EA011156B1 - Активаторы плазминогена, имеющие сниженную способность связывать лизин - Google Patents
Активаторы плазминогена, имеющие сниженную способность связывать лизин Download PDFInfo
- Publication number
- EA011156B1 EA011156B1 EA200600573A EA200600573A EA011156B1 EA 011156 B1 EA011156 B1 EA 011156B1 EA 200600573 A EA200600573 A EA 200600573A EA 200600573 A EA200600573 A EA 200600573A EA 011156 B1 EA011156 B1 EA 011156B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- plasminogen
- plasminogen activator
- domain
- fibrin
- activity
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Применение при лечении тромботических заболеваний активаторов плазминогена, которые обладают сниженной способностью связывать лизин.
Description
Изобретение относится к преимущественному применению активаторов плазминогена, и для него испрашивается приоритет в соответствии с патентной заявкой Германии 103 42 518 7, содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки.
Назначение тромболизиса как варианта терапии при различных тромбоэмболических заболеваниях считается уже в значительной степени завершенным. Основной интерес в исследовании тромболизиса направлен поэтому на дальнейшее развитие и модификацию известных тромболитиков и/или улучшение сопутствующих методов терапии.
Важным тромболитиком, служащим в качестве отправного пункта для разработки новых тромболитиков, является тканевой активатор плазминогена (1-РА), который обладает более высокой селективностью в отношении фибрина и более высокой активностью, чем стрептокиназа и урокиназа. Делеционные мутанты ретеплаза и ланотеплаза, а также тенектеплаза, являются дальнейшими разработками этого активатора плазминогена.
Тканевой активатор плазминогена (1-РА) является одноцепочечным гликопротеином, состоящим из 527 аминокислот. Молекула, исходно представляющая собой одиночную цепь (кс1-РА), протеолитически расщепляется на двухцепочечную форму (1с1-РА). 1-РА обладает определенными структурными и функциональными доменами. Так, Ν-концевая составляющая цепь содержит фингер-домен (Г, аминокислоты 8ег1-Еук49), домен эпидермального фактора роста (Е, 8ег50-Акр87) и два крингл-домена (К1, Т1г88О1у176, и К2, Акп177-Сук261). С-концевая цепь, которая включает домен сериновой протеазы (Р), содержит аминокислоты с 8ег262 по Рго527. Посредством аминокислотных остатков Ηίκ322, Акр371 и 8ег478 С-концевая цепь формирует активный центр.
1-РА и его рекомбинантные варианты и их получение, являются объектом, например, патента США 4766075 и большого числа публикаций (например, Вобе апб Кепа1ик: Тйкие-1уре р1акт1подеп асбуа1ог: уапапб апб сгук1а1/ко1и1юп к1гис1игек бетагса1е К1гис1ига1 бе1егттап1к о! Гцпсбоп, Сиггеп1 Ор1шоп ίη 81гис1ига1 Вю1оду 1997, 7:865-872). Диаграмма структуры 1-РА прилагается на фиг. 1.
Подобно большинству других сериновых протеаз кс1-РА превращается в 1с1-РА форму при расщеплении. Расщепление происходит по связи между Агд275 и 11е276. После этого две цепи удерживаются вместе только посредством одного дисульфидного мостика между серином 264 и серином 395.
Такая нумерация сайта расщепления 1-РА соответствует нумерации, выбранной Вобе и Кепа1ик (1ос. сй). Однако другие авторы берут за основу отличную от этой нумерацию и определяют сайт расщепления или активации как Κ15-Ι16 или К.310-1311. Однако сайты, определенные таким образом, не отличаются функционально или структурно.
Тканевой активатор плазминогена (1-РА, алтеплаза) способен активировать плазминоген, который переходит в плазмин. Однако из кинетических констант очевидно, что 1-РА активирует циркулирующий плазминоген только в слабой степени. Обе формы 1-РА, то есть и одно-, и двухцепочечная молекулы, демонстрируют в принципе одни и те же фармакологические свойства. Однако плазминоген, связанный с фибрином, активируется с каталитической активностью, на три порядка превосходящей активность, с которой активируется свободный плазминоген. Соответственно, тромболитические свойства тканевого активатора плазминогена значительно усиливаются в присутствии фибрина.
Сообщается, что относительная селективность 1-РА по отношению к фибрину находится в интервале от 500 до 1000. Каталитический эффект может также быть увеличен при взаимодействии активатора плазминогена с бета-амилоидом или фибриногеном. Способность 1-РА активироваться фибриногеном сравнима с его способностью активироваться бета-амилоидом.
Эффект активатора плазминогена контролируется физиологически ингибиторами, причем ингибитор I активатора плазминогена (РА1-1) является важным антагонистом. Связывание РА1-1 с легкой цепью, входящей в состав молекулы 1-РА, изменяет структуру каталитического центра таким образом, что реакция активации плазминогена не может далее осуществляться (Веппе1 УГ, Раоп ΝΓ, Кеу1 ВА, Во1йеш Ό, 1опек А18, Ргейа Ь, Уигт ГМ, 2о11ег Μ: Шдй геко1и1юп апа1укй оГ Гцпс1юпа1 бе1егттап1к ш йцтап 11ккие-1уре р1акттодеп асбуа1ог. 1оита1 оГ Вю1одюа1 Сйетй1гу 1991; 266: 5191-5201).
Активатор тканевого плазминогена быстро метаболизируется в печени. Поэтому наличие печеночной недостаточности у пациента увеличивает период полужизни этого вещества в плазме крови (Етей Л, уап беп Ноодеп СМ, 1епке Ό: Нерайс с1еагапсе оГ 1йкие-1уре р1акттодеп асбуа1ог т га1к, Т1отЬ Наеток1ак 1985; 54: 661-664; ПеГепЬшпп А1, КоЫкоп АК, Кигшк РВ, ЬибЬгоок РА, 8оЬе1 ВЕ. С11шса1 рНагтасоГ оду 1п рабепй тейй еуоМпд туосагб1а1 шГагсбоп оГ 1йкие р1акт1подеп асбуа1ог ргобисеб Ьу гесотЬшап1 ^NА 1ес1по1оду Сйси1а1юп 1985; 71: 110-116).
Активаторы плазминогена разработаны для лечения тромботических заболеваний, таких как инфаркт миокарда и инсульт. 1-РА является в настоящее время единственным тромболитиком, одобренным Гооб апб Эгид Абт1пй1га1юп (ГОА) в США для лечения инсульта.
Тем не менее, в прошлом возросли подозрения, что, хотя 1-РА, с одной стороны, проявляет ожидаемые положительные тромболитические эффекты при лечении инсульта, с другой стороны он является ответственным за нежелательное повреждение тканей. Таким образом, инфузия 1-РА 1-РА-дефицитным мышам приводила к возрастанию числа инфарктов (Уапд Υ.Γ., Ткйка 8.Е., 81пск1апб 8, 8бед РЕ, 8опапо 80, Ыр1оп 8А: Тйкие р1акт1подеп асбуа1ог (1РА) тсгеакек пеигопа1 батаде айег Госа1 сегеЬга1 йскепиа т
- 1 011156 \\Иб-!уре апб 1РЛ-бсПс1Сп1 Ш1се. №1 Меб 1998; 4 (2): 228-231). Предполагается, что это возросшее число повреждений обусловлено стимуляцией ИМОЛ-зависимых глутаматных рецепторов (ЫЬега!оге СТ, 8аткоп А, В1аб1п С, 8с111ешипд \УЭ. МебсаИ ВЬ: Уатрйе Ьа1 кайуагу р1акттодеп асйуа!ог (бекто!ер1аке): а ипк|ие йЬгшоййс епхуте !йа! боек по! ргото!е пеигобедепегабоп. 8!гоке 2003; 34 (2) : 537-543). Этот эффект может быть вызван протеолитическим расщеплением ΝΜΟΑ-рецепторов под действием !-РА (№со1е О, Эосадпе Р, Ай С, МагдаШ I, Сагтейе! Р, МасКегШе ЕТ, е! а1.: Тйе рго!ео1уйс асйуйу о! йккие р1акттодеп асйуа!ог епйапсек NΜ^Α гесер!ог-теб1а!еб ыдиайид. Ν;·ι! Меб 2001; 7 (1): 59-64).
Следовательно, цель настоящего изобретения состоит в разработке новых методов терапии тромботических болезней, в частности инсульта.
Эта цель достигается посредством применения плазминоген-активирующего фактора, который проявляет способность связывать лизин, сниженную по сравнению со связывающей способностью нативного активатора плазминогена. В особенно преимущественном варианте осуществления активатор плазминогена демонстрирует модифицированный крингл-домен, предпочтительно крингл-2 домен, который изменен по сравнению с доменом нативного !-РА. Последний домен может полностью или частично отсутствовать, так, что способность связывать лизин снижена.
К2 домен или области, которые функционально или структурно, по существу, гомологичны ему, могут быть предпочтительно модифицированы таким образом, что остатки лизина более не связываются или связываются только с низкой аффинностью.
В особенно преимущественном варианте осуществления, активатор плазминогена, который может использоваться в соответствии с изобретением, представляет собой модифицированный !-РА.
Значение К2-домена, включая получение К2-делеционных мутантов !-РА, детально описано в Ноггеуое!к А1, 8тйбе А, бе Упек С, Раппекоек Н (Тйе кресгйс го1ек о! йпдег апб кг1пд1е 2 боташк о! йккие!уре р1акттодеп асйуа!ог биппд т уйго ПЬг1по1ук1к: 1оита1 о! Вю1одюа1 Сйеткйу, 269, 17, 12639-12644, 1994).
Поскольку их способность связывать лизин снижена или отсутствует, плазминоген-активирующие факторы, которые могут использоваться в соответствии с изобретением, проявляют повышенную селективность по отношению к фибрину и сниженную способность активироваться фибриногеном или бетаамилоидом. Эта сниженная способность активироваться фибриногеном является, возможно, причиной селективности по отношению к фибрину. Наличие у активатора плазминогена высокой селективности по отношению к фибрину имеет важное значение в связи с лечением инсульта, в частности, поскольку, например, нативный !-РА может быть активирован фибриногеном, который преодолевает поврежденный гематоэнцефалический барьер и затем стимулирует опосредованную глутаматом эксцитотоксичность, посредством последующей активации ИМЭА рецепторов. Соответственно, снижение в соответствии с изобретением способности активатора плазминогена активироваться фибриногеном также ведет к снижению нейротоксичности.
Важность лизин-связывающих участков на !-РА крингл-2 выяснилась, в частности, в результате сравнительных исследований структурных и функциональных доменов !-РА в сравнении с Э8РА. Э8РА представляет собой активатор плазминогена, который был первоначально выделен из слюнной железы летучей мыши-вампира (в этой связи см. патент США 6008019; ЕР 0 383 417). Э8РА может быть выделен в виде четырех изоформ, из которых Э8РАа1р11а1 можно получить в рекомбинантном виде, используя клетки СНО.
В отличие от !-РА, Э8РА содержит только один крингл-домен. Функционально и структурно этот домен соответствует скорее К1 домену !-РА, чем К2 домену, и не имеет участков связывания лизина (Вппдтапп Р, СгиЬег Э, Ыеке А, ТоксЫ Е КгаЕксйтаг 1, 8с111еитпд ХУЭ, Эогтег Р: 8!гис!ига1 !еа!игек теб1а!1пд ПЬпп ке1есйуйу о! уатрйе Ьа! р1акттодеп асйуа!огк; 1оита1 о! Вю1одюа1 Сйет1к!гу 1995, 270(43): 25596-25603). Поэтому в литературе встречаются утверждения, что Э8РА не содержит крингл-2 домена.
Кроме того, Э8РА всегда представлен одноцепочечными молекулами, потому что в нем отсутсвует сайт активации плазмина, такой как в !-РА. В сравнении с !-РА активность Э8РА стимулируется в присутствии фибрина в 45000 раз, в то время как, согласно Сагбе11 81, Эпопд ЬТ, □(еЫ, Уогк ГО, Наге ТВ, Вед1к!ег ВВ, 1асоЬк 1^, Э|хоп ВА, Рпебтап РА (1ко1айоп, с11агас!епха!юп апб с^NΑ с1ошпд о! а уатрйе Ьа! кайуагу р1акттодеп асйуа!ог: 1оита1 о! Вю1одка1 Сйет1к!гу 198 9; 264(30): 17947-17952) это значение составляет 205.
Диаграмма структуры Э8РА прилагается в виде фиг. 2а. Фиг. 2Ь показывает сравнение аминокислотных последовательностей !-РА и Э8РА (8ЕЦ ГО №к. 1+2).
Прежде считалось, что способность !-РА связывать фибрин функционально обусловлена фингер- и крингл-2 доменами (уап ΖоииепГе1б А1, Уеегтап Н, Раппекоек Н: (1986) Ргос. Ν;·ι!1. Асаб. 8ск И8А., 83: 4670-4674). Однако в недавних публикациях предполагается определенное участие и протеазного домена Р (Веппе!! 1ос. сй.). Функции индивидуальных доменов исследовались также Ваккег АНР, 1асойпе Е., ^еешпд-Уегйоейе! Э., Уегйеуеп 1Н (Тйе го1е о! йукуйВтбтд кйе о! йккие !уре р1акппподеп асйуа!ог ш !йе т!егасйоп \νί!1ι а !огттд йЬгт с1об: 1оита1 о! Вю1одюа1 Сйет1к!гу 270, 21, 12355-12360, 1995).
Ваккег с соавторами получили различные модификации !-РА, например два делеционных мутанта, которые лишены либо крингл-2, фингер-домена, или домена эпидермального фактора роста. Эти мута
- 2 011156 ции были получены также в сочетании, и некоторые из них были дополнены точечной мутацией в крингл-2 домене, конкретно включающей замену Ό236Ν. Эта избирательная аминокислотная замена заключается в замещении аспарагиновой кислоты в положении 236 аспарагином и, таким образом, уничтожении участка связывания лизина (ЬВ8 в К2 домене). Для процедуры получения мутации читателю настоятельно рекомендуют обратиться к упомянутой выше публикации Ваккег с( а1., включающей цитируемые в ней ссылки.
В этих исследованиях Ваккег с соавторами продемонстрировали, что занятие лизин-связывающего участка в К2 домене ЕАСА (ε-аминокапроновой кислотой) заметно ослабляет связывание нативного 1-РА с фибрином. То же самое относится к модификации ЬВ8 заменой Ό236Ν, за тем исключением, что ослабление меньше. Даже делеционный мутант, который состоял из одного К2 домена и протеолитического С-концевого фрагмента, все еще связывался с фибрином, но в небольшой степени. И только К2Р мутант, в котором был делетирован ЬВ8, не проявлял более способности связывать фибрин.
Хотя эти результаты демонстрируют, с одной стороны, важность Р и К2 доменов, а также ЬВ8 в К2, они также демонстрируют, что взаимодействие 1-РА и фибрина не опосредуется исключительно Р и К2 доменами. Есть еще функция у ЬВ8 в домене К2, причем ЬВ8 отвечает предположительно за стабилизацию конформации 1-РА, наиболее благоприятную для связывания фибрина.
Важность К2 домена, включая его лизин-связывающий участок, выяснилась в исследованиях, проведенных 81ехсаг1 К1, РгейепЬигдй 16 и \νί(ζ Л (С11агас1епха1юп оГ 1йе йИегасПощ оГ рктшпподеп апй апй уатрие Ьа1 р1а8ттодеп асйуа1ог8 \νί(1ι ЛЬгтодеп, ЛЬгш, апй 1йе сотр1ех оГ О-йнпег попсоуакпИу Бпкей 1о Ггадтеп1 Е: 1оита1 оГ Вю1одка1 СйетщЛу 273, 29, 18292-18299, 1998).
В экспериментах по связыванию 81е\\'аг1 е1 а1. изучают, среди прочего, сродство 1-РА и Э8РА к фибрину и фибриногену. В исследовании сродство изучалось в присутствии или в отсутствие аналога лизина ЕАСЕ для того, чтобы проанализировать значение крингл-зависимого взаимодействия. На основании исследований они заключили, что Э8РА не способен связывать фибриноген из-за отсутствия связывающих лизин сайтов в крингл-домене. Они поэтому приписывают функцию, существенную для способности 1-РА связывать фибрин, ЬВ8 в крингл-2-домене 1-РА в сочетании с фингер-доменом.
Результаты экспериментов, представленные в примере 1, подтверждают разное сродство Э8РАа1рйа1 и рекомбинантного 1-РА человека к кофакторам бета-амилоиду (1-42), фибриногену и фибрину. Для получения этих данных, кинетические параметры Ккат и Кт, и отношение Ккат/Кт, были определены для каждой комбинации активатор плазминогена/кофактор. В отсутствие кофактора способность Э8РАа1рйа1 к активации плазминогена была приблизительно в 100 раз ниже, чем способность к активации плазминогена 1-РА, в то время как оба соединения одинаково способны активировать плазминоген в присутствии фибрина. Э8РАа1рйа1 был примерно в 30 раз менее эффективным, чем 1-РА в присутствии кофактора фибриногена или бета-амилоида. При физиологической концентрации плазминогена 2 мкМ, из этих данных выводится отношение эффективности фибрина как кофактора к эффективности фибриногена или бета-амилоида как кофактора, 480 в случае Э8РАа1рйа1 и 16 в случае 1-РА человека.
Как было уже разъяснено выше, плазминоген-активирующий фактор, который используется в соответствии с изобретением, характеризуется тем фактом, что его связывающий лизин сайт крингл-2-домена или отсутствует, или является измененным. В одном варианте осуществления крингл-2 удален. Однако также возможно, в другом варианте осуществления сохранить крингл-2 и заменить аспарагиновую кислоту в 236 позиции на аспарагин. Соответственно, для изобретения не критично, в соответствии с изобретением, отсутствует ли структура крингл-домена 1-РА, но это имеет место только для лизинсвязывающего сайта, подлежащего модификации таким образом, что взаимодействие, повышающее активность 1-РА, с кофактором более невозможно.
В другом предпочтительном варианте осуществления активатор плазминогена, в частности, измененный 1-РА, который используется, может быть модифицирован посредством делеции крингл-1-домена, таким образом, что 1-РА не способен более связывать рецептор. Как результат, активатор тканевого плазминогена более не метаболизируется естественным образом в печени, что приводит к удлинению периода полужизни ш у1уо (Кукеп ОС, 011ег М, Кшрег 1, уоп Вегке1 Т1С: Кесер1ог-тей1а1ей епйосу1о8Щ оГ П55ие-1уре рктшпподеп асйуа1ог (1-РА) Ьу йуег сеШ ТйготЬ. Ке§. 1990; 8ире1. X: 63-71). Делеция крингл-1 домена из ретеплазы известна и описана, например, Магйп и, Вайег К, Войт Е, КойпеП и, уоп Мб11епйогГ Е, Рщсйег 8, 8ропйег 6 (ВМ 06.022: А №ус1 гесотйтаЩ ркгшпподеп асЛуа1ог. Сагйюуа8си1аг йгид геу1е\\'5 1993; 11:299-311). Для этого применялись мутанты, в которых аминокислоты с 4 по 176 удалены. Увеличение периода полужизни делает возможным болюсное введение активатора плазминогена.
В предпочтительном варианте осуществления активатор плазминогена, который может быть использован в соответствии с изобретением, основан на одной из аминокилотных последовательностей, показанных на фиг. 3, 11 или 13. Каждая из этих аминокислотных последовательностей составляет модифицированную 1-РА, в которой удален крингл-2 и сделано структурное изменение на участке последовательности сайта расщепления 1-РА при активации. Это изменение может либо состоять только в замещении аминокислот К и I в сайте расщепления при активации (например, Н8; см. последовательность 8ЕО Ш № 3, фиг. 3) или дополнительно воздействовать на близлежащие аминокислоты (например, замещение РК1К на ЬН8Т в последовательности 8ЕО Ш № 4, фиг. 11). Последняя модификация в этом
- 3 011156 месте соответствует структуре нативного Ό8ΡΆ.
В соответствии с изобретением предпочтение отдается получению и использованию для лечения инсульта активатора плазминогена, который особенно подходящим образом сочетает преимущество нативного 1-ΡΛ, а именно, в частности, низкую иммуногенность при использовании у человека, с преимуществами Ό8ΡΆ, а именно отсутствием нейротоксичности. В одном варианте осуществления изобретения удаление крингл 2-домена из 1-ΡΆ соответственно выбирается так, что переносимый участок соотносится с соответствующей структурой в Ό8ΡΆ. Переносимый участок между оставшимся крингл 1доменом измененной 1-ΡΛ и нижележащий цистеиновый мостик, соответственно, формируются преимущественно последовательностью 8КЛТ. В Ό8ΡΆ последовательность 8КЛТ расположена между кринглдоменом и цистеиновым мостиком. Эта преимущественная структура реализуется, например, в последовательности 8ЕО ΙΌ № 4, как показано на фиг. 11.
Фиг. 12 (множественное выравнивание последовательностей) показывает сравнение между ΐ-ΡΆ и двумя описанными вариантами осуществления в соответствии с изобретением.
В еще одном варианте осуществления в соответствии с изобретением используется активатор плазминогена как изображено на фиг. 13 (8ЕЦ ΙΌ № 5).
Естественно, также возможно, в соответствии с изобретением, использовать белки, обладающие последовательностями, которые гомологичны или частично идентичны аминокислотным последовательностям, изображенным на фиг. 3, 11 и 13. Предпочтение отдается гомологам или последовательностям, идентичным по крайней мере на 70%, предпочтительно на 80-95%. Эти гомологичные или идентичные белки демонстрируют активность плазминоген-активирующего фактора (предпочтительно проявляющуюся в освобождении ρΝΑ) и вызывают лизис кровяного сгустка ίη νίίτο (см. пример 3).
Активатор плазминогена, который может быть использован в соответствии с изобретением, может характеризоваться отсутствием фингер-домена и домена эпидермального фактора роста. Эта делеция существенно снижает связывание с рецепторами печени и снова удлиняет период полужизни (Ьаткоп СК, Т1топу СА, Ногдап ΡΟ, Вагопе КМ, Непкоп К8, Апдик ЬВ, 81оибетйе 1В: ΡΐΌΐοίη епдшеегшд оГ ηονοί р1актэподеп ас1АаЮгк \сйЕ тстеакеб ЛтошЬоЩю ро1епсу ш таЬЬйк ге1а(1уе Ю ас1Ааке. 1оитпа1 оГ Ью1одюа1 СЕеппк1гу 1991; 266: 8156-8161; 8та11тд К^: Мо1еси1аг Ью1оду оГ р1актэподеп ас1АаЮгк: \\'Еа1 аге 1Пе сйшса1 ЕпрЕсабопк оГ бгид бек1дп? Ат 1 Сагбю1. 1996; 78 (кирр1. 12): 2-7).
Помимо делеционных мутантов, активаторы плазминогена, которые используются в соответствии с изобретением, могут также быть точечно изменены посредством сайт-направленного мутагенеза. Так, известно, например, для ΓΙ-ΡΑ-ΤΝΙΧ (тенектеплазы), что три мутации в сайте связывания ингибитора активатора плазминогена, с одной стороны, и в сайте связывания, посредством которого ΐ-ΡΑ связывается с клетками печени, с другой стороны, приводит к возрастанию каталитической активности, в то время как способность инактивироваться ΡΑΙ снижается. Это, таким образом, обеспечивает тенектеплазе константу каталитической конверсии Ккат/Кт, которая повышена в 100 раз (в этой связи см. также Баот ΝΕ, Кеу1 ВА, КеГшо С1, СЕо\у АМ, Nдиуеη НУ, Вег1еаи ЬТ, ВабШо 1, Ρеηа ЬС, Вгабу К, \Уигт ЕМ, Оде/ 1, Веппей \УЕ: А к1о\т с1еаттд йЬтш-кресШс, ΡΑI гекМаШ νа^^аηΐ оГ ΐ-ВА (Ώ03Ν, КНКК 296-299 АААА). ТЕготЬ НаетоЧак 1993; 70: 307-312 апб Саппоп СΡ, Бо^'е Т^, МсСаЬе СН, КикйепЬаит 1М. Непгу Т, 8ес.|шга К, 8сЕ\се|Гег М, Вгееб 1, Сибег Ό, Тгасу К, Гог Ле Т1М1 ЕкекбдаЮгк. ТМ<-Пккие р1актшодеп ас1АаЮгк ш туосагб1а1 1пГагсПоп (Т1М1) 10: Кекибк оГ Ле 1шйа1 раПеп1к ш Ле Т1М1 10 рПо( - а рЕаке 1, рйаттасокшейск йга1. С1гси1айоп 1995; 92 (кирр1.): 1-415).
Пример 1.
1. Сравнительный анализ эффективности бета-амилоида (от 1 до 42), фибриногена и фибрина как кофакторов активации плазминогена ЛЗЕАафЕа! и рекомбинантного человеческого ΐ-ВА.
Материалы и способы:
Были использованы следующие вещества:
□ЗВАа^ий (приготовленный Баюн серия №. 2Л8А01, 12 декабря 2002, образец 10). 10 мг вещества были растворены в 10 мл стерильной воды, для получения конечной концентрации 1 мг/мл;
рекомбинантный 1-ГА (Ас111уке, приготовленный каюгт серия №. 102572). 10 мг были растворены в 10 мл стерильной воды для получения конечной концентрации 1 мг/мл;
С1и-плазминоген человека, очищенный из плазмы крови человека (приготовленной Еаюп) и растворенный в буфере ГСБА в концентрации 25 мкМ;
фибриноген человека, по существу, свободный от плазминогена, был получен от 81дша (каталожный №. Е4883, серия 12К7620). 25 мг были растворены в 25 мл буфера ГСЕА для получения конечной концентрации 1 мг/мл;
тромбин человека (81дша; каталожный №. Т7009. Серия 61К7603). 100 единиц были растворены в 10 мл буфера ГСБА для получения конечной концентрации 10 единиц /мл.
Е1ау1деп.рП цветной реагент (П-ЬЛ-СНТ-Еук-р-пйгоапШпе-ОНСЕ) от Вю1оо1 (каталожный №. 101353, серия 1512016). 100 мкМ были растворены в 50 мл буфера ΡΕ-СР для получения 2 миллимолярной конечной концентрации;
белок бета-Амилоид (1-42) от ВасЕет (каталожный №. Н-1368, серия 0535120). 4 мг были растворены в 4 мл 0,1-процентного гидроксида аммония для получения конечной концентрации 1 мг/мл.
- 4 011156
Все реагенты были разделены на порции и хранились при -20°С в течение не более двух недель.
РЬС буфер Йопек 1990): 0,1 М ЫаС1-2Н2О (Легок, каталожный Νο. 20779); 0,03 М ЫаНСОз (Легок, каталожный Νο. 21712); 4 мМ КС1 (Р1ика, каталожный Νο. 60130); 1 мМ СаС12· 2Н2О (Легок, каталожный Νο. 207780); 1 мМ №12НРО4· 2Н2О (Р1ика, каталожный №. 71638); 0,3 мМ МдС12· 6Н2О (Легок, каталожный №. 197530); 0,4 мМ Мд8О4· 7Н2О (Р1ика, каталожный №. 63140); 20 мМ НЕРЕ8 (Аррйсйет, каталожный №. А1969); 0,01% Ро1укогЬа1е 80 (Е1ика, каталожный №. 93781).
Исследование активации плазминогена
Исследование активации плазминогена проводилось на микропланшетах для титрования в суммарном объеме 0,15 мл, как описано у Вгшдтапи е! а1., (1ос. сП.). Реагенты добавлялись в следующем порядке: 50 мкл плазминогена (0-24 мкМ); 15 мкл кофактора (1 мг/мл); 10 мкл активатора плазминогена (7,5 нМ) и 75 мкл Наущеп (2 мМ).
Конечные концентрации были таковы: активатор плазминогена (ΐ-РА или ΌδΡΑα.1): 0,5 нМ; С1иплазминоген: 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 и 8 мкМ; Е1ау1депР11: 1 мМ и кофакторы: 100 мкг/мл.
Кофакторы бета-амилоид (1-42), фибриноген и фибрин сравнивались с контролем без кофакторов. В контроле реакционная смесь содержала добавочные 0,13 единиц/мл тромбина человека.
Сразу после заполнения планшет для титрования помещался при 25°С в то1еси1аг беуюе ТйегтоМах писгоШег геабег.
Перемешивание производилось, начиная с ΐ=0.
Оптическая плотность при 405 нм и 490 нм измерялась с регулярными интервалами. Оптические плотности при 490 нм вычитались из оптических плотностей при 405 нм для того, чтобы исключить различия, обусловленные током жидкости. Все эксперименты выполнялись в трех повторах для каждой концентрации плазминогена и активатора плазминогена.
Определялись значения Кт и ккат (фиг. 4-6).
Фиг. 4
a) определение молярной экстинкции ρΝΑ;
b) конверсия Наущеп.рН 10 нМ плазмином как функция концентрации Е1ау1деп.р11 (в мкМ);
c) график Михаэлиса-Ментен для конверсии Е1ау1деп 10 нМ плазмином. Начальные скорости из фиг. 4Ь были переведены в ρΝΑ/с.
Фиг. 5
Кривые изменения оптической плотности во времени для четырех различных комбинаций активаторов плазминогена и кофакторов. Для этой цели были использованы концентрации плазминогена: 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125 и 0,0625 мкМ.
a) ΐ-РА без кофактора;
b) ΐ-РА с бета-амилоидом (1-42) как кофактором;
c) ΐ-РА с фибриногеном как кофактором;
6) ΐ-РА с фибрином как кофактором;
е) П8РАа1рйа1 без кофактора;
Г) 08РАа1р11а1 с бета-амилоидом (1-42) как кофактором;
д) И8РАа1рйа1 с фибриногеном как кофактором
11) И8РАа1рйа1 с фибрином как кофактором.
Фиг. 6.
График значений {=кк. ккат.РА.Е.Р./(Кт+Р)} в зависимости от концентрации плазминогена
a) графики для ΐ-РА без кофактора или с бета-амилоидом, фибриногеном или фибрином как кофактором;
b) графики для П8РАа1рйа111.38 без кофакторов.
- 5 011156
Результаты
Таблица 1
Ккат (с *) | Кт (мкМ) | Ккат/Кт | |
Д-РА - | Не определен | не определен | 12721224 |
контроль | |||
Д-РА с | Не определен | не определен | 9307+579 |
амилоидом. | |||
Д-РА с | Не определен | не определен | 1020411546 |
фибриногеном | |||
Д-РА с | 0,35110,35 | 0, 178±0,017 | 1990000+327000 |
фибрином | |||
ΟΞΡΆ - | Не определен | не определен | 12,510,9 |
контроль | |||
ОЗРА с | 1,64910,110е-3 | 2,465±О,426 | 6901131 |
фибриногеном | |||
ΏΞΡΑ с | 0,957+0,199е-3 | 0,853+0,316 | 13041785 |
амилоидом | |||
ΏΞΡΑ С | 0,532+0,136 | 1,098±0,382 | 5060001120000 |
фибрином |
Табл. 1: значения ккат/Кт для активации плазминогена рекомбинантными 1-РЛ и 08РЛа1рНа1 человека с использованием бета-амилоида (1-42), фибриногена и фибрина как кофакторов.
Результаты даны как среднее ± стандартное отклонение для трех независимых экспериментов.
Определить точные значения ккат и Кт было невозможно, потому что значения Кт были выше максимальной концентрации (8 мкМ) плазминогена, которую можно было использовать.
Вывод кинетических констант сам по себе недостаточен для сравнения эффективностей различных кофакторов, поскольку скорости реакции при концентрации плазминогена, близкой или меньшей чем Кт, зависят от концентрации плазминогена. По этой причине скорости реакции вычисляются с использованием кинетики Михаэлиса-Ментен при характерной для плазмы крови физиологической концентрации плазминогена - 2 мкМ. Относительные эффективности различных кофакторов в активации плазминогена со стороны ΐ-РА и ПБРАа1рйа1 (табл. 2) определены на этой основе.
Таблица 2
Кофактор | 03РАа1 | 1-РА |
нет | 1 | 101,8117,9 |
ОЗ РА с амилоидом | 27,3+7,7 | 744,6+23,6 |
РЗРА с фибриногеном | 29,815,0 | 816,31123,7 |
ϋ3ΡΑ с фибрином | 13560+2360 | 12880+1360 |
Относительные скорости активации плазминогена при его физиологической концентрации - 2 мкМ, вычисленные с использованием кинетических параметров табл. 1. Сочетание Ό8ΡΆ контроля составляет 1.
Пример 2.
Прионные болезни, например губчатые энцефалопатии, представляют собой фатальные нейродегенеративные явления, которые характеризуются накоплением неправильной изоформы прионного белка (РгР8С) в амилоидных отложениях. Нормальный прионный белок (РгРс) экспрессируется во многих тканях, особенно, в мозге, где он концентрируется в синапсах. Механизм перехода конформации РгРС в РгР8С до сих пор недостаточно понятен, и непонятен механизм, который ведет к нейродегенерации посредством образования РгР8С. Возможный механизм мог бы заключаться в действии на РгР8С в связи с активацией плазминогена 1-РЛ.
Авторы уже показали, используя рекомбинантный белок, что РгР может повышать катализируемую ΐ-РА активацию плазминогена в 300 раз (ЕШз V, Пашек М, Мкга К, Вго\уп ΌΚ. (2000): Р1а8тшодеп аСЙуаΐίοη к 8Йти1а1еб Ьу рпоп рго!ет апб геди1а1еб ίη а Соррег-берепбеп1 таппег, ВюСЙеткйу 41: 6891-6896).
Способность РгР стимулировать активацию плазминогена зависит от конформации РгР, причем на конформацию влияет наличие или отсутствие Си2+. Последняя форма содержит большое количество бета-структур, которые соответствуют изоформе РгР8С и стимулируют активацию плазминогена. Эти данные согласуются с более ранними наблюдениями в том, что, когда плазминоген, связанный с РгР8С, который выделен из мозга мышей, инфицированных 8Сгар1е, он не связывал РгРС, как в нормальных клетках мозга (Е18Йег М, КоеСк1 С, Капхек Р, 8с11\\шу НР, Λβυζζί А (2000): Вшбшд οί бкеа8е-а88оС1а1еб рпоп рго1еш Ю р1а8тшодеп. №1иге 408: 479-483).
Более того, эксперименты авторов показали, что механизм активации плазминогена, стимулированной РгР, также заключает в себе связывание ΐ-РА с ароРгР (то есть РгР без Си2+). Структуры, которые
- 6 011156 необходимы для этого связывания, детально еще не определены. Однако связывание специфично, так как оно предотвращается ΌΕΡ-инактивированным 1-РА.
Другие способы:
Препараты РгР, которые использовались в этих исследованиях, были в каждом случае получены из рекомбинантной мышиной РгР, выделенной из Ε.οοίί. После очистки Н18-меченой РгР, белок снова сворачивается, в отсутствие или в присутствии хлорида меди, для того, чтобы сформировать либо 1ю1о-РгР. или аро-РгР. Агрегированные формы этих белков в каждом случае получают быстрым растворением в воде. Белок был собран при центрифугировании. Вещество устойчиво к обработке протеиназой К. Мутантную форму Δ51-90, которая не содержит Си2+-связывающий сайт, получают таким же образом. Действие этих разных форм РгР на активацию плазминогена ЭЗРА было исследовано путем инкубации РгР (0-100 мкг/м) с Ьук-плазминогеном (25 нм) и ЭЗРА (0,25 нм). Активация плазминогена определяется по гидролизу плазмин-специфичного красителя Н-6-Уа1-Ееи-Еу8-7-амидо-4-метилкумарина при 37°С, при использовании считывающего устройства для микропланшетов ЗРЕСТКАтах Сет1ш-1оиге8сепсе. Контроли для этих экспериментов содержат 5С-1-РА в качестве положительного контроля эффекта РгР на активацию плазминогена, и фрагменты фибрина, в качестве положительного контроля для стимуляции активностей ΐ-РА и ЭЗРА.
Специфичность связывания плазминогена определяется по конкуренции с ΐ-РА, инактивированной ЭБР. Лизиновый аналог ЕАОА был также использован в качестве конкурентного ингибитора.
Результаты
Результаты экспериментов представлены в табл. 3 и фиг. 7-10.
Фиг. 7, в частности, предоставляет информационное обеспечение. Эта фигура объясняет, что РгР специфично активирует только ΐ-РА, а не ЭЗРА. Кроме того, она объясняет, что должен быть задействован лизин-связывающий сайт крингл-2, в качестве существенного различия между ЭЗРА и 1-РА.
Таблица 3. Скорости реакций, М-1с-1 | Фибрин | ||||
Без РгР | В присутствии РгР | РгР + Нер | |||
Препарат | Ь-РА | 7200 | 1800000 | 2000000 | |
Ргр #1 | ЦЗРА | 15,3 | 9,77 | 2000000 | |
Препарат | Ъ-РА | 7020 | 624000 | 2912000 | |
Ргр #2 | ΏΞΡΑ | 15,75 | 162,75 | 5565 |
Стимуляция образования складок
присутствии
Фибрин
Препарат | Е-РА | 1 | 250 |
РгР #1 | □ 5РА | 1 | 0,638562 |
Препарат
2777778
130719
Ό3ΡΑ
88889
33333
353,3333
Пример 3.
а) Получение и очистка гуманизированного ЭЗРА (йцтЭЗРА) (аминокислотная последовательность, как показано на фиг. 11).
ДНК бакуловируса, кодирующая рекомбинантный человеческий ЭЗРА, была получена с использованием системы Вас-1о-Вас (1пуйгодеп) и очищенная вирусная ДНК была трансфецирована в 8ί9 клетки насекомых. Рекомбинантный бакуловирус, который был продуцирован, был размножен с использованием 8ί9 клеток. НцтЭЗРА экспрессируется с применением Нфй Бгуе клеток насекомых в среде, не содержащей сыворотки, в суспензионной культуре. Супернатант клеточной культуры, содержащий рекомбинантный белок, был заморожен при 20°С до того, как он подвергнется дальнейшей обработке.
Супернатант клеточной культуры размораживали медленно при комнатной температуре на шейкере и затем центрифугировали при 4000/д в течение 1 ч. рН раствора белка (1,5 л) был уравновешен до 6,0 при помощи ацетата аммония, нанесен на ионообменную колонку (с объемом слоя 350 мл) ЗР-керйагоке ХЬ (Атегайат) и промыт 5 колоночными объемами 50 мМ раствора ацетата аммония. Связанный белок элюировали 0-100% градиентом 1 М ацетата аммония, рН 6,0, в 10 объемах колонки.
Фракции, содержавшие йитЭЗРА, были идентифицированы Вестерн-блоттингом; после определения белков эти фракции подвергались тесту на активность, замораживались при -80°С и впоследствии лиофилизировались.
В отличие от стандартного определения активности, в этом эксперименте использовали 50 мкл
- 7 011156 элюата (=йитО8РА-содержащая фракция), 50 мкл 0,2 М Тг® рН 8,0, 100 мкл 2 мМ 8-2288 в РВ8.
б) Исследование активности Ό8ΡΑ.
Применяемое исследование анализа активности представляет собой определение скорости, с которой активатор плазминогена превращает бесцветный субстрат 8-2288 в окрашенный продукт. Это стандартный способ определения протеолитической активности активирующих плазминоген факторов. Активность визуализируется посредством определения высвобождения хромогена (п-нитроанилина, ρΝΑ) тестируемым веществом. Компания Сйтошодешх предлагает для этой цели хромоген 8-2288.
В таком исследовании скорость реакции не определяется непосредственно (например, в каталитических единицах); вместо этого делается сравнение со стандартом, который принимается за 100% активность.
Скорость реакции измерялась в буфере, имеющем следующий состав: 25 мМ ТИ8-НС1, рН 8/0,1% альбумин/100 мМ №1С1 /1,1 мМ глицин/1,2 мМ маннит/2,5 мМ 8-2288.
Измерение проводилось в 96-луночном планшете с использованием контролей, стандартов и образцов, содержавших различные концентрации белка.
Изменение поглощения при 405 нм во времени регистрировалось с использованием фотометра. Наклон линейного участка кривой определялся с помощью Ехсе1. Этот параметр давал значения активности.
Фиг. 14 показывает активности фракций (выраженные через активность 8-2288). Гели, окрашенные серебром, можно видеть на фиг. 15а и 15Ь. Фиг. 16а и 16Ь демонстрируют иммуноблоты. Белок, выявленный на иммуноблоте, соответствует белку, отмеченному стрелкой на геле, окрашенном серебром.
[Ь = образец, нанесенный на колонку; Т = «проскок» (материал, не задержанный колонкой); фракция, полученная промыванием колонки; 0-40% В, А2, Α3 ... фракции.
Пример 4. Лизис сгустка (тромболитическая активность).
Остаток содержащей йитО8РА фракции В6 был растворен в 15 мл РВ8 и раствор был центрифугирован при 4000хд в течение 15 мин. Эта фракция была выбрана потому, что она демонстрировала наибольшую чистоту. Из нее была отобрана порция для определения активности. Каталитическая активность этой фракции была приблизительно сравнима с каталитической активностью 5 мкг/мл активазы.
Кровяные сгустки, которые были использованы, были получены из образцов нормальной крови, взятых за 24 ч, и в каждом случае формировались из 2 мл крови, которая была перенесена в полипропиленовые пробирки и коагулировала в естественных условиях. Лизис проводился в РВ8.
Содержавшая йитО8РА фракция В6 (связанная 8РХЬ-сефарозой) была прежде всего лиофилизирована. Остаток был растворен в 15 мл РВ8 и центрифугирован при 4000 д в течение 15 мин. Образец этого раствора был взят для определения активности с 8-2288 до того, как был добавлен сгусток. Каталитическая активность этого образца в большой степени соответствовала каталитической активности 5 мкг/мл активазы.
Фиг. 17а и 176 показывают результаты хронологического хода лизиса сгустка в 0, 3, 4 и 24 ч после добавления 1штЭ8РА. Слева в каждом случае показан контрольный эксперимент. Эксперимент с РВ8, содержавшим 1штЭ8РА в указанном выше количестве, представлен справа.
Клетки крови медленно оседают из распадающегося сгустка. Сеть, которую можно различить уже через 4 ч, сохраняется до 24 ч. В исследовании отделившиеся клетки крови удалялись через 4 ч при помощи шприца для того, чтобы оценить структуру оставшегося сгустка.
Следует уделить внимание тому факту, что фибринолиз замедляется, когда сгусток больше не подвешен в своем собственном лизате. По этой причине любой сгусток все еще сохраняется через 24 ч.
Количественно оценить эту реакцию невозможно. Однако 1штЭ8РА проявляет явное повышение активности в сравнении с нативным И8РА, так, что по крайней мере в 4 раза большее количество И8РА должно быть использовано для того, чтобы растворить сгусток такого же размера.
Claims (6)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Активатор плазминогена, характеризующийся идентичностью по крайней мере на 70% с последовательностями, приведенными на одной из фиг. 3, 11 и 13.
- 2. Активатор плазминогена по п.1, отличающийся тем, что в области перехода между кринглдоменом и цистеиновым мостиком активатор плазминогена имеет сегмент аминокислотной последовательности, содержащий 8КАТ.
- 3. Активатор плазминогена по п.1 или 2, отличающийся тем, что сайт активации активатора плазминогена имеет последовательность ЬН8Т.
- 4. Активатор плазминогена по любому из пп.1-3, отличающийся замещением Ό236Ν или аминокислот, которые гомологичны ему.
- 5. Применение активатора плазминогена по любому из пп.1-4 для лечения тромботических заболеваний, в частности инсульта.
- 6. Активатор плазминогена по любому из пп.1-5, характеризующийся тромболитической активностью, которая является повышенной в сравнении с активностью нативного 1-РА.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10342518A DE10342518A1 (de) | 2003-09-12 | 2003-09-12 | Plasminogen-Aktivatoren mit verringerter Lysin-Bindungskapazität |
PCT/EP2004/010220 WO2005026341A2 (de) | 2003-09-12 | 2004-09-13 | Plasminogen-aktivatoren mit verringerter lysin-bindungskapazität |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200600573A1 EA200600573A1 (ru) | 2006-08-25 |
EA011156B1 true EA011156B1 (ru) | 2009-02-27 |
Family
ID=34305758
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200801861A EA200801861A1 (ru) | 2003-09-12 | 2004-09-13 | Активаторы плазминогена, имеющие сниженную способность связывать лизин |
EA200600573A EA011156B1 (ru) | 2003-09-12 | 2004-09-13 | Активаторы плазминогена, имеющие сниженную способность связывать лизин |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200801861A EA200801861A1 (ru) | 2003-09-12 | 2004-09-13 | Активаторы плазминогена, имеющие сниженную способность связывать лизин |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1664293A2 (ru) |
JP (1) | JP2007505079A (ru) |
CN (1) | CN1849394A (ru) |
AU (1) | AU2004272731A1 (ru) |
BR (1) | BRPI0413718A (ru) |
CA (1) | CA2537696A1 (ru) |
DE (1) | DE10342518A1 (ru) |
EA (2) | EA200801861A1 (ru) |
IL (1) | IL173953A0 (ru) |
MX (1) | MXPA06002756A (ru) |
NO (1) | NO20061646L (ru) |
NZ (1) | NZ545825A (ru) |
WO (1) | WO2005026341A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200602716B (ru) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7946917B2 (en) | 2001-08-10 | 2011-05-24 | Igt | Flexible loyalty points programs |
US8430749B2 (en) | 2001-08-10 | 2013-04-30 | Igt | Dynamic casino tracking and optimization |
DE10153601A1 (de) | 2001-11-02 | 2003-05-22 | Paion Gmbh | DSPA zur Behandlung von Schlaganfall |
DE10342518A1 (de) | 2003-09-12 | 2005-05-12 | Paion Gmbh | Plasminogen-Aktivatoren mit verringerter Lysin-Bindungskapazität |
IL190184A0 (en) * | 2008-03-16 | 2009-02-11 | Hadasit Med Res Service | tPA MUTANT IN THE TREATMENT OF ACUTE BRAIN INJURY AND NEURODEGENERATIVE DISORDERS |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0352710A2 (de) * | 1988-07-25 | 1990-01-31 | Roche Diagnostics GmbH | t-PA-Derivat und seine Herstellung |
WO1996001312A1 (de) * | 1994-07-05 | 1996-01-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nicht-glykosylierte plasminogenaktivator-derivate und ihre verwendung bei erhöhtem blutungsrisiko |
US5714145A (en) * | 1988-09-02 | 1998-02-03 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
WO2003037363A2 (de) * | 2001-11-02 | 2003-05-08 | Paion Gmbh | Nicht-neurotoxische plasminogen aktivierende faktoren zur behandlung von schlaganfall |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4766075A (en) | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
US5094953A (en) * | 1988-03-21 | 1992-03-10 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator variants |
IE69054B1 (en) * | 1988-07-20 | 1996-08-07 | Schering Ag | Vampire bat salivary plasminogen activators |
ES2085326T3 (es) | 1989-02-13 | 1996-06-01 | Schering Ag | Activador de plasminogeno salivar del murcielago vampiro vpa-alfa1. |
US6008019A (en) | 1989-02-13 | 1999-12-28 | Schering Aktiengesellschaft | Plasminogen activator from saliva of the vampire bat |
WO1993012238A1 (en) * | 1991-12-16 | 1993-06-24 | Genentech, Inc. | t-PA SUBSTITUTION VARIANTS WITH IMPROVED FIBRIN-SPECIFICITY |
PL1622639T3 (pl) * | 2003-05-02 | 2013-06-28 | Lundbeck H As | Dożylne wstrzyknięcie nieneurotoksycznych aktywatorów plazminogenu do leczenia udaru mózgu |
DE10342518A1 (de) | 2003-09-12 | 2005-05-12 | Paion Gmbh | Plasminogen-Aktivatoren mit verringerter Lysin-Bindungskapazität |
-
2003
- 2003-09-12 DE DE10342518A patent/DE10342518A1/de not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-09-13 AU AU2004272731A patent/AU2004272731A1/en not_active Abandoned
- 2004-09-13 EA EA200801861A patent/EA200801861A1/ru unknown
- 2004-09-13 EA EA200600573A patent/EA011156B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-09-13 CN CNA2004800260817A patent/CN1849394A/zh active Pending
- 2004-09-13 BR BRPI0413718-3A patent/BRPI0413718A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-09-13 EP EP04765139A patent/EP1664293A2/de not_active Withdrawn
- 2004-09-13 NZ NZ545825A patent/NZ545825A/en unknown
- 2004-09-13 WO PCT/EP2004/010220 patent/WO2005026341A2/de active Application Filing
- 2004-09-13 MX MXPA06002756A patent/MXPA06002756A/es unknown
- 2004-09-13 ZA ZA200602716A patent/ZA200602716B/en unknown
- 2004-09-13 EP EP10011604A patent/EP2368984A1/de not_active Withdrawn
- 2004-09-13 CA CA002537696A patent/CA2537696A1/en not_active Abandoned
- 2004-09-13 JP JP2006525786A patent/JP2007505079A/ja active Pending
-
2006
- 2006-02-27 IL IL173953A patent/IL173953A0/en unknown
- 2006-04-11 NO NO20061646A patent/NO20061646L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0352710A2 (de) * | 1988-07-25 | 1990-01-31 | Roche Diagnostics GmbH | t-PA-Derivat und seine Herstellung |
US5714145A (en) * | 1988-09-02 | 1998-02-03 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
WO1996001312A1 (de) * | 1994-07-05 | 1996-01-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nicht-glykosylierte plasminogenaktivator-derivate und ihre verwendung bei erhöhtem blutungsrisiko |
WO2003037363A2 (de) * | 2001-11-02 | 2003-05-08 | Paion Gmbh | Nicht-neurotoxische plasminogen aktivierende faktoren zur behandlung von schlaganfall |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
BAKKER ARJEN H. F. ET AL.: "The role of the lysyl binding site of tissue-type plasminogen activator in the interaction with a forming fibrin clot", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 21, 1995, pages 12355-12360, XP002319385, ISSN: 0021-9258, the whole document * |
HORREVOETS A. J. G. ET AL.: "The Specific Roles of Finger and Kringle 2 Domains of Tissue-type Plasminogen activator during in Vitro Fibrinolysis", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, vol. 269, no. 17, 29 April 1994 (1994-04-29), pages 12639-12644, XP002235245, ISSN: 0021-9258, the whole document * |
SCHLEUNING W.-D.: "VAMPIRE BAT PLASMINOGEN ACTIVATOR DSPA-ALPHA-1 (DESMOTEPLASE): A THROMBOLYTIC DRUG OPTIMIZED BY NATURAL SELECTION", HAEMOSTASIS, BASEL, CH, vol. 31, no. 3-6, 2001, pages 118-122, XP008012096 * |
STRANDBERG L. ET AL.: "Variants of tissue-type plasminogen activator with substantially enhanced response and selectivity toward fibrin co-factors", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, vol. 270, no. 40, 6 October 1995 (1995-10-06), pages 23444-23449, XP002232776, ISSN: 0021-9258 * |
WEENING-VERHOEFF E. J. D. ET AL.: "INVOLVEMENT OF ASPARTIC AND GLUTAMIC RESIDUES IN KRINGLE-2 OF TISSUE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR IN LYSINE BINDING FIBRIN BINDING AND STIMULATION OF ACTIVITY AS REVEALED BY CHEMICAL MODIFICATION AND OLIGONUCLEOTIDE-DIRECTED MUTAGENESIS", PROTEIN ENGINEERING, vol. 4, no. 2, 1990, pages 191-198, XP009042068, ISSN: 0269-2139, the whole document * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20061646L (no) | 2006-04-11 |
ZA200602716B (en) | 2007-07-25 |
WO2005026341A2 (de) | 2005-03-24 |
MXPA06002756A (es) | 2007-08-24 |
IL173953A0 (en) | 2006-07-05 |
CA2537696A1 (en) | 2005-03-24 |
CN1849394A (zh) | 2006-10-18 |
NZ545825A (en) | 2009-08-28 |
JP2007505079A (ja) | 2007-03-08 |
AU2004272731A1 (en) | 2005-03-24 |
EP1664293A2 (de) | 2006-06-07 |
EA200801861A1 (ru) | 2010-06-30 |
EA200600573A1 (ru) | 2006-08-25 |
WO2005026341A3 (de) | 2005-09-01 |
DE10342518A1 (de) | 2005-05-12 |
BRPI0413718A (pt) | 2006-10-17 |
EP2368984A1 (de) | 2011-09-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6571735B2 (ja) | 止血を調節する組成物および方法 | |
RU2122004C1 (ru) | Производное белка с человека и фармацевтическая композиция, обладающая антитромбическим действием | |
US5504067A (en) | Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with FVII | |
JP4451514B2 (ja) | 血液凝固第vii因子改変体 | |
WO2002038162A1 (en) | MODIFIED FACTOR VIIa | |
Hovinga et al. | Coagulation factor XII Locarno: the functional defect is caused by the amino acid substitution Arg 353--> Pro leading to loss of a kallikrein cleavage site | |
JP2015501137A (ja) | 止血を調節するための組成物および方法 | |
EA011156B1 (ru) | Активаторы плазминогена, имеющие сниженную способность связывать лизин | |
AU2008265770A1 (en) | Protein C for use in maintaining hemostasis | |
Cheung et al. | The role of the epidermal growth factor-1 and hydrophobic stack domains of human factor IX in binding to endothelial cells | |
US6624289B1 (en) | Region of factor IXa protease domain that interacts with factor VIIIa and methods therefor | |
EP0253582A1 (en) | Modified tissue plasminogenen activator | |
US7109170B2 (en) | Region of factor IXa protease domain that interacts with factor VIIIa and methods therefor | |
US20140256640A1 (en) | Treatment of coagulopathy with hyperfibrinolysis | |
AU2003213856B2 (en) | Peptides for regulation of urokinase (uPA) and tissue type (tPA) plasminogen activator and method of optimizing therapeutic efficacy | |
JP2023505208A (ja) | 第viii因子の機能を調節するための組成物および方法 | |
US8329168B2 (en) | Compositions and methods for modulating hemostasis | |
KR20070021985A (ko) | 라이신 결합 능력이 감소된 플라스미노겐 활성화인자 | |
WO2012031240A2 (en) | Therapeutics for trauma induced factor v consumptive coagulopathy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |