EP1664293A2 - Plasminogen-aktivatoren mit verringerter lysin-bindungskapazität - Google Patents

Plasminogen-aktivatoren mit verringerter lysin-bindungskapazität

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Publication number
EP1664293A2
EP1664293A2 EP04765139A EP04765139A EP1664293A2 EP 1664293 A2 EP1664293 A2 EP 1664293A2 EP 04765139 A EP04765139 A EP 04765139A EP 04765139 A EP04765139 A EP 04765139A EP 1664293 A2 EP1664293 A2 EP 1664293A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plasminogen
plasminogen activator
use according
dspa
activator
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04765139A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Söhngen
Oliver Kops
Vincent School of Biological Sciences ELLIS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Paion Deutschland GmbH
Original Assignee
Paion Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Paion Deutschland GmbH filed Critical Paion Deutschland GmbH
Priority to EP10011604A priority Critical patent/EP2368984A1/de
Publication of EP1664293A2 publication Critical patent/EP1664293A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Definitions

  • the invention relates to an advantageous use of plasminogen activators and claims the priority of German patent application 103 42 518.7, to which reference is made in terms of content.
  • thrombolysis as a therapy option for various thromboembolic diseases is considered largely completed.
  • the main interest of thrombolysis research is therefore the further development and modification of known thrombolytics and / or the improvement of accompanying therapies.
  • tissue plasminogen activator t-PA
  • fibrin selectivity an important thrombolytic agent as the starting point for new thrombolytic agents
  • urokinase an important thrombolytic agent as the starting point for new thrombolytic agents
  • tissue plasminogen activator t-PA
  • t-PA tissue plasminogen activator
  • Further developments of this plasminogen activator are the deletion mutants reteplase and lanoteplase as well as tenecteplase.
  • the tissue plasminogen activator is a single-chain glycoprotein consisting of 527 amino acids.
  • the initially single-chain molecule (single-chain; sct-PA) is split into a two-chain form (two chain; tct-PA) by proteolysis.
  • the t-PA has certain structural and functional domains.
  • the N-terminal partial chain comprises the so-called finger domain (F, Ser1 - Lys49), the epidermal growth factor domain (E, Ser ⁇ O - Asp87) and the two kinkle domains (K1, Thr88 - Gly176; and K2, Asn177 - Cys261).
  • the C-terminal chain with a serine proteinase domain (P) comprises the amino acids Ser262 to Pro527.
  • the C-terminal chain forms the active center with the amino acids His322, Asp371 and Ser478.
  • t-PA and its recombinant variants and their production are the subject of, for example, US Pat. No. 4,766,075 and various publications (such as Bode and Renatus: Tissue-type plasminogen activator: variants and crystal / soiution structures demarcate structural determinants of function, Current Opinion in Structural Biology 1997, 7: 865-872).
  • a schematic representation of the t-PA structure is attached as Fig. 1.
  • the sct-PA is converted into the tct-PA form by cleavage.
  • the cleavage takes place at the bond between Arg275 and IIe276.
  • the two chains are then held together only via a single disulfide bridge between Serin264 and Serin395.
  • This numbering of the t-PA cleavage site corresponds to that chosen by Bode and Renatus (op. Cit.). However, other authors use a different numbering and define the cleavage or activation site as R15-I16 or R310-I311. However, the positions defined in this way do not differ functionally and structurally.
  • tissue plasminogen activator (t-PA; old plase) can activate plasminogen to plasmin.
  • Kinetic constants show that t-PA only activates circulating plasminogen with weak activity.
  • the plasminogen bound to fibrin is activated with a catalytic potency improved by three powers of ten compared to the free plasminogen. Accordingly, the thrombolytic property of the tissue plasminogen activator is greatly enhanced by the presence of fibrin.
  • a relative fibrin selectivity with a factor of 500 to 1000 is given for t-PA.
  • the catalytic effect can also be increased by the Interaction of the piasminogen activator with ⁇ -amyloid or fibrinogen can be achieved.
  • the activation of t-PA by fibrinogen is comparable to the activation by ß-amyloid.
  • the action of the piasminogen activator is controlled physiologically by inhibitors, with the plasminogen activator inhibitor I (PAI-1) being the main antagonist.
  • PAI-1 the plasminogen activator inhibitor I
  • PAI-1 the plasminogen activator inhibitor I
  • the structure of the catalytic center is changed so that an activation reaction with the plasminogen can no longer take place (Bennet WF, Paoni NF, Keyt BA, Botstein D, Jones AJS, Presta L, Wurm FM, Zoller M: High resolution analysis of functional determinants in human tissue-type plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry 1991; 266: 5191-5201).
  • tissue plasminogen activator is rapidly metabolized by the liver. Therefore, a patient's hepatic insufficiency prolongs the plasma half-life (Emeis JJ, van den Hoogen CM, Jense D: Hepatic clearance of tissue-type plasminogen activator in rats, Thomb Haemostas 1985; 54: 661-664; Tiefenbrunn AJ, Robison AK , Kurnik PB, Ludbrook PA, Sobel BE. Clinical pharmacology in patients with evolving myocardial infection of tissue plasminogen activator produced by recombinant DNA technology Circulation 1985; 71: 110-116).
  • T-PA is the only thrombolytic currently approved for stroke treatment by the Food and Drug Administration (FDA) in the United States.
  • FDA Food and Drug Administration
  • t-PA shows the expected positive thrombolytic effects on the one hand in the treatment of stroke, but on the other hand also wanted tissue destruction is responsible.
  • NMDA-dependent glutamate receptors (Liberatore GT, Samson A, Bladin C, Schleuning WD, Medcalf RL: Vampire bat salivary plasminogen activator (desmoteplase): a unique fibrinolytic enzyme that does not promote neurodegeneration, Stroke 2003; 34 (2): 537-543).
  • a proteolytic cleavage of the NMDA receptor by t-PA could be responsible for this effect (Nicole O, Docagne F, Ali C, Margaill I, Carmeliet P, MacKenzie ET, et al: The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor -mediated signaling.Nat Med 2001; 7 (1): 59-64).
  • the plasminogen activator has a modified Kringel domain, preferably a Kringel 2 domain modified in comparison to the native t-PA. This can be completely or partially deleted so that the lysine binding capacity is reduced.
  • the K2 domain - or regions which are essentially homologous in terms of function or structure - can advantageously be modified in such a way that the lysine residues no longer bind or only bind with low affinity.
  • the plasminogen activator that can be used according to the invention is modified t-PA.
  • the plasminogen activating factors which can be used according to the invention show, owing to their lack of or reduced lysine binding capacity, an increased fibrin selectivity and a reduced activatability by fibrinogen or ⁇ -amyloid. This reduced fibrinogen activatability is probably the cause of the fibrin selectivity.
  • a high fibrin selectivity of the piasminogen activator is particularly important in the treatment of stroke, since, for example, the native t-PA can be activated via the fibrinogen that overcomes the damaged blood-brain barrier and the glutamate can be activated via the subsequent activation of the NMDA receptors mediated excitotoxicity stimulated.
  • the reduction in the fibrinogen activatability of the piasminogen activator according to the invention accordingly also leads to reduced neurotoxicity.
  • DSPA is a plasminogen activator that was originally isolated from the saliva of the vampire bat (see US Pat. No. 6,008,019; EP 0 383 417).
  • the DSPA can be isolated in four isoforms, of which the DSPA ⁇ l can be produced recombinantly via CHO cells.
  • DSPA only has a kinkle domain.
  • This domain corresponds functionally and structurally to the K1 domain of the t-PA rather than the K2 domain and has no lysine binding sites (Bringmann P, Gruber D, Liese A, Toschi L, Krhartschmar J, Schleuning WD, Donner P: Structural features mediating fibrin selectivity of vampire bat plasminogen activators; Journal of Biological Chemistry 1995; 270 (43): 25596-25603). It is therefore spoken in the literature in part that DSPA has no Kringel 2 domains.
  • DSPA is always available as a single-chain molecule because there is no plasma activation site as in t-PA.
  • DSPA shows 45,000-fold stimulation of activity in the presence of fibrin compared to t-PA, according to Gardell SJ, Duong LT, Diehl, York JD, Hare TR, Register RB, Jacobs JW, Dixon RA, Friedman PA (isolation, characterization and c-DNA cloning of a vampire bat salivary plasminogen activator: Journal of Biological Chemistry 1989; 264 (30): 17947-17952) is 205.
  • FIG. 2b A schematic representation of the structure of the DSPA is added as FIG. 2.
  • FIG. 2b A comparison of the amino acid sequence of the t-PA with that of the DSPA is shown in FIG. 2b.
  • Bakker et al. made various modifications of the t-PA, such as two deletion mutants lacking either the Kringel-2, the finger domain, or the epidermal growth factor domain. These mutations were also combined and in some cases additionally provided with a point mutation in Kringel-2, namely with the substitution D236N. This targeted amino acid substitution leads to an exchange of the Asp in position 236 to asparagine and thus to a deletion of the lysine binding site (LBS in the K2 domain). To provide the mutation, reference is made to the publication by Bakker et al. including the references cited therein.
  • Bakker et al. were able to show in their investigations that the occupation of the lysine binding site in the K2 domain with EACA ( ⁇ -aminocaproic acid) significantly weakened the binding of the native t-PA to fibrin. The same applies to the modification of the LBS with the substitution D236N, whereby this weakening was less.
  • the deletion mutant which consisted only of the K2 domain and the proteolytic C terminus, was still bound to fibrin, albeit slightly. Only the K2P mutation with deleted LBS no longer showed any fibrin binding.
  • Example 1 confirm the different affinities of DSPA 1 and recombinant human t-PA for the cofactors amyloid ⁇ (1-42) and fibrinogen and fibrin.
  • the kinetic parameters kcat and Km as well as the ratio kcat / Km were determined for each plasminogen activator / CoFactor combination.
  • the efficiency of the DSPA 1 for plasminogen activation was approximately 100 times lower than that of the t-PA, while both were equally efficient in the presence of fibrin.
  • the DSPA ⁇ l was about 30 times less effective than t-PA. This data gives a ratio of the efficiency of fibrin as a cofactor to the cofactors fibrinogen or ⁇ -amyloid at a physiological plasminogen concentration of 2 ⁇ M of 480 for DSPA ⁇ l and 16 for human t-PA.
  • the plasminogen-activating factor used according to the invention is - as already stated above - characterized in that it has no or a modified lysine binding site on Kringel-2.
  • the Kringel-2 is deleted.
  • the plasminogen activator used - in particular the modified t-PA - can be modified by deleting the KringeI-1 such that receptor binding of the t-PA is no longer possible.
  • the tissue plasminogen activator is therefore no longer metabolized in the native way via the liver, so that the in vivo half-life is extended (Rijken DC, Otter M, Kuiper J, from Berkel TJC: Receptor-mediated endocytosis of tissue-type plasminogen activator (t-PA) by liver cells. Thromb. Res. 1990; Supel. X: 63-71).
  • Kringle-1 is known from the reteplase and is known, for example, from Martin U, Bader R, Böhm E, Kohnert U, from Möllendorf E, Fischer S, Sponder G. (BM 06.022: A Novel recombinant plasminogen activator. Cardiovascular drug reviews 1993; 11: 299-311). Mutants with a deletion of amino acids 4-176 are used for this. By extending the half-life, a bolus application of the piasminogen activator is possible.
  • the plasminogen activator which can be used according to the invention is based on one of the amino acid sequences shown in FIGS. 3, 11 or 13.
  • This is a modified t-PA with a deleted curl 2 and a structural change in the sequence region of the activation cleavage site of the t-PA.
  • This change can either consist in the substitution of only the amino acids R and I of the activation cleavage site (for example by HS; see sequence according to FIG. 3) or may also relate to adjacent amino acids (for example substitution of FRIK by LHST in the sequence in accordance with FIG. 11) ).
  • the latter modification corresponds to the structure of the native DSPA at this point.
  • the deletion of the curl 2 in the t-PA is accordingly selected such that a transition area to the structure below is created which corresponds to the comparable structure of the DSPA.
  • the transition region between the remaining curl 1 domain of the modified t-PA and the subsequent cysteine bridge is accordingly advantageously formed by the sequence SKAT.
  • the sequence SKAT can be found in the DSPA between the curling and the cysteine bridge.
  • FIG. 12 A comparison between t-PA and the two described embodiments according to the invention is shown in FIG. 12 (multiple sequence alignment).
  • a plasminogen activator according to FIG. 13 is used.
  • proteins according to the invention which have sequences which are homologous or partially identical to the amino acid sequences shown in FIGS. 3, 11 and 13. Homologies or identities of at least 70, preferably between 80 and 95% are preferred. These homologous or identical proteins show the activity of a plasminogen-activating factor (preferably shown as release of the pNA) and cause the lysis of a blood clot in vitro (see example 3).
  • a plasminogen-activating factor preferably shown as release of the pNA
  • the plasminogen activator that can be used according to the invention can be characterized by a lack of finger and epidermal growth factor domains. be drawn. This deletion significantly reduces the binding to the receptors of the liver and extends the half-life even further (Larson GR, Timony GA, Horgan PG, Barone KM, Henson KS, Angus LB, Stoudemire JB: Protein engineering of novel plasminogen activators with increased thrombolytic potency in rabbits relative to activase. Journal of biological Chemistry 1991; 266: 8156-8161; Smalling RW: Molecular biology of plasminogen activators: what are the clinical implications of drug design? Am J Cardiol 1996; 78 (suppl. 12): 2 - 7).
  • the plasminogen activators used according to the invention can also be modified only selectively by directed mutagenesis.
  • rt-PA-TNK tenecteplase
  • three mutations at the binding site of the plasminogen activator inhibitor on the one hand and at the binding site via which t-PA binds to the liver cells on the other hand increase the lead to catalytic activity while at the same time reducing PAI inactivability.
  • TNK- tissue plasminogen activators in myocardial infarction (TIMI) 10 Results of the initial patients in the TIMI 10 pilot - a phase 1, pharmacokinetics trial, Circulation 1995; 92 (suppl.): 1-415).
  • t-PA Recombinant t-PA (Actilyse® supplied by Paion, batch no. 102572) 10 mg dissolved in 10 ml sterile water to a final concentration of 1 mg / ml.
  • Human fibrinogen essentially plasminogen-free, was purchased from Sigma (Catalog No. F4883, Lot 12K7620). 25 mg was dissolved in 25 ml PCLA buffer to a final concentration of 1 mg / ml.
  • Flavigen.pli D-but-CHT-Lys-P-Nitroanelin-DHCL from Biopool (catalog no.101353, batch 1512016). 100 ⁇ M was dissolved in 50 ml PLCR buffer to a final concentration of 2 milimolar.
  • PLC buffer Jones 1990: 0.1 M NaCl.2H 2 O (Acros Catalog No. 20779); 0.03 M NaHCO 3 (Acros Catalog No. 21712); 4mM KCI (Fluka, Catalog No. 60130); 1mM CaCl 2 .2H 2 (Acros, Catalog No. 207780); 1mM Na 2 HPO 4 .2H 2 O (Fluka, Catalog No. 71638); 0.3 mM MgCl 2 .6H 2 0 (Acros, Catalog No. 197530); 0.4 mM MgSO 4 .7H 2 0 (Fluka, Catalog No. 63,140th); 20mM HEPES (Applichen, Catalog No. A1969); 0.01% Polysorbate 80 (Fluka, Catalog No. 93781)
  • the assay for plasminogen activation was carried out on microtiter plates at a total volume of 0.15 ml as described by Bringma ⁇ n et al. (loc. cit.).
  • the regents were added as follows:
  • the final concentration was as follows:
  • Plasminogen activator (t-PA or DSPA ⁇ l): 0.5 nM; Glu-plasminogen; 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 and 8 ⁇ M; FlavigenPli: 1mM and cofactors: 100 ⁇ g / ml.
  • the cofactors amyloid ⁇ (1-42), fibrinogen and fibrin were compared with the control without cofactor.
  • the reaction mixture contained a further 0.13 units / ml of human thrombin.
  • optical density at 405 nm and 490 nm was measured at regular intervals.
  • the optical densities at 490 nm were subtracted from the optical densities at 405 nm to eliminate the differences due to the liquid movement. All experiments were carried out in three repetitions with each plasminogen concentration and plasminogen activator concentration.
  • plasminogen activators Optical density versus time curves of four different combinations of plasminogen activators and cofactors.
  • plasmogenogen concentrations 8; 4; 2; 1 ; 0.5; 0.25; 0.125 and 0.0625 ⁇ M are used.
  • Table 1 Values for kcat / Km for the activation of plasminogen by recombining human T-PA or DSPA ⁇ l with ß-amyloid (1 to 42), fibrinogen or fibrin as cofactors.
  • the prion diseases, the spongiform encephalopathies are fatal neurodegenerative phenomena, which are characterized by an accumulation of the abnormal isoform of the prion protein (PrP sc ) in amyloid deposits.
  • the normal prion protein (PrP c ) has been expressed in many tissues, especially in the brain, where it is concentrated in the synapses.
  • the mechanism of the conformational change from PrP c to PrP sc is still poorly understood, as is the mechanism that leads to neurodegeneration via the formation of PrP sc .
  • One possible mechanism could be the influence of PrP sc on plasminogen activation by t-PA.
  • PrP PrP to stimulate plasminogen activation
  • PrP conformation which was influenced by the presence or absence of Cu 2+ .
  • the latter form contains a large number of ß structures which correspond to PrP sc isoform and stimulate plasminogen activation.
  • PrP-stimulated plasminogen activation also includes the binding of t-PA apo-PrP (ie PrP without Cu 2+ ).
  • the structures required for this binding have not yet been evaluated in detail. However, the binding is specific because it was prevented by DFP-inactivated t-PA.
  • PrP approaches used in these studies were derived from recombinant murine PrP from E. coli. Following purification of the His labeled PrP, the protein folds again in the absence or presence of copper chloride to form either a holo-PrP or an apo-PrP. Aggregated forms of these proteins are created by quickly dissolving them in water. The protein was collected by centrifugation. The material is resistant to Proteinase-K digestion. A mutant form of ⁇ 51-90, which does not include the Cu 2+ binding site, was prepared in the same way.
  • PrP PrP
  • Lys plasmonogen 25 nm
  • DSPA DSPA (0.25 nm).
  • the plasminogen activation is determined by the hydrolysis of the plasmin-specific dye Hd-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcoumarin at 37 ° C using the SPECTRAmax Gemini lourescence microplate reader.
  • the controls of these experiments included sc-t-PA, as a positive control for the effect of PrP on plasminogen activation, and Firbin fragments as a positive control for stimulation of t-PA and DSPA activity.
  • the specificity of the plasminogen binding was determined by competition with DFP-inactivated t-Pa.
  • the lysine analog EACA was also used as a competitive inhibitor.
  • Recombinant humanDSPA baculovirus DNA was produced using the Bac-to-Bac system (Invitrogen) and the purified virus DNA was transfected into Sf9 insect cells.
  • the recombinant baculovirus produced was amplified using Sf-9 cells.
  • HumDSAP was expressed with high five insect cells in serum-free medium in suspension culture. The cell culture supernatant with the recombinant protein was frozen at -20 ° C. until further processing.
  • the cell culture supernatant was slowly thawed at RT on a shaker and centrifuged for 1 hour at 4000xg.
  • the protein solution (1.51) was equilibrated to pH 6.0 with 50 mM ammonium acetate, loaded onto an SP-Sepharose XL (Amersham) ion exchange column (350 ml bed volume) and washed with 5 column volumes of 50 mM ammonium acetate solution.
  • the bound protein was eluted in a gradient of 0-100% 1 M ammonium acetate pH 6 over 10 column volumes.
  • the activity assay used is a determination of the rate at which a plasminogen activator converts the colorless substrate S-2288 into a colored product.
  • the assay represents a standard method for determining the proteolytic activity of plasminogen activating factors.
  • To display the activity the release of a chromogen (p-nitroaniline, pNA) is determined by the test substance.
  • the Chromogenix company offers the Chromogen S-2288.
  • reaction rate is not determined directly (e.g. in the catalytic converter), but is compared with a standard that is defined as 100% activity.
  • reaction rate measurement was carried out in a buffer which had the following composition: 25mM Tris-HCl pH8 / 0.1% albumin / 100mM NaCl / 1.1mM Glycine / 1.2mM mannitol / 2.5mM S-2288
  • the measurement was carried out in a 96-hole plate with blank values, standards and samples with different protein concentrations.
  • FIG. 14 The activity of the fractions (expressed in S-2288 activity) is shown in FIG. 14.
  • the silver-colored gels can be seen in FIGS. 15 a and 15 b.
  • FIG. 16a and 16b show the western blots.
  • the protein detected in the Western blot corresponds to the protein marked with the arrow head in the silver-colored gel.
  • Clot lysis (thrombolytic activity) The residue of the humaDSPA-containing fraction B6 was dissolved in 15 ml PBS and centrifuged at 4000xg for 15 min. This fraction was chosen because it showed the greatest purity. An aliquot was taken and used to determine activity. The catalytic activity of this sample was roughly comparable to the catalytic activity of 5 ⁇ g / ml activase.
  • the blood clots used originate from normal blood sampling 24 hours earlier and each resulted from 2 ml of blood that was transferred to polypropylene tubes and curdled under natural conditions.
  • the lysis was carried out in PBS. ,
  • the humaDSPA-containing fraction B6 (from SPXL-Sepharose capture step) was first lyophilized. The residue was dissolved in 15 ml of PBS and centrifuged for 15 min / 4000 g. Before the blood clot was added, a sample was taken for an S-2288 activity determination. The catalytic activity of this sample essentially corresponded to the catalytic activity of 5 ⁇ g / ml activase.
  • FIGS. 17a to 17d show the results of the clot lysis in the time course of 0h, 3h, 4h and 24h after addition of the humDSPA.
  • the left test approach shows the control.
  • PBS with humaDSPA is contained in the amount described above.
  • the blood cells slowly fall out of the clot that dissolves. After 24 hours, a kind of network remains that can be recognized after just 4 hours.
  • detached blood cells were aspirated with a syringe so that the structure of the remaining clot was visible.
  • fibrinolysis slows down when the clot no longer hangs in its own lysate. Therefore, a clot is still present after 24 hours.
  • the humDSPA shows a significant increase in activity, since at least four times the amount of DSPA must be used for the dissolution of a clot of the same size by DSPA.

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Abstract

Verwendung von Plasminogen-Aktivatoren mit verringerter Lysin-Bindungskapazität zur Behandlung thrombotischer Erkrankung.

Description

"Plasminoαen-Aktivatoren mit verringerter Lvsin-Bindunqskapazität"
Die Erfindung betrifft eine vorteilhafte Verwendung von Plasminogen-Akti- vatoren und nimmt die Priorität der deutschen Patentanmeldung 103 42 518.7 in Anspruch, auf die inhaltlich Bezug genommen wird.
Die Etablierung der Thrombolyse als Therapieöption bei unterschiedlichen thromboembolischen Erkrankungen gilt als weitgehend abgeschlossen. Das Hauptinteresse der Thrombolyseforschung gilt daher der Weiterentwicklung und Modifikation bekannter Thrombolytika und/oder der Verbesserung der Begleittherapien.
Ein wichtiges Thrombolytikum als Ausgangspunkt neuer Thrombolytika ist der Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA), der im Vergleich zu Streptoki- nase oder Urokinase eine erhöhte Fibrinselektivität und eine verbesserte Wirksamkeit aufweist. Weiterentwicklungen dieses Plasminogen-Aktivators stellen die Deletionsmutanten Reteplase und Lanoteplase sowie die Tenecteplase dar.
Der Gewebe-Plasminogen-Aktivator (rt-PA) ist ein einkettiges Glykoprotein aus 527 Aminosäuren. Das zunächst einkettige Molekül (single-chain; sct- PA) wird durch Proteolyse in eine zweikettige Form (two chain; tct-PA) gespalten. Das t-PA weist bestimmte strukturelle und funktioneile Domainen auf. So umfaßt die N-terminale Teilkette die sog. Fingerdomaine (F, Ser1 - Lys49), die epidermale Wachstumsfaktordomaine (E, SerδO - Asp87) sowie die zwei Kringeldomainen (K1 , Thr88 - Gly176; und K2, Asn177 - Cys261 ). Die C-terminale Kette mit einer Serinproteinasedomaine (P) umfaßt die Aminosäuren Ser262 bis Pro527. Die C-terminale Kette bildet mit den Aminosäuren His322, Asp371 und Ser478 das aktive Zentrum.
BESTATIGUNGSKOPIE Das t-PA sowie dessen rekombinante Varianten und deren Herstellung sind Gegenstand beispielsweise des US-Patentes 4,766,075 und vielfältiger Publikationen (so z.B. Bode und Renatus: Tissue-type plasminogen activator: variants and crystal/soiution structures demarcate structural determinants of function, Current Opinion in Structural Biology 1997, 7: 865 - 872). Eine schematische Darstellung der t-PA-Struktur ist als Fig. 1 beigefügt.
Wie die meisten anderen Trypsin-ähnlichen Serinproteinasen wird das sct- PA durch Spaltung in die tct-PA-Form überführt. Die Spaltung erfolgt an der Bindung zwischen Arg275 und IIe276. Danach werden die zwei Ketten nur noch über eine einzige Disulfidbrücke zwischen Serin264 und Serin395 zusammengehalten.
Diese Numerierung der Spaltstelle des t-PA entspricht derjenigen, die Bode und Renatus (a.a.O) gewählt haben. Andere Autoren legen jedoch eine andere Numerierung zugrunde und definieren die Spalt- oder Aktivierungsstelle als R15-I16 oder R310-I311. Funktioneil und strukturell unterscheiden sich die so definierten Stellen aber nicht.
Der Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA; Alteplase) kann Plasminogen zu Plasmin aktivieren. Aus kinetischen Konstanten geht hervor, daß t-PA zirkulierendes Plasminogen jedoch nur mit schwacher Aktivität aktiviert. Beide t- PA-Formen - d.h. sowohl das einkettige als auch das zweikettige Molekül - weisen prinzipiell die gleichen pharmakologischen Eigenschaften auf. Das an Fibrin gebundene Plasminogen wird gegenüber dem freien Plasminogen jedoch mit einer um drei Zehnerpotenzen verbesserten katalytischen Potenz aktiviert. Demnach wird die thrombolytische Eigenschaft des Gewebe-Plas- minogen-Aktivators durch die Anwesenheit von Fibrin außerordentlich verstärkt.
Es wird für t-PA eine relative Fibrinselektivität mit einem Faktor 500 bis 1000 angegeben. Eine Steigerung der katalytischen Wirkung kann auch durch die Interaktion des Piasminogen-Aktivators mit ß-Amyloid oder Fibrinogen erreicht werden. Die Aktivierbarkeit der t-PA durch Fibrinogen ist vergleichbar mit der Aktivierbarkeit durch ß-Amyloid.
Die Wirkung des Piasminogen-Aktivators wird physiologisch durch Inhibitoren kontrolliert, wobei der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor I (PAI-1 ) den wesentlichen Gegenspieler darstellt. Durch Bindung von PAI-1 an die leichte Teilkette des t-PA-Moleküls wird die Struktur des katalytischen Zentrums so verändert, daß keine Aktivierungsreaktion mit dem Plasminogen mehr erfol- gen kann (Bennet WF, Paoni NF, Keyt BA, Botstein D, Jones AJS, Presta L, Wurm FM, Zoller M: High resolution analysis of functional determinants in human tissue-type plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry 1991 ; 266: 5191-5201 ).
Der Gewebe-Plasminogen-Aktivator wird rasch über die Leber metabolisiert. Daher verlängert die Leberinsuffizienz eines Patienten die Plasma-Halbwertzeit der Substanz (Emeis JJ, van den Hoogen CM, Jense D: Hepatic clearance of tissue-type plasminogen activator in rats, Thomb Haemostas 1985; 54:661-664; Tiefenbrunn AJ, Robison AK, Kurnik PB, Ludbrook PA, Sobel BE. Clinical pharmacology in patients with evolving myocardial infarc- tion of tissue plasminogen activator produced by recombinant DNA technol- ogy Circulation 1985; 71 : 110-116).
Plasminogen-Aktivatoren werden zur Behandlung thrombotischer Erkran- kungen wie beispielsweise des Herzinfarktes und des Schlaganfalls entwickelt. Bei t-PA handelt es sich um das einzige derzeit für die Behandlung des Schlaganfalls von der Food and Drug Administration (FDA) in den USA zugelassene Thrombolytikum.
Gleichwohl mehren sich in der Vergangenheit die Vermutungen, daß t-PA bei der Behandlung des Schlaganfalls zwar einerseits die erwarteten positiven thrombolytischen Effekte zeigt, andererseits aber auch für eine unge- wollte Gewebezerstörung verantwortlich ist. So verursachte die Infusion von t-PA in t-PA-defizienten Mäusen größere Infarkte (Wang YF, Tsirka SE, Strickland S, Stieg, PE, Soriano SG, Lipton SA: Tissue plasminogen activator (tPA) increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild- type and tPA-deficient mice. Nat Med 1998; 4(2):228-231 ). Diese vergrößerten Läsionen sind - so wird vermutet - auf die Stimulierung der NMDA abhängigen Glutamat-Rezeptoren zurückzuführen (Liberatore GT, Samson A, Bladin C, Schleuning WD, Medcalf RL: Vampire bat salivary plasminogen activator (desmoteplase): a unique fibrinolytic enzyme that does not promote neurodegeneration. Stroke 2003;34(2):537-543). Für diesen Effekt könnte eine proteolytische Spaltung des NMDA-Rezeptors durch t-PA verantwortlich sein (Nicole O, Docagne F, Ali C, Margaill I, Carmeliet P, MacKenzie ET, et al: The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling. Nat Med 2001 ;7(1 ):59-64).
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue therapeutische Behandlung thrombotischer Erkrankungen, insbesondere des Schlaganfalls, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung eines Plasminogen aktivierenden Faktors, der eine gegenüber dem nativen Plasminogen-Aktivator verringerte Kapazität zur Bindung von Lysin aufweist. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform weist der Plasminogen-Aktivator eine modifizierte Kringel-Domaine, vorzugsweise eine im Vergleich zum nativen t-PA modifizierte Kringel 2-Domaine auf. Diese kann vollständig oder in Teilen deletiert sein, so daß die Lysin-Bindungskapazität verringert ist.
Die K2-Domaine - oder dazu funktioήell oder strukturell im wesentlichen homologe Bereiche - können vorteilhafterweise so modifiziert sein, daß die Lysinreste nicht mehr oder nur mit geringer Affinität binden. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäß einsetzbaren Plasminogen-Aktivator um modifiziertes t- PA.
Die Bedeutung der K2-Domaine einschließlich der Herstellung von t-PA K2 Deletionsmutanten wird ausführlich beschrieben bei Horrevoets AJ, Smilde A, de Vries C, Pannekoek H (The specific roles of finger and kringle 2 do- mains of tissue-type plasminogen activator during in vitro fibrinolysis: Journal of Biological Chemistry, 269, 17, 12639-12644, 1994).
Die gemäß der Erfindung einsetzbaren Plasminogen aktivierenden Faktoren zeigen aufgrund ihrer fehlenden oder verminderten Lysin-Bindungsfähigkeit eine erhöhte Fibrinselektivität und eine verringerte Aktivierbarkeit durch Fibrinogen oder ß-Amyloid. Diese reduzierte Fibrinogen-Aktivierbarkeit ist vermutlich die Ursache für die Fibrinselektivität. Insbesondere bei der Behandlung von Schlaganfall ist ein hohe Fibrinselektivität des Piasminogen- Aktivators von wesentlicher Bedeutung, da beispielsweise das native t-PA über das die beschädigte Blut-Hirnschranke überwindende Fibrinogen aktiviert werden kann und über die anschließende Aktivierung der NMDA-Re- zeptoren die Glutamat vermittelte Exzitotoxizität stimuliert. Die erfindungsgemäße Verringerung der Fibrinogen-Aktivierbarkeit des Piasminogen-Aktivators führt demnach auch zu einer verringerten Neurotoxizität.
Die Bedeutung der Lysin-Bindungsstellen am Kringel-2 des t-PAs wurde vor allem durch vergleichende Untersuchungen der strukturellen und funktioneilen Domainen des t-PA im Vergleich zum DSPA deutlich. Bei DSPA handelt es sich um einen Plasminogen-Aktivator, der ursprünglich aus dem Speichel der Vampirfledermaus isoliert wurde (siehe dazu US-Patent 6,008,019; EP 0 383 417). Das DSPA ist in vier Isoformen isolierbar, von der das DSPAαl rekombinant über CHO-Zellen herstellbar ist. DSPA weist im Vergleich zum t-PA lediglich eine Kringel-Domaine auf. Diese Domaine entspricht funktionell und strukturell eher der K1-Domaine des t-PA als der K2-Domaine und weist keine Lysin-Bindungsstellen auf (Bringmann P, Gruber D, Liese A, Toschi L, Krätzschmar J, Schleuning WD, Donner P: Structural features mediating fibrin selectivity of vampire bat plasminogen activators; Journal of Biological Chemistry 1995;270(43):25596-25603). Es wird daher in der Literatur zum Teil davon gesprochen, dass DSPA keine Kringel 2 Domaine aufweist.
Des weiteren liegt DSPA stets als einkettiges Molekül vor, da eine Plas- minaktivierungsstelle wie im t-PA fehlt. DSPA zeigt im Vergleich zu t-PA eine Stimulierung der Aktivität in Gegenwart von Fibrin um das 45000-fache, während dieser Wert nach Gardell SJ, Duong LT, Diehl, York JD, Hare TR, Register RB, Jacobs JW, Dixon RA, Friedman PA (Isolation, characteriza- tion and c-DNA cloning of a vampire bat salivary plasminogen activator: Journal of Biological Chemistry 1989;264(30): 17947-17952) bei einem Wert von 205 liegt.
Eine schematische Darstellung der Struktur des DSPA ist als Fig. 2 beige- fügt. Einen Vergleich der Aminosäuresequenz des t-PA mit derjenigen des DSPA zeigt Fig. 2b.
In der Vergangenheit wurde die Fibrin-Bindung des t-PA funktioneil auf die Finger-Domaine und den Kringel-2 zurückgeführt (van Zonnenfeld AJ, Veerman H, Pannekoek H: (1986) Proc. Nati. Acad. Sei. USA., 83:4670- 4674). Publikationen der jüngeren Zeit weisen jedoch auch der Proteinase Domaine P eine gewisse Relevanz bei (Bennett a.a.O). Die Funktion der einzelnen Domainen wurde auch von Bakker AHF, Jacoline E., Weening- Verhoeffet. D., Verheijen JH (The role of Lysyl-Binding site of tissue type plasminogen activator in the interaction with a forming fibrin clod: Journal of Biological Chemistry 270, 21 , 12355-12360, 1995) untersucht. Bakker et al. stellten verschiedene Modifikationen des t-PA her, so zwei Deletionsmutanten, denen entweder der Kringel-2, die Finger-Domaine oder die epidermale Wachstumsfaktor-Domaine fehlten. Diese Mutationen wurden auch kombiniert und zum Teil zusätzlich mit einer Punktmutation im Kringel-2 versehen, nämlich mit der Substitution D236N. Diese gezielte Aminosäuresubstitution führt zu einem Austausch des Asp in der Position 236 zu Asparagin und damit zu einer Deletion der Lysin-Bindungsstelle (LBS in der K2-Domaine). Zur Bereitstellung der Mutation wird auf die genannte Veröffentlichung von Bakker et al. einschließlich der darin zitierten Referen- zen ausdrücklich verwiesen.
Bakker et al. konnten in ihren Untersuchungen zeigen, daß die Besetzung der Lysin-Bindestelle in der K2-Domaine mit EACA (ε-Aminocapronsäure) die Bindung des nativen t-PA an Fibrin deutlich schwächte. Das gleiche gilt für die Modifikation der LBS durch die Substitution D236N, wobei diese Schwächung geringer ausfiel. Auch die Deletionsmutante, die lediglich aus der K2-Domaine und dem proteolytischen C-Terminus bestand, hat noch - wenn auch gering - an Fibrin gebunden. Nur die Mutation K2P mit deletierter LBS zeigte keinerlei Fibrin-Bindung mehr.
Diese Ergebnisse zeigen zwar zum einen die Bedeutung der F- und K2-Do- mainen so wie der LBS im K2. Sie zeigen jedoch auch, daß die Fibrininteraktion des t-PA nicht ausschließlich durch die F- und K2-Domaine vermittelt wird. Vielmehr tritt noch die Funktion der LBS in der K2-Domaine hinzu, die vermutlich zur Stabilisierung einer für die Fibrin-Bindung günstigen Konformation des t-PA verantwortlich ist.
Die Bedeutung der K2-Domaine einschließlich ihrer Lysin-Bindungsstelle wurde des weiteren durch Untersuchungen von Stewart RJ, Fredenburgh JG, Witz Jl deutlich (Characterization of the interactions of plasminogen and tissue and vampire bat plasminogen activators with fibrinogen, fibrin, and the complex of D-dimer noncovalently linked to fragment E: Journal of Biological Chemistry 273, 29, 18292-18299, 1998).
Stewart et al. haben in Bindungsstudien unter anderem die Affinitäten von t- PA und DSPA zu Fibrin und Fibrinogen untersucht. Dabei wurden die Affinitäten in Anwesenheit oder Abwesenheit des Lysinanalogs EACA untersucht, um die Bedeutung der Kringel abhängigen Interaktionen zu analysieren. Aus ihren Untersuchungen zogen sie den Schluß, daß DSPA aufgrund der fehlenden Lysin-Bindestellen im Kringel nicht an Fibrinogen binden kann. Sie messen daher der LSB am Kringel-2 des t-PA in Kombination mit der Finger-Domaine eine wesentliche Funktion für die Fibrinbindung des t- PA zu.
Die unter Beispiel 1 aufgeführten Versuchsergebnisse bestätigen die unter- schiedlichen Affinitäten des DSPA 1 und des rekombinanten humanen t- PA für die Cofaktoren Amyloid ß (1-42) sowie Fibrinogen und Fibrin. Dazu wurden die kinetischen Parameter kcat und Km sowie das Verhältnis kcat/Km für jede Plasminogen-Aktivator/CoFaktor-Kombination ermittelt. Bei der Abwesenheit eines Cofaktors war die Effizienz des DSPA l für die Plasminogen-Aktivierung etwa 100-fach niedriger als diejenige des t-PA, während sie bei der Anwesenheit von Fibrin beide gleichermaßen effizient waren. In Anwesenheit des Cofaktors Fibrinogen oder ß-Amyloids war das DSPAαl etwa 30-fach weniger effektiv als t-PA. Aus diesen Daten ergibt sich ein Verhältnis der Effizienz des Fibrins als Cofaktor zu den Cofaktoren Fibrinogen oder ß-Amyloid bei einer physiologischen Plasminogen Konzentration von 2 μM von 480 für DSPAαl und 16 für humanes t-PA.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Plasminogen aktivierende Faktor ist - wie oben bereits ausgeführt - dadurch gekennzeichnet - daß er keine oder aber eine modifizierte Lysin-Bindungsstelle am Kringel-2 aufweist. In einer Ausführungsform ist der Kringel-2 deletiert. In einer weiteren Ausführungsform ist es jedoch auch möglich, den Kringel-2 zu erhalten und eine Substitution der Asparaginsäure durch Asparagin in der Position 236 vorzunehmen. Demnach ist es für die erfindungsgemäße Erfindung des modifizierten t-PA nicht entscheidend, daß die Kringel-Struktur fehlt, sondern lediglich, daß die Lysin-Bindungsstelle so modifiziert ist, daß eine die Aktivität des t-PA stei- gernde Interaktion mit einem Cofaktor nicht mehr möglich ist.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann der verwendete Plasminogen-Aktivator - insbesondere das modifizierte t-PA - durch die Deletion des KringeI-1 so modifiziert werden, daß eine Rezeptorbindung des t-PA nicht mehr möglich ist. Damit wird der Gewebe-Plasminogen-Aktivator nicht mehr in der nativen Weise über die Leber metabolisiert, so daß sich die in vivo Halbwertzeit verlängert (Rijken DC, Otter M, Kuiper J, von Berkel TJC: Receptor-mediated endocytosis of tissue-type plasminogen activator (t-PA) by liver cells. Thromb. Res. 1990; Supel. X: 63-71). Die Deletion des Krin- gel-1 ist von der Reteplase bekannt und beispielsweise von Martin U, Bader R, Böhm E, Kohnert U, von Möllendorf E, Fischer S, Sponder G. (BM 06.022: A Novel recombinant plasminogen activator. Cardiovascular drug reviews 1993;11 : 299-311 ) beschrieben. Dazu werden Mutanten mit einer Deletion der Aminosäuren 4 - 176 eingesetzt. Durch die Verlängerung der Halbwertzeit ist eine Bolusapplikation des Piasminogen-Aktivators möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform basiert der erfindungsgemäß einsetzbare Plasminogen-Aktivator auf einer der in den Figuren 3, 11 oder 13 gezeigten Aminosäuresequenzen. Dabei handelt es sich jeweils um ein mo- difiziertes t-PA mit einem deletierten Kringel 2 und einer strukturellen Änderung im Sequenzbereich der Aktivierungsspaltstelle des t-PA. Diese Änderung kann entweder in der Substitution lediglich der Aminosäuren R und I der Aktivierungsspaltstelle bestehen (z.B. durch HS; siehe Sequenz gemäß Fig. 3) oder auch noch benachbarte Aminosäuren betreffen (z.B. Substitu- tion von FRIK durch LHST in der Sequenz gemäß Fig. 11 ). Die letztere Modifikation entspricht der Struktur des nativen DSPA an dieser Stelle. Es wird erfindungsgemäß bevorzugt, einen Plasminogen Aktivator zu erzeugen und für die Schlaganfallbehandlung einzusetzen, der in besonders geeigneter Weise die Vorteile des nativen t-PA - nämlich vor allem eine niedrige Immunogenität bei der Verwendung in menschlichen Patienten - mit den Vorteilen des DSPA - nämlich die fehlende Neurotoxizität - verbindet. In einer Ausführungsform der Erfindung wird demnach die Deletion des Kringels 2 im t-PA so gewählt, daß ein Übergangsbereich zu der nachfolgenden Struktur geschaffen wird, der der vergleichbaren Struktur des DSPA entspricht. Der Übergangsbereich zwischen der verbleibenden Kringel 1 Do- maine des modifizierten t-PA zu der nachfolgenden Cysteinbrücke wird demnach vorteilhafterweise durch die Sequenz SKAT gebildet. Die Sequenz SKAT findet sich im DSPA zwischen dem Kringel und der Cysteinbrücke. Diese vorteilhafte Struktur ist beispielsweise in der Sequenz gemäß Fig. 11 verwirklicht.
Einen Vergleich zwischen t-PA und den beiden geschilderten erfindungsgemäßen Ausführungsformen zeigt Fig. 12 (Multiple Sequence Alignment).
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Plasmino^ gen Aktivator gemäß der Figur 13 eingesetzt.
Es ist selbstverständlich auch möglich, erfindungsgemäß Proteine einzusetzen, die zu den in den Figuren 3, 11 und 13 dargestellten Aminosäuresequenzen homologe oder teil-identische Sequenzen aufweisen. Bevorzugt sind Homologien bzw. Identitäten von mindestens 70, bevorzugt zwischen 80 und 95%. Diese homologen oder identischen Proteine zeigen die Aktivität eines Plasminogen-aktivierenden Faktors (vorzugsweise dargestellt als Freigabe des pNA) und verursachen in vitro die Lyse eines Blutgerinnsels (siehe Beispiel 3).
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Plasminogen-Aktivator können durch eine fehlende Finger- und epidermale Wachstumsfaktor-Domaine gekenn- zeichnet sein. Durch diese Deletion wird die Bindung an die Rezeptoren der Leber wesentlich vermindert und die Halbwertzeit nochmals verlängert (Larson GR, Timony GA, Horgan PG, Barone KM, Henson KS, Angus LB, Stoudemire JB: Protein engineering of novel plasminogen activators with increased thrombolytic potency in rabbits relative to activase. Journal of biological Chemistry 1991 ; 266:8156-8161 ; Smalling RW: Molecular biology of plasminogen activators: what are the clinical implications of drug design? Am J Cardiol 1996; 78 (suppl. 12): 2 - 7).
Neben Deletionsmutanten können die erfindungsgemäß eingesetzten Plas- minogen-Aktivatoren auch durch gerichtete Mutagenese nur punktuell modifiziert werden. So ist beispielsweise aus der rt-PA-TNK (Tenecteplase) bekannt, daß drei Mutationen an der Bindungsstelle des Plasminogen-Akti- vator-lnhibitors einerseits und an der Bindungsstelle, über die t-PA an die Leberzellen bindet andererseits, zu einer Erhöhung der katalytischen Aktivität bei einer gleichzeitig verminderten PAI-Inaktivierbarkeit führen. Damit erhält die Tenecteplase eine 100-fach erhöhte katalytische Konversionskonstante Kcat/Km (s. dazu auch Paoni NF, Keyt BA, Refino CJ, Chow AM, Nguyen HV, Berleau LT, Badillo J, Pena LC, Brady K, Wurm FM, Ogez J, Bennett WF: A slow Clearing fibrin-specific, PAI resistant variant of t-PA (T103N, KHRR 296-299 AAAA). Thromb Haemostas 1993; 70: 307 - 312 und Cannon CP, Love TW, McCabe CH, Kirshenbaum JM, Henry T, Sequira R, Schweifer M, Breed J, Cutler D, Tracy R, for the TIMI investigators. TNK- tissue plasminogen activators in myocardial infarction (TIMI) 10: Results of the initial patients in the TIMI 10 pilot - a phase 1 , pharmacokinetics trial. Circulation 1995; 92 (suppl.): 1-415).
BEISPIEL 1:
1. Vergleichende Analyse der Effizienz von ß-Amyloid (1 bis 42) Fibrinogen und Fibrin als Cofaktoren für die Plasminogen-Aktivierung durch DSPAαl und rekombinanten humanen t-PA. Material und Methoden
Die folgenden Substanzen wurden verwendet:
- DSPAαl (bereitgestellt von Paion, Chargen-Nr. 2DSA01 , 12. Dezember 2002, Probe 10). 10 mg davon wurden in 10 ml sterilem Wasser aufgelöst, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu erhalten.
- Rekombinantes t-PA (Actilyse ® bereitgestellt von Paion, Chargen-Nr. 102572) 10 mg gelöst in 10 ml sterilem Wasser zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml.
- Humanes Glu-Plasminogen gereinigt aus humanem Plasma (bereitgestellt von Paion) gelöst in PCLA-Puffer mit einer Konzentration von 25μM.
- Humanes Fibrinogen, im wesentlichen plasminogenfrei wurde erworben von Sigma (Katalog-Nr. F4883, Charge 12K7620). 25 mg wurden in 25 ml PCLA-Puffer aufgelöst zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml.
- Humanes Thrombin (Sigma; Katalog-Nr. T7009, Charge 61 K7603) 100 U wurden in 10 ml PCLA-Puffer zu einer Konzentration von 10 U/ml aufgelöst.
- Farbreagenz Flavigen.pli (D-but-CHT-Lys-P-Nitroanelin-DHCL) von Biopool (Katalog-Nr. 101353, Charge 1512016). 100 μM wurden in 50 ml PLCR-Puffer zu einer Endkonzentration von 2 Milimolar aufgelöst.
- Amyloidprotein ß (1 - 42) von Bachem (Katalog-Nr. H-1368, Charge 0535120). 4 mg wurden in 4 ml 0,1-prozentigen Ammoniumhydroxid zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml aufgelöst. Alle Reagenzien wurden in Aliquots geteilt und bei -20°C für nicht mehr als zwei Wochen gelagert.
PLC-Puffer (Jones 1990): 0,1 M NaCI.2H2O (Acros Katalog-Nr. 20779); 0,03 M NaHCO3 (Acros Katalog-Nr.21712); 4mM KCI (Fluka, Katalog-Nr. 60130); 1 mM CaCI2.2H2 (Acros, Katalog-Nr. 207780); 1 mM Na2HPO4.2H2O (Fluka, Katalog-Nr. 71638); 0,3 mM MgCI2.6H20 (Acros, Katalog-Nr. 197530); 0,4 mM MgsO4.7H20 (Fluka, Katalog-Nr. 63140); 20 mM HEPES (Applichem, Katalog-Nr. A1969); 0,01 % Polysorbate 80 (Fluka, Katalog-Nr. 93781 )
Plasminogen-Aktivierungsassay:
Der Assay für die Plasminogen-Aktivierung wurde auf Mikrotiterplatten beim Gesamtvolumen von 0,15 ml durchgeführt wie von Bringmaηn et al. (a. a. O.) beschrieben. Die Regenzien wurden wie folgt zugefügt:
50 μl Plasminogen (0 - 24 μM); 15 μl Cofaktor (1 mg/ml); 10 μl Plasminogen- Aktivator 7,5 nM und 75 μl Flavigen (2 mM).
Die Endkonzentration war wie folgt:
Plasminogen-Aktivator: (t-PA oder DSPAαl): 0,5 nM; Glu-Plasminogen; 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1 , 2, 4 und 8 μM; FlavigenPli: 1mM und Cofakto- ren: 100μg/ml.
Es wurden die Cofaktoren Amyloid ß (1 - 42), Fibrinogen und Fibrin mit der Kontrolle ohne Cofaktor verglichen. Für die Kontrolle enthielt der Reaktionsansatz weitere 0,13 Units/ml humanen Thrombins.
Direkt nach dem Hinzufügen wurde die Mikrotiterplatte in einen molecular device ThermoMax microplate reader bei 25°C eingebracht. Ab Zeitpunkt t = 0 wurde gerührt.
Nach regelmäßigen Intervallen wurde die optische Dichte bei 405 nm und 490 nm gemessen. Die optischen Dichten bei 490 nm wurde subtrahiert von den optischen Dichten bei 405 nm, um die Unterschiede aufgrund der Flüssigkeitsbewegung zu eliminieren. Alle Versuche wurden in drei Wiederholungen mit jeder Plasminogenkonzentration und Plasminogenaktivatorkon- zentration durchgeführt.
Es wurden die Km- und kcat-Werte ermittelt (Fig. 4 - 6).
Figuren 4
a) Bestimmung der molaren Extinktion des pNA.
b) Konversion des Flavigen. pli durch 10 nM Plasmin als Funktion der Flavigen. pli-Konzentration (in μM).
c) Michaelis-Menten plot der Konversion von Flavigen durch 10 nM Plasmin. Die Anfangsraten aus Fig. 4b wurden umgesetzt in pNA/s.
Figuren 5
Kurven der optischen Dichte gegen die Zeit von vier verschiedenen Kombinationen von Plasminogen-Aktivatoren und Cofaktoren. Dazu waren Plasmi- nogenkonzentrationen von 8; 4; 2; 1 ; 0,5; 0,25; 0,125 und 0,0625 μM eingesetzt.
a) t-PA ohne Cofaktor
b) t-PA mit Amyloid ß auf (1 - 42) als Cofaktor c) t-PA mit Fibrinogen als Cofaktor
d) t-PA mit Fibrin als Cofaktor
e) DSPAαl ohne Cofaktor
f) DSPAαl mit Amyloid ß (1 - 42) als Cofaktor
g) DSPAαl mit Fibrinogen als Cofaktor
h) DSPAαl mit Fibrin als Cofaktor
Figuren 6
Plot von a { = ks.kcat.PA.E.PJ(Km + P)r gegen die Plasminogenkonzentra- tion
a) Plots für -PA ohne Cofaktor oder Amyloid ß, Fibrinogen oder Fibrin als Cofaktor
b) Plots für DSPAαl 11.38 ohne Cofaktoren
Ergebnisse:
Tabelle 1 kcat (s"1) Km(μM) kcat/Km t-PA ctrl n.d. n.d 1272 1 224 t-PA amyl n.d. n.d 9307 ± 579 t-PA fbg n.d. n.d 10204 ± 1546 t-PA fibrin 0.351 ± 0.35 0.178 ± 0.017 1990000 ± 32 DSPA ctrl n.d. n.d 12,5 ± 0.9
DSPA fbg 1.649 ± 0.110e-3 2.465 ± 0.426 690 ± 181
DSPA amyl 0.957 ± 0.199e-3 0.853 ± 0.316 1304 ± 785 DSPA fibrin 0.532 ± 0.136 1.098 ± 0.382 506000 ± 120O00
Tabelle 1 : Werte für kcat/Km für die Aktivierung von Plasminogen durch re- kombinantes humanes T-PA oder DSPAαl mit ß-Amyloid (1 bis 42), Fibri- nogen oder Fibrin als Cofaktoren.
Die Ergebnisse sind angegeben als Mittel ± Standardabweichung von drei unabhängigen Versuchen.
Die genauen Werte für kcat und Km konnten nicht bestimmt werden, da die Km-Werte höher als die maximale Plasminogenkonzentration (8 μM) lagen, die einsetzbar waren.
Die Ableitung der kinetischen Konstanten allein ist nicht ausreichend, um die Effizienz der verschiedenen Cofaktoren zu vergleichen, da die Reaktionsraten bei Plasminogenkonzentrationen nahe oder unterhalb der Km-Werte abhängig sind von der Plasminogenkonzentration. Daher werden - unter Heranziehung der Michaelis-Menten-Kinetik - die Reaktionsraten bei physiologischen Plasmaplasminogenkonzentrationen bei 2 μM berechnet. Da- von ausgehend werden die relativen Effizienten der verschiedenen Cofaktoren für die Plasminogen-Aktivierung durch t-PA und DSPAαl (Tabelle 2) ermittelt.
Tabelle 2
cofactor DSPAal t-PA none 1 101.8 ± 17.9 DSPA amyloid 27.3 ± 7.7 744.6 ± 23.6
DSPA fbg 29.8 ± 5.0 816.3 ± 123.7
DSPA fibrin 13560 ± 2360 12880 ± 1360
Relative Raten der Plasminogenaktivierung bei der physiologischen Plasminogenkonzentration von 2 μM berechnet ausgehend von den kinetischen Parametern der Tabelle 1. Die Kombination der DSPA-Kontrolle ist 1.
BEISPIEL 2:
Die Prionen-Erkrankungen, die spongiformen Encephalopatien sind fatale neurodegenerative Erscheinungen, die durch eine Akkumulation der Abnormalen Isoform des Prionproteins (PrPsc) in Amyloid Ablagerungen charakterisiert sind. Das normale Prionenprotein (PrPc) ist in vielen Geweben exprimiert worden, vor allem im Gehirn, in dem es konzentriert in den Synapsen vorliegt. Der Mechanismus der Konformationsänderung von PrPc zu PrPsc ist noch wenig verstanden ebenso wie der Mechanismus der über die Bildung der PrPsc zu Neurodegeneration führt. Ein möglicher Mechanismus könnte in der Beeinflussung des PrPsc bei der Plasminogen-Aktivie- rung durch t-PA liegen.
Wir haben bereits unter Verwendung eines rekombinanten Proteins gezeigt, daß PrP die t-PA katalysierte Plasminogen-Aktivierung um das 300fache steigern kann (Ellis V, Daniels M, Misra R, Brown DR (2000): Plasminogen activation is stimulated by prion protein and regulated in a copper-depend- ent manner. Biochemistry 41 :6891-6896).
Die Fähigkeit des PrP zur Stimulierung der Plasminogen-Aktivierung war abhängig von der PrP Konformation, die durch die Gegenwart oder Abwe- senheit von Cu2+ beeinflußt war. Die letztere Form enthält eine große Anzahl von ß-Strukturen die PrPsc Isoform entspricht und die Plasminogen-Aktivierung stimuliert. Diese Daten stimmten überein mit früheren Beobachtungen der Plasminogen-Bindung an PrPsc, das von scrapie-infizierten Mäusegehirnen isoliert wurde, jedoch nicht von PrPc als normalen Gehirnzellen (Fischer M, Roeckl C, Rarizek P, Schwarz HP Aguzzi A (2000): Binding of disease- associated prion protein to plasminogen. Nature 408: 479-483).
Weiterhin haben unsere Experimente gezeigt, daß der Mechanismus der PrP stimulierten Plasminogen-Aktivierung auch die Bindung von t-PA apo- PrP (d.h. PrP ohne Cu2+) umfaßt. Die Strukturen, die für diese Bindung erforderlich sind, sind im Einzelnen noch nicht evaluiert. Die Bindung ist je- doch spezifisch, da sie durch DFP-inaktiviertes t-PA verhindert wurde.
Weitere Methoden:
Die PrP Ansätze die in diesen Untersuchungen verwendet wurden, wurden jeweils aus rekombinanten murinen PrP aus E.coli abgeleitet. Im Anschluß an die Reinigung der His markierten PrP faltet sich das Protein wieder in der Abwesenheit oder Gegenwart von Kupferchlorid, um entweder ein holo-PrP oder ein apo-PrP zu bilden. Aggregierte Formen dieser Proteine werden jeweils durch schnelles Lösen in Wasser erzeugt. Das Protein wurde durch Zentrifugation gesammelt. Das Material ist resistent gegen Proteinase-K Verdauung. Eine mutante Form von Δ51-90, das die Cu2+ Bindungsstelle nicht umfaßt, ist in gleicher Weise hergestellt worden. Die Wirkung dieser verschiedenen Formen PrP auf die Plasminogen-Aktivierung durch DSPA wurde untersucht durch die Inkubation von PrP (0-100 μg/m) mit Lys-Plas- mionogen (25 nm) und DSPA (0,25 nm). Die Plasminogen-Aktivierung wird ermittelt durch die Hydrolyse der plasminspezifischen Farbstoffs H-d-Val- Leu-Lys-7-amido-4-methylcoumarin bei 37°C unter Verwendung der des SPECTRAmax Gemini lourescence microplate reader. Die Kontrollen dieser Experimente enthalten sc-t-PA, als positive Kontrolle für den Effekt des PrP auf die Plasminogen-Aktivierung, und Firbinfragmente als positive Kontrolle für die Stimulierung der t-PA sowie der DSPA Aktivität. Die Spezifität der Plasminogenbindung wurde bestimmt durch Kompetition mit DFP-inaktiviertem t-Pa. Als kompetitiver Hemmstoff wurde auch das Ly- sinanalogon EACA eingesetzt.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse der Versuche sind in der Tabelle 3 und den Fig. 7 bis 10 dargestellt.
Eine inhaltliche Aussage wird insbesondere durch die Fig. 7 verdeutlicht. Diese macht klar, daß PrP spezifisch nur t-PA aktiviert, nicht jedoch DSPA. Des weiteren wurde deutlich, daß die Lysin-Bindestelle Kringel 2 als wesentlicher Unterschied zwischen DSPA und t-PA involviert sein muß. Tabelle 3
Reaction rates, M-1s-1 minus PrP plus PrP PrP + Hep fibrin
PrP preparation #1 tPA 7200 1800000 2000000 DSPA 15,3 9,77 2000000
PrP preparation #2 tPA 7020 624000 2912000 DSPA 15,75 162,75 5565
Fold-stimulation minus PrP plus PrP PrP + Hep fibrin
PrP preparation #1 tPA 1 250 277,7778 DSPA 1 0,638562 130719 PrP preparation #2 tPA 1 88,88889 414,8148 DSPA 1 10,33333 353,3333
BEISPIEL 3:
a. Herstellung und Reinigung von humanisiertem DSPA (humDSPA)(Aminosäuresequenz gemäß Fig. 11)
Mit dem Bac-to-Bac System (Invitrogen) wurde rekombinante humanDSPA- Baculovirus-DNA hergestellt und die gereinigte Virus-DNA in Sf9-Insekten- zellen transfiziert. Der produzierte rekombinante Baculovirus wurde mit Hilfe von Sf-9 Zellen amplifiziert. Die Expression von humDSAP erfolgte mit High Five-Insektenzellen in serumfreien Medium in Suspensionskultur. Der Zell- kulturüberstand mit dem rekombinanten Protein wurde bis zur weiteren Aufarbeitung bei -20°C eingefroren.
Der Zellkulturüberstand wurde langsam bei RT auf einem Schüttler aufgetaut und 1 Stunde bei 4000xg abzentrifugiert. Die Proteinlösung (1.51) wurde mit 50 mM Ammoniumacetat auf pH 6.0 equilibriert, an eine SP-Sepharose XL (Amersham) lonenaustauschersäule (350 ml Bettvolumen) geladen und mit 5 Säulenvolumina 50 mM Ammoniumacetatlösung gewaschen. Das gebundene Protein wurde in einem Gradienten von 0-100% 1 M Ammoniumacetat pH 6 über 10 Säulenvolumina eluiert.
HumDSPA haltige Fraktionen wurden über Westernblot identifiziert, nach Proteinbestimmung wurden solche Fraktionen einem Aktivitätstest unterzogen, bei -80°C eingefroren und später lyophilisiert. Im Unterschied zum Standard Aktivitätsassay wurden in diesem Experiment 50μl Eluat (=humDSPA haltige Fraktion), 50 μl 0,2M Tris pH 8.0 und 100 μl
9 2 . SQ_-2929fi8ft8 i inn P PRB.SQ o eiinnπgoescoettvztt.
b. DSPA Aktivitätsassay
Beim eingesetzten Aktivitätsassay handelt es sich um eine Bestimmung der Geschwindigkeit, mit der ein Plasminogenaktivator das farblose Substrat S- 2288 in ein farbiges Produkt umsetzt. Der Assay stellt ein Standardverfahren zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität von Plasminogen aktivierenden Faktoren dar. Zur Darstellung der Aktivität wird die Freigabe eines Chromogens (p-Nitroanilin, pNA) durch die Testsubstanz ermittelt. Dazu bietet die Firma Chromogenix das Chromogen S-2288 an.
Die Reaktionsgeschwindigkeit wird dabei nicht direkt bestimmt (z.B. in Ka- tal), sondern mit einem Standard verglichen, der als 100% Aktivität definiert ist.
Die Messung der Reaktionsgeschwindigkeit wurde in einem Puffer durchgeführt, der folgende Zusammensetzung hatte: 25mM Tris-HCI pH8 / 0,1 % Albumin / 100mM NaCI / 1.1 mM Glycine / 1.2 mM Mannitol / 2.5mM S-2288
Die Messung wurde in einer 96-Loch Platte mit Leerwerten, Standards und Proben mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen durchgeführt.
Die zeitliche Zunahme der Absorption bei 405 nm wurde mit Hilfe eines Photometers aufgezeichnet. Die Steigung des linearen Teils der Kurve wurde mit Hilfe von Excel bestimmt. Dies gibt die Aktivität wieder.
Die Aktivität des Fraktionen (ausgedrückt in S-2288 Aktivität) zeigt die Fig. 14. Die silbergefärbten Gele sind in den Fig. 15 a und 15 b zu sehen. Fig. 16a und 16b zeigen die Westem-Blots. Das im Western Blot dedektierte Protein entspricht dem mit der Pfeilspitze markierten Protein im silbergefärbten Gel.
[L= Load; T_Durchfluß; W=Wash; 0-40%B, A2, A3... Fraktionenj
BEISPIEL 4:
Clot-Lyse (thrombolytische Aktivität) Der Rückstand der humaDSPA-haltigen Fraktion B6 wurde in 15 ml PBS aufgelöst und 15 min bei 4000xg abzentrifugiert. Diese Fraktion wurde ausgewählt, da sie die größte Reinheit zeigte. Ein Aliquot wurde zur Aktivitätsbestimmung abgenommen und benutzt. Die katalytische Aktivität dieser Probe war ungefähr mit der katalytischen Aktivität von 5 μg/ml Activase ver- gleichbar.
Die verwendeten Blutgerinnsel entstammen einer normalen Blutabnahme 24 h früher und sind aus jeweils 2 ml Blut entstanden, das in Polypropylen- Röhrchen überführt wurde und unter natürlichen Bedingungen gerann. Die Lyse wurde in PBS durchgeführt. .
Die humaDSPA-haltige Fraktion B6 (von SPXL-Sepharose Capture Schritt) wurde zunächst lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 15 ml PBS aufgelöst und 15 min/4000g abzentrifugiert. Davon wurde vor Zugabe des Blutgerinn- sels eine Probe für eine S-2288 Aktivitätsbstimmung abgenommen. Die katalytische Aktivität dieser Probe entsprach im wesentlichen der katalytischen Aktivität von 5 μg/ml Activase.
Die Figuren 17a bis 17d zeigen die Ergebnisse der Clot-Lyse im zeitlichen Verlauf von 0h, 3h, 4h und 24h nach Zusatz des humDSPA. Der linke Versuchsansatz zeigt jeweils die Kontrolle. In den rechten Ansätzen ist PBS mit humaDSPA in der oben beschriebenen Menge enthalten. Die Blutzellen fallen langsam aus dem sich auflösenden Gerinnsel heraus. Nach 24 h bleibt eine Art Netz übrig, das bereits nach 4 h erkennbar wird. In dem Ansatz nach 4 h wurden abgelösten Blutzellen mit einer Spritze abge- saugt, damit die Struktur des verbliebenen Gerinnsels sichtbar wurde.
Es gilt zu beachten, daß sich die Fibrinolyse verlangsamt, wenn das Gerinnsel nicht mehr im eigenen Lysat hängt. Daher ist nach 24 h überhaupt noch ein Gerinnsel vorhanden.
Eine Quantifizierung dieser Reaktion ist nicht möglich. Im Vergleich zu nati- vem DSPA zeigt das humDSPA aber eine deutliche Aktivitätssteigerung, da für die Auflösung eines Gerinnsels derselben Größe durch DSPA mindestens die 4fache Menge DSPA verwendet werden muß.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Piasminogen-Aktivators mit einer gegenüber dem nativen t-PA verringerten Lysin-Bindungskpazität zur Behandlung thromboti- scher Erkrankungen, insbesondere Schlaganfall.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch eine Modifikation des Piasminogen-Aktivators am Kringel 2 oder dazu funktionell oder strukturell homologer Domainen.
3. Verwendung nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch eine Deletion des Kringels 2 oder dazu strukturell oder funktioneil homologer Domainen.
4. Verwendung nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch eine Modifikation der Lysin-Bindungsstellen des Kringels 2 oder dazu strukturell oder funktioneil homologer Domainen.
5. Verwendung nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch die Substitution D236N oder dazu homologer Aminosäuren.
6. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Plasminogen-Aktivator eine mindestens 75%-ige Homologie zu t-PA aufweist.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die t-PA- Aktivierungsstelle durch Deletion oder Substitution modifiziert ist, so daß keine protolytische Spaltung statt findet.
8. Verwendung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch eine Modifikation der Aminosäureposition R15-116.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierungsstelle eine Sequenz LHST aufweist.
10. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator im Übergangsbereich zwischen dem kringel und der Cysteinbrücke einen Aminosäuresequenzabschnitt mit SKAT aufweist.
11. Plasminogen-Aktivator umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 3, 11 oder 13.
12. Plasminogen-Aktivator gekennzeichnet durch eine Identität von mindestens 70 %, vorzugsweise eine Identität von 80 bis 90%-, besonders bevorzugt eine Identität von 95 % zu einem Plasminogen-Aktivator nach Anspruch 10.
13. Plasminogen-Aktivator nach einem der Ansprüche 10 bis 12 gekennzeichnet durch eine gegenüber dem nativen DSPA erhöhten thromboly- tischen Aktivität.
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