EP1735449A2 - Eingriff in den energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur selektion und expressionssteigerung - Google Patents

Eingriff in den energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur selektion und expressionssteigerung

Info

Publication number
EP1735449A2
EP1735449A2 EP05735849A EP05735849A EP1735449A2 EP 1735449 A2 EP1735449 A2 EP 1735449A2 EP 05735849 A EP05735849 A EP 05735849A EP 05735849 A EP05735849 A EP 05735849A EP 1735449 A2 EP1735449 A2 EP 1735449A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
expression
sugar
transport protein
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05735849A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Volker Sandig
Ingo Jordan
Karsten Winkler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ProBioGen AG
Original Assignee
ProBioGen AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ProBioGen AG filed Critical ProBioGen AG
Priority to EP05735849A priority Critical patent/EP1735449A2/de
Publication of EP1735449A2 publication Critical patent/EP1735449A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins

Definitions

  • the invention relates to a method for the expression of one or more foreign genes in eukaryotic cells, in which the energy metabolism of the cells is improved by introducing nucleic acid sequences which encode sugar transport proteins and whose expression is linked to the foreign gene expression, and suitable transformed cells for this and their use.
  • the nucleic acid sequences code in particular for glucose transport proteins such as GLUT-1.
  • Important parameters for the production of recombinant active substances in cell cultures are (1) the stable preservation of the foreign gene, (2) a high expression rate of the foreign gene, and (3) proliferation properties of the transformed cell.
  • the invention described here can help optimize all three parameters.
  • foreign genes are expressed in eukaryotic cells via the transfection of plasmids which carry the corresponding gene under the control of cis-active sequences such as the promoter and polyadenylation signal.
  • cis-active sequences such as the promoter and polyadenylation signal.
  • this process only leads to a transient or transient expression of foreign genes, since with the division of the transfected cells and through the degradation of the introduced DNA, fewer and fewer plasmids are available to the daughter cells, so that the transfected plasmids can no longer be detected within a few passages.
  • the foreign gene For stable expression, the foreign gene must either be integrated into the chromosome of the host cell or, mediated by functions in the plasmid backwheel, be coupled episomally to cell division in its replication (Van Craenenbroeck, K. et al., Eur. J. Biochem. 267: 5665-78 (2000)).
  • the occurrence of revertants can be counteracted by combining the expression of the foreign gene with a simultaneous expression of a selection marker.
  • the selection marker can be a resistance factor that is able to protect the host cell from antibiotics that are toxic to the wild type. Although this form of selection gives very good results, there are some significant disadvantages to consider: (1) Only partially inactivated antibiotics, like the process of inactivation, strain the cell and can therefore theoretically lower possible expression rates to significantly lower levels. (2) Antibiotics converted by the resistance factor must be renewed. This requires manipulation of culture media, which can lead to contamination. The sequence of consumption and feeding also leads to temporal courses in which the active substance concentrations can fluctuate between ineffective and toxic values. (3) The resistance gene is usually of prokaryotic origin.
  • Sections deviating from eukaryotic base sequences in the gene and primary sequence patterns in the protein can be recognized by the cell as foreign and can contribute to the inactivation of the foreign gene.
  • Inhibition of expression by neomycin phosphotransferase has been demonstrated in retroviral systems (Artelt, P. et al., Gene 99: 249-254 (1991)).
  • a disturbance in RNA splicing due to amino glycosidic antibiotics has been demonstrated (Waldsich, C. et al., RNA 4: 1653-63 (1998)).
  • Antibiotics are expensive and polluting.
  • Glutamine synthetase can also be used as a so-called amplifiable marker for the production of high expression cell lines (Barnes, L.M. et al., Cytotechnology 32: 109-123 (2000)).
  • This method uses the property of some cells to increase the expression level of some gene products by multiplying the number of copies of the associated gene.
  • concentrations of the specific inhibitor methionine sulfoximine (MSX) are added to the medium. The inhibitor reduces the effective activity of glutamine synthetase. This is compensated for by increasing the gene dose.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • This enzyme converts folate via dihydrofolate to tetrahydrofolate, an essential starting material for the de novo synthesis of purines, pyrimidines and glycine.
  • DHFR is specifically inhibited by methotrexate (MTX). Gradual addition of MTX can force an increase in DHFR expression by amplifying the copy number of the gene.
  • MTX methotrexate
  • WO 92/21756 discloses the stimulation of insulin production by increasing concentrations of glucose.
  • the introduction of a glucose transporter gene is also disclosed.
  • the mechanism is part of a physiological regulatory loop; stimulation of foreign gene expression with a decreasing amount of glucose is not disclosed.
  • F. Ismail-Beigi and G. Vanderberg, Arch. Biochem. Biophys. 331 (2): 201-207 C1996) describe the expression of a recombinant GLUT-1 transporter in a liver cell line from rats. Furthermore, the regulation of glucose transport in response to stimuli such as insulin concentration or lack of oxygen is discussed and it is shown that a poison in the respiratory chain (sodium azide) stimulates glucose transport. A coupling of the deficiency state with the high expression of a foreign gene and the protection of cells against cell death induced by limitations of nutrients is not shown.
  • WO 97/15668 describes the use of a therapeutic against neoplastic diseases, streptozotocin or STZ.
  • This agent is a glucose analogue and gets into cells via glucose transport mechanisms.
  • STZ and GLUT-2 recombinant cells are proposed, but coupling with the expression of a foreign gene is not mentioned.
  • Some cell lines such as CHO cells, respond to the deficiency conditions outlined above with apoptosis, others, such as HEK 293 cells, slow proliferation (Zhangi, JA et al., Biotechnol. Bioeng. 64: 108-119 (1999) and the applicant's own observations).
  • the 293 cells are briefly discussed in connection with FIG. 5. However, cells that now express the sugar transport protein are better able to use the low nutrient concentration in the culture supernatant and can proliferate.
  • the culture gradually adjusts itself to the conditions that lead to an increased selection pressure towards highly expressing cells through the consumption of sugar. Furthermore, it is not necessary to add antibiotics such as gentamycin or hygromycin B to the nutrient medium to ensure that foreign genes are preserved.
  • Low glucose values also interfere with the replication of some viruses, for example adenoviruses (Bardell, D., -Microbios 20: 139-44 (1977)), which have important medical significance as viral vectors or for vaccine production.
  • glucose in the medium is more quickly depleted by the increased glycolysis in the infected cells (Bardell, D., Microbios 20: 139-44 (1977)).
  • glucose in higher concentrations is toxic to the host cell (Acker, H. et al., Cancer Res 47: 3504-8 (1987); Medina-Navarro, R. et al., Hum Exp Toxicol 23: 101-5 ( 2004))
  • the increased glucose requirement can only be compensated to a limited extent by increased addition of glucose.
  • the system described here facilitates the use of sugars even at reduced concentrations in the culture medium and thus allows improved yields in the pharmaceutical production of viruses or viral vectors.
  • the protection of the cells in the high-density reactor from apoptosis and / or necrosis follows a principle related to selection. However, it is primarily local variations in the nutrient concentration that the present system is intended to buffer. In this way, the culture is protected from necrotic or apoptotic foci in areas of low diffusion, which increases the duration of culture and production intervals and reduces the proportion of degradation products.
  • the glucose limitation in the present invention increases to an increased level Expression of a foreign gene; because with the glucose limitation in the extracellular space the passive influx of glucose is impeded.
  • the invention thus relates to:
  • a method for expressing one or more foreign genes in eukaryotic cells which supports the energy metabolism of the cells by introducing a functional nucleic acid segment into the starting cells, which codes for a sugar transprotein, the Expression improves the energy metabolism of the transformed cells compared to the starting cells (if it is expressed in the cells) and whose expression is linked to the expression of foreign genes;
  • (2) a method for the selection of a eukaryotic cell which is suitable for the expression of one or more foreign genes, the selected cell by introducing a functional nucleic acid segment which codes for a sugar transport protein, the expression of which improves the energy metabolism of the cells compared to the starting cells and the latter Expression is linked to the foreign gene expression, has been modified and is particularly suitable for carrying out a method according to (1), and the method comprises one or more of the steps (a) transforming or transfecting starting cells with the functional nucleic acid segment; and (b) selection with depletion of one or more of the nutrients or cofactors transported by the sugar transport protein; includes;
  • Eukaryotic cells which are suitable for a method as defined in (1) and / or are obtainable by the method according to (2) and which are transformed or transfected with a functional nucleic acid segment as defined in (1). are decorated;
  • Fig. 1 CHO cells transfected with pIJO-22-GlutGFP (SEQ ID NO: 1). Representative sections of the culture are shown 7, 14 and 15 days after transfection (each because a, b; c, d and e, f). For each time value, contrast images (a, c, e) and fluorescence images for the detection of GFP are shown (b, d, f). Induction of cell death due to glucose deficiency is evident from day 14. The dynamics of this process become clear when the cell density is compared on the two consecutive days. Cells carrying the GLUT-GFP cassette prefer to survive.
  • Fig. 2 Control experiment parallel to Fig. 1: CHO cells transfected with p O-25-NeoGFP (SEQ ID NO: 2). Representative sections of the culture are shown 7, 14 and 15 days after transfection (a, b; c, d and e, f in each case). For each time value, phase contrast images (a, c, e) and fluorescence images for the detection of GFP are shown (b, d, f). From day 14, a uniform death of the culture becomes evident, regardless of the presence of the transfected episome. The transfection efficiency for pDO-22-Glut-GFP (SEQ ID NO: 1) in Fig. 1 and for pI-JO-25-NeoGFP (SEQ ID NO: 2) in Fig. 2 was identical.
  • Fig. 4 Clear increase in the expression of selected alkaline phosphatase (SEAP) in vector pIJO-76 (GLUT-PV-SEAP) (SEQ ID NO: 3) in minimal medium. Compared to the reference (p O-73 (PV-SEAP) (SEQ ED NO: 4) in minimal medium), the SEAP activity is 6 times higher at the end point of the measurement.
  • the expression of pDO-76 (GLUT-PV-SEAP) (SEQ ID NO: 3) is also better in other media (full medium or full medium with 600 ⁇ g / l selection reagent G418) than with the reference plasmid pIJO 73 (PV-SEAP).
  • a functional nucleic acid segment is expressed in the cells and thereby the energy metabolism of the cells is improved compared to the starting cells.
  • a functional nucleic acid segment in the context of the present invention codes for a sugar transport protein, preferably for a factor which compares the use of mono-, di- or oligosaccharides by the transformed cells to the output cells improved.
  • the supported energy metabolism path is preferably selected from glycolysis, citrate cycle, pentose phosphate pathway, gluconeogenesis, the preferred energy pathway being glycolysis.
  • the nucleic acid segment according to the invention can be a DNA segment (contained in a vector, plasmid, etc.) or RNA segment (viral RNA vector).
  • the functional nucleic acid segment can comprise further functional sequences which are required for successful transformation and / or expression, preferably promoters, foreign genes to be expressed, IRES elements, selection markers, activator proteins of regulatory Cascades, ice and trans-active factors for improved translation of an mRNA or for recognition by viral factors, e.g. B. for packaging in envelopes or replication etc.
  • a “nutrient 1” is a compound which is implemented by the primary metabolism of a cell in order to obtain energy.
  • Preferred nutrients for the practice of the present invention are sugar.
  • sugar derivatives are understood to be sugars.
  • Mono-, di- or oligosaccharides are preferred, monosaccharides are particularly preferred, hexoses are particularly preferred. The latter include glucose and fructose, in particular the corresponding pyranosides and furanosides are preferred.
  • Glucose is very particularly preferred.
  • Sugar derivatives for the purposes of the present invention are compounds which are formed by derivatizing the functional groups of naturally occurring sugars, for example alkylated and acylated sugars, but also reduced or oxidized sugars, e.g. sugar alcohols such as sorbitol or xylitol.
  • a “sugar transport protein” is a protein which is suitable for the transport of one or different sugars. It is encoded by a sugar transport protein gene. Hexose transport proteins are preferably used to carry out the method according to (1) or (2) ,
  • a “depletion” in the sense of the present application is a lack of certain nutrients in the medium, in particular of certain sugars, in comparison to optimal concentrations for the growth and / or maintenance of the cells.
  • sugar depletion is characterized by a concentration of up to 1 g / l, preferably up to 0.5 g / l, preferably up to 0.2 g / l, of the sugar which is transported through the sugar transport protein and whose concentration thus has a direct influence on the metabolism of the transformed cell
  • Low concentration of alternative nutrients in the fresh medium Low concentration of alternative nutrients means a concentration that is not increased in comparison to the usual concentrations of these nutrients in standard media.
  • sodium pyruvate preferably a concentration of at most 200 mg / 1, in particular at most 110 mg / 1, glutamine, preferably a concentration of at most 4 mM, particularly of at most 2 mM, and glutamate preferably a concentration of have a maximum of 120 mg / 1, preferably a maximum of 80 mg / 1.
  • Eukaryotic cells i.e. vertebrate, invertebrate or plant cells
  • vertebrate or invertebrate cells can be used as starting cells in the method according to the invention, with vertebrate or invertebrate cells being preferred.
  • Mammalian cells such as rodent, dog, pig, bovine or primate cells ( e ⁇ including human cells)
  • Cells from lower eukaryotes such as yeasts and fission fungi
  • the term “z: ellen” in the context of the present invention also includes tissue / tissue cultures and (non-human) organisms from the cells defined above.
  • Primary or transformed cells can be used in the method according to the invention.
  • Preferred cells include primary human fibroblabs, CHO cells, BHK cells, NSO cells and HEK-293 cells.
  • the method according to (1) or (2) comprises culturing a transformed eukaryote cell as defined above and isolating the expression product from the culture.
  • the cultivation in the process (1) and (2) can be carried out in vitro or in vivo, but is preferably carried out in vitro.
  • An unexpected beneficial effect of the method according to (1) and (2) is that the cell density for cultures in minimal medium is clearly below the density of the cells in the full medium on the same day, although the extent of gene expression does not differ significantly (Observation in Example 2C). This results in a higher specific expression activity of the individual cell in the minimal medium. This effect has a considerable advantage for production, since the depletion of secreted metabolites is easier for the purification of the product from the culture supernatant.
  • the functional nucleic acid segment can be introduced transiently or stably into the cells. This happens by methods familiar to the person skilled in the art, such as transformation and transfection with suitable constructs (vectors, plasmids, etc.) comprising the functional nucleic acid segment defined above.
  • the sugar transport protein is a hexose transport protein, particularly preferably a glucose transport protein.
  • the latter is either a passive glucose transport protein that facilitates diffusion of glucose, fructose and / or other hexoses into the cells, or an active glucose transport protein that transports glucose, fructose and / or other hexoses into the cell through an active support system , It is preferably a passive glucose transport protein selected from the group comprising GLUT-1, GLUT-2, GLUT-3, GLUT-4, GLUT-5 or GLUT-7 proteins.
  • the sugar transport protein GLUT-1 is very particularly preferred.
  • the starting cell has at least one copy of the gene encoding sugar transport protein.
  • the gene is inactivated in the starting cells.
  • the system described here also works in cells (CHO and HEK 293) which have intact endogenous metabolic pathways which are complemented by the system according to the invention.
  • the sugar transport protein gene in method (1) or (2) can be heterologous or homologous to the starting cell. In the case of a heterologous sugar transport protein, however, it must be taken into account that this unfolds the desired function in the transformed cell.
  • the sugar transport protein of the present invention preferably originates from eukaryotes, particularly preferably from acids, very particularly preferably from humans or mice. A human sugar transport protein is particularly preferred.
  • the expression of the sugar transport protein is linked to the expression of a foreign gene.
  • This connection is created either by a direct link between the expression of the foreign gene and the expression of the sugar transport protein gene or via a regulatory cascade.
  • Direct linking is possible by controlling the expression of both genes via a common promoter. Is this pro moter bidirectional, separate transcripts can be generated for both genes. In a preferred particularly close direct link, however, both transcripts are located on a biscistronic RNA molecule.
  • the expression of the gene in the rear position is made possible by an IRES element which links the two genes to one another.
  • IRES elements are those of the encephalomyocarditis virus (Ghattas, IR et al., Mol Cell Biol 11 (12): 5848-59 (1991)) or of the poliovirus (Haller, AA et al., J Virol 67 (12) : 7461-71 (1993)).
  • leader sequences of certain cellular genes such as that of the myc gene, which allow cap-independent initiation of translation, are also possible as IRES. Both genes can also be translated from a primary transript after alternative splicing.
  • Regulatory cascades which can control the expression of a gene are suitable as regulatory cascades for connecting the expression of the sugar transport protein gene with the expression of the foreign gene.
  • the expression of the sugar transport protein gene is preferably linked directly to the expression of an activator protein, preferably as described above, the activator protein in turn activating the expression of the foreign substance at another point in the DNA.
  • Suitable activator proteins for regulatory cascades are e.g. B. steroid receptors.
  • the foreign gene can be stably transfected or introduced transiently into the cell, a stable transfection being preferred.
  • a stable or transient viral vector system for example a retroviral or alphaviral vector, can also be used to introduce the functional nucleic acid fragment.
  • a suitable vector for carrying out the method according to (1) or (2) comprises, in addition to the signal elements for controlling the expression of foreign gene and sugar transport protein gene (i.e.
  • Such a vector preferably also contains at least one gene for a classic selection marker (e.g. neomycin phosphotransferase (npt), hygromycin B phosphotransferase (hpt), blasticidin deaminase (bda) and puromycin N-acetyl transferase (pac)).
  • a classic selection marker e.g. neomycin phosphotransferase (npt), hygromycin B phosphotransferase (hpt), blasticidin deaminase (bda) and puromycin N-acetyl transferase (pac)
  • a plasmid which is preferably used for transformation provides ice and trans-active factors for preservation as an episome.
  • the stable expression of the foreign gene can be achieved without integration into the genome of the starting cell.
  • the cells are initially selected with one or more antibiotics. After building a stable cell line, the cells are kept under glucose deficiency conditions without the addition of antibiotics.
  • PREP-4 Invitrogen, San Diego, USA
  • PREP-4 is particularly suitable for carrying out the method according to (1) or (2).
  • the expression of foreign gene and sugar transport protein is ensured via dependent expression of two promoters on the same plasmid backwheel or via dependent expression by cotransfection with different plasmids.
  • the dependence arises from the spatial proximity and flanking genomic sequences.
  • the common expression is achieved via the formation of chimeras, proteins which have not been processed further, or via fusion proteins which are separated from one another cotranslationally (for example by changing ribosomal reading frames) or post-translationally (for example by proteolysis).
  • the cultivability in particular specifically supports the survival and proliferation of the recombinant cell population.
  • the method comprises a preselection using a conventional selection principle. This is preferably done by adding an inhibitor for the recombinant or endogenous sugar transport protein for the selection of the gene amplification.
  • an inhibitor for the recombinant or endogenous sugar transport protein for the selection of the gene amplification.
  • the specific yield of foreign gene product can be increased by targeted or process-related nutrient depletion, the cells being replaced by the recombinant sugar transporter and in particular before apoptosis , Necrosis or inhibition of proliferation are protected.
  • the addition of antibiotics is cultivated only under conditions of insufficient glucose.
  • a simultaneous or alternating selection with antibiotics and glucose deficiency is possible, with the alternating selection being able to be carried out in different combinations and time intervals.
  • the selection and / or maintenance of foreign genes is supported by the application of stress.
  • stressors can be inhibitors of mitochondrial processes or variations in insulin administration.
  • usability of nutrients is modulated by adjusting the ion concentrations in the culture medium (especially the Na + and K + ions involved in the active Symport).
  • the use of the cells in the bioreactor, tissue or organism can be designed in such a way that nutrient depletion due to the method is buffered better than by the starting cells.
  • the transformed cells which are obtained by means of the method (1) according to the invention are also suitable as hosts for the targeted multiplication of viruses or viral vectors.
  • the selection process according to (2) preferably additionally comprises a preselection with a conventional selection principle, in particular the preselection with antibiotics, very particularly with neomycin or hygromycin. Furthermore or alternatively, it preferably comprises one or more of the method steps of the method according to (1) and / or is carried out as described in the preferred aspects of method (1).
  • the functional nucleic acid segment and the sugar transport protein in the selection process according to (2) preferably have one or more of the properties as described above for the functional nucleic acid segment in the process according to (1); in particular the sugar transport protein is preferably a hexose transport protein, very particularly preferably one of the glucose transport proteins defined above.
  • a knock-out mutation of the active hexose transporter SGLT-1 was simulated by means of low sodium concentration and the absence of pyruvate as an alternative energy donor in the medium (Example 3).
  • This hexose transporter is particularly preferably a glucose transporter.
  • glucose cannot diffuse freely through the plasma membrane, but instead reaches the interior of the cell via the energy-dependent pathways.
  • the system presented here modulates the first and rate-determining step in the use of glucose as an energy carrier by supporting the translocation into the cell interior by means of special, recombinantly expressed transporter proteins.
  • very low external glucose concentrations can be used by the recombinant cells, while wild-type cells throttle their division rate or even, like CHO cells, react with programmed cell death (Zanghi, JA et al., Biotechnol. Bioeng. 64: 108-19 (1999 )).
  • Mammalian cells are equipped with two mechanistically different transport systems for glucose and other hexoses, the easier diffusion (through passive glucose transport proteins) and the active symport (through active glucose transport proteins):
  • a facilitated diffusion is catalyzed by specific receptors of the GLUT protein family (GLUT1 to GLUT5 and GLUT7) and allows the influx of hexoses (in addition to glucose in the case of GLUT5 especially fructose) along a concentration gradient (Brown, GK, J. Inherit. Metab. Dis 23: 237-46 (2000)).
  • the hexoses are extracted from the gradient by phosphorylation, so that there is no backflow.
  • GLUT1 to GLUT5 are integral proteins of the plasma membrane, GLUT7 is expressed on the intracellular membranes of the endoplasmic retinal.
  • Active transporters bring metabolites such as amino acids and sugar into the cytoplasm using electrochemical gradients.
  • glucose is transported by SGLT1 (Wright, EM et al., J. Exp. Bioi. 196: 197-212 (1994)), which converts the Na + concentration gradient into a so-called Symport for one uses active accumulation of glucose in the cell.
  • the driving Na + gradient in turn is maintained with hydrolysis of ATP in the antiport of Na + in the lumen against K + from the extracellular space.
  • foreign gene and sugar transport protein gene on an mRNA are linked to one another via an IRES element.
  • the sugar transport protein gene preferably codes for a glucose transporter.
  • the glucose transporter can be an active transporter or a factor that facilitates the diffusion of nutrients.
  • glucose transport proteins can be used for the method according to (1) or (2):
  • the transporter GLUT5 expresses for fructose and uses the system with fructose as an energy source.
  • a combination of transporters for example GLUTl with GLUT5, GLUTl with the GLUT7 located in the endoplasmic reticulum, or SGLT1 with GLUTl, and / or a combination of sugar molecules or sugar derivatives is used.
  • glucose is used for the selection of SGLT1 recombinant cells and genistein (Vera, JC et al., 1. Biol. Chem. 271: 8719-8724 (1996)) for the inhibition of endogenous GLUT1 transporters.
  • the system presented here uses a recombinant glucose transporter in eukaryotic cells in two areas of application: (i) the expression of the transporter is coupled to the expression of a foreign gene and thus enables a selection pressure which ensures the preservation of the foreign gene; or (ii) the transporter can also be expressed independently of a foreign gene in order to enable selection of the cells and / or to improve the cultivability of cells or the product yield under adverse growth conditions.
  • the principle of the system is used with or without the additional expression of a transporter at later points in the cell's energy balance.
  • a transporter for example, the glucohexokinase in the cytoplasm or the aconitase in the mitochondria, the location of the citrate cycle, can be modulated in its expression by recombinant methods or in its activity via chemical or biological induction.
  • changes in the nutrient concentration and / or specific inhibitors of the transporter and / or substances with chromosome-destabilizing properties are used for gene amplification of a foreign gene, the expression of which is coupled to the expression of the transporter.
  • specific active ingredients serve to inhibit endogenous transport processes, so that the recombinant transporter has to be used more frequently.
  • cells are used whose endogenous hexose transport molecules are experimentally inactivated, for example by antisense or knock-out technology.
  • the transporter or a combination of transporter and foreign gene is expressed in cells with the intention of enabling them to be cultivated more cheaply or to survive under adverse conditions. These cells could be used, for example, under high cell density conditions in the bioreactor.
  • the cell equipped with the transporter can be intended for use in a living organism, for example in ex-vivo gene therapy, or for the implantation of a cell network or a cell capsule.
  • a cell that is more favorable for the application can also be created at locations of lower nutrient concentration or diffusion.
  • the amplifications and clonings were planned on the basis of the gene bank sequences # NM006516 and # XM002033 (which differ from one another in three areas).
  • the primers ilOO (SEQ ID NO: 6) and ilOl (SEQ ID NO: 7) contain unique restrictive target sequences (Hind III and Xho I) .
  • the vector pREP4 also expresses the resistance factor against hygromycin B.
  • an expression cassette based on the EMCV-IRES for the EGFP reporter protein (Clontech, Palo Alto CA, USA) was inserted immediately after the open reading frame for GLUTl, with which the plasmid pEO-22-GlutGFP ( SEQ ID NO: l) arises.
  • Neo is known to those skilled in the art that it is non-toxic and differences in the enrichment of p O-22-GlutGFP (SEQ ID NO: 1) and pIJO-25-NeoGFP (SEQ ID NO: 2) should therefore affect the present have it returned by GLUTl.
  • the plasmids pIJO-22-GlutGFP (SEQ ID NO: 1) and pUO-25-NeoGFP (SEQ ID MO: 2) were transfected as liposomal complex in CHO cells and the expression of the GFP marker protein was monitored over 15 days. The transfection took place in this and in further experiments with LipofectAMINE Plus (Invitrogen): CHO cells were sown in 12-hole plates the day before the transfection.
  • 750 ng of plasmid DNA were mixed with 50 ⁇ l Opti-MEM (Invitrogen) and 5 ⁇ l Plus Reagent, incubated at room temperature and, after 15 min, 2 ⁇ l LipofectAMINE in 50 ⁇ l Opti-MEM were added. After a further 15 min, the culture medium was replaced by fresh 400 ⁇ l Opti-MEM mixed with the transfection mix. After 3 hours, 1 ml of medium was added.
  • FIG. 1 and 2 show the temporal course of GFP expression in CHO cultures which were in parallel with p O-22-GlutGFP (SEQ ID NO: 1) (FIG. 1) or the control plasmid pUO-25-NeoGFP (SEQ ID NO: 2) (Fig. 2). Both approaches were cultivated in MEM # M4655. After an initially comparable number of GFP-expressing cells and comparable signal intensities of the reporter protein for both constructs, a significant accumulation of GFP-positive cells occurs only in the culture transfected with p O-22-GlutGFP (SEQ ID NO: 1). In addition, it can be seen that the cells expressing GLUT-GFP suffer remarkably less cell death in the deficient medium than the neo-GFP controls.
  • CHO cells were transfected with pDO-22-GlutGFP (SEQ ID NO: 1) and pDO-25-NeoGFP (SEQ ID NO: 2) by conventional selection with 200 ⁇ g / ml Hygromycin B enriched for 20 days, diluted 6-fold in T25 culture bottles under MEM # M4655 and then cultured for 20 days without changing the medium.
  • SEQ ID NO: 1 pDO-22-GlutGFP
  • SEQ ID NO: 2 pDO-25-NeoGFP
  • Figure 3 shows a clear accumulation of the GlutGFP positive cells in comparison to the NeoGFP expressing cells.
  • the GFP reporter protein allowed a surprisingly clear confirmation of the function of the system according to the invention.
  • expression results for another reporter are to be quantified.
  • an expression cassette for SEAP was connected downstream of the ORF for glow in an episomal vector. Since the original amino terminal sequences may be necessary for the secretion of the SEAP, that of the poliovirus (PV) was used as the IRES element, which differs from the EMCV-IRES in that no ATG initiator codon has to be provided by the IRES.
  • PV poliovirus
  • the episomal vector with the glut-PV IRES-SEAP cassette was named pDO-76 (SEQ ID NO: 3), and was created by inserting the glow gene from pDO-62 (SEQ ID NO: 12) as a 1602 bp Hind III fragment in the vector pDO-73 (SEQ ID NO: 4).
  • pEO-62 is an intermediate clone containing a PCR amplification product (with primers ilOO (SEQ ID NO: 6) and ilOl (SEQ ID NO: 7)) of the glut gene;
  • pDO-73 (SEQ ID NO: 4) is an EBV episomal vector containing a PV-IRES-SEAP cassette after a multiple cloning site; this cassette was generated by inserting SEAP as Hind III (Klenow-treated) Not I fragment from p O-53 (SEQ ID NO: 13) in pBS Polio opened with Sma I and Not I.
  • the original episomal vector (pUO-73 (SEQ ID NO: 4)
  • the episomal vector used for the SEAP experiments carries the resistance gene for the inactivation of G418 (neo, neomycin phosphotransferase).
  • CHO cells were transfected with p O-76 (GLUT-PV-SEAP) (SEQ ID NO: 3) and pDO-73 (PV-SEAP) (SEQ ID NO: 4) and SEAP secretion into the medium was monitored for 2 weeks (Fig. 4).
  • the background-adjusted, absolute SEAP value of the experiment shown is 667889 relative light units for pIJO 76 (GLUT-PV-SEAP) in minimal medium, 546866 relative light units for pIJO 73 (PV-SEAP) in full medium / G418 and 344'356 for pIJO 73 (PV-SEAP) in minimal medium.
  • D. 293 cells HEK 293 cells were surprisingly insensitive to glucose limitation.
  • HEK 293 cells were transfected with pDO-71 (EBN-GLUT-GFP) (SEQ ID NO: 5) and with G418 selected for 8 weeks.
  • the stable transfectants were presented in parallel with wild-type HEK 293 as a reference to the same confluence in different media (without G418): unsupplemented # M4655, unsupplemented F10 medium, and serum-supplemented PBG 1.0 medium.
  • the culture medium was not changed or fresh medium was added for the following 4 weeks.
  • Fig. 5 shows the starting point and two snapshots (after 2 and 4 weeks).
  • the amplifications with primer pair il02 (SEQ ID NO: 8) and il03 (SEQ ID NO: 9) and cloning have been planned using the GenBank sequence # M24847.
  • the primers il02 (SEQ ID NO: 8) and il03 (SEQ ID NO: 9) contain unique restrictase target sequences.
  • RNA isolated from cells treated in this way could be converted into a surprisingly wide range of amplification products in RT-PCR. be changed.
  • the product range was characterized by very low yields and a host of signals, which also indicate products of different sizes in the range of the expected size of 2013 bp.
  • the desired sequence could be isolated and cloned into the episomal plasmid pREP4 by cloning amplification products of different sizes.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression eines oder mehrerer Fremdgene in Eukaryontenzellen, bei dem der Energiestoffwechsel der Zellen durch Einbringen von Nukleinsäuresequenzen, die Zucker-Transportproteine kodieren und deren Expression mit der Fremdgen-Expression verknüpft ist, verbessert wird, sowie geeignete transformierte Zellen hierfür und deren Verwendung. Die Nukleinsäuresequenzen kodieren insbesondere für Glukosetransportproteine wie GLUT-1.

Description

Eingriff in den Energiestoffwechsel von Eukaryontenzellen zur Selektion und Expressionssteigerung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression eines oder mehrerer Fremd- gene in Eukaryontenzellen, bei dem der Energiestoffwechsel der Zellen durch Einbringen von Nukleinsauresequenzen, die Zucker-Transportproteine kodieren und deren Expression mit der Fremdgen-Expression verknüpft ist, verbessert wird, sowie geeignete transformierte Zellen hierfür und deren Verwendung. Die Nukleinsauresequenzen kodieren insbesondere für Glukosetransportproteine wie GLUT-1.
Hintergrund der Erfindung
Wichtige Parameter für die Herstellung rekombinanter Wirkstoffe in Zellkulturen sind (1) der stabile Erhalt des Fremdgens, (2) eine hohe Expressionsrate des Fremdgens, und (3) Proliferationseigenschaften der transformierten Zelle. Die hier beschriebene Erfindung kann zur Optimierung aller drei Parameter beitragen.
In der Regel werden Fremdgene in Eukaryontenzellen über die Transfektion von Plasmiden exprimiert, die das entsprechende Gen unter der Kontrolle von cis- aktiven Sequenzen wie Promotor und Polyadenylierungssignal tragen. Allerdings führt dieser Prozess nur zu einer vorübergehenden oder transienten Expression von Fremdgenen, da mit der Teilung der transfizierten Zellen und durch Degradation der eingebrachten DNA den Tochterzellen immer weniger Plasmide zur Verfügung stehen, so daß innerhalb weniger Passagen die transfizierten Plasmide nicht mehr nachweisbar sein können. Für eine stabile Expression muss das Fremdgen somit entweder in das Chromosom der Wirtszelle integriert, oder aber, vermittelt durch Funktionen im Plasmidrückrad, in seiner Replikation episomal an die Zellteilung gekoppelt werden (Van Craenenbroeck, K. et al., Eur. J. Biochem. 267:5665-78 (2000)).
Auch in der stabilen Konfiguration ist eine Expression in den allermeisten Fällen jedoch nicht dauerhaft: Episomen können im Laufe der Zellteilung ungleich auf Tochterzellen verteilt werden und so verloren gehen; chromosomale Abschnitte mit den integrierten Fremdgenen können durch Methylierung und Kondensierung für die zelluläre Transkriptionsmaschinerie unzugänglich gemacht werden oder durch Rekombination deletiert werden. Da das Einbringen von Fremdgenen häufig eine Belastung für die Wirtszelle bedeutet, sind die Zellen, in denen die Inak- tivierung des Fremdgens erfolgt, gegenüber den stabilen Transfektanten im Vorteil. Im Laufe der Passagierung einer Zelllinie verdrängen die Revertanten somit ihre transgenen Nachbarn.
Dem Auftreten von Revertanten kann entgegengesteuert werden, indem die Expression des Fremdgens mit einer gleichzeitigen Expression eines Selektionsmar- kers verbunden wird.
Der Selektionsmarker kann ein Resistenzfaktor sein, der in der Lage ist, die Wirtszelle vor Antibiotika zu schützen, die für den Wildtyp toxisch sind. Obwohl diese Form der Selektion sehr gute Ergebnisse liefert, sind einige erhebliche Nachteile zu berücksichtigen: (1) Nur teilweise inaktivierte Antibiotika, wie auch der Prozess der Inaktivierung, belasten die Zelle und können daher theoretisch mögliche Expressionsraten auf deutlich niedrigere Niveaus senken. (2) Vom Resistenzfaktor umgesetzte Antibiotika müssen erneuert werden. Dies erfordert Manipulationen an Kulturmedien, die zu Kontaminationen führen können. Die Abfolge von Verbrauch und Zufütterung führt außerdem zu zeitlichen Verläufen, in denen die Wirkstoffkonzentrationen zwischen unwirksamen und toxischen Werten schwanken können. (3) Das Resistenzgen ist in der Regel prokaryoti- schen Ursprungs. Von eukaryotischen Basenabfolgen im Gen und Primärsequenzmustern im Protein abweichende Abschnitte können von der Zelle als fremd erkannt werden und zur Inaktivierung des Fremdgens beitragen. In retro- viralen Systemen wurde eine Inhibition der Expression durch die Neomycin- Phosphotransferase demonstriert (Artelt, P. et al., Gene 99:249-254 (1991)). In wieder anderen Systemen konnte eine Störung des RNA-Spleißens durch ami- noglykosidische Antibiotika demonstriert werden (Waldsich, C. et al., RNA 4: 1653-63 (1998)). (4) Antibiotika sind teuer und umweltbelastend. (5) In der Produktaufreinigung müssen Schritte zur Abtrennung und Inaktivierung der Antibiotika eingeplant werden (Panayotatos, N., Gene 74:357-63 (1988)). Ein eukaryotisches Selektionssystem, das einige dieser Probleme umgeht, beruht auf der Expression rekombinanter Glutaminsynthetase (Barnes, L. M. et al., Cy- totechnology 32:109-123 (2000)). Dieses Enzym katalysiert die Synthese von Glutamin durch Amidierung von Glutamat mit Ammoniumionen. Manche Zellinien haben dieses Enzym verloren und können somit nur in Medium überleben, das mit Glutamin supplementiert wurde. Für diese Zellen eignet sich eine Selektion in Medium ohne Glutaminzusatz, wobei das Fremdgen an die Expression der Glutaminsynthetase gekoppelt wird. Allerdings darf Glutamin dem Medium nur graduell entzogen werden, da bei einem zu schnellen Wechsel auf Glutamin-freies Medium auch die Zellen sterben, die rekombinante Glutaminsynthetase exprimie- ren.
Die Glutaminsynthetase kann außerdem als sogenannter amplifizierbarer Marker gezielt zur Herstellung von Hochexpressionszelllinien eingesetzt werden (Barnes, L. M. et al., Cytotechnology 32:109-123 (2000)). Diese Methode nutzt die Eigenschaft mancher Zellen, die Expressionsstärke einiger Genprodukte über Vervielfachung der Kopienzahl des zugehörigen Gens zu steigern. Für eine Genamplifi- kation der Glutaminsynthetase werden dem Medium graduell steigende Konzentration des spezifischen Inhibitors Methioninsulfoximin (MSX) zugegeben. Durch den Inhibitor sinkt die effektive Aktivität der Glutaminsynthetase. Dies wird durch Steigerung der Gendosis kompensiert. Dem Gen der Glutaminsynthetase eng benachbarte Fremdgene können in der so induzierten Genamplifikation e- benfalls vervielfältigt und damit verstärkt exprimiert werden. Die Genamplifikation kann auch dann erfolgreich sein, wenn die Zelle über eine endogene Glutaminsynthetase verfügt.
Einem vergleichbaren Prinzip folgt die Amplifikation über das Dihydrofolatreduk- tase (DHFR) Gen (Banerjee, D. et al., Cancer Gene Ther. 1: 181-4 (1994)). Dieses Enzym überführt Folat über Dihydrofolat zu Tetra hydrofolat, einem essentiellen Edukt für die de novo Synthese von Purinen, Pyrimidinen und Glycin. DHFR wird durch Methotrexat (MTX) spezifisch inhibiert. Eine graduelle Zugabe von MTX kann eine Steigerung der Expression von DHFR über Amplifikation der Kopienzahl des Gens erzwingen. Wenn ein Fremdgen eng benachbart zu rekombi- nater DHFR in das Chromosom inseriert wird, dann kann durch die Zugabe von MTX mit der Amplifikation der rekombinanten DHFR auch eine Amplifikation der Zahl an Fremdgenkopien erreicht werden.
Auch wenn rekombinant in eine Zelle eingebrachte Genabschnitte im Chromosom stabilisiert und zu einer möglichst hohen Expression geführt worden sind, kann die Wirkstoffgewinnung im Bioreaktor scheitern, wenn die Kulturbedingungen zur Induktion von Apoptose führen. Dieses Problem ist in der Literatur bekannt CFrahm, B. et al., Bioprocess Biosyst. Eng. 26:1-10 (2003)) und wird durch Interferenz mit dem apoptotischen Programm minimiert. Wichtige Sensoren für Nährstoffmangel sind Proteine der Bcl-2-Genfamilie, wobei einige dieser Proteine pro-apoptotisch wirken und andere, wie das prototypische Bcl-2 Protein, eine begonnene apoptotische Signalkaskade stoppen können (Gross, A. et al., Genes Dev. 13:1899-911 (1999)). Rekombinante Überproduktion von Bcl-2 hat sich in der Wirkstoffherstellung als günstig erwiesen (Frahm, B. et al., Bioprocess Biosyst. Eng. 26:1-10 (2003)).
WO 92/21756 offenbart die Stimulation der Insulinproduktion durch steigende Konzentrationen von Glukose. Auch wird die Einführung eines Glukosetransportergens offenbart. Der Mechanismus ist jedoch Bestandteil einer physiologischen Regulationsschleife, eine Stimulation einer Fremdgenexpression mit sinkender Menge an Glukose wird nicht offenbart.
F. Ismail-Beigi und G. Vanderberg, Arch. Biochem. Biophys. 331(2):201-207 C1996) beschreiben die Expression eines rekombinanten GLUT-1 Transporters in einer Leberzelllinie aus Ratten. Weiterhin wird die Regulation des Glukosetransports als Reaktion auf Stimuli wie Insulinkonzentration oder Sauerstoffmangel diskutiert und gezeigt, dass ein Gift der Atmungskette (Natriumazid) den Glukosetransport stimuliert. Eine Kopplung des Mangelzustandes mit der Hochexpression eines Fremdgens und der Schutz von Zellen vor Zelltod induziert durch Limi- tationen von Nährstoffen wird nicht gezeigt.
Auch D.-Y. Hwang und F. Ismail-Beigi, Arch. Biochem. Biophys., 339(2):206-211 C2002), beschreiben den Transport von Glukose in Gegenwart eines Stoffwechselgifts (hier: Kobaltchlorid), welches Sauerstoffmangel simuliert. Es wird durch die rekombinante Expression von GLUT-1 gezeigt, dass in manchen Systemen der Glukosetransport der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Metabolismus von Glukose ist. Umgekehrt führt in anderen Systemen der Glukosemetabolismus zur Akkumulation von Laktat, wenn der durch Sauerstoffmangel induzierte Transport überhöhte intrazelluläre Glukosekonzentrationen verursacht. Die Möglichkeit einer Kopplung der Expression eines Fremdgens an die Expression des GLUT-1 Transporters wird nicht gezeigt.
T. Asano et al., J. Biol. Chem. 264(6): 3416-3420 (1989), beschreiben die Stimulation der Expression eines Glukosetransportmoleküls durch Insulin in HepG2 Zellen, einer menschlichen Hepatomalinie. Die Zugabe von Insulin zum Kulturmedium führt zu einer erhöhten Expression des Glukosetransporters und damit auch zu einer erhöhten Aufnahme von Glukose. Eine Kopplung der Expression eines Fremdgens an die Expression des GLUT-1 Transporters ist nicht erwähnt.
N. R. Cohen et al., Biochem J. 315:971-975 (1996), beschreiben die Expression von GLUT-1 aus der Ratte in einem Schleimpilz, Dictyosteliυm discoideum. Kultivierte Zellen dieses Eukaryoten wurden mit GLUT-1 so transfiziert, dass der Glukosetransporter stabil exprimiert wird. Wildtypische Zellen zeigten nur sehr geringe Transportraten für Glukose. Es wird belegt, dass GLUT-1 aus Säugern auch über Tierreichg renzen hinweg Hexosen selektiv transportiert mit einer Kinetik, die derjenigen in menschlichen Erythrozyten vergleichbar ist. Ob eine verbesserte Aufnahme von Glukose mit Vorteilen für die rekombinanten Zellen verbunden ist, wird nicht u ntersucht oder beschrieben.
WO 97/15668 beschreibt den Einsatz eines Therapeutikums gegen neoplastische Erkrankungen, Streptozotocin oder STZ. Dieses Mittel ist ein Glukoseanalog und gelangt über Glukosetransportmechanismen in Zellen. Mehrere Einsatzmöglichkeiten für STZ und GLUT-2 rekombinante Zellen werden vorgeschlagen, eine Kopplung mit der Expression eins Fremdgens wird jedoch nicht erwähnt.
Es bestand somit weiterhin Bedarf für ein Selektionssystem, bei dem der Erhalt und die Hochexpression von Fremdgenen unabhängig von externen Selektions- markern möglich ist und gleichzeitig Induktion von Apoptose verhindert wird, also nicht - wie dies bei Bcl-2-Überproduktion der Fall wäre - der Abbruch eines schon laufenden Programms in einer vorgeschädigten Zelle erfolgt. Kurzbeschreibung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, dass mittels einer bestimmten Manipulation - nämlich der Expression von Zucker-Transportproteinen, die den Energiestoffwechsel der Zellen verbessern, insbesondere eine verbesserte Nutzung von Zuckern trotz gezielter oder verfahrenstechnisch bedingter Depletion von Nährstoffen oder Kofak- toren im Medium erlauben - besonders geeignete Zellen für die stabile Expression von Fremdgenen generiert werden können. In einer bevorzugten Variation der Erfindung werden die Zellkulturen unter widrigen Wachstumsbedingungen, zum Beispiel bei sehr hoher Zelldichte in Bioreaktoren oder bei Implantation als Zellkapsel in einen Organismus, vor Nekrose und/oder Induktion von Apoptose geschützt.
Einige Zellinien, wie zum Beispiel CHO Zellen, reagieren auf die vorstehend skizzierten Mangelbedingungen mit Apoptose, andere, wie zum Beispiel HEK 293 Zellen, verlangsamen die Proliferation (Zhangi, J.A. et al., Biotechnol. Bioeng. 64:108-119 (1999) und eigene Beobachtungen des Anmelders). Die 293 Zellen werden im Zusammenhang mit Fig. 5 kurz diskutiert. Zellen, die nun jedoch das Zucker-Transportprotein exprimieren, sind besser befähigt, die niedrige Nährstoffkonzentration im Kulturüberstand zu nutzen und können proliferieren.
Überraschend ist hierbei außerdem, dass sich die Kultur durch den Verbrauch von Zuckern sukzessive selbst die Bedingungen einstellt, die zu einem verstärkten Selektionsdruck hin zu hochexprimierenden Zellen führen. Darüberhinaus ist es nicht erforderlich, das Nährmedium mit Antibiotika wie Gentamycin oder Hy- gromycin B zu versetzen, um den Erhalt von Fremdgenen zu gewährleisten.
Überraschenderweise wurde bei der Entwicklung des Systems beobachtet, dass die Produktionsraten von Fremdproteϊn in Zellen unter z. B. Glukosemangelbedingungen erhöht waren. Da aber die Proliferationsrate mit dem Glukoseangebot korrelierte, war folglich! die spezifische Produktion (Produktionsrate pro Zelle) unter Glukosemangel erhöht und das Verhältnis von sekretiertem Fremd protein zu anderen Komponenten im Kulturüberstand zugunsten einer vorteilhaften Aufreinigung verschoben. Es wird angenommen, dass im frühen Stadium des Zellstresses durch Glukosernangel die umfangreiche Aktivierung von Stressfaktoren auch zu einer metabolischen Aktivierung der Zelle führt, und damit zu erhöhten Expressionsleistungen für das Fremdgen. Fortwährender Glukosemangel induziert jedoch den Unfolded Protein Response (UPR; also die transkriptionelle Aktivierung von Genen infolge von Akkumulation mißgefalteter Proteine) und ist aus- serdem Ursache für fehlerhafte Prozessierung von Glykoproteinen im endoplas- matischen Retikulum und Golgi Apparat (Kaufman, R. J. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 3:411-21 (2002)). Das hier getestete und beschriebene System inhibiert möglicherweise die Induktion der massiven Stressantwort und erlaubt auch bei herabgesetzten Glukosekonzentrationen die Synthese normal prozessierter Gly- koproteine. Diese Eigenschaften stellen einen erheblichen Vorteil in der Produktion von rekombinanten Proteinen und pharmazeutischen Wirkstoffen dar.
Niedrige Glukosewerte interferieren auch mit der Replikation einiger Viren, zürn Beispiel Adenoviren (Bardell, D., -Microbios 20:139-44 (1977)), die als virale Vektoren oder für die Impfstoff Produ tion eine wichtige medizinische Bedeutung besitzten. Darüber hinaus wird Glukose im Medium durch die erhöhte Glykolyse in den infizierten Zellen (Bardell, D., Microbios 20:139-44 (1977)) schneller erschöpft. Da Glukose in höheren Konzentrationen jedoch toxisch für die Wirtszelle ist (Acker, H. et al., Cancer Res 47:3504-8 (1987); Medina-Navarro, R. et al ., Hum Exp Toxicol 23:101-5 (2004)), kann der erhöhte Glukosebedarf nur eingeschränkt durch erhöhte Zugabe von Glukose kompensiert werden. Das hier beschriebene System erleichtert die Nutzung von Zuckern auch bei herabgesetzten Konzentrationen im Kulturmedium und erlaubt so verbesserte Ausbeuten in der pharmazeutischen Produktion von Viren oder viralen Vektoren.
Der Schutz der Zellen im Hochdichtereaktor vor Apoptose und/oder Nekrose folgt einem der Selektion verwandten Prinzip. Hierbei sind es jedoch vor allem lokale Variationen in der Nährstoffkonzentration, die das vorliegende System abpuffern soll. Auf diese Weise wird die Ku ltur vor nekrotischen oder apoptotischen Foci in Bereichen geringerer Diffusion geschützt, wodurch Kulturdauer und Produktionsintervalle verlängert werden sowie der Anteil von Abbau Produkten verringert wird.
Nachdem die Fremdgenhochexpression Energie benötigt, ist es zudem überraschend, dass die Glukoselimitierung in vorliegender Erfindung zu einer erhöhten Expression eines Fremdgens führt; denn mit der Glukoselimitierung im extrazellulären Raum wird der passive Influx von Glukose behindert.
Die Erfindung betrifft somit:
(1) ein Verfahren zur Expression eines oder mehrerer Fremdgene in Eukaryontenzellen (nachfolgend kurz "Zeller»"), umfassend die Unterstützung des Energiestoffwechsels der Zellen durch das Einbringen eines funktioneilen Nukleinsäure- segments in die Ausgangszellen, das für ein Zucker-Transprotprotein kodiert, dessen Expression den Energiestoffwechsel der transformierten Zellen im Vergleich zu den Ausgangszellen verbessert (wenn es in den Zellen exprimiert wird) und dessen Expression mit der Frerndgen-Expression verknüpft ist;
(2) ein Verfahren zur Selektion einer Eukaryontenzelle, die zur Expression eines oder mehrerer Fremdgene geeignet ist, wobei die selektierte Zelle durch Einbringen eines funktioneilen Nukleinsäuresegments, das für ein Zucker- Transportprotein kodiert, dessen Expression den Energiestoffwechsel der Zellen gegenüber den Ausgangszellen verbessert und dessen Expression mit der Fremdgen-Expression verknüpft ist, modifiziert wurde und insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens gemäß (1) geeignet ist, und wobei das Verfahren einen oder mehrere der Schritte (a) Transformieren oder Transfizieren von Ausgangszellen mit dem funkti- onellen Nukleinsäuresegrnent; und (b) Selektion unter Depletion eines oder mehrerer der durch das Zucker- Transportprotein transportierten Nährstoffe oder Kofaktoren; umfasst;
(3) Eukaryontenzellen, die für ein wie in (1) definiertes Verfahren geeignet sind und/oder durch das Verfahren gemäß (2) erhältlich sind, und die mit einem funk- tionellen Nukleinsäuresegrnent, wie in (1) definiert, transformiert oder transfi- ziert sind;
(4) ein funktionelles Nukleinsäuresegrnent, wie in (1) definiert; und
(5) die Verwendung von Zellen, wie in (3) definiert, zur Expression von Fremdgenen und zur Vermehrung von Viren.
Beschreibung der Figuren
Fig. l: CHO Zellen transfiziert mit pIJO-22-GlutGFP (SEQ ID NO:l). Gezeigt sind repräsentative Ausschnitte der Kultur 7, 14 und 15 Tage nach Transfektion (je- weils a, b; c, d und e, f). Für jeden Zeitwert sind Pfnasenkontrastbilder (a, c, e) und Fluoreszenzaufnahmen zum Nachweis von GFP dargestellt (b, d, f). Induktion von Zelltod durch Glukosemangel wird ab Tag 14 deutlich. Die Dynamik dieses Prozesses wird deutlich, wenn die Zelldichte an den beiden aufeinanderfolgenden Tagen verglichen wird. Bevorzugt überleben Zellen, die die GLUT-GFP Kassette tragen.
Fig. 2: Paralleles Kontrollexperiment zu Fig. 1: CHO Zellen transfiziert mit p O- 25-NeoGFP (SEQ ID NO: 2). Gezeigt sind repräsentative Auschnitte der Kultur 7, 14 und 15 Tage nach Transfektion (jeweils a, b; c, d und e, f). Für jeden Zeitwert sind Phasenkontrastbilder (a, c, e) und Fluoreszenzaufnahmen zum Nachweis von GFP dargestellt (b, d, f). Ab Tag 14 wird ein gleichförmiges Absterben der Kultur deutlich, unabhängig von der Gegenwart des transfizierten Episoms. Die Transfektionseffizienz für pDO-22-GIut-GFP (SEQ ID NO: l) in Fig. 1 und für pl- JO-25-NeoGFP (SEQ ID NO:2) in Fig. 2 war identisch .
Fig. 3: Mit pDO-22-GlutGFP (SEQ ID NO:l) (a, b) oder pUO-25-NeoGFP (SEQ ID NO:2) Kontrollplasmid (c, d) transfizierte CHO Zellen wurden mit Hygromycin B vorselektioniert und ohne Mediumwechsel solange kultiviert, bis die Kulturen auf etwa 5% Konfluenz abgestorben sind. Anschließend wurde die Kultur durch regelmäßige Medienwechsel bis auf Konfluenz kultiviert und im Phasenkontrast (a, c) und unter Fluoreszenzfilter zum Nachweis des Reporterproteins (b, d) photo- graphiert. Durch die widrigen Kulturbedingungen konnten im vorselektionierten Pool Subpopulationen entstehen, die das Episom verloren haben. Dieser Effekt war deutlich ausgeprägt in der Transfektion mit dem Referenzplasmid (NeoGFP Kassette; SEQ ID NO:2), nicht aber mit dem Effektorplasmid (GlutGFP Kassette; SEQ ID NO: l)).
Fig. 4: Deutlicher Anstieg der Expression von selektierter alkalischer Phosphatase (SEAP) in Vektor pIJO-76 (GLUT-PV-SEAP) (SEQ ID NO:3) in Minimalmedium. Gegenüber der Referenz (p O-73 (PV-SEAP) (SEQ ED NO:4) in Minimalmedium) ist zum Endpunkt der Messung die SEAP-Aktivität 6fach höher. Auch in anderen Medien (Vollmedium oder Vollmedium mit 600 μg/ l Selektionsreagenz G418) ist die Expression von pDO-76 (GLUT-PV-SEAP) (SEQ ID NO:3) besser als beim Referenzplasmid pIJO 73 (PV-SEAP). Volle Symbole für Experimente mit Effek- torplasmid pDO-76 (GLUT-PV-SEAP) (SEQ ID NO:3), offene Symbole für Referenzplasmid pEO 73 (PV-SEAP); Rauten für Kultivierung in Vollmedium, Quadrate für Vollmedium zusammen mit G418, Dreiecke für Minimalmedium.
Fig. 5: 293-Zellen mit Plasmid mit episomaler GLUT-IRES-GFP Kassette (pDO-71 (SEQ ID NO:5)) wachsen in unsupplementiertem Medium und unter Glukosemangel besser als Wildtypzellen. Dargestellt sind Wildtypzellen in der linken Säule und transfizierte Zellen in den beiden rechten Säulen. Die transfizierten Zellen wurden vor Beginn dieses Experiments für 8 Wochen mit G418 selektioniert. Un- supplementiertes Glukose-Mangelmedium M4566 wurde für die Dauer des Experiments nicht gewechselt (Abbildungen a-i). Gleiche Anfangsbedingungen sind in a-c dokumentiert. Nach 4 Wochen Kultivierung (vergleiche g mit h und i), nicht aber nach 2 Wochen (d-f), wird der Vorteil für die Transfektanten deutlich. Als Referenz in Abbildungen j-l Zelldichten für Wildtyp und Transfektant in unsupplementiertem F10 Medium.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In dem Verfahren gemäß Ausführungsform (1) der Erfindu ng wird ein funktionel- les Nukleinsäuresegment in den Zellen exprimiert und dadurch der Energiestoffwechsel der Zellen gegenüber den Ausgangszellen verbessert.
Ein funktionelles Nukleinsäuresegment im Kontext der vorliegenden Erfindung, insbesondere im Sinne der Ausführungsform (4) der Erfi ndung, codiert für ein Zucker-Transportprotein, vorzugsweise für einen Faktor, der die Nutzung von Mono-, Di- oder Oligosacchariden durch die transformierten Zellen im Vergleich zu den Ausgangszellen verbessert. Der unterstützte Energiestoffwechselweg ist dabei vorzugsweise ausgewählt aus Glykolyse, Citratzyklus, Pentosephosphat- weg, Gluconeogenese, wobei der bevorzugte Energiestoffwechselweg die Glykolyse ist. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuresegment kann ein DNA-Segment (enthalten in einem Vektor, Plasmid u.s.w.) oder RNA-Segrnent (viraler RNA Vektor) sein. Das funktioneile Nukleinsäuresegment kann neben der Sequenz, die für das Zucker-Transportprotein codiert, weitere funktionelle Sequenzen umfassen, welche für eine erfolgreiche Transformation und/oder Expression erforderlich sind, vorzugsweise Promotoren, zu exprimierende Fremd gene, IRES-Elemente, Selektionsmarker, Aktivatorproteine von regulatorischen Kaskaden, eis- und trans-aktive Faktoren zur verbesserten Translation einer mRNA oder für die Erkennung durch virale Faktoren z. B. zur Verpackung in Hüllen oder Replikation etc.
Ein „Nährstoff1 ist im Kontext der vorliegenden Erfindung eine Verbindung, welche durch den Primärmetabolismus einer Zelle zur Gewinnung von Energie umgesetzt wird. Bevorzugte Nährstoffe für die Durchführung der vorliegenden Erfindung sind Zucker.
Als Zucker werden im folgenden natürlich vorkommende Zucker und deren Derivate („Zuckerderivate") verstanden. Es sind bevorzugt Mono-, Di- oder Oligosac- charide, besonders bevorzugt Monosaccharide, ganz besonders bevorzugt Hexo- sen. Von letzteren sind insbesondere Glukose und Fruktose sowie die entsprechenden Pyranoside und Furanoside bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt ist Glukose. Zuckerderivate im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, welche durch Derivatisierung der funktionellen Gruppen von natürlich vorkommenden Zuckern entstehen, z. B. alkylierte und acylierte Zucker, aber auch reduzierte oder oxidierte Zucker, z. B. Zuckeralkohole wie Sorbit oder Xylit.
Ein „Zucker-Transportprotein" ist ein Protein, das zum Transport eines oder verschiedener Zucker geeignet ist. Es wird durch ein Zucker-Tra nsportprotein-Gen codiert. Zur Durchführung des Verfahrens nach (1) oder (2) werden bevorzugt Hexose-Transportproteine verwendet.
Eine „Depletion" im Sinne der vorliegenden Anmeldung ist ein Mangel an bestimmten Nährstoffen im Medium, insbesondere an bestimmten Zuckern, im Vergleich zu für das Wachstum und/oder den Erhalt der Zellen optimalen Konzentrationen. So ist eine Zuckerdepletion gekennzeichnet durch eine Konzentration von bis zu 1 g/l, bevorzugt bis zu 0,5 g/l, bevorzugt bis zu 0,2 g/l desjenigen Zuckers, der durch das Zucker-Transportprotein transportiert wird und dessen Konzentration somit direkten Einfluss auf den Stoffwechsel der transformierten Zelle hat, bei geringer Konzentration alternativer Nährstoffe im Frischmedium. Geringe Konzentration alternativer Nährstoffe bedeutet eine Konzentration, die im Vergleich zu üblichen Konzentrationen dieser Nährstoffe in Standardmedien nicht erhöht ist. Eine geringe Konzentration alternativer Nährstoffe ist ge- währleistet, wenn - im Falle von Glukose als transportierter Hexose - bei den genannten Zuckerkonzentrationen neben Glukose als Zucker keine weiteren Hexo- sen im Medium enthalten sind. So sollte in dem Medium Natrium pyruvat, vorzugsweise eine Konzentration von maximal 200 mg/1, insbesondere maximal 110 mg/1, Glutamin, vorzugsweise eine Konzentration von maximal 4 mM, ϊ nsbeson- dere von maximal 2 mM, und Glutamat vorzugsweise eine Konzentration von maximal 120 mg/1, vorzugsweise von maximal 80 mg/1 aufweisen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können als Ausgangszellen Eukaryontenzellen („Zellen"), also Vertebraten-, Invertebraten- oder Pflanzenzellen eingesetzt werden, wobei Vertebraten- oder Invertebratenzellen bevorzugt sind. Säugerzellen (wie Nager-, Hund-, Schweine-, Rind- oder Primatenzellen (eϊ nschließ- lich humaner Zellen)) sind besonders bevorzugt. Ebenfalls sind Zellen von niederen Eukaryonten (wie Hefen und Spaltpilzen) einsetzbar. Der Begriff „z:ellen" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst auch Gewebe/Gewebekulturen sowie (nicht-humane) Organismen aus den vorstehend definierten Zellen. Es k;önnen in dem erfindungsgemäßen Verfahren primäre oder transformierte Zellen eingesetzt werden. Bevorzugte Zellen umfassen dabei primäre humane Fibroblasben, CHO- Zellen, BHK-Zellen, NSO-Zellen und HEK-293-Zellen.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren nach (1) oder (2) die Kultivierung einer wie vorstehend definierten transformierten Eukaryontenzelle und die Isolation des Expressions produkts aus der Kultur. Die Kultivierung im Rahmen des Verfahrens (1) und (2) kann in vitro oder in vivo erfolgen, erfolgt jedoch vorzugsweise in vitro. Ein unerwarteter günstiger Effekt des Verfahrens nach (1) und (2) liegt darin, dass die Zelldichte für Kulturen in Minimalmedium deutlich unter der Dichte der Zellen im Vollmedium am gleichen Tag liegt, obwohl sich die Exp> ressions- stärke der Gene nicht wesentlich unterscheidet (Beobachtung in Beispiel 2C). Damit ergibt sich eine höhere spezifische Expressionsaktivität der einzel nen Zelle im Minimalmedium. Dieser Effekt hat einen erheblichen Vorteil für die Produktion, da sich für die Reinigung des Produkts aus dem Kulturüberstand die Abrei- cherung von sekretierten Metaboliten einfacher gestaltet.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren (1) und (2) kann das funktionelle Nukleinsäuresegment transient oder stabil in die Zellen eingebracht werden. Dies erfolgt durch dem Fachmann geläufige Verfahren, wie Transformation und Transfektion mit geeigneten Konstrukten (Vektoren, Plasmiden, etc.) umfassend das vorstehend definierte funktionelle Nukleinsäuresegment.
In einem bevorzugten Aspekt des Verfahrens (1) ist das Zucker-Transportprotein ein Hexose-Transportprotein, besonders bevorzugt ein Glukose-Transportprotein. Letzteres ist entweder ein passives Glukose-Tansportprotein, das eine Diffusion von Glukose, Fruktose und/oder anderen Hexosen in die Zellen erleichtert, oder ein aktives Glukose-Transportprotein, das Glukose, Fruktose und/oder andere Hexosen durch ein aktives Symportsystem in die Zelle transportiert. Bevo rzugt ist es ein passives Glukose-Transportprotein ausgewählt aus der Gruppe umfassend GLUT-1-, GLUT-2-, GLUT-3-, GLUT-4-, GLUT-5- oder GLUT-7-Proteine. Ganz besonders bevorzugt ist das Zucker-Transportprotein GLUT-1.
In einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens (1) weist die Ausgangszelle wenigstens eine Kopie des Zucker-Transportprotein-kodierenden Gens auf. In einer alternativen Ausführungsform ist das Gen in der Ausgangszellen inaktiviert. Das hier beschriebene System funktioniert auch in Zellen (CHO und HEK 293), die über intakte endogene Stoffwechselwege verfügten, welche durch das erfindungsgemäße System komplementiert werden.
Das Zucker-Transportprotein-Gen im Verfahren (1) oder (2) kann heterolog oder homolog zur Ausgangszelle sein. Bei einem heterologen Zucker-Transportprotein ist jedoch zu berücksichtigen, dass dieses in der transformierten Zelle die gewünschte Funktion entfaltet. Das Zucker-Transportprotein der vorliegenden Erfindung stammt bevorzugt aus Eukaryonten, besonders bevorzugt aus Säu gern, ganz besonders bevorzugt aus Mensch oder Maus. Speziell bevorzugt ist ein Zucker-Transportprotein aus Mensch.
Im Verfahren gemäß Ausführungsform (1) ist die Expression des Zucker- Transportproteins mit der Expression eines Fremdgens verbunden. Diese Verbindung entsteht entweder durch eine direkte Verknüpfung der Expression des Fremdgens mit der Expression des Zucker-Transportprotein-Gens oder über eine regulatorische Kaskade. Die direkte Verknüpfung ist möglich durch die Steuerung der Expression beider Gene über einen gemeinsamen Promoter. Ist dieser Pro- moter bidirektional, so können für beide Gene getrennte Transkripte gebildet werden. In einer bevorzugten besonders engen direkten Verknüpfung befinden sich jedoch beide Transkripte auf einem biscistronischen RNA-Molekül. In einer besonders bevorzugten Anwendung wird dabei die Expression des Gens in der hinteren Position durch ein IRES-Element ermöglicht, welches die beiden Gene miteinander verknüpft. Bevorzugte IRES-Elemente sind diejenigen des Encepha- lomyokarditisvirus (Ghattas, I. R. et al., Mol Cell Biol 11(12): 5848-59 (1991)) oder des Poliovirus (Haller, A. A. et al., J Virol 67(12) :7461-71 (1993)). Auch Leader-Sequenzen bestimmter zellulärer Gene wie die des myc-Gens, die eine cap-unabhängige Initiation der Translation erlauben, kommen als IRES in Frage. Beide Gene können auch nach alternativem Splicing von einem Primärtransript translatiert werden.
Als regulatorische Kaskaden zur Verbindung der Expression des Zucker- Transportprotein-Gens mit der Expression des Fremdgens eignen sich regulatorische Kaskaden, welche die Expression eines Gens steuern können. Bevorzugt wird in einer solchen Kaskade die Expression des Zucker-Transportprotein-Gens mit der Expression eines Aktivatorproteins direkt verknüpft, vorzugsweise wie vorstehend beschrieben, wobei das Aktivatorprotein wiederum die Expression des Fremgens an einer anderen Stelle der DNA aktiviert. Geeignete Aktivatorproteine für regulatorische Kaskaden sind z. B. Steroidrezeptoren. Bei dieser Variante kann das Fremdgen stabil transfiziert oder transient in die Zelle eingebracht sein, wobei eine stabile Transfektion bevorzugt ist.
Es bestehen keinerlei Einschränkungen für die Fremdgene, die gemäß der vorliegenden Verfahren exprimiert werden können. Dies umfasst pharmakologisch wirksame Proteine wie z. B. Zytokine, Hormone, Rezeptoren, membranständige oder lösliche Antikörper sowie Fusionsproteine, bei denen wenigstens ein Partner eines der vorstehenden pharmakologisch aktiven Proteine ist.
Im Verfahren nach (1) oder (2) wird die transiente Expression von Proteinen o- der die stabile Integration von Plasmiden oder Genabschnitten angestrebt. Epi- somale Plasmide sind im letzteren Fall dann nicht notwendig. Auch ein stabiles oder transientes virales Vektorsystem, zum Beispiel ein retroviraler oder alphavi- raler Vektor, kann zum Einbringen des funktionalen Nukleisäurefragments genutzt werden. Ein geeigneter Vektor für die Durchführung des Verfahrens nach (1) oder (2) umfasst außer den Signalelementen zur Steuerung der Expression von Fremdgen und Zucker-Transportprotein-Gen (also Promotor(en), Enhancer und PolyA) mindestens ein ori-Element (in Säugetierzellen aktives Transkriptionsstart-Element), sowie mindestens ein Element, welches eine Assozation mit der chromosomalen Matrix bedingt und eine Verteilung während der Zellteilung sicherstellt, und umfasst des weiteren Sequenzen, welche die Vermehrung des Vektors in Vermeh- rungs-Wirtszellen, also insbesondere in Bakterien sicherstellen. Vorzugsweise enthält ein solcher Vektor des weiteren mindestens ein Gen für einen klassischen Selektionsmarker (z. B. Neomycin Phosphotransferase (npt), Hygromycin B- Phosphotransferase (hpt), Blasticidin Deaminase (bda) und Puromycin N-acetyl- Transferase (pac)). Ein bevorzugt zur Transformation verwendetes Plasmid stellt eis- und trans-aktive Faktoren für einen Erhalt als Episom zur Verfügung. Dadurch kann ohne Integration in das Genom der Ausgangszelle die stabile Expression des Fremdgens erreicht werden. Die Zellen werden in einem bevorzugten Aspekt des Verfahrens anfänglich mit einem oder mehren Antibiotika selektio- niert. Nach dem Aufbau einer stabilen Zelllinie werden die Zellen ohne die Zugabe von Antibiotika unter Glukosemangelbedingungen gehalten. Besonders geeignet zur Durchführung des Verfahrens nach (1) oder (2) ist pREP-4 (Invitrogen, San Diego, USA).
In weiteren Aspekten des Verfahrens (1) wird die Expression von Fremdgen und Zucker-Transportprotein über abhängige Expression von zwei Promotoren auf dem gleichen Plasmidrückrad oder über abhängige Expression durch Kotransfek- tion mit verschiedenen Plasmiden gewährleistet. Die Abhängigkeit entsteht dabei über die räumliche Nähe und flankierende genomische Sequenzen. In weiteren Aspekten wird die gemeinsame Expression über die Bildung von Chimären, nicht weiter prozessierten Proteinen, oder über Fusionsproteine erreicht, die kotransla- tional (zum Beispiel durch ribosomalen Leserasterwechsel) oder posttranslational (zum Beispiel durch Proteolyse) voneinander getrennt werden.
Vorzugsweise wird im Verfahren nach (1) oder (2) über Regulation der Menge an Nährstoffen, insbesondere an Zucker, im Kulturmedium die Kultivierbarkeit, ins- besondere das Überleben und die Proliferation der rekombinanten Zellpopulation gezielt unterstützt.
In einem anderen bevorzugten Aspekt des Verfahrens (1) umfasst das Verfahren eine Vorselektion mittels eines herkömmlichen Selektionsprinzips. Dies erfolgt bevorzugt dadurch, dass ein Inhibitor für das rekombinante oder endogene Zucker-Transportprotein zur Selektion der Gen-Amplifikation zugegeben wird. Alternativ kann - wegen der Kopplung der Expression des Zucker- Transportproteins mit der Expression eines für ein Produkt kodierenden Fremdgens - die spezifische Ausbeute an Fremdgen-Produkt durch gezielte oder verfahrensbedingte Nährstoffdepletion gesteigert werden, wobei die Zellen durch den rekombinanten Zucker-Transporter und insbesondere vor Apoptose, Nekrose o- der Inhibition der Proliferation geschützt werden.
In weiteren bevorzugten Aspekten der Verfahren nach (1) oder (2) wird zur Anreicherung transfizierter oder transduzierter Zellen frei von Antibiotikazugabe nur unter Glukosemangelbedingungen kultiviert. Alternativ ist eine gleichzeitige oder abwechselnde Selektion mit Antibiotika und Glukosemangel möglich, wobei die abwchselnde Selektion in verschiedenen Kombinationen und Zeitintervallen erfolgen kann.
In weiteren Aspekten der Verfahren (1) und (2) wird die Selektion und/oder der Erhalt von Fremdgenen durch die Anwendung von Stress unterstützt. Stressoren können zum Beispiel Inhibitoren mitochondrialer Prozesse oder Variationen in der Insulingabe sein. Außerdem wird die Nutzbarkeit von Nährstoffen durch das Einstellen der Ionenkonzentrationen im Kulturmedium (vor allem der am aktiven Symport beteiligten Ionen Na+ und K+) moduliert.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der Einsatz der Zellen im Bioreaktor, Gewebe oder Organismus derart gestaltet werden, dass verfahrensbedingte Nährstoffdepletion besser als durch die Ausgangszellen abgepuffert wird.
Die transformierten Zellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahren (1) erhalten werden, sind zudem in einem bevorzugten Aspekt von (1) als Wirt für die gezielte Vermehrung von Viren oder viralen Vektoren geeignet. Das Selektionsverfahren gemäß (2) umfasst bevorzugt im Schritt (a) zusätzlich eine Vorselektion mit einem herkömmlichen Selektionsprinzip, insbesondere die Vorselektion mit Antibiotika, ganz besonders mit Neomycin oder Hygromycin. Des weiteren oder alternativ dazu umfasst es bevorzugt einen oder mehrere der Verfahrensschritte des Verfahrens gemäß (1) und/oder wird so durchgeführt, wie es in den bevorzugten Aspekten des Verfahrens (1) beschrieben ist. Das funktionelle Nukleinsäuresegment und das Zucker-Transportprotein im Selektionsverfahren gemäß (2) weisen bevorzugt eine oder mehrere der Eigenschaften auf, wie sie vorstehen für das funktionelle Nukleinsäuresegment im Verfahren nach (1) beschrieben sind; insbesondere ist das Zucker-Transportprotein bevorzugt ein Hexose-Transportprotein, ganz besonders bevorzugt eines der oben definierten Glukose-Transportproteine.
Der Einsatz von relevanten knock-out Mutanten kann den Selektionseffekt im Verfahren gemäß (2) verstärken. Eine knock-out Mutation des aktiven Hexo- setransporters SGLT-1 wurde duch niedrige Natriumkonzentration und Abwesenheit von Pyruvat als alternativen Energiedonor im Medium simuliert (Bsp. 3).
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand der bevorzugten Ausführungsform von (1) und (2), nämlich mit einem Hexosetransporter als Zucker- Transportprotein, näher erläutert. Dieser Hexosetransporter ist besonders bevorzugt ein Glukosetransporter.
Glukose kann als polares Molekül nicht frei durch die Plasmamebran diffundieren, sondern gelangt rezeptorvermittelt über energieabhängige Wege in das Zellinnere. Das hier vorgestellte System moduliert den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Nutzung von Glukose als Energieträger, indem die Translokation in das Zellinnere durch spezielle, rekombinant exprimierte Transporterp roteine unterstützt wird. Dadurch können durch die rekombinanten Zellen sehr niedrige äußere Glukosekonzentrationen genutzt werden, während Wildtypzellen ihre Teilungsrate drosseln oder sogar, wie zum Beispiel CHO Zellen, mit programmiertem Zelltod reagieren (Zanghi, J. A. et al., Biotechnol. Bioeng. 64:108-19 (1999)). Weitere Vorteile dieses Systems liegen darin, daß ein euka- ryotisches Gen der gleichen Spezies in die Zelle eingebracht werden kann, im Gegensatz zu vielen heutigen Selektionsmarkern, die prokaryotischer Herkunft sind. Außerdem ist mit dem hier beschriebenen System die Zugabe von Wirkstoffen wie Antibiotika nicht notwendig.
Säugerzellen sind mit zwei mechanistisch unterschiedlichen Transportsystemen für Glukose und weitere Hexosen ausgestattet, der erleichterten Diffusion (durch passive Glukose-Transportproteine) und dem aktiven Symport (durch aktive Glukose-Transportproteine) :
Eine erleichterte Diffusion wird von spezifischen Rezeptoren der GLUT Proteinfamilie (GLUTl bis GLUT5 und GLUT7) katalysiert und erlaubt den Influx von Hexosen (neben Glukose im Falle von GLUT5 vor allem Fruktose) entlang eines Konzentrationsgradienten (Brown, G. K., J. Inherit. Metab. Dis. 23:237-46 (2000)). Im Zytoplasma werden die Hexosen durch Phosphorylierung dem Gradienten entzogen, so daß es nicht zum Rückstau kommt. GLUTl bis GLUT5 sind integrale Proteine der Plasmamebran, GLUT7 wird auf den intrazellulären Membranen des endoplasmatischen Retϊkulums exprimiert.
Aktive Transporter bringen Metabolite wie Aminosäuren und Zucker unter Nutzung von elektrochemischen Gradienten in das Zytoplasma. In dieser sehr heterogenen Superfamilie von Proteinen erfolgt der Glukosetransport durch SGLT1 (Wright, E. M. et al., J. Exp. Bioi. 196:197-212 (1994)), das den Na+-Konzentra- tionsgradienten in einem sogenannten Symport für eine aktive Anreicherung der Glukose in der Zelle nutzt. Der treibende Na+ Gradient wiederum wird unter Hydrolyse von ATP im Antiport von Na+ im Lumen gegen K+ aus dem extrazellulären Raum aufrecht erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens (1) werden Fremdgen und Zucker-Transportprotein-Gen auf einer mRNA über ein IRES-Element miteinander verbunden. Vorzugsweise codiert das Zucker-Transportprotein-Gen für einen Glukose-Transporter. Der Glukosetransporter kann ein aktiver Transporter sein, oder ein Faktor, der die Diffusion der Nährstoffe erleichtert.
Nicht nur Glukose-Transportproteine können für das Verfahren nach (1) oder (2) verwendet werden: In einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung wird der für Fruktose spezifische Transporter GLUT5 exprimiert und das System mit Fruktose als Energieträger verwendet. In wieder anderen Aspekten wird eine Kombination von Transportern, zum Beispiel GLUTl mit GLUT5, GLUTl mit dem im Endoplasmatischen Retikulum angesiedelten GLUT7, oder SGLT1 mit GLUTl, und/oder eine Kombination von Zuckermolekülen oder auch Zuckerderivaten eingesetzt. Bei der Kombination von Substanzen wird zum Beispiel Glukose zur Selektion von SGLTl-rekombinanten Zellen und Genistein (Vera, J.C. et al., 1. Biol. Chem. 271:8719-8724 (1996)) zur Hemmung endogener GLUTl Transporter verwendet.
Das hier vorgestellte System nutzt einen rekombinanten Glukosetransporter in eukaryotische Zellen in zwei Anwendungsbereichen: (i) die Expression des Transporters wird an die Expression eines Fremdgens gekoppelt und ermöglicht so einen Selektionsdruck, der den Erhalt des Fremdgens gewährleistet; oder (ii) der Transporter kann auch unabhängig von einem Fremdgen exprimiert werden, um eine Selektion der Zellen zu ermöglichen und/oder die Kultivierbarkeit von Zellen oder die Produktausbeute unter widrigen Wachstumsbedingungen zu verbessern.
In weiteren Aspekten wird das Prinzip des Systems mit oder ohne der zusätzlichen Expression eines Transporters an späteren Punkten im Energiehaushalt der Zelle genutzt. So können zum Beispiel die Glukohexokinase im Zytoplasma oder die Aconitase in den Mitochondrien, dem Ort des Citratzyklus, in ihrer Expression durch rekombinante Methoden oder in ihrer Aktivität über chemische oder biologische Induktion moduliert werden.
In weiteren Aspekten werden Änderungen der Nährstoff konzentration und/oder spezifische Inhibitoren des Transporters und/oder Substanzen mit Chromoso- men-destabilisierenden Eigenschaften zur Genamplifϊkation eines Fremdgens eingesetzt, das in seiner Expression an die Expression des Transporters gekoppelt ist. In einer Ausführung dieses Aspektes dienen spezifische Wirkstoffe dazu, endogene Transportprozesse zu inhibieren, so daß der rekombinante Transporter verstärkt genutzt werden muß. In wieder anderen Aspekten werden Zellen verwendet, deren endogene Hexosetransportmoleküle experimentell inaktiviert werden, zum Beispiel durch antisense oder knock-out Technologie. In einer weiteren Ausführung wird der Transporter oder eine Kombination von Transporter und Fremdgen mit der Absicht in Zellen exprimiert, diesen eine günstigere Kultivierbarkeit oder ein verbessertes Überleben unter widrigen Bedingungen zu ermöglichen. Diese Zellen könnten zum Beispiel unter Hochzelldichtebedingungen im Bioreaktor eingesetzt werden.
In einem Aspekt dieser Ausführung kann die mit dem Transporter ausgestattete Zelle für den Einsatz in einem lebenden Organismus, zum Beispiel in der ex-vivo Gentherapie, oder für die Implantation eines Zellverbunds oder einer Zellkapsel bestimmt sein. Durch die Expression des Transporters kann eine für die Anwendung günstigere Zelle auch an Orten geringerer Nährstoffkonzentration oder Diffusion geschaffen werden.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch den Schutzbereich der Erfindung nicht einschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Aufbau des GLUT-1 Systems
Gesamt-RNA wurde mit saurem Phenol aus HeLa Zellen extrahiert und mit dT- 16mer Primern durch die SuperScript II Reverse Transkriptase (Invitrogen, Carlsberg CA, USA) in cDNA umgeschrieben. Wegen überraschend geringer Ausbeute an PCR Amplifikationsprodukten wurde die cDNA mit Primern il04 (SEQ ID NO: 10) und il05 (SEQ ID NO: 11) voramplifiziert, und diese PCR Reaktion in einer weiteren PCR Reaktion mit den eigentlichen Klonierungsprimem ilOO (SEQ ID NO:6) und ilOl (SEQ ID NO:7) eingesetzt. Die Amplifϊkationen und Klonierungen sind anhand der (in drei Bereichen untereinander differierenden) Gen- Bank Sequenzen #NM006516 und #XM002033 geplant worden. Für eine gerichtete Klonierung in den episomalen Vektor pREP4 (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) enthalten die Primer ilOO (SEQ ID NO:6) und ilOl (SEQ ID NO:7) unikale Re- striktasen-Zielsequenzen (Hind III und Xho I). Der Vektor pREP4 exprimiert außerdem den Resistenzfaktor gegen Hygromycin B. Um den Erhalt transfizierter episomaler Plasmide verfolgen zu können, wurde eine auf der EMCV-IRES basierende Expressionskassette für das EGFP Reporterprotein (Clontech, Palo Alto CA, USA) unmittelbar nach dem offenen Leseraster für GLUTl inseriert, womit das Plasmid pEO-22-GlutGFP (SEQ ID NO:l) entsteht.
Beispiel 2: Einsatz des GLUT-1 Systems
A. Selektion: Als Kontrolle für eine erfolgreiche Anreicherung von p O-22- GlutGFP (SEQ ID NO:l) aufgrund der Expression von GLUTl wurde der Leserah- rnen für GLUTl durch das Gen für den eukaryotischen Selektionsmarker Neomy- cϊn-Phosphotransferase (Neo) ersetzt, indem p O-22 mit Hind III und Xho I geöffnet wurde und Neo als Stu I und BstB I Fragment aus pEGFP-Nl (Clontech) nach Behandlung mit Klenow DNA Polymerase mit T4 DNA Ligase eingefügt wurde, womit das Plasmid pIJO-25-NeoGFP (SEQ ID NO:2) entsteht. Von Neo ist dem Fachmann bekannt, daß es nicht toxisch ist und Differenzen in der Anreicherung von p O-22-GlutGFP (SEQ ID NO:l) und pIJO-25-NeoGFP (SEQ ID NO:2) sollten sich somit auf die Gegenwart von GLUTl rückführen lassen. Die Plasmide pIJO-22-GlutGFP (SEQ ID NO:l) und pUO-25-NeoGFP (SEQ ID MO:2) wurden als liposomaler Komplex in CHO Zellen transfiziert und die Expression des GFP Markerproteins über 15 Tage hinweg verfolgt. Die Transfektion erfolgte in diesem und in weiteren Experimenten mit LipofectAMINE Plus (Invitrogen): CHO Zellen wurden in 12-Lochplatten am Tag vor der Transfektion ausge- säät. Für die Transfektion wurden 750 ng Plasmid DNA mit 50 μl Opti-MEM (Invitrogen) und 5 μl Plus Reagent gemischt, bei Raumtemperatur inkubiert und nach 15 min mit 2 μl LipofectAMINE in 50 μl Opti-MEM versetzt. Nach weiteren 15 min wurde das Kulturmedium durch frische 400 μl Opti-MEM, vermischt mit dem Transfektionsmix, ersetzt. Nach 3 Stunden wurde 1 ml Medium zugegeben.
Hierbei zeigte sich in anfänglichen Experimenten, dass das für liposomale Trans- fektionen empfohlene Serum-freie Opti-MEM zu viel Glukose enthält, so daß ein Selektionsdruck aufgrund der Umsetzung von Glukose nur langsam einsetzt. In weiteren Experimenten wurde daher das Transfektionsprotokoll für eine Transfektion in Glukose-reduziertem Medium eingestellt. In den hier beschriebenen Versuchen war Glukose-reduziertes Medium (Sigma Taufkirchen, D) MEM Medium #M4655 (Sigma Taufkirchen, D), das mit 5% Kälberserum supplementiert wurde. MEM #M4655 zeichnet sich durch relativ niedrige Glukose (1 g/L) und NaCI (6,8 g/l) Konzentrationen aus; der neuartigen Natur des vorliegenden Systems entsprechend wurde kein Medium mit noch geringeren Glukosekonzentrationen gefunden. Pyruvat ist diesem Medium nicht zugesetzt. Pyruvat ist das sehr energiereiche Produkt der Glykolyse und wird im anschließenden Zitratzyklus endgültig in Energie umgewandelt. Durch den Entzug von Pyruvat sind die Zellen gezwungen, Glukose zur Energiegewinnung in die Zelle zu transportieren.
Fig. 1 und 2 zeigen den zeitlichen Verlauf der GFP Expression in CHO-Kulturen, die parallel mit p O-22-GlutGFP (SEQ ID NO:l) (Fig. 1) oder dem Kontrollplas- mid pUO-25-NeoGFP (SEQ ID NO:2) (Fig. 2) transfiziert wurden. Kultivierung beider Ansätze erfolgte in MEM #M4655. Nach anfänglich vergleichbarer Zahl GFP-exprimierender Zellen und vergleichbaren Signalintensitäten des Reporterproteins für beide Konstrukte kommt es nur in der mit p O-22-GlutGFP (SEQ ID NO: l) transfizierten Kultur zu einer deutlichen Anreicherung GFP-positiver Zellen. Außerdem zeigt sich, dass die GLUT-GFP-exprimierenden Zellen auffallend weniger Zelltod im Mangelmedium erleiden als die Neo-GFP-Kontrollen.
B. Erhalt des Episomes unter Stress: Für Abbildung Fig. 3 wurden mit pDO-22- GlutGFP (SEQ ID NO:l) und pDO-25- NeoGFP (SEQ ID NO:2) transfizierte CHO Zellen durch herkömmliche Selektion mit 200 μg/ml Hygromycin B für 20 Tage angereichtert, 6-fach verdünnt in T25 Kulturflaschen unter MEM #M4655 überführt und anschliessend für 20 Tage ohne Mediumwechsel kultiviert.
Diese äußerst widrigen Kulturbedingungen führten zu massiver Abnahme lebensfähiger Zellen auf etwa 5% Konfluenz und könnten den limitierenden Bedingungen in einem Reaktor ähnlich sein.
Nach dieser Behandlung erfolgten bis zum Erreichen der Konfluenz (weitere 14 Tage) regelmäßige Medienwechsel gegen MEM #M4655 ohne Hygromycin. Abbildung Fig. 3 zeigt eine deutliche Anreicherung der GlutGFP-positiven Zellen im Vergleich zu den NeoGFP-exprimierenden Zellen.
C. Quantifizierung: Das GFP-Reporterprotein erlaubte eine überraschend deutliche Bestätigung der erfindungsgemäßen Funktion des Systems. Im folgenden sollen Expressionsergebnisse für einen anderen Reporter, die Sekretierte Alkalische Phosphatase (SEAP), quantifiziert werden. Dazu wurde in einem episomalen Vektor dem ORF für Glut eine Expressionskassette für SEAP nachgeschaltet. Da für die Sekretion der SEAP die ursprünglichen, aminoterminalen Sequenzen notwendig sein können, wurde als IRES-Element das des Poliovirus (PV) verwendet, welches sich von der EMCV-IRES darin unterscheidet, dass kein ATG- Initiatorkodon durch die IRES gestellt werden muss. Der episomale Vektor mit der Glut-PV IRES-SEAP Kassette wurde pDO-76 (SEQ ID NO:3) genannt, und entstand durch Insertion des Glut-Gens aus pDO-62 (SEQ ID NO: 12) als 1602 bp-grosses Hind III Fragment in den Vektor pDO-73 (SEQ ID NO:4). pEO-62 ist ein Zwischenklon, der ein PCR Amplifikationsprodukt (mit Primern ilOO (SEQ ID NO:6) und ilOl (SEQ ID NO:7)) des Glut-Gens enthält; pDO-73 (SEQ ID NO:4) ist ein EBV-episomaler Vektor, der eine PV-IRES-SEAP Kassette nach einer Multiple Cloning Site enthält; diese Kassette wurde durch Insertion von SEAP als Hind III (Klenow-behandelt) Not I Fragment aus p O-53 (SEQ ID NO: 13) in mit Sma I und Not I geöffnetem Vektor pBS Polio erzeugt. Als Negativkontrolle dient in den Experimenten mit SEAP der ursprüngliche episomale Vektor (pUO-73 (SEQ ID NO:4)), dem der ORF für Glut ersatzlos fehlt. Der für die SEAP- Experimente verwendete episomale Vektor trägt das Resistenzgen für die Inaktivierung von G418 (Neo, Neomycinphosphotransferase).
CHO Zellen wurden mit p O-76 (GLUT-PV-SEAP) (SEQ ID NO:3) und pDO-73 (PV-SEAP) (SEQ ID NO:4) transfiziert und SEAP Sekretion in das Medium über 2 Wochen hinweg verfolgt (Fig. 4). Durch die Normierung der Daten auf den jeweils ersten Wert (Tag 2) werden unterschiedliche Expressionsstärken zwischen pDO-76 (GLUT-PV-SEAP) (SEQ ID NO: 3) und p O-73 (PV-SEAP) (SEQ ID NO:4) ausgeglichen: die Expression von SEAP ist höher im Kontrollvektor pIJO-73 (PV- SEAP) (SEQ ID NO:4) als in pDO-76 (GLUT-PV-SEAP), da der SEAP im Referenzplasmid kein Gen vorgelagert ist. Am Tag 12 beträgt der Hintergrundbereinigte, absolute SEAP Wert des abgebildeten Versuchs 667889 relative Lichteinheiten für pIJO 76 (GLUT-PV-SEAP) in Minimalmedium, 546866 relative Lichteinheiten für pIJO 73 (PV-SEAP) in Vollmedium/G418 und 344'356 für pIJO 73 (PV-SEAP) in Minimalmedium. D. 293 Zellen: HEK 293 Zellen zeigten sich überraschenderweise unempfindlich gegenüber Glukoselimitierung. Trotz dieser für eine Selektion ungünstigen Vorbedingungen wurde das Glut-System auch in HEK 293 Zellen eingesetzt und erbrachte einen unvorhergesehenen Effekt: HEK 293 Zellen wurden mit pDO-71 (EBN-GLUT-GFP) (SEQ ID NO: 5) transfiziert und mit G418 für 8 Wochen selekti- oniert. Die stabilen Transfektanten wurden parallel mit wildtypischen HEK 293 als Referenz auf gleiche Konfluenz in verschiedenen Medien (ohne G418) vorgelegt: unsupplementiertes #M4655, unsupplementiertes F10 Medium, und Serum- supplementiertes PBG 1.0 Medium. Das Kulturmedium wurde für die folgenden 4 Wochen nicht gewechselt oder mit frischem Medium versetzt. Fig. 5 zeigt den Ausgangspunkt und zwei Momentaufnahmen (nach 2 und 4 Wochen). Überasch- enderweise wurde nur unter Glukosemangel nach 4 Wochen, nicht aber nach 2 Wochen, ein deutlicher Unterschied in der Dichte der Zellen beobachtet. (F10 Medium enthält mit 1100 mg/1 ebenfalls wenig Glukose, was jedoch durch 110 mg/1 Natriumpyruvat kompensiert wird). Die Fluoreszenzaufnahme zeigt, dass das episomale Transgen ohne weitere G418-Selektion über die 4 Wochen Versuchsdauer vollständig erhalten worden ist. Die vorliegende Erfindung eignet sich somit unerwarteterweise auch zur Unterstützung der Langzeitkultivierung von Zelllinien, die auf Glukosemangel scheinbar nicht reagieren.
Beispiel 3: Einrichtung des SGLT-1 Systems
Gesamt-RNA wurde mit saurem Phenol aus HeLa Zellen extrahiert und mit dT- 16mer Primern durch die SuperScript II Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Die Amplifikationen mit Primerpaar il02 (SEQ ID NO:8) und il03 (SEQ ID NO:9) sowie Klonierungen sind anhand der GenBank Sequenz #M24847 geplant worden. Für eine gerichtete Klonierung in den episomalen Vektor pREP4 enthalten die Primer il02 (SEQ ID NO:8) und il03 (SEQ ID NO:9) unikale Re- striktasen-Zielsequenzen.
Nachdem anfängliche Amplifikationen über RT-PCR nicht erfolgreich waren, sind für weitere Versuche HeLa Zellen eingesetzt worden, die unter Glukosemangelbedingungen kultiviert waren. So sollte eine mögliche Induktion der Expression von SGLT1 erreicht werden, und damit eine relative Anreicherung der SGLT1 mRNA. Tatsächlich konnte aus derart behandelten Zellen isolierte RNA in der RT- PCR in ein überraschend breites Spektrum von Amplifikationsprodukten umge- wandelt werden. Das Produktspektrum zeichnete sich durch sehr geringe Ausbeuten und einer Schar von Signalen aus, die auch im Bereich der erwarteten Größe von 2013 bp auf unterschiedlich große Produkte schließen lassen. Durch die Klonierung unterschiedlich großer Amplifikationsprodukte konnte die gewünschte Sequenz isoliert und in das episomale Plasmid pREP4 transferiert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Expression eines oder mehrerer Fremdgene in Eukaryontenzellen (Zellen), umfassend die Unterstützung des Energiestoffwechsels der Zellen durch Einbringen eines funktionellen Nukleinsäuresegments in die Ausgangszellen, das für ein Zucker-Transportprotein kodiert, dessen Expression den Energiestoffwechsel der transformierten Zellen gegenüber den Ausgangszellen verbessert und dessen Expression mit der Fremdgen-Expression verknüpft ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei
(i) der unterstützte Energiestoffwechselweg die Glykolyse ist; und/oder (ii) über die Regulation der Menge an Zucker im Kulturmedium die Kuitivierbar- keit, insbesondere Überleben und Proliferation der rekombinanten Zellpopulation gezielt unterstützt wird; und/oder
(iii) die spezifische Ausbeute an Fremdgen-Produkten durch gezielte oder verfahrensbedingte Zuckerdepletion gesteigert wird, wobei die Zellen durch den rekombinanten Zucker-Transporter und insbesondere vor Apoptose, Nekrose oder Inhibition der Proliferation geschützt werden und/oder
(iv) ein Inhibitor für den rekombinanten oder endogenen Transporter zur Selektion der Gen-Amplifϊkation zugegeben wird; und/oder (v) die Kultivierung in vitro oder in vivo, vorzugsweise in vitro, erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei
(i) das exprimierte Zucker-Transportprotein die Nutzung von Mono-, Di- oder Oligosacchariden gegenüber den Ausgangszellen verbessert, und insbesondere das Transportprotein ein Hexose-Transportprotein, bevorzugt ein passives Glukose-Transportprotein, das eine Diffusion von Hexose in die Zellen erleichtert, oder ein aktives Glukose-Transportprotein, das Hexose durch ein aktives Symport- system in die Zelle transportiert, ist, wobei ein passives Glukose- Transportprotein, ausgewählt aus einem GLUT-1-, GLUT-2-, GLUT-3-, GLUT-4-, GLUT-5- und GLUT-7-Protein, besonders bevorzugt ist; und/oder (ii) die Ausgangszelle wenigstens eine Kopie des Zucker-Transportprotein- kodierenden Gens aufweist oder das Gen in der Ausgangszelle inaktiviert ist; und/oder (iii) die Zellen Vertebraten- oder Invertebraten-Zellen, vorzugsweise Säugerzellen sind, die sowohl primäre als auch transformierte Zellen sein können, wobei primäre humane Fibroblasten, CHO-Zellen, BHK-Zellen, NSO-Zellen und HEK- 293-Zellen besonders bevorzugt sind; und/oder
(iv) das funktionelle Nukleinsäuresegment transient oder stabil in die Zellen eingebracht ist; und/oder
(v) das funktionelle Nukleinsäuresegment ein DNA- oder RNA-Segment ist; und/oder
(vi) die Fremdgene ausgewählt sind aus Zytokinen, Hormonen, Rezeptoren, membranständigen oder löslichen Antikörpern und Fusionsproteinen; und/oder (vii) das funktionelle Nukleinsäuresegment weitere funktionelle Sequenzen, vorzugsweise Promotoren, zu exprimierende Fremdgene, IRES-Elemente, Selekti- onsmarker, Aktivatorproteine von regulatorischen Kaskaden, eis- und transaktive Faktoren, zur verbesserten Translation einer mRNA oder für die Erkennung durch virale Faktoren, insbesondere zur Verpackung in Hüllen oder Replika- tion etc., aufweist.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Expression des Zucker-Transportprotein-Gens direkt oder über eine regulatorische Kaskade mit der Fremdgen-Expression verknüpft ist, wobei (i) bei der direkten Verknüpfung das Fremdgen und das Zucker- Transportprotein-kodierende Gen durch eine Kotransfektion von Plasmiden, welche diese Gene enthalten und in das Genom integrieren, durch eine Konfiguration auf einem Plasmid oder einem RNA-Molekül und bevorzugt über ein IRES- Element, insbesondere ein IRES-Element von Poliovirus oder Enzephalomyocardi- tisvirus miteinander verknüpft sind, oder die Fremdgen-Expression und die Expression des Zucker-Transportprotein-kodierenden Gens vorzugsweise so miteinander verknüpft sind, daß nach der Transkription die Transkripte der Gene sich auf einem mRNA-Molekül befinden und miteinander verknüpft sind, wobei eine Verknüpfung über IRES-Elemente, insbesondere über IRES-Elemente von En- zephalomyokarditisvirus oder Poliovirus besonders bevorzugt ist; und (ii) bei der Verknüpfung über eine regulatorische Kaskade die Expression des Zucker-Transportprotein-Gens direkt mit der Expression eines Aktivatorproteins verknüpft ist, wobei das Aktivatorprotein die Expression des Fremdgens/der Fremdgene, das/die sich an einer anderen Stelle der DNA befindet/befinden, aktiviert.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei
(i) die Konzentration des durch das Zucker-Transportprotein transportierten Zuckers im Medium maximal 1 g/l, bevorzugt maximal 0,5 g/l beträgt, wobei vorzugsweise die Konzentration alternativer Nährstoffe im Medium gering ist; und/oder
(ii) der durch das Zuckertransportprotein transportierte Zucker eine Hexose, bevorzugt Glukose oder Fruktose ist; und/oder
(iii) der Einsatz der Zellen im Bioreaktor, Gewebe oder Organismus derart gestaltet wird, dass verfahrensbedingte Nährstoffdepletion besser als durch die Ausgangszellen abgepuffert werden kann; und/oder
(iv) die transformierten Zellen als Wirt für die gezielte Vermehrung von Viren oder viralen Vektoren angepasst werden; und/oder
(v) das Verfahren das Kultivieren einer transformierten Eukaryontenzelle, wie vorstehend definiert, und Isolation des Expressionsprodukts aus der Kultur umfasst.
6. Verfahren zur Selektion einer Eukaryontenzelle, die zur Expression eines oder mehrerer Fremdgene geeignet ist, wobei die selektierte Zelle durch Einbringen eines funktioneilen Nukleinsäuresegments, das für ein Zucker-Transportprotein kodiert, dessen Expression den Energiestoffwechsel der Zellen gegenüber den Ausgangszellen verbessert und dessen Expression mit der Fremdgen-Expression verknüpft ist, modifiziert wurde und insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 geeignet ist, und wobei das Verfahren einen oder mehrere der Schritte (a) Transformieren oder Transfizieren von Ausgangszellen mit dem funktionellen Nukleinsäuresegment und (b) Selektion unter Depletion eines oder mehrerer der durch das Zucker-Transportprotein transportierten Nährstoffe oder Kofaktoren umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei (i) Schritt (a) weiterhin eine Vorselektion mit einem herkömmlichen Selektionsprinzip umfasst; und/oder
(ii) bei der Selektion die Konzentration des durch das Zucker-Transportprotein transportierten Zuckers im Medium maximal 1 g/l, bevorzugt maximal 0,5 g/l beträgt, wobei vorzugsweise die Konzentration alternativer Nährstoffe im Medium gering ist; und/oder
(iii) das Verfahren und/oder das funktionelle Nukleinsäuresegment eine oder mehrere der in Ansprüchen 2 bis 5 definierten Eigenschaften aufweist.
8. Eukaryontenzellen, die für ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 geeignet sind und/oder nach dem Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7 erhältlich sind, und die mit einem funktionellen Nukleinsäuresegment, wie in Ansprüchen 1 bis 5 definiert, transformiert oder transfiziert sind.
9. Funktionelle Nukleinsäuresegmente, wie in Ansprüchen 1 bis 5 definiert.
10. Verwendung von Zellen, wie in Anspruch 8 definiert, zur Expression von Fremdgenen und zur Vermehrung von Viren.
EP05735849A 2004-04-16 2005-04-15 Eingriff in den energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur selektion und expressionssteigerung Withdrawn EP1735449A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05735849A EP1735449A2 (de) 2004-04-16 2005-04-15 Eingriff in den energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur selektion und expressionssteigerung

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04009094A EP1586650A1 (de) 2004-04-16 2004-04-16 Eingriff in den Energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur Selektion und Expressionssteigerung
EP05735849A EP1735449A2 (de) 2004-04-16 2005-04-15 Eingriff in den energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur selektion und expressionssteigerung
PCT/EP2005/051679 WO2005100564A2 (de) 2004-04-16 2005-04-15 Eingriff in den energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur selektion und expressionssteigerung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1735449A2 true EP1735449A2 (de) 2006-12-27

Family

ID=34924636

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP04009094A Withdrawn EP1586650A1 (de) 2004-04-16 2004-04-16 Eingriff in den Energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur Selektion und Expressionssteigerung
EP05735849A Withdrawn EP1735449A2 (de) 2004-04-16 2005-04-15 Eingriff in den energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur selektion und expressionssteigerung

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP04009094A Withdrawn EP1586650A1 (de) 2004-04-16 2004-04-16 Eingriff in den Energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur Selektion und Expressionssteigerung

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20080057584A1 (de)
EP (2) EP1586650A1 (de)
WO (1) WO2005100564A2 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1824964A4 (de) * 2004-11-19 2009-04-01 Biogen Idec Inc Verfahren zur herstellung von säugetierzellen

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5427940A (en) * 1991-06-03 1995-06-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered cells producing insulin in response to glucose
AU7525496A (en) * 1995-10-23 1997-05-15 Betagene, Inc. Methods and compositions comprising glut-2 and glut-2 chimeras
US5859227A (en) * 1996-07-31 1999-01-12 Bearsden Bio, Inc. RNA sequences which interact with RNA-binding proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2005100564A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20080057584A1 (en) 2008-03-06
WO2005100564A3 (de) 2006-01-19
EP1586650A1 (de) 2005-10-19
WO2005100564A2 (de) 2005-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69031172T2 (de) Modifikation der endogenen genexpression mit hilfe eines regulatorischen elements mittels homologe rekombination
DE69032284T2 (de) Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
KR100379356B1 (ko) 상동재조합을달성하기위한dna구성물및이것의용도
EP1931765B1 (de) Verbessertes zellkulturmedium
DE69535389T2 (de) Methode zur selektion hoch-exprimierender wirtszellen
DE69729481T2 (de) Induzierbares expressionssystem zur erzeugung von verpackungszelllinien für pseudotypisierte retrovirale vektoren
DE68926892T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Zellen, die stabil integrierte fremde DNS mit hoher Kopiezahl enthalten, durch dieses Verfahren hergestellte Zellen und Verwendung dieser Zellen zur Herstellung von durch diese fremde DNS kodierten Polypeptiden
DE3851289T2 (de) Verfahren zur Züchtung rekombinanter Zellen.
DE69027526T2 (de) Herstellung von proteinen mittels homologer rekombination
DE69629576T2 (de) Verfahren zur herstellung von rekombinanten plasmiden
EP2049671B1 (de) Regulatorische nukleinsäureelemente
DE3730599A1 (de) Verfahren zur kontinuierlichen herstellung von heterologen proteinen in eukaryontischen wirtszellen
CA2151032A1 (en) Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination
WO2006015789A2 (de) Verfahren zur modulation der genexpression durch änderung des cpg gehalts
EP1464705B1 (de) Optimierung von Zellen für die endogene Genaktivierung
DE3855681T2 (de) Transkaryotische Einpflanzung
DE60307615T2 (de) Zellkulturmedium
DE60312039T2 (de) Mittel und methoden zur produktion eines proteins durch chromatin-öffner, die chromatin zugänglicher für transkriptionsfaktoren machen können
DE60226343T2 (de) Zur glucoseregulierten produktion von menschlichem insulin in somatischen zelllinien geeignete nukleinsäurekonstrukte
EP1735449A2 (de) Eingriff in den energiestoffwechsel von eukaryontenzellen zur selektion und expressionssteigerung
DE69635513T2 (de) Menschliche Pancreas Zelllinien: Entwicklungen und Anwendungen
WO1996033272A1 (de) Vektoren zur transfektion von eukaryotischen zellen, deren verwendung und damit transfizierte zielzellen
DE60119386T2 (de) Verbessertes transfektionssystem
DE60213441T2 (de) Verwendung des aminoglycosidresistenzgens
AT500838A1 (de) Multiple hse

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20061017

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: WINKLER, KARSTEN

Inventor name: JORDAN, INGO

Inventor name: SANDIG, VOLKER

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20070820

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20121101