps, any suitable buffer described above, then typically the desired ligand in a second step (ii) and optionally a further amount of the compounds of the formulas I, IA, II, III or IV1 to IV3 (catalysts) added to the composition and incubated together with the MHC molecule.
  • the desired new ligand may already be added to the composition.
  • the new ligand binds to the MHC molecule, preferably by shifting the concentration equilibrium, ie the new ligand is preferably present in such a concentration that displacement of the previously bound ligand by the new ligand using the compounds of the formulas I, IA , II, III or IV1 to IV3 (catalysts).
  • the method steps (a) and (b) and the alternative step (c ') described here of the method according to the invention can therefore be carried out in any order or in parallel. For example, steps (a), (b) and (c ') may take place in parallel.
  • the catalyst preferably in solution, in a process step (a) are submitted and then step (b) are performed.
  • Step (c ') is typically performed after steps (a) and (b), but may alternatively be performed in parallel with steps (a) and (b).
  • a change in the loading state of MHC molecules already loaded with ligands leads to a reduction in the loading density of ligands of the MHC molecules.
  • a washing step is carried out which separates the ligands dissolved from the MHC molecule by means of the compounds of the formulas I, IA, II, III or IV1 to IV3 from the MHC molecules on a solid phase, eg Sepharose, beads, microbeads, eg over in the state of the art nik available linker, eg tags such as a His-tag, etc., be immobilized.
  • any suitable buffer described above may be used in the washing steps.
  • the process steps (a), (b) and (c ") of the embodiment of the process according to the invention described here can be carried out in any order or in parallel Alternatively, instead of providing the composition containing MHC molecules, first of all the catalyst, preferably in solution, can be initially introduced in one process step and then the respective other steps (b) and (b) (c "), such as, for example, addition of ligands and / or MHC molecules. Also, all steps (a), (b) and (c ") can be performed simultaneously.
  • the peptide binding region is preferably a peptide binding region of an MHC class I or MHC class II molecule
  • the peptide binding region of an MHC I molecule is formed by the ⁇ chain of the MHC class I molecule and consists of a ⁇ -sheet formed from eight strands on which the peptides are sandwiched between two ⁇ -helices and fixed at both ends by hydrogen bonds between the N- and C-termini, respectively
  • the MHC class 1 molecule of the MHC class I molecule usually contains several binding pockets: the specificity of a ligand to the peptide binding region of an MHC K I-molecule is typically prepared by binding the amino acid side chains with one of these binding pockets.
  • the binding pocket is preferably selected from the binding pockets A, B, C, D, E and F, which preferably take up the side chains of the ligands.
  • the peptide binding region of an MHC II molecule is typically formed by the Oc 1 and ⁇ 1 domains of the ⁇ and ⁇ chains forming MHC II molecules.
  • the peptide binding region of the MHC II molecule also usually contains one to several binding pockets.
  • the binding pocket is preferably selected from the binding pockets P1, P3, P4, P6, P7, and P9 preferably take up the side chains of the ligands.
  • the specificity of the ligand to the peptide binding region or preferably to a peptide binding pocket, by binding of the amino acid side chains to the described binding pocket.
  • the binding of the ligand is produced, in particular, by a binding to the binding pocket P1 of a MHC molecule of class II, which differs essentially only in the HLA-DR molecules by the occupation of the dimorphic residue ⁇ 86.
  • the binding of the ligands or the stability of the complexes can also be influenced by further regions which lie outside the actual peptide binding region.
  • the pH-dependent destabilization is significantly influenced by a region that lies below the binding pit.
  • His33 a histidine residue is located (His33), which bridges the ⁇ r domain with the ⁇ 1 domain and is directly influenced by protons and possibly also other H donors (Rötzschke et al., PNAS, 2002, 99: 16946-16950).
  • a step d) of the method according to the invention the isolation of ligand-loaded MHC molecules takes place, for example, via a biochemical or biophysical isolation method or via a method for isolating cells, as described above.
  • Biophysical and biochemical detection methods or isolation methods for the purposes of the present invention are preferably spectroscopic methods, sequencing reactions, immunological methods, or chromatographic methods.
  • spectroscopic methods are preferably selected from an NMR, light scattering, Raman, UV, VIS, IR, circular dichroism method, mass spectrometric analysis (MS) or X-ray structure analysis.
  • MS mass spectrometric analysis
  • a sequencing reaction is preferably understood as meaning peptide or nucleic acid sequencing.
  • Immunological methods are preferably selected from ELISA methods, antibody binding assays, immunofluorescence detection methods or Western Blots.
  • Chromatographic methods according to the present invention are preferably adsorption chromatography, partition chromatography, ion exchange chromatography, exclusion chromatography or affinity chromatography. Preference is given to further carrying out a chromatography by means of Ni-NTA agarose, an HPLC, an FPLC, or a reversed-phase (RP-reversed phase) chromatography.
  • Another object of the present invention is a method for the determination of substances that can change the loading state of MHC molecules.
  • Such a method can be performed using both a loaded and an unloaded MHC molecule, and can be based, for example, on a kinetic measurement of ligand dissociation and / or ligand binding, or on the detection of their underlying conformational changes.
  • Experimentally observed effects of possibly changing the loading state substances in a method of the invention for determining the same then, for example, in an accelerated dissociation of ligands bound to MHC and / or in an accelerated binding of uncharged MHC molecules added ligands, in particular peptides.
  • spectroscopic or thermodynamic measurement methods in particular in connection with conformation-specific antibodies, can also be used to determine the effects of test substances and thus to identify them.
  • Process step (a) Specification of MHC molecules loaded with ligands, for example in solution or on a surface, for example a metal surface, in particular gold surface, (b) addition of a substance to be tested and (c) measurement of the
  • the Measurement can, for example., As mentioned above, carried out by kinetic measurement, or else by concentration measurement of the dissociated and / or remaining on the MHC molecules ligands.
  • the concentration measurement can be carried out by appropriate spectroscopic methods (for example surface plasmon resonance, which can detect the difference between loaded or unloaded MHC molecule) or by, for example, spectroscopically detectable changes between the loaded or unloaded MHC molecules (eg altered fluorescence or absorption properties of the bound or unbound ligands in the complex or the complex).
  • spectroscopic methods for example surface plasmon resonance, which can detect the difference between loaded or unloaded MHC molecule
  • spectroscopically detectable changes between the loaded or unloaded MHC molecules eg altered fluorescence or absorption properties of the bound or unbound ligands in the complex or the complex.
  • microcalorimetric or other methods familiar to those skilled in the art can be used to detect the changes caused by addition of the test substances in process step (b) compared to the starting state
  • Process step (a) unladen MHC molecules in, for example, solution or on a surface, for example.
  • Process step (b2) a ligand of the MHC molecule.
  • the method steps (b1) or (b2) can also be carried out simultaneously, i. in such a case will be one
  • Process step (c) is measured by the above-mentioned methods, for example by kinetic measurements, the loading of the MHC molecules with the ligand, wherein the evaluation is preferably carried out by comparing the experimental results without adding the test substance. This then again suitable test substances can be specified.
  • test substances having the property of changing the loading state of MHC molecules two or more different test substances, typically in a mixture, can be added be added to a trial. This allows a higher throughput of test substances.
  • the one or more test substance (s) positive in its action (s) must be identified in a positive experimental approach.
  • methods according to the invention can be carried out by means of a competition assay.
  • the embodiment 1 is modified so that in the process step (b) not only the test substance is added, but rather before, simultaneously with or after the addition of the test substance, a second ligand for the MHC molecule is added to the experimental approach.
  • the concentration of the second ligand on the MHC molecules or the kinetics of the binding of the second ligand to the MHC molecule is determined.
  • the effect of the test substance thus results again from the comparison of the experiments without addition and after addition of the test substance.
  • a further object of the present invention relates to the use according to the invention of the compounds of the formulas I, IA, II, IH or IV1 to IV3 alone or optionally together with one or more ligands, e.g. Peptides, for the production of vaccines.
  • compounds of formulas 1, IA, II, Ul or 1V1 to IV3 may be used together with ligands, e.g. Peptides, proteins or antigen-containing cell extracts can be used as a peptide vaccine for the preparation of vaccines, in particular peptide vaccines.
  • MHC molecules whose loading state has been altered can be used to make vaccines.
  • the vaccines of the present invention typically comprise compounds of formulas I, IA, II, III or IV1 to IV3 (catalysts) alone or optionally together with one or more ligands, eg peptides, especially antigenic peptides, especially peptides of tumor antigens or from Surface proteins of pathogens, for example peptides of viral or bacterial surface proteins.
  • ligands eg peptides, especially antigenic peptides, especially peptides of tumor antigens or from Surface proteins of pathogens, for example peptides of viral or bacterial surface proteins.
  • the compounds of the formulas I, IA, II, III or IV1 to IV3 can thus be incorporated as adjuvants into a vaccine according to the invention.
  • the adjuvant properties of the abovementioned compounds are based on the ability of the abovementioned compounds according to the invention to change the loading state of the patient's own MHC molecules and thus to increase the effect of the ligands used for vaccination.
  • the aforementioned compounds of the formulas I, IA, II, III or IVl to IV3 fulfill the typical adjuvant properties which consist in further enhancing the immune response, for example against tumors or against pathogens, caused by the ligands, in the present case by the relevant loading with ligands of a vaccine according to the invention on the MHC-expressing immune cells of the vaccinated patient is increased.
  • adjuvants may be incorporated as adjuvants into a vaccine according to the invention, advantageously one or more other adjuvants will have to be selected depending on the immunogenicity and other properties of the antigenic ligand in the vaccine according to the invention.
  • complete Freund's adjuvant can be used.
  • adjuvants may be selected from, for example, TDM, MDP, muramyl dipeptide, Alum solution, CpG oligonucleotides or Pluronics.
  • the antigenic ligand can also be chemically coupled to KLH ("keyhole limpet haemocyanin”), a very immunogenic foreign protein, or else KLH, without chemical coupling to the ligand, in a vaccine according to the invention be included as adjuvants cytokines, in particular interferons, for example. IFN-gamma, or GM-CSF, M-CSF or G-CSF.
  • Such vaccines are particularly applicable to the indications mentioned below, especially anticancer or anti-infective therapies, and can be administered to a patient in vitro or in vivo.
  • Inventive vaccine can be administered directly to a patient intravenously or subcutaneously.
  • Changing the loading state of MHC molecules with ligands preferably occurs in vivo, ie loading of ligands, exchange of ligands or reduction of ligands on MHC molecules typically takes place in the patient by administration of the vaccine.
  • Such vaccines according to the invention can also be administered by means of a dialysis procedure.
  • the change in the loading state of MHC molecules also preferably takes place in vivo.
  • cells, body fluids, etc. for example from the lymph, can be taken from the patient and mixed with a vaccine according to the invention in vitro.
  • the change in the loading state of the associated with these cells, body fluids, etc. MHC molecules also takes place preferably in vitro.
  • the cells can be returned to the patient, for example by means of a dialysis procedure or by intravenous or subcutaneous injection.
  • vaccines containing ligand-loaded or unloaded MHC molecules the loading state of which has preferably been modified by a method according to the invention, optionally together with one or more ligands and / or with one of the compounds of the formulas 1, IA, 11, HI or IVI to IV3 included.
  • vaccines may contain compounds of the formulas I, IA, II, III or IV1 to 1V3, as well as MHC molecules additionally loaded with ligands or unloaded, the loading state of which has preferably been changed by a process according to the invention.
  • vaccines may contain compounds of the formulas I, IA, II, III or IV1 to IV3, ligands and additionally MHC molecules loaded or unloaded with ligands whose loading state has been altered by a method according to the invention.
  • those MHC molecules are used whose loading state has been changed by a method according to the invention.
  • those MHC molecules that after a have been loaded with peptides according to the invention, especially with antigenic peptides, in particular peptides of a tumor antigen, or peptides which trigger an immune response under physiological conditions.
  • ligands and / or catalysts together with the MHC molecules already contained in the vaccine makes it possible to control the loading density of the MHC molecules in the vaccine by a corresponding adjustment of the equilibrium in the solution. This is of particular interest if vaccines are not used immediately after preparation but are first stored. Furthermore, by such a vaccine in vivo and / or in vitro, if necessary, an increased change in the loading state of MHC molecules with certain (eg desired) ligands can be achieved.
  • Vaccines are typically formulated in liquid or solid form.
  • the concentrations of the contained catalysts are typically in a range as described above, ie at a concentration of 0.001-500 mM, preferably at a concentration of 0.001-250 mM, even more preferably at a concentration of 0.001-100 mM.
  • the ligands used in the vaccines of the invention are typically the ligands previously defined in this specification.
  • the MHC molecule contained in the vaccines is typically employed unloaded or loaded prior to use with a ligand as defined above, even more preferably with peptide antigens or with fragments of such antigens, preferably 8-25 amino acids in length, more preferably one length from 8-15 amino acids.
  • the MHC molecule used for the production of a vaccine can be an MHC monomer as described above or an MHC multimer.
  • the MHC monomer or MHC multimer is particularly preferably an MHC monomer or MHC multimer as described above, or an MHC tetramer or pentamer, from MHC classes I or II.
  • MHC molecules loaded with ligands by the methods according to the invention, or compounds of the formulas I, IA, II, III or 1V1 to IV3 according to the invention together with one or more ligands as defined in the present invention for example, the vaccines according to the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the choice of a pharmaceutically suitable carrier is basically determined by the way in which the vaccines according to the invention are administered.
  • the vaccines prepared by a method according to the invention can be administered systemically. Routes for administration include transdermal, oral, parenteral, including subcutaneous or intravenous injections, topical and / or intranasal routes.
  • Another object of the present invention relates to the use of vaccines prepared by a method according to the invention for therapeutic purposes.
  • cells or tissues preferably dendritic cells, particularly preferably mature and non-matured dendritic cells
  • dendritic cells preferably mature and non-matured dendritic cells
  • the isolation methods used were described previously.
  • the MHC molecules which are obtained by such a method together with the endogenous cells of a patient, can then preferably be loaded by a method according to the invention with ligands or the existing ligands of the MHC molecule can be exchanged for desired ligands or the number of existing Ligands are reduced.
  • such desired ligands are antigens, even more preferably peptide antigens, protein antigens or tumor antigens, in particular from tumor cell lysates.
  • the MHC molecules loaded in this way are preferably returned together with the dendritic cells to the patient in a subsequent vaccination process, for example via reinjection or dialysis.
  • dendritic cells or MHC molecules then preferentially induce tumor-specific immune responses in the patient, leading to rejection and destruction of the transformed tissue.
  • the vaccines according to the invention are used for the treatment of exemplary indications mentioned below.
  • vaccines according to the present invention can be used to treat those diseases or conditions associated with various pathologically exaggerated or absent immune responses.
  • Such vaccines according to the invention are preferably used to trigger tumor-specific or pathogen-specific immune responses.
  • such vaccines according to the present invention may contain, for example, compounds of the formulas I, IA, II, III and IV1 to IV3 according to the invention optionally together with one or more ligands, or alternatively those according to a method according to the invention with ligands loaded MHC molecules, preferably MHC multimers loaded with ligands, more preferably Class II MHC multimers loaded with ligands, in which the loading state has been reduced or in which the ligands have been removed or exchanged, used to attenuate aggressive immune reactions.
  • antigen-presenting cells are loaded with ligands to induce, attenuate or suppress immune responses.
  • the antigen-presenting cells are selected, for example, from the body's own or non-body mature and non-matured dendritic cells, IDO + DC cells, B cells or macrophages.
  • the MHC molecules loaded with ligands according to a method according to the invention can be used for the treatment of cancer, preferably selected from colon carcinomas, melanomas, renal carcinomas, lymphomas, acute myeloid leukemia (AML), acute lymphoid leukemia (ALL), chronic myeloid leukemia ( CML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), gastrointestinal tumors, lung carcinomas, gliomas, thyroid tumors, breast cancers, prostate tumors, hepatomas, various virus-induced tumors such as papillomavirus-induced carcinomas (eg cervical carcinoma), adenocarcinomas, herpesvirus-induced tumors (eg Burkitt's Lymphoma, EBV-
  • Thyroid carcinoma Bladder cancer, Hodgkin's syndrome, Meningeome, Schneeberger's disease, Bronchial carcinoma, Pituitary tumor, Mycosis fungoides, Esophageal cancer, Breast cancer, Carcinoid, Neurinoma, Spinal iom, Burkitt's lymphoma, Throat cancer, Kidney cancer, Thymoma, Corpus carcinoma, Bone cancer, Non-Hodgkin's lymphoma , Urethral cancer, CUP, head and neck tumors, oligodendroglioma, vulvar cancer, colon cancer, colon carcinoma, esophageal carcinoma, wart involvement, small bowel tumors, craniopharyngioma, ovarian carcinoma, soft tissue tumors, ovarian cancer, liver cancer, pancreatic carcinoma, cervical carcinoma, endometrial carcinoma, liver metastases, penile cancer, tongue cancer , Gallbladder cancer, leukemia, plasmocytoma, uterine cancer, eyelid
  • Another object of the present invention relates to the use of MHC molecules loaded with ligands, which can be prepared by a process according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of the above-mentioned indications.
  • compositions form a further subject of the present invention.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention typically comprise a safe and effective amount of the compounds of Formulas I, IA, II, III and IV1 to IV3 of the invention, preferably as defined above, optionally together with one or more ligands as defined in the present invention.
  • ligands as defined in the present invention.
  • pharmaceutical compositions preferably comprise a safe and effective amount of the MHC molecules whose loading state has been altered with ligands by a method of the invention, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier and other excipients and additives.
  • safe and effective amount means an amount of a compound that is sufficient to significantly induce a positive modification of the condition to be treated but low enough to avoid serious side effects (with a reasonable benefit / risk ratio ), within the scope of reasonable medical judgment.
  • a safe and effective amount of a compound will vary with the particular condition being treated, the age and physical condition of the patient being treated, the severity of the condition, the duration of the treatment, the nature of the concomitant therapy, the particular pharmaceutical used appropriate vehicle and similar factors within the knowledge and experience of the attendant physician.
  • the pharmaceutical according to the invention is an amount of a compound that is sufficient to significantly induce a positive modification of the condition to be treated but low enough to avoid serious side effects (with a reasonable benefit / risk ratio ), within the scope of reasonable medical judgment.
  • a safe and effective amount of a compound will vary with the particular condition being treated, the age and physical condition of the patient being treated, the severity of the condition, the duration of the treatment, the nature of the concomitant therapy, the particular pharmaceutical used appropriate vehicle and similar factors within the knowledge and experience of
  • compositions may further be used for human as well as veterinary purposes.
  • the pharmaceutical Compositions of the present invention include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier preferably includes one or more compatible solid or liquid fillers, diluents or encapsulating compounds which are suitable for administration to a subject.
  • compatible means that the components of the composition are capable of being mixed together with the compound and with each other in such a manner that no interaction occurs which substantially affects the pharmaceutical effectiveness of the composition under ordinary conditions of use would reduce.
  • pharmaceutically acceptable carriers must have sufficiently high purity and sufficiently low toxicity to render them suitable for administration to a subject to be treated.
  • sugars such as lactose
  • Glucose and sucrose starches such as corn starch or potato starch;
  • Cellulose and its derivatives such as sodium carboxymethylcellulose,
  • Lubricants such as stearic acid, magnesium stearate; Calcium sulfate; vegetable oils, such as peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, olive oil,
  • Grain oil and oil from theobromine Polyols, such as polypropylene glycol, Glycerol, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol; alginic acid; Emulators, such as the Tweene®; Wetting agents, such as sodium lauryl sulfate; coloring agents; taste-promoting agents, excipients; tablet-forming agents; stabilizers; antioxidants; Preservatives; pyrogen-free water; isotonic saline and phosphate buffered solutions.
  • Polyols such as polypropylene glycol, Glycerol, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol
  • alginic acid Emulators, such as the Tweene®
  • Wetting agents such as sodium lauryl sulfate
  • coloring agents such as sodium lauryl sulfate
  • taste-promoting agents, excipients tablet-forming agents
  • stabilizers stabilizers
  • antioxidants Preservatives
  • a pharmaceutically suitable carrier which, together with compounds of the formulas I, IA, II, III and IV1 to IV3 according to the invention, optionally together with one or more ligands, or alternatively additionally together with MHC molecules, their loading state with ligands according to the invention
  • the method which has been modified should be used is basically determined by the way in which the MH C molecules are loaded with ligands according to a method according to the invention.
  • the MHC molecules loaded with ligands by a method according to the invention can be administered systemically. Routes for administration include transdermal, oral, parenteral, including subcutaneous or intravenous injections, topical and / or intranasal routes.
  • the suitable amount of the inventive compounds of the formulas I, IA, II, III and IV1 to 1V3 to be used, optionally together with one or more ligands, or alternatively the MHC molecules whose loading state has been changed with ligands by a method according to the invention, can by Routine experiments with animal models are determined.
  • animal models include, but are not limited to, models of rabbit, sheep, mouse, rat, dog and nonhuman primate models.
  • Preferred unit dosage forms for injection include sterile solutions of water, physiological saline or mixtures thereof. The pH of such solutions should be adjusted to about 7.4.
  • Suitable carriers for injection or surgical implantation include hydrogels, devices for controlled or delayed release, polylactic acid and collagen matrices.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers for topical use include those suitable for use in lotions, creams, gels, and the like. are suitable.
  • a likewise preferred subject matter of the present invention relates to the use of compounds according to the invention of the formulas I, IA, II, III and IV1 to IV3, optionally together with one or more ligands, or alternatively of MHC molecules, whose loading state with ligands by a process according to the invention has been modified, preferably MHC multimers, for screening methods and diagnostic methods for the search for and identification of new antigens, in particular tumor antigens, pathoantigens and autoantigens, as well as for the detection of specific T cells, for example autoreactive T cells or cytotoxic T cells, or Monitoring a specific T-cell response.
  • a composition comprising compounds of the formulas I, IA, II, III and 1V1 to IV3 according to the invention, optionally together with one or more ligands, or alternatively of MHC molecules, whose loading state with ligands is changed by a method according to the invention was provided.
  • MHC molecules are as defined above MHC molecules.
  • the compositions used herein may include the compositions provided in the methods of altering the loading state of MHC molecules correspond.
  • the MHC molecules used in the present case may be loaded with ligands or unloaded.
  • the ligands preferably correspond to the ligands previously defined in the description and are selected specifically depending on the underlying task.
  • such ligands are charged to MHC molecules that lead to an immune response even under physiological conditions.
  • the ligands used and / or identified in the screening method or methods are preferably ligands of MHC molecules as defined above, even more preferably ligands of tumor or pathogen specific antigens, as well as autoreactive T cell antigens.
  • targeted binding of antigens to MHC molecules can be used to screen the formation of specific T cell reporters or T cells for this antigen in a patient using the screening or diagnostic method of the present invention.
  • the immune response optionally obtained by the screening can then be directly linked to an indication.
  • such an amount of ligand is loaded onto the MHC molecule that the amount of ligand on the MHC molecules is sufficient to stimulate an immune response, preferably a T cell response.
  • the MHC molecule can be bound to a solid phase or to a matrix.
  • a solid phase or a matrix in the sense of the present method is preferably any surface to which MHC molecules can bind directly, via a linker, via a label or via their affinity.
  • the MHC molecules may be labeled for binding to a solid phase as described above.
  • suitable buffers may be added to the composition. Suitable buffers are known to a person skilled in the art.
  • Suitable buffers for the purposes of the present process are, for example, PBS buffer, RSA-PBS buffer (PBS buffer with bovine serum albumin (RSA)), FKS-PBS buffer (PBS buffer with fetal calf serum (FKS)), phosphate buffer, TRIS -HCl buffer, Tris-phosphate buffer, or other suitable buffers.
  • concentrations and amounts of the buffers to be used preferably correspond to those mentioned above in the description.
  • a substance to be examined For example, a body fluid or a homogenized tissue, preferably blood or tissue, may be added in one of the previously described buffers.
  • the physiological binding partners contained in the added substance usually bind to the immobilized MHC molecules optionally loaded with ligands according to a method of the invention. After binding of the contained physiological binding partners to the MHC molecules, the solid phase or matrix is usually washed with a buffer, preferably one of the previously described buffers.
  • the physiological binding partner is preferably a T cell, more preferably such a T cell having a high affinity for an antigen, even more preferably a T cell having a high affinity for a tumor or pathogen specific antigen ,
  • the immune response generated in a screening method or to be detected in a diagnostic method is an antigen-specific T cell response.
  • the ligand-bound MHC molecules bound to the MHC molecules can be identified and isolated by a biophysical or biochemical detection or isolation method, preferably FACS or MACS, as described above.
  • a biophysical or biochemical detection or isolation method preferably FACS or MACS, as described above.
  • T cells using MHC class II-carrying magnetic beads can be isolated antigen-specifically by means of MACS.
  • the steps mentioned in the aforementioned screening method or methods may be changed in a suitable order.
  • Screening methods or diagnostic methods according to the present invention preferably include in vitro T-cell assays, more preferably proliferation assays, ELISPOTS, ELISA methods, chromium release assays, high throughput screening (HTS) methods, etc.
  • a particular embodiment of the screening or diagnostic procedure according to the invention relates to a method for the search and identification of novel tumor antigens, for detecting specific cytotoxic T cells or for monitoring a specific T cell response, comprising the following steps: a) providing a composition comprising MHC molecules whose loading state with ligands has been altered by a method according to the invention; and b) determining the interaction of MHC molecules whose loading state with ligands has been changed by a method according to the invention with a physiological binding partner of the MHC molecules by means of a biochemical or biophysical detection method; and c) optionally identifying and isolating the physiological binding partner of the MHC molecules whose loading state with ligands has been altered by a method of the invention using a biochemical or biophysical detection or isolation method.
  • the MHC molecules whose loading state has been changed with ligands by a method according to the invention for the antigen-specific identification of (eg autoreactive) T-cells, preferably from tumor-specific, pathogen-specific or autoreactive T cells are used.
  • ligands selected are those antigens which are associated with one of the aforementioned indications.
  • Such a diagnostic method is typically performed ex vivo, for example, by samples of the patient, for example, body fluid samples, especially blood or lymph samples, with the aid of the catalysts of the invention with ligands (eg., From a pathogen antigen or a tumor antigen derived, for example Fragment of the same) loaded MHC molecules.
  • ligands eg., From a pathogen antigen or a tumor antigen derived, for example Fragment of the same
  • the binding of cells in the patient sample for example (auto) reactive T cells
  • the loaded, preferably tetrameric, MHC molecules is then detected, for example with the aid of suitable detection method, in particular by marking the MHC molecules and / or ligands, for example by fluorescence labeling or other spectroscopically detectable compounds.
  • the detection can be carried out by means of FACS analysis.
  • FIG. 1 shows the catalysis of the loading of soluble HLA-DR1 molecules
  • Panel A shows structural formulas of p-chlorophenol (pCP), 2- (1-adamantyl) ethanol
  • Panel B shows the loading of empty soluble HLA-DR1 molecules with the HA306-318 peptide. The loading was determined using biotinylated peptide by ELISA. The height of the bars of the bar diagram shown in the left panel represents the number of peptide / MHC complexes formed after 60 minutes. Black bars represent the uncatalyzed loading reaction, (+) representing the spontaneous loading and (-) the background signal in the absence of the peptide.
  • the height of the gray bars marks the number of complexes formed of the catalyzed reactions which were carried out in the presence of 250 ⁇ M pCP, AdEtOH or AdCaPy.
  • the right figure shows the corresponding dose-response curves. As can be clearly seen from this figure, all three catalysts are basically capable of
  • FIG. 1 shows the catalysis of the loading of HLA-DR molecules on the
  • FIG. 3 shows the amplification of the T cell response by catalysis of the loading of HLA-expressing cells on the basis of the dose
  • Action curves of the immune response of two different HLA-DR1 restricted T cells were either HA306-318 (left panel) or CO260-273 (right panel).
  • the immune response of the T cells is significantly enhanced by the compounds AdEtOH or AdCaPY used in the method according to the invention.
  • the comparison of the dose effects shows that the adamantyl compounds are also about 10-100 times more effective than pCP with respect to the T cell response.
  • FIG. 4 shows the allele-specific effect of catalysis by adamantyl compounds by comparing the dose-response curves of an HLA-DR4 (left field) and an HLA-DR2-restricted T cell response (right field).
  • HLA-DR4 (DRB1 * 0401) and HLADR2 (DRB1 * 1501) expressing cells were isolated as described in Comparative Experiment 3.4 in the presence of
  • the adamantyl compounds In contrast to the pCP, which can amplify all HLA-DR molecules studied, the adamantyl compounds apparently act on HLA-DR1 (DRB1 * 0101) and HLA-DR4 (DRB1 * 0401), but not on HLADR2 (DRB1 * l 501) , The effect of the adamantyl compound is therefore obviously allele-specific.
  • FIG. 5 shows a comparison of the dose-activity curves of the catalysis of the binding of MBP86-100 to the HLA-DR2 wild-type molecule (left Fig.) And to the mutated HLA-DR2 molecule in which the valine residue at position 86 of the ⁇ - Chain replaced by glycine (right fig.). While adamantaneethanol can not catalyze the unmutated HLA-DR2 molecule of fibroblast cells as in the MGAR cells described in Comparative Experiment 3.4, the V-> G substitution causes the mutated HLA-DR2 molecule to revert to the
  • Adamantyl-mediated catalysis becomes susceptible. Since the glycine / valine dimorphism determines the depth of binding pocket P1, with ⁇ 86G correlating with a deep pocket, adamantyl compounds apparently mediate their catalytic activity by binding to a deep P1 pocket.
  • FIG. 6 shows dose-response curves of the catalysis of an HLA-DR1
  • Adamantyl compounds have a catalytic activity.
  • the different chemical character of the side chains shows that the effect is essentially mediated by the adamantyl moiety.
  • the location of the dose-response curves is obviously also determined by the side chain, it can at least be attributed a modulating effect.
  • Figure 7 shows flow cytometric measurements of HLA-DR1 restricted human T cells (PD2) stained with fluorescently labeled peptide-loaded HLA-DR1 tetramers.
  • the following tetramers were used here: HA tetramers, HLA-DR1 tetramers which were already obtained from the manufacturer (Proimmune Ltd.) with the T Zeilantigen HA306-318 and IC tetramers which carry the non-relevant peptide IC106-120.
  • Panel A) shows flow cytometric measurements made by loading IC tetramers with HA306-318 in the presence of adamantyl compounds (AdEtOH). In addition, a loading with a non-relevant peptide (ABL) was carried out as a control.
  • Flow cytometric analysis after staining of the following tetramers were used here: HA tetramers, HLA-DR1 tetramers which were already obtained from the manufacturer (Proimmune Ltd.)
  • the HA306-318-specific PD2 T cells are stained with the adamantylethanol-catalyzed tetramers.
  • no significant coloration is observed with the complexes in which loading without a catalyst was attempted.
  • the resulting with the help of Adamantylethanols complexes also have the demanded antigen specificity, since A 10 T cells are not stained, in contrast to the PD2.
  • Figure 8 represents dose-response curves of other compounds that also act through the deep P1 pocket.
  • field A are the examined
  • HLA-DRI-restricted HA306-318-specific EvHA / X5 T cells left Fig.
  • HLA-DR2 restricted MBP86-100 specific 08073 T cells On HLA-DR1, # 4230 has a catalytic activity approximately equal to that of adamantylethanol. By contrast, # 3651 is weaker, but still has higher activity than pCP.
  • HLA-DR2 both compounds show no activity and therefore apparently, like the adamantyl compounds, mediate their catalytic effect by binding to the deep P1 pocket.
  • FIG. 9 shows dose-response curves of various catalytically active phenolic compounds.
  • Figure 10 illustrates dose-response curves of catalysis of HLA-DR loading by pCP and adamantylethanol. Data were determined by T cell assays as described in Comparative Experiment 3.3 and illustrate the effect of the two catalysts on HLA-DR molecules with low or flat P1 pockets ⁇ 86G or 86V ⁇ and mouse MHC class II molecules H2-E k and H2-A k . The broken lines represent the strength of the uncatalyzed T cell response. As described in Comparative Experiment 3.5, the effect of adamantylethanol is stronger compared to pCP, but directed to those HLA-DR molecules that possess the deep P1 pocket. The spectrum of action of the pCP is less specific for this.
  • HLA-DR molecules There is no dependence on the 86 dimorphism and so far no other allele-specific limitations of the effect of pCP on HLA-DR molecules have been observed.
  • pCP has no effect on all previously investigated H2-A and H2-E molecules, which are homologues to the human HLA-DQ and HLA-DR molecules, respectively.
  • FIG. 11 shows dose-response curves of various catalytically active thiophene compounds.
  • Field A) shows structural formulas of some catalytically active thiophene compounds. The catalytic
  • Link class is usually a bit stronger than the pCP.
  • EvHA / X5 T cells shown. The experiment was like under Comparative experiment 3.3 described performed. Panel B) shows the comparative dose-response curves of pCP, AdEtOH and ATC. Similar to the active phenol / aniline compounds, the activity is obviously independent of the ⁇ 86 dimorphism of the HAL-DR molecules. As shown in Comparative Experiment 3.1.1, compound ATC catalyses the peptide loading of both fibroblasts expressing either HLA-DR1 (DRB1 * 0101; ⁇ 86G) or HLA-DR2 (DRB1 * 1501; ⁇ 86V). The depth of the P1 pocket obviously plays no role in the thiophene compounds.
  • FIG. 12 shows the catalytic activity of several adamantyl compounds used according to the invention, which are covered by the generic formulas I and IA, respectively.
  • the relative increase in the loading rate relative to the concentrations of the catalytic adamantyl compounds used is plotted (see Embodiment 3.12). It can be clearly seen that the compounds tested can cause a marked increase in the loading rate, which is dose-dependent. As a control DMSO was used. In the right column of Figure 12 are the used
  • FIG. 13 shows the catalytic activity of a number of compounds used according to the invention and falling under the generic formulas II, III or IV1 to IV3.
  • the relative increase in the loading rate relative to the concentrations of the catalytic compounds used is plotted (see Embodiment 3.12). It can be clearly seen that the compounds tested can cause a marked increase in the loading rate, which is dose-dependent.
  • DMSO DMSO was used.
  • the right column of Figure 12 are the experimentally used compounds (with decreasing activity from top to bottom). Their structure is shown in Tables 2 to 4.
  • FIG. 14 shows the catalysis of the loading of dendritic cells with antigens for use in adoptive immunotherapies.
  • AdEtOH I 1 a compound of generic Formulas I or IA
  • peptide is loaded to the surface of the DC only to a small extent (left panel of FIG. 14A); each point represents a single cell).
  • a much stronger peptide signal is measured when the loading is performed in the presence of 250 ⁇ M AdEtOH (right panel of Figure 14A).
  • the amplification of the antigen-specific T cell response is correspondingly high (FIG. 14B).
  • DC which are loaded with the antigen in the presence of AdEtOH, trigger up to 15 times stronger T-cell responses than DC, which were loaded without AdEtOH.
  • the amount of amplification shows the expected dependence on the amount of AdEtOH used and manifests itself in a clear shift in the dose / activity curve of the peptide antigen (FIG. 14 C).
  • DC of (B) ex vivo loaded with tumor antigens and then reinjected (c) to elicit tumor-specific immune responses in vivo.
  • ex vivo therapy methods can also be carried out according to the invention, wherein compounds of the formulas I, IA, II, III or IVl to IV3 in
  • Process step (b) can be used. Such a method can - as disclosed in the present application - also be carried out with other than tumor-specific antigens.
  • FIG 15 shows the effect of using AdEtOH (I 1) as a vaccine additive or adjuvant to enhance the immune response in vaccination experiments. As demonstrated by the analysis of this experiment, evidently, significantly more T cells were activated in vaccination using AdEtOH as an additive, which could react against the ABL domain. The addition of the
  • AdEtOH has thus led to a significant increase in the efficiency of vaccination.
  • the number of spots is plotted against vaccination with or without adjuvant (AdEtOH).
  • AdEtOH adjuvant
  • concentrations of antigen were used.
  • Each spot corresponds to the activation of a T-cell.
  • one of the major problems is the efficient transfer of the antigens to the MHC molecules.
  • the efficiency is additionally reduced by the proteases present in the serum, which degrade the free antigens in a relatively short time. Acceleration of the antigen transfer, as effected by the methods according to the invention, thus has a positive effect on the amplification of the immune response in the vaccination in two respects. This can be achieved, for example, by the fact that Catalysts such as AdEtOH can be added as an additive or adjuvant to the vaccine.
  • FIG. 16 illustrates the use of the MHC binding assay to identify immunotoxic compounds.
  • two compounds which can be used in the process according to the invention were used (3-N-phenylaminopropanediol, PAP, (III 36) (o) or sulfamethoxazole (III 37) (V) compared to the pCP known from the St.dT).
  • This assay was done in vitro.
  • both compounds can accelerate the loading of MHC molecules with peptide ligands.
  • the activity is significantly lower than that of the pCP, it is still clearly detectable with the assay shown here.
  • Loading state of the MHC can be traced hereby in corresponding screening method according to the invention. This is illustrated by two examples of 3-N-phenylaminopropanediol (PAP) and sulfamethoxazole (SMX).
  • PAP is an aniline derivative associated with the formation of an autoimmune syndrome ("toxic oil
  • Results are exchanged.
  • the experienced practitioner will prefer that the examples provide guidance and can be varied based on the different connections to be used.
  • Soluble MHC class II molecules HLA-DR1 (DRAT 1 OI OI, DRB1 * 0101), HLA-DR2 (DRA1 * 0101, DRB1 * 1501), and HLA-DR4 (DRA1 * 0101, DRB1 * 0401) were used in S2 insect cells produced. These were stably transfected with vectors coding for truncated ⁇ - and chains without the cytoplasmic and transmembrane portion of the MHC molecule following a metallothionine promoter.
  • the HLA-DR producing cells were cultured in serum-free HyQ SFX insect medium (HyClone) at 26 ° C in shake culture. The induction of HLA-DR production was carried out at a cell density of 6-8x10 6 AnI by adding 1 mM CuSO 4 . The production then took place for a period of 5 days.
  • the cell supernatants of the HLA-DR producing cells were passed through three serial 25 ml affinity columns for several days in the cycle using a peristaltic pump at a flow of 1.6 ml / min.
  • the first column contained pure protein A agarose and the second protein G agarose.
  • the third column contained protein A agarose to which LB3.1 anti-HLA-DR antibody had been coupled. Subsequently, all three columns were first washed with 50 .mu.l PBS-0.02% sodium azide and then the antibody coupled column again individually with 200ml.
  • This column was then equilibrated in a BiologicHR Chromatography System with 50 ml of 1 OmM NaH 2 PO 4 and bound HLA-DR eluted with 50 mM CAPS (pH 11.5). The elution was monitored by measuring the absorbance at 280nm and collecting the eluate during a peak in 1mL 60Mm NaH 2 PO 4 . Finally, the column was neutralized by washing with 50 ml of 30 mM NaH 2 PO 4 . The protein concentration in the collected eluate was determined using Bradford protein determination.
  • HLA-DR on ice was incubated with 1 ⁇ g of high affinity, biotinylated peptide (HA-biot. (Biot. HA306-318) in HLA-DR1 & DR4 and MBP-biot. (MBP86-100) in HLA DR2 loading experiments) and the concentration of catalyst substance indicated in the respective experiments.
  • HA-biot. Biot. HA306-318
  • MBP-biot. MBP-biot.
  • the detection of bound peptide was carried out by means of a sandwich ELISA.
  • 96-well Maxisorp plates overnight with 80 .mu.l / well ⁇ -HLA-DR antibody (clone L243 (1 mg / ml) diluted 1: 500 in 10OmM NaHCO 3 solution) and then coated with 200 .mu.l / well 2 % RSA-PBS at 37 ° C for blocked for at least an hour. Between these steps, the plate was washed twice with PBS-0.05% Tween by means of a PW plate washer (Tecan Industries) and, prior to filling with new solution, all remaining liquid residues by tapping on Scott®Natura paper towels (Hakle-Kimberly Germany GmbH).
  • the plate was washed three times and filled with 50 ⁇ l / well 1% BSA-PBS. Twice 25 ⁇ l per reaction batch were transferred to the plate as double values and thoroughly mixed there (total volume per well: 75 ⁇ l). From each filled row, another 25 ⁇ l / well was then titrated on the plate in a serial, two-stage dilution series (final volume per well: 50 ⁇ l). The plates thus filled were then stored at 4 ° C. for 2 hours.
  • the compounds of formulas I, IA, II, III and IV1 to IV3 to be tested were delivered in 384-well plates as 16 oMM starting library, dissolved in DMSO, from which an aliquot library had to be prepared. By manual decay of 2 ⁇ l / well and dilution with 38 ⁇ l / well DMSO, an 8mM strain library was prepared which was used for all further assays.
  • a high-throughput method based on an HLA-DR1 loading experiment was used. For this purpose, two 384-well Nunc maxisorp plates were added per library plate.
  • a 384-well NUNC polystyrene plate (assay plate) was filled with 22 ⁇ l / well DR1 analysis solution (about 12 ⁇ g / ml HLA-DR1 in PO 4 3 buffer) per library plate and stored cool. Subsequently, with the aid of a 384-well pipetting robot, 1 ⁇ l / well was transferred from the library plate into the analysis plate (final volume 23 ⁇ l / well) and the tips of the robot were washed. This was done by pulling up and down 20 ⁇ l of solution five times in succession in a DMSO, a water and an ultrasonic flow bath filled with distilled water.
  • the two ELISA plates were washed five times as described, remaining wash was removed and, using the robot, 30 ⁇ l / well of 1% RSA-PBS solution was added. After the 40-minute incubation, 40 ⁇ l / well of 1% RSA-PBS were then additionally introduced into the analysis plate with the aid of the pipetting robot and mixed with the reaction solution by pipetting up and down 30 ⁇ l / well five times (final volume in the assay plate approx 65 ⁇ l / well).
  • the robot then transferred twice 30 ⁇ l ⁇ / well into the two ELISA plates and mixed them with the RSA-PBS solution prepared by pipetting up again 3 ⁇ l / well (final volume in the ELISA plates 60 ⁇ l / well).
  • the ELISA plates so filled were then stored for 2 hours at 4 ° C and the tips of the robot were washed in three water baths by pulling up and down 40 ⁇ l ten times. Then the two ELISA plates were washed six times as described above and filled by hand with 60 ⁇ l / well of Eu 3+ staining solution.
  • the plates were then stored quietly for at least 30 min at RT. Thereupon, excess staining solution was removed by washing eight times with PBS-0.05% Tween and manually pipetting 80 ⁇ l / well of fluorescence activating solution (enhancer). The signal was then detected as described in the previous chapter.
  • 1, 2 .mu.l of the respective substance from the library plate were mixed with 4.8 .mu.l PO 4 3 " - buffer and transferred from 1 .mu.l in a new Eppendorf tube and mixed there again with 5 .mu.l PO 4 3" buffer.
  • another 1 ⁇ l was removed from this second dilution step and mixed with 7 ⁇ l PO 4 3 " buffer
  • All three dilution stages were then mixed with 0.5 ⁇ g HLA-DR1 and 1 ⁇ g HA-biot each on ice and with PO 4 3 " buffer set to a final volume of l O ⁇ l.
  • High pressure analytical liquid chromatography was performed in a Pharmacia Biotech Smart TM system equipped with a C2 / C18 SC2.1 / 10 RP (reverse phase) chromatography column. Contained substances were detected by means of a UV detector, which simultaneously recorded the absorbance at 214nm, 260nm and 280nm at RT.
  • the mobile phase consisted of 0.096% trifluoroacetic acid (TFA) in H 2 O and 0.104% TFA in acetonitrile. Eluates were collected by time-dependent fractionation with a volume of 1 ml.
  • 50,000-100,000 cells were mixed in 100 ⁇ l DMEM with 50 ⁇ l of the catalysts in the respectively indicated concentrations (dissolved in DMEM at a maximum concentration of 3% DMSO) and at 37 ° for four hours C and 10% CO 2 incubated in a wet incubator.
  • DMEM fetal calf serum
  • concentrations dissolved in DMEM at a maximum concentration of 3% DMSO
  • CO 2 incubated in a wet incubator.
  • cells were spiked with 50 ⁇ l of DMEM. Subsequently, the cells were centrifuged off at 1300 rpm for 5 min and the supernatant medium was gently ejected.
  • the cell pellets were then solubilized by briefly vortexing the whole plate at low level, resuspended with 100 ⁇ l / well of 5% FCS-PBS, and centrifuged again at 1300 rpm for 5 min. The supernatant was then discarded again and the cell pellets were dissolved in 100 ⁇ l / well of propidium iodide staining solution (25 ⁇ g / ml). Subsequently, the cell suspension was transferred to Falcon® 5 ml round bottom tubes previously filled with 300 ⁇ l 5% FCS-PBS and then analyzed in the BD FACSCalibur TM System flow cytometer.
  • the catalytic properties of found substances on the loading of cellular MHC class II molecules was determined in cell loading experiments. 50,000-100,000 cells in 50 ⁇ l DMEM with 50 ⁇ l 24 ⁇ M HA-biot were added. dissolved in DMEM and 50 .mu.l catalyst solution (various concentrations dissolved in DMEM with a maximum DMSO content of 3%) and incubated for 4 h at 37 ° C and 10% CO 2 . As controls, cells were spiked with 50 ⁇ l of peptide solution and 50 ⁇ l of DMEM in several batches. At the end of the incubation period, the cells were centrifuged off at 1300 rpm for 5 min and supernatant was removed.
  • the cell pellets were then solubilized by briefly vortexing the plate, resuspended in 100 ⁇ l / well of 5% FCS-PBS, and centrifuged again at 1300 rpm for 5 min. After removing the supernatant, the cell pellets were redissolved and diluted in 50 ⁇ l / well of streptavidin-phycoerythrin solution (SA-PE stock solution (1 mg / ml) 1: 200 with 2% FCS-PBS). added. The staining was carried out for 30 min at 4 0 C under Lichtausschi uss to avoid excessive decomposition of the fluorescent dyes.
  • the stained cells were then again centrifuged as described previously washed with 2% FCS-PBS and taken up in 100 ⁇ l / well 2% FCS-PBS and transferred to previously filled with 300 ⁇ l 2% FCS-PBS Falcon® 5ml round bottomed tube. Subsequently, the cells were analyzed in the flow cytometer.
  • MHC molecules on the surface of the cells was determined in controls by staining with ⁇ -HLA-DR antibody (labeled with PE, stock solution (1 mg / ml) diluted 1: 75 with 2% FCS-PBS) or as isotype control with IgG2a mouse antibody (labeled with PE, stock solution (1 mg / ml) diluted 1: 75 with 2% FCS-PBS) instead of with SA-PE (streptavidin-PE).
  • Flow cytometric analyzes were performed on a BD FACSCal ibur TM system from Becton Dickinson.
  • phycoerythrin-labeled streptavidin (CALTAG Laboratories)
  • the reference substance was 1, 2-dichloro-4,5- Dihydroxybenzene / dichlorocatechol (see Figure 9, for example), a substance which still showed activity at low concentrations.
  • Table 5 Structural formulas of exemplary catalysts identified from the library.
  • Table 6 Analysis of homologous compounds using the example of adamantanethanol. Structural formulas of the catalyst identified by the analysis adamantanethanol and six homologous compounds contained in the library.
  • AdaEtOH has been shown to have a toxic effect
  • AdaEtOH shows significantly greater catalytic activity in the ELISA. This means that it could possibly be used in concentrations that are reduced by such a large factor that toxic effects can be ruled out.
  • concentrations of AdaEtOH in the lower ⁇ M range, as could be detected in the ELISA, would provide suitable conditions for this.
  • DPHIA which has even lower toxic effects than AdaEtOH or 4-HBP and gave similarly good results in the ELISA as AdaEtOH.
  • HLA-DR1 (DRB1 * 0101) or HLA-DR4 (DRB1 * 0401) express two MHC class II molecules that can present the HLA306-318 peptide.
  • the lack of any coloration of the L929 cells indicates that all catalysts selectively enhance binding to the surface MHC molecules.
  • a comparison of the dose Effect curves confirm the result with the soluble MHC molecules (see also FIG. 1). Again, prove the tested
  • Adamantyl compounds significantly more active than pCP and accelerate the loading of the cells even at a concentration of significantly less than one-tenth of the corresponding pCP concentration.
  • the amplification of the T-cell response was investigated by catalysis of the loading of HLA-expressing cells.
  • the dose-response curves of the immune response of two different HLA-DR1-restricted T cells were prepared and HLA-DR expressing 721,221 cells as described in Comparative Experiment 3.2, incubated for 4 h with titrated amounts of pCP, AdEtOH or AdCaPY.
  • As peptide antigen either HA306-318 (see also Figure 3, left panel) or CO260-273 (see also Figure 3, right panel) was used. After loading, the cells were washed and used to stimulate EvHA / X5 or hCII 19.3 cells, respectively.
  • the immune response of the T cells is significantly enhanced by the compounds AdEtOH or AdCaPY used in the method according to the invention.
  • the comparison of the dose effects thus shows that the adamantyl compounds are also about 10-1000 times more effective than pCP with respect to the T cell response.
  • HLA-DR4 (DRB1 * 0401) and HLADR2 (DRB1 * 1501) -expressing cells were loaded in the presence of the catalysts with HA306-318 or MPB86-100 and then used in T-cell assay.
  • the allele-specific effect of the adamantyl compounds is apparently due to the interaction with the deep 1 pl pocket. Since the allele-specific activity of the adamantyl compounds obviously correlates with a dimorphism at the HLA-DR ⁇ -chain position 86, a corresponding mutation was made in the HLA-DR2 (DRB1 * 1501) molecule to study this assumption and subsequently expressed in fibroblast cells. The results are shown in Figure 5.
  • Figure 5 shows a comparison of the dose-response curves of catalysis of binding of MBP86-100 to the HLA-DR2 wild-type molecule (see Figure, left panel) and to the mutant HLA-DR2 molecule in which the valine residue at position 86 has been replaced by glycine (see figure, right figure).
  • HA tetramers HLA-DR1 tetramers which were already obtained from the manufacturer (Proimmune Ltd.) loaded with the T cell antigen HA306-318 and IC tetramers, which carry the non-relevant peptide IC106-120.
  • the HA306-318-specific PD2 cells are also stained with those tetramers catalyzed by adamantylethanol in this experiment. In contrast, no significant coloration is observed with the complexes in which loading without a catalyst was attempted.
  • the complexes formed with the aid of adamantylethanol also have the required antigenic specificity, since A 10 T cells are not stained in contrast to PD 2.
  • FIG. Figure 7 shows the results of flow cytometric measurements of HLA-DR1 restricted human T cells (PD2) stained with fluorescently labeled peptide-loaded HLA-DR1 tetramers.
  • HLA-DR1 restricted HA306-318 specific EvHA / X5 T cells and the HLA ⁇ DR2 restricted MBP86-100 specific 08073 T cells.
  • HLA-DRI # 4230 has a catalytic activity which is approximately which corresponds to the adamantylethanol.
  • # 3651 is weaker, but still has higher activity than the pCP.
  • HLA-DR2 both compounds have no activity, and therefore, like the adamantyl compounds, they presumably mediate their catalytic activity by binding to the deep P 1 pocket.
  • the results from comparative experiment 3.8 are shown in FIG.
  • the activity of three exemplary compounds was determined by way of example on the basis of the dose / effect curves of the stimulation HLA-DR1-restricted EvHA / X5 T cells.
  • the experiment was carried out as described under comparative experiment 3.3.
  • the results are shown in FIG. 11. Similar to the active phenol / aniline compounds, the activity is obviously independent of the ⁇ 86 dimorphism of the HAL-DR molecules.
  • compound ATC therefore catalyzes peptide loading of both fibroblasts expressing either HLA-DR1 (DRB1 * 0101; ⁇ 86G) or HLA-DR2 (DRB1 * 1501; ⁇ 86V).
  • the depth of the P1 pocket obviously plays no role in the thiophene compounds either.
  • the catalytic activity of the hitherto identified active compounds of this class of compounds is stronger than that of the pCP.
  • the experimental data were collected in an MHC loading assay with soluble recombinant HLA-DR1 (DRB1 * 0101).
  • the MHC molecules were incubated with biotinylated HA306-318 for about 1 h in the presence of titrated amounts of small molecules (in various concentrations).
  • the amount of peptide / MHC complexes that have formed within this time was then determined by an ELISA assay ('capture' antibody: anti-HLA-DR; detection: fluorescently labeled streptavidin).
  • the sequence of the activities of the individual compounds was determined on the basis of the dose / activity curves obtained.
  • DC Dendritic cells
  • HLA-DR1 (DRB1 * 0101) transgenic mice was used in the present embodiment, which were loaded for 4h with biotinylated HA306-318 peptide. Subsequently, the cells were stained for determining the peptide loading with streptavidin-APC (SA-APC) and with anti-HLA-DR and analyzed by flow cytometry (FIG. 14A).
  • SA-APC streptavidin-APC
  • FIG. 14A flow cytometry
  • HLA-DR1 (DRB1 * 0101) transgenic mice were immunized with 10 mg of a recombinantly produced domain of the ABL protein.
  • the immunization was carried out by subcutaneous administration of an emulsion of the antigen in complete Freund's adjuvant, wherein this was additionally added in the one group with 10 mM AdEtOH.
  • the vaccine-elicited immune response was then checked 12 days later using an ELISPOT assay.
  • approximately 10 6 lymph node cells / well were transferred to culture plates coated with membrane filters and restimulated with titrated amounts of the antigen.
  • the activation of a cell leads to the release of cytokines, such as IFN-g, which can be detected on the membrane with appropriate antibodies (see Fig. 15).
  • the compounds of the formulas I, IA, II, III and IV1 to IV3 used for the purposes of this invention have for the first time provided efficient possibilities for triggering tumor-specific, pathogen-specific or autoreactive immune responses, as well as possibilities for the treatment of diseases or conditions with various pathologically excessive ones or remaining immune responses are linked. Furthermore, by providing a vaccine or a pharmaceutical composition, a Treatment of cancer, infectious diseases, autoimmune diseases or the mitigation of aggressive immune reactions.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, wobei die Änderung des Beladungszustandes durch eine Verbindung der Formeln (I, IA, II, III) oder (IV1 bis IV3) katalysiert wird. Im weiteren bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Verbindungen der Formeln (I, IA, II, III) oder (IV1 bis IV3) oder bzw. auf die Verwendung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen, herstellbar nach einem erfindungsgemässen Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit diversen pathologisch überschiessenden oder unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind, sowie zur Auslösung tumorspezifischer, pathogenspezifischer oder autoreaktiver Immunantworten. Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf die Verwendung dieser Verbindungen zur Behandlung und Diagnose von Krebs, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten und zur Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen, sowie auf die Herstellung eines Vakzins oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der genannten Erkrankungen oder Zustände.

Description

Anmelder:
MAX-DELBRÜCK-ZENTRUM FÜR MOLEKULARE MEDIZIN
Robert-Rössle-Str. 10
13125 Berlin
Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, wobei die Änderung des Beladungszustandes durch eine Verbindung der Formeln I, IA, II, IN oder IV1 bis IV3 katalysiert wird. Im weiteren bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis 1V3 oder bzw. auf die Verwendung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen, herstellbar nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind, sowie zur Auslösung tumorspezifischer, pathogenspezifischer oder autoreaktiver Immunantworten. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung dieser Verbindungen zur Behandlung und Diagnose von Krebs, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten und zur Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen, sowie auf die Herstellung eines Vakzins oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der genannten Erkrankungen oder Zustände.
Die Initiation der Kaskade der Immunantwort verläuft im wesentlichen über MHC- Moleküle und beruht vor allem auf der spezifischen Detektion und Abwehr pathogener Invasoren durch die Bindung von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-assoziierten Peptidantigenen an T-ZeI l-Rezeptoren (TCR). Die Bildung stabiler MHC-Peptid-Komplexe ist dabei von zentraler Bedeutung für die Auslösung von Immunantworten. Leere MHC-Klasse II Moleküle sind von Natur aus instabil und zerfallen relativ schnell, während MHC-Peptid-Komplexe eine wesentlich größere Halbwertszeit aufweisen. Die Bindung von CLIP bzw. Ii (Class Il associated invariant chain peptide (CLIP/li89.102)) unmittelbar nach Expression der MHC-Klasse Il Moleküle sorgt u.a. dafür, dass die Komplexe bis zu ihrer Beladung mit antigenen Peptiden stabil bleiben. Die Dissoziation gebundener Peptide insbesondere bei physiologischen pH-Werten dauert allerdings sehr lange und kann abhängig von dem jeweiligen Peptid und von dem MHC-Klasse Il-Allel mehrere Stunden dauern. Erste Untersuchungen stellten jedoch fest, dass die in späten endosomalen Vesikeln vorliegenden, niedrigen pH-Werte die Dissoziation von CLIP drastisch beschleunigen und somit die Assoziation anderer Peptide erleichtern (Avva, R.R., and P. Cresswell. 1994, Immunity 1 :763-774). Dennoch liegen die Dissoziationsraten für viele MHC-AIIeIe noch so hoch, dass die relativ kurze Verweilzeit in endosomalen Vesikeln nicht ausreichen würde, um den kompletten Austausch gebundenen CLIPs zu gewährleisten. Deshalb ist zur Katalyse des vollständigen Austausches ein physiologischer Kofaktor nötig. Dieser wird als HLA- DM bezeichnet. HLA-DM ist ein Transmembranprotein, das ebenfalls im MHC- Klasse Il Genlocus kodiert wird und durch Bindung an den Peptid/MHC-Komplex den Ligandenaustausch beschleunigt.
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Genlocus kontrolliert eine Vielzahl wichtiger immunologischer Funktionen. Er liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 des menschlichen Genoms und kodiert für mehrere Klassen an MHC-Molekülen. Beim Menschen wird der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) als HLA (Human Leukocyte Antigen) bezeichnet (Wake, CT. 1986. Molecular biology of the HLA class I and class II genes. Mol Bio/ Med3:\ -11).
Die Moleküle der Klasse I werden als HLA-A, -B und -C bezeichnet. Sie beschreiben eine Gruppe an membranständigen hochpolymorphen Glykoproteinen, die zur
Präsentation von endogen exprimierten Antigenen an der Zelloberfläche dienen. Sie werden in fast allen Zellen des menschlichen Körpers exprimiert und bilden Heterodimere aus den schweren MHC-Klasse I-Ketten (HLA-A, -B oder -C) und einem nicht im MHC-Genlocus kodierten kleinen Protein, dem ß2 Microglobulin (ß2m). Die schweren α-Ketten besitzen eine kurze zytoplasmische Domäne, eine Transmembrandomäne und drei extrazelluläre Domänen die nicht kovalent mit ß2m verknüpft sind. Die von MHC-Klasse I gebundenen Antigene sind Peptide, die fast ausschließlich eine Länge von 9-1 1 Aminosäuren besitzen. Die Peptidbindungsstelle wird allein von der α-Kette gebildet und besteht aus einem aus acht Strängen bestehenden ß-Faltblatt, auf dem die Peptide zwischen zwei α-Helices eingeklemmt und an den beiden Enden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den N- bzw. C-Termini des gebundenen Peptids und dem MHC-Komplex fixiert werden.
Die Moleküle der Klasse II beschreiben ebenfalls eine Gruppe an hoch polymorphen membranständigen Glykoproteinen, die zur Antigenpräsentation dienen. Anders als MHC-Klasse I-Moleküle werden diese allerdings normalerweise nur in einer Gruppe spezieller Antigen-präsentierender Zellen (APC) exprimiert und dienen überwiegend zur Präsentation von Peptiden exogen aufgenommener Proteine. Man unterscheidet im Menschen drei verschiedene Arten von Klasse Il Molekülen: HLA-DP, -DQ und - DR, von denen wiederum eine Vielzahl an unterschiedlichen Allelen existiert. Die gebildeten αß-Heterodimere bestehen aus einer α- und einer ß- Kette, die beide im MHC kodiert werden. Beide Ketten besitzen eine kurze zytoplasmatische Domäne, eine Transmembran- und zwei extrazelluläre Domänen (α1 und α2 bzw. ß1 und ß2). Die Peptidbindungsgrube wird dabei von den α1 - und ß1 - Domänen beider Ketten gebildet (Brown, J. H., T.S. Jardetzky, J. C. Gorga, L.J. Stern, R.G. Urban, J. L. Strominger, and D. C. Wiley. 1993. Three-dimensional structure of the human class H histocompatibility antigen HLA-DR1. Nature 364:33-39). Ähnlich wie bei Klasse-I- Molekülen wird das Peptid auch hier auf einem ß-Faltblatt zwischen mehreren α- helikalen Strukturen eingebunden. Anders als bei MHC-Klasse-I-Molekülen sind hier allerdings die Enden der Peptidbindungsstelle offen, so dass die Peptide aus dem Komplex herausragen können (Rajnavolgyi, E., A. Horvath, P. Gogolak, G. K. Toth, G. Fazekas, M. Fridkin, and I. Pecht. 1997. Characterizing immunodominant and protective influenza hemagglutinin epitopes by functional activity and relative binding to major histocompatibility complex class II sites. Eur J Immunol 27:3105- 31 14). In vivo liegt die Größe der gebundenen Peptide normalerweise in einem Bereich zwischen 13 und 25 Aminosäuren (AS) (Chicz, R.M., R.G. Urban, W.S. Lane, J.C. Gorga, LJ. Stern, D.A. Vignali, and J. L. Strominger. 1992. Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DR1 are derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size. Nature 358:764-768, Rudensky, A., P. Preston-Hurlburt, S.C. Hong, A. Barlow, and CA. Janeway, Jr. 1991. Sequence analysis of peptides bound to MHC class Il molecules. Nature 353:622-627), davon sind allerdings nur 13 in der Peptidbindungsfalte des MHC-Moleküls fixiert. Kristallographische Untersuchungen ergaben dabei, dass diese 13 AS in einer langgestreckten Konformation, ähnlich zu einer Polyprolin Typ Il Helix, gebunden sind. Die aus der Peptidbindungsgrube herausragenden AS können demgegenüber auch andere Konformationen annehmen Oardetzky, T.S., J. H. Brown, J.C. Gorga, LJ. Stern, R.G. Urban, J. L. Strominger, and D. C. Wiley. 1996. Crystallographic analysis of endogenous peptides associated with HLA-DR1 suggests a common, polyproline Il-like conformation for bound peptides. Proc Natl Λcad Sei U S A 93:734-738). Nähere Untersuchungen der Peptidbindung ergaben, dass 9 AS des Peptids für die Affinität der Bindung verantwortlich sind (Hill, J.A., S. Southwood, A. Sette, A. M. Jevnikar, D.A. Bell, and E. Cairns. 2003. Cutting Edge: The Conversion of Arginine to Citrulline Allows for a High-Affinity Peptide Interaction with the Rheumatoid Arthritis-Associated HLA-DRB1 *0401 MHC Class Il Molecule. J Immunol 171 :538- 541 ). Eine Verlängerung der Peptide in jedweder Richtung erhöht dabei nicht die Affinität der Bindung (Siklodi, B., A.B. Vogt, H. Kropshofer, F. Falcioni, M. Molina, D.R. Bolin, R. Campbell, GJ. Hammerling, and Z.A. Nagy. 1998. Binding affinity independent contribution of peptide length to the stability of peptide-H LA-DR complexes in live antigen presenting cells. Hum Immunol 59:463-471 ). Experimente mit unterschiedlichen Allelen des MHC-Klasse Il Moleküls HLA-DR identifizierten über den Verlauf der Bindungsfalte mehrere „Bindungstaschen", die für die Affinität des Peptids zu dem jeweiligen Allel entscheidend sind (O'Sullivan, D., T. Arrhenius, J. Sidney, M. F. DeI Guercio, M. Albertson, M. Wall, C. Oseroff, S. Southwood, S. M. Colon, F.C. Gaeta, and et al. 1991 . On the interaction of promiscuous antigenic Peptides with different DR alleles. Identification of common structural motifs. / Immunol 147:2663-2669; und Sette, A., J. Sidney, C. Oseroff, M.F. del Guercio, S. Southwood, T. Arrhenius, M.F. Powell, S. M. Colon, F.C. Gaeta, and H. M. Grey. 1993. HLA DR4w4-binding motifs illustrate the biochemical basis of degeneracy and specificity in peptide-DR interactions. J Immunol 151 :3163-3170). Dabei scheint für alle allelischen Formen des HLA-DR die Bindung in der ersten Tasche nahe des N- terminalen Endes des Peptids ausschlaggebend für die Stabilität des ganzen Komplexes zu sein (Hammer, J., P. Valsasnini, K. Tolba, D. Bolin, J. Higelin, B. Takacs, and F. Sinigaglia. 1993. Promiscuous and allele-specific anchors in HLA- DR-binding peptides. Cell 74:197-203). Aber auch die Taschen an den relativen Positionen P3, P4, P6, P7 und P9 sowie Taschen an anderen Positionen der Bindungsfalte scheinen, in einer allelspezifischen Weise, von großer Bedeutung für die Affinität gebundener Peptide zu sein (Southwood, S., J. Sidney, A. Kondo, M.F. del Guercio, E. Appella, S. Hoffman, RT. Kubo, R.W. Chesnut, H.M. Grey, and A. Sette. 1998. Several common HLA-DR types share largely overlapping peptide binding repertoires. J Immunol 160:3363-3373). Allerdings erlauben alle Allele selbst in der stringentesten Position die Bindung verschiedener Aminosäureseitenketten des gebundenen Peptids, so dass eine Vielzahl unterschiedlichster Peptide auf demselben HLA-AIIeI gebunden werden können (McFarland, B.J., and C. Beeson. 2002. Binding interactions between peptides and proteins of the class U major histocompatibility complex. Med Res Revllύ 68-203). Die Stabilität der Bindung wird neben diesen allelspezifischen Bindungstaschen noch durch eine Reihe an Wasserstoffbrückenbindungen von hochkonservierten Teilen des MHC-Moleküls zum Peptidrückgrat des Antigens bestimmt. Anders als bei MHC-Klasse-I Komplexen sind diese über die gesamte Peptidbindungsgrube verteilt (Batalia, M.A., and .EJ. Collins. 1997. Peptide binding by class I and class Il MHC molecules. Biopolymers 43:281 -302).
Ausgehend von den bisherigen Erkenntnissen erscheint die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Antigenen ein vielversprechender Ansatz zur Therapie pathologischer, sowie diverser pathologisch überschießender oder unterbleibender Immunantworten zu sein. Verschiedenste in vitro Ansätze zur Beschleunigung dieser Prozesse erbrachten bislang jedoch noch keine praktikablen Beladungsraten von MHC-MoI ekϋ I en oder führten zu Erkenntnissen, die auf eine entsprechende Verwendbarkeit von solchen MHC-Molekülen schließen lassen.
Beispielsweise beschreiben Jensen et al. öensen et al., J. Exp. Med., 1990, 171 .-1779-84), die Erhöhung der Beladung von MHC-Klasse Il Molekülen durch die Absenkung des pH-Wertes. Jensen et al. (1990, supra) stellten die Hypothese auf, dass Peptidaustauschreaktionen auf der Zelloberfläche von aktivierten APCs auftreten könnten. Im Rahmen einer Infektion könnte dadurch die Dichte an präsentierten, normalerweise editierten Selbstpeptiden ansteigen, die sonst unterhalb des Grenzwertes zur Aktivierung autoreaktiver T-Zellen präsentiert werden. Als mögliche Ursache für solche extrazellulären Austauschreaktionen vermuteten Jensen et al. (1990, supra) lokale Erniedrigungen des pH-Wertes. Die lokale Erniedrigung des pH-Wertes ist jedoch im wesentlichen nur bei MHC-Molekülen möglich, die bei einem solchen pH löslich sind, nicht jedoch bei MHC-Molekülen, die bei einem solchen pH bereits unlöslich vorliegen. Eine Beladung von MHC-Molekülen mit Antigenen durch Absenkung des pH-Wertes kann weiterhin aufgrund der zeilschädigenden nicht-physiologischen Wirkung nur sehr kurz oder lediglich nach Fixierung der Zellen angewendet werden. Für in vivo Situationen ist daher eine Anwendung des nach Jensen et al. (1990, supra) beschriebenen Verfahrens nicht möglich.
Ein weiterer Ansatz zur Beladung von MHC-Molekülen mit Antigenen erfolgt über die Verwendung des für den MHC-Ligadenaustausch natürlichen Katalysators HLA- DM (Weber et al., J. Immunol., 2001 , 167:5167-74). Das von Weber et al. beschriebene Verfahren ermöglicht prinzipiell sehr effiziente Beladungen, jedoch ist die Herstellung des HLA-Proteins sehr aufwendig und teuer und somit kommerziell nicht erhältlich. Weiterhin erfordert bei diesem Verfahren die Beladung von MHC- Molekülen mit Antigenen die Anwesenheit von Detergenzien und kann lediglich bei einem niedrigen pH-Wert effizient durchgeführt werden. Da durch die Verwendung eines niedrigen pH-Wertes und die Verwendung von Detergenzien bei Weber et al. (2001, supra) zu nicht-physiologischen Bedingungen führen, ist ein in vivo Einsatz der durch dieses Verfahren erhaltenen beladenen MHC-Moleküle ausgeschlossen.
Eine weitere Alternative zur Beladung von MHC-Molekülen mit Antigenen ist die Verwendung von destabilisierenden Detergenzien, die vermutlich aufgrund ihres komplexdestabilierenden Einflusses die Beladung von MHC-Klasse Il Molekülen beschleunigen können (siehe Roof et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A., 1990, 87:1735-9; Avva und Cresswell, Immunity, 1994, 1 :763-74). Destabilisierende Detergenzien zeigen jedoch nur eine verhältnismäßig geringe Aktivität bei der Beladung von MHC-Molekülen und besitzen den evidenten Nachteil, sich nach Zugabe nicht mehr oder nur extrem schwer von den MHC-Molekülen abtrennen zu lassen. Eine Auftrennung von destabilisierenden Detergenzien und beladenen MHC- Molekülen erscheint daher unter in vivo Bedingungen nicht möglich und mit Hilfe von destabilisierenden Detergenzien beladene MHC-Moleküle könnten daher nur zusammen mit den verwendeten destabilisierenden Detergenzien in vivo eingebracht werden. Da jedoch die Verwendung dieser Detergenzien zur Auflösung oder teilweisen Auflösung von Zellen führt, ist ein Einsatz der nach dem von Roof et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1990, 87:1735-9) oder Avva und Cresswell (Immunity, 1994, 1 :763-74) beschriebenen Verfahren erhaltenen beladenen MHC- Moleküle in vivo nicht denkbar.
Die bislang besten Ergebnisse bei der Beladung von MHC-Molekülen mit Antigenen wurde durch die Verwendung von niedermolekularen Verbindungen erreicht, wie sogenannte Kleinmoleküle wie z. B. para-Chlorphenol, die als H-Donoren agieren
(siehe Falk et al., J. Biol. Chem., 2002, 277:2709-15; und Marin-Esteban et al., J.
Autoimmun., 2003, 20:63-9; und WO 03/016512). In diesen Studien wurde gezeigt, dass sogenannte Kleinmoleküle mit H-Donor-Eigenschaften die Fähigkeit besitzen, die Beladung von MHC-Klasse I und Il Molekülen mit Peptiden bei physiologischem pH-Wert zu katalysieren bzw. gebundene Antigene auf der Oberfläche von APCs bei physiologischem pH-Wert auszutauschen. Alle in diesen Studien identifizierten Substanzen, die in der Lage sind, die MHC-Klasse Il-Liganden Wechselwirkungen zu beeinflussen, können allerdings nur bei relativ hohen, nicht physiologischen Konzentrationen eingesetzt werden. Beispielsweise erfordert die Verwendung von Phenol eine Konzentration von 30 mM, n-Propanol sogar eine Konzentration von über 200 mM, Konzentrationen, die in vivo bereits erheblich toxisch wirken. Um ihre Wirksamkeit zu entfalten, müssten in vivo toxische Konzentrationen eingesetzt werden, so dass eine Überprüfung ihrer Wirksamkeit in Tiermodellen und damit ihre potenzielle Verknüpfung mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten weder möglich noch denkbar ist.
Im Stand der Technik ist das Problem der Katalyse zur effizienten Beladung von MHC-Molekülen mit Liganden unter Verwendung geringstmögl icher Konzentrationen an Katalysatorverbindungen noch nicht gelöst.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Änderung des Beladungszustandes von MHC- Molekülen mit Liganden, welches sowohl eine effiziente Beladung der MHC- Molekülen mit Liganden, den Austausch von Liganden auf der Oberfläche von MHC-Molekülen, die Verringerung oder Entfernung von Liganden auf der Oberfläche von MHC-Molekülen, sowie deren späteren in vivo Einsatz ermöglicht.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Therapeutika oder Diagnostika bzw. mit diesen Therapeutika oder Diagnostika durchführbaren Verfahren zur Behandlung oder Erkennung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden gelöst. Dieses Verfahren umfasst die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formeln I oder IA mit der folgenden Struktur:
Formel I,
oder
Formel IA,
wobei: R0, R00, R1, R2, R3 , R4 , R5, R6, R7, R8, R9 , R10 , R11, R12, R44 R66 , R77 , R", R1010 und R1111 eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13,
SH, SO, SO2, SO2R13, SO3, HSO3, SR13, SR13R14, S(CH2)nR13, S(CHn)R13; S(CH2)n(CH)nRl3, S(CH2)n(CH)nR13, NH, NH2, NHNH2, NHR13, NR13R14, NO, NO2, NOH, NOR13, X, CX3, CHX2, CH2X, CR13X2, CR2 13X, CR3 13, wobei X = Halogen,
CN, CO, COR13, COOH, COOR13,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH2)nR13, (CH)nR13, (CH)n(CH2)nCH3; (CH2)n(CH)nCH3; (CH)n(CH2)nR13; (CH2)n(CH)nR13; C(R13)C(R14)CH3, C(R13)(CH2)nR14, (CH2)nR13, (CH)n(OH)R13; (CH2)n(OH)R13; (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; OCH3, O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3,
O(CH2)nR13, 0(CH)nR13, O(CH)n(CH2)nR13, O(CH2)n(CH)nR13, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH2)nOR13, (CH)nOR13, (CH)n(CH2)nOR13, (CH2)n(CH)nOR13, (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; (CH)n(OH)R13; (CH2)π(OH)R13; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X; (CH2)nX, (CH)nX, (CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX; (CH2)n(CH)nX;
OCH2X, O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX, O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X, (CH2)nNHR13, (CH2)nNHOR13, (CH2)nNHCOR13, (CH2)nN(R13)CO, N(R13)(CH2)nR14, N(R13XCH)nR14, N(R13)(CH)n(CH2)nR14, N(R13)(CH2)n(CH)nR14, N(R13)COR14, N(R13)COOR14, CONH2,
CONHCH3, C3H6OH, C(NH2)(CH2)n(OH), OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3;
OCONH(CH2)n(CH)nCH3; (CH)nOR13, (CH2)nOR13, C6N2H5, C6H4(NHCOCH3), C6H4SO2NH, (CNNHC(CONHNH2)CH2), und C6N2H7, wobei n = 1 bis 30 ist, und R13 und R14 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, OR15,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15, SR15R16, S(CH2)nR15, S(CHn)R15; S(CH2)n(CH)nR15, S(CH2)n(CH)nR15,
NH, NH2, NHNH2, NHR15, NR15R16, NO, NO2, NOH, NOR15, X, CX3, CHX2, CH2X, CR15X2, CR2 15X, CR3 15, wobei X = Halogen,
CN, CO, COR15, COOH, COR15, COOR15,
CH3, (CH2)πCH3; (CH)nCH3; (CH2)nR15, (CH)nR15, (CH)n(CH2)nCH3; (CH2)n(CH)nCH3; (CH)n(CH2)nR15; (CH2)n(CH)nR15; OCH3, O(CH2)nCH
0(CH)nCH3, O(CH2)nR15, 0(CH)nR15, O(CH)n(CH2)nR15, O(CH2)n(CH)nR15, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH2)nOR15, (CH)nOR15,
(CH)n(CH2)nOR15, (CH2)n(CH)nOR15, (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3;
(CH)n(OH)R15; (CH2)n(OH)R15; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X;
(CH2)nX, (CH)nX, (CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX;
(CH2)n(CH)nX; OCH2X, O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX, O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X,
(CH2)nNHR15, (CH2)nNHOR15, (CH2)nNHCOR15, NR15(CH2)nR16,
NR15(CH)nR16, NR15(CH)n(CH2)nR16, NR15(CH2)n(CH)nR16,
OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3;
OCONH(CH2)n(CH)nCH3; (CH)nOR15, (CH2)nOR13, C6N2H5, C6H4(NHCOCH3), QH4SO2NH,(CNNHC(CONHNH2)CH2),
Adamantan, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, und Oxazol; wobei n = 1 bis 30 ist, und
R15 und R16 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N, OH,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, NH, NH2, NHNH2, NO, NO2, NHNH2, NOH, X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen, CN, CO, COOH,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH)n(CH2)nCH3; (CH2)n(CH)nCH3; OCH3, O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X; (CH2)nX, (CH)nX, (CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX; (CH2)n(CH)nX; OCH2X, O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX,
O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X, OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3; OCONH(CH2)n(CH)nCH3; C6N2H5, C6H4(NHCOCH3),
QH4SO2NH,(CNNHC(CONHNH2)CH2), Adamantan, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, und Oxazol;
und/oder
RO pOO pl p2 p3 p4 pS p6 p7 p8 p9 piO p11 p12 p44 p66 p77 p99 , K , K , K , K , K , K , K , K , K , K , K , K , K , K K , K , K , R1010 und R1111 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-C30- Alkyl, C1 -C30-AI kenyl, Q-Qo-Heteroalkyl, CrC30-Heteroalkenyl, C1- C30-Alkoxy, C1 -C30AI kenoxy, C1-C30, C3~C8-Cycloalkyl, C3-C8- Cycloalkenyl, C5-C30 Aryl, C5-C30-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5. 20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylal kenyl, Heterocycloalkyl,
Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Heteroaryloxyrest, Adamantan, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin,
Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, Cumarin (Chromen-2-on), und Oxazol,
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Verbindungen der Formeln I oder IA wie folgt definiert:
R0, R00, R1, R2, R3 , R4 , R5, R6, R7, R8, R9 , R10, R", R12, R44 R66 , R77 , R", R1010 und R1111 können gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13,
SH, SO, SO2, SO2R13, SO3, HSO3, SR13, SR13R14, S(CH2)nR13, S(CHn)R13;
S(CH2)n(CH)nR13, S(CH2)n(CH)nR13,
NH, NH2, NHNH2, NHR13, NR13R14, NO, NO2, NOH, NOR13, X, CX3, CHX2, CH2X, CR13X2, CR2 13X, CR3 13, wobei X = Halogen,
CN, CO, COR13, COOH, COOR13,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH2)nR13, (CH)nR13, (CH)n(CH2)nCH3;
(CH2)n(CH)nCH3; (CH)n(CH2)nR13; (CH2)n(CH)nR13; C(R13)C(R14)CH3,
C(R13)(CH2)nR14, (CH2)nR13, (CH)n(OH)R13; (CH2)n(OH)R13; (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; OCH3, O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3,
O(CH2)nR13, 0(CH)nR13, O(CH)n(CH2)nR13, O(CH2)n(CH)nR13,
(CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH2)nOR13, (CH)nOR13, (CH)n(CH2)nOR13,
(CH2)n(CH)nOR13, (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; (CH)n(OH)R13;
(CH2)n(OH)R13; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X; (CH2)nX, (CH)nX, (CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX; (CH2)n(CH)nX;
OCH2X, O(CH2)nCH2X, Q(CH)nCH2X, O(CH2)nX, Q(CH)nX, O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3/ (CH)nOCH2X7 (CH2)nNHR13, (CH2)nNHOR13, (CH2)nNHCOR13, (CH2)nN(R13)CO, N(R13)(CH2)nR14, N(R13XCH)nR14, N(Rl3)(CH)n(CH2)nR14,
N(R13)(CH2)n(CH)nR14, N(R13)COR14, N(R13)COOR14, CONH2, CONHCH3, C3H5OH, C(NH2)(CH2)n(OH), OCONH(CH2)nCH3;
OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3;
OCONH(CH2)n(CH)nCH3; (CH)nOR13, (CH2)nOR13, C6N2H5, C6H4(NHCOCH3), C6H4SO2NH, und (CNNHC(CONHNH2)CH2), C6N2H7, wobei n = 1 bis 10 ist, und
R13 und R14 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, OR15,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15, SR15R16, S(CH2)nR15, S(CHn)R15;
S(CH2)n(CH)nR15, S(CH2)n(CH)nR15,
NH, NH2, NHNH2, NHR15, NR15R16, NO, NO2, NOH, NOR15, X, CX3, CHX2, CH2X, CR15X2, CR2 15X, CR3 15, wobei X = Halogen,
CN, CO, COR15, COOH, COR15, COOR15,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH2)nR15, (CH)nR15, (CH)n(CH2)nCH3;
(CH2)n(CH)nCH3; (CH)n(CH2)nR15; (CH2)n(CH)nR15; OCH3, O(CH2)nCH3,
0(CH)nCH3, O(CH2)nR15, 0(CH)nR15, O(CH)n(CH2)nR15, O(CH2)n(CH)nR15, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH2)nOR15, (CH)nOR15,
(CH)n(CH2)nOR15, (CH2)n(CH)nOR15, (CH)n(OH)CH3; (CH2UOH)CH3;
(CH)n(OH)R15; (CH2UOH)R15; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2JnCH2X;
(CH2)nX, (CH)nX, (CH)n(CH2)nCH2X; (CH2Jn(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX;
(CH2UCH)nX; OCH2X, O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX, O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X,
(CH2)nNHR15, (CH2)nNHOR15, (CH2)nNHCOR15, NR15(CH2)nR16, NR1s(CH)πR16, NR15(CH)n(CH2)nR16, NR15(CH2)n(CH)nR16,
OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3; OCONH(CH2)n(CH)nCH3; (CH)nOR15, (CH2)nOR13, C6N2H5, C6H4(NHCOCH3), C6H4SO2NH,(CNNHC(CONHNH2)CH2), Adamantan, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, und Oxazol; wobei n = 1 bis 10 ist, und
R15 und R16 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N,
OH,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3,
NH, NH2, NHNH2, NO, NO2, NHNH2, NOH,
X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen, CN, CO, COOH,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH)n(CH2)nCH3; (CH2)n(CH)nCH3; OCH3,
O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH)n(OH)CH3;
(CH2)n(OH)CH3; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X; (CH2)nX, (CH)nX,
(CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX; (CH2)n(CH)nX; OCH2X, O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX,
O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X,
OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3;
OCONH(CH2)n(CH)nCH3; C6N2H5, C6H4(NHCOCH3),
C6H4SO2NH,(CNNHC(CONHNH2)CH2), Adamantan, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, und Oxazol.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Verbindungen der Formeln I oder IA durch die folgenden Strukturen 1 1 bis I 36 definiert:
Tabelle 1 : Erfindungsgemäße Katalysatoren gemäß den Formeln I und IA
Die unter die Formeln I und IA fallenden Verbindungen werden in der vorliegenden Erfindung auch generisch als Adamantylverbindungen bezeichnet, da sie auf einer vorzugsweise substituierten Adamant-Grundstruktur beruhen. Grundsätzlich können für die Durchführung eines jeden hierin offenbarten Verfahrens sämtliche substituierten Adamant-Grundstrukturen herangezogen werden. Bei allen diesen denkbaren substituierten Adamant-Grundstrukturen handelt es sich um Adamantylverbindungen. Die kugelsymmetrische Adamantgrundstruktur kann einfach, zweifach, dreifach oder höher substituiert sein, ggf. auch an allen, die Adamant-Grundstruktur bildenden Kohlenstoffatomen (insgesamt 10). Hierbei weist die Adamant-Grundstruktur verschiedene Arten von Kohlenstoffatomen auf, nämlich zweifach oder dreifach im Grundgerüst koordinierte Kohlenstoffe. Während an den dreifach koordinierten Kohlenstoffen jeweils nur ein Substituent auftreten kann, können dies an den zweifach koordinierten Kohlenstoffen auch jeweils zwei Substituenten sein. Bevorzugt ist es jedoch, an den im Grundgerüst zweifach koordinierten Kohlenstoffen nur einen Substituenten einzuführen. Obwohl also insgesamt 16 Substitutionen in der Adamant-Grundstruktur vorgesehen sein können, um Verbindungen für erfindungsgemäße Verfahren, bspw. zur Beladungsänderung oder zur Diagnose, bereitzustellen, werden erfindungsgemäß solche substituierten Adamantyl-Strukturen bevorzugt, die ein, zwei oder drei Substituenten aufweisen, bevorzugt an verschiedenen Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen, die an einem Kohlenstoffatom im Grundgerüst, sei es ein zweifach oder ein dreifach koordiniertes Kohlenstoffatom, einen langkettigen Substituenten aufweisen. Ein langkettiger Substituent im Sinne dieser Erfindung zeichnet sich typischerweise durch mindestens 8 kettenförmig über kovalente Bindungen miteinander verbundene Atome aus, bspw. ein C8-Alkyl oder C8-Alkoxy oder auch 8 über amidartige Verknüpfungen miteinander verbundene Atome. Treten weitere Substituenten, vorzugsweise an mindestens einem weiteren Kohlenstoffatom im Adamant-Grundgerüst auf, so sind diese vorzugsweise kurzkettig und weisen typischerweise 6 oder weniger miteinander kettenförmig verbundene Kohlenstoffatome auf. Besonders bevorzugt sind einfach substituierte Adamantylverbindungen mit einem Substituenten von einer Kettenlänge von mindestens 8 Atomen.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden gelöst, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel Il mit der folgenden Struktur: Formel
wobei:
R1', R2', R3' und R4 eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13', SH, SO, SO2, SO2R13', SO3, HSO3, SR13', SR13'R14', X, CX3, CHX2, CH2X, CR13'X2, CR2 13 X, CR3 13' wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOR13', NH, NH2, NHR13', NR13'R14', NO, NO2, NOH, NOR13',
CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, (CH2)nR13 , (CH)nR13 , OCH 3/ O(CH2)n, O(CH2)nCH3, O(CH2)n R13', (CH2)nOH, (CH)nOH, (CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3, (CH2)n(CH)nR13',
(CH)n(CH2)nR13', -(C3HNO)-CHX2, (C3HNO)-COOR13', - (C3HNO)-CHR^R14', wobei n = 1 bis 30 ist, und
R13' und R14' unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N,
OH, OR15', SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15', SR15 R16', X, CX3, CHX2, CH2X, CR15'X2, CR2 15X CR3 15' wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOR15',
NH, NH2, NHR15', NR15'R16', NO, NO2, NOH, NOR15',
CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, (CH2)nR15', (CH)nR15', OCH3,
O(CH2)n, O(CH2)nCH3, O(CH2)nR15', (CH2)nOH, (CH)nOH, (CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3/ (CH2)n(CH)nR15',
(CH)n(CH2)nR15', -(C3HNO)-CHX2, -(C3HNO)-CHR1^R16', wobei n = 1 bis 30 ist,
5 R15' und R16' unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, SH, SO, SO2, SO3, HSO3,
X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen, 10 CN, CO, COOH,
NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3,
(CH2)nOH, (CH)nOH, (CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3,
-(C3HNO)-CHX2, wobei n = 1 bis 30 ist, 15 und/oder
R1', R2', R3' und R4' unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem verzweigten oder
20 unverzweigten C1-C30-AIRyI, C1 -C30-Al kenyl, C1-C30-Heteroalkyl,
C1 -C30-Heteroal kenyl, C, -C30-Al koxy, C , -C30-AI kenoxy, C1-C30- Acyl, C3-C8-Cycloalkyl, C3-C8-Cycloalkenyl, C5-C30-Aryl, C5-C30- Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5-30-Aryloxy,
Heteroarylalkyl, Heteroarylal kenyl, Heterocycloalkyl,
25 Heterocycloal kenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-,
Adamantylrest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin,
30 Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen,
Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Adamantan, Pyrazol, Diazol, Tetrazol, Triazol, und/oder
R1' und R2' gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus aus einem verzweigten oder unverzweigten C1- C8-Al kyl, C1 -C8-Al kenyl, Q-Q-Heteroalkyl, C1-C8- Heteroalkenyl, C1-C8-AIkOXy, C1 -C8-Al kenoxy, C1-C8-ACyI, C3- C8-Cycloalkyl, C3-C8-CyC loa I kenyl, C5-C8-Aryl, C5-C8- Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5.8-Aryloxy, Heteroarylalkyl,
Heteroary IaI kenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantylrest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen,
Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Adamantan, Pyrazol,
Diazol, Tetrazol, Triazol, wobei an jedem einzelnen der Atome der verbrückten Struktur, bevorzugt 1 bis 12 Atome, unabhängig voneinander ein oder 2 Substituenten, ausgewählt aus (den zuvor einzeln beschriebenen) R1' oder R2', auftreten kann/können,
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Substituenten der Formel Il wie folgt definiert. R1', R2', R3' oder R4' können eine Bindung sein oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13', SH, SO, SO2, SO2R13', SO3, HSO3, SR13', SR13'R14', X, CX3, CHX2, CH2X, CR13 X2, CR2 13X CR3 13' wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOR13', NH, NH2, NHR13', NR13'R14', NO, NO2, NOH, NOR13',
CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, (CH2)nR13', (CH)nR13', OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3, O(CH2)n R13', (CH2)nOH, (CH)nOH, (CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3, (CH2)n(CH)nR13',
(CH)n(CH2)nR13', -(C3HNO)-CHX2, (C3HNO)-COOR13', - (C3HNO)-CHR13^14', wobei n = 1 bis 10 ist, und
R13' und R14 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N,
OH, OR15', SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15', SR15 R16',
X, CX3, CHX2, CH2X, CR15'X2, CR2 15X CR3 15' wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOR15',
NH, NH2, NHR15', NR15'R16', NO, NO2, NOH, NOR15', CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, (CH2)nR15', (CH)nR15', OCH3,
O(CH2)n, O(CH2)nCH3, O(CH2)nR15', (CH2)nOH, (CH)nOH,
(CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3, (CH2)n(CH)nR15',
(CH)n(CH2)nR15', -(C3HNO)-CHX2, -(C3HNO)-CHR15'R16', wobei n = 1 bis 10 ist, und R15' und R16' unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N,
OH, SH, SO, SO2, SO3, HSO3, X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3, (CH2)nOH, (CH)nOH, (CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3, -(C3HNO)-CHX2, wobei n = 1 bis 10 ist,
und/oder
R1 und R2 gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-
C8-Alkyl, CrC8-Alkenyl, Q-Q-Heteroalkyl, C1-C8- Heteroalkenyl, C1-C8-AIkOXy, C1 -C8-Al kenoxy, C1-C8-ACyI, C3- C8-Cycloalkyl, C3-C8-Cycloalkenyl, C5-C8-Aryl, C5-C8- Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Cs.8-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl,
Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantylrest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin,
Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Adamantan, Pyrazol, Diazol, Tetrazol, Triazol, wobei an jedem einzelnen der Atome der verbrückten Struktur, bevorzugt 1 bis 12 Atome, unabhängig voneinander ein oder 2 Substituenten, ausgewählt aus den zuvor definierten R1 oder R2', auftreten kann/können,.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der folgenden Erfindung werden die Verbindungen der Formel II aus folgenden Strukturen ausgewählt:
In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden gelöst, umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel III mit der folgenden Struktur: Formel III
wobei:
R1" und R2" eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13", SH, SO, SO2, SO2R13", SO3, HSO3, SR13", SR13"R14", S(CH2)n(CH4N);
X, CX3, CHX2, CH2X, CR13"X2, CR2 13"X wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3, COOR13",
NH, NH2, NHR13", NR13"R14", NR13"(CO)R14"; NO, NO2, NOH,
CHNOH, NOR13", CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR13", (CH)nCR13"R14", OCH3, O(CH2)n,
O(CH2)nCH3; O(CH2)nR13", (CH2)nOH, C4H2O(CH3); (C3H2NO)(R13"),
(O(CH2)nCH(R13")S(O2)); (C(CH3)(CH2)nN HC(O)S),
((CH2)nN(CH2)nC(R13")S), (CHC(R13^N(R14INC(R13"), NR13"(CH2)nR14", und (C2H3N2O(NR13"R14"), wobei n = 1 bis 30 ist, und
R13" und R14" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N, OH, OR15", SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15", SR15"R15",
SC(CX3)XCOOR15",
X, CX3, CHX2, CH2X, CR1S"X2, CR2 15"X wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOCH3, COOR15", NH, NH2, NHR13", NR1S"R16", NO, NO2, NOH, NOR15", CH3/ (CH2)n, (CH2)nCH3/ (CH2)nR15", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3;
O(CH2)nR15", (CH2)nOH, C6H4CH3, C6H9, C3H5N2O2, (C3H2NS)(R15"), und (N(R15"C3HNO(R16")), CH(R15")(CH2)nR16", wobei n = 1 bis 30 ist, und
R15" und R16" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, SH, SO, SO2, SO3, HSO3, X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3,
NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; und (CH2)nOH, wobei n = 1 bis 30 ist,
und/oder
R1 " und R2 " unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-C30- Alkyl, C1-C30-Al kenyl, CrC30-Heteroalkyl, CrC30-Heteroalkenyl, C1-
C30-Alkoxy, C1 -C30-Al kenoxy, C1-C30-ACyI, C3-C8-Cycloalkyl, C3-C8- Cycloalkenyl, C3-C30-Aryl, C5-C30-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5. 30-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloal kenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest; Toluol, Anilin, Benzaldehyd,
Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin,
Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Diazol, Tetrazol, Pyrazol, C3H2S2O, gesättigtes oder nicht-gesättigtes C6.8-Lacton, und Succinimid,
und/oder
R3" und R4" entweder wie für R1 " und R2" definiert sind oder eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR13", SR13"R14",
X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, CR13"X2, CR2 13 X CR3 13 " wobei X
= Halogen,
CN, CO, COOH, COOR13", NH, NH2, NHR13", NR13"R14", NO, NO2, NOH, NOR13",
CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR13", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3;
O(CH2)nR13", (CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3,
S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH),
NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3, SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2,
C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(C5H4N),
CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O),
C6H4S(O)2NH, C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, und Adamantyl; wobei n = 1 bis 30 ist, und
R13" und R14" unabhängig voneinander ausgewählt werden aus
H, O, S, N,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15", SR15"R16",
X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, CR15"X2, CR2 1B"X, CR3 15" wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOR15", NH, NH2, NHR15", NR1S"R16", NO, NO2, NOH, NOR15", CH3, (CH2)nCH3, (CH2)nR15", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; O(CH2)nR15", (CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3, S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH), NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3, SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3,
C(CH3)C(O)NHC(O)CH2, C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5,
NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(C5H4N), CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O), C6H4S(O)2NH,
C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, Adamantyl; wobei n - 1 bis 30 ist, und
R15" und R16" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N, SH, SO, SO2, SO3, HSO3,
X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3,
NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; (CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3, S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH),
NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3,
SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2,
C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(C5H4N),
CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O), C6H4S(O)2NH, C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, und Adamantyl; wobei n = 1 bis 30 ist,
und/oder
R3' und R4" können unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-C30-AIkYl, C1 -C30-Al kenyl, Q-Qo-Heteroalkyl, C1- C30-Heteroalkenyl, C1-C30-AIkOXy, Q-Qo-Alkenoxy, CrC30-Acyl, C3-C8- Cycloalkyl, C3-C8-Cycloalkenyl, C3-C30-Aryl, C5-C30-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5.3o-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloal kenyl,
Carboxamidorest, Acylaminorest, Amidinorest, Adamantylrest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran,
Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, lmidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Diazol, Tetrazol, Pyrazol, C3H2S2O, gesättigtes oder nicht-gesättigtes C6.8-Lacton, und Succinimid;
und/oder
R3 ' und R4" gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus einem verzweigten oder unverzweigten C1 -C8-Al kyl, CrC8-Alkenyl, C1-
Q-Heteroalkyl, Q-Q-Heteroalkenyl, CrC8-Alkoxy, C1 -C8-Al kenoxy,
CrC8-Acyl, C3-C8-Cycl oalkyl, C3-C8-Cycloalkenyl, C3-C8-Aryl, C5-C8-
Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5.8-Aryloxy, Heteroarylalkyl,
Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantylrest,
Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril,
Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin,
Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren,
Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan,
Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Diazol, Tetrazol, Pyrazol, C3H2S2O, gesättigtes oder nicht-gesättigtes C6-8-LaCtOn, und Succinimid, wobei an jedem einzelnen der Atome der verbrückten Struktur, bevorzugt 1 bis 12 Atome, unabhängig voneinander ein oder 2 Substituenten, ausgewählt aus R1 oder R2", auftreten kann/können,
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Substituenten der Formel Hl wie folgt definiert:
R1" und R2 " können eine Bindung sein oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13", SH, SO, SO2, SO2R13", SO3, HSO3, SR13", SR13"R14", S(CH2)n(CH4N);
X, CX3, CHX2, CH2X, CR13"X2, CR2 13"X wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3, COOR13",
NH, NH2, NHR13", NR13"R14", NR13"(CO)R14"; NO, NO2, NOH,
CHNOH, NOR13", CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR13", (CH)nCR13"R14", OCH3,
O(CH2)n, O(CH2)nCH3; O(CH2)nR13", (CH2)nOH, C4H2O(CH3);
(C3H2NO)R13"), (O(CH2)nCH(R13")S(O2));
(C(CH3)(CH2)nNHC(O)S), ((CH2)nN(CH2)nC(R13")S),
(CHC(R13IN(R14INC(R13"), und (C2H3N2O(NR13"R14")), wobei n = 1 bis 10 ist, und R13 " und R14" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N,
OH, OR15", SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15", SR15"R15", SC(CX3)XCOOR15",
X, CX3, CHX2, CH2X, CR15"X2, CR2 1S"X wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOCH3, COOR15", NH, NH2, NHR13", NR15"R16", NO, NO2, NOH, NOR15", CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR15", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; O(CH2)nR15", (CH2)nOH, C6H4CH3, C6H9,
C3H5N2O2, und (C3H2NS)(R15"), wobei n = 1 bis 10 ist, und
R15" und R16" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, SH, SO, SO2, SO3, HSO3,
X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3, NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; und
(CH2)nOH, wobei n = 1 bis 10 ist,
und/oder
R3" und R4" entweder wie für R1" oder R2" definiert sind oder eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N, SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR13", SR13"R14", X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, CR13"X2, CR2 13"X, CR3 13" wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOR13", 5 NH, NH2, NHR13", NR13"R14", NO, NO2, NOH, NOR13",
CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR13", OCH3, O(CH2)n/ O(CH2)nCH3; O(CH2)nR13", (CH2JnOH, C6H10OH, SO2CF3, S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH),
NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3,
10 SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2,
C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(QH4N), CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)),
NH(C6H3N2O), C6H4S(O)2NH, C6H4NHC(O)CH3,
NHC(O)CHNOH, Adamantyl;
15 wobei n = 1 bis 10 ist, und
R13" und R14" unabhängig voneinander ausgewählt werden aus
H, O, S, N,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15", SR15"R16",
20 X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, CR15"X2, CR2 1 S"X, CR3 15" wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOR15",
NH, NH2, NHR15", NR15"R16", NO, NO2, NOH, NOR15", CH3, (CH2)nCH3, (CH2)nR15", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3;
25 O(CH2)nR15", (CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3,
S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH),
NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3, SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2, C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2J2(C5H4N),
30 CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O), C6H4S(O)2NH, C6H4NHC(O)CH3,
NHC(O)CHNOH, und Adamantyl; wobei n = 1 bis 10 ist, und
R15 und R15" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOCH3,
NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; (CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3, S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)),
(CNONC)NHCH2(N4CH), NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3, SCH2(C2NSH(NH2)),
C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2, C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(C5H4N), CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O), C6H4S(O)2NH,
C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, und Adamantyl; wobei n = 1 bis 10 ist,
und/oder
R3 " und R4 " gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-C8-
Alkyl, C,-C8-Alkenyl, Q-Q-Heteroalkyl, Q-Q-Heteroalkenyl, C1-C8-AIkOXy, C1 -C8-Al kenoxy, C1-C8-ACyI, C3-C8-Cycloalkyl, C3- C8-Cycloalkenyl, C5-C8-Aryl, C5-C8-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5.8-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-,
Acylamino-, Amidino-, Adamantyl rest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Diazol, Tetrazol, Pyrazol, C3H2S2O, gesättigtes und nicht-gesättigtes C6.8-Lacton, Succinimid, wobei an jedem einzelnen der Atome der verbrückten Struktur, bevorzugt 1 bis 12 Atome, unabhängig voneinander ein oder 2 Substituenten, ausgewählt aus R1" oder R2 ", auftreten kann/können.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen nach Formel III aus den folgenden Strukturen ausgewählt:
III 19 III 20
21 III 22
23 I 24
III 25 III 26
III 27 III 28
In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden gelöst, umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend M H C-Mo I ekü Ie; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formeln IV1 bis IV3; und
Tabelle 4: Erfindungsgemäße Katalysatoren gemäß den Formeln IV 1, IV 2 und IV 3
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand geändert wurde.
Die Verfahrensschritte (a), (b) und gegebenenfalls (c) der zuvorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-
Molekülen mit Liganden können in beliebiger Reihenfolge oder parallel erfolgen.
Beispielsweise können die Schritte (b) und (c) parallel stattfinden. Auch kann anstelle der Bereitstellung der Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle zunächst der
Katalysator, vorzugsweise in Lösung, in einem Verfahrensschritt (a) vorgelegt werden und dann die jeweils anderen Substanzen hinzugegeben werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die oben genannten Substituenten bevorzugt wie folgt definiert:
Ein Alkyl gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst lineare, verzweigte oder zyklische C1-C30, bevorzugt C1-C20, weiter bevorzugt C1-C6 Kohlenwasserstoffstrukturen sowie Kombinationen daraus. „Niedere Alkyle" beziehen sich auf Alkylgruppen mit 1 -6 Kohlenstoffatomen. Beispiele niederer Alkylgruppen schließen Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, s-und t-Butyl- und ähnliches mit ein. Cycloalkyle sind eine Untergruppe der Alkyle und schließen zyklische Kohlenwasserstoffgruppen von 3 bis 8 Kohlenstoffatomen mit ein. Beispiele von Cycloalkylgruppen schließen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Norbornyl und ähnliches mit ein.
Ein Alkenyl gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst lineare, verzweigte oder zyklische ungesättigte C1-C30, bevorzugt C1-C20, weiter bevorzugt C1-C6 Kohlenwasserstoffstrukturen sowie Kombinationen daraus. „Niedere Alkenyle" beziehen sich auf Alkenylgruppen mit 1 -6 Kohlenstoffatomen. Beispiele niederer Alkenylgruppen schließen Methenyl-, Ethenyl-, Propenyl-, Isopropenyl-, Butenyl-, s- und t-Butenyl- und ähnliches mit ein. Cycioalkenyle sind eine Untergruppe der Alkenyle und schließen zyklische Kohlenwasserstoffgruppen von 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugt von 3 bis 8 Kohlenstoffatomen mit ein. Beispiele von Cycloalkenylgruppen schließen Cyclopropenyl, Cyclobutenyl, Cyclopentenyl und ähnliches mit ein.
Ein Heteroalkyl oder Heteroalkenyl der vorliegenden Verbindung umfasst ein wie oben definiertes Alkyl oder Alkenyl, in welchem ein oder zwei Kohlenstoffe gegen ein Heteroatom wie beispielsweise Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel ausgetauscht sind.
Alkoxy- oder Alkoxyl-Gruppen gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Gruppen aus 1 bis 30 Kohlenwasserstoffatomen, bevorzugt 1 bis 20, weiter bevorzugt aus 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einer unverzweigten, einer verzweigten oder einer zyklischen Konfiguration sowie Kombinationen davon, die über ein
Sauerstoffatom mit der Hauptverbindung verknüpft sind. Beispiele schließen
Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Isopropoxy-, Cyclopropyloxy-, Cyclohexyloxy- und ähnliche Gruppen mit ein. Niedere Alkoxy- oder Alkoxyl-Gruppen beziehen sich auf
Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Alkenoxy- oder Alkenoxyl-Gruppen gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Gruppen aus 1 bis 30 Kohlenwasserstoffatomen, bevorzugt 1 bis 20, weiter bevorzugt aus 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einer unverzweigten, einer verzweigten oder einer zyklischen ungesättigten Konfiguration sowie Kombinationen davon, die über ein Sauerstoffatom mit der Hauptverbindung verknüpft sind. Beispiele schließen Methenoxy, Ethenoxy, Propenoxy, Isopropenoxy, Cyclopropenyloxy, Cyclohexenyloxy und ähnliches mit ein. Niedere Alkenoxy- oder Alkenoxyl- Gruppen beziehen sich auf Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Aryle und Heteroaryle gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf einen 5 oder 6-gliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring enthaltend 0-3 Heteroatome ausgewählt aus O, N, oder S; ein bicyclisches 9-oder 10-gliedriges aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem enthaltend 0-5 Heteroatome ausgewählt aus O, N, oder S; oder ein tricyclisches 13-or 14-gliedriges aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem enthaltend 0-7 Heteroatome ausgewählt aus O, N, oder S. Die aromatischen 6- bis 14-gliedrigen Ringsysteme schließen beispielsweise mit ein Benzol, Naphthalen, Indan, Tetralin, und Fluoren und die 5- bis 10-gliedrigen aromatischen heterocyclischen Ringe, schließen beispielsweise mit ein Imidazol, Pyridin, Indol, Thiophen, Benzopyranon, Thiazol, Furan, Benzimidazol, Chinolin, Isochinolin, Chinoxalin, Pyrimidin, Pyrazin, Tetrazol und Pyrazol.
Ein Arylalkyl oder Aralkyl gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet einen wie oben definierten Alkylrest, der an ein wie oben definiertes Aryl gebunden ist.
Beispiele von Aralkylresten sind Benzyl, Phenethyl und ähnliche. Heteroarylalkyl bedeutet einen wie oben definierten Alkylrest, der an einen wie oben definierten
Heteroarylring gebunden ist. Heteroarylalkenyl bedeutet einen wie oben definierten
Alkyenlrest, der an einen wie oben definierten Heteroarylring gebunden ist Beispiele schließen mit ein, Pyridinylmethyl, Pyrimidinylethyl und Ähnliches. Ein Heterocyclus gemäß der vorliegenden Erfindung repräsentiert einen wie oben definierten Cycloalkyl- oder Arylrest, in welchem ein oder zwei Kohlenstoffe gegen ein Heteroatom wie beispielsweise Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel ausgetauscht sind.
Heteroaryle bilden eine Untergruppe der Heterocyclen. Beispiele von Heterocyclen, die unter den Schutzbereich dieser Erfindung fallen, schließen Pyrrolidin, Pyrazol, Pyrrol, Indol, Chinolin, Isochinolin, Tetrahydroisochinolin, Benzofuran, Benzodioxan, Benzodioxol (allgemein als Methylendioxyphenyl bezeichnet, wenn es als Substituent auftritt), Tetrazol, Morpholin, Thiazol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Thiophen, Furan, Oxazol, Oxazolin, lsoxazol, Dioxan, Tetrahydrofuran und Ähnliches mit ein.
Acyle gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Gruppen aus 1 bis 30, bevorzugt 1 bis 20 Kohlenwasserstoffatomen der Form RCO, weiter bevorzugt aus 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wobei R jede der oben genannten Gruppen sein kann. Beispielhafte Acylgruppen der vorliegenden Erfindung sind Methanoyl-, Acetyl-, Ethanoyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Malonyl-, Benzoyl-, und Ähnliche.
Alle Alkyl, Alkenyl, Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Alkoxy, Alkenoxy, Acyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyreste gemäß der vorliegenden Erfindung können substituiert sein. Substituierte Alkyl, Alkenyl, Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Alkoxy, Alkenoxy, Acyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyreste beziehen sich auf Alkyl, Alkenyl, Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Alkoxy, Alkenoxy, Acyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyreste, wobei 1 bis 10 H Atome mit einem SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR1, SRr'R2", X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, CR1"X2, CR2 1"X, CR3 1" CN, CO, COOH, COOR1", NH, NH2, NHR1", NRr'R2", NO, NO2, NOH, NOR1", CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3; (CH2)n R1", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; O(CH2)n R1 , (CH2)nOH, einem niederen Alkyl-, Carboxy-, Carboalkoxy-, Carboxamido-, Cyano-, Carbonyl-, Alkylthio, Sulfoxid, Sulfon, Acylamino-, Amidino-, Phenyl-, Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, Heteroaryloxy-, oder einem substituierten Phenyl-, Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, oder einem Heteroaryloxyrest substituiert sein können.
Ein Halogen X umfasst typischerweise die Halogene F, Cl, Br, und I. Alternativ können anstelle der genannten Halogene auch die Pseudohalogene CN oder CO eingesetzt werden.
Alle gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen können ein oder mehrere asymmetrische Zentren enthalten und daher Enantiomere, Diastereomere, und andere stereomere Formen ausbilden, die gemäß den Begriffen der absoluten Stereochemie mit (R)-oder (S)- bezeichnet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst solche möglichen Isomere, sowie deren reine und racemische Formen. Optisch aktive (R)-oder (S)-Isomere können unter Verwendung von Synthosan oder chiralen Reagenzien hergestellt werden oder unter Verwendung von Standardverfahren aufgetrennt werden. Enthalten die hier beschriebenen Verbindungen olefinische Doppelbindungen oder andere Zentren geometrischer Asymmetrie, werden, soweit nicht anders beschrieben, sowohl geometrische E und Z Isomere mit umfasst. In analoger Weise werden erfindungsgemäß alle tautomeren Formen mit umfaßt.
Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 können aus
Substanzbibliotheken isoliert werden. In den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung wurden beispielsweise Kleinmoleküle aus einer
Substanzbibliothek mit 20.000 Kleinmolekülen von Chemical Diversity Labs Inc., San Diego, USA gescreent. Alternativ können für die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen Substanzen aus jeder anderen Substanzbibliothek verwendet werden, die Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und 1V1 bis IV3 enthält, beispielsweise Substanzbibliotheken der Cambridge Small Compound Library, der Aldrich Library of Rare Chemicals oder Substanzbibliotheken von Reaction Biology Corp. (RBC), ActiMol, AnalytiCon Discovery, Biofocus, BIOMOL Research Laboratories, Chembridge, Comgenex, Microsource /MSDI, Polyphor, Prestwick Chemical, SPECS and Biospecs, TimTec, Tripos, usw..
MHC-Moleküle, die in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können aus verschiedenen natürlichen Quellen oder über rekombinante Verfahren gewonnen werden. Natürliche Quellen von MHC- Molekülen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise Zellen oder Gewebe humanen oder tierischen Ursprungs, noch stärker bevorzugt körpereigene oder nicht-körpereigene dendritische Zellen wie beispielsweise maturierte und nicht- maturierte dendritische Zellen, sowie B-Zellen oder Makrophagen oder andere Antigen-präsentierende Zellen. Natürliche Quellen von MHC-Molekülen im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen ebenfalls bevorzugt Körperflüssigkeiten, enthaltend die zuvor definierten Zellen, beispielsweise Blut, Lymphe, oder Gewebe, etc..
MHC-Moleküle, die aus natürlichen Quellen gewonnen und in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können in isolierter Form oder zusammen mit den Zellen eingesetzt werden, mit denen sie assoziiert sind.
Einerseits können MHC-Moleküle aus natürlichen Quellen, d.h. aus Zellen, Körperflüssigkeit, Lymphe, etc. gewonnen und über biochemische Aufreinigungsverfahren, bspw. chromatographische Verfahren, Zentrifugationsverfahren, Dialyseverfahren, Antikörperbindungsverfahren, etc. isoliert werden. Dies erfolgt z.B. durch Abspaltung des extrazellulären Anteils der darin enthaltenen Zellen durch Waschschritte und/oder Abspaltung mit Proteasen von den z.B. in Körperflüssigkeiten oder Lymphe enthaltenen, mit MHC-Molekülen assoziierten Zellen. Anschließend werden bevorzugt die MHC-Moleküle aus der abgespaltenen extrazellulären Fraktion durch biochemische Aufreinigungsverfahren, z.B. über Antikörperbindungsverfahren, isoliert. Diese so gewonnenen isolierten MHC-Moleküle können anschließend in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.
Alternativ können MHC-Moleküle aus natürlichen Quellen zusammen mit ihren assoziierten Zellen ohne weitere Isolierung der MHC-Moleküle in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Typischerweise werden dazu die Zellen als solche zusammen mit den MHC-Molekülen isoliert. Verfahren zur Gewinnung von Zellen sind einem Fachmann bekannt. Beispielsweise' können zur Gewinnung von MHC-Molekülen im Sinne der vorliegenden Erfindung aus natürlichen Quellen einem Patienten bevorzugt dendritische Zellen, besonders bevorzugt maturierte und/oder nichtmaturierte dendritische Zellen, oder B-Zellen oder Makrophagen, oder andere MHC-Moleküle exprimierende Zellen, einzeln oder in Ansammlungen von mehreren Zellen entnommen und aufgereinigt werden. Aufreinigungsverfahren für Zellen sind einem Fachmann ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise werden für die Aufreinigung von Zellen die Bestandteile einer Zell- oder Gewebeprobe aus einer natürlichen Quelle einer Auftrennung anhand ihrer Dichte unterworfen. Eine Auftrennung anhand der Dichte kann mittels chromatographischen Verfahren, beispielsweise durch Ausschlusschromatographie oder FPLC, oder anhand einer Zentrifugation, bevorzugt einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation beispielsweise über eine Ficoll-Trennlösung, erfolgen. Nach Auftrennung der Bestandteile anhand ihrer Dichte werden die Zellen typischerweise durch Adhärenz der gesuchten Zielzellen an eine Matrix oder eine Festphase, beispielsweise an Nylonwolle, angereichert und unerwünschte Zellen depletiert. Eine Festphase oder eine Matrix im Sinne des vorliegenden Verfahrens ist dabei jede Oberfläche, an die sich MHC-Moleküle direkt, über einen Linker, eine Markierung oder über ihre Affinität, binden lassen. Alternativ können die Zellen durch chromatographische Verfahren/ beispielsweise durch chromatographische Ausschlussverfahren oder FPLC-Verfahren angereichert werden. Falls erforderlich, kann nach einer ersten Anreicherung die in der Zellsupension vorhandene Zellzahl bestimmt werden. Anschließend werden die Zeilen typischerweise aus der erhaltenen Zellsuspension durch Chromatograph ische Verfahren, durch Bindung an eine Festphase, durch magnetische Sortierung mittels eines MACS-Verfahren (Magnetic Activated Cell Sort), oder durch vergleichbare Verfahren aufgetrennt. Eine magnetische Sortierung von Zellen ermöglicht beispielsweise die quantitative Ausbeute hochreiner Zellpopulationen aus verschiedenen Geweben. Die Zellen werden bei der Auftrennung bevorzugt negativ sortiert, d. h. alle nicht gewünschten Zellen werden aus dem Zellgemisch depletiert. Alternativ können die gewünschten Zellen ebenfalls bevorzugt positiv direkt aus dem Zellgemisch sortiert werden. In beiden Fällen können die Zellen bevorzugt mit einem für den Zelltyp spezifischen monoklonalen Antikörper markiert werden, der an eine Festphase oder an Partikel, beispielsweise an superferromagnetische Partikel (m/crobeads), gebunden sein kann. Alternativ kann ein erster spezifischer monoklonaler Antikörper von einem zweiten Antikörper erkannt werden, der an eine Festphase, üblicherweise microbeads, gebunden ist und den Fc-Anteil des ersten Antikörpers erkennt. Nach einem Chromatograph ischen Verfahren oder der Bindung an eine Festphase können die Zellen von der Säule oder der Festphase getrennt werden, typischerweise durch Elution. Nach einer magnetischen Sortierung mittels eines MACS-Ve rfahrens und der Bindung an Microbeads, können die Zellen typischerweise in einem magnetischen Feld über eine Säule aufgetrennt werden. Methodische Einzelheiten sind aus den Angaben des Herstellers der verwendeten Microbeads ersichtlich (z.B. Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland). Die Aufreinigung der Zellen findet typisch erweise zu jedem Zeitpunkt unter Kühlung statt, bevorzugt unter Kühlung auf Eis. Falls erforderlich, werden die erhaltenen Zellsuspensionen zu jedem Zeitpunkt der Aufreinigung einmalig oder mehrmals mit geeigneten Pufferlösungen, beispielsweise PBS, gewaschen. Nach erfolgter Aufreinigung werden die erhaltenen Zellen entweder gelagert oder direkt eingesetzt. Die Zellen werden üblicherweise in einem Puffer gelagert, der die Zellen unter physiologischen Bedingungen hält und keinen osmotischen Druck verursacht. Geeignete Puffer sind beispielsweise PBS Puffer, RSA-PBS Puffer (PBS Puffer mit Rinder-Serum-Albumin (RSA)), FKS-PBS Puffer (PBS Puffer mit Fötalem Kälberserum (FKS)), Phosphat-Puffer, TRIS-HCl Puffer, Tris-Phosphat-Puffer, oder weitere geeignete Puffer, wie Dulbeccos's modified Eagle Medium (DMEM) oder RPMI mit 5-10%FKS., wobei die beiden zuletzt genannten insbesondere auch zur Lagerung von Zellen geeignet sind Gegebenenfalls können die Zellen in Nährmedium gelagert und/oder eingesetzt werden, beispielsweise FKS/10% DMSO.
MHC-Moleküle zur Verwendung in einem der erfindungsgemäßen Verfahren können auch durch rekombinante Verfahren zur Verfügung gestellt werden. Verfahren zur rekombinanten Herstellung von MHC-Molekülen sind einem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise J. Sambrook ; E. F. Fritsch; T. Maniatis, 2001 , „Molecular cloning : a laboratory manual", CoId Spring Harbor, NY : CoId Spring Harbor Laboratory Press). Typischerweise werden dazu Vektoren, die MHC- Moleküle kodieren, in geignete Zeilexpressionssysteme, eingebracht, die MHC- Moleküle exprimieren, anschließend geerntet, und die MHC-Moleküle mit Hilfe von biochemischen Aufreinigungsverfahren, beispielsweise chromatographischen Verfahren, Zentrifugationsverfahren, Dialyseverfahren, etc. aufgereinigt.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte MHC-Moleküle sind typischerweise MHC Monomere oder Multimere, bevorzugt MHC Monomere oder Multimere der Klassen I und II. MHC-Moleküle, die über ein rekombinantes Verfahren gewonnen werden, liegen typischerweise in einer monomeren Form vor. MHC-Moleküle, die aus einer natürlichen Quelle gewonnen werden, liegen üblicherweise ebenfalls monomer vor. Um solche monomeren MHC-Moleküle in eine multimere Form zu überführen, können aus natürlichen Quellen isolierte oder rekombinant hergestellte MHC-Moleküle biotinyliert und anschließend gebunden werden. Durch die Bindung der biotinylierten MHC-Moleküle an fluoreszenz- markierte Streptavidin-Moleküle entstehen multimere MHC-Komplexe, bevorzugt tetramere Komplexe, da am Streptavidin 4 Bindungsstellen für Biotin existieren. Alternativ können aus natürlichen Quellen isolierte oder rekombinant hergestellte MHC-Moleküle multimerisiert werden, bevorzugt in MHC-Tetramere oder Pentamere der Klassen I und II. Dazu wird bevorzugt eine sich selbst anordnende „coiled-coil//-Domäne zusammen mit einem rekombinanten MHC-Molekül coexprimiert. Alternativ zu den hier beschriebenen Multimerisierungsverfahren kann jedes weitere bekannte Verfahren zur Multimerisierung von MHC-Molekülen eingesetzt werden. Einem Fachmann im Stand der Technik sind solche Verfahren bekannt. Eine weitere Möglichkeit der Multimerisierung besteht in der kovalenten oder nicht-kovalenten Bindung der Moleküle an Oberflächen, wie z.B. Kulturplatten oder sogenannte Mikrobeads. Beides wird bereits zur Stimulierung von T Zellen eingesetzt, wobei die Mikrobeads für den Fall, dass sie einen Eisenkern enthalten (z.B. Dynabeads, Dynal Biotech GMBH), auch für die selektive Aufreinigung der Zellen mittels Magneten eingesetzt werden können. Für letztere Zwecke können auch an sogenannte nano-beads gekoppelte monomere MHC-Moleküle eingesetzt werden (z.B. Miltenyi Biotec). Multimere MHC-Moleküle können ebenfalls kommerziell erworben werden. Beispielsweise können Tetramere von der Firma Becton Dickinson, Beckman Coulter und Pentamere von der Firma Proimmune bezogen werden. Nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mit Liganden beladene MHC Multimere sind bevorzugt in der Lage, selektiv an T-Zellen zu binden, deren T-Zellrezeptor spezifisch den auf den Komplex geladenen Liganden erkennt.
MHC-Moleküle, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können markiert sein. Die MHC-Moleküle, deren Beladungszustand gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung verändert wird, bevorzugt MHC Multimere, werden dazu bevorzugt vor der Änderung ihres Beladungszustandes markiert. Bevorzugt enthalten die MHC-Moleküle Markierungen, die die Erzeugung eines direkt oder indirekt nachweisbaren Signals erlauben. Dem Fachmann sind dabei folgende Modifikationen bekannt: (i) radioaktive Modifikationen, z.B. radioaktive Phosphorylierung oder radioaktive Markierung mit Schwefel, Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff,
(ii) farbige Gruppen (z.B. Digoxygenin, etc.), (iii) fluoreszierende Gruppen (z.B. Fluorescein, etc.),
(iv) chemolumineszierende Gruppen,
(v) Gruppen zur Immobilisierung an einer festen Phase (z.B. Biotin, Streptag, Antikörper, Antigene, etc.),
oder Kombinationen von Modifikationen gemäß zwei oder mehr der unter (i) bis (v) genannten Modifikationen.
MHC-Moleküle, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, treten typischerweise in einer geschlossenen, unbeladenen, nicht-rezeptiven oder in einer offenen rezeptiven Konformation auf. In der geschlossenen nicht-rezeptiven Konformation ist das MHC-Molekül bevorzugt nicht in der Lage, Liganden aufzunehmen oder abzugeben. Ein Übergang zwischen diesen verschiedenen Konformationen eines MHC-Moleküls findet typischerweise durch eine entsprechende Verschiebung des Gleichgewichts der Reaktion statt, d.h. eine Gleichgewichtsverschiebung zwischen der geschlossenen, unbeladenen, nicht¬ rezeptiven Konformation; der offenen, unbeladenen, rezeptive Konformation; und der offenen, beladenen, rezeptiven Konformation. In den erfindungsgemäßen Verfahren werden die MHC-Moleküle durch die verwendeten Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 bevorzugt von einer geschlossenen, unbeladenen, nicht-rezeptiven Konformation in eine offene, unbeladene, rezeptive Konformation überführt. Alternativ werden die MHC-Moleküle direkt von einer geschlossenen, unbeladenen, nicht-rezeptiven Konformation in eine offene, beladene, rezeptive Konformation überführt. Geht das MHC-Molekül infolge der katalysatorischen Wirkung der Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 in einen offenen rezeptiven Zustand über oder liegt es in einem offenen rezeptiven Zustand vor, können die MHC-Moleküle mit Liganden beladen werden oder es kann am MHC-Molekül ein Austausch von Liganden stattfinden. Anders formuliert ist das MHC-Molekül in der offenen, unbeladenen, rezeptiven Konformation bevorzugt in der Lage, einen Liganden aufzunehmen. Alternativ kann der Ligand eines MHC- Molekül in der offenen, beladenen, rezeptiven Konformation ausgetauscht werden. In einer weiteren Alternative kann auch direkt eine Beladung des MHC-Moleküls mit Liganden aus der geschlossenen, unbeladenen, nicht-rezeptiven Konformation unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 durchgeführt werden.
Monomere oder multimere MHC-Moleküle, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, können unbeladen oder bereits mit Liganden beladen sein. Im Falle der Herstellung durch rekombinante Verfahren sind die MHC- Moleküle nach ihrer Aufreinigung typischerweise unbeladen. Es können jedoch ebenfalls aus natürlichen Quellen isolierte MHC-Moleküle oder die zusammen mit ihren assoziierten Zellen isolierten MHC-Moleküle, nach ihrer Aufreinigung unbeladen sein. Solche unbeladenen MHC-Moleküle können nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mit gewünschten Liganden beladen werden. Eine Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden bedeutet in diesem Fall daher bevorzugt die Beladung von (vorher unbeladenen) MHC- Molekülen mit Liganden. Alternativ können MHC-Moleküle sowohl nach ihrer rekombinanten Herstellung als auch nach ihrer Isolierung aus natürlichen Quellen bereits mit Liganden beladen sein. Die Anzahl der Liganden auf der Oberfläche solcher beladenen MHC-Moleküle, kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren verringert oder die Liganden ganz entfernt werden. Eine Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden bedeutet in diesem Fall daher bevorzugt die Verringerung des Beladungszustandes von (vorher beladenen) MHC-Molekülen mit Liganden, gegebenfalls die vollständige Entfernung der Liganden von (vorher beladenen) MHC-Molekülen. In einer weiteren Alternative können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren Liganden von (vorher beladenen) MHC-Molekülen gegen andere gewünschte Liganden ausgetauscht werden. Eine Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden bedeutet in diesem Fall daher bevorzugt den Austausch von Liganden von (vorher beladenen) MHC-Molekülen gegen gewünschte Liganden. Typischerweise findet zu diesem Zweck vorgeschaltet eine Entfernung oder Verringerung von bereits vorhanden Liganden auf dem MHC-Molekül gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren statt, und anschließend die erneute Beladung von MHC-Molekülen mit gewünschten Liganden gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Liganden von MHC-Molekülen native und nicht-native Verbindungen, die an MHC- Moleküle unter physiologischen Bedingungen binden. Besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Liganden von MHC-Molekülen Antigene, insbesondere tumor- oder pathogenspezifische Antigene, Peptidantigene, gewebsspezifische Selbstantigene, Antigene autoreaktiver T-Zellen oder Fragmente solcher Antigene, bevorzugt mit einer Länge von 8-25 Aminosäuren, stärker bevorzugt mit einer Länge von 8-15 Aminosäuren. Ebenfalls bevorzugt sind Liganden von MHC-Molekülen größerer Peptidfragmente, Proteindomänen, vollständige Proteine, Proteingemische, komplexe Proteingemische und/oder ZeI I lysate, bevorzugt Tumorzel I lysate.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gegenstandes kann die in einem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellte Zusammensetzung in
Schritt (a) eine wäßrige Zusammensetzung sein. Bevorzugt enthält die
Zusammensetzung zusätzlich zu den MHC-Molekülen einen Puffer. Beispielsweise können folgende Puffer eingesetzt werden: PBS Puffer (beispielsweise pH 5,0-8,5, bevorzugt pH 7,0-8,0, 50-200 mM NaCl, bevorzugt etwa 137,0 mM NaCI, 0,5-5 mM KCl, bevorzugt 2,7 mM KCl, bevorzugt 1 -10 mM Na2HPO4, bevorzugt 4,3 mM
Na2HPO4, 0,1 -5 mM KHPO4, bevorzugt 1 ,4 mM KHPO4), RSA-PBS Puffer
(beispielsweise pH 5,0-8,5, 1 -15 Gew.-% Rinder-Serum-Albumin (RSA), bevorzugt pH 5,0-8,0, 50-200 mM NaCl, bevorzugt etwa 137,0 mM NaCl, 0,5-5 mM KCl, bevorzugt 2,7 mM KCl, bevorzugt 1 -10 mM Na2HPO4, bevorzugt 4,3 mM Na2HPO4, 0,1 -5 mM KHPO4, bevorzugt 1,4 mM KHPO4), FKS-PBS Puffer (beispielsweise pH
5,0-8,5, 1 -15 Gew.-% Fötales Kälberserum (RSA), bevorzugt pH 5,0-8,0, 50-200 mM NaCI, bevorzugt etwa 137,0 mM NaCI, 0,5-5 mM KCl, bevorzugt 2,7 mM KCl, bevorzugt 1 -10 mM Na2HPO4, bevorzugt 4,3 mM Na2HPO4, 0,1 -5 mM KHPO4, bevorzugt 1 ,4 mM KHPO4), Phosphat-Puffer (beispielsweise pH 5,0-8,5, bevorzugt pH 7,0, 20-80 mM Na2HPO4, bevorzugt 57,7 mM Na2HPO4, 10-60 mM NaH2PO4, bevorzugt 42,3 mM NaH2PO4), TRIS-HCl Puffer (beispielsweise 0,5-3,0 M TRIS mit HCKkonz.), bevorzugt 1 -1 ,5 M TRIS mit HCI(konz.) auf pH 6,8-8,0 eingestellt), Tris- Phosphat-Puffer (beispielsweise 20-80 mM Na2HPO4, 10-60 mM NaH2PO4, 0,5-3,0 M TRIS mit HCI(konz.) auf pH 6,0-8,5 eingestellt), oder weiteren geeigneten Puffer. Die genannten Konzentrationen sind bevorzugt die Konzentrationen in den Pufferlösungen vor deren Zugabe zur Zusammensetzung. Zur Zusammensetzung werden typischerweise 0 bis 15,0 Vol.-% zugegeben. Die im erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellte Zusammensetzung kann ebenfalls organische Lösungsmittel enthalten. Organische Lösungsmittel werden bevorzugt aus folgender Gruppe ausgewählt: DMSO, Ethanol, Methanol, Aceton und ähnliche, besonders bevorzugt 0,1 -1 % DMSO. Der pH der Zusammensetzung beträgt typischerweise 6,0-8,5, bevorzugt 6,5-7,5. Optional kann die Zusammensetzung zusätzlich zu der wäßrigen Lösung oder dem organischen Lösungsmittel ein polares Lösungsmittel enthalten, beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), TFE (Tetrafluorethylen), Hexamethylphosphorsäuretrisamid (HMPT), Hexamethyl- phosphoramid (HMPA), oder ähnliche. Die Endkonzentration des polaren Lösungsmittels in der Zusammensetzung kann bevorzugt 0,05-15 Gew.-%, stärker bevorzugt 0,1 -5 Gew.-%, und noch stärker bevorzugt 0,5-2 Gew.-% betragen. Ebenfalls bevorzugt wird die Beladung in DMEM oder RPMI-Puffern durchgeführt.
Typischerweise wird in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur bereitgestellten Zusammensetzung aus Schritt (a) ein Katalysator zugegeben, ausgewählt aus einer der Verbindungen I, II, III oder IVI bis IV3 in einer Konzentration von 0,001 -500 mM, bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 -250 mM, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 -100 mM. Typischerweise beträgt das molare Verhältnis MHC-Molekül zu Ligand 0,1 : 10 bis 10 : 0,1. Bevorzugt beträgt das molare Verhältnis von Ligand zu MHC-Molekül 0,5 : 5 bis 5 : 0,5, besonders bevorzugt 0,75 : 2,5 bis 2,5 : 0,75. In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Beladung der MHC- Moleküle mit Liganden oder der Ligandenaustausch der MHC-Moleküle bevorzugt bei einer Temperatur von 20-400C, noch stärker bevorzugt bei einer Temperatur von 24-39°C und am stärksten bevorzugt bei einer Temperatur von 36-38°C.
Bei der Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden in Schritt (c) nach einem erfindungsgemäßen Verfahren wird bevorzugt die Menge der durch das erfindungsgemäße Verfahren auf ein MHC-Molekül geladenen oder ausgetauschten Liganden gesteuert. Beispielsweise kann durch das erfindungsgemäße Verfahren, bevorzugt in vitro, ein Beladungszustand erzielt werden, der zu einer gleichen Beladung, zu einer Erhöhung oder alternativ zu einer Erniedrigung der Beladung von MHC-Molekülen mit Liganden im Vergleich zu der Beladung von MHC-Molekülen unter in vivo Bedingungen führt, bzw. im Vergleich zu der Beladung der vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Zusammensetzung enthaltenen MHC-Moleküle. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden zu einer Neubeladung vorher nicht beladener MHC-Moleküle, zu einer teilweisen oder vollständigen Entfernung bereits vorhandener Liganden, oder zum Austausch bereits vorhandener Liganden gegen andere, gewünschte Liganden führen. Verfahren zur Bestimmung von Beladungszuständen unter in vivo und in vitro Bedingungen sind einem Fachmann bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (c) eine Änderung des Beladungszustandes von (nicht-beladenen) MHC- Molekülen mit Liganden durch Zugabe von potentiellen Liganden, insbesondere Peptiden, z.B. Peptidliganden, zu der Zusammensetzung, enthaltend MHC-Moleküle gemäß Verfahrensschritt (a), und Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 (Katalysator) gemäß Verfahrensschritt (b), erreicht. Die Konzentrationen von MHC-Molekülen, Liganden und Katalysatoren sind dabei bevorzugt wie oben beschrieben. Die Verfahrensschritte (a), (b) und (c) des hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens zur Änderung des Beladungszustandes von MHC- Molekülen mit Liganden können in beliebiger Reihenfolge oder parallel erfolgen. Beispielsweise können die Schritte (b) und (c) parallel stattfinden. Auch können anstelle der Bereitstellung der Zusammensetzung, enthaltend MHC-Moleküle, zunächst die Verbindungen der Formeln 1, IA, 11, 111 oder 1V1 bis 1V3, vorzugsweise in Lösung, in einem Verfahrensschritt vorgelegt werden und dann die jeweils anderen Verfahrensschritte durchgeführt werden, wie bspw. Zugabe von Liganden und/oder MHC-Molekülen. Ebenfalls können alle Schritte (a), (b) und (c) gleichzeitig durchgeführt werden.
In einer anderen alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in einem Schritt (c') eine Änderung des Beladungszustandes von bereits mit Liganden beladenen MHC-Molekülen durch einen teilweisen oder vollständigen Austausch bereits auf dem MHC-Molekül vorhandener Liganden gegen andere gewünschte Liganden erreicht. Dazu wird bevorzugt in einem ersten Schritt (i) eine Verringerung der Beladungsdichte von Liganden der MHC-Moleküle bis zu einem gewünschten Beladungszustand hin (bevorzugt analog zu dem weiter unten genauer beschriebenen alternativen Verfahrensschritt (c")) erreicht. Typischerweise werden dafür die bereits auf dem MHC-Molekül gebundenen Liganden unter Verwendung der Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3 (Katalysatoren) teilweise oder gegebenenfalls vollständig durch einen Waschschritt entfernt. Die MHC- Moleküle können dabei an einer Festphase, z.B. Sepharose, Beads, Microbeads, etc. oder über im Stand der Technik erhältliche Linker, z.B. tags wie einen His-Tag, immobilisiert werden. In den Waschschritten kann jeder geeignete, zuvor beschriebene Puffer verwendet werden. Danach wird in einem zweiten Schritt (ii) typischerweise der gewünschte Ligand und gegebenenfalls eine weitere Menge der Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3 (Katalysatoren) zu der Zusammensetzung zugegeben und zusammen mit dem MHC-Molekül inkubiert. Alternativ kann parallel zu Schritt 1 des Verfahrensschrittes (c') bereits der gewünschte neue Ligand zur Zusammensetzung hinzugegeben werden. Dabei bindet der neue Ligand, bevorzugt durch eine Verschiebung des Konzentrationsgleichgewichtes, an das MHC-Molekül, d.h. der neue Ligand liegt bevorzugt in einer solche Konzentration vor, dass eine Verdrängung des vorher gebundenen Liganden durch den neuen Liganden unter Verwendung der Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3 (Katalysatoren) stattfindet. Die Verfahrensschritte (a) und (b) und der hier beschriebene alternative Schritt (c') des erfindungsgemäßen Verfahrens können daher in beliebiger Reihenfolge oder parallel erfolgen. Beispielsweise können die Schritte (a), (b) und (c') parallel stattfinden. Auch kann anstelle der Bereitstellung der Zusammensetzung, enthaltend MHC-Moleküle, zunächst der Katalysator, vorzugsweise in Lösung, in einem Verfahrensschritt (a) vorgelegt werden und dann Schritt (b) durchgeführt werden. Schritt (c') wird typischerweise nach den Schritten (a) und (b) durchgeführt, kann jedoch auch alternativ parallel mit den Schritten (a) und (b) durchgeführt werden.
In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens führt in einem anderen alternativen Schritt (c") eine Änderung des Beladungszustandes von bereits mit Liganden beladenen MHC-Molekülen zu einer Verringerung der Beladungsdichte von Liganden der MHC-Moleküle. Dazu werden typischerweise die bereits auf dem MHC-Molekül gebundenen Liganden unter Verwendung der Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IVl bis IV3 (Katalysatoren) teilweise oder gegebenenfalls vollständig entfernt. Bevorzugt wird dazu nach Bereitstellung der Zusammensetzung, enthaltend MHC-Moleküle gemäß Verfahrensschritt (a), und Zugabe der erfindungsgemäßen Katalysatoren gemäß Verfahrensschritt (b), ein Waschschritt durchgeführt, der die mit Hilfe der Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3 vom MHC-Molekül gelösten Liganden von den MHC-Molekülen abtrennt. Die MHC-Moleküle können dazu an einer Festphase, z.B. Sepharose, Beads, Microbeads, z.B. über im Stand der Technik erhältliche Linker, z.B. tags wie einen His-Tag, etc., immobilisiert werden. In den Waschschritten kann jeder geeignete, zuvor beschriebene Puffer verwendet werden. Die Verfahrensschritte (a), (b) und (c") der hier beschriebenen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können in beliebiger Reihenfolge oder parallel erfolgen. Beispielsweise können die Schritte (b) und (c") parallel stattfinden. Auch kann anstelle der Bereitstellung der Zusammensetzung, enthaltend MHC-Moleküle, zunächst der Katalysator, vorzugsweise in Lösung, in einem Verfahrensschritt vorgelegt werden und dann die jeweils anderen Schritte (b) und (c") durchgeführt werden, wie bspw. Zugabe von Liganden und/oder MHC-Molekülen. Ebenfalls können alle Schritte (a), (b) und (c") gleichzeitig durchgeführt werden.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden in einem der Schritte (c), (c') oder (c") typischerweise auf einem MHC-Molekül der Klassen I oder II, an einer Peptidbindungsregion des MHC-Moleküls vorgenommen. Bei der Peptidbindungsregion handelt es sich vorzugsweise um eine Peptidbindungsregion eines MHC Klasse I- oder MHC-Klasse II-Moleküls. Typischerweise wird die Peptidbindungsregion eines MHC I-Moleküls durch die α-Kette des MHC Klasse I- Moleküls gebildet und besteht aus einem aus acht Strängen gebildeten ß-Faltblatt, auf dem die Peptide zwischen zwei α-Helices eingeklemmt und an den beiden Enden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den N- bzw. C-Termini und dem MHC Klasse 1-Molekül fixiert werden. Die Peptidbindungsregion des MHC Klasse I-Moleküls enthält üblicherweise mehrere Bindungstaschen. Die Spezifität eines Liganden an die Peptidbindungsregion eines MHC Klasse I-Moleküls wird typischerweise durch eine Bindung der Aminosäureseitenketten mit jeweils einer dieser Bindungstaschen hergestellt. Im Fall des MHC I-Moleküls wird die Bindungstasche bevorzugt ausgewählt aus den Bindungstaschen A, B, C, D, E und F, die vorzugsweise die Seitenketten der Liganden aufnehmen. Die Peptidbindungsregion eines MHC II-Moleküls wird typischerweise durch die Oc 1 und ß^Domänen der die MHC II-Moleküle bildenden α- und ß-Kette gebildet. Die Peptidbindungsregion des MHC II-Moleküls enthält ebenfalls üblicherweise eine bis mehrere Bindungstaschen. Im Fall des MHC II-Moleküls wird die Bindungstasche bevorzugt ausgewählt aus den Bindungstaschen P1 , P3, P4, P6, ?7 und P9, die vorzugsweise die Seitenketten der Liganden aufnehmen. Ebenfalls bevorzugt wird die Spezifität des Liganden an die Peptidbindungsregion, oder vorzugsweise an eine Peptidbindungstasche durch eine Bindung der Aminosäureseitenketten mit der beschriebenen Bindungstasche hergestellt. Üblicherweise wird die Bindung des Liganden insbesondere durch eine Bindung an die Bindungstasche P1 eines MHC- Moleküls der Klasse II hergestellt, welche sich bei HLA-DR Molekülen im wesentlichen nur durch die Besetzung des dimorphen Restes ß86 unterscheidet. Die Bindung der Liganden bzw. die Stabilität der Komplexe kann darüber hinaus auch durch weitere Regionen beeinflusst werden, welche außerhalb der eigentlichen Peptidbindungsregion liegen. So ist beispielsweise die pH-abhängige Destabilisierung maßgeblich von einer Region beeinflusst, welche unterhalb der Bindungsgrube liegt. An dieser Stelle ist ein Histidinrest lokalisiert (His33), welcher die αrDomäne mit der ß^Domäne verbrückt und direkt durch Protonen und möglicherweise auch anderen H-Donoren beeinflusst wird (Rötzschke et al. PNAS, 2002, 99: 16946-16950)
In einem Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Isolierung der mit Liganden beladenen MHC-Moleküle beispielsweise über ein biochemisches oder biophysikalische Isolierungsverfahren oder über ein Verfahren zur Isolierung von Zellen, wie zuvor beschrieben.
Biophysikalische und biochemische Nachweisverfahren oder Isolierungsverfahren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt spektroskopische Verfahren, Sequenzierungsreaktionen, immunologische Verfahren, oder chromatographische Verfahren. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden spektroskopische Verfahren bevorzugt ausgewählt aus einem NMR-, Lichtstreuungs-, Raman-, UV-, VIS-, IR-, Circulardichroismus-Verfahren, einer massenspektrometrischen Analyse (MS) oder einer Röntgenstrukturanalyse. Unter einer Sequenzierungereaktion werden bevorzugt Peptid- oder Nukleinsäuresequenzierungen verstanden. Immunologische Verfahren werden bevorzugt ausgewählt aus ELISA-Verfahren, Antikörperbindungsassays, Immunfluoreszenzdetektionsverfahren oder Western Blots. Chromatographische Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt eine Adsorptionschromatographie, eine Verteilungschromatographie, eine lonenaustauschchromatographie, eine Ausschlußchromatographie oder eine Affinitätschromatographie. Bevorzugt wird im weiteren eine Chromatographie mittels Ni-NTA-Agarose, eine HPLC, eine FPLC, oder eine Reversed-Phase (RP- Umkehrphasen)-Chromatographie durchgeführt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Substanzen, die den Beladungszustand von MHC-Molekülen verändern können. Ein derartiges Verfahren kann sowohl unter Verwendung eines beladenen als auch eines unbeladenen MHC-Moleküls durchgeführt werden und kann bspw. auf einer kinetischen Messung der Liganden-Dissoziation und/oder der Ligandenbindung oder auf der Detektion der ihnen zugrundeliegenden konformationellen Änderungen beruhen. Experimentell zu beobachtende Effekte von ggf. den Beladungszustand verändernden Substanzen bestehen in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung derselben dann bspw. in einer beschleunigten Dissoziation von an MHC gebundenen Liganden und/oder in einer beschleunigten Bindung von zu unbeladenen MHC-Molekülen zugegebenen Liganden, insbesondere Peptiden. Aber auch spektroskopische oder thermodynamische Meßmethoden, insbesondere in Verbindung mit konformationsspezifischen Antikörpern, können zur Bestimmung der Wirkungen von Testsubstanzen und damit zur Identifizierung derselben eingesetzt werden.
Falls das erfindungsgemäße Verfahren auf der Basis eines beladenen MHC-Moleküls durchgeführt werden soll (Ausführungsform 1), ergibt sich allgemein ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung von die MHC-Beladung, insbesondere MHCII-Beladung, verändernden Substanzen aus einem
Verfahrensschritt (a) Vorgabe von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen, bspw. in Lösung oder auf einer Oberfläche, bspw. einer Metall-, insbesondere Goldoberfläche, (b) Zugabe einer zu testenden Substanz und (c) Messung der
Dissoziation der ursprünglich auf den MHC-Molekülen befindlichen Liganden. Die Messung kann bspw., wie oben erwähnt, durch kinetische Messung erfolgen, oder aber auch durch Konzentrationsmessung der dissoziierten und/oder der auf den MHC-Molekülen verbliebenen Liganden. Die Konzentrationsmessung kann durch entsprechende spektroskopische Methoden erfolgen (bspw. Oberflächenplasmonresonanz, die den Unterschied zwischen beladenem oder unbeladenem MHC-Molekül detektieren kann) oder durch bspw. spektroskopisch detektierbare Änderungen zwischen dem beladenen oder unbeladenen MHC- Molekülen (z.B. veränderte Fluoreszenz- oder Absorptionseigeigenschaften des gebundenen bzw. nicht gebundenen Liganden im Komplex bzw. des Komplexes). Auch mikrokalorimetrische oder andere dem Fachmann geläufige Methoden können eingesetzt werden, um die durch Zugabe der Testsubstanzen in Verfahrensschritt (b) hervorgerufenen Veränderungen im Vergleich zum Ausgangszustand zu detektieren.
Im Falle einer Verfahrensführung zur Bestimmung geeigneter Substanzen ohne Beladung (Ausführungsform 2) stellt es sich, wie folgt, dar: in einem ersten
Verfahrensschritt (a) werden unbeladene MHC-Moleküle in bspw. Lösung oder auf einer Oberfläche, bspw. einer Metall-, insbesondere Goldoberfläche vorgegeben, in einem Verfahrensschritt (b1) wird eine zu testenden Substanz zugegeben, in einem
Verfahrensschritt (b2) ein Ligand des MHC-Moleküls. Die Verfahrensschritte (b1) bzw. (b2) können auch gleichzeitig erfolgen, d.h. in einem solchen Fall wird ein
Gemisch aus Ligand und Testsubstanz hinzugegeben. In einem abschließenden
Verfahrensschritt (c) wird nach den bereits oben genannten Methoden, bspw. durch kinetische Messungen, die Beladung der MHC-Moleküle mit dem Liganden gemessen, wobei die Auswertung vorzugsweise durch Vergleich der experimentellen Ergebnisse ohne Zugabe der Testsubstanz erfolgt. Hierdurch können dann wiederum geeignete Testsubstanzen spezifiziert werden.
In einer Variante der beiden vorgenannten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Substanzen, mit der Eigenschaft, den Beladungszustand von MHC-Molekülen zu verändern, können zwei oder mehr unterschiedliche Testsubstanzen, typischerweise in einem Gemisch, zu einem Versuchsansatz hinzugegeben werden. Dies erlaubt einen höheren Durchsatz an Testsubstanzen. In einem nachgelagerten Verfahrensschritt muß/müssen dann in einem positiven Versuchsansatz die eine oder mehr in ihrer/ihren Wirkung(en) positive(n) Testsubstanz(en) identifiziert werden. In einer anderen Variante können erfindungsgemäße Verfahren im Wege eines Kompetitionsassays durchgeführt werden. Hierzu wird bspw. die Ausführungsform 1 so modifiziert, daß in deren Verfahrensschritt (b) nicht nur die Testsubstanz hinzugegeben wird, sondern vielmehr vor, gleichzeitig mit oder nach der Zugabe der Testsubstanz ein zweiter Ligand für das MHC-Molekül zum Versuchsansatz hinzugegeben wird. Dann wird typischerweise durch die zuvor beschriebenen Methoden bspw. die Konzentration des zweiten Liganden auf den MHC-Molekülen oder die Kinetik der Bindung des zweiten Liganden an das MHC-Molekül bestimmt. Die Wirkung der Testsubstanz ergibt sich also wiederum aus dem Vergleich der Versuche ohne Zugabe und nach Zugabe der Testsubstanz.
Einen weiteren Gegenstand gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Verwendung der Verbindungen der Formeln I, IA, II, IH oder IV1 bis IV3 alleine oder optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, z.B. Peptiden, zur Herstellung von Vakzinen. In einer alternativen Ausführungsform können Verbindungen der Formeln 1, IA, II, Ul oder 1V1 bis IV3 zusammen mit Liganden, z.B. Peptiden, Proteinen oder antigenhaltigen Zellextrakten, als Peptidvakzin zur Herstellung von Vakzinen, insbesondere Peptidvakzinen, verwendet werden. In einer anderen alternativen Ausführungsform können MHC- Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde, zur Herstellung von Vakzinen verwendet werden.
Vakzine bilden ebenfalls einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung. In einer Ausführungsform umfassen die Vakzine der vorliegenden Erfindung typischerweise Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3 (Katalysatoren) alleine oder optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, z.B. Peptiden, vor allem antigenen Peptiden, insbesondere Peptiden von Tumorenantigenen oder von Oberfiächenproteinen von Pathogenen, bspw. Peptide viraler oder bakterieller Oberflächenproteine. Die Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3 können damit als Adjuvanten in eine erfindungsgemäße Vakzine eingearbeitet sein. Die Adjuvantieneigenschaften der vorgenannten Verbindungen beruhen auf der Fähigkeit der erfindungsgemäßen vorgenannten Verbindungen, den Beladungszustand der patienteneigenen MHC-Moleküle zu ändern und damit die Wirkung der zur Vakzinierung eingesetzten Liganden zu erhöhen. Insoweit also erfüllen die vorgenannten Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IVl bis IV3 die typischen Adjuvanseigenschaften, die darin bestehen, die durch die Liganden hervorgerufene Immunantwort, bspw. gegen Tumore oder gegen Pathogene weiter zu verstärken, indem vorliegend die einschlägige Beladung mit Liganden einer erfindungsgemäßen Vakzine auf den MHC-exprimierenden Immunzellen des vakzinierten Patienten erhöht wird. Auch können ggf. in eine erfindungsgemäße Vakzine weitere Substanzen als Adjuvantien eingearbeitet sein, vorteilhafterweise wird/werden ein oder mehr weitere Adjuvantien in Abhängigkeit von der Immunogenität und anderen Eigenschaften des antigenischen Liganden in der erfindungsgemäßen Vakzine zu wählen sein. Insbesondere im Falle schwacher Immunogenität kann komplettes Freund's Adjuvans eingesetzt werden. Anstelle oder in Kombination mit Freund's Adjuvans können (neben den Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IVl bis IV3) Adjuvantien ausgewählt sein aus z.B. TDM, MDP, Muramyldipeptid, Alum-Lösung, CpG-OI igonukleotide oder Pluronics. Schließlich kann der antigenische Ligand auch bspw. chemisch an KLH („Keyhole Limpet Haemocyanin") gekoppelt sein, einem sehr immunogenen Fremdprotein, oder auch KLH, ohne chemische Kopplung an den Liganden, in einer erfindungsgemäßen Vakzine enthalten sein. Weiterhin können in der Vakzine auch als Ajuvantien Cytokine enthalten sein, insbesondere Interferone, bspw. IFN-gamma, oder auch GM-CSF, M-CSF oder G-CSF.
Solche Vakzine sind insbesondere bei den unten genannten Indikationen anwendbar, vor allem bei Antikrebs- oder Antiinfektionstherapien, und können einem Patienten in vitro oder in vivo verabreicht werden. Z.B. kann ein solches erfindungsgemäßes Vakzin direkt einem Patienten intravenös oder subkutan verabreicht werden. Die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden findet bevorzugt in vivo statt, d.h. die Beladung mit Liganden, der Austausch von Liganden oder die Verringerung von Liganden auf MHC-Molekülen findet, durch Verabreichung des Vakzins, typischerweise im Patienten statt. Solche erfindungsgemäßen Vakzine können ebenfalls mittels eines Dialyseverfahrens verabreicht werden. Die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen findet dabei ebenfalls bevorzugt in vivo statt. Alternativ zur in vivo Beladung können dem Patienten Zellen, Körperflüssigkeiten, etc., z.B. aus der Lymphe, entnommen werden und in vitro mit einem erfindungsgemäßen Vakzin versetzt werden. Die Änderung des Beladungszustandes der mit diesen Zellen, Körperflüssigkeiten, etc. assozierten MHC-Moleküle findet dabei ebenfalls bevorzugt in vitro statt. Nach Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle in vitro können die Zellen, z.B. mittels eines Dialyse-Verfahrens oder durch intravenöse oder subkutane Injektion, in den Patienten rückgeführt werden.
In einer alternativen Ausführungsform können Vakzine mit Liganden beladene oder unbeladene MHC-Moleküle, deren Beladungszustand vorzugsweise nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden und/oder mit einer der Verbindungen der Formeln 1, IA, 11, Hl oder IVl bis IV3 enthalten. In einer besonderen Ausführungsform dieser Alternative können Vakzine Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis 1V3 enthalten, sowie zusätzlich mit Liganden beladene oder unbeladene MHC-Moleküle, deren Beladungszustand vorzugsweise nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieser Alternative können Vakzine Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IVl bis IV3, Liganden und zusätzlich mit Liganden beladene oder unbeladene MHC-Moleküle enthalten, deren Beladungszustand nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde. Vorzugsweise werden für die erfindungsgemäßen Vakzine solche MHC- Moleküle eingesetzt, deren Beladungszustand nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde. Dies sind z.B. solche MHC-Moleküle, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Peptiden beladen wurden, vor allem mit antigenen Peptiden, insbesondere Peptiden eines Tumorenantigens, oder Peptiden die unter physiologischen Bedingungen eine Immunantwort auslösen. Die Anwesenheit von Liganden und/oder Katalysatoren zusammen mit den im Vakzin bereits enthaltenen MHC-Molekülen ermöglicht dabei eine Kontrolle der Beladungsdichte der MHC-Moleküle im Vakzin durch eine entsprechende Einstellung des Gleichgewichts in der Lösung. Dies ist insbesondere von Interesse, wenn Vakzine nicht unmittelbar nach Herstellung eingesetzt sondern zunächst gelagert werden. Weiterhin kann durch ein solches Vakzin in vivo und/oder in vitro gegebenfalls eine verstärkte Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit bestimmten (z.B. gewünschten) Liganden erreicht werden.
Vakzine werden typischerweise in flüssiger oder fester Form formuliert. Bei flüssigen Vakzinen liegt die Konzentrationen der enthaltenen Katalysatoren typischerweise in einem wie oben beschrieben Bereich., d.h. in einer Konzentration von 0,001 -500 mM, bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 -250 mM, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001-100 mM. Die in den erfindungsgemäßen Vakzinen verwendeten Liganden sind typischerweise die zuvor in dieser Beschreibung definierten Liganden. Das in den Vakzinen enthaltenen MHC- Molekül wird typischerweise unbeladen eingesetzt oder vor dem Einsatz mit einem wie oben definierten Liganden beladen, noch stärker bevorzugt mit Peptidantigenen oder mit Fragmenten solcher Antigene, bevorzugt mit einer Länge von 8-25 Aminosäuren, stärker bevorzugt mit einer Länge von 8-15 Aminosäuren. Ebenfalls bevorzugt im Sinne des erfindungsgemäßen Gegenstandes kann das zur Herstellung eines Vakzins verwendete MHC-Molekül ein wie oben beschriebenes MHC Monomer oder ein MHC Multimer sein. Besonders bevorzugt ist das MHC Monomer oder MHC Multimer ein wie oben beschriebenes MHC Monomer oder MHC Multimer, bzw. ein MHC-Tetramer oder Pentamer, aus den MHC-Klassen I oder II. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Komponenten eines Vakzins, z.B. durch die erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle, oder erfindungsgemäße Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder 1V1 bis IV3 zusammen mit einem oder mehreren Liganden wie in der vorliegenden Erfindung definiert, können die Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten. Die Wahl eines pharmazeutisch geeigneten Trägers wird grundsätzlich durch die Art bestimmt, durch die die erfindungsgemäßen Vakzine verabreicht werden. Die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vakzine können systemisch verabreicht werden. Routen zur Verabreichung schließen transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen mit ein.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vakzine für therapeutische Zwecke. Dazu können in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zuvor einem Patienten, wie bereits oben beschrieben, Zellen oder Gewebe, bevorzugt dendritische Zellen, besonders bevorzugt maturierte und nicht-maturierte dendritische Zellen, einzeln oder in Ansammlungen von mehreren Zellen entnommen und isoliert werden. Die dabei verwendeten Isolierungsverfahren wurden zuvor beschrieben. Die MHC-Moleküle, die nach einem solchen Verfahren zusammen mit den körpereigenen Zellen eines Patienten gewonnen werden, können anschließend bevorzugt nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladen werden oder die bereits vorhandenen Liganden des MHC-Moleküls können gegen gewünschte Liganden ausgetauscht oder die Anzahl der vorhandenen Liganden verringert werden. Bevorzugt sind solche gewünschten Liganden Antigene, noch stärker bevorzugt Peptidantigene, Proteinantigene oder Tumorantigene, insbesondere aus Tumorzellysaten. In einem weiteren Schritt werden bevorzugt die so beladenen MHC-Moleküle zusammen mit den dendritischen Zellen dem Patienten in einem anschließenden Vakzinierungsverfahren wieder zugeführt z.B. via Reinjektion oder Dialyse. Die so nach einem erfindungsgemäßen Verfahren beladenen dendritischen Zellen oder MHC-Moleküle lösen dann bevorzugt im Patienten tumor-spezifische Immunantworten aus, welche zur Abstoßung und Zerstörung des transformierten Gewebes führen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Gegenstandes können die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln 1, IA, 11, Hl oder IV1 bis IV3 zusammen mit einem oder mehreren Liganden oder die MHC- Moleküle, deren Beladungszustand nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, einem Patienten, bevorzugt in Form eines Vakzins verabreicht werden.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden die erfindungsgemäßen Vakzine zur Behandlung von im folgenden genannten beispielhaften Indikationen eingesetzt. Mit Vakzinen gemäß der vorliegenden Erfindung können beispielsweise solche Erkrankungen oder Zustände behandelt werden, die mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind. Bevorzugt werden solche erfindungsgemäßen Vakzine eingesetzt, um tumorspezifische oder pathogenspezifische Immunantworten auszulösen. Gemäß einer anderen Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Gegenstandes können solche Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung, die beispielsweise erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IVl bis 1V3 optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden enthalten, oder wahlweise die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle, bevorzugt mit Liganden beladene MHC-Multimere, besonders bevorzugt mit Liganden beladene MHC-Multimere der Klasse II, bei denen der Beladungszustand erniedrigt wurde oder bei denen die Liganden entfernt oder ausgetauscht wurden, zur Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen eingesetzt werden. In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform werden zur Auslösung, zur Abschwächung oder zur Unterdrückung von Immunantworten antigenpräsentierende Zellen (APC) mit Liganden beladen. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform werden die antigenpräsentierenden Zellen ausgewählt z.B. aus körpereigenen oder nicht-körpereigenen maturierten und nicht-maturierten dendritischen Zellen, IDO + DC-Zellen, B-Zellen oder Makrophagen. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle zur Behandlung von Krebs, bevorzugt ausgewählt aus Kolonkarzinomen, Melanomen, Nierenkarzinomen, Lymphomen Akute myeloide Leukämie (AML), Akute Lymphoide Leukämie (ALL), chronische myeloide Leukämie (CML), chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Gastrointestinale Tumoren, Lungenkarzinome, Gliome, Schilddrüsentumoren, Mammakarzinome, Prostatatumore, Hepatome, diverse virus¬ induzierte Tumoren wie z.B. Papillomvirus-induzierte Karzinome (z.B. Cervixkarzinom), Adenokarzinome, Herpesviren-induzierte Tumore (z.B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertes B Zelllymphom), Hepatitis B-induzuierte Tumore (Hepatozellkarzinome), HTLV-I und HTLV-2 induzierte Lymphome, Akustikusneurinom, Gebärmuttehalskrebs, Lungenkrebs, Rachenkrebs, Analkarzinom, Glioblastom, Lymphome, Rektumkarzinom, Astrozytom, Hirntumore, Magenkrebs, Retinoblastom, Basaliom, Hirnmetastasen, Medulloblastome, Scheidenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hodenkrebs, Melanom,
Schilddrüsenkarzinom, Blasenkrebs, Hodgkin-Syndrom, Meningeome, Schneeberger Krankheit, Bronchialkarzinom, Hypophysentumor, Mycosis fungoides, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs, Karzinoide, Neurinom, Spinal iom, Burkitt-Lymphom, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymom, Corpuskarzinom, Knochenkrebs, Non- Hodgkin-Lymphome, Urethrakrebs, CUP-Sysndrom, Kopf-Hals-Tumore, Oligodendrogliom, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinom, Ösphaguskarzinom, Warzenbeteiligung, Dünndarmtumore, Kraniopharyngeome, Ovarial-Karzinom, Weichteiltumore, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Pankreaskarzinom, Zervixkarzinom, Endometriumkarzinom, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytom, Gebärmutterkrebs, Lidtumor, Prostatakrebs, etc., oder zur Behandlung von Infektionskrankheiten, ausgewählt aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten wie AIDS, Condyloma acuminata, Deliwarze, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Erkältung, Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes- Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanische Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-infektion, Pfeifersches-Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West- Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus (CMV), bakteriellen Infektionskrankheiten wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis (Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischer Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, lungenentzündung, Meningitis, Bakterielle Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weicher Schanker und durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufene Inkektionskrankheiten wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas- Krankheit, Echinococcus, Fischbandwurm, Fischvergiftung (Ciguatera), Fuchsbandwurm, Fußpilz, Hundebandwurm, Kandiose, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Kutane Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), Läuse, Malaria, Mikroskopie, Onchozerkose (Flussblindheit), Pilzerkrankungen, Rinderbandwurm, Schistosomiasis, Schlafkrankheit, Schweinebandwurm, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszerale Leishmaniose, Windeldermatitis, Zwergbandwurm, zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen, insbesondere Autoimmun-Typ-I- Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-Il-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-III- Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-IV-Erkrankungen, ausgewählt werden, wie Multiple Sklerose (MS), Rheumatoide Arthritis, Diabetes, Diabetes Typ I, Systemische Lupus Erythematosus (SLE), Chronische Polyarthritis, Basedowsche Krankheit, Autoimmune Formen der chronischen Hepatitis, Colitis Ulcerosa, Allergie Typ I- Erkrankungen, Allergie Typ Il-Erkrankungen, Allergie Typ III-Erkrankungen, Allergie Typ IV-Erkrankungen, Fibromyalgie, Haarausfall, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Myasthenia gravis, Neurodermitis, Polymyalgia rheumatica, Progressive Systemische Sklerose (PSS), Psiorasis, Reiter-Syndrom, Rheumatische Arthritis, Schuppenflechte, Vaskulitis, etc. eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen, herstellbar nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der oben genannten Indikationen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen bilden einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise eine sichere und effektive Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3, bevorzugt wie oben definiert, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, z.B. Peptiden, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger sowie weitere Hilfs- und Zusatzstoffe. Alternativ umfassen pharmazeutischen Zusammensetzungen bevorzugt eine sichere und effektive Menge der MHC-Moleküle, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger sowie weitere Hilfs- und Zusatzstoffe. Wie hier verwendet bedeutet "sichere und effektive Menge" eine solche Menge einer Verbindung, die ausreichend ist, um signifikant eine positive Modifikation des zu behandelnden Zustands zu induzieren, jedoch gering genug, um schwerwiegende Nebeneffekte zu vermeiden (mit einem vernünftigen Verhältnis von Vorteil/Risiko), innerhalb des Bereichs vernünftiger medizinischer Urteilskraft. Eine sichere und effektive Menge einer Verbindung wird im Zusammenhang mit dem besonderen zu behandelnden Zustand variieren, sowie dem Alter und dem physischen Zustand des zu behandelnden Patienten, der Schwere des Zustandes, der Dauer der Behandlung, der Natur der begleitenden Therapie, des verwendeten besonderen pharmazeutisch geeigneten Trägers und ähnlichen Faktoren innerhalb des Wissens und der Erfahrung des begleitenden Arztes. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen können weiterhin für humane und wie auch für veterinärmedizinische Zwecke eingesetzt werden.
Zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ zusätzlich zu den MHC-Molekülen, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten. Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch geeigneter Träger" umfasst bevorzugt einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, bzw. Verdünnungsmittel oder einkapselnde Verbindungen, welche für die Verabreichung an eine Person geeignet sind. Der Begriff "kompatibel", wie hier verwendet, bedeutet, dass die Bestandteile der Zusammensetzung in der Lage sind, mit der Verbindung und miteinander in einer solchen Art zusammengemischt zu werden, dass keine Interaktion auftritt, welche wesentlich die pharmazeutische Effektivität der Zusammensetzung unter gewöhnlichen Verwendungsbedingungen reduzieren würde. Pharmazeutisch geeignete Träger müssen selbstverständlich eine ausreichend hohe Reinheit und eine ausreichend geringe Toxizität aufweisen, um sie für die Verabreichung an eine zu behandelnde Person geeignet zu machen.
Einige Beispiele von Verbindungen, welche als pharmazeutisch geeignete Träger oder Bestandteile davon dienen können, sind Zucker, wie beispielsweise Lactose,
Glucose und Sukrose; Stärken wie beispielsweise Kornstärke oder Kartoffelstärke;
Cellulose und seine Derivate, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose,
Ethylcellulose, Celluloseacetat; pulverisiertes Tragacanth; Malz; Gelatine; Talg; feste
Gleitmittel, wie beispielsweise Stearinsäure, Magnesiumstearat; Kalziumsulfat; vegetabile Öle, wie beispielsweise Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl,
Kornöl und Öl aus Theobroma; Polyole, wie beispielsweise Polypropylenglycol, Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; Algininsäure; Emulatoren, wie beispielsweise die Tweene®; Benetzungsmittel, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat; färbende Agenzien; geschmacksvermittelnde Agenzien, Arzneistoffträger; tablettenbildende Agenzien; Stabilisatoren; Antioxidantien; Konservierungsmittel; pyrogen-freies Wasser; isotonische Salzlösung und phosphatgepufferte Lösungen.
Die Wahl eines pharmazeutisch geeigneten Trägers, der zusammen mit erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IVl bis IV3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ zusätzlich zusammen mit MHC-Molekülen, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, verwendet werden soll, wird grundsätzlich durch die Art bestimmt, durch die die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen M H C-Mo I ekü Ie verabreicht werden. Die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle können systemisch verabreicht werden. Routen zur Verabreichung schließen transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen mit ein.
Die geeignete Menge der zu verwendenden erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis 1V3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ der MHC-Moleküle, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, kann durch Routineexperimente mit Tiermodellen bestimmt werden. Solche Modelle schließen, ohne jedoch darauf begrenzt zu sein, Modelle von Kaninchen, Schaf, Maus, Ratte, Hund und nichthumane Primatenmodelle mit ein.
Bevorzugte Einheitsdosisformen zur Injektion schließen sterile Lösungen von Wasser, physiologischer Salzlösung oder Mischungen davon mit ein. Der pH solcher Lösungen sollte auf etwa 7,4 eingestellt werden. Geeignete Träger zur Injektion oder zur chirurgischen Implantation schließen Hydrogele, Vorrichtungen zur kontrollierten oder verzögerten Freigabe, polylaktische Säure und Collagenmatrizen mit ein.
Geeignete pharmazeutisch-geeignete Träger zur topischen Anwendung schließen solche mit ein, die zur Verwendung in Lotionen, Cremes, Gels u.a. geeignet sind.
Falls die Verbindung peroral verabreicht werden soll, sind Tabletten, Kapseln u.a. die bevorzugte Einheitsdosisform. Die pharmazeutische geeigneten Träger zur
Herstellung von Einheitsdosisformen, die für die orale Verabreichung verwendbar sind, sind im Stand der Technik gut bekannt. Ihre Auswahl wird von sekundären Überlegungen wie Geschmack, Kosten und Lagerfähigkeit abhängen, welche für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht kritisch sind, und ohne Schwierigkeiten durch einen Fachmann durchgeführt werden können.
Ein ebenfalls bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IVl bis IV3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ von MHC-Molekülen, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, bevorzugt MHC-Multimeren, für Screeningverfahren und diagnostische Verfahren zur Suche und Identifizierung von neuen Antigenen, insbesondere von Tumorantigenen, Pathoantigenen und Autoantigenen, sowie zum Nachweis spezifischer T-Zellen, beispielsweise autoreaktiven T-Zellen oder zytotoxischen T-Zellen, oder zum Monitoring einer spezifischen T-ZeI I-Antwort. Typischerweise wird dazu in einem ersten Schritt eine Zusammensetzung mit erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und 1V1 bis IV3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ von MHC-Molekülen, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, bereitgestellt. MHC-Moleküle sind dabei wie oben definierte MHC-Moleküle. Die hier verwendeten Zusammensetzungen können den in den Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen bereitgestellten Zusammensetzungen entsprechen. Die im vorliegenden Fall verwendeten MHC-Moleküle können mit Liganden beladen oder unbeladen sein. Die Liganden entsprechen bevorzugt den zuvor in der Beschreibung definierten Liganden und werden in Abhängigkeit der zugrundeliegenden Aufgabe gezielt ausgewählt. Bevorzugt werden solche Liganden auf MHC-Moleküle aufgeladen, die auch unter physiologischen Bedingungen zu einer Immunantwort führen. Die in dem Screeningverfahren oder diagnostischen Verfahren verwendeten und/oder identifizierten Liganden sind bevorzugt wie oben definierte Liganden von MHC-Molekülen, noch stärker bevorzugt Liganden tumor- oder pathogenspezifischer Antigene sowie Antigene autoreaktiver T-Zellen. Beispielsweise können durch die gezielte Bindung von Antigenen auf MHC- Molekülen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- oder Diagnoseverfahrens die Bildung von spezifischen T-Zellrezptoren oder T-Zellen auf dieses Antigen hin in einem Patienten überprüft werden. Die mit dem Screening gegebenfalls erhaltene Immunantwort kann anschließend mit einer Indikation in direkten Zusammenhang gebracht werden. Typischerweise wird nach einem erfindungsgemäßen Verfahren eine solche Menge an Liganden auf das MHC-Molekül geladen, dass die Menge an Liganden auf den MHC-Molekülen zur Stimulierung einer Immunantwort, bevorzugt einer T-Zellantwort ausreicht. In einem weiteren Schritt kann das MHC-Molekül an eine Festphase oder an eine Matrix gebunden werden. Eine Festphase oder eine Matrix im Sinne des vorliegenden Verfahrens ist dabei bevorzugt jede Oberfläche, an die sich MHC-Moleküle direkt, über einen Linker, über eine Markierung oder über ihre Affinität, binden lassen. Die MHC-Moleküle können für die Bindung an eine Festphase wie oben beschrieben markiert sein. Für die Bindung an eine Festphase oder an eine Matrix können der Zusammensetzung geeignete Puffer zugesetzt werden. Geeignete Puffer sind einem Fachmann bekannt. Geeignete Puffer im Sinne des vorliegenden Verfahrens sind beispielsweise PBS Puffer, RSA- PBS Puffer (PBS Puffer mit Rinder-Serum-Albumin (RSA)), FKS-PBS Puffer (PBS Puffer mit Fötalem Kälberserum (FKS)), Phosphat-Puffer, TRIS-HCI Puffer, Tris-Phosphat- Puffer, oder weitere geeignete Puffer. Die Konzentrationen und Mengen der einzusetzenden Puffer entsprechen bevorzugt den zuvor in der Beschreibung genannten. In einem weiteren Schritt kann eine zu untersuchende Substanz, beispielsweise eine Körperflüssigkeit oder ein homogenisiertes Gewebe, bevorzugt Blut oder Gewebe, gegebenfalls in einem der zuvor beschriebenen Puffer zugegeben werden. Die in der zugegebenen Substanz enthaltenen physiologischen Bindungspartner binden üblicherweise an die immobilisierten, gegebenfalls nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle. Nach der Bindung der enthaltenen physiologischen Bindungspartner an die MHC- Moleküle wird üblicherweise die Festphase oder Matrix mit einem Puffer, bevorzugt einem der zuvor beschriebenen Puffer, gewaschen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der physiologische Bindungspartner bevorzugt eine T-ZeIIe, besonders bevorzugt eine solche T-ZeIIe, die eine hohe Affinität zu einem Antigen besitzt, noch stärker bevorzugt eine T-ZeIIe mit einer hohen Affinität zu einem tumor- oder pathogenspezifischen Antigen. Ebenfalls besonders bevorzugt ist die in einem Screeningverfahren erzeugte oder in einem diagnostischen Verfahren nachzuweisende Immunantwort eine antigenspezifische T-ZeI lantwort. In einem abschließenden Schritt können die an die MHC-Moleküle gebundenen physiologischen Bindungspartner der gegebenfalls mit Liganden beladenen MHC- Moleküle durch ein wie oben beschriebenes biophysikalisches oder biochemisches Nachweis- oder Isolierungsverfahren, bevorzugt mittels FACS oder MACS, identifiziert und isoliert werden. Gemäß einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform können in solchen Verfahren unter Verwendung von MHC Klasse Il tragenden magnetischen beads T-Zellen antigenspezifisch mittels MACS isoliert werden. Die im zuvorgenannten Screeningverfahren oder diagnostischen Verfahren genannten Schritte können in geeigneter Reihenfolge geändert werden. Screeningverfahren oder diagnostische Verfahren gemäß der hier vorliegenden Erfindung schließen bevorzugt in vitro T-ZeII Assays, besonders bevorzugt Proliferationsassays, ELISPOTS, ELISA-Verfahren, Chromium-Release-Assays, High- Throughput Screeningverfahren (HTS), etc. mit ein.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Screening- oder Diagnostiziervefahrens betrifft ein Verfahren zur Suche und Identifizierung von neuen Tumorantigenen, zum Nachweis spezifischer zytotoxischer T-ZeI len oder zum Monitoring einer spezifischen T-ZeI I-Antwort umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde; und b) Bestimmung der Wechselwirkung von MHC-Molekülen, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, mit einem physiologischen Bindungspartner der MHC- Moleküle mit Hilfe eines biochemischen oder biophysikalischen Nachweisverfahrens; und c) Optional Identifizierung und Isolierung des physiologischen Bindungspartners der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, mit Hilfe eines biochemischen oder biophysikalischen Nachweis- oder Isolierungsverfahrens.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können in einem Screeningverfahren oder diagnostischen Verfahren die MHC-Moleküle, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, bevorzugt MHC Multimere, zur antigenspezifischen Identifizierung von (bspw. autoreaktiven) T-ZeI len, bevorzugt von tumorspezifischen, pathogenspezifischen oder autoreaktiven T-Zellen eingesetzt werden. Bevorzugt werden als Liganden solche Antigene ausgewählt, die mit einer der zuvor genannten Indikationen in Zusammenhang stehen. Ein solches Diagnostikverfahren wird typischerweise ex vivo durchgeführt, bspw. indem Proben des Patienten, bspw. Körperflüssigkeitsproben, insbesondere Blut- oder Lymphproben, zu mit Hilfe der erfindungsgemäßen Katalysatoren mit Liganden (bspw. von einem Pathogen-Antigen oder einem Tumorantigen abgeleitet, bspw. ein Fragment derselben) beladenen MHC-Molekülen gegeben werden. In einem nachfolgenden Schritt wird dann die Bindung von Zellen in der Patientenprobe, bspw. (auto)reaktiven T-Zellen, an die beladenen, vorzugsweise tetrameren, MHC-Moleküle detektiert, bspw. mit Hilfe geeigneter Detektionsverfahren, insbesondere durch Markierung der MHC-Moleküle und/oder Liganden, bspw. durch Fluoreszenzmarkierung oder andere spektroskopisch detektierbare Verbindungen. Insbesondere kann die Detektion mittels FACS-Analyse durchgeführt werden.
Figurenbeschreibung:
Figur 1 : stellt die Katalyse der Beladung löslicher HLA-DR1 Moleküle durch
Phenol- und Adamantylverbindungen dar. Feld A) zeigt Strukturformeln von p-Chlorphenol (pCP), 2-(1-Adamantyl)-Ethanol
(AdEtOH) und 3-(1 -Adamantyl)-5-Carbohydrazidpyrazol (AdCaPy), die in den erfindungsgemäßen Experimenten eingesetzt wurden. Feld B) zeigt die Beladung von leeren löslichen HLA-DR1 Molekülen mit dem HA306-318 Peptid. Die Beladung wurde unter Verwendung von biotinyliertem Peptid im ELISA bestimmt. Die Höhe der Balken des gezeigten Balkendiagramms im linken Feld repräsentiert die Zahl der gebildeten Peptid/MHC Komplexe nach 60 Minuten. Schwarze Balken repräsentieren dabei die unkatalysierte Beladungsreaktion, wobei (+) die Spontanbeladung und (-) das Hintergrundsignal in Abwesenheit des Peptids darstellt. Die Höhe der grauen Balken markiert die Zahl der gebildeten Komplexe der katalysierten Reaktionen, welche in Anwesenheit von 250 μM pCP, AdEtOH oder AdCaPy durchgeführt wurden. In der rechten Abbildung sind die entsprechenden Dosis- Wirkungskurven dargestellt. Wie aus dieser Abbildung deutlich hervorgeht, sind alle drei Katalysatoren grundsätzlich in der Lage, die
Reaktion zu beschleunigen. Verglichen mit der pCP Kurve sind die entsprechenden Kurven der Adamantylverbindungen jedoch um mehr als eine Zehnerpotenz nach links verschoben, d.h. sie sind 10-fach aktiver als pCP.
Figur 2: zeigt die Katalyse der Beladung von HLA-DR Molekülen auf der
Zelloberfläche anhand von Dosis-Wirkungskurven der Beladung von Fibroblastenzellen mit dem HA306-318 Peptid. Die Zellen wurden dafür mit dem Peptid sowie mit p-Chlorphenol (pCP), 2-(1 -Adamantyl)- Ethanol (AdEtOH) und 3-(1 -Adamantyl)-5-Carbohydrazidpyrazol
(AdCaPy) inkubiert. Durch Verwendung eines biotinylierten Peptides konnte anschließend nach Färbung der Zellen mit fluoreszierendem Streptavidin die Menge an gebundenem Peptid auf L57.23 und L243.6 nachgewiesen werden, welche HLA-DR1 (DRB1 *O1 O1) bzw. HLA-DR4 (DRB1 *0401 ) exprimieren, zwei MHC Klasse II Moleküle, welche das HLA306-318 Peptid präsentieren können. Das Fehlen jeglicher
Färbung der L929 Zellen zeigt an, dass alle Katalysatoren selektiv die Bindung an die MHC-Moleküle verstärken. Ein Vergleich der Dosis- Wirkungskurven bestätigt dabei das Ergebnis mit den löslichen MHC- Molekülen (siehe auch Fig. 1 ). Auch hier erweisen sich die getesteten Adamantylverbindungen wesentlich aktiver als pCP und beschleunigen die Beladung der Zellen bereits bei einer Konzentration von deutlich weniger als einem Zehntel der entsprechenden pCP Konzentration.
Figur 3: zeigt die Verstärkung der T-Zellantwort durch die Katalyse der Beladung von HLA-exprimierenden Zellen anhand der Dosis-
Wirkungskurven der Immunantwort von zwei verschiedenen HLA- DR1 -restringierten T-Zellen. Als Peptidantigen wurde dabei entweder HA306-318 (linkes Feld) oder CO260-273 (rechtes Feld) verwendet. In beiden Fällen wird die Immunantwort der T-Zellen durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen AdEtOH oder AdCaPY deutlich verstärkt. Der Vergleich der Dosiswirkungen ergibt, dass ebenfalls bezüglich der T-Zellantwort die Adamantylverbindungen etwa 10-100-fach effektiver sind als pCP.
Figur 4: zeigt die allelspezifische Wirkung der Katalyse durch Adamantylverbindungen durch einen Vergleich der Dosis- Wirkungskurven einer HLA-DR4- (linkes Feld) und einer HLA-DR2- restringierten T-Zellantwort (rechtes Feld). HLA-DR4 (DRB1 *0401) und HLADR2 (DRB1 *1501)-exprimierende Zellen wurden, wie unter Vergleichsversuch 3.4 beschrieben, unter Anwesenheit der
Katalysatoren mit HA306-318 bzw. MPB86-100 beladen und anschließend im T-ZeI lassay eingesetzt. Während die Dosis- Wirkungskurven der HLA-DR4-restringierten 8475/94 T-Zellen denen der zuvor in Vergleichsversuch 3.3 beschriebenen HL-DRl- restringierten T-Zellen entspricht, ist bei den Kurven der HLA-DR2 restringierten 08073 T-Zellen ein deutlicher Unterschied zu erkennen.
Im Gegensatz zum pCP, das auf allen untersuchten HLA-DR Molekülen verstärkend wirken kann, wirken die Adamantylverbindungen offensichtlich auf HLA-DR1 (DRB1 *0101 ) und HLA-DR4 (DRB1 *0401 ), nicht jedoch auf HLADR2 (DRB1 *l 501 ). Die Wirkung der Adamantylverbindung ist daher offensichtlich allelspezifisch.
Figur 5: zeigt einen Vergleich der Dosis-Wirkungskurven der Katalyse der Bindung von MBP86-100 an das HLA-DR2 Wildtyp Molekül (linke Abb.) und an das mutierte HLA-DR2 Molekül, bei dem der Valinrest an der Position 86 der ß-Kette durch Glycin ersetzt wurde (rechte Abb.). Während Adamantanethanol am unmutierten HLA-DR2 Molekül der Fibroblastenzellen keine Katalyse bewirken kann wie an den in Vergleichsversuch 3.4 beschriebenen MGAR Zellen, bewirkt die V->G Substitution, dass das mutierte HLA-DR2 Molekül wieder für die
Adamantyl-vermittelte Katalyse empfänglich wird. Da der Glycin/Valin-Dimorphismus die Tiefe der Bindungstasche P1 bestimmt, wobei ß86G mit einer tiefen Tasche korreliert, vermitteln Adamantylverbindungen ihre katalytische Aktivität offensichtlich durch ihre Bindung an eine tiefe P1 Tasche.
Figur 6: zeigt Dosis-Wirkungskurven der Katalyse einer HLA-DR1
(DRB1 *O101 )-restringierten T Zellantwort. Das Experiment wurde analog der Beschreibung zu Vergleichsversuch 3.3 durchgeführt, wobei das Peptidantigen HA306-318 auf 721.221 Zellen geladen wurde, um damit EvHA/X5 T-Zellen zu stimulieren. Die Dosis- Wirkungskurven zeigen, dass alle aufgeführten
Adamantylverbindungen eine katalytische Aktivität besitzen. Der unterschiedliche chemische Charakter der Seitenketten zeigt, dass die Wirkung im wesentlichen durch die Adamantylgruppierung vermittelt wird. Da die Lage der Dosis-Wirkungskurven offensichtlich jedoch auch von der Seitenkette bestimmt wird, kann ihr jedoch zumindest eine modulierende Wirkung zugesprochen werden.
Figur 7: zeigt durchflußzytometrische Messungen von HLA-DR1 -restringierten humanen T Zellen (PD2), welche mit fluoreszenzmarkierten peptidbeladenen HLA-DRl Tetrameren gefärbt wurden. Folgende Tetramere wurden hierbei eingesetzt: HA-Tetramere, HLA-DR1 - Tetramere, die vom Hersteller (Proimmune Ltd.) bereits mit dem T Zeilantigen HA306-318 beladen bezogen wurden und IC-Tetramere, welche das nichtrelevante Peptid IC106-120 tragen. In Feld A) werden durchflußzytometrische Messungen gezeigt, welche durch Beladung von IC-Tetrameren mit HA306-318 unter Anwesenheit von Adamantylverbindungen (AdEtOH) hergestellt wurden. Als Kontrolle wurde zudem eine Beladung mit einem nicht-relevanten Peptid (ABL) durchgeführt. Die durchflußzytometrische Analyse nach Färbung der
Zellen mit den Komplexen ergab, dass die PD2 T-ZeI len, welche mittels Adamantylethanol beladenen Tetrameren gefärbt wurden, ein ähnlich hohes Signal lieferten, wie die vorgefertigten HA- Tetramere. In Feld B) wird der Ligandenaustausch in Anwesenheit sowie in Abwesenheit des Adamantylethanols dargestellt. Wie aus dem
Balkendiagramm ersichtlich ist, werden auch in diesem Experiment die HA306-318-spezifischen PD2 T-Zellen mit den durch Adamantylethanol katalysierten Tetrameren gefärbt. Dagegen wird keine nennenswerte Färbung mit den Komplexen beobachtet, bei denen eine Beladung ohne Katalysator versucht wurde. Die mit Hilfe des Adamantylethanols entstandenen Komplexe weisen zudem die geforderte Antigenspezifität auf, da A 10 T-Zellen im Gegensatz zu den PD2 nicht gefärbt werden.
Figur 8 stellt Dosis-Wirkungskurven weiterer Verbindungen dar, die ebenfalls über die tiefe P1 Tasche wirken. In Feld A) sind die untersuchten
Strukturen dargestellt (2-(7,7-Dichlor-6-methyl-bicyclo[4.1.0]heptan-3- yl)-propan-2-ol (#4230) und 6-Methoxybenzofuran-3(2H)-on-oxim (#3651 )). Trotz sehr unterschiedlicher chemischer Struktur weist dabei zumindest #4230 eine Raumstruktur auf, welche der der Adamantylgruppe sehr ähnlich ist. In Feld B) wird die Aktivität und
Allelspezifität mit den HLA-DRl -restringierten HA306-318- spezifischen EvHA/X5 T-Zellen (linke Abb.) und den HLA-DR2- restringierten MBP86-100 spezifischen 08073 T Zellen dargestellt. Auf HLA-DR1 weist #4230 eine katalytische Aktivität auf, welche ungefähr der des Adamantylethanols entspricht. #3651 ist dagegen schwächer, weist jedoch immer noch höhere Aktivität auf als pCP. Auf HLA-DR2 weisen beide Verbindungen keine Aktivität auf, weshalb sie offensichtlich, ähnlich wie die Adamantylverbindungen, ihre katalytische Wirkung durch die Bindung an die tiefe P1 Tasche vermitteln.
Figur 9 stellt Dosis-Wirkungskurven verschiedener katalytisch aktiver Phenol-
/Anilinverbindungen dar. In Feld A) sind Strukturformeln einiger katalytisch aktiver Phenol- und Anilinverbindungen dargestellt. Die katalytische Aktivität der bislang identifizierten aktiven Verbindungen dieser Verbindungsklasse liegen zumeist, häufig auch deutlich, unter der der Adamantylverbindungen. Der Mechanismus der Katalyse ähnelt offensichtlich jedoch dem der Adamantylverbindungen, da auch hier eine rezeptive Konformation ausgelöst wird. B) Die katalytische Aktivität der Beispielsubstanzen ist hier an der beschleunigten
Beladung von löslichen HLA-DR1 Molekülen mit dem HA306-318 demonstriert. Ein Vergleich der Dosis-AVirkungskurven mit pCP zeigt, dass alle Verbindungen in einem sehr ähnlichen Wirkungsbereich liegen, wobei insbesondere DCC und pHDP leicht erhöhte Aktivität zeigen.
Figur 10 stellt Dosis-Wirkungskurven der Katalyse der HLA-DR Beladung durch pCP und Adamantylethanol dar. Die Daten wurden mittels T- Zellassays wie in Vergleichsversuch 3.3 beschrieben bestimmt und illustrieren die Wirkung der beiden Katalysatoren auf HLA-DR Molekülen mit tiefer oder flacher P1 Tasche { 86G bzw. 86V} sowie auf die Maus MHC Klasse Il Moleküle H2-Ek und H2-Ak. Die unterbrochenen Linien repräsentieren dabei die Stärke der unkatalysierten T Zellantwort. Wie bereits in Vergleichsversuch 3.5 beschrieben, ist die Wirkung des Adamanthylethanols verglichen mit pCP stärker, jedoch auf solche HLA-DR Moleküle gerichtet, welche die tiefe P1 Tasche besitzen. Dafür ist das Wirkungsspektrum des pCP weniger spezifisch. Es existiert keine Abhängigkeit vom 86- Dimorphismus und bislang wurden auch keine sonstigen allelspezifischen Beschränkungen der Wirkung von pCP auf HLA-DR Molekülen beobachtet. pCP besitzt keinen Effekt auf alle bislang untersuchten H2-A und H2-E Moleküle, die Homologe zu den humanen HLA-DQ bzw. HLA-DR Molekülen sind.
Figur 11 stellt Dosis-Wirkungskurven verschiedener katalytisch aktiver Thiophenverbindungen dar. In Feld A) sind Strukturformeln einiger katalytisch aktiver Thiophenverbindungen dargestellt. Die katalytische
Aktivität der bislang identifizierten aktiven Verbindungen dieser
Verbindungsklasse ist zumeist etwas stärker als die des pCP. Die
Aktivität von drei Beispielverbindungen ist hier anhand der Dosis/Wirkungskurven der Stimulation H LA-D R1 -restringierten
EvHA/X5 T-Zellen gezeigt. Das Experiment wurde wie unter Vergleichsversuch 3.3 beschrieben durchgeführt. In Feld B) sind die vergleichenden Dosis-Wirkungskurven von pCP, AdEtOH und ATC dargestellt. Ähnlich wie bei den aktiven Phenol/Anilinverbindungen ist auch hier die Aktivität offensichtlich unabhängig vom ß86- Dimorphismus der HAL-DR Moleküle. Wie in Vergleichsversuch 3.1 1 gezeigt wird mit der Verbindung ATC die Peptidbeladung sowohl von Fibroblasten katalysiert, welche entweder HLA-DR1 (DRB1 *0101 ; ß86G) oder auch HLA-DR2 (DRB1 *1501 ; ß86V) exprimieren. Die Tiefe der P1 Tasche spielt demnach bei den Thiophenverbindungen offensichtlich keine Rolle.
Figur 12 stellt die katalytische Aktivität von etlichen erfindungsgemäß eingesetzten Adamantylverbindungen, die unter die generischen Formeln I bzw. IA fallen, dar. Aufgetragen ist die relative Verstärkung der Beladungsrate gegenüber den verwendeten Konzentrationen der katalytischen Adamantylverbindungen (s. Ausführungsbeispiel 3.12). Es ist deutlich zu erkennen, dass die getesteten Verbindungen eine deutliche Verstärkung der Beladungsrate bewirken können, welche dosisabhängig ist. Als Kontrolle wurde DMSO eingesetzt. In der rechten Spalte von Figur 12 finden sich die eingesetzten
Adamantylverbindungen (mit abnehmender Aktivität von oben nach unten). Deren Struktur ist Tabelle 1 zu entnehmen.
Figur 13 stellt die katalytische Aktivität von etlichen erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen, die unter die generischen Formeln II, III bzw. IV1 bis IV3 fallen, dar. Aufgetragen ist die relative Verstärkung der Beladungsrate gegenüber den verwendeten Konzentrationen der katalytischen Verbindungen (s. Ausführungsbeispiel 3.12). Es ist deutlich zu erkennen, dass die getesteten Verbindungen eine deutliche Verstärkung der Beladungsrate bewirken können, welche dosisabhängig ist. Als Kontrolle wurde DMSO eingesetzt. In der rechten Spalte von Figur 12 finden sich die experimentell eingesetzten Verbindungen (mit abnehmender Aktivität von oben nach unten). Deren Struktur ist Tabellen 2 bis 4 zu entnehmen.
Figur 14 zeigt die Katalyse der Beladung dendritischer Zellen mit Antigenen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapien. In Abwesenheit von AdEtOH I 1 , einer Verbindung der generischen Formeln I oder IA, wird nur zu einen geringem Umfang Peptid auf die Oberfläche der DC geladen (linke Abb. Von Fig. 14A); jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Zelle). Ein deutlich stärkeres Peptidsignal wird jedoch gemessen, wenn die Beladung in Anwesenheit von 250 μM AdEtOH durchgeführt wird (rechte Abb. von Fig. 14 A). Entsprechend hoch ist auch die Verstärkung der antigenspezifischen T-ZeI lantwort (Fig. 14B). DC, welche in Anwesenheit von AdEtOH mit dem Antigen beladen werden, lösen bis zu 15 mal stärkere T-ZeI lantworten aus, als DC, welche ohne AdEtOH beladen wurden. Die Höhe der Verstärkung zeigt dabei die erwartete Abhängigkeit von der eingesetzten Menge an AdEtOH und äußert sich in einer deutlichen Verschiebung der Dosis/Wirkungskurve des Peptidantigens (Fig. 14 C). Ein Vergleich der
Peptidbeladung mit (•) und ohne (o) AdEtOH ist dargestellt. Bei 250 μM AdEtOH lösen hier bereits weniger als 10 ng/ml HA306-318 Peptid eine T Zellantwort aus, welche in Abwesenheit des Katalysators nur bei einer Konzentration von 100 ng/ml Peptid erreicht wird. Figur 14 illustriert, dass die Effizienz dieses Ansatzes erheblich gesteigert werden kann, wenn die ex vivo Antigenbeladung dabei durch katalytische Verbindungen wie AdEtOH verstärkt wird. Da diese MHC Klasse II-exprimierenden Zellen (DC) besondere Bedeutung bei der Auslösung antigenspezifischer T Zellantworten besitzen, werden sie u.a. bevorzugt bei Immuntherapien eingesetzt. So werden beispielsweise bei adoptiven Tumorimmuntherapien DC von Krebspatienten (a) isoliert, (b) ex vivo mit Tumorantigenen beladen und anschließend (c) wieder reinjiziert, um in vivo tumorspezifische Immunantworten auszulösen. Derartige ex vivo Therapieverfahren können auch erfindungsgemäß durchgeführt werden, wobei Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IVl bis IV3 in
Verfahrensschritt (b) eingesetzt werden können. Ein derartiges Verfahren kann - wie in der vorliegenden Anmeldung offenbart - auch mit anderen als tumorspezifischen Antigenen durchgeführt werden.
Figur 15 zeigt die Wirkung des Einsatzes von AdEtOH (I 1 ) als Vakzinadditiv oder Adjuvans zur Verstärkung der Immunantwort bei Vakzinierungsexperimenten. Wie die Analyse dieses Experiments verdeutlicht, wurden bei der Vakzinierung, bei der AdEtOH als Additiv eingesetzt wurde, offensichtlich deutlich mehr T-Zellen aktiviert, welche gegen die ABL-Domäne reagieren können. Der Zusatz des
AdEtOH hat somit zu einer erheblichen Steigerung der Effizienz der Vakzinierung geführt. Die Anzahl der Spots ist gegen hierbei gegen die Vakzinierung mit oder ohne Adjuvans (AdEtOH) aufgetragen. Hierbei wurden verschiedene Konzentrationen an Antigen verwendet. Jeder Spot entspricht der Aktivierung einer T-ZeIIe.
Bei der Vakzinierung mit Peptidantigenen oder größeren antigenen Polypeptidfragmenten ist eines der Hauptprobleme der effiziente Transfer der Antigene auf die MHC-Moleküle. Die Effizienz wird hierbei zusätzlich durch die im Serum vorhandenen Proteasen reduziert, welche die freien Antigene in relativ kurzer Zeit abbauen. Eine Beschleunigung des Antigentransfers, wie durch die erfindungsgemäßen Verfahren bewirkt, wirkt sich bei der Vakzinierung somit in doppelter Hinsicht positiv auf die Verstärkung der Immunantwort aus. Dies kann z.B. dadurch erreicht werden, daß Katalysatoren wie z.B. AdEtOH als Additiv oder Adjuvans dem Vakzin zugesetzt werden.
Figur 16 stellt die Verwendung des MHC-Bindungsassays zur Identifizierung immuntoxischer Verbindungen dar. Hierzu wurden zwei in erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare Verbindungen verwendet (3-N-Phenylaminopropandiol, PAP, (III 36) (o) bzw. Sulfamethoxazol (III 37) (V) im Vergleich zu dem aus dem St.d.T. bekannten pCP). Dieser Assay erfolgte in vitro. Wie in der Figur ersichtlich, können beide Verbindungen im Gegensatz zu den meisten anderen Verbindungen, die Beladung von MHC Molekülen mit Peptidliganden beschleunigen. Die Aktivität ist dabei zwar deutlich geringer als die des pCP, mit dem hier gezeigten Assay jedoch immer noch deutlich nachweisbar. Damit wird nachgewiesen, dass der Einsatz von erfindungsgemäßen Verfahren, wie z.B. des MHC-Beladungsassay, die Möglichkeit bietet, zumindest einen Teil dieser Verbindungen bereits in vitro anhand ihrer katalytischen Aktivität zu identifizieren. Insbesondere Verbindungen, deren immuntoxische Wirkung vermutlich auf einer unmittelbaren Einflussnahme des
Beladungszustandes des MHC zurückzuführen ist, können hiermit in entsprechenden erfindungsgemäßen Screening-Verfahren aufgespürt werden. Dies ist hier an zwei Beispielen 3-N-Phenylaminopropandiol (PAP) und Sulfamethoxazol (SMX) illustriert. PAP ist ein Anilinderivat, welches mit der Ausbildung eines Autoimmunsyndrom (,toxic oil
Syndrome') in Verbindung gebracht wird (Gelpi E., et. al. Environ Health Perspect. 1 10:457), während SMX eine Allergie durch direkte Bindung an das MHC Klasse Il Molekül auslösen kann (Burkhart C, et al. Clin Exp Allergy. 32:1635). Ausführungsbeispiele:
Die folgenden nicht begrenzenden Beispiele beschreiben die vorliegende Erfindung und schränken die Erfindung in keiner Weise ein. Die Beispiele stellen sie dem Fachmann eine Anleitung zur Verwendung der Verbindungen und Verfahren der
Erfindung zur Verfügung. In jedem Fall können andere Verbindungen innerhalb der
Erfindung gegen diejenigen der unten gezeigten Beispielverbindung mit ähnlichen
Ergebnissen ausgetauscht werden. Der erfahrene Praktiker wird es bevorzugen, dass die Beispiele eine Anleitung bereitstellen und aufgrund der unterschiedlichen zu verwendenden Verbindungen variiert werden können.
1. In vitro-Verfahren
1.1. Analyse synthetischer Katalysatoren in vitro
1.1.1 Rekombinante lösliche HLA-DR Komplexe
Lösliche MHC-Klasse II Moleküle HLA-DR1 (DRAT1OI OI , DRB1 *0101 ), HLA-DR2 (DRA1 *0101 , DRB1 *1501) und HLA-DR4 (DRA1 *0101 , DRB1 *0401 ) wurden in S2- Insektenzellen produziert. Diese waren stabil mit Vektoren, die für verkürzte α- und -Ketten ohne den cytoplasmatischen und transmembranen Teil des MHC-Moleküls im Anschluß an einen Metallothionin-Promotor kodieren, transfiziert worden. Die HLA-DR produzierenden Zellen wurden in serumfreiem HyQ-SFX-lnsektenmedium (HyClone) bei 26°C in Schüttelkultur kultiviert. Die Induktion der HLA-DR- Produktion erfolgte bei einer Zelldichte von 6-8x106AnI durch Zugabe von 1 mM CuSO4. Die Produktion erfolgte dann für einen Zeitraum von 5 Tagen.
1.2.2 Aufreinigung löslicher HLA-DR Komplexe aus Zellkulturmedien
Die ZeI I überstände der HLA-DR produzierenden Zellen wurden für mehrere Tage im Zyklus mit Hilfe einer Peristaltikpumpe mit einem Fluss von 1 ,6ml/min über drei in Reihe geschaltete 25ml-Affinitätssäulen geleitet. Die erste Säule enthielt reine Protein A-Agarose und die zweite Protein G-Agarose. Die dritte Säule enthielt Protein A- Agarose an die LB3.1 anti-HLA-DR Antikörper gekopppelt worden war. Anschließend wurden zunächst alle drei Säulen mit 50OmI PBS-0,02%Natriumazid gewaschen und die Antikörper gekoppelte Säule danach nochmals einzeln mit 200ml. Diese Säule wurde anschließend in einem BiologicHR Chromatography System mit 50ml 1 OmM NaH2PO4 equiübriert und gebundenes HLA-DR mit 5OmM CAPS (pH 11 ,5) eluiert. Die Elution wurde durch Messung der Absorption bei 280nm überwacht und das Eluat während eines Peaks in 1 ml 60OmM NaH2PO4 aufgefangen. Zum Schluss wurde die Säule durch Waschen mit 50ml 30OmM NaH2PO4 neutralisiert. Die Proteinkonzentration in dem aufgefangenen Eluat wurde mit Hilfe der Proteinbestimmung nach Bradford ermittelt.
1.2.3 MHC-Klasse II Beladungsexperimente
Um die Katalyse der Beladung von HLA-DR-Molekülen durch Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 zu verfolgen, wurden leere, lösliche DR- Moleküle mit biotinyliertem, hochaffinem Peptid inkubiert und diese dann in einem Sandwich ELISA auf den MHC-Komplexen nachgewiesen.
Dazu wurden ca. 0.5 μg an HLA-DR auf Eis mit 1 μg an hochaffinem, biotinyliertem Peptid (HA-biot. (biot. HA306-318) in HLA-DR1 &DR4- und MBP-biot. (MBP86-100) in HLA-DR2-Beladungsexperimeneten) und der in den jeweiligen Versuchen angegebenen Konzentration an Katalysatorsubstanz vermischt. Alle Ansätze wurden dann mit 2% RSA- PO4 3"- Puffer (im Falle von HLA-DR1 nur mit PO4 3--Puffer) auf ein Endvolumen von 10μl eingestellt. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 37°C in einem Thermocycler gestartet. Nach 40min wurde die Inkubation abgebrochen und die Beladungsreaktion durch Lagerung auf Eis und Zugabe von 50μl eiskaltem 1 %- RSA-PBS gestoppt.
Die Detektion gebundenen Peptids erfolgte mit Hilfe eines Sandwich ELISAs. Dazu wurden 96-well-Maxisorp-Platten über Nacht mit 80μl/Vertiefung α-HLA-DR- Antikörper (Klon L243 (1 mg/ml) vedünnt 1 :500 in 10OmM NaHCO3-Lösung) beschichtet und anschließend mit 200μl/Vertiefung 2%-RSA-PBS bei 37°C für mindestens eine Stunde geblockt. Zwischen diesen Schritten wurde die Platte zweimal mit Hilfe eines PW-Plattenwaschgeräts (Tecan Industries) mit PBS- 0,05%Tween gewaschen und, vor dem Befüllen mit neuer Lösung, alle verbleibenden Flüssigkeitsreste durch Ausklopfen auf Scott®Natura Papierhandtüchern (Hakle-Kimberly Deutschland GmbH) entfernt. Nach dem Blockieren unspezifischer Bindungsstellen wurde die Platte dreimal gewaschen und mit 50μlΛ/ertiefung 1 %RSA-PBS befüllt. Zweimal 25μl je Reaktionsansatz wurden als Doppelwerte auf die Platte transferiert und dort sorgfältig vermischt (Gesamtvolumen je well: 75μl). Aus jeder befüllten Reihe wurden dann nochmals 25μl/Vertiefung in einer seriellen, zweistufigen Verdünnungsreihe auf der Platte titriert (Endvolumen je well: 50μl). Die so befüllten Platten wurden dann bei 40C für 2h ruhig gelagert. Anschließend wurde jede Platte sechsmal wie oben beschrieben gewaschen und mit 80μ l/Vertiefung Eu3+-Streptavidin-Färbelösung (Europium- Streptavidin-Stammlösung 1 :10.000 mit 1 %-RSA-PBS verdünnt) befüllt und für 30min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach weiterem achtmaligem Waschen wurden dann 100μ l/Vertiefung Fluoreszenz-aktivierende Lösung (Enhancer) zugegeben und das Signal mit einem Victor2-multilabelcounter (Wallac Oy) bei einer Anregungswellenlänge von 340nm und einer Emissionswellenlänge von 615nm im zeitauflösenden Modus gemessen.
1 .2.4 Analyse der Substanzbibliothek
Die zu testenden Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 wurden in 384-well-Platten als 16OmM Ausgangsbibliothek, gelöst in DMSO, geliefert, aus der eine Aliquotbibliothek angefertigt werden musste. Durch manuelle Abnahme von 2μl/Vertiefung und Verdünnung mit 38μl/Vertiefung DMSO wurde eine 8mM Stammbibliothek angefertigt, die für alle weiteren Untersuchungen verwendet wurde. Zur Analyse der enthaltenen Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 auf ihren Effekt auf MHC-Klasse Il Moleküle wurde ein Hochdurchsatzverfahren auf der Basis eines HLA-DR1 -Beladungsversuchs verwendet. Dazu wurden pro Bibliotheksplatte zwei 384-Vertiefung-Nunc-Maxisorp- Platten (EUSA-Platten) mit 6Oμ l/Vertiefung monoklonalem anti-HLA-DR-Antikörper (L243-Stammlösung (1 mg/ml) 1 :500 verdünnt in 10OmM NaHCO3) über Nacht bei 4°C beschichtet. Anschließend wurden die Platten dreimal durch Eintauchen in PBS- 0,05%Tween-Lösung und Entfernen von Luftblasen durch Stoßen der Platte gegen die Waschgefäßwand gewaschen. Verbleibende Waschlösung wurde durch Ausklopfen der Platten auf Papiertüchern entfernt und 80μl/Vertiefung 2% RSA-PBS eingefüllt. Durch Inkubation bei 37°C für mindestens eine Stunde sollten unspezifische Bindungen verhindert werden. Währenddessen wurde je Bibliotheksplatte eine 384-well-NUNC-Polystyren-Platte (Analysen-Platte) mit 22μl/Vertiefung DR1 -Analyselösung (ca.12μg/ml HLA-DR1 in PO4 3 -puffer) befüllt und kühl gelagert. Anschließend wurde mit Hilfe eines 384-well-Pipettier-roboters 1 μl/Vertiefung aus der Bibliotheksplatte in die Analysen-Platte überführt (Endvolumen 23μl/well) und die Spitzen des Roboters gewaschen. Dies geschah durch fünfmaliges Auf und Abziehen von 20μl Lösung nacheinander in einem DMSO-, einem Wasser- und einem Ultraschalldurchflussbad gefüllt mit destilliertem Wasser. Nach Ausblasen etwaiger, in den Spitzen verbliebener Flüssigkeit, wurden 2μl/Vertiefung aus einer 384-well Platte gefüllt mit HA-biot.-Lösung (1 mg/ml HA- biot. gelöst in PBS) in die Analysen-Platte überführt, und dort sorgfältig durch Auf- und Abpipettieren von 15μl/Vertiefung mit dem HLA-DR- Gemisch mit Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 vermengt (Endvolumen 25μl/Vertiefung). Die so befüllte Analysenplatte wurde dann für 40min bei 37°C inkubiert und die Spitzen des Roboters wie oben beschrieben gewaschen (Anstatt DMSO wurde hier ein weiteres Wasserbad verwendet!). Kurz vor Ablauf dieser Zeitspanne wurden die beiden ELISA-Platten fünfmal wie beschrieben gewaschen, verbliebene Waschlösung entfernt und mit Hilfe des Roboters 30μl/Vertiefung 1 %- RSA-PBS-Iösung eingefüllt. Nach den 40 Minuten Inkubation wurden dann mit Hilfe des Pipettierroboters 40μl/Vertiefung 1 %-RSA-PBS zusätzlich in die Analysen-Platte eingefüllt und mit der Reaktionslösung durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren von 30μl/Vertiefung vermischt (Endvolumen in der Analysen-Platte ca. 65μI/Vertiefung). Aus diesem Reaktions-RSA-PBS-Gemisch überführte der Roboter dann zweimal je 30μlΛ/ertiefung in die beiden ELISA-Platten und vermengte sie mit der vorgelegten RSA-PBS-Iösung durch erneutes Auf- und Abpipettieren von 3Oμl/Vertiefung (Endvolumen in den ELISA-Platten 60μl/Vertiefung). Die so befüllten ELISA-Platten wurden dann für zwei Stunden bei 4°C gelagert und die Spitzen des Roboters in drei Wasserbädem durch zehnmaliges Auf- und Abziehen von 40μl gewaschen. Anschließend wurden die beiden ELISA-Platten sechsmal wie bereits beschrieben gewaschen und von Hand mit 60μl/Vertiefung Eu3+-Färbelösung befüllt. Um eine ausreichende Markierung des gebundenen biotinylierten Peptids zu gewährleisten wurden die Platten dann für mindestens 30min bei RT ruhig gelagert. Daraufhin wurde überschüssige Färbelösung durch achtfaches Waschen mit PBS- 0.05%Tween entfernt und 80μl/Vertiefung fluoreszenzaktivierende Lösung (Enhancer) manuell zupipettiert. Die Detektion des Signals erfolgte dann wie im vorhergehenden Kapitel beschrieben.
1.2.5 Validierung in der Bibliothek identifizierter Katalysatoren
1 ,2μl der jeweiligen Substanz aus der Bibliotheksplatte wurden mit 4,8μl PO4 3"- Puffer vermischt und daraus 1 μl in ein neues Eppendorfgefäß überführt und dort wieder mit 5μl PO4 3"-Puffer vermengt. In einem weiteren Verdünnungsschritt wurde dann aus dieser zweiten Verdünnungsstufe noch einmal 1 μl entnommen und mit 7μl PO4 3"-Puffer vermischt. Alle drei Verdünnungsstufen wurden dann auf Eis mit je 0,5μg HLA-DR1 und 1 μg HA-biot. versetzt und mit PO4 3"-Puffer auf ein Endvolumen von l Oμl eingestellt. Dadurch entstanden eine 1 :10-, eine 1 :50- und eine 1 :300- Verdünnung der Substanz aus der Bibliothek. Als Kontrolle wurde mit DMSO und einer 10mM-StockIösung an I ^-Dichlor-^S-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. Fig. 9) ebenso wie für die Bibliothekssubstanzen beschrieben verfahren. Die weitere Analyse erfolgte wie unter MHC-Klasse 11 Beladungsexperimente beschrieben. 1.3 Untersuchung natürlicher potentieller Katalysatorquellen
1.3.1 Gewinnung und Extraktion von humanem Plasma
Patienten wurden Blutproben entnommen und in HEPES-beschichtete Röhrchen gegeben. Das frisch entnommene Blut wurde sofort bei 1500rpm für 15min zentrifugiert und das Plasma abgenommen.
Die Extraktion des Plasmas wurde im Wesentlichen wie von Gamache et al. (1998, Proc Soc Exp B/o/ Med 217:274-280) beschrieben ausgeführt. Im Einzelnen wurde
0.4ml humanes Plasma mit 1.6ml EtOH versetzt und durch Vortexen auf höchster
Stufe für 5min auf einem MS2 Minishaker vermischt. Durch Zentrifugation für 10min bei 13.200g in einer 5804 R Zentrifuge von Eppendorf wurde präzipitiertes Protein abgetrennt und der Überstand in ein frisches Eppendorfgefäß aufgenommen. Der so entstandene Extrakt wurde dann in einer SPD111V SpeedVac unter reduziertem
Druck und bei ca. 400C für 2h auf ein Endvolumen von ca 100μl eingeengt. 50μl von diesem Konzentrat wurden dann direkt in der HPLC-Analyse eingesetzt.
1.3.2 HPLC-Analyse
Analytische Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) wurde in einem Pharmacia Biotech Smart™System, ausgestattet mit einer C2/C18 SC2.1/10 RP (reverse phase) Chromatographiesäule, durchgeführt. Enthaltene Substanzen wurde mit Hilfe eines UV-Detektors nachgewiesen, der gleichzeitig die Absorption bei 214nm, 260nm und 280nm bei RT aufzeichnete. Die mobile Phase bestand aus 0,096% Trifluoressigsäure (TFA) in H2O bzw. aus 0,104% TFA in Acetonitril. Eluate wurden durch zeitabhängige Fraktionierung mit einem Volumen von 1 ml gesammelt. Das Lösungsmittel wurde daraufhin komplett unter erniedrigtem Druck bei 400C in einer SPD111 V SpeedVac (Savant Instruments Inc.) entfernt und das Pellet in 5μl DMSO resuspendiert. Die weitere Untersuchung der Fraktionen erfolgte durch HLA-DR1- Beladungsexperimente. 1.4 Toxizitätsanalysen
Zur Bestimmung der Toxizität der gefundenen Substanzen wurden 50.000- 100.000 Zellen (L57.23) in 100μl DMEM mit 50μl der Katalysatoren in den jeweils angegebenen Konzentrationen (gelöst in DMEM bei einer maximalen Konzentration von 3% DMSO) vermengt und für vier Stunden bei 37°C und 10% CO2 in einem Feuchtbrutschrank inkubiert. Als Kontrolle wurden Zellen nur mit 50μl DMEM versetzt. Anschließend wurden die Zellen bei 1300rpm für 5min abzentrifugiert und das überstehende Medium vorsichtig ausgeworfen. Die Zellpellets wurden dann durch kurzes vortexen der ganzen Platte auf niedriger Stufe angelöst, mit 100μl/Vertiefung 5%-FKS-PBS resuspendiert und erneut bei 1300rpm für 5min zentrifugiert. Daraufhin wurde der Überstand erneut verworfen und die Zellpellets in 100μl/Vertiefung Propidiumiodid-Färbelösung (25pg/ml) gelöst. Anschließend wurde die Zellsuspension in zuvor mit 300μl 5%-FKS-PBS befüllte Falcon® 5ml- Rundbodenröhrchen überführt und dann im BD FACSCalibur™System Durchflußzytometer analysiert.
1 .5 Beladung von MHC-Klasse Il Molekülen auf der Oberfläche von Zellen
Die katalytischen Eigenschaften gefundener Substanzen auf die Beladung zellständiger MHC-Klasse Il Moleküle wurde in Zeilbeladungsexperimenten ermittelt. Dazu wurden 50.000-100.000 Zellen in 50μl DMEM mit 50μl 24μM HA- biot. gelöst in DMEM und 50μl Katalysatorlösung (verschiedene Konzentrationen gelöst in DMEM mit einem maximalen DMSO-Gehalt von 3%) vermischt und für 4h bei 37°C und 10%CO2 inkubiert. Als Kontrollen wurden in mehreren Ansätzen Zellen nur mit 50μl Peptidlösung und 50μI DMEM versetzt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen bei 1300rpm für 5min abzentrifugiert und überstehendes Medium abgenommen. Die Zellpellets wurden dann durch kurzes Vortexen der Platte angelöst, in 100μl/Vertiefung 5%-FKS-PBS resuspendiert und erneut bei 1300rpm für 5min zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstands wurden die Zellpellets erneut angelöst und in 50μl/Vertiefung Streptavidin-Phycoerythrin- lösung (SA-PE-Stammlösung(1 mg/ml) verdünnt 1 :200 mit 2%FKS-PBS) aufgenommen. Die Färbung erfolgte für 30min bei 40C unter Lichtausschi uss um übermäßigen Zerfall der Fluoreszenzfarbstoffe zu vermeiden. Die gefärbten Zellen wurden daraufhin noch einmal wie bereits beschrieben abzentrifugiert mit 2%-FKS- PBS gewaschen und in 100μl/Vertiefung 2%FKS-PBS aufgenommen und in zuvor mit 300μl 2%-FKS-PBS befüllte Falcon® 5ml-Rundbodenröhrchen überführt. Anschliessend wurden die Zellen im Durchflusszytometer analysiert. Die Expression von MHC-Molekülen auf der Oberfläche der Zellen wurde in Kontrollansätzen durch Färbung mit α-HLA-DR-Antikörper (markiert mit PE, Stammlösung (1 mg/ml) 1 :75 verdünnt mit 2%-FKS-PBS) bzw. als Isotypenkontrolle mit IgG2a-Maus- Antikörper (markiert mit PE, Stammlösung (1 mg/ml) verdünnt 1 :75 mit 2% FKS-PBS) statt mit SA-PE (Streptavidin-PE) überprüft.
1.6 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrischen Analysen wurden auf einem BD FACSCaI ibur™ System von Becton Dickinson durchgeführt. Zur Färbung wurden Phycoerythrin markiertes Streptavidin (CALTAG Laboratories), α-HLA-DR Antikörper und lgG2a-Maus-Antikörper (BD-Biosciences) beide markiert mit Phycoerythrin sowie Propidiumiodid (Sigma-Aldrich-GmbH) verwendet. Alle weiteren zur Messung nötigen Materialien wurden von BD Biosciences, Bedford, USA bezogen.
1 .7 Analyse der Substanz-Bibliothek
Zur Identifikation neuer Substanzen oder Substanzklassen, die in der Lage sind, die Wechselwirkungen zwischen MHC-Klasse II Molekülen und deren Liganden, ähnlich wie HLA-DM jedoch bei physiologischen pH-Werten, zu beeinflussen, wurde eine 20.000-Komponenten-KleinmoleküI-Bibliothek (Chemical Diversity
Labs, Inc.) mit Hilfe eines Hochdurchsatzanalyseverfahrens auf Verbindungen hin untersucht, die die Beladung leerer, löslicher HLA-DR1 -Komplexe mit hoher Effizienz katalysieren. Als Referenzsubstanz wurde 1 ,2-Dichlor-4,5- Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. Fig. 9) verwendet, eine Substanz, die bei geringen Konzentrationen noch Aktivität zeigte.
1.8.1 Hochdurchsatz Analyse der 20.000 Komponenten Bibliothek
Die Analyse der in 384-well-Platten vorliegenden Bibliothek erfolgte mit Hilfe eines Quadra-384 Pipettier-Roboters. Da auf den Bibliotheksplatten alle Vertiefungen mit Substanz gefüllt waren, wurde als Kontrolle eine Extraplatte angelegt, die hauptsächlich mit DMSO und in einigen Vertiefungen mit pCP und 1 ,2-Dichlor-4,5- Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. Fig. 9) in unterschiedlichen Konzentrationen befüllt war. Diese Kontrollplatte wurde dann parallel zu den eigentlichen Bibliotheksplatten in die Analyse nach aktiven Substanzen eingeschlossen. Die Analyse der Bibliothek beruht auf einem oben beschriebenen Hochdurchsatz-Analyseverfahren. Die meisten Substanzen liegen hierbei in einem relativ engen Bereich, während einzelne Substanzen über diese Hintergrundbeladung hinausragen. Der Vergleich mit den für die Kontrollplatte erzielten Werte lieferte einen Schwellenwert von 15.000 gezählten Ereignissen, da dieser Wert von 1 ,2-Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. Fig. 9) bei einer Endkonzentration von 0,4mM (entspricht in etwa der Konzentration der aus der Bibliothek eingesetzten Verbindungen) erreicht wird. Alle Substanzen die eine höhere Beladung katalysieren konnten wurden als katalytisch aktiver als 1 ,2-Dichlor- 4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. Fig. 9) eingestuft und in nachfolgenden Experimenten weiter untersucht.
1.8.2 Validierung der in der Bibliothek identifizierten Verbindungen
Die aus der Analyse der Bibliothek gewonnenen Ergebnisse wurden zunächst für alle als katalytisch aktiv bewerteten Substanzen bestätigt. Zur Erweiterung der mit diesem Experiment erzielten Ergebnisse wurden die Katalysatoren dabei titriert und in den Verdünnungsstufen 1 :10, 1 :50 und 1 :300 eingesetzt. Als Referenz dienten 1 ,2- Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. Fig. 9) und DMSO. Als Maßstab wurde festgelegt, dass alle Verbindungen als positiv bewertet werden, die in der ersten Stufe ein wesentlich stärkeres Signal als 1 ,2-Dichlor-4,5- Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. Fig. 9) lieferten und danach abfielen, oder über den Verlauf der drei Verdünnungen eine mindestens ebenso hohe oder höhere Beladung katalysierten.
Die Untersuchungen ermittelten Substanzen, deren katalytische Aktivität als entweder ebenso hoch wie die von 1 ,2-Dichlor-4,5~ Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. Fig. 9), oder sogar als höher eingestuft wurde. Die Strukturformeln der so beispielhaft ermittelten Verbindungen sind in Tabelle 5 dargestellt.
U I8
1 -Adamantan-1 -yl-propan-1 -o! 1 -Adamantan-1 -yl-1 ,2-diol
I9 110
(4-Adamantan-l -yl-phenyl)-
5-Adamantan-1 -yl-4H-pyrazol-3- isoprenylamin carboxylsäurehadrazid
111 112
-Adamantan-1 -yl-benzensulfonamid 1 -Adamantan-1 -yl-ethanol
113 114
1 -Adama ntan-1 -yl-ethanol
115 116
IV1 IV2
2-(7,7-Dichloro-6-methyl-bicycIo
2-Amino-4-pyrrolidin-2-yl-4a,5,6,7- [4.1.0]hept-3yl) propan-2-ol tetrahydro-4H-naphtalen-1 ,3,3- tricarbonitril
2-Cyano-2-(4-methyl-cyclohexyliden)- thioacetamid
Tabelle 5: Strukturformeln von beispielhaften, aus der Bibliothek identifizierten Katalysatoren. Die
Graphiken wurden mit Hilfe des Programms ISIS™/Draw2.4 (MDL Information Systems, Inc., USA) erstellt. Die angegebenen lUPAC-Bezeichnungen wurden durch das beigefügte Plugin AutoNom Standard ermittelt.
Um das System der Analyse zu überprüfen, wurden die bestimmten Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 in einem HLA-DR1 -Beladungsansatz auf ihre Aktivität hin untersucht. In Tabelle 6 sind die zu Adamantanethanol (11 ) homologen Verbindungen, von denen auch die Position in der Bibliothek ermittelt werden konnte, abgebildet. Wie sich zeigt, treten Unterschiede in der Aktivität auf. Dabei spielt offensichtlich vor allem die Ladung der Substituenten eine Rolle, da die Säureamid substituierte Form des Adamantan (12) erneut erhöhte katalytische Aktivität aufweist. Die leicht verminderte Aktivität von Verbindung 13 könnte auf sterische Effekte zurückzuführen sein. Daher ist offensichtlich die Adamantylstruktur entscheidend für die katalytische Aktivität, während der Seitenkette" modulierende Eigenschaften zugesprochen werden können.
Tabelle 6: Analyse homologer Verbindungen am Beispiel von Adamantanethanol. Strukturformeln des durch die Analyse identifizierten Katalysators Adamantanethanol und sechs homologer, in der Bibliothek enthaltenen Verbindungen.
1 .8.3 Additive Effekte
Die Beobachtung, dass die identifizierten Verbindungen der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3 sich unterschiedlich auf die einzelnen allelischen Varianten auswirken, könnte den Rückschluss erlauben, dass die getesteten Verbindungen verschiedene katalytische Zentren auf dem MHC-Komplex angreifen. Für diese Annahme könnte auch die große strukturelle Diversität der gefundenen Substanzen sprechen. Sollte dies tatsächlich zutreffen, so könnte sich die Wirkung der einzelnen Katalysatoren bei gemeinsamer Inkubation addieren, bzw. sogar potenzieren. Deshalb wurde folgendes Experiment durchgeführt. In einem Ansatz zur Beladung von HLA-DR1 mit HA-biot. wurde je ein Katalysator in der fixen Konzentration von 0,05mM vorgelegt. Pro Ansatz wurde dann dieselbe Konzentration an einem zweiten Katalysator zugegeben. Als Kontrollen wurde einmal 1 %DMSO addiert und als Negativkontrolle wurde eine Reaktion mit zweimal 1 %-DMSO angesetzt. Die Reaktionen wurden dann wie bereits beschrieben für 40min inkubiert und die Beladung in einem Sandwich-ELISA gemessen.
Im Ergebnis ergibt sich in diesem Versuch eine relative Erhöhung der Beladung um ca. 10%(+DMSO). Verdoppelt man die Menge an 2-HBP (+2-HBP) erhöht sich dieser Wert erwartungsgemäß, da, wie bereits gezeigt wurde, der Effekt konzentrationsabhängig ist. Die Zugabe von 0,05mM AdaEtOH steigert die Beladung allerdings bis auf fast 50% und deutet damit eine drastische Verstärkung des katalytischen Effekts an.
2. Versuche auf zellulärer Ebene
2.1 Analyse der Wirkung auf MHC exprimierende Zellen
Für den Nachweis einer möglichen physiologischen Relevanz solcher Verbindungen wurde die Aktivität der zuvor identifizierten Verbindungen auf Zellen analysiert. Dafür wurde im Folgenden der Einfluss von AdaEtOH, DPHIA und 4-HBP auf MHC- Klasse II exprimierende Zelllinien untersucht.
2.1.1 Toxizität
Neben der Anforderung, dass die in der Bibliothek identifizierten Substanzen eine erhöhte katalytische Aktivität aufweisen sollten, wurde als zweites Kriterium zur Beurteilung eine verminderte oder äquivalente Toxizität verglichen mit pCP gefordert. Für AdaEtOH wurde zwar eine toxische Wirkung gezeigt, jedoch zeigt AdaEtOH im ELISA eine wesentlich größere katalytische Aktivität. Das bedeutet, dass es eventuell in Konzentrationen eingesetzt werden könnte, die um einen so großen Faktor erniedrigt sind, dass toxische Effekte ausgeschlossen werden können. Der Einsatz von Konzentrationen an AdaEtOH im unteren μM-Bereich, wie er im ELISA nachgewiesen werden konnte, würde dafür geeignete Voraussetzungen bieten. Das gleiche gilt auch für DPHIA, das sogar noch geringere toxische Effekte als AdaEtOH oder 4-HBP aufweist und im ELISA ähnlich gute Ergebnisse lieferte wie AdaEtOH.
2.1.2 Beladung membranständiger MHC-Komplexe
Aufgrund der aus den vorhergehenden Experimenten erhaltenen Ergebnisse, wurden im folgenden Zeilbeladungsexperimente mit L57.23 (HLA-DR1 , DRB1 *O1 O1 ) und L243.6 Zellen (HLA-DR4, DRB1 *0401 ) angesetzt. Dabei wurde die Beladung der Zellen mit 8μM HA-biot. durch AdaEtOH, DPHIA, und 1 ,2-Dichlor-4,5- Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. Fig. 9) in den Konzentrationen 0,1 mM, 0,05mM und 0,025mM katalysiert. Als Kontrolle wurde die Beladung mit pCP in den Konzentrationen 1 mM, 0,5mM und 0,25mM verwendet. Zur Einstellung des Systems wurde wiederum die Expression der MHC-Komplexe auf der Zelloberfläche gemessen. Das Ergebnis der Beladungen für pCP und AdaEtOH ergibt, dass AdaEtOH eine fast ebenso hohe Beladung der membranständigen HLA-DR1 - Komplexe im Vergleich zu pCP bei zehnfach niedrigeren Konzentrationen katalysiert. Die Beladung von HLA-DR4-Komplexen ergibt sogar eine erhöhte Beladung im Vergleich zu pCP bei einem Zehntel der Konzentration. Damit konnte sowohl mit löslichen MHC-Molekülen als auch in MHC-exprimierenden Zellen eine drastische Verbesserung der katalytischen Aktivität im Vergleich zu pCP erzielt werden. 3. Vergleichsversuche
3.1 Katalyse der Beladung löslicher HLA-DR1 Moleküle durch Adamantylverbindungen
Im vorliegenden Experiment wurden p-Chlorphenol (pCP), 2-(1-Adamantyl)-Ethanol (AdEtOH) und 3-(1 -Adamantyl)-5-Carbohydrazidpyrazol (AdCaPy) zur Katalyse der Beladung von leeren löslichen HLA-DR1 Molekülen mit dem HA306-318 Peptid eingesetzt. Die Reaktionen wurden in Anwesenheit von 250 μM pCP, AdEtOH oder AdCaPy durchgeführt. Die erhaltene Beladung wurde anschließend unter Verwendung von biotinyliertem Peptid im ELISA bestimmt (siehe Figur 1 ). Wie aus Figur 1 deutlich hervorgeht, sind alle drei Katalysatoren grundsätzlich in der Lage, die Reaktion zu beschleunigen. Verglichen mit der pCP Kurve sind die entsprechenden Kurven der Adamantylverbindungen jedoch um mehr als eine Zehnerpotenz nach links verschoben, d.h. sie sind mindestens 10-fach aktiver als pCP.
3.2 Katalyse der Beladung von HLA-DR Molekülen auf der Zelloberfläche
Im vorliegenden Versuch wurde die Katalyse der Beladung von HLA-DR Molekülen auf der Zelloberfläche untersucht und Dosis-Wirkungskurven zur Beladung von Fibroblastenzellen mit dem HA306-318 Peptid erstellt. Die Zellen wurden dafür 4 h mit dem Peptid sowie mit titrierten Mengen an pCP, AdEtOH oder AdCaPy bei 37°C in Kulturmedium inkubiert. Durch Verwendung eines biotinylierten Peptides konnte anschließend nach Färbung der Zellen mit fluoreszierendem Streptavidin die Menge an gebundenem Peptid auf L57.23 und auf L243.6 detektiert werden, welche HLA- DR1 (DRB1 *0101 ) bzw. HLA-DR4 (DRB1 *0401) exprimieren, zwei MHC Klasse Il Moleküle, welche das HLA306-318 Peptid präsentieren können. Das Fehlen jeglicher Färbung der L929 Zellen zeigt an, dass alle Katalysatoren selektiv die Bindung an die Oberflächen-MHC-Moleküle verstärken. Ein Vergleich der Dosis- Wirkungskurven bestätigt dabei das Ergebnis mit den löslichen MHC-Molekülen (siehe auch Figur 1 ). Auch hier erweisen sich die getesteten
Adamantylverbindungen wesentlich aktiver als pCP und beschleunigen die Beladung der Zellen bereits bei einer Konzentration von deutlich weniger als einem Zehntel der entsprechenden pCP Konzentration.
3.3 Verstärkung der T-Zellantwort durch die Katalyse der Beladung von HLA- exprimierenden Zellen.
Im vorliegende Vergleichsversuch wurde die Verstärkung der T-Zellantwort durch die Katalyse der Beladung von HLA-exprimierenden Zellen untersucht. Dafür wurden die Dosis-Wirkungskurven der Immunantwort von zwei verschiedenen HLA- DR1 -restringierten T-Zellen erstellt und dafür HLA-DR-exprimierende 721.221 Zellen wie im Vergleichsversuch 3.2 beschrieben, für 4 h mit titrierten Mengen an pCP, AdEtOH oder AdCaPY inkubiert. Als Peptidantigen wurde dabei entweder HA306-318 (siehe auch Figur 3, linkes Feld) oder CO260-273 (siehe auch Figur 3, rechtes Feld) verwendet. Nach der Beladung wurden die Zellen gewaschen und dazu verwendet, EvHA/X5 bzw hCII 19.3 Zellen zu stimulieren. In beiden Fällen wird die Immunantwort der T-Zellen durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen AdEtOH oder AdCaPY deutlich verstärkt. Der Vergleich der Dosiswirkungen ergibt damit, dass ebenfalls bezüglich der T-Zellantwort die Adamantylverbindungen etwa 10-1000-fach effektiver sind als pCP.
3.4 Allelspezifische Wirkung der Katalyse durch Adamantylverbindungen
Zur Untersuchung der allelspezifischen Wirkung der Katalyse durch Adamantylverbindungen wurden HLA-DR4 (DRB1 *0401 ) und HLADR2 (DRB1 *1501)-exprimierende Zellen unter Anwesenheit der Katalysatoren mit HA306-318 bzw. MPB86-100 beladen und anschließend im T-Zellassay eingesetzt. Zur Auswertung wurden Dosis-Wirkungskurven einer HLA-DR4- (Figur A1 linkes Feld) und einer HLA-DR2-restringierten T-Zellantwort (Figur A1 rechtes Feld) erstellt. Während die Dosis-Wirkungskurven der HLA-DR4-restringierten 8475/94 T-Zellen, denen der zuvor in Vergleichsexperiment 3.3 beschriebenen HL-DR1 -restringierten T-Zellen entspricht, ist bei den Kurven der HLA-DR2 restringierten 08073 T-Zellen ein deutlicher Unterschied zu erkennen. Im Gegensatz zu pCP, das auf allen untersuchten HLA-DR Molekülen verstärkend wirken kann, wirken die Adamantylverbindungen offensichtlich allelspezifisch.
3.5 Untersuchung der Ursachen der Allelspezifischen Wirkung
Die allelspezifische Wirkung der Adamantylverbindungen beruht offensichtlich auf der Interaktion mit der , tiefen1 Pl Tasche. Da die allelspezifische Wirkung der Adamantylverbindungen offensichtlich mit einem Dimorphismus an der Position 86 der HLA-DR ß-Kette korreliert, wurde zur Untersuchung dieser Annahme eine entsprechende Mutation im HLA-DR2 (DRB1 *1501 ) Molekül durchgeführt und anschließend in Fibroblastenzellen exprimiert. Die Ergebnisse sind in Figur 5 dargestellt Figur 5 zeigt einen Vergleich der Dosis-Wirkungskurven der Katalyse der Bindung von MBP86-100 an das HLA-DR2 Wildtyp Molekül (siehe Figur, linke Abb.) und an das mutierte HLA-DR2 Molekül, bei dem der Valinrest an der Position 86 durch Glycin ersetzt wurde (siehe Figur, rechte Abb.). Während Adamantanethanol am nicht-mutierten HLA-DR2 Molekül der Fibroblastenzellen keine Katalyse bewirken kann wie an den in Figur 4 beschriebenen MGAR Zellen, bewirkt die V— »G Substitution, dass das mutierte HLA-DR2 Molekül wieder für die Adamantyl- vermittelte Katalyse empfänglich wird. Da bekannt ist, dass der Glycin/Valin- Dimorphismus die Tiefe der Bindungstasche P1 bestimmt, wobei 86G mit einer tiefen Tasche korreliert, vermitteln Adamantylverbindungen demnach ihre katalytische Aktivität offensichtlich durch ihre Bindung an eine tiefe P1 Tasche.
3.6 Katalyse einer HLA-DR1 (DRB1 *Ol 01 )-restringierten T Zellantwort
Zur Untersuchung der Katalyse einer HLA-DRl (DRBl *0101 )-restringierten T Zellantwort durch verschiedene katalytisch aktive Adamantylverbindungen wurden Dosis-Wirkungskurven der Katalyse einer HLA-DRl (DRBl *0101 )-restringierten T Zellantwort erstellt. Das Experiment wurde analog zu Vergleichsexperiment 3.3 durchgeführt, wobei das Peptidantigen HA306-318 auf 721 .221 Zellen geladen wurde, um damit EvHA/X5 T-Zelien zu stimulieren. Die Ergebnisse werden in Figur 6 dargestellt. Die dargestellten Dosis- Wirkungskurven zeigen, dass alle aufgeführten Adamantylverbindungen eine katalytische Aktivität besitzen. Der z.T. sehr unterschiedliche chemische Charakter der Seitenketten legen den Schluss nahe, dass die Wirkung im wesentlichen durch die Adamantylgruppierung vermittelt wird. Da die Lage der Dosis-Wirkungskurven offensichtlich auch von der Seitenkette bestimmt wird, kann der Seitenkette eine modulierende Wirkung zugesprochen werden.
3.7 Beladung von MHC Klasse 11 Tetrameren mittels Adamantylverbindungen.
Im vorliegende Vergleichsversuch wurde die Beladung von MHC Klasse Il Tetrameren mittels Adamantylverbindungen näher untersucht. Dazu wurden folgende Tetramere eingesetzt: HA- Tetramere, HLA-DR1 - Tetramere, die vom Hersteller (Proimmune Ltd.) bereits mit dem T Zellantigen HA306-318 beladen bezogen wurden und IC-Tetramere, welche das nichtrelevante Peptid IC106-120 tragen.
A) Um nachzuweisen, dass Adamantylverbindungen die Beladung von Tetrameren katalysieren können, wurden IC-Tetramere über Nacht mit AdEtOH und HA306-318 inkubiert. Als Kontrolle wurde zudem eine Beladung mit einen nicht-relevanten Peptid (ABL) durchgeführt. Nach Färbung der Zellen mit den Komplexen ergab die durchflußzytometrische
Analyse, dass die PD2 T Zellen, welche mittels Adamantylethanol beladenen Tetrameren gefärbt wurden, ein ähnlich hohes Signal lieferten, wie die vorgefertigten HA-Tetramere.
B) Um sicherzustellen, dass der Austausch des IC-Peptides durch das HA-Peptid tatsächlich auf die Katalyse durch das Adamantylethanol zurückzuführen ist, wurde in einem zweiten Experiment der Ligandenaustausch in Anwesenheit sowie in Abwesenheit des Adamantylethanols durchgeführt. Die dabei entstandenen Komplexe wurden ebenso wie das unbehandelte IC-Tetramer anschließend wieder zur Färbung der PD2 Zellen, sowie als Negativkontrolle zur Färbung von HLA-DRw52a (DRB3*OlO1)-restringierten TT1272-1284 spezifischen A10 T Zellen verwendet. Wie aus dem Balkendiagramm in Figur
7 ersichtlich ist, werden auch in diesem Experiment die HA306-318- spezifischen PD2 Zellen mit denen durch Adamantylethanol katalysierten Tetrameren gefärbt. Dagegen wird keine nennenswerte Färbung mit den Komplexen beobachtet, bei denen eine Beladung ohne Katalysator versucht wurde. Die mit Hilfe des Adamantylethanols entstandenen Komplexe weisen zudem die geforderte Antigenspezifität auf, da A 10 T Zellen im Gegensatz zu den PD2 nicht gefärbt werden.
Die Ergebnisse aus Vergleichsversuch 3.7 werden in Figur 7 dargestellt. Figur 7 zeigt die Ergebnisse durchflußzytometrischer Messungen von HLA-DR1 -restringierten humanen T Zellen (PD2), welche mit fluoreszenzmarkierten peptidbeladenen HLA- DR1 Tetrameren gefärbt wurden.
3.8 Untersuchung von Verbindungen, die ebenfalls über die tiefe Pl Tasche wirken.
Neben den Adamantyl Verbindungen wurden nach den vorher beschriebenen Verfahren weitere Verbindungen identifiziert, welche die gleiche Allelspezifität aufweisen wie die Adamantylverbindungen, 2-(7,7-Dichlor-6-methyl- bicyclo[4.1.0]heptan-3-yl)-propan-2-ol (#4230) und 6-Methoxybenzofuran-3(2H)- on-oxim (#3651 ). Trotz sehr unterschiedlicher chemischer Struktur weist dabei zumindest #4230 eine Raumstruktur auf, welche der der Adamantylgruppe sehr ähnlich ist. Bei diesen zusätzlich bestimmten Verbindungen wurde die Aktivität und Allelspezifität mit den HLA-DR1 -restringierten HA306-318-spezifischen EvHA/X5 T- Zellen und den HLA~DR2-restringierten MBP86-100 spezifischen 08073 T Zellen getestet. Auf HLA-DRI weist #4230 eine katalytische Aktivität auf, welche ungefähr der des Adamantylethanols entspricht. #3651 ist dagegen schwächer, weist jedoch immer noch höhere Aktivität auf als das pCP. Auf HLA-DR2 weisen beide Verbindungen keine Aktivität auf, weshalb sie vermutlich, ähnlich wie die Adamantylverbindungen, ihre katalytische Wirkung durch die Bindung an die tiefe Pl Tasche vermitteln. Die Ergebnisse aus Vergleichsversuch 3.8 werden in Figur 8 dargestellt.
3.9 Untersuchung der Aktivität verschiedener katalytisch aktiver Phenol- /Anilinverbindungen.
Im vorliegende Vergleichsversuch wurde die katalytische Aktivität der Beispielsubstanzen an der beschleunigten Beladung von löslichen HLA-DR1 Molekülen mit dem HA306-318 demonstriert. Ein Vergleich der Dosis- /Wirkungskurven zeigt, dass alle Verbindungen in einem sehr ähnlichen Wirkungsbereich liegen, wobei insbesondere DCC und pHDP leicht erhöhte Aktivität zeigen. Die Ergebnisse werden in Figur 9 dargestellt.
3.10 Katalyse der HLA-DR Beladung
Im Folgenden wurde die Katalyse der HLA-Beladung durch pCP zum Vergleich bestimmt. Dazu wurden Dosis-Wirkungskurven des Adamantylethanol (AdEtOH) und des pCP mittels T Zellassays, wie in Vergleichsversuch 3.3 beschrieben, bestimmt. Diese Dosis-Wirkungskurven illustrieren die Wirkung der beiden Katalysatoren auf HLA-DR Molekülen mit tiefer oder flacher Pl Tasche {ß86G bzw. ß86V} sowie auf die Maus MHC Klasse II Moleküle H2-Ek und H2-Ak. Mit dem vorliegenden Versuch konnte gezeigt werden, dass die Katalyse der HLA-DR Bindung unabhängig von der Tiefe der P1 Tasche ist. Die Ergebnisse werden in Figur 10 dargestellt. 3.1 1 Katalytische Aktivität von Thiophenverbindungen
Zur Untersuchung der katalytischen Aktivität von verschiedenen katalytisch aktiven Thiophenverbindungen wurde beispielhaft die Aktivität von drei Beispielverbindungen anhand der Dosis/Wirkungskurven der Stimulation HLA-DR1 - restringierten EvHA/X5 T-Zellen bestimmt. Der Versuch wurde wie unter Vergleichsversuch 3.3 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 1 dargestellt. Ähnlich wie bei den aktiven Phenol/Anilinverbindungen ist auch hier die Aktivität offensichtlich unabhängig vom ß86-Dimorphismus der HAL-DR Moleküle. Wie in diesem Beispiel gezeigt, wird mit der Verbindung ATC deshalb die Peptidbeladung sowohl von Fibroblasten katalysiert, welche entweder HLA-DR1 (DRB1 *0101 ; ß86G) oder auch HLA-DR2 (DRB1 *1501 ; ß86V) exprimieren. Die Tiefe der P1 Tasche spielt demnach auch bei den Thiophenverbindungen offensichtlich keine Rolle. Die katalytische Aktivität der bislang identifizierten aktiven Verbindungen dieser Verbindungsklasse ist stärker als die des pCP.
3.12 Katalytische Aktivität von spezifischen katalytisch wirksamen Verbindungen
Die experimentellen Daten wurden in einem MHC-Beladungsassay mit löslichem rekombinant hergestelltem HLA-DR1 (DRB1 *0101 ) erhoben. Hierzu wurden die MHC Moleküle mit biotinyliertem HA306-318 für etwa 1 h in Anwesenheit titrierter Mengen an Kleinmolekülen (in verschiedenen Konzentrationen) inkubiert. Die Menge an Peptid/MHC-Komplexen, welche sich innerhalb dieser Zeit gebildet haben, wurde anschließend mittels eines ELISA Assays bestimmt (,capture' Antikörper: anti-HLA-DR; Detektion: fluoreszenzmarkiertes Streptavidin). Die Reihung der Aktivitäten der einzelnen Verbindungen wurde anhand der dabei gewonnenen Dosis/Wirkungskurven vorgenommen.
3.13 Messung der Verstärkung der DC-vermittelten T Zellantwort durch AdEtOH.
Dendritische Zellen (DC) sind eine der wichtigsten Untergruppen der
/professionellen' antigenpräsentierende Zellen. Daher wurden im vorliegenden Ausführungsbeispiel DC von HLA-DR1 (DRB1 *0101 )-transgenen Mäusen verwendet, welche für 4h mit biotinyliertem HA306-318 Peptid beladen wurden. Anschließend wurden die Zellen zur Bestimmung der Peptidbeladung mit Streptavidin-APC (SA- APC) sowie mit anti-HLA-DR gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert (Figur 14A).
3.14 Verwendung von Vakzinierungsadditiven und Einsatz für die Immunisierung
In diesem Beispiel wurden HLA-DR1 (DRB1 *0101 ) transgene Mäuse mit 10 mg einer rekombinant hergestellten Domäne des ABL Proteins immunisiert. Die Immunisierung erfolgte dabei durch subkutane Verabreichung einer Emulsion des Antigens in kompletten Freund's Adjuvans, wobei dieser bei der einen Gruppe zusätzlich mit 10 mM AdEtOH versetzt wurde. Die durch die Vakzinierung ausgelöste Immunantwort wurde dann 12 Tage später mittels eines ELISPOT Assays überprüft. Hierzu wurden jeweils etwa 106 Lymphknotenzellen/well in mit Membranfiltern beschichteten Kulturplatten überführt und mit titrierten Mengen des Antigens restimuliert. Die Aktivierung einer Zelle führt zur Freisetzung von Zytokinen, wie z.B. IFN-g, welche auf der Membran mit entsprechenden Antikörpern nachgewiesen werden können (s. Fig. 15).
3.15 Verwendung eines Verfahrens zur MHC-Beladung zur Identifizierung immuntoxischer Verbindungen
Hierzu wurde rekombinant hergestelltes lösliches HLA-DRl (DRB1 *O1O1) für 4h mit biotinyliertem HA306-318 Peptid in Anwesenheit der (in Figur 16) angezeigten Mengen der Testsubstanzen inkubiert und anschließend die gebildeten Peptid/MHC Komplexe mittels ELISA nachgewiesen Ocapture' Antikörper: anti-HLA-DR; Detektion mit Fluoreszenz- oder Enzymmarkiertem Streptavidin). Die Ergebnisse sind in Figur 16 bzw. in der entsprechenden Figurenbeschreibung dargestellt. 4. Vorteile der Erfindung
Im Rahmen dieser Erfindung wurden Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden unter Verwendung von Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 entwickelt, die im Vergleich zur Verwendung des bereits bekannten Katalysators pCP bspw. für Adamantanethanol (AdaEtOH), Dichlorophenylhydroxyiminoacetamid (DPHIA) und 4-Hydroxybiphenyl (4-HBP) bei Konzentrationen oberhalb von 0,025mM eine Erhöhung der Beladung katalysieren. Es ist im Rahmen dieser erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls möglich eine Verringerung der Beladung von MHC-Molekülen mit Liganden, gegebenenfalls bis zur vollständigen Entfernung, zu erreichen sowie alternativ einen Austausch von Liganden von MHC-Molekülen unter Verwendung der Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 zu erzielen. Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 (Katalysatoren) führen zu einer Konformationsänderung der MHC- Moleküle von einer geschlossenen nicht-rezeptiven Konformation in eine offene rezeptive Konformation, die eine Beladung bzw. einen Austausch. der Liganden der MHC-Moleküle erst ermöglicht. Im Vergleich zu pCP wurde mit Hilfe der erfindungsgemäß verwendeten Katalysatoren eine deutliche Verbesserung der zur Konformationsänderung benötigten Konzentration an katalytisch aktiven Verbindungen erreicht. Damit erlauben die erfindungsgemäß verwendeten Katalysatoren höhere Wirksamkeiten, die den Einsatz solcher Verbindungen im Tierversuch ermöglichen.
Weiterhin wurden erstmals durch die im Rahmen dieser Erfindung verwendeten Verbindungen der Formeln I, IA, II, III und IV1 bis IV3 effiziente Möglichkeiten zur Auslösung tumorspezifischer, pathogenspezifischer oder autoreaktiver Immunantworten bereitgestellt, sowie Möglichkeiten zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind. Weiterhin wird durch die Bereitstellung eines Vakzins oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung eine Behandlung von Krebs, Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen oder die Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen ermöglicht.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel I oder IA mit der folgenden Struktur:
Formel
oder
Formel IA, wobei:
R0, R00, R1, R2, R3 , R4 , R5, R6, R7, R8, R9 , R10 , R11, R12, R44 R66 , R77 , R", R1010 und R1111 eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13,
SH, SO, SO2, SO2R13, SO3, HSO3, SR13, SR13R14, S(CH2)nR13, S(CHn)R13; S(CH2)n(CH)nR13, S(CH2)n(CH)nR13,
NH, NH2, NHNH2, NHR13, NR13R14, NO, NO2, NOH, NOR13,
X, CX3, CHX2, CH2X, CR13X2, CR2 13X, CR3 13, wobei X = Halogen,
CN, CO, COR13, COOH, COOR13,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH2)nR13, (CH)nR13, (CH)n(CH2)nCH3; (CH2UCH)nCH3; (CH)n(CH2)nR13; (CH2)n(CH)nR13; C(R13)C(R14)CH3,
C(R13)(CH2)nR14, (CH2)nR13, (CH)n(OH)R13; (CH2)n(OH)R13;
(CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; OCH3, O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3, O(CH2)nR13, 0(CH)nR13, O(CH)n(CH2)nR13, O(CH2)n(CH)nR13, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH2)nOR13, (CH)nOR13, (CH)n(CH2)nOR13, (CH2)n(CH)nOR13, (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; (CH)n(OH)R13;
(CH2)n(OH)R13; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X; (CH2)nX, (CH)nX, (CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX; (CH2)n(CH)nX; OCH2X, O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX, O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X, (CH2)nNHR13, (CH2)nNHOR13, (CH2)nNHCOR13, (CH2)nN(R13)CO,
N(Rl3)(CH2)nR14, N(R13)(CH)nR14, N(R13)(CH)n(CH2)nR14,
N(Rl3)(CH2)n(CH)nR14, N(R13)COR14, N(R13)COOR14, CONH2, CONHCH3, C3H6OH, C(NH2)(CH2)n(OH), OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3; ' OCONH(CH2)n(CH)nCH3; (CH)nOR13, (CH2)nOR13, C6N2H5, C6H4(NHCOCH3), C6H4SO2NH, (CNNHC(CONHNH2)CH2), und
C6N2H7, wobei n = 1 bis 30 ist, und
R13 und R14 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N, OH, OR15, SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15, SR15R16, S(CH2)nR15, S(CHn)R15;
S(CH2)n(CH)nR15, S(CH2)n(CH)nR15,
NH, NH2, NHNH2, NHR15, NR15R16, NO, NO2, NOH, NOR15, X, CX3, CHX2, CH2X, CR15X2, CR2 15X, CR3 15, wobei X = Halogen, CN, CO, COR15, COOH, COR15, COOR15, CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH2)nR15, (CH)nR15, (CH)n(CH2)nCH3;
(CH2)n(CH)nCH3; (CH)n(CH2)nR15; (CH2)n(CH)nR15; OCH3, O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3, O(CH2)nR15, 0(CH)nR15, O(CH)n(CH2)nR15,
O(CH2)n(CH)nR15, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH2)nOR15, (CH)nOR15, (CH)n(CH2)nOR15, (CH2)n(CH)nOR15, (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; (CH)n(OH)R15; (CH2)n(OH)R15; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X;
(CH2)nX, (CH)nX, (CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX; (CH2)n(CH)nX; OCH2X, O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX, O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X, (CH2)nNHR15, (CH2)nNHOR15, (CH2)nNHCOR15, NR15(CH2)nR16, NR15(CH)nR16, NR15(CH)n(CH2)nR16, NR15(CH2)n(CH)nR16,
OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3; OCONH(CH2)n(CH)nCH3; (CH)nOR15, (CH2)nOR13, C6N2H5, C6H4(NHCOCH3), C6H4SO2NH,(CNNHC(CONHNH2)CH2),
Adamantan, Triazol, Tetrazol, Pyrazoi, und Oxazol; wobei n = 1 bis 30 ist, und R15 und R16 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, SH, SO, SO2, SO3, HSO3,
NH, NH2, NHNH2, NO, NO2, NHNH2, NOH,
X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH)π(CH2)nCH3; (CH2)n(CH)nCH3; OCH3, O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH)n(OH)CH3;
(CH2)n(OH)CH3; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X; (CH2)nX, (CH)nX,
(CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX; (CH2)n(CH)nX;
OCH2X, O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX,
O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X, OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3;
OCONH(CH2)n(CH)nCH3; C6N2H5, C6H4(NHCOCH3),
C6H4SO2NH,(CNNHC(CONHNH2)CH2), Adamantan, Triazol, Tetrazol,
Pyrazol, und Oxazol;
und/oder
R0 D00 D1 E>2 p3 r>4 p5 p6 p7 p8 p9 p10 pH D12 D^4 D56 D77 D99 , K , K , K , K , K , t\ , K , t\ , l\ , l\ , K , K. , K , K. K , K f K ,
R1010 und R1111 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-C30- Alkyl, C,-C30~Alkenyl, Q-Qo-Heteroalkyl, Q-Qo-Heteroalkenyl, C1-
C30-Alkoxy, C1 -C30AI kenoxy, C1-C30, C3-C8-Cycloalkyl, C3-C8- Cycloalkenyl, C5-C30 Aryl, C5-C30-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5. 20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Heteroaryloxyrest, Adamantan, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, ToI uol,
Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrroi, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman,
Chromen, Cumarin (Chromen-2-on), und Oxazol,
c) Änderung des Beladungszustandes der MHG-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
2. Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel
Il mit der folgenden Struktur:
Formel Il
wobei:
wobei:
R1', R2', R3' und R4' eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13', SH, SO, SO2, SO2R13', SO3, HSO3, SR13', SR13'R14', X, CX3, CHX2/ CH2X, CR13 X2, CR2 13 X, CR3 13' wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOR13',
NH, NH2, NHR13', NR13'R14', NO, NO2, NOH, NOR13',
CH3, (CH2DnCH3, (CH)nCH3, (CH2)nR13', (CH)nR13', OCH3, 5 O(CH2)n, O(CH2)nCH3, O(CH2)n R13', (CH2)nOH, (CH)nOH,
(CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3, (CH2)n(CH)nR13',
(CH)n(CH2)nR13', -(C3HNO)-CHX2, (C3HNO)-COOR13',
(C3HNO)-CHR13 R14', wobei n = 1 bis 30 ist,, und 10
R13' und R14 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, OR15', SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15', SR15 R16', 15 X, CX3, CHX2, CH2X, CR15'X2, CR2 15X CR3 15' wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOR15',
NH, NH2, NHR15', NR15'R16', NO, NO2, NOH, NOR15',
CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, (CH2)nR15', (CH)nR15', OCH3,
O(CH2)n, O(CH2)nCH3, O(CH2)nR15', (CH2)nOH, (CH)nOH, 20 (CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3, (CH2)n(CH)nR15',
(CH)n(CH2)nR15', -(C3HNO)-CHX2, -(C3HNO)-CHR^R16', wobei n = 1 bis 30 ist,
R15' und R16' unabhängig voneinander aus einer Gruppe 25 ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, SH, SO, SO2, SO3, HSO3,
X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, 30 NH, NH2, NO, NO2, NOH, CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3, (CH2)nOH; (CH)nOH, (CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3, -(C3HNO)-CHX2, wobei n = 1 bis 30 ist,
und/oder
R1', R2, R3 und R4 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-C30-AIkYl, C1 -C30-Al kenyl, C,-C30-Heteroalkyl, Q-Qo-Heteroalkenyl, C1 -C30-Al koxy, C1 -C30-Al kenoxy, C1-C30-
Acyl, C3-C8-Cycloa!kyl, C3-C8-Cycloalkenyl, C3-C30-Aryl, C5-C30- Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5.30-Aryloxy,
Heteroarylalkyl, Heteroaryialkenyl, Heterocycloalkyi,
Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantylrest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd,
Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetra h yd rofu ran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin,
Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Adamantan, Pyrazol, Diazol, Tetrazol, Triazol,
und/oder
R1' und R2' gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus aus einem verzweigten oder unverzweigten C1- C8-Alkyl, C1 -C8-Al kenyl, Q-Q-Heteroalkyl, C1-C8- Heteroal kenyl, CrC8-Alkoxy, C1 -C8-Al kenoxy, C1-C8-ACyI, C3-
C8-Cycloalkyl, C3-C8-Cycloal kenyl, C5-C8-Aryl, Q-C8- Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Cs.8-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantylrest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol,
Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman,
Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Adamantan, Pyrazol, Diazol, Tetrazol, Triazol, wobei an jedem einzelnen der Atome der verbrückten Struktur, bevorzugt 1 bis 12 Atome, unabhängig voneinander ein oder 2 Substituenten, ausgewählt aus den zuvor definierten R1' oder R2', auftreten kann/können,
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
3. Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel III mit der folgenden Struktur:
Formel III
wobei: R1 " und R2 " eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13", SH, SO, SO2, SO2R13", SO3, HSO3, SR13", SR13"R14",
S(CH2)n(CH4N);
X, CX3, CHX2, CH2X, CR13"X2, CR2 13"X wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3, COOR13", NH, NH2, NHR13", NR13"R14", NR13"(CO)R14"; NO, NO2, NOH,
CHNOH, NOR13",
CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR13", (CH)nCR13"R14", OCH3, O(CH2)n,
O(CH2)nCH3; O(CH2)nR13", (CH2DnOH, C4H2O(CH3); (C3H2NO)(R13"),
(O(CH2)nCH(R13")S(O2)); (C(CH3)(CH2)nNHC(O)S), ((CH2)nN(CH2)nC(R13")S), (CHC(R13^N(R14INC(R13"), NR13"(CH2)nR14", und (C2H3N2O(NR13"R14"), wobei n = 1 bis 30 ist, und
R13" und R14" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, OR15", SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15", SR15"R15",
SC(CX3)XCOOR15",
X, CX3, CHX2, CH2X, CR15"X2, CR2 15"X wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOCH3, COOR15",
NH, NH2, NHR13", NR15"R16", NO, NO2, NOH, NOR15",
CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR15", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3;
O(CH2)nR15", (CH2)nOH, C6H4CH3, C6H9, C3H5N2O2, (C3H2NS)(R15"), und (N(R15X3HNO(R16")), CH(R15")(CH2)nR16", wobei n = 1 bis 30 ist, und R15" und R15" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N,
OH, SH, SO, SO2, SO3, HSO3, X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3, NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; und (CH2)nOH, wobei n = 1 bis 30 ist,
und/oder
R1" und R2" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-C30- Alkyl, Q-Qo-Alkenyl, Q-Qo-Heteroalkyl, Q-Qo-Heteroalkenyl, C1-
C30-Alkoxy, C1-C30-AIkBnOXy, C1-C30-ACyI, C3-C8-Cycloalkyl, C3-C8- Cycloalkenyl, C5-C30-Aryl, Q-C30-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5. 30-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest; Toluol, Anilin, Benzaldehyd,
Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin,
Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Diazol, Tetrazol, Pyrazol, C3H2S2O, gesättigtes oder nicht-gesättigtes C6.8-Lacton, und Succinimid,
und/oder entweder wie für R1" und R2 definiert sind oder eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR13", SR13"R14",
X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, CR13"X2, CR2 13 X CR3 13" wobei X
= Halogen,
CN, CO, COOH, COOR13", NH, NH2, NHR13", NR13"R14", NO, NO2, NOH, NOR13",
CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR13", OCH3, O(CH2)n/ O(CH2)nCH3;
O(CH2)nR13", (CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3,
S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONQNHCH2(N4CH),
NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3, SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2,
C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(CSH4N),
CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O),
C6H4S(O)2NH, C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, und Adamantyl; wobei n = 1 bis 30 ist, und
R13" und R14" unabhängig voneinander ausgewählt werden aus
H, O, S, N,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15", SR15"R16",
X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, CR1S"X2, CR2 15X CR3 15" wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOR15",
NH, NH2, NHR15", NR15"R16", NO, NO2, NOH, NOR15",
CH3, (CH2)nCH3, (CH2)nR15", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; O(CH2)nR15",
(CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3, S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH), NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2),
SCFCF3COOCH3, SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2, C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5,
NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(C5H4N), CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O), C6H4S(O)2NH,
C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, Adamantyl; wobei n = 1 bis 30 ist, und
R15" und R16 " unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N, SH, SO, SO2, SO3, HSO3,
X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3,
NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; (CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3, S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH),
NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3,
SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2,
C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(C5H4N),
CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O), C6H4S(O)2NH, C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, und Adamantyl; wobei n = 1 bis 30 ist,
und/oder
R3" und R4 " können unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-C30-AIkYl, C1-C30-Al kenyl, Q-Qo-Heteroalkyl, C1- C30-Heteroalkenyl, C1-C30-AIkOXy, Q-Qo-Alkenoxy, C1-C30-ACyI, C3-C8- Cycloalkyl, C3-C8-Cycloalkenyl, C5-C30-Aryl, C3-C30-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Cs.30-Aryloxy, Heteroarylalkyl,
Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamidorest, Acylaminorest, Amidinorest, Adamantylrest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran,
Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Diazol, Tetrazol, Pyrazol, C3H2S2O, gesättigtes oder nicht-gesättigtes Q.8-Lacton, und Succinimid;
und/oder
R3" und R4" gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus einem verzweigten oder unverzweigten CrC8-Alkyl, C1 -C8-Al kenyl, C1-
C8-Heteroalkyl, CrC8-Heteroalkenyl, CrC8-Alkoxy, C1 -C8-Al kenoxy, CrC8-Acyl, C3-C8-Cycloalkyl, C3-C8-Cycloal kenyl, C5-C8-Aryl, C5-C8- Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5.8-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylal kenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloal kenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantylrest,
Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan,
Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Diazol, Tetrazol, Pyrazol, C3H2S2O, gesättigtes oder nicht-gesättigtes C6.8-Lacton, und Succinimid, wobei an jedem einzelnen der Atome der verbrückten Struktur, bevorzugt 1 bis 12 Atome, unabhängig voneinander ein oder 2 Substituenten, ausgewählt aus R1" oder R2", auftreten kann/können,
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass
R0, R00, R1, R2, R3 , R4 , R5, R6, R7, R8, R9 , R10 , R", R12, R44 R66 , R77 , R", R1010 und R1111 können gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden bestehend aus:
H, O, S, N, OH, OR13,
SH, SO, SO2, SO2R13, SO3, HSO3, SR13, SR13R14, S(CH2)nR13, S(CHn)R13; S(CH2)n(CH)nR13, S(CH2)n(CH)nR13, NH, NH2, NHNH2, NHR13, NR13R14, NO, NO2, NOH, NOR13, X, CX3, CHX2, CH2X, CR13X2, CR2 13X, CR3 13, wobei X = Halogen, CN, CO, COR13, COOH, COOR13,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH2)nR13, (CH)nR13, (CH)n(CH2)nCH3; (CH2)n(CH)nCH3; (CH)n(CH2)nR13; (CH2)n(CH)nR13;
C(R13)C(R14)CH3, C(R13)(CH2)nR14, (CH2)nR13, (CH)n(OH)R13;
(CH2)n(OH)R13; (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; OCH V O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3, O(CH2)nR13, 0(CH)nR13,
O(CH)n(CH2)nR13, O(CH2)n(CH)nR13, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH2)nOR13, (CH)nOR13, (CH)n(CH2)nOR13, (CH2)n(CH)nOR13, (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; (CH)n(OH)R13; (CH2)n(OH)R13; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X; (CH2)nX, (CH)nX, (CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX;
(CH2)n(CH)nX; OCH2X, O(CH2)nCH2X, Q(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX, O(CH)n(CH2)Λ O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3/ (CH)nOCH2X, (CH2)nNHR13, (CH2)nNHOR13, (CH2)nNHCOR13, (CH2)nN(R13)CO, N(Rl3)(CH2)nR14 / N(Rl3)(CH)nR14,
N(R13)(CH)n(CH2)nRl4 / N(R13)(CH2)n(CH)nR14, N(R13)COR14,
5 N(R13)COOR14, CONH2, CONHCH3, C3H6OH,
C(NH2)(CH2)n(OH), OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3; OCONH(CH2)n(CH)nCH3; (CH)nOR13, (CH2)nOR13, C6N2H5, C6H4(NHCOCH3), C6H4SO2NH, und (CNNHC(CONHNH2)CH2), C6N2H7, 10 wobei n = 1 bis 10 ist, und
R13 und R14 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
15 H, O, S, N,
OH, OR15,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15, SR15R16, S(CH2)nR15, S(CHn)R15;
S(CH2)n(CH)nR1s, S(CH2)n(CH)nR15,
NH, NH2, NHNH2, NHR15, NR15R16, NO, NO2, NOH, NOR15, 20 X, CX3, CHX2, CH2X, CR15X2, CR2 15X, CR3 15, wobei X = Halogen,
CN, CO, COR15, COOH, COR15, COOR15,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH2)nR15, (CH)nR15, (CH)n(CH2)nCH3;
(CH2)n(CH)nCH3; (CH)n(CH2)nR15; (CH2)n(CH)nR15; OCH3,
O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3, O(CH2)nR15, 0(CH)nR15, 25 O(CH)n(CH2)nR15, O(CH2)n(CH)nR15, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3,
(CH2)nOR15, (CH)nOR15, (CH)n(CH2)nOR15, (CH2)n(CH)nOR15,
(CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; (CH)n(OH)R15; (CH2)n(OH)R15;
(CH2)nCH2X; (CH)nCH2X; (CH2)nCH2X; (CH2)nX, (CH)nX,
(CH)n(CH2)nCH2X; (CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX;
30 (CH2)n(CH)nX; OCH2X, O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX,
Q(CH)nX, O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X, (CH2)nNHR15, (CH2)nNHOR15, (CH2)nNHCOR15, NR15(CH2)nR16, NR15CCH)nR16, NR15(CH)n(CH2)nR16,
NRl5(CH2)n(CH)nR16, OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3; OCONH(CH)n(CH2)nCH3; OCONH(CH2)n(CH)nCH3; (CH)nOR15, (CH2JnOR13, QN2H5, C6H4(NHCOCH3),
C6H4SO2NH^CNNHC(CONHNH2)CH2), Adamantan, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, und Oxazol; wobei n = 1 bis 10 ist, und
R15 und R16 unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, NH, NH2, NHNH2, NO, NO2, NHNH2, NOH,
X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH,
CH3, (CH2)nCH3; (CH)nCH3; (CH)n(CH2)nCH3; (CH2)n(CH)nCH3;
OCH3, O(CH2)nCH3, 0(CH)nCH3, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH3, (CH)n(OH)CH3; (CH2)n(OH)CH3; (CH2)nCH2X; (CH)nCH2X;
(CH2)nCH2X; (CH2)nX, (CH)nX, (CH)n(CH2)nCH2X;
(CH2)n(CH)nCH2X; (CH)n(CH2)nX; (CH2)n(CH)nX; OCH2X,
O(CH2)nCH2X, 0(CH)nCH2X, O(CH2)nX, 0(CH)nX,
O(CH)n(CH2)nX, O(CH2)n(CH)nX, (CH2)nOCH3, (CH)nOCH2X, OCONH(CH2)nCH3; OCONH(CH)nCH3;
OCONH(CH)n(CH2)nCH3; OCONH(CH2)n(CH)nCH3; C6N2H5,
C6H4(NHCOCH3), C6H4SO2NH,(CNNHC(CONHNH2)CH2),
Adamantan, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, und Oxazol.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel I aus einer der folgenden Strukturen ausgewählt wird: I 1 12
I3 14
I5 16
\7 8
19 110
11 12
113 14
15 16
27 128
I 35 36
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass
R1', R2 , R3' oder R4' eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13', SH, SO, SO2, SO2R13', SO3, HSO3, SR13', SR13 R14',
X, CX3, CHX2, CH2X, CR13'X2, CR2 13X CR3 13' wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOR13',
NH, NH2, NHR13', NR13'R14', NO, NO2, NOH, NOR13', CH3, (CH2)nCH3/ (CH)nCH3, (CH2)nR13', (CH)nR13', OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3, O(CH2)n R13', (CH2)nOH, (CH)nOH, (CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3, (CH2)n(CH)nR13', (CH)n(CH2)nR13', -(C3HNO)-CHX2, (C3HNO)-COOR13', -
(C3H NO)-CH R13'R14', wobei n = 1 bis 10 ist, und R13' und R14' unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N, OH, OR15', SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15', SR15 R16',
X, CX3, CHX2, CH2X, CR151X2, CR2 15X CR3 15' wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOR15',
NH, NH2, NHR15', NR15'R16', NO, NO2, NOH, NOR15', CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, (CH2)nR15', (CH)nR15', OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3, O(CH2)nR15', (CH2)nOH, (CH)nOH,
(CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3, (CH2)n(CH)nR15',
(CH)n(CH2)nR15', -(C3HNO)-CHX2, -(C3HNO)-CHR15'R16', wobei n = 1 bis 10 ist, und
R15 und R16' unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, SH, SO, SO2, SO3, HSO3,
X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen, CN, CO, COOH,
NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)nCH3, (CH)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3,
(CH2)nOH, (CH)nOH, (CH2)n(CH)nCH3, (CH)n(CH2)nCH3,
-(C3HNO)-CHX2, wobei n = 1 bis 10 ist,
und/oder
R1' und R2' gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus aus einem verzweigten oder unverzweigten C1- Q-Alkyl, CrC8-Alkenyl, Q-Q-Heteroalkyl, C1-C8-
Heteroalkenyl, CrC8-Alkoxy, C1 -C8-Al kenoxy, CrC8-Acyl, C3- C8-Cycloalkyl, C3-C8-Cycloalkenyl, C5-C8-Aryl, C5-C8-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5.8-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantylrest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol,
Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol,
Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Adamantan, Pyrazol, Diazol, Tetrazol, Triazol, wobei an jedem einzelnen der Atome der verbrückten Struktur, bevorzugt 1 bis 12 Atome, unabhängig voneinander ein oder 2 Substituenten, ausgewählt aus den zuvor definierten R1' oder R2', auftreten kann/können.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel II aus einer der folgenden Strukturen ausgewählt wird:
IM 11 2
11 4
8. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass
R1" und R2 " eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR13", SH, SO, SO2, SO2R13", SO3, HSO3, SR13", SR13"R14", S(CH2UCH4N); X, CX3, CHX2, CH2X, CRI3"X2, CR2 13"X wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3, COOR13",
NH, NH2, NHR13", NR13"R14", NR13"(CO)R14"; NO, NO2, NOH, CHNOH, NOR13",
CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR13", (CH)nCR13"R1<", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; O(CH2)nR13", (CH2JnOH, C4H2O(CH3); (C3H2NO)(R13"), (O(CH2)nCH(R13")S(O2)); (C(CH3)(CH2)nN HC(O)S),
((CH2)nN(CH2)nC(Rl3")S), (CHC(R13")N(R14")NC(R13"), NR13"(CH2)nR14", und (C2H3N2O(NR13"R14"), wobei n = 1 bis 10 ist, und
R13" und R14" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N,
OH, OR15", SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15", SR15"R15", SC(CX3)XCOOR15", X, CX3, CHX2, CH2X, CR15"X2, CR2 15"X wobei X - Halogen, CN, CO, COOH, COOCH3, COOR15", NH7 NH2, NHR13", NR1S"R16", NO, NO2, NOH, NOR15", CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR15", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; O(CH2)nR1s", (CH2)nOH, C6H4CH3, C6H9, C3H5N2O2, (C3H2NS)(R15"), und (N(R15"C3HNO(R16")), CH(R15")(CH2)nR16", wobei n = 1 bis 10 ist, und
R15" und R16" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
H, O, S, N,
OH, SH, SO, SO2, SO3, HSO3,
X, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOCH3, NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2Jn, (CH2)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; und (CH2)nOH, wobei n = 1 bis 10 ist,
und/oder
R1" und R2" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus einem verzweigten oder unverzweigten C1-C30- Alkyl, CrC30-Alkenyl, CrC30-Heteroalkyl, CrC30-Heteroalkenyl, C1- C30-Alkoxy, C1 -C30-Al kenoxy, CrC30-Acyl, C3-C8-Cycloalkyl, C3-C8- Cycloalkenyl, C5-C30-Aryl, C5-C30-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C5.
30-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest; Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitrii, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen,
Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin (Chromen-2-on), Diazol, Tetrazol, Pyrazol, C3H2S2O, gesättigtes oder nicht-gesättigtes C6.8-Lacton, und Succinimid,
und/oder
R3" und R4 entweder wie für R1" und R2 " definiert sind oder eine Bindung sein können oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR13", SR13"R14", X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, CR13"X2, CR2 13"X, CR3 13" wobei X
= Halogen,
CN, CO, COOH, COOR13",
NH, NH2, NHR13", NR13"R14", NO, NO2, NOH, NOR13", CH3, (CH2)n, (CH2)nCH3, (CH2)nR13", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; O(CH2)nR13", (CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3,
S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH),
NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3, SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2,
C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(C5H4N), CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O),
C6H4S(O)2NH, C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, und Adamantyl; wobei n = 1 bis 10 ist, und
R13" und R14" unabhängig voneinander ausgewählt werden aus H, O, S, N,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, SR15", SR1S"R16", X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, CR15"X2, CR2 1S"X, CR3 15" wobei X = Halogen,
CN, CO, COOH, COOR15",
NH, NH2, NHR15", NR15"R16", NO, NO2, NOH, NOR15", CH3, (CH2)nCH3, (CH2)nR15", OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; O(CH2)nR15",
(CH2)nOH, C5H10OH, SO2CF3, S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH), NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3, SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3,
C(CH3)C(O)NHC(O)CH2, C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(C5H4N), CHC(CN)(COOCH3), C3H4N,
S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O), C6H4S(O)2NH,
C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, Adamantyl; wobei n = 1 bis 10 ist, und
R15" und R16" unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H, O, S, N,
SH, SO, SO2, SO3, HSO3, X, insbesondere Br, CX3, CHX2, CH2X, wobei X = Halogen, CN, CO, COOH, COOCH3,
NH, NH2, NO, NO2, NOH,
CH3, (CH2)nCH3, OCH3, O(CH2)n, O(CH2)nCH3; (CH2)nOH, C6H10OH, SO2CF3, S(CCH(CH3)N(OH)NC(CH3)), (CNONC)NHCH2(N4CH), NHC(O)(C4H2O(CH3)), CH2(C2N2H5(CO)2), SCFCF3COOCH3, SCH2(C2NSH(NH2)), C3N2H3, C(CH3)C(O)NHC(O)CH2,
C(CH3)CH2NHC(O)S, C6H5, NHC(O)CHNOH, S(CH2)2(C5H4N), CHC(CN)(COOCH3), C3H4N, S(C(CH3)NHNC(CH3)), NH(C6H3N2O), C6H4S(O)2NH, C6H4NHC(O)CH3, NHC(O)CHNOH, und Adamantyl; wobei n = 1 bis 10 ist,
und/oder R3 " und R4" gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus einem verzweigten oder unverzweigten Q-Q-AIkyl, Q-Q-Alkenyl, C1- C8-Heteroalkyl, Q-Cg-Heteroalkenyl, C1-C8-AIkOXy, C1-C8-AI kenoxy, C1-C8-ACyI, C3-C8-Cycloalkyl, C3-C8-Cycloalkenyl, C5-C8-Aryl, C5-C8-
Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Cs„8-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl,
Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantylrest, Heteroaryloxyrest, Toluol, Anilin, Benzaldehyd, Anisol, Benzonitril, Phenol, Acetophenon, Benzoesäure, XyIoI, Styrol, Naphtalin,
Anthracen, Phenanthren, Naphtalin, Anthracen, Phenanthren, Benzpyren, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Tetrahydrothiophen, Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Pyrazin, Purin, Imidazol, Pteridin, Acridin, Chroman, Chromen, und Cumarin
(Chromen-2-on), Diazol, Tetrazol, Pyrazol, C3H2S2O, gesättigtes oder nicht-gesättigtes C6.8-Lacton, und Succinimid, wobei an jedem einzelnen der Atome der verbrückten Struktur, bevorzugt 1 bis 12 Atome, unabhängig voneinander ein oder 2 Substituenten, ausgewählt aus R1" oder R2 ', auftreten kann/können.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel IH aus einer der folgenden Strukturen ausgewählt wird:
1111 III2
1113 1114
1115 IHb
1117 Illδ
1119 HIl O
11111 11112
IUI 3 11114
11115 11116
III17 18
11119 IH20
11121 III22
III23 HI24
III25 III26
11129 11130
11131 11132
11133 11134
III 37
10. Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formeln 1V1 bis IV3:
IVl IV2
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
1 1. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 -10, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (a) und (b) austauschbar sind.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 -11 , dadurch gekennzeichnet, dass die MHC Moleküle MHC Klasse I oder Il-Moleküle sind.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 -12, dadurch gekennzeichnet, dass die MHC Moleküle mit Liganden beladen oder unbeladen sind.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 -13, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ausgewählt wird aus Antigenen, insbesondere tumor- oder pathogenspezifischen Antigenen, gewebsspezifischen Selbstantigenen, Antigenen autoreaktiver Zellen, Peptidantigenen und Fragmenten solcher Peptidantigene, vollständigen Proteinen, Proteingemischen und/oder komplexen Proteingemischen.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 -14, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle in Schritt (c) zu einer Beladung von nicht beladenen MHC-Molekülen mit Liganden führt.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Beladung der MHC-Moleküle in Schritt (c) durch Zugabe von potentiellen Liganden von MHC-Molekülen erfolgt.
17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 -14, dadurch gekennzeichnet, dass die
Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle in einem alternativen
Schritt (c') zu einem Austausch von Liganden von beladenen MHC-Molekülen gegen andere Liganden führt.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Austausch von Liganden von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen in dem alternativen Schritt (c') folgende Schritte umfasst: (i) Verringerung der Beladung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen; (ii) Zugabe von anderen Liganden von MHC-Molekülen.
19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15-18, dadurch gekennzeichnet, dass zur Auslösung tumorspezifischer, pathogenspezifischer oder autoreaktiver
Immunantworten eine Erhöhung der Beladung der MHC-Moleküle mit antigenischen Liganden erfolgt.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass zur Auslösung der Immunantworten eine Beladung von antigenpräsentierenden Zellen (APC) erfolgt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die antigenpräsentierenden Zellen ausgewählt werden aus körpereigenen oder nicht-körpereigenen maturierten und nicht-maturierten dendritischen Zellen, B-
ZeI len oder Makrophagen oder anderen Antigen-präsentierenden Zellen.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle in einem alternativen Schritt (c") zu einer Verringerung der Beladung von mit Liganden beladenen
MHC-Molekülen führt.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der Beladung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen in Schritt (c") durch einen Waschschritt erfolgt.
24. Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der Beladung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen in Schritt (c") zu einer vollständigen Entfernung der Liganden führt.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22-24, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verringerung der Beladung von mit Antigenen beladenen MHC-Molekülen zur Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen erfolgt.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -25, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen an einer Bindungstasche eines MHC-Moleküls vorgenommen wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungstasche eine Bindungstasche eines MHC I-Moleküls ist.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidbindungstasche eines MHC I-Moleküls ausgewählt wird aus den Peptidbindungstaschen A, B, C, D, E oder F.
29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungstasche eine Peptidbindungstasche eines MHC II-Moleküls ist.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungstasche eines MHC II-Moleküls ausgewählt wird aus den
Peptidbindungstaschen P1 , P3, P4, P6, P7 und P9.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungstasche die Bindungstasche P1 ist.
32. Screeningverfahren zur Suche und Identifizierung von neuen Antigenen, zum Nachweis spezifischer zytotoxischer T-Zellen oder zum Monitoring einer spezifischen T-ZeI I-Antwort umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem Verfahren gemäß einem der
Ansprüche 1 -31 verändert wurde; und b) Bestimmung der Wechselwirkung dieser MHC-Moleküle, deren
Beladungszustand mit Liganden nach einem Verfahren gemäß einem der
Ansprüche 1-31 verändert wurde, mit einem physiologischen
Bindungspartner der MHC-Moleküle mit Hilfe eines biochemischen oder biophysikalischen Nachweisverfahrens; und
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet dass das Screeningverfahren in vitro T-ZeII Assays, Proliferationsassays, ELISPOTS, ELISA-Verfahren, Chromium-Release-Assays und High-Throughput Screeningverfahren (HTS) mit umfasst.
34. MHC-Molekül, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 -31.
35. Verwendung eines ligandenbeladenen MHC-Moleküls gemäß Anspruch 34 zur Herstellung von Vakzinen, bevorzugt von Protein- oder Peptidvakzinen.
36. Verwendung eines ligandenbeladenen MHC-Moleküls gemäß Anspruch 34 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Auslösung tumorspezifischer, pathogenspezifischer oder autoreaktiver Immunantworten.
37. Verwendung eines ligandenbeladenen MHC-Moleküls gemäß Anspruch 34 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, Infektionskrankheiten oder von Autoimmunkrankheiten.
38. Verwendung gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs ausgewählt wird aus Kolonkarzinomen, Melanomen, Nierenkarzinomen, Lymphomen Akute myeloide Leukämie (AML), Akute Lymphoide Leukämie (ALL), chronische myeloide Leukämie (CML), chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Gastrointestinale Tumoren, Lungenkarzinome, Gliome,
Schilddrüsentumoren, Mammakarzinome, Prostatatumore, Hepatome, diverse virus-induzierte Tumoren wie z.B. Papillomvirus-induzierte Karzinome (z.B. Cervixkarzinom), Adenokarzinome, Herpesviren-induzierte Tumore (z.B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertes B Zelllymphom), Hepatitis B-induzuierte Tumore (Hepatozellkarzinome), HTLV-1 und HTLV-2 induzierte Lymphome, Akustikusneurinom, Gebärmuttehalskrebs, Lungenkrebs, Rachenkrebs,
Analkarzinom, Glioblastom, Lymphome, Rektumkarzinom, Astrozytom, Hirntumore, Magenkrebs, Retinoblastom, Basaliom, Hirnmetastasen, Medulloblastome, Scheidenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hodenkrebs, Melanom, Schilddrüsenkarzinom, Blasenkrebs, Hodgkin-Syndrom, Meningeome, Schneeberger Krankheit, Bronchialkarzinom, Hypophysentumor,
Mycosis fungoides, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs, Karzinoide, Neurinom, Spinaliom, Burkitt-Lymphom, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymom, Corpuskarzinom, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphome, Urethrakrebs, CUP-Sysndrom, Kopf-Hals-Tumore, Oligodendrogliom, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinom, Ösphaguskarzinom, Warzenbeteiligung,
Dünndarmtumore, Kraniopharyngeome, Ovarial-Karzinom, Weichteiltumore, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Pankreaskarzinom, Zervixkarzinom, Endometriumkarzinom, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytom, Gebärmutterkrebs, Lidtumor oder Prostatakrebs.
39. Verwendung gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Infektionskrankheiten ausgewählt werden aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten wie AIDS, Condyloma acuminata, Dellwarze,
Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Erkältung,
Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanische Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-infektion, Pfeifersches-
Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie- Virus (CMV), bakteriellen Infektionskrankheiten wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis(Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys,
Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischer Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, lungenentzündung, Meningitis, Bakterielle Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weicher Schanker, durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufene Inkektionskrankheiten wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas- Krankheit, Echinococcus, Fischbandwurm, Fischvergiftung (Ciguatera),
Fuchsbandwurm, Fußpilz, Hundebandwurm, Kandiose, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Kutane Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), Läuse, Malaria, Mikroskopie, Onchozerkose (Flussblindheit), Pilzerkrankungen, Rinderbandwurm, Schistosomiasis, Schlafkrankheit, Schweinebandwurm, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszerale
Leishmaniose, Windeldermatitis oder Zwergbandwurm.
40. Verwendung gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Autoimmunerkrankungen ausgewählt werden aus Multipler Sklerose (MS), Rheumatoider Arthritis, Diabetes, Diabetes Typ I, Systemischer Lupus
Erythematosus (SLE), Chronischer Polyarthritis, Basedowscher Krankheit, Autoimmunen Formen der chronischen Hepatitis, Colitis Ulcerosa, Allergie Typ I-Erkrankungen, Allergie Typ Il-Erkrankungen, Allergie Typ III-Erkrankungen, Allergie Typ lV-Erkrankungen, Fibromyalgie, Haarausfall, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Myasthenia gravis, Neurodermitis, Polymyalgia rheumatica,
Progressiver Systemischer Sklerose (PSS), Psiorasis, Reiter-Syndrom, Rheumatischer Arthritis, Schuppenflechte oder Vaskulitis, oder weiteren Autoimmun-Erkrankungen des Typs 1, Typs II, Typs 111 oder Typs IV.
41. Verwendung eines ligandenbeladenen MHC-Moleküls gemäß Anspruch 34 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen.
42. Verwendung einer Verbindung der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3, wie in den Ansprüchen 1 bis 10 definiert, zusammen mit Liganden zur Herstellung von Vakzinen.
43. Verwendung gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ausgewählt wird aus Antigenen, insbesondere tumor- oder pathogenspezifischen Antigenen, gewebsspezifischen Selbstantigenen, Peptidantigenen und Fragmenten solcher Peptidantigene, vollständigen
Proteinen, Proteingemischen und/oder komplexen Proteingemischen.
44. Vakzin, enthaltend ein ligandenbeladenes MHC-Molekül gemäß Anspruch 34, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
45. Vakzin, enthaltend eine Verbindung der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3, wie in den Ansprüchen 1 bis 10 definiert, zusammen mit Liganden, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
46. Vakzin gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ausgewählt wird aus Antigenen, insbesondere tumor- oder pathogenspezifischen Antigenen, gewebsspezifischen Selbstantigenen, Peptidantigenen und Fragmenten solcher Peptidantigene, vollständigen Proteinen, Proteingemischen und/oder komplexen Proteingemischen.
47. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein ligandenbeladenes MHC- Molekül nach Anspruch 34, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
48. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit der Eigenschaft, den Beladungszustand von MHC-Molekülen zu verändern, dadurch gekennzeichnet, daß (a) unbeladene MHC-Moleküle, insbesondere in Lösung oder fixiert auf einer Oberfläche, vorgegeben werden, (b) eine Verbindung der der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3 zugegeben wird, (c) gleichzeitig oder nach Schritt (b) Liganden des vorgegebenen MHC-Moleküls zugegeben werden und (d) die Beladung bzw. Bindung der MHC-Moleküle mit den gemäß Schtitt (c) zugegebenen Liganden gemessen wird.
49. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit der Eigenschaft, den Beladungszustand von MHC-Molekülen zu verändern, dadurch gekennzeichnet, daß (a) mit Liganden beladene MHC-Moleküle, insbesondere in Lösung oder fixiert auf einer Oberfläche, vorgegeben werden, (b) eine Verbindung der der Formeln I, IA, II, III oder IV1 bis IV3 zugegeben wird, und (c) die Dissoziation der Liganden von den MHC-Molekülen gemessen wird.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung kinetisch, durch Oberflächenplasmonresonanz oder durch thermodynamische, insbesondere mikrokalorimetrische Verfahren erfolgt.
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