EP1592783A2 - Verfahren zur herstellung von carotinoiden oder deren vorstufen mittels gentechnisch veränderter organismen der gattung blakeslea, mit dem verfahren hergestellte carotinoide oder deren vorstufen und deren verwendung - Google Patents

Verfahren zur herstellung von carotinoiden oder deren vorstufen mittels gentechnisch veränderter organismen der gattung blakeslea, mit dem verfahren hergestellte carotinoide oder deren vorstufen und deren verwendung

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EP1592783A2
EP1592783A2 EP04700978A EP04700978A EP1592783A2 EP 1592783 A2 EP1592783 A2 EP 1592783A2 EP 04700978 A EP04700978 A EP 04700978A EP 04700978 A EP04700978 A EP 04700978A EP 1592783 A2 EP1592783 A2 EP 1592783A2
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EP
European Patent Office
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carotenoids
biomass
carotenoid
seq
cells
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EP04700978A
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Markus Matuschek
Daniela Klein
Thorsten Heinekamp
Andre Schmidt
Axel Brakhage
Brigitte Achatz
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BASF SE
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of carotenoids or their precursors by means of genetically modified organisms of the genus Blakeslea, carotenoids produced by the process or their precursors and their use and preparation, in particular as high-purity carotenoids, as foods containing carotenoid-producing organisms and at least one carotenoid, in particular animal feed, animal feed supplements and food supplements, and the distortion of the carotenoids obtainable from the process for the production of cosmetic, pharmaceutical, dermatological preparations, foods or nutritional supplements.
  • Blakeslea trispora is known as a production organism for ⁇ -carotene (Ciegler, 1965, Adv Appl Microbiol. 7: 1) and lycopene (EP 1201762, EP 1184464, WO 03/038064).
  • this organism is suitable for the fermentative production of carotenoids.
  • Carotenoids are added to animal feed, foodstuffs, food supplements, cosmetics and pharmaceuticals.
  • the carotenoids mainly serve as pigments for coloring.
  • the antioxidative effects of carotenoids and other properties of these substances are used.
  • the carotenoids are divided into the pure hydrocarbons, the carotenes and the oxygenated hydrocarbons, the xanthophylls.
  • Xanthophylls such as canthaxanthin and astaxanthin are used, for example, to pigment chicken eggs and fish (Britton et al. 1998, Carotenoids, Vol 3, Biosynthesis and Metabolism).
  • the carotenes ß-carotene and lycopene are mainly used in human nutrition.
  • ⁇ -carotene is used, for example, as a beverage dye.
  • Lycopene has a disease preventive effect (Argwal and Rao, 2000, CMAJ 163: 739-744; Rao and Argwal 1999, Nutrition Research 19: 305-323).
  • the colorless carotenoid precursor phytoene is particularly suitable for use as an antioxidant in cosmetic, pharmaceutical or dermatological preparations.
  • mutants can be generated in which phytoene cannot be converted to lycopene and therefore not further to ß-carotene (Mehta and Cerdä-Olmedo, 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 836-838).
  • phytoendesaturase such as e.g. Diphenylamine and cinnamon alcohol can block the further conversion of phytoene so that it accumulates (Cerdä-Olmedo, 1989, In: E. Vandamme, ed.Biotechnoiogy of vitamin, growth factorand pigment production.London: Eisevier Applied Science, p. 27 -42).
  • the random mutagenesis usually affects not only the genes of carotenoid biosynthesis for the further implementation of phytoene, but also other important genes. Therefore, the growth and synthesis performance of the mutants are often impaired.
  • the generation z. B. from Phytoenüberpro- ducents by random mutagenesis of lycopene overproducers or ß-carotene overproducers can therefore either not be achieved or can only be achieved with great experimental effort.
  • the addition of inhibitors causes an increase in production costs and possibly contamination of the product.
  • the cell growth can be impaired by the inhibitor, so that the production of carotenoids or their precursors, in particular phytoene, is restricted.
  • a genetic modification could avoid the above-mentioned disadvantages of random mutagenesis and the addition of inhibitors.
  • the Agrobacterium-mediated transformation was successfully used as a method for producing genetically modified fungi.
  • So z. B. the following organisms have been transformed by agrobacteria: Saccharomyces cerevisiae (Bundock et al., 1995, EMBO Journal, 14: 3206-3214), Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani pisi, Neurosporoder crassa, Neurospora crassa, Re , Pleurotus ostreatus, Fusarium graminearum (van der Toorren et al., 1997, EP 870835), Agraricus bisporus, Fusarium venenatum (de Groot et al., 1998, Nature Biotechnol.
  • homologous recombination in which as many sequence homologies as possible exist between the DNA to be introduced and the cell DNA, so that a site-specific introduction or deactivation of genetic information in the genome of the recipient organism is possible. Otherwise, the donor DNA is integrated into the genome of the recipient organism by illegitimate or non-homologous recombination, which is not site-specific.
  • a transformation mediated by Agrobacterium and subsequent homologous recombination of the transferred DNA has so far been detected in the following organisms: Aspergillus awamori (Gouka et al. 1999, Nature Biotech 17: 598-601), Glarea lozoyensis (Zhang et al., 2003, Mol. Gen Genomics 268: 645-655), Mycosphaerella graminicola ((Zwiers et al. 2001, Curr. Genet. 39: 388-393).
  • Electroporation is known as another method for transforming fungi.
  • the integrative transformation of yeast by electroporation was developed by Hill, Nucl. Acids. Res. 17: 8011.
  • the transformation by Chakaborty and Kapoor was described (1990, Nucl. Acids. Res. 18: 6737).
  • a “biolistic” method ie the transfer of DNA by bombarding lines with DNA-loaded particles, has been described, for example, for Trichoderma harzianum and Gliocladium virens (Lorito et al. 1993, Curr. Genet. 24: 349-356). So far, however, these methods have not been successful in the targeted genetic modification of Blakeslea and in particular Blakeslea trispora. be used.
  • a particular difficulty in the production of genetically modified Blakeslea and Blakeslea trispora is the fact that their cells are multinucleated at all stages of the sexual and vegetative cell cycle.
  • spores of Blakeslea trispora strain NRRL2456 and NRRL2457 z For example, an average of 4.5 nuclei per spore was detected (Metha and Cerda-Olmedo, 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 836-838).
  • the consequence of this is that the genetic modification is usually only present in one or a few nuclei, which means that the cells are heterokaryotic.
  • the genetically modified Blakeslea in particular Blakeslea trispora
  • the strains must therefore be homokaryotic with regard to the genetic modification.
  • a recessive selection marker for Phycomyces blakes- leanus is e.g. Dar + strains take up the toxic riboflavin analogue 5-carbon-5-deazariboflavin; dar " strains, on the other hand, are not (Delbrück et al. 1979, Genetics 92:27). Recessive mutants are selected by adding 5-carbon-5-deazaribof lavin (DARF).
  • DARF 5-carbon-5-deazaribof lavin
  • Isolation from natural sources is also carried out.
  • phytoene it is known to extract a mixture of carotenoids, vitamin E and other components, which also contains phytoene, from tomatoes, carrots or palm oil, etc.
  • the separation of the individual carotenoids from one another is problematic here.
  • the phytoene cannot be obtained in pure form by this process.
  • the naturally occurring amount of carotenoids in the plants is small.
  • fermentative processes are technically relatively simple and are based on inexpensive starting materials. Fermentative processes for the production of carotenoids can be economically attractive and competitive for chemical synthesis if the productivity of the previous fermentative processes would be increased or new carotenoids could be produced on the basis of the known production organisms.
  • the processing methods which only provide small amounts of high-purity carotenoids are problematic in the fermentative production of carotenoids.
  • complex multi-step processes are usually required, possibly using large amounts of solvent. So there is a large amount of waste or it A high effort for re-evaluation (recycling) must be carried out.
  • Blakeslea trispora as a production organism for ⁇ -carotene is also from WO 98/03480 A1. known.
  • ⁇ -carotene crystals from biomass from Blakeslea trispora are obtained by extraction.
  • large amounts of different solvents have to be used in the process described in order to obtain crystals with high purity through several extraction and washing steps.
  • the amounts of ⁇ -carotene obtained are also small, based on the amount of biomass used.
  • carotenoid crystals from biomass from microorganisms is also known from WO 98/50574, whereby in contrast to WO 01/83437 A1 methanol, ethanol, acetone can only be used for removing lipids from the biomass, ie for washing. Accordingly, ethyl acetate, hexane or an oil is used as the solvent for the extraction of carotenoids. Subsequently, several cleaning and washing steps with large amounts of ethanol and water are necessary, whereby only a purity of 93.3% is achieved with a yield of 35%.
  • WO 03/038064 A2 describes the fermentative production of lycopene by co-cultivating mutated ones. Blakeslea trispora mating type (-) and Blakeslea trispora mating type (+), which produce lycopene without the addition of inhibitors of carotenoid biosynthesis.
  • the mutant used for fermentation is generated by unselective chemical mutation and subsequent screening.
  • the culture broth is worked up by cell disruption and subsequent cleaning with different aqueous media with different salinity and pH and with water-immiscible organic solvents such as ethyl acetate, hexane and 1-butanol to remove lipids. Alternatively, extraction using large amounts of ethyl acetate is described. Purity information is missing. Since ethyl acetate and hexane are solvents for lycopene, it can be assumed that some of the lycopene will be washed out, thus reducing the theoretical possible yield.
  • WO 01/55100 A1 also describes the isolation of carotenoids in general or ⁇ -carotene in particular from the biomass by using several washing and cleaning steps on the digested biomass without solvent extraction. This will digested biomass from Blakeslea trispora washed with water, lye, acid, butanol and ethanol, so that a large number of different solvents and aqueous media must be used. The purity of the ⁇ -carotene obtained is 96-98%. However, information on the yield is missing.
  • WO 97/36996 A2 generally describes a method for isolating substances (including carotenoids) from microorganisms, the substances being isolated from the biomass by means of solid / liquid extraction. Cell disruption should not be necessary, but the biomass must first be extruded into a granular, porous shape. How only carotenoids can be isolated and their purity or yield is not specified. The residue from the extrusion can then be used as a feed additive.
  • substances including carotenoids
  • the nutritious culture broth and the biomass contained therein are treated as waste after extraction or isolation of the carotenoids.
  • the above-mentioned methods have a decisive further disadvantage. It is then necessary to add the carotenoids to the food afterwards, ie they are not part of the food itself or not in sufficient quantities. It would therefore be of great advantage if the carotenoid content in the food was already covered by the actual food itself. It is also necessary to further increase the productivity of the previously naturally produced carotenes and their precursors and the production of other carotenoids, such as.
  • B. xanthophylls particularly preferred to enable astaxanthin or zeaxanthin and phytoene or bixin, which have so far not been able to be formed or isolated to a very small extent by the wild types of microorganisms.
  • the object of the invention is to provide genetically modified cells from Blakeslea strains, in particular Blakeslea trispora, which produce carotenoids or their precursors, in particular xanthophylls, particularly preferably astaxanthin or zeaxanthin and phytoene or bixin.
  • the method is intended to increase the carotenoid productivity of the modified cells compared to the corresponding wild types.
  • the method should allow the production of new cells or mycelium consisting of them, which are suitable for use in the production of carotenoids or their precursors which have not previously been obtainable in economically interesting amounts from the naturally occurring fungi, in particular xanthophylls, particularly preferably Asta - xanthine or zeaxanthine and phytoene or bixin.
  • the method is intended to make possible a genetic modification of Blakeslea strains, in particular Blakeslea trispora, and to allow the production of homokaryotic genetically modified production strains.
  • the process is also intended to produce further carotenoids, such as, for. B. xanthophylls, in particular astaxanthin or zeaxanthin and phytoene or bixin, which have so far not been able to be formed or isolated to a very small extent by the wild types of microorganisms. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a process for the production of carotenoids from genetically modified cells of Blakeslea strains, in particular Blakeslea trispora, which allows the use of smaller amounts of solvent and essentially does without waste and also does one high purity and higher yields allowed.
  • the greatest possible proportion of the nutrients present in the fermenter, both carotenoids and other nutrients in the microorganisms, should be used. It is therefore also an object of the present invention to provide a method for producing a carotenoid-containing food, the food itself covering the need for carotenoids without additives.
  • the nutrient content of the foods obtainable by the process should be at least equivalent to those previously available.
  • the process is also intended to enable the carotenoids produced to be used efficiently.
  • This object is achieved comprehensively by a process for the production of carotenoids or their precursors by means of genetically modified organisms of the Blakeslea genus
  • the method according to the invention it is possible to specifically and stably modify Blakeslea genetically in order to obtain mycelium from cells with uniform nuclei, which produces carotenoids or their precursors, especially xanthophylls, particularly preferably astaxanthin or zeaxanthin and phytoene or bixin. These are preferably cells from Blakeslea trispora fungi.
  • the carotenoids produced or their precursors can be obtained essentially free of impurities and high concentrations of the carotenoids or their precursors can be achieved in the culture medium.
  • Transformation is understood to mean the transmission of genetic information into the organism, in particular fungus. This should include all possibilities known to the person skilled in the art for introducing the information, in particular DNA, e.g. B. Bombardment with DNA-loaded particles, transformation by means of protoplasts, microinjection of DNA, electroporation, conjugation or transformation of competent cells, chemicals or agrobacteria mediated transformation.
  • Genetic information means a gene segment, a gene or several genes.
  • the genetic information can e.g. B. with the help of a vector or as free nucleic acid (z. B. DNA, RNA) and otherwise introduced into the cells and either incorporated into the host genome by recombination or present in the cell in free form. Homologous recombination is particularly preferred.
  • the preferred transformation method is the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.
  • Donor DNA inserted into a vector which (i) flanking the T-DNA ends flanking the DNA to be transferred, which (ii) contains a selection marker and (iii) optionally promoters and terminators for the gene expression of the donor DNA having.
  • This vector is transferred into an Agrobacterium tumefaciens strain which contains a Ti plasmid with the vir genes. vir genes are responsible for DNA transfer in Blakeslea. This two-vector system is used to transfer Agrobacterium's DNA into Blakeslea.
  • the agrobacteria are first incubated in the presence of acetosyringones. Acetosyringone induces the vir genes. Then Blakeslea trispora spores are incubated together with the induced cells from Agrobacterium tumefaciens on medium containing acetosyringone and then transferred to medium which enables a selection of the transformants, ie the genetically modified strains of Blakeslea.
  • vector is used in the present application as a name for a DNA molecule which is used for introducing and possibly for multiplying foreign DNA into a cell (see also "Vector” in Römpp Lexikon Chemie - CDROM Version 2.0, Stuttgart / New York: Georg Thieme Verlag 1999).
  • vector should also be understood to mean plasmids, cosmids, etc., which serve the same purpose.
  • expression is understood to mean the transfer of genetic information starting from DNA or RNA into a gene product (here preferably enzymes for the production of carotenoids and especially xanthophylls, particularly preferably astaxanthin or zeaxanthin and phytoene or bixin) and is also intended to mean the term of overexpression, which means increased expression, so that a cell already produced in the untransformed cell (wild type) gene product is increasingly produced or makes up a large part of the total cell content.
  • a gene product here preferably enzymes for the production of carotenoids and especially xanthophylls, particularly preferably astaxanthin or zeaxanthin and phytoene or bixin
  • Genetic modification is understood to mean the introduction of genetic information into a recipient organism so that it is stably expressed and passed on during cell division.
  • homokaryotization the production of cells that contain only uniform nuclei, i. H. Cores with the same genetic information content.
  • a selection of the mononuclear spores is preferably carried out for homokaryotization.
  • a small proportion of Blakeslea trispora spores are mononuclear, so that these may be identified by specific labeling, e.g. B.
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • a core reduction can first be carried out for homokaryotization.
  • a mutagenic agent can be used for this purpose, in particular N-methyl-N'-nitro-nitrosoguanidine (MNNG).
  • MNNG N-methyl-N'-nitro-nitrosoguanidine
  • high-energy rays such as UV or X-rays
  • the FACS procedure or recessive selection markers can then be used for selection. Selection is understood to mean the selection of cells whose nuclei contain the same genetic information, ie cells that have the same properties as resistance or the manufacture or increased manufacture of a product.
  • 5-carbon-5-deazariboflavin (DARF) and hygromycin (hyg) or 5'-fluororotate (FOA) and uracil are preferably used in the selection.
  • the vector used in transformation (i) can be designed such that the genetic information contained in the vector is integrated into the genome of at least one cell. Genetic information in the cell can be switched off. This can be done directly. H. by a deletion. However, it is also possible for the vector used in the transformation (i) to be designed in such a way that the genetic information contained in the vector is expressed in the cell, i. H. genetic information is inserted which is not present in the corresponding wild type or which is amplified or overexpressed by the transformation and whose product switches off the gene. The introduced genetic information can also indirectly switch off genetic information in the cell, e.g. B. by production of an inhibitor.
  • the vector used contains genetic information or parts of the genetic information for the production of carotenoids or their precursors, in particular carotenes or xanthophylls or their precursors.
  • the vector used preferably contains genetic information for the production of astaxanthin, zeaxanthin, echinenone, ⁇ -cryptoxanthin, ⁇ -carotene, andonixanthin, adonirubin, canthaxanthin, 3-hydroxyechinenone, 3-hydroxyechinenone, lycopene, lutein, bixin or phytoen.
  • the vector very particularly preferably contains information on the production of bixin, phytoene, canthaxanthin, astaxanthin or zeaxanthin.
  • the vector can contain any genetic information on the genetic changes of organisms of the genus Blakeslea.
  • Genetic information is preferably understood to mean nucleic acids whose introduction into the organism of the Blakeslea genus leads to a genetic change in organisms of the Blakeslea genus, that is to say, for example, to cause, increase or reduce enzyme activities in comparison to the starting organism.
  • the vector can contain, for example, genetic information for the production of lipophilic substances, e.g. Carotenoids and their precursors, phospholipids, triacylglycerides, steroids, waxes, fat-soluble vitamins, provitamins and cofactors or genetic information for the production of hydrophilic substances such as e.g. Proteins, amino acids, nucleotides and water-soluble vitamins, provitamins and cofactors.
  • lipophilic substances e.g. Carotenoids and their precursors, phospholipids, triacylglycerides, steroids, waxes, fat-soluble vitamins, provitamins and cofactors
  • hydrophilic substances such as e.g. Proteins, amino acids, nucleotides and water-soluble vitamins, provitamins and cofactors.
  • the vector used preferably contains genetic information for the production of carotenoids or xanthophylls or their precursors.
  • the vector preferably contains genetic information which causes the carotenoid biosynthesis enzymes to be localized in the cell compartment in which the carotenoid biosynthesis takes place.
  • Genetic information for the production of astaxanthin, zeaxanthin, echinenone, ⁇ -cryptoxanthin, andonixanthin, adonirubin, canthaxanthin, 3- and 3'-hydroxyechinenone, lycopene, lutein, ⁇ -carotene, phytoene and / or phytofluene is particularly preferred.
  • Genetic information for the production of phytoene, bixin, lycopene, zeaxanthin, canthaxanthin and / or astaxanthin is very particularly preferred.
  • organisms are produced and cultivated which have an increased synthesis rate for intermediates in carotenoid biosynthesis and consequently have an increased productivity for end products in carotenoid biosynthesis.
  • HMG-CoA- 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase
  • organisms are produced and cultivated which have an increased HMG-CoA reductase activity compared to the wild type.
  • HMG-CoA reductase activity means the enzyme activity of an HMG-CoA reductase (3-hydroxy-3 ⁇ methyl-glutaryl-coenzyme A reductase).
  • HMG-CoA reductase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme-A into mevalonate.
  • HMG-CoA reductase activity is understood to mean the amount of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A converted or amount of mevalonate formed in a certain time by the protein HMG-CoA reductase.
  • HMG-CoA reductase activity is increased compared to the wild type, the amount of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme-A or the formed amount of mevalonate increased.
  • This increase in HMG-CoA reductase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, particularly preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% the wild-type HMG-CoA reductase activity.
  • the HMG-CoA reductase activity is increased compared to the wild type by increasing the gene expression of a nucleic acid encoding an HMG-CoA reductase.
  • the gene expression of a nucleic acid encoding an HMG-CoA reductase is increased by introducing into the organism a nucleic acid construct containing a nucleic acid encoding an HMG-CoA reductase, the expression of which in the organism compared to the wild type, is subject to reduced regulation.
  • a reduced regulation compared to the wild type means a regulation which is reduced compared to the wild type defined above, preferably no regulation at the expression or protein level.
  • the reduced regulation can preferably be achieved by a promoter which is functionally linked in the nucleic acid construct to the coding sequence and which is subject to a reduced regulation in the organism compared to the wild-type promoter.
  • promoters ptefl from Blakeslea trispora and pgpdA from Aspergillus nidulans are subject to only a reduced regulation and are therefore particularly preferred as promoters. These promoters show an almost constitutive expression in Blakeslea trispora, so that the transcriptional regulation no longer takes place via the intermediates of carotenoid biosynthesis.
  • the reduced regulation can be achieved by using an HMG-CoA reductase encoding a nucleic acid as the nucleic acid, the expression of which in the organism is subject to a reduced regulation in comparison with the organism's own orthological nucleic acid.
  • nucleic acid which encodes only the catalytic region of the HMG-CoA reductase (truncated (t-) HMG-CoA reductase) is particularly preferred.
  • the membrane domain responsible for regulation is missing.
  • the nucleic acid used is therefore subject to reduced regulation and leads to an increase in the gene expression of the HMG-CoA reductase.
  • nucleic acids are introduced into Blakeslea trispora which have the sequence SEQ ID. NO. Contain 75.
  • HMG-CoA reductases and thus also for the t-HMG-CoA reductases reduced to the catalytic range or the coding genes can be determined, for example, from different organisms whose genomic sequence is known by comparing the sequences with homology Databases with the SEQ ID. NO. 75 easy to find.
  • HMG-CoA reductases and thus also for the t-HMG-CoA reductases reduced to the catalytic range or the coding genes can also be obtained, for example, from the sequence SEQ ID. NO. 75 from various organisms whose genomic sequence is not known, can be easily found in a manner known per se by hybridization and PCR techniques.
  • the reduced regulation is achieved by using an HMG-CoA reductase encoding a nucleic acid as a nucleic acid, the expression of which in the organism is subject to reduced regulation compared to the orthologic nucleic acid proper to the organism and a promoter is used which is subject to reduced regulation in the organism compared to the wild-type promoter.
  • the gene expression of the phytoendesaturase is switched off by the transformation, so that the phytoene produced by the organisms can be obtained.
  • the vector used in transformation (i) therefore preferably comprises a sequence coding for a fragment of the phytoendesaturase gene, in particular carB from Blakeslea trispora with SEQ ID NO: 69.
  • the gene expression of the lycopene cyclase is switched off by transformation, so that the lycopene produced by the organisms can be obtained.
  • the vector used in the transformation therefore preferably comprises a sequence coding for a fragment of the gene of the lycopene cyclase, in particular carR from Blakeslea trispora.
  • the organisms of the genus Blakeslea are enabled, for example, by xanthophylls, such as producing canthaxanthin, zeaxanthin or astaxanthin, bixin or phytoene by causing a hydroxylase activity and / or ketolase activity in the genetically modified organisms of the genus Blakeslea compared to the wild type.
  • xanthophylls such as producing canthaxanthin, zeaxanthin or astaxanthin, bixin or phytoene by causing a hydroxylase activity and / or ketolase activity in the genetically modified organisms of the genus Blakeslea compared to the wild type.
  • the vector used in transformation (i) thus contains genetic information which, after expression, exhibits ketolase and / or hydroxylase activity, so that the organisms produce zeaxanthin or astaxanthin.
  • Ketolase activity means the enzyme activity of a ketolase.
  • a ketolase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity of introducing a keto group on the optionally substituted ⁇ -ionone ring of carotenoids.
  • a ketolase is understood to be a protein which has the enzymatic activity to convert ⁇ -carotene into canthaxanthin.
  • ketolase activity is understood to mean the amount of ⁇ -carotene or amount of canthaxanthin formed by the protein ketolase in a certain time.
  • wild type is understood to mean the corresponding non-genetically modified starting organism of the Blakesleaa genus.
  • organism can be the starting organism (wild type) of the genus Blakesleaa or an inventive appropriate, genetically modified organism of the genus Blakesleaa or both.
  • Wild type is preferably understood to refer to a reference organism in each case for causing the ketolase activity and for causing the hydroxylase activity.
  • This reference organism of the Blakeslea genus is Blakeslea trispora ATCC 14271 or ATCC 14272, which differ only in the mating type.
  • ketolase activity in genetically modified organisms of the genus Blakesleaa according to the invention and in wild-type or reference organisms is preferably determined under the following conditions:
  • the determination of the ketolase activity in organisms of the genus Blakeslea is based on the method of Frazer et al., (J. Biol. Chem. 272 (10): 6128-6135, 1997).
  • the ketolase activity in extracts is determined with the substrates beta-carotene and canthaxanthin in the presence of lipid (soy lecithin) and detergent (sodium cholate).
  • Substrate / product ratios from the ketolase assays are determined by means of HPLC.
  • the genetically modified organism of the genus Blakesleaa according to the invention has ketolase activity in comparison to the genetically unmodified wild type and is therefore preferably able to transgenically express a ketolase.
  • the ketolase activity is caused in the organisms of the Blakesleaa genus by causing the gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase.
  • the gene expression of a nucleic acid encoding a ketolase is preferably caused by introducing nucleic acids which encode ketolases into the starting organism of the Blakesleaa genus.
  • any ketolase gene that is to say any nucleic acids encoding a ketolase, can be used for this purpose.
  • nucleic acids mentioned in the description can be, for example, an RNA, DNA or cDNA sequence.
  • nucleic acid sequences such as that which have already been processed to use corresponding cDNAs.
  • nucleic acids encoding a ketolase and the corresponding ketolases that can be used in the method according to the invention are, for example, sequences from:
  • Haematoccus pluvialis especially from Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Accession NO: X86782; nucleic acid: SEQ ID NO: 11, protein SEQ ID NO: 12),
  • Paracoccus marcusii (Accession NO: Y15112; nucleic acid: SEQ ID NO: 19, protein SEQ ID NO: 20).
  • Synechocystis sp. Strain PC6803 (Accession NO: NP442491; nucleic acid: SEQ ID NO: 21, protein SEQ ID NO: 22).
  • Bradyrhizobium sp. (Accession NO: AF218415; nucleic acid: SEQ ID NO: 23, protein SEQ ID NO: 24).
  • Nostoc punctiforme ATTC 29133 nucleic acid: Acc.-No. NZ_AABC01000195, base pair 55.604 to 55.392 (SEQ ID NO: 27); Protein: Acc.-No. ZP_00111258 (SEQ ID NO: 28) (annotated as putative protein),
  • Nostoc punctiforme ATTC 29133 nucleic acid: Acc.-No. NZ_AABC01000196, base pair 140.571 to 139.810 (SEQ ID NO: 29), protein: (SEQ ID NO: 30) (not annotated),
  • ketolases and ketolase genes that can be used in the method according to the invention can be obtained, for example, from different organisms, the genomic sequence of which is known, by comparing the identity of the amino acid sequences or of easily find corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the sequences described above and in particular with the sequences SEQ ID NO: 12, 26 and / or 33.
  • ketolases and ketolase genes can also be derived from the nucleic acid sequences described above, in particular from the sequences SEQ ID NO: 12, 26 and / or 30 from various organisms, the genomic sequence of which is not known, by hybridization techniques find each other easily.
  • the hybridization can take place under moderate (low stringency) or preferably under stringent (high stringency) conditions.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with 2X SSC at 50_C) and those with high stringency (with 0.2X SSC at 50_C, preferably at 65_C) (20X SSC: 0, 3 M sodium citrate, 3 M sodium chloride, pH 7.0).
  • the temperature during the washing step can be raised from moderate conditions at room temperature, 22 ° C, to stringent conditions at 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can be kept constant and only the other can be varied. Denaturing agents such as formamide or SDS can also be used during hybridization. In the presence of 50% formamide, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • Hybridization conditions with, for example, (i) 4X SSC at 65 ° C, or
  • 6X SSC at 68 ° C, 100 mg / ml denatured fish sperm DNA, or (iv) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 mg / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA at 68 ° C, or
  • nucleic acids are encoded which encode a protein containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 12 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and which have an identity of at least 20%, preferably at least 30%, 40%, 50%, 60%, preferably at least 70%, 80%, particularly preferably at least 90%, in particular 91%, 92%; 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 12 and has the enzymatic property of a ketolase.
  • This can be a natural ketolase sequence which can be found as described above by comparing the identity of the sequences from other organisms or an artificial ketolase sequence which can be started from the sequence SEQ ID NO: 12 by artificial variation, for example by substitution , Insertion or deletion of amino acids has been modified.
  • nucleic acids which encode a protein are introduced, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 26 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 20 %, preferably at least 30%, 40%, 50%, 60%, preferably at least 70%, 80%, particularly preferably at least 90%, in particular 91%, 92%; 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 26 and has the enzymatic property of a ketolase.
  • This can be a natural ketolase sequence which, as described above, can be found by comparing the identity of the sequences from other organisms or an artificial ketolase sequence which can be derived from the sequence SEQ ID NO: 26 by artificial variation , for example by substitution, insertion or deletion of amino acids.
  • nucleic acids which encode a protein are introduced, containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 30 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids and having an identity of at least 20%, preferably at least 30%, 40%, 50%, preferably at least 60%, 70%, of preferred at least 80%, 85% most preferably at least 90%, especially 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ⁇ , 96%, 97%, 98%, 99% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO 30 and the enzymatic property of a ketolase.
  • This can be a natural ketolase sequence which, as described above, can be found by comparing the identity of the sequences from other organisms, or an artificial ketolase sequence which can be derived from the sequence SEQ ID NO: 30 by artificial variation, for example was modified by substitution, insertion or deletion of amino acids.
  • substitution is to be understood as meaning the replacement of one or more amino acids by one or more amino acids. So-called conservative exchanges are preferably carried out, in which the replaced amino acid has a similar property as the original amino acid, for example replacement of Glu by Asp, Gin by Asn, Val by He, Leu by Ile, Ser by Thr.
  • Deletion is the replacement of an amino acid with a direct link.
  • Preferred positions for deletions are the termini of the polypeptide and the links between the individual protein domains.
  • Inserts are insertions of amino acids into the polypeptide chain, with a direct bond being formally replaced by one or more amino acids.
  • Identity between two proteins is understood to mean the identity of the amino acids over the respective total protein length, in particular the identity obtained by comparison with the aid of the laser genes software from DNASTAR, ine. Madison, Wisconsin (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5 (2): 151-1) using the following parameters becomes:
  • a protein which has an identity of at least 20% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 12 or 26 or 30 is accordingly understood to be a protein which, when compared its sequence with the sequence SEQ ID NO: 12 or 26 or 30, in particular according to the above program logarithm with the above parameter set, an identity of at least 20%, preferably 30%, 40%, 50%, particularly preferably 60%, 70%, 80%, in particular 85%, 90, 95%.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other known genes from organisms of the Blakesleaa genus.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 11 is introduced into the organism of the genus.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 25 is introduced into the organism of the genus.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 29 is introduced into the organism of the genus.
  • ketolase genes can also be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can, for example, in a known manner, according to the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pp. 896-897).
  • the attachment of synthetic oligonucleotides and the filling of gaps using the Klenow fragment of DNA polymerase and ligation reactions as well as general cloning methods are described in Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the vector used in transformation (i) therefore preferably comprises a sequence coding for a ketolase, in particular the ketolase Nostoc punctiforme from with SEQ ID NO: 72.
  • Hydroxylase activity means the enzyme activity of a hydroxylase.
  • a hydroxylase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity of introducing a hydroxyl group on the optionally substituted ⁇ -ionone ring of carotenoids.
  • a hydroxylase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity to convert ⁇ -carotene into zeaxanthin or canaxanthin into astaxanthin.
  • hydroxyase activity is understood to mean the amount of ⁇ -carotene or cantaxanthin converted or the amount of zeaxanthin or astaxanthin formed in a certain time by the protein hydroxylase.
  • the protein compared to the wild type in a certain time Hydroxylase increases the amount of ß-carotene or cantaxantin converted or the amount of zeaxanthin or astaxanthin formed.
  • This increase in hydroxylase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the hydroxylase Wild type activity.
  • hydroxylase activity in genetically modified organisms according to the invention and in wild-type or reference organisms is preferably determined under the following conditions:
  • the activity of the hydroxylase is according to Bouvier et al. (Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328) in vitro. Ferredoxin, ferredoxin-NADP oxidoreductase, catalase, NADPH and beta-carotene with mono- and digalactosyl glycerides are added to a certain amount of organism extract.
  • the hydroxylase activity is particularly preferably determined under the following conditions according to Bouvier, Keller, d'Harlingue and Camara (xanthophyll biosynthesis: molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L .; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328):
  • the in vitro assay is carried out in a volume of 0.250 ml volume.
  • the mixture contains 50 mM potassium phosphate (pH 7.6), 0.025 mg ferredoxin from spinach, 0.5 units ferredoxin-NADP + oxidoreductase from spinach, 0.25 mM NADPH, 0.010 mg beta-carotene (emulsified in 0.1 mg Tween 80), 0.05 mM a mixture of mono - and digalactosylglycerides (1: 1), 1 unit of catalysis, 200 mono- and digalactosylglycerides, (1: 1), 0.2 mg bovine serum albumin and organism extract in different volumes.
  • the reaction mixture is incubated for 2 hours at 30C.
  • the reaction products are extracted with organic solvent such as acetone or chloroform / methanol (2: 1) and determined by means of HPLC.
  • the hydroxylase activity is particularly preferably determined under the following conditions according to Bouvier, d'Harlingue and Camara (Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition; Arch. Biochem. Biophys. 346 (1) (1997) 53-64):
  • the in vitro assay is carried out in a volume of 250 DI volume.
  • the mixture contains 50 mM potassium phosphate (pH 7.6), different amounts of organism extract, 20 nM lycopene, 250 Dg of chromoplastic stromal protein from paprika, 0.2 mM NADP +, 0.2 mM NADPH and 1 mM ATP.
  • NADP / NADPH and ATP are dissolved in 10 ml ethanol with 1 mg Tween 80 immediately before adding to the incubation medium.
  • the reaction products extracted in chloroform are analyzed by HPLC.
  • the hydroxylase activity can be increased in various ways, for example by switching off inhibitory regulatory mechanisms at the expression and protein level or by increasing the gene expression of nucleic acids encoding a hydroxylase compared to the wild type.
  • the increase in the gene expression of the nucleic acids encoding a hydroxylase compared to the wild type can also be caused by various Ways are carried out, for example by inducing the hydroxylase gene by activators or by introducing one or more copies of hydroxylase genes, ie by introducing at least one nucleic acid encoding a hydroxylase into the thickened organism of the genus Blakesleaa.
  • the gene expression of a nucleic acid encoding a hydroxylase is increased by introducing at least one nucleic acid encoding a hydroxylase into the organism of the genus Blakesleaa.
  • any hydroxylase gene that is to say any nucleic acid which codes for a hydroxylase and any nucleic acid which codes for a ⁇ -cyclase, can be used for this purpose.
  • genomic hydroxylase sequences from eukaryotic sources which contain introns in the event that the host organism is unable or unable to express the corresponding hydroxylase, preference is given to processed nucleic acid sequences, such as the corresponding ones to use cDNAs.
  • a hydroxylase gene is a nucleic acid encoding a hydroxylase from Haematococcus pluvialis with the accession no. AX038729 (WO 0061764; nucleic acid: SEQ ID NO: 31, protein: SEQ ID NO: 32), from Erwinia uredovora 20D3 (ATCC 19321, Accession No.. D90087; nucleic acid: SEQ ID NO: 33, protein: SEQ ID NO: 34) or hydroxylase from Thermus thermophilus (DE 102 34 126.5) encoded by the sequence with SEQ ID NO 76.
  • the genetically modified organism has, for example, at least one exogenous nucleic acid encoding a hydroxylase or at least two endogenous nucleic acids encoding a hydroxylase.
  • nucleic acids encoding proteins are preferably used which contain the amino acid sequence SEQ ID NO: 32, 34 or encoded by the sequence with SEQ ID NO 76 or one of these sequences by substitution, insertion or deletion Sequence derived from amino acids, which has an identity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, most preferably at least 90%, in particular 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99% at the amino acid level with the sequence SEQ. ID. NO: 32, 34 or encoded by the sequence with SEQ ID NO 76 and which have the enzymatic property of a hydroxylase.
  • hydroxylases and hydroxylase genes can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, as described above, by homology comparison. before the amino acid sequences or the corresponding back-translated nucleic acid sequences from databases with the SEQ ID. NO: 31, 33 or 76 easy to find.
  • hydroxylases and hydroxylase genes can also be found, for example, starting from the sequence SEQ ID NO: 31, 33 or 76 from various organisms whose genomic sequence is not known, as described above, by hybridization and PCR techniques in a manner known per se Easy to find.
  • nucleic acids are introduced into organisms which encode proteins, containing the amino acid sequence of the hydroxylase of the sequence SEQ ID NO: 32, 34 or encoded by the sequence with the SEQ ID NO 76.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained, for example, by back-translating the polypeptide sequence in accordance with the genetic code.
  • codons which are frequently used in accordance with the organism-specific codon usage are preferably used for this.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other, known genes of the organisms in question.
  • a nucleic acid containing the sequence SEQ is brought. ID. NO: 31, 33 or 76 in the organism.
  • hydroxylase genes are further known in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, Complementary nucleic acid building blocks of the double helix can be produced.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the attachment of synthetic oligonucleotides and the filling of gaps using the Klenow fragment of DNA polymerase and ligation reactions as well as general cloning methods are described in Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the vector used in transformation (i) therefore preferably comprises a sequence coding for a hydroxlase, in particular a hydroxlase from Haematococcus pluvialis with SEQ ID NO: 70 or a hydroxlase from Erwinia uredova with SEQ ID NO : 71. or a hydroxylase from Thermus thermophilus encoded by the sequence with SEQ ID NO 76.
  • the gene of phytoendesaturase is preferably switched off by the transformation.
  • the vector used in transformation (i) preferably also contains expression-regulating and supporting areas, in particular promoters and terminators.
  • the vector used in transformation (i) preferably contains the gpd and / or the ptefl promoter and / or the trpC terminator. These have proven particularly useful for the transformation of Blakeslea.
  • the use of “inverted repeats” (IR, Römpp Lexikon der Biotechnologie 1992, Thieme Verlag Stuttgart, page 407 “Inverse repetitive sequences”) for regulating expression or transcription is also within the scope of the invention.
  • the gpd promoter used in the vector advantageously has the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the trpC terminator used in the vector advantageously has the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the ptefl promoter used in the vector advantageously has the sequence SEQ ID NO: 35.
  • the gpd promoter and the trpC terminator from Aspergillus nidulans and the ptefl promoter from Blakeslea trispora are used.
  • the vector used in transformation (i) contains a resistance gene. It is preferably a hygromycin resistance gene (hph), in particular one from E. coli. This resistance gene has proven to be particularly suitable for the detection of the transformation and selection of the cells.
  • hph hygromycin resistance gene
  • P-gpdA the promoter of glycerinaldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Aspergillus nidulans, is therefore preferably used as the promoter for hph.
  • the terminator for hph is preferably t-trpC, the terminator of the trpC gene, coding for anthranilate synthase components from Aspergillus nidulans.
  • Descendants of the pBinAHyg Vector have proven to be particularly suitable as vectors.
  • the vector used for the transformation therefore preferably comprises SEQ ID NO: 3.
  • the vectors therefore comprise the sequence SEQ ID NO: 69 coding for the phytoendesaturase.
  • the vectors also include in a further embodiment of the invention, the sequence SEQ ID NO: 72 coding for a ketolase.
  • the vectors further comprise the sequence SEQ ID NO: 70 or 71 or 76 coding for a hydoxylase.
  • the vector thus encompasses both a sequence SEQ ID NO: 72 coding for a ketolase and the sequence SEQ ID NO: 70 or 71 or 76 coding for a hydoxylase and thus enables the production of astaxanthin.
  • vectors selected from the group consisting of SEQ ID NO: 37 to 51 and 62 can be used in the context of the invention.
  • the genetically modified organisms can be used to produce carotenoids, xanthophylls or their precursors, in particular bixin, phytoene, astaxanthin, zeaxanthin and canthaxanthin.
  • New carotenoids that do not occur naturally in the wild type can also be generated by introducing the appropriate genetic information from the specifically genetically modified cells or the mycelium formed by them and then isolated.
  • the genetically modified cells are cultivated after the selection, so that carotenoids or their precursors can be provided.
  • carotenoids or their precursors with the specifically genetically modified cells or the mycelium formed by them.
  • the cultivation of organisms is not subject to any particularities.
  • the genetic modification is only carried out in cells of one of the occurring mating types (in Blakeslea trispora (+) or (-)), the corresponding other, unchanged mating type is added for cultivation, since this ensures good production of the carotenoids or their precursors due to the substances released by the second, unchanged mating type (e.g. trisporic acids).
  • the genetic modification is advantageously carried out in cells of both mating types and these are cultivated together. As a result, particularly good growth and optimal production of the carotenoids or their precursors are achieved. (Artificial) addition of trisporic acids is also possible and useful.
  • Trisporic acids are sex hormones in Mucorales mushrooms, such as Blakeslea, which stimulate the formation of zygophores and the production of ß-carotene (van den Ende 1968, J. Bacteriol. 96: 1298-1303, Austin et al. 1969, Nature 223: 1178 - 1179, Reschke Tetrahedron Lett. 29: 3435-3439, van den late 1970, J. Bacteriol. 101: 423-428).
  • the media used preferably contain additives such as one or more carbon sources, one or more nitrogen sources, mineral salts and thiamines. Additives are preferably used, as can be seen from WO 03/038064 A2, page 4, line 30 to page 5 line 7. Glucose is particularly preferred as the carbon source and embroidery Material source asparagine, vegetable or animal extracts, such as cottonseed oil, soybean oil, cottonseed flour or yeast extract, are added.
  • the cultivation can be carried out either under aerobic or anaerobic conditions.
  • the temperature during the cultivation is preferably between approximately 20 and approximately 34 ° C., in particular between approximately 26 ° C. and approximately 28 ° C.
  • the cultivation can also be carried out continuously, batchwise or batchwise.
  • the cultivation is preferably carried out up to a solids content of between about 1 and about 20%, preferably 3 and 15% and particularly preferably 4 and 11%.
  • a solids content of between about 1 and about 20%, preferably 3 and 15% and particularly preferably 4 and 11%.
  • the cultivation or fermentation can be carried out in the usual equipment. All equipment suitable for the microorganisms used and their products can be considered. In particular, such as those given in the Römpp Lexicon Biotechnologie (1992 Georg Thieme Verlag, Stuttgart) under the keyword "bioreactor" on pages 123 - 126.
  • the use of stirred tank reactors with various internals, bubble columns of various types, etc. is particularly preferred.
  • the carotenoids or their precursors provided by the process according to the invention are particularly suitable for the production of additives for feed, food and food supplements, cosmetic, pharmaceutical or dermatological preparations.
  • the carotenoid produced by the genetically modified cells or the carotenoid precursor produced by the genetically modified cells from the culture of the genetically modified microorganisms is provided in two variants a) or b); a combination of a) and b) is also preferred;
  • the inventive provision of the carotenoid produced by the genetically modified cells or the carotenoid precursor produced by the genetically modified cells from the culture of the genetically modified microorganisms is carried out according to two variants a) or b), which enables the simultaneous production of two products.
  • Foodstuffs obtainable by the process according to the invention with provision according to variant b) thus already contain large amounts of carotenoids that do not need to be added.
  • the fact that the food contains Blakeslea trispora in addition to the at least one carotenoid also increases its nutrient content.
  • the nutrient content according to the preferred alternatives IIA and IIB is greatly increased since, in addition to the at least one carotenoid and Blakeslea trispora, it also contains all the media components of the fermentation.
  • the process does not require any additional, complicated work-up and production steps, but the homogenized and, if appropriate, dewatered Blakeslea trispora-containing culture broth can be dried directly without detours to produce the food.
  • the combination according to the invention of the production of two products according to IIC, namely the carotenoid-containing food and the carotenoids per se, has the advantage that again essentially no waste is produced and complete extraction of the carotenoids from the biomass is unnecessary, so that otherwise the effort involved in the extraction is less.
  • the valuable carotenoid (s) only have to be partially extracted despite complete recovery, without resulting in product loss. This requires lower amounts of solvent and, as a result, less effort in the measures for their reuse.
  • waste is largely avoided because the biomass does not accumulate as waste, but is processed into high-quality food becomes. This results in lower costs for the processes by exploiting synergies.
  • “Highly pure” in the present application is to be understood to mean a purity of the at least one carotenoid of at least 95%, preferably> 95%, preferably> 96%, particularly preferably> 97%, very particularly preferably> 98%, most preferably> 99% ,
  • the at least one carotenoid is selected from the group consisting of astaxanthin, zeaxanthin, echinenone, ß-cryptoxanthin, andonixanthin, adonirubin, canthaxanthin, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, lycopene, ß-carotene, lutein, phytoflueno and benxin , It is preferably astaxanthin or zeaxanthin.
  • the carotenoids can be obtained individually or as mixtures of two or more of the aforementioned carotenoids by the process according to the invention.
  • this or the carotenoids can be produced in a targeted manner.
  • compositions are used as food that serve for nutrition. This also includes compositions for supplementing the diet.
  • animal feed and animal feed supplements are regarded as foods.
  • the biomass can be separated from the culture broth.
  • All methods known to the person skilled in the art and customarily usable for solid / liquid separation can be used for this purpose. This includes in particular the mechanical processes, such as filtration and centrifugation, on the Exploitation of gravity, centrifugal force, pressure or vacuum are based.
  • the processes and apparatus that can be used also include cross-flow filtration or membrane technologies such as osmosis, reverse osmosis, microfiltration, ultrafiltration, nanofiltration, cake filtration processes (e.g.
  • centrifugation processes by means of continuously or discontinuously operated centrifuges or filter centrifuges (eg inverting filter centrifuges, peeling centrifuges, push centrifuges, sieve screw centrifuges, sliding centrifuges), sliding centrifuges, separators or separators, separators or separators Processes using gravity such as flotation, sedimentation, sink-float treatment and clarification.
  • the biomass is preferably separated from the culture broth by centrifugation using a decanter or by filtration using a membrane filtration unit.
  • a homogeneously distributed suspension of the solids is produced in the culture broth. All methods which are familiar to the person skilled in the art and can usually be used can be used for this purpose. In particular, dispersing devices such as an Ultra-Turrax® (on a laboratory scale) are used. Cell disruption is not necessary, but can be done.
  • the culture broth can be dewatered in order to achieve a suitable solids content between> 2% and ⁇ 50%.
  • All methods known to the person skilled in the art and customarily usable for solid / liquid separation can be used for this purpose.
  • the processes and apparatus that can be used also include cross-flow filtration and membrane technologies such as osmosis, Reverse osmosis, microfiltration, ultrafiltration, nanofiltration, cake filtration processes (e.g.
  • centrifugation processes using continuously or discontinuously operated centrifuges or filter centrifuges (e.g. inverting filter centrifuges, peeling centrifuges, push centrifuges, sieve screw centrifuges, sliding centrifuges, separators or decanters), processes using gravity such as flotation, sedimentation, sink-float treatment and clarification.
  • the biomass is preferably separated from the culture broth by centrifugation using a decanter or by filtration using a membrane filtration unit. The culture broth is then dried.
  • thermal drying such as convection, contact and radiation drying
  • devices for thermal drying for example tray, chamber, channel, flat sheet, plate, rotary drum, trickle shaft, sieve belt, current, fluidized bed, fluidized bed , Paddle, ball bed,, heating plate, thin-film, roller, belt, sieve drum, screw, tumble, contact disc, infrared, microwave and freeze dryer, spray dryer or spray dryer with integrated fluidized bed which may be heated by steam, oil, gas or electrical current and may be operated under vacuum.
  • the operating mode can be continuous or discontinuous.
  • the mechanical methods for solid / liquid separation already given above can be used.
  • Spray drying as is known from DE 101 04 494 A1, DE-A-12 11 911 or EP 0 410 236 A1, is preferably used for drying.
  • inlet temperatures of approximately 115 ° C. to 180 ° C., preferably 120 ° C. to 130 ° C., and outlet temperatures of approximately 50 ° C. to 80 ° C., preferably 55 ° C. to 70 ° C. are selected.
  • Nitrogen is preferably used as the drying gas.
  • flow aids such as silicas etc. can be added to achieve better flowability.
  • inert carrier materials i.e. low molecular weight inorganic carriers such as NaCI, CaC03, Na2S04 or MgS04, organic carriers such as glucose, fructose, sucrose, dextrins or starch products (rye, barley, oatmeal, wheat semolina bran) are conceivable.
  • the dried product preferably has a residual moisture content of less than 10%, preferably less than 5%, based on the dry matter. Its carotenoid content is between 0.05 and 20%, in particular 1 and 10%, based on the dry matter.
  • the foodstuff produced in this way can either be used directly or prepared by means of further additives, as is also known from DE 101 04494 A1.
  • the biomass is first separated from the culture broth.
  • all methods for solid / liquid separation which are familiar to the person skilled in the art and can usually be used can be used, as have already been mentioned above for dewatering.
  • the biomass is preferably separated from the culture broth by centrifugation using a decanter or by membrane filtration.
  • the biomass is optionally washed with a solvent which does not dissolve carotenoids, in particular water, as a result of which water-soluble components in particular are removed.
  • This step can optionally be supplemented using other non-solvent carotenoids (e.g. alcohols), but this is not necessary within the scope of the invention and is not preferred to avoid waste.
  • the sterilization kills the microorganisms and, if appropriate, stops any enzyme activity. This is important for preventing the degradation of the biomass or the substances contained therein, in particular the carotenoids, and for the durability.
  • the sterilization can be carried out using a customary method known to the person skilled in the art. This includes steam sterilization, especially at temperatures above 120 ° C under pressure (> 1 bar) and times of> approx. 20 min. and treatment with high-energy rays, such as UV, microwaves, gamma or beta rays.
  • the sterilization is preferably carried out in the process according to the invention by means of steam or microwave radiation.
  • Subsequent or simultaneous cell disruption releases the carotenoids present within the cells.
  • the cell disruption can also be carried out using all customary methods known to the person skilled in the art. This includes mechanical and non-mechanical methods. Mechanical methods include dry milling, wet milling, stirring, homogenizing (eg in a high pressure homogenizer) and the use of ultrasound or microwaves.
  • Non-mechanical methods Physical, chemical and biochemical methods can be considered as non-mechanical methods. This includes short-term heating, short-term freezing, osmotic shock, drying, treatment with acids or alkalis as well as enzymatic digestion.
  • the method used for sterilization is advantageously used for cell disruption.
  • the cell disruption is therefore preferably likewise carried out by means of steam or microwave radiation.
  • the sterilization and / or the cell disruption can be carried out continuously or batchwise.
  • the sterilization and / or the cell disruption can be carried out in the bioreactor used for cultivation or in other apparatus, such as autoclaves, etc. If the process is carried out continuously, the method and corresponding apparatuses known from WO 01/83437 A1 can be used.
  • the biomass is optionally dried and / or homogenized.
  • devices for thermal drying such as convection, contact and radiation drying, for example tray, chamber, channel, flat sheet, plate, rotary drum, trickle shaft, sieve belt, current, fluidized bed, fluidized bed , Shovel, ball bed,, heating plate, thin-film, roller, belt, Sieve drum, screw, tumble, contact disc, infrared, microwave and freeze dryers, spray dryers or spray dryers with integrated fluidized bed, which are heated by steam, oil, gas or electrical current, if necessary, and operated under vacuum if necessary.
  • the mode of operation can be continuous or discontinuous.
  • the mechanical methods for solid / liquid separation already given above can be used.
  • the carotenoids are partially extracted from the digested biomass by means of a solvent that dissolves carotenoids and the solvent is separated from the biomass. Both the solvent and the biomass now contain carotenoids, the majority of the carotenoids preferably being in the solvent.
  • the high-purity carotenoids are then isolated from the solvent, whereas the biomass is further processed into a high-quality, carotenoid-containing food which, due to the previous cell disruption, also has good bioavailability of the carotenoids.
  • Partial extraction should therefore be understood to mean the deliberately incomplete extraction of the carotenoids from the biomass (see above).
  • the extraction thus extracts less than 100% of the total amount of carotenoids contained in the biomass. This is of great advantage, since the effort for extraction increases disproportionately with the decreasing amount of carotenoid in the biomass.
  • solvents are used that dissolve carotenoids, such as. B. hexane, ethyl acetate, dichloromethane or supercritical carbon dioxide.
  • the carotenoids contained therein can then be converted into dichloromethane or the product of value can be obtained directly by relaxing the carbon dioxide.
  • the amounts of solvents and mixing times are selected such that the desired amount of carotenoids is extracted from the biomass.
  • the extraction step is carried out only once, which makes technical and economic sense (see above).
  • liquid / liquid extraction for example, bubble columns, pulsating columns, columns with rotating internals, mixer-settler batteries or stirred tanks etc. can be used.
  • the solid / liquid extraction can be carried out using conventional equipment. Stirred kettles or mixer-settlers are preferably used.
  • the cell disruption can take place without prior separation of the fermentation medium and then a direct separation of a carotenoid suspension which is formed from the biomass, e.g. B. be carried out by means of a decanter.
  • the carotenoid suspension is then taken up in dichloromethane and processed further, or alternatively purified by washing with various aqueous solutions.
  • the carotenoids are crystallized from the solvent used and the carotenoid crystals are isolated, in particular by filtration.
  • the remaining mother liquor can be added to the process again after distillation, so that product losses are minimized despite little effort.
  • the crystallization is preferably carried out by gradual solvent exchange for a solvent which does not dissolve carotenoids.
  • the solubility of the carotenoids is continuously reduced until they precipitate out as pure crystals.
  • a "lower alcohol” or water is preferably used.
  • Aliphatic alcohols with 1 to 4 carbon atoms are regarded as the lower alcohol. These include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, 1-butanol, tert-butanol and sec-butanol. Methanol is preferably used.
  • the carotenoid solution can be heated, the temperature preferably being kept ⁇ 100 ° C., in particular ⁇ 60 ° C., so that
  • the carotenoids are obtained as high-purity crystals and have a purity of at least 95%, preferably> 95%, preferably> 96%, particularly preferably> 97%, very particularly preferably> 98%, most preferably> 99%.
  • the yields which can be achieved are between 45% and 95%, preferably between 70% and 95%, based on the amount present in the culture broth (0.5-15 g / L, preferably 1-10 g / L).
  • solvent residues are first removed from the carotenoid-containing biomass.
  • steam distillation or so-called stripping with water vapor is preferably carried out (cf. Römpp Lexikon Chemie CD-ROM version 2.0, Georg Thieme Verlag, 1999, "Strippen”).
  • the biomass can optionally be suspended homogeneously in the culture broth separated above, a solids content of> 100 g / L and ⁇ 600 g / L being adhered to, so that the subsequent drying of the biomass or suspension for the production of the food is carried out without technical difficulties can.
  • All the processes and equipment already mentioned can be used as drying processes.
  • Spray drying is used in particular for drying. This can be done as known from DE 101 04494 A1. In spray drying, inlet temperatures of approximately 100 ° C. to 180 ° C., preferably 120 ° C. to 130 ° C., and outlet temperatures of approximately 50 ° to 80 ° C., preferably 55 ° C. to 70 ° C. are selected. Nitrogen is preferably used as the drying gas.
  • the foodstuff produced in this way can either be used directly or prepared by means of further additives, as is also known from DE 101 04494 A1.
  • compositions are used as food that serve for nutrition. This also includes compositions for supplementing the diet. In particular, animal feed and animal feed supplements are regarded as foods. In addition, reference is made to Römpp Lexikon Chemie CD-ROM version 2.0, Georg Thieme Verlag, 1999, "Lebensstoff".
  • the dry product preferably has a residual moisture content of less than 5% based on the dry matter. Its carotenoid content is between 0.05 and 20%, in particular 1 and 10%, based on the dry mass.
  • the desired carotenoid content can be controlled via the extent of the extraction (see above).
  • Foodstuffs obtainable by the process according to the invention therefore already contain large amounts of carotenoids after the preparation, which do not have to be added. Because the food contains biomass in addition to the at least one carotenoid, its nutrient content is also increased. In particular, according to the preferred alternative, the nutrient content is greatly increased by containing all the media components of the fermentation in addition to the at least one carotenoid and biomass. There are therefore practically none Waste, apart from aqueous media, which can be easily cleaned in a sewage treatment plant. In addition, the entire production amount of carotenoids is used without or with only marginal losses, since no lossy separation or processing steps have to be carried out in order to extract the entire amount of carotenoids.
  • the solvents used in the process according to the invention described above are all processed as far as possible and then reused or fed back into the process.
  • the dichloromethane used is already cleaned during the solvent exchange and is then ready for reuse.
  • the lower alcohol or the methanol is, for. B. cleaned by distillation and also used again. All that remains as waste is the distillation sump, which can be safely fed to a sewage treatment plant together with the aqueous media, where ultimately only a small amount of sewage sludge is obtained as actual waste.
  • the method described is thus essentially waste-free.
  • Isoniazid (Isonieotinklarehydrazid) 0.75 g / l The pH was adjusted to 6.5.
  • 200 ml of the media described were inoculated with spore suspensions of Blakeslea trispora ATCC 14272 Mating Type (-) containing 10 8 (for medium 2) and 10 7 (for medium 1 and 3) spores.
  • the cultivation was carried out in 1 liter Erlenmeyer flasks with baffles. Six identical flasks were set up with each medium and incubated for 7 days at 28 ° C. and 140 rpm in a shaker.
  • the Blakeslea trispora strains ATCC 14271 (mating type (+)) and ATCC14272 (-) (a wild type) were obtained. Mating type (-)) were from the American Type Culture Collection. receive. B. trispora was grown in MEP medium (malt extract peptone medium): 30 g / l malt extract (Difco), 3 g / l peptone (Soytone, Difco), 20 g / l agar, pH 5 setting , 5, ad 1000 ml with H 2 O at 28 ° C.
  • MEP medium malt extract peptone medium
  • Agrobacterium tumefaciens LBA4404 was grown according to Hoekema et al. (1983, Nature 303: 179-180) at 28 ° C for 24 h in Agrobacteria-Minimal Medium (AMM): 10 mM K 2 HP0 4 , 10 mM KH 2 P0 4 , 10 mM Glu- cose, MM salts (2.5 mM NaCl, 2 mM MgSO 4 , 700 ⁇ M CaCl 2 , 9 ⁇ M Fe-SO 4 , 4 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ).
  • Agrobacteria-Minimal Medium Agrobacteria-Minimal Medium
  • the plasmid pBinAHyg was electroporated into the Agrobacterium strain LBA 4404 (Hoekema et al., 1983, Nature 303: 179-180) (Mozo and Hooykaas, 1991, Plant Mol. Biol. 16: 917-918).
  • the following antibiotics were used for the selection of agrobacteria: rifampicin 50 mg / l (selection for the A. tumefaciens chromosome), streptomycin 30 mg / l (selection for the helper plasmid) and kanamycin 100 mg / l (selection for the binary vector) ).
  • agrobacteria were grown after 24 h in AMM to an OD 6 oo of 0.15 in induction medium (IM: MM salts, 40 mM MES (pH 5.6), 5 mM glucose, 2 mM phosphate, 0.5 % Glycerol, 200 ⁇ M acetosyringone) and again grown overnight in IM to an ODeoo of approx. 0.6.
  • IM induction medium
  • the medium contained hygromycin in a concentration of 100 mg / l for selection for transformed Blakeslea cells and 100 mg / l cefotaxime for selection against agrobacteria.
  • the incubation was carried out at 26 ° C. for about 7 days. The mycelium was then transferred to fresh selection plates.
  • CM 17-1 agar 3 g / l glucose, 200 mg / l L- Asparagine, 50 mg / l MgS0 4 x 7H 2 0, 150 mg / l KH 2 P0 4 , 25 ⁇ g / l ThiaminHCI, 100 mg / l Yeast Extract, 100 mg / l Na-deoxycholate, 100 mg / L Hygromycin, 100 mg / L cefotaxime, pH 5.5.18 g / l agar). To isolate individual genetically modified spores, the spores were individually deposited on selective medium using a BectonDickson FACS device (model Vantage + Diva Option).
  • spore suspensions were treated with MNNG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine).
  • MNNG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • a spore suspension with 1 x 10 7 spores / ml in Tris / HCl buffer, pH 7.0 was first prepared.
  • MNNG was added to the spore suspension at a final concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • the time of incubation in MNNG was chosen so that the survival rate of the spores was approx. 5%.
  • the spores were washed three times with 1 g / l Span 20 in 50 mM phosphate buffer pH 7.0 and plated.
  • homonucleater cells The selection of homonucleater cells from Blakeslea trispora carB "was carried out analogously to the test protocol for Phycomyces blakesleeanus (Roncero et al., 1984, Mutation Research, 125: 195-204), modified by growth in the presence of 5-carbon-5-deazariboflavin (1 ⁇ g / ml) and hygromycin 100 ( ⁇ g / ml).
  • the gpdA-hph-trpC cassette was isolated as a BglII / HindIII fragment from the plasmid pANsCosI (FIG. 1, Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26: 87-90, SEQ ID NO: 4) and inserted into the BamHI / HindIII fragment. Hindlll opened binary plasmid pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721) ligated. The vector thus obtained was designated pBinAHyg (FIG. 2, SEQ ID NO: 3) and contained the E.
  • hph coli hygromycin resistance gene
  • SEQ ID NO: 1 the gpd promoter
  • SEQ ID NO: 2 the trpC terminator from Aspergillus nidulans and the corresponding border sequences that are necessary for the DNA transfer from Agrobacterium.
  • the vectors mentioned in the exemplary embodiments described below are descendants of pBinAHyg.
  • the plasmid pBinAHyg was electroporated into the agrobacterial strain LBA 4404 (Hoekema et al., 1983, Nature 303: 179-180) (Mozo and Hooykaas, 1991, Plant Mol. Biol. 16: 917-918).
  • the following antibiotics were used for the selection of agrobacteria: rifampicin 50 mg / l (selection for the A. tumefaciens chromosome), streptomycin 30 mg / l (selection for the helper plasmid) and kanamycin 100 mg / l (selection for the binary vector) ).
  • agrobacteria were grown after 24 h in AMM to an OD 66 o of 0.15 in induction medium (IM: MM salts, 40 mM MES (pH 5.6), 5 mM glucose, 2 mM phosphate, 0.5% glycerol, 200 ⁇ M acetosyringone) and diluted again overnight in IM to an OD ⁇ o of approximately 0.6.
  • IM induction medium
  • IM MM salts, 40 mM MES (pH 5.6), 5 mM glucose, 2 mM phosphate, 0.5% glycerol, 200 ⁇ M acetosyringone
  • the medium contained hygromycin in a concentration of 100 mg / l for selection for transformed Blakeslea cells and 100 mg / l cefotaxime for selection against agrobacteria.
  • the incubation was carried out at 26 ° C. for about 7 days. The mycelium was then transferred to fresh selection plates.
  • CM 17-1 agar 3 g / l glucose, 200 mg / l L-asparagine, 50 mg / l MgSO 4 ⁇ 7H 2 0, 150 mg / l KH2P04, 25 ⁇ g / l thiamine-HCl, 100 mg / l yeast extract, 100 mg / l Na deoxycholate, pH 5.5, 100 mg / l cefotaxime, 100 mg / l hygromycin, 18 g / l agar). The transfer of spores to fresh selection plates was repeated three times. The transformant Blakeslea trispora GVO 3005 was isolated in this way.
  • the individual deposits of the spores were carried out by the BectonDickinson FacsVantage + Diva Option on CM-17 agar with 100 mg / l cefotaxime, 100 mg / l hygromycin. In this case, fungal mycelium was only formed where the spores were genetically modified.
  • the primers hph-forward (5'-CGATGTAGGAGGGCGTGGATA, SEQ ID NO: 5) and hph-reverse (5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT, SEQ ID NO: 6) were used to detect the hygromycin resistance gene (hph).
  • the expected fragment of hph was 800 bp in length.
  • nptlll-forward (5'-TGAGAATATCACCGGAATTG, SEQ ID NO: 7)
  • nptlil-reverse 5'-AGCTCGACATACTGTTCTTCC, SEQ ID NO: 8
  • the expected fragment of nptlll was 700 bp in length.
  • hygromycin resistance gene hph
  • glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene gpdl
  • spore suspensions of the recombinant strains were first treated with MNNG.
  • a spore suspension was prepared with 1 x 10 7 spores / ml in Tris / HCl buffer, pH 7.0.
  • MNNG was added to the spore suspension at a final concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • the duration of the incubation with MNNG was chosen so that the survival rate of the spores was ⁇ 5%.
  • the spores were washed three times with 1 g / l Span 20 in 50 mM phosphate buffer pH 7.0 and plated.
  • a small proportion of the Blakeslea trispora spores or the genetically modified strains of Blakeslea trispora are naturally single-core.
  • the mononuclear spores were sorted out by FACS and analyzed for MEP (30 g / l malt extract, 3 g / l peptone, pH 5.5, 18 g / l Agar) plated with 100 mg / l cefotaxime and 100 mg / l hygromycin. The mycelia formed here were homonucleate.
  • the spores of a 3-day-old smear were washed away with 10 ml Tris-HCI 50mMol + 0.1% Span20 per agar plate.
  • the spore concentration was 0.5 to 0.8 x 10 7 spores per ml.
  • 1 ml of DMSO and 10 ⁇ l of Syto 11 were added to 9 ml of spore suspension.
  • the dyeing was then carried out at 30 ° C. for 2 hours. Selection and storage was carried out using a BectonDickinson FacsVantage + Diva Option.
  • the spores were then plated onto MEP agar plates and new spores were generated.
  • homokaryonte cells were of the genotype hyg R and is "selected.
  • MNNG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • a spore suspension with 1 x 10 7 spores / ml in Tris / HCl buffer, pH 7.0 was first prepared.
  • MNNG was added to the spore suspension at a final concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • the time of incubation in MNNG was chosen so that the survival rate of the spores was approx. 5%.
  • the spores were washed three times with 1 g / l Span 20 in 50 mM phosphate buffer pH 7.0 and sorted or selected according to the method described under 1).
  • X-rays and UV rays could also be used to reduce the number of nuclei in the spores, as described by Cerdä-Olmedo and Patricia Reau in Mutation Res., 9 (1970), 369-384.
  • the recessive selection marker pyrG can be used as a recessive selection marker for the selection of homonucleater mycelia.
  • Wild-type strains of Blakeslea trispora are pyrG + . These strains cannot grow in the presence of the pyrimidine analogue 5-fluororotate (FOA) because they convert FOA to methyl metabolites through orotidine-5'-monophosphate decarboxylase.
  • Genetically modified Blakesleaa which are homonucleate pyrG " , lack the enzyme activity orotidine-5'-monophosphate decarboxylase. Consequently, these pyrG ⁇ strains cannot utilize 5-fluororotate. The strains therefore grow in the presence of FOA and uracil. In the case of coupling the mutation pyrG " and the insertion of foreign DNA on the core of a mononuclear spore, homonucleates recombinant fungal mycelium can be formed from this spore.
  • Homonucleate GMOs from Blakeslea trispora with the phenotype pyrG " were selected as follows.
  • MEP (30 g / l malt extract, 3 g / l peptone, pH 5.5, 18 g / l) was used as described above.
  • 1 agar plated with 100 mg / l cefotaxime and 100 mg / l hygromycin The spores of the transformants were washed away with 10 ml Tris-HCl 50mM + 0.1% Span20 per agar plate. The spore concentration was 0.5 to 0.8 x 10 7 spores per ml.
  • the spores were then plated on FOA medium with 100 mg / l cefotaxime and 100 mg / l hygromycin.
  • FOA medium contained 20 g glucose, 1 g FOA, 50 mg uracil, 200 ml citrate buffer (0.5 M, pH 4.5) and 40 ml trace salt solution according to Sutter, 1975, PNAS, 72: 127 per liter ).
  • Hormucleate pyrG " mutants showed growth on the uracil-containing FOA medium, but no growth when plated on FOA medium without uracil.
  • the GMOs described below from Blakeslea trispora for the production of xanthophylls were homo- Nuclear GMO produced.
  • the plasmids mentioned below were generated by the “overiap-extension PCR” method and then by inserting the amplification products into the plasmid pBinAHyg.
  • the “overiap-extension PCR” method was carried out as in Innis et al. (Eds.) PCR protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, San Diego.
  • the transformation of the pBinAHyg descendants and the production of homonuclear genetically modified strains of Blakeslea trispora was carried out as described above. Genetically modified strains of Blakeslea trispora for the production of zeaxanthin
  • piasmids were used to genetically modify Blakeslea trispora for the production of zeaxanthin.
  • p-carRA-HPcrtZ containing gene of the hydroxylase HPcrtZ from Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 under the control of the pcarRA promoter from Blakeslea trispora
  • pBinAHyg- BTpcarRA-HPcrtZ SEQ ID NO: 38, Fig. 6
  • p-carB- HPcrtZ containing gene of the hydroxylase HPcrtZ from Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 under the control of the pcarB promoter from Blakeslea trispora
  • PBinAHygBTpcarB-HPcrtZ SEQ ID NO: 39, Fig. 7
  • p-carRA-HPcrtZA-T'-3 ' -IR containing gene of the hydroxylase HPcrtZ from Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 under the control of the pcarRA promoter from Blakeslea trispora.
  • An inverted repeat structure is located downstream of the hydroxylase gene, which originates from the 3 'end of carA and the region located downstream of carA (IR, SEQ ID NO: 74,.
  • HPcrtZ from Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 under the control of the pcarRA promoter from Blakeslea trispora.
  • the gene of Hydroxylase is fused to an inverted repeat structure derived from the 3 'end of carA and the region downstream of carA (IR, SEQ ID NO: 74, inverted repeat V about 350 bp from carA, then about 200 bp, loop 'and then approx. 350 bp inverted repeat 2').
  • the derived fusion protein consequently consists of the hydroxylase from Haematococcus pluvialis and the carboxy terminus of CarA from Blakeslea trispora (Seq.
  • PBinAHyg-BTpcarRA-HPcrtZ-GCG-3'carA-IR SEQ ID NO: 41, Fig. 9
  • p-tef1-EUcrtZ containing gene of the hydroxylase EUcrtZ (SEQ ID NO: 71) from Erwinia uredova 20D3 (Accession No. D90087) below
  • p-carB-EUcrtZ containing gene of the hydroxylase EUcrtZ from Erwinia uredova 20D3 under the control of the pcarB promoter from Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-EUcrtZ, SEQ ID NO: 44, Fig.
  • p-gpdA-BTcarR-HPcrtZ-BTcarA containing gene fusion from genes of the lycopene cyclase carR from Blakeslea trispora, the hydroxylase HPcrtZ from Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 and the Phytoene synthase carA from Blakeslea trispora under control of the gpdA promoter from Aspergillus nidulans (Seq. PBinAHyg-carR_crtZ_carA, SEQ ID NO: 46, Fig. 14);
  • Nostoc punctiform PCC73102 under the control of the pcarRA promoter from Blakeslea trispora (Seq. PBinAHygBTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO: 48, Fig. 16); p-carB-NPcrtW, containing the gene of the ketolase NPcrtW from Noctoc punctiform PCC73102 under the control of the pcarB promoter from Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-NpucrtW, SEQ ID NO: 49, Fig. 17);
  • plasmids (descendants of pBinAHyg) were used for the genetic engineering of Blakeslea trispora for the production of astaxanthin, so they code for hydroxylases (crtZ) and ketolases (crtW), among others: p-carRA-HPcrtZ-pcarRA-NPcrtW, containing the gene of the hydroxylase HPcrtZ from Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 and the gene of the ketolase NPcrtW from Nostoc punctiforme PCC73102 (ORF148, Accesion No.
  • the cloning of p-tef from Blakeslea trispora was based on a sequence of the structural gene for the translation elongation factor 1- ⁇ from Blakeslea trispora already published in GenBank (AF157235). Starting from the sequence entry AF157235, primers for the inverse PCR were selected in order to amplify and sequence the promoter region located upstream of the structural gene.
  • a 3000 bp fragment was obtained in the following approach: template DNA (1 ⁇ g genomic see DNA from Blakeslea trispora ATCC 14272) Primer MAT344 5'- GGCGTACTTGAAGGAACCCTTACCG-3 '(SEQ ID NO: 63) and MAT 345 5'-ATTGATGCTCCCGGTCACCGTGATT-3' (SEQ ID NO: 64) each 0.25 ⁇ N, 100 ⁇ M , 10 ⁇ l Herculase polymerase buffer 10 ⁇ , 5 U Herculase (addition at 85 ° C.), H 2 0 ad 100 ⁇ l.
  • the PCR profile was 95 ° C, 10 min (1 cycle); 85 ° C, 5 min (1 cycle); 60 ° C, 30 s. 72 ° C, 60 s, 95 ° C, 30 s (30 cycles); 72 ° C, 10 min (1 cycle).
  • the sequence section which lies upstream of the putative start codon of the gene tefl within 3000 bp fragment was designated as promoter ptefl.
  • a 315 bp DNA probe was produced by the following PCR.
  • Reaction mixture 1 ⁇ g of genomic DNA from Blakeslea trispora ATCC 14272, primer MAT314 5'- CCGATGGCGACGACGGAAGGTTGTT-3 '[SEQ ID NO 79] and MAT315 5'-CATGTTCATGCCCATTGCATCACCT-3' [SEQ ID NO 80] each 0.25 ⁇ M dNTP, 10 ⁇ l Herculase polymerase buffer 10 ⁇ , 5 U Herculase (addition at 85 ° C.), H 2 0 ad 100 ⁇ l.
  • the PCR profile was 95 ° C, 10 min (1 cycle); 85 ° C, 5 min (1 cycle); 58 ° C, 30 s. 72 ° C, 30 s, 95 ° C, 30 s (30 cycles); 72 ° C, 10 min (1 cycle).
  • the cosmid library was screened with this DNA probe. A clone was identified, the cosmid of which hybridized with the DNA probe. The insertion of this cosmid was sequenced. The DNA sequence contained a section which was assigned to the gene of an HMG-CoA reductase [HMG-CoA-Red.gb].
  • the degenerate primers MAT182 5'-GCNGARGGNATHTGGTA-5 ') (MAT192) from the sequence comparison of the peptide sequences of Phytoendesaturases and the comparison of the associated DNA sequences from Phycomyces blakesleeanus, Cercospora nicotianae, Phaffia rhodozyma and Neurospora crassa - TCNGCNAGRAADATRTTRTG-3 ' (SEQ ID 53).
  • the PCR was carried out in 100 ⁇ l batches.
  • the PCR profile was 95 ° C, 10 min (1 cycle); 85 ° C, 5 min (1 cycle); 40 ° C, 30 s, 72 ° C, 30 s, 95 ° C, 30 s (35 cycles); 72 ° C, 10 min (1 cycle).
  • the gene regions upstream and downstream of the 350 bp fragment were used as follows according to the principle of chromosome walking amplified, cloned and sequenced: (i) a 1.1 kbp fragment by PCR with the primers MAT219 5'-AAGTGACACCGGTTACACGCTTGTCTT-3 '(SEQ ID 54) and MAT 220 5'-GCTTATCACCATCTGTTACCTCCTTGC-3 '(SEQ ID 55) obtained from 200 ng EcoRI-digested and circularized genomic DNA from Blakeslea trispora ATCC14272, 0.25 ⁇ M MAT219, 0.25 ⁇ M MAT220, 100 ⁇ M dNTP, 10 ⁇ l Herepulase- 10x, 5 U Herculase (addition at 85 ° C), H 2 0 ad
  • the PCR profile was 95 ° C, 10 min (1 cycle); 85 ° C, 5 min (1 cycle); 60 ° C, 30 s. 72 ° C, 60 s, 95 ° C, 30 s (30 cycles); 72 ° C, 10 min (1 cycle), (ii) a 2.9 kbp fragment by PCR with the primers MAT219 and MAT220 obtained from 200 ng Xbal-cleaved and circularized genomic DNA from Blakeslea trispora ATCC14272, 0.25 ⁇ M MAT219, 0.25 ⁇ M MAT220, 100 ⁇ M dNTP, 10 ⁇ l Herculase polymerase buffer 10 ⁇ , 5 U Herculase (addition at 85 ° C.), H 2 0 ad 100 ⁇ l.
  • the PCR profile was 95 ° C, 10 min (1 cycle); 85 ° C, 5 min (1 cycle); 60 ° C, 30 s, 72 ° C, 3 min, 95 ° C, 30 s (30
  • the cloned sequence section is shown schematically in FIG. 20 (SEQ ID NO 77).
  • the sequencing was carried out in the strand and counter-strand direction with the cloned fragments and with the PCR products.
  • the sequence of the cloned sequence section is shown in Fig. 21 (SEQ ID NO 78).
  • the nucleotide sequence of carB and the peptide sequence of the derived protein CarB were compared with the known sequences of related proteins.
  • the programs GAP and BESTFIT were used to compare the sequences.
  • Neurospora crassa 47.943 Cercospora nicotianae: 47.740
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2
  • Phaffia rhodozyma 53.175
  • Neurospora crassa 51.896
  • Length Weight 3 Average Match: 10,000 Average Mismatch: 0,000 The following values were found for the agreement of the bases to CarB from Blakeslea trispora ATCC14272 in%: Phycomyces blakesleeanus: 64.853 Cercospora nicotianae: 50.143 Phaffia rhodozyma: 43.179
  • Neurospora crassa 42.130
  • Phaffia rhodozyma 62.403
  • Neurospora crassa 60.230
  • the DNA fragment obtained was ligated to the vector pJOE2702.
  • the plasmid obtained was designated pBT4 and was cloned together with pCAR-AE in Escherichia coli XL1-Blue. Expression was carried out by induction with rhamnose. Enzyme activity was demonstrated by detecting lycopene synthesis via HPLC. The cloning steps are described below:
  • PCR 2 was carried out to produce the coding sequence of carB from Blakeslea trispora for cloning in pJOE2702: Approx. 50 ng product from PCR 1.1 and approx. 50 ng product from PCR1.2 with 0.25 ⁇ M MAT350 5'-
  • CarB The gene product derived from carB was called CarB. Based on the peptide sequence analysis, CarB has the following properties:
  • the plasmids pCAR-AE and pBT4 were therefore transferred to Escherichia coli. After growth in liquid culture, the carotenoids were extracted from the cells and characterized (see above). It was demonstrated by HPLC analysis that the Escherichia coli XL1-Blue (pCAR-AE) strain produces phytoene and the Escherichia coli XL1-Blue (pCAR-AE) (pBT4) strain produces lycopene. CarB consequently shows the enzyme activity of a phytoendesaturase.
  • pBinAHyg ⁇ carB SEQ. ID. NO: 62, Fig. 22
  • the precursor of pBinAHyg ⁇ carB is pBinAHyg (SEQ. ID. NO: 3, Fig. 2).
  • pBinAHyg was constructed as follows:
  • the gpdA-hph cassette was isolated as a BglII / HindIII fragment from the plasmid pANsCosI (SEQ. ID. NO: 4, Fig. 1, Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26: 87-90) and opened in the BamHI / HindIII fragment binary plasmid pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721) ligated.
  • the vector thus obtained was called pBinAHyg and contains the E.
  • coli hygromycin resistance gene (hph) under the control of the gpd promoter and the trpC terrminator from Aspergillus nidulans as well as the corresponding border sequences which are necessary for the DNA transfer from Agrobacterium.
  • the amplification of the coding sequence of carB with the primers MAT350 (SEQ ID NO 58) and MAT353 (SEQ ID NO 61) by means of PCR was carried out with the following parameters: 50 ng pBT4 with 0.25 ⁇ M MAT350 5'-ACTTTATTGGATCCTTAAAT-GCGAATATCGTTGCTGC- 3 ', 0.25 ⁇ M MAT353 5'- CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3 ', 100 ⁇ M dNTP, 10 ⁇ L Pfu polymerase buffer, 2.5 U Pfu polymerase (addition at 85 ° C, "hot start") and ad 100 ⁇ L H 2 0 temperature profile: 1.
  • the plasmid pBinAHyg ⁇ carB was transferred into the agrobacterial strain LBA 4404, e.g. B. by electroporation (see above).
  • the plasmid of Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 was then transferred into Blakeslea trispora ATCC 14272 and into Blakeslea trispora ATCC 14271 (see above).
  • the successful detection of gene transfer in Blakesleslea trispora was carried out via polymerase chain reaction according to the following protocol:
  • shake flasks were inoculated with spore suspensions of (+) and (-) strains of the Blakeslea trispora GMO.
  • the shake flasks were incubated at 26 ° C at 250 rpm for 7 days.
  • trisporic acids were added to mixtures of the strains after 4 days and incubated for a further 3 days.
  • the final concentration of trisporic acids was 300 - 400 ⁇ g / ml.
  • Eluent A 50 mM NaH 2 PO 4 , pH 2.5 with perchloric acid
  • Extracts from the fermentation broths were used as the matrix. Before the HPLC, each sample was filtered through a 0.22 ⁇ m filter. The samples were kept cool and protected from light. For the calibration, 50-1000 mg / l were weighed out and dissolved in THF. Phytoene was used as the standard, which under the given conditions had a retention time of 7.7 min. having.
  • Extracts from the fermentation broths were used as the matrix. Before the HPLC, each sample was filtered through a 0.22 ⁇ m filter. The samples were kept cool and protected from light. For the calibration, 10 mg were weighed out and dissolved in 100 ml of THF. The following carotenoids with the following retention times were used as standard: ⁇ -carotene (12.5 min), lycopene (11.7 min), echinenone (10.9 min), cryptoxanthin (10.5 min), canthaxanthin (8.7 min) , Zeaxanthin (7.6 min) and astaxanthin (6.4 min) [s. Fig. 23].
  • GMOs genetically modified organisms
  • the vector pBinA-HygBTpTEFI-HPcrtZ was transferred into Blakeslea trispora by agrobacterium-mediated transformation (see above).
  • a hygromycin-resistant clone was isolated and transferred to a potato-glucose agar plate (Merck KGaA, Darmstadt).
  • a spore suspension was prepared from this plate.
  • a 250 ml Erlenmeyer flask without baffles with 50 ml growth medium corn flour 47 g / l, soy flour 23 g / l, KH 2 P0 4 0.5 g / l, thiamine-HCl 2.0 mg / l, pH with NaOH sterilization set to 6.2-6.7
  • 50 ml growth medium corn flour 47 g / l, soy flour 23 g / l, KH 2 P0 4 0.5 g / l, thiamine-HCl 2.0 mg / l, pH with NaOH sterilization set to 6.2-6.7
  • the production medium contained glucose 50 g / l, Ca-his acid hydrolyzate 2 g / l, yeast extract 1 g / l, L-asparagine 2 g / l, KH 2 P0 4 1.5 g / l, MgSO-4 x 7 H 2 0 0.5 g / l, thiamine-HCl 5 mg / l, Span20 10 g / l, Tween 80 1 g / l, linoleic acid 20 g / l, corn steep liquor 80 g / l. After 72 hours, kerosene was added at a final concentration of 40 g / l kerosene. After harvesting the cultures, the remaining approximately 35 ml of culture are made up to 40 ml with water. The cells are then disrupted 3 times at 1500 bar in a high-pressure homogenizer, type Micron Lab 40, from APV Gaulin.
  • the suspension with the disrupted cells was mixed with 35 ml of THF and shaken for 60 min at RT in the dark at 250 rpm. Then 2 g of NaCl were added and the mixture was shaken again. The extraction batch was then centrifuged at 5000 x g for 10 min. The colored THF phase was removed and the cell mass was completely decolorized. The THF phase was concentrated to 1 ml on a rotary evaporator at 30 mbar and 30 ° C. and then again taken up in 1 ml of THF. After centrifugation at 20,000 x g for 5 min, an aliquot of the upper phase was removed and analyzed by HPLC (FIG. 24, FIG. 23).
  • the culture broths given under A) above were worked up as follows in order to obtain high-purity carotenoids and a corresponding food.
  • the carotenoid content of the culture broths 1, 2, 3 was between 0.5 and 1.5 g / L.
  • Example according to Varainte a) IIA and variant b) IIA or IIB The cultures with identical media (in total approx. 1 L) were combined at the end of the cultivation period and homogenized using a dispersing device (Ultra.Turrax ®).
  • the solids concentration in media 1 and 2 was 37 g / l and 11 g / l, respectively.
  • the culture broth was drained by a centrifuge. In the case of high cell concentrations or high solids content of the medium, the culture broth can also be processed without prior solid-liquid separation (medium 3: 127 g solids / L.
  • a disperser Ultra-Turrax ®
  • the cell mass was fed to the dryer via a peristaltic pump, and was injected into the cylinder of the laboratory spray dryer via a two-fluid nozzle with a diameter of 2.0 mm, and was injected with 2 bar and 4.5 Nm 3 / h of nitrogen approx.
  • the drying gas was nitrogen with a flow rate of 22 Nm 3 / h.
  • the outlet temperature was between 59 ° C and 61 ° C.
  • the cells from 40 ml each of the culture broths 1, 2, 3 were digested 3 times at 1500 bar by a high-pressure homogenizer, type Micron Lab 40, from APV Gaulin.
  • 20 ml of the suspensions with the disrupted cells were mixed with 20 ml of tetrahydrofuran and shaken for 30 min at 30 ° C. in a rotary shaker at 200 rpm.
  • 2 g of NaCl were added and centrifuged for 5 min at 5000 x g for phase separation.
  • the THF phase was removed.
  • the aqueous phase was then extracted again with 20 ml of THF.
  • the extracts were combined.
  • the carotenoid concentration was quantified by HPLC.
  • the separated bio-moist mass (approx. 10 g to 100 g each) was mixed with 10 - 100 mL water to remove water-soluble components.
  • a solvent exchange from methylene chloride to methanol was carried out, for which the carotenoid solution was kept at 40 ° C. to 60 ° C. for about four hours and continuously with a total of 20 ° C. over this period.
  • carotenoid crystals 0.0.08 g to 0.24 g were obtained which had a purity (HPLC, see above) of 95%.
  • the yield of carotenoid crystals was 80% based on the concentration of carotenoid in the biomass.
  • the cell mass was added to the dryer using a peristaltic pump.
  • the injection into the cylinder of the laboratory spray dryer was carried out via a two-component nozzle with a diameter of 2.0 mm. Was injected with 2 bar and 4.5 Nm 3 / h nitrogen. The temperature at the inlet was approx. 125 ° C to 127 ° C. The drying gas was nitrogen with a flow rate of 22 Nm 3 / h. The outlet temperature was between 59 ° C and 61 ° C. With each of the three fermentation broths, free-flowing product could be separated on the cyclone of the spray dryer. The wall coverings in the tower (if present) automatically broke off from the vessel wall and were classified as unproblematic. About 2.5-25 g of powdery food were obtained, which could be used directly as animal feed. It contained approx. 0.5% - 1.5% carotenoids based on the dry weight. The residual moisture was less than 5%.
  • the yield of carotenoid was approximately 95% based on the starting amount of carotenoid in the culture broth.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen mittels gentechnisch veränderter Organismen der Gattung Blakeslea umfassend (i) (i) Transformation mindestens einer der Zellen, (ii) ggf. Homokaryotisierung der aus (i) erhaltenen Zellen, so dass Zellen entstehen, in denen die Kerne in einem oder in mehreren genetischen Merkmalen alle gleichartig verändert sind und diese genetische Veränderung zur Ausprägung bringen, und (ix) Selektion und Vermehrung der gentechnisch veränderten Zelle oder Zellen, (x) Kultivierung der gentechnisch veränderten Zellen, (xi) Bereitstellung des von den gentechnisch veränderten Zellen produzierten Carotinoids oder der von den gentechnischen veränderten Zellen produzierten Carotinoidvorstufe; nach dem Verfahren hergestellte Carotinoide oder deren Vorstufen und deren Verwendung.

Description

Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen mittels qentechnisch veränderter Organismen der Gattung Blakeslea. mit dem Verfahren hergestellte Carotinoide oder deren Vorstufen und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen mittels gentechnisch veränderten Organismen der Gattung Blakeslea, mit dem Verfahren hergestellte Carotinoide oder deren Vorstufen und deren Verwendung und Bereitstellung, besonders als hoch- reine Carotinoide, als Nahrungsmittel, enthaltend Carotinoide- produzierende Organismen und mindestens ein Carotinoid, insbesondere Tierfuttermittel, Tierfutterergänzungsmittel und Nahrungsergänzungsmittel, sowie die Verwehdung der aus dem Verfahren erhältlichen Carotinoide zur Herstellung von kosmetischen, pharmazeutischen, dermatologischen Zu- bereitungen, Nahrungsmitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln.
Blakeslea trispora ist als Produktionsorganismus für ß-Carotin (Ciegler, 1965, Adv Appl Microbiol. 7:1) und Lycopin bekannt (EP 1201762, EP 1184464, WO 03/038064).
Von Blakeslea trispora sind bisher verschiedene DNA-Sequenzen bekannt, insbesondere die DNA-Sequenz, die für die Gene der Carotinoid- biosynthese von Geranylgeranylpyrophosphat bis ß-Carotin codiert (WO 03/027293).
Insbesondere aufgrund der hohen Produktivität, die mit Blakeslea in der Produktion von Lycopin und ß-Carotin erreicht werden, bietet sich dieser Organismus zur fermentativen Herstellung von Carotinoiden an.
Es ist auch von Interesse die Produktivitäten der bisher natürlicherweise produzierten Carotine und deren Vorstufen weiter zu steigern und die Her- Stellung weiterer Carotinoide, wie z. B. Xanthophylle zu ermöglichen, die von Blakeslea bisher nicht oder nur in sehr geringem Maße gebildet und isoliert werden können.
Carotinoide werden Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Nahrungsergän- zungsmitteln, Kosmetika und Arzneimitteln zugesetzt. Die Carotinoide dienen vor allem als Pigmente zur Färbung. Daneben werden die antioxidati- ve Wirkung der Carotinoide und andere Eigenschaften dieser Substanzen genutzt. Man unterteilt die Carotinoide in die reinen Kohlenwasserstoffe, die Carotine und die sauerstoffhaltigen Kohlenwasserstoffe, die Xanthophylle. Xanthophylle wie Canthaxanthin und Astaxanthin werden beispielsweise zur Pigmentierung von Hühnereiern und Fischen eingesetzt (Britton et al. 1998, Carotinoids, Vol 3, Biosynthesis and Metabolism). Die Carotine ß-Carotin und Lycopin werden vor allem in der Humanernährung eingesetzt. ß-Carotin wird beispielsweise als Getränkefarbstoff verwendet. Lycopin hat eine krankheitsvorbeugende Wirkung (Argwal und Rao, 2000, CMAJ 163:739-744; Rao und Argwal 1999, Nutrition Research 19:305- 323). Die farblose Carotinoidvorstufe Phytoen kommt vor allem für Anwendungen als Antioxidans in kosmetischen, pharmazeutischen oder dermatologischen Zubereitungen in Frage.
Der überwiegende Teil der Carotinoide und deren Vorstufen, die als Zusatzstoffe für die oben genannten Anwendungen eingesetzt werden, wird durch chemische Synthese hergestellt. Die chemische Synthese ist tech- nisch sehr aufwendig und verursacht hohe Herstellkosten. Fermentative Verfahren sind demgegenüber technisch verhältnismäßig einfach und basieren auf kostengünstigen Einsatzstoffen. Fermentative Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden und deren Vorstufen können dann wirtschaftlich attraktiv und wettbewerbsfähig zur chemischen Synthese sein, wenn die Produktivität der bisherigen fermentativen Verfahren gesteigert würde oder neue Carotinoide auf Basis der bekannten würde oder neue Carotinoide auf Basis der bekannten Produktionsorganismen hergestellt werden könnten.
Hierzu ist eine gentechnische, d. h. gezielte genetische Veränderung von Blakeslea erforderlich. Insbesondere, wenn Xanthophylle produziert werden sollen, da diese Verbindungen natürlicherweise vom Wildtyp der Blakeslea nicht synthetisiert werden.
Z. B. zur Herstellung von Phytoen mittels Fermentation von Blakesles trispora sind bisher zwei Methoden bekannt:
(i) Durch zufallsabhängige Mutagenese mit chemischen Agenzien wie MNNG können Mutanten erzeugt werden, in denen Phytoen nicht zu Lycopin und somit nicht weiter zu ß-Carotin umgesetzt werden kann (Mehta und Cerdä-Olmedo, 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:836-838).
(ii) Durch Zugabe von Inhibitoren des Enzyms Phytoendesaturase wie z.B. Diphenylamin und Zimtalkohol kann die weitere Umsetzung von Phytoen blockiert werden, so dass es sich anreichert (Cerdä- Olmedo, 1989, In: E. Vandamme, ed. Biotechnoiogy of vitamin, growth factorand pigment production. London: Eisevier Applied Science, S. 27-42).
Die genannten Methoden zur Herstellung von Phytoen mit Blakeslea trispora weisen jedoch eine Reihe von Nachteilen auf.
Die zufallsabhängie Mutagenese betrifft in der Regel nicht nur die Gene der Carotinoidbiosynthese zur weiteren Umsetzung von Phytoen, sondern auch weitere wichtige Gene. Daher sind Wachstum und Syntheseleistung der Mutanten oft beeinträchtigt. Die Erzeugung z. B. von Phytoenüberpro- duzenten durch zufallsabhängige Mutagenese von Lycopinüberproduzen- ten oder ß-Carotinüberproduzenten ist daher entweder nicht oder nur mit großem experimentellem Aufwand zu erreichen. Die Zugabe von Inhibitoren verursacht eine Erhöhung der Produktionskosten und gegebenenfalls eine Verunreinigung des Produktes. Daneben kann das Zellwachstum durch den Inhibitor beeinträchtigt werden, so dass die Produktion von Carotinoiden oder deren Vorstufen, insbesondere Phytoen eingeschränkt wird.
Durch eine gentechnische Veränderung könnten die oben genannten Nachteile der zufallsabhängigen Mutagenese und der Inhibitorzugabe vermieden werden.
Allerdings sind bisher keine Methoden zur gentechnischen, d. h. gezielten gentechnischen Veränderung von Blakeslea, insbesondere Blakeslea trispora bekannt.
Als Methode zur Herstellung von gentechnisch veränderten Pilzen wurde in einigen Fällen die Agrobacterium-vermittelte Transformation erfolgreich eingesetzt. So sind z. B. folgende Organismen durch Agrobakterien transformiert worden: Saccharomyces cerevisiae (Bundock et al., 1995, EMBO Journal, 14:3206-3214), Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani pisi, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, Pleurotus ostreatus, Fusarium graminearum (van der Toorren et al., 1997, EP 870835), Agraricus bispo- rus, Fusarium venenatum (de Groot et al., 1998, Nature Biotechnol. 16:839-842), Mycosphaerella graminicola (Zwiers et al. 2001, Curr. Ge- net. 39:388-393), Glarea lozoyensis (Zhang et al., 2003, Mol. Gen. Ge- nomics 268:645-655), Mucor miehei (Monfort et al. 2003, FEMS Microbio- logy Lett. 244:101 - 106).
Von Interesse ist besonders eine homologe Rekombination, bei der zwi- sehen der einzuführenden DNA und der Zeil-DNA möglichst viele Sequenzhomologien bestehen, so dass eine ortsspezifische Einführung bzw. Ausschaltung von genetischer Information im Genom des Empfängerorganismus möglich ist. Andernfalls wird die Spender-DNA durch illegitime bzw. nicht-homologe Rekombination ins Genom des Empfängerorganis- mus integriert, was nicht ortsspezifisch erfolgt.
Eine durch Agrobacterium vermittelte Transformation und anschließende homologe Rekombination der transferierten DNA wurde bisher bei folgenden Organismen nachgewiesen: Aspergillus awamori (Gouka et al. 1999, Nature Biotech 17:598-601), Glarea lozoyensis (Zhang et al., 2003, Mol. Gen. Genomics 268:645-655), Mycosphaerella graminicola ((Zwiers et al. 2001 , Curr. Genet. 39:388-393).
Als weitere Methode zur Transformation von Pilzen ist die Elektroporation bekannt. Die integrative Transformation von Hefe durch Elektroporation wurde von Hill, Nucl. Acids. Res. 17:8011 gezeigt. Für filamentöse Pilze wurde die Transformation durch Chakaborty und Kapoor beschrieben (1990, Nucl. Acids. Res. 18:6737).
Eine „biolistische" Methode, d.h. die Übertragung von DNA durch Be- schuss von Zeilen mit DNA-beladenen Partikeln wurde beispielsweise für Trichoderma harzianum und Gliocladium virens beschrieben (Lorito et al. 1993, Curr. Genet. 24:349-356). Diese Methoden konnten bisher jedoch nicht erfolgreich zur gezielten genetischen Veränderung von Blakeslea und insbesondere Blakeslea trispora. eingesetzt werden.
Eine besondere Schwierigkeit bei der Herstellung von gentechnisch veränderten Blakeslea und Blakeslea trispora, ist die Tatsache, dass deren Zellen in allen Stadien des sexuellen und des vegetativen Zellzyklus mehrkernig sind. In Sporen von Blakeslea trispora Stamm NRRL2456 und NRRL2457 wurden z. B. im Durchschnitt 4,5 Kerne pro Spore nachgewie- sen (Metha und Cerda-Olmedo, 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:836- 838). Dies hat zur Folge, dass die gentechnische Veränderung in aller Regel nur in einem oder wenigen Kernen vorliegt, die Zellen also hetero- karyotisch sind.
Sollen die genetisch veränderten Blakeslea, insbesondere Blakeslea trispora zur Produktion eingesetzt werden, so ist es insbesondere bei einer Gendeletion wichtig, dass in den Produktionsstämmen die gentechnische Veränderung in allen Kernen vorliegt, so dass eine stabile und hohe Syntheseleistung ohne Nebenprodukte möglich wird. Die Stämme müssen folglich in Bezug auf die gentechnische Veränderung homokaryotisch sein.
Lediglich für Phycomyces blakesleeanus ist ein Verfahren beschrieben worden, um homokaryotische Zellen zu erzeugen (Roncero et al., 1984, Mutat. Res. 125:195). Durch Zugabe des mutagenen Agens MNNG (N- Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) werden nach dem dort beschriebenen Verfahren Kerne in den Zellen eliminiert, so dass statistisch eine gewisse Anzahl von Zellen mit nur noch einem funktionellem Kern vorliegt. Die Zellen werden dann einer Selektion unterzogen, in der nur einkernige Zellen mit einem rezessiven Selektionsmarker zu einem Mycel auswachsen kön- nen. Die Nachkommen dieser selektierten Zellen sind mehrkernig und homokaryotisch. Ein rezessiver Selektionsmarker für Phycomyces blakes- leanus ist z. B. dar. dar+-Stämme nehmen das toxische Riboflavin-Analog 5-Carbon-5-deazariboflavin auf; dar"-Stämme dagegen nicht (Delbrück et al. 1979, Genetics 92:27). Die Selektion von rezessiven Mutanten erfolgt durch Zugabe von 5-Carbon-5-deazaribof lavin (DARF).
Allerdings ist dieses Verfahren nicht für Blakeslea, insbesondere Blakeslea trispora bekannt und insbesondere nicht mit im Zusammenhang mit einer Transformation oder der Produktion von Carotinoiden oder deren Vorstufen beschrieben worden.
Auch die Isolierung aus natürlichen Quellen wird durchgeführt. Beispielsweise ist es für die Gewinnung von Phytoen bekannt, ein Gemisch aus Carotinoiden, Vitamin E und anderen Komponenten, welches auch Phytoen enthält, aus Tomaten, Karotten oder Palmöl usw. zu extrahieren. Problematisch ist hierbei die Trennung der einzelnen Carotinoide voneinander. So ist beispielsweise das Phytoen nach diesem Verfahren nicht in reiner Form erhältlich. Insbesondere ist die natürlich vorkommende Menge der Carotinoiden in den Pflanzen gering.
Fermentative Verfahren sind demgegenüber technisch verhältnismäßig einfach und basieren auf kostengünstigen Einsatzstoffen. Fermentative Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden können dann wirtschaftlich attraktiv und wettbewerbsfähig zur chemischen Synthese sein, wenn die Produktivität der bisherigen fermentativen Verfahren gesteigert würde oder neue Carotinoide auf Basis der bekannten Produktionsorganismen hergestellt werden könnten. Problematisch bei der fermentativen Herstellung von Carotinoiden sind allerdings die Aufarbeitungsverfahren, die nur geringe Mengen an hochreinen Carotinoiden bereitstellen. Zudem sind dafür meist aufwendige Vielschritt-Prozesse ggf. unter Verwendung großer Lö- sungsmittelmengen erforderlich. So fallen große Mengen Abfall an oder es muss ein hoher Aufwand zur Wiedeπ/erwertung (Recycling) betrieben werden.
Die Produktion von Carotinoiden durch verschiedene Mikroorganismen ist an sich bekannt. So ist z. B. in der WO 00/13654 A2 offenbart, ein Gemisch aus Phytoen und Phytofluen aus Algen der Art Dunaliella sp. zu extrahieren. Auch nach diesem Verfahren ist das Phytoen nicht in reiner Form erhältlich und muss von den anderen Produkten getrennt werden. Zudem handelt es sich um gentechnisch unveränderte Algen, deren Bio- synthese mittels eines hinzugefügten Inhibitors beeinflusst werden muss.
Blakeslea trispora als Produktionsorganismus für ß-Carotin ist auch aus der WO 98/03480 A1. bekannt. Hier werden ß-Carotin Kristalle aus Biomasse von Blakeslea trispora mittels Extraktion erhalten. Allerdings müs- sen in dem beschriebenen Verfahren große Mengen unterschiedlicher Lösungsmittel eingesetzt werden, um Kristalle mit hoher Reinheit durch mehrere Extraktions- und Waschschritte zu erhalten. Auch sind die erhaltenen Mengen ß-Carotin bezogen auf die eingesetzte Menge Biomasse klein.
Aus der WO 01/83437 A1 ist ein Verfahren zur Extraktion von Astaxanthin aus Hefe bekannt, bei dem die Kulturbrühe zur Sterilisation und zum Zellauf schluss mit Mikrowellenstrahlung behandelt wird. Der Zellaufschluss mittels Mikrowellenstrahlung ist danach nötig, um Astaxanthin aus Hefe zu gewinnen, ohne es dabei zu zerstören. Anschließend soll Astaxanthin mit- tels Methanol, Ethanol oder Aceton oder deren Mischungen extrahiert werden. Hierzu sind allerdings große Mengen Lösungsmittel (5 bis 20 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil Suspension) und ein langer Zeitraum (24h) erforderlich. Zudem sind keine Reinheiten des Astaxanthins angegeben und die erhaltenen Mengen sind klein. Versuche der Anmelderin und andere Veröffentlichungen bestätigen jedoch, dass eine Extraktion mittels Methanol oder Ethanol nicht durchführbar ist. Aus der WO 98/50574 ist ebenfalls die Isolierung von Carotinoid Kristallen aus Biomasse von Mikroorganismen bekannt, wobei hiernach im Gegensatz zur WO 01/83437 A1 Methanol, Ethanol, Aceton nur zum Entfernen von Lipiden aus der Biomasse d. h. .zum Waschen verwendet werden kann. Als Lösungsmittel zur Extraktion von Carotinoiden wird demnach Ethylacetat, Hexan oder ein Öl verwendet. Anschließend sind mehrere Reinigungs- und Waschschritte mit großen Mengen Ethanol und Wasser nötig, wobei lediglich eine Reinheit von 93,3 % bei einer Ausbeute von 35 % erreicht wird.
Die WO 03/038064 A2 beschreibt die fermentative Produktion von Lycopin durch Co-Kultivierung von mutierten. Blakeslea trispora Paarungstyp (-) und Blakeslea trispora Paarungstyp (+), die ohne Zusatz von Inhibitoren der Carotinoid Biosynthese Lycopin herstellen. Die Erzeugung der zur Fermentation eingesetzten Mutante wird durch unselektive chemische Mutation und anschließendes Screening vorgenommen. Die Aufarbeitung der Kulturbrühe erfolgt mittels Zellaufschluss und anschließender Reinigung mit unterschiedlichen wässrigen Medien mit verschiedenem Salzgehalt und pH-Wert und mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln wie Ethylacetat, Hexan und 1- Butanol zur Entfernung von Lipiden. Alternativ ist eine Extraktion mittels großer Mengen Ethylacetat beschrieben. Angaben zur Reinheit fehlen. Da Ethylacetat und Hexan Lösungsmittel für Lycopin sind, ist davon auszugehen, dass ein Teil des Lycopins herausgewaschen und so die theoretische mögliche Ausbeute verringert wird.
Auch aus der WO 01/55100 A1 ist die Isolierung von Carotinoiden allgemein bzw. ß-Carotin im speziellen aus der Biomasse durch Anwendung mehrerer Wasch- und Reinigungsschritte auf die aufgeschlossene Biomasse ohne Extraktion mittels Lösungsmittel beschrieben. Hierzu wird aufgeschlossene Biomasse von Blakeslea trispora mit Wasser, Lauge, Säure, Butanol und Ethanol gewaschen, so daß eine große Zahl unterschiedlicher Lösungsmittel und wässriger Medien verwendet werden muss. Die Reinheit des erhaltenen ß-Carotins beträgt 96 - 98 %. Angaben zur Ausbeute fehlen jedoch.
Die WO 97/36996 A2 beschreibt allgemein eine Verfahren zur Isolierung von Substanzen (u. a. Carotinoide) aus Mikroorganismen, wobei die Substanzen aus der Biomasse mittels Fest/Flüssig-Extraktion isoliert werden. Ein Zellaufschluß soll hierbei nicht nötig sein, jedoch muss die Biomasse zunächst durch Extrusion in eine granulierte, poröse Gestalt gebracht werden. Wie nur Carotinoide isoliert werden können und wie deren Reinheit bzw. Ausbeute ist, ist nicht angegeben. Der Rückstand der Extrusion kann anschließend als Futtermittelzusatz verwendet werden.
In allen oben beschriebenen Verfahren müssen große Mengen Lösungsmittel zur Extraktion eingesetzt werden, um die isolierte Menge an Carotinoid durch vollständige Extraktion zu erhöhen, und/oder große Mengen wässriger Medien zur Reinigung und zum Waschen eingesetzt werden. Dies bedingt hohe Kosten und aufwendige Maßnahmen zur Wiederverwendung bzw. ggf. Abfälle.
Zudem werden die nahrhafte Kulturbrühe und die darin enthaltene Biomasse nach Extraktion bzw. Isolierung der Carotinoide als Abfall behandelt. Die oben angegebenen Verfahren haben neben diesen vordergründi- gen Nachteilen einen entscheidenden weiteren Nachteil. Es ist nämlich danach notwendig, die Carotinoide den Nahrungsmitteln nachträglich zuzusetzen, d. h. sie sind nicht Bestandteil der Nahrungsmittel an sich bzw. nicht in ausreichender Menge. Von großem Vorteil wäre daher, wenn der Gehalt an Carotinoiden in den Nahrungsmitteln bereits durch die eigentli- chen Nahrungsmittel selbst gedeckt würde. Es ist ebenfalls nötig die Produktivitäten der bisher natürlicherweise produzierten Carotine und deren Vorstufen weiter zu steigern und die Herstellung weiterer Carotinoide, wie z. B. Xanthophylle besonders bevorzugt Astaxanthin oder Zeaxanthin und Phytoen oder Bixin zu ermöglichen, die von den Wildtypen der Mikroorganismen bisher nicht oder nur in sehr geringem Maße gebildet und isoliert werden können.
Aufgabe der Erfindung ist es gentechnisch veränderte Zellen von Blakes- lea-Stämmen, insbesondere Blakeslea trispora bereitzustellen, die Carotinoide oder deren Vorstufen, insbesondere Xanthophylle, besonders bevorzugt Astaxanthin oder Zeaxanthin und Phytoen oder Bixin produzieren. Zudem soll das Verfahren die Steigerung der Carotinoid-Produktivität der veränderten Zellen gegenüber den korrespondierenden Wildtypen erlau- ben. Ferner soll das Verfahren die Erzeugung neuer Zellen oder aus ihnen bestehendes Mycel erlauben, die sich für die Verwendung zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen eignen, die bisher nicht in wirtschaftlich interessanten Mengen aus den natürlich vorkommenden Pilzen gewinnbar waren, insbesondere Xanthophylle, besonders bevorzugt Asta- xanthin oder Zeaxanthin und Phytoen oder Bixin. Das Verfahren soll dabei eine gentechnische Veränderung von Blakeslea-Stämmen, insbesondere Blakeslea trispora möglich machen und die Herstellung homokaryotischer gentechnisch veränderter Produktions-Stämme erlauben.
Des weiteren soll das Verfahren die Herstellung weiterer Carotinoide, wie z. B. Xanthophylle, insbesondere Astaxanthin oder Zeaxanthin und Phytoen oder Bixin ermöglichen, die von den Wildtypen der Mikroorganismen bisher nicht oder nur in sehr geringem Maße gebildet und isoliert werden können. Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden aus gentechnisch veränderte Zellen von Blakes- lea-Stämmen, insbesondere Blakeslea trispora, zur Verfügung zu stellen, welches den Einsatz geringerer Lösungsmittelmengen erlaubt und im we- sentlichen ohne Abfälle auskommt und zudem eine hohe Reinheit und höhere Ausbeuten erlaubt.
In diesem Zusammenhang soll ein möglichst großer Anteil der im Fermenter vorliegenden Nährstoffe, sowohl Carotinoide als auch weitere sich in den Mikroorganismen befindende, verwertet werden. Somit ist es auch Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Carotinoid-haltigen Nahrungsmittels bereitzustellen, wobei das Nahrungsmittel selbst den Bedarf an Carotinoiden ohne Zusätze deckt. Insbesondere soll der Nährstoffgehalt der nach dem Verfahren erhältlichen Nahrungsmittel gegenüber den bisher erhältlichen Nahrungsmit- teln zumindest gleichwertig sein. Ferner soll das Verfahren die effiziente Verwertung der produzierten Carotinoide ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen mittels gentechnisch veränderten Organismen der Gattung Blakeslea gelöst, umfassend
(i) Transformation mindestens einer der Zellen,
(ii) ggf. Homokaryotisierung der aus (i) erhaltenen Zellen, so dass Zellen entstehen, in denen die Kerne in einem oder in mehreren genetischen Merkmalen alle gleichartig verändert sind und diese genetische Veränderung zur Ausprägung bringen, und
(iii) Selektion und Vermehrung der gentechnisch veränderten Zelle oder Zellen,
(iv) Kultivierung der gentechnisch veränderten Zellen, (v) Bereitstellung des von den gentechnisch veränderten Zellen produzierten Carotinoids oder der von den gentechnischen veränderten Zellen produzierten Carotinoidvorstufe.
Mit der erfindungsgemäßen Methode ist es möglich, Blakeslea gezielt und stabil genetisch zu verändern, um so Mycel aus Zellen mit einheitlichen Kernen zu gewinnen, das Carotinoide oder deren Vorstufen, insbesondere Xanthophylle, besonders bevorzugt Astaxanthin oder Zeaxanthin und Phytoen oder Bixin produziert. Vorzugsweise handelt es sich um Zellen von Pilzen der Art Blakeslea trispora. Die produzierten Carotinoiden oder deren Vorstufen sind dabei im wesentlichen frei von Verunreinigungen erhältlich und es können hohe Konzentrationen der Carotinoiden oder deren Vorstufen im Kulturmedium erzielt werden.
Unter Transformation wird die Übertragung einer genetischen Information in den Organismus, insbesondere Pilz verstanden. Darunter sollen alle dem Fachmann bekannten Möglichkeiten zur Einschleusung der Information, insbesondere DNA fallen, z. B. Beschuss mit DNA-beladenen Partikeln, Transformation mittels Protoplasten, Mikroinjektion von DNA, Elek- troporation, Konjugation oder Transformation kompetenter Zellen, Chemikalien oder Agrobakterien vermittelte Transformation. Als genetische Information werden ein Genabschnitt, ein Gen oder mehrere Gene verstanden. Die genetische Information kann z. B. mit Hilfe eines Vectors oder als freie Nukleinsäure (z. B. DNA, RNA) und auf sonstige Weise in die Zellen eingebracht und entweder durch Rekombination ins Wirtsgenom eingebaut oder in freier Form in der Zelle vorliegen. Besonders bevorzugt ist hierbei die homologe Rekombination.
Bevorzugte Transformationsmethode ist die Agrobacterium tumefaciens- vermittelte Transformation. Hierzu wird zunächst die zu transferierende Spender-DNA in einen Vektor eingefügt, der (i) flankierend zu der zu transferierenden DNA die T-DNA-Enden trägt, der (ii) einen Selektionsmarker enthält und der (iii) ggf. Promotoren und Terminatoren für die Genexpression der Spender-DNA aufweist. Dieser Vektor wird in einen Agro- bacterium-tumefaciens-Stamm übertragen, der ein Ti-Plasmid mit den vir- Genen enthält. vir-Gene sind für den DNA-Transfer in Blakeslea verantwortlich. Mit diesem Zwei-Vektor-System wird die DNA von Agrobacterium in Blakeslea übertragen. Hierzu werden die Agrobakterien zunächst in Gegenwart von Acetosyringone inkubiert. Acetosyringone induziert die vir- Gene. Anschließend werden Sporen von Blakeslea trispora zusammen mit den induzierten Zellen von Agrobacterium tumefaciens auf Acetosyringo- ne-haltigem Medium inkubiert und dann auf Medium übertragen, das eine Selektion der Transformanten, d.h. der gentechnisch veränderten Stämme von Blakeslea ermöglicht.
Der Begriff Vector wird in der vorliegenden Anmeldung als eine Bezeichnung für ein DNA-Molekül verwendet, das zum Einschleusen und ggf. zur Vermehrung von Fremd-DNA in eine Zelle dient (siehe auch "Vector" in Römpp Lexikon Chemie - CDROM Version 2.0, Stuttgart/New York: Ge- org Thieme Verlag 1999). In der vorliegenden Anmeldung sollen unter dem begriff "Vector" auch Plasmide, Cosmide usw. verstanden werden, die dem gleichen Zweck dienen.
Unter Expression wird in der vorliegenden Anmeldung die Übertragung einer genetischen Information ausgehend von DNA oder RNA in ein Gen- Produkt (hier vorzugsweise Enzyme zur Herstellung von Carotinoiden und insbesondere Xanthophylle, besonders bevorzugt Astaxanthin oder Zeaxanthin und Phytoen oder Bixin) verstanden und soll auch den Begriff der Überexpression beinhalten, womit eine verstärkte Expression gemeint ist, so dass ein bereits in der nicht transformierten Zelle (Wildtyp) hergestell- tes Genprodukt verstärkt produziert wird oder einen großen Teil des gesamten Gehaltes der Zelle ausmacht.
Unter gentechnische Veränderung soll die Einschleusung genetischer In- formation in einen Empfängerorganismus, so dass diese stabil exprimiert und bei der Zellteilung weitergegeben wird, verstanden werden. In diesem Zusammenhang ist die Homokaryotisierung, die Herstellung von Zellen, die nur einheitliche Kerne enthalten, d. h. Kerne mit gleichem genetischem Informationsgehalt.
Diese Homokaryotisierung ist nur notwendig, wenn die durch Transformation eingeführte genetische Information rezessiv vorliegt, d. h. nicht zur Ausprägung gelangt. Führt die Transformation aber zu einem dominanten Vorliegen der genetischen Information, d. h. wird sie ausgeprägt, so ist eine Homokaryotisierung nicht unbedingt nötig.
Vorzugsweise wird zur Homokaryotisierung eine Selektion der einkernigen Sporen durchgeführt. Von Natur aus ist ein geringer Anteil der Sporen von Blakeslea trispora einkernig, so dass sich diese ggf. nach spezifischer Markierung z. B. Färbung der Zellkerne aussortieren lassen. Dies wird bevorzugterweise mittels FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) anhand der geringeren Fluoreszenz der einkernigen Zellen durchgeführt.
Alternativ kann zur Homokaryotisierung zunächst eine Kernreduktion durchgeführt werden. Hierzu kann ein mutagenes Agens eingesetzt werden, wobei es sich insbesondere um N-Methyl-N'-nitro-nitrosoguanidin (MNNG) handelt. Auch die Verwendung von energiereichen Strahlen, wie UV- oder Röntgen-Strahlen zur Kernreduktion ist möglich. Anschließend kann zur Selektion auf das FACS Verfahren oder rezessive Selektions- marker zurückgegriffen werden. Unter Selektion wird die Auswahl von Zellen verstanden, deren Kerne dieselbe genetische Information beinhalten, d. h. Zellen die die gleichen Eigenschaften aufweisen, wie Resistenzen oder die Herstellung bzw. vermehrte Herstellung eines Produktes. In der Selektion werden neben der FACS Methode bevorzugt 5-Carbon-5-deazariboflavin (DARF) und Hy- gromycin (hyg) oder 5'-Fluororotat (FOA) und Uracil eingesetzt.
Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector kann derart gestaltet sein, dass die im Vector enthaltene genetische Information in das Genom min- destens einer Zelle integriert wird. Dabei kann genetische Information in der Zelle ausgeschaltet werden. Dies kann direkt, d. h. durch eine Deletion erfolgen. Es ist aber auch möglich, daß der in der Transformation (i) eingesetzte Vector derart ausgestaltet ist, dass die im Vector enthaltene genetische Information in der Zelle exprimiert wird, d. h. genetische Informa- tion eingefügt wird, die im korrespondierenden Wildtyp nicht vorhanden ist oder die durch die Transformation verstärkt bzw. überexprimiert wird und deren Produkt das Gen ausschaltet. Die eingeführte genetische Information kann aber auch indirekt eine genetische Information in der Zelle ausschalten, z. B. durch Produktion eines Inhibitors.
Der eingesetzte Vector enthält genetische Informationen oder Teile der genetischen Information zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen, insbesondere Carotinen oder Xanthophyllen oder deren Vorstufen. Der eingesetzte Vector enthält vorzugsweise genetische Informationen zur Herstellung von Astaxanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, ß- Carotin, Andonixanthin, Adonirubin, Canthaxanthin, 3-Hydroxyechinenon, 3-Hydroxyechinenon, Lycopin, Lutein, Bixin oder Phytoen. Ganz besonders bevorzugt enthält der Vector Informationen zur Herstellung von Bixin, Phytoen, Canthaxanthin, Astaxanthin oder Zeaxanthin. Der Vector kann beliebige genetische Informationen zur genetischen Veränderungen von Organismen der Gattung Blakeslea enthalten.
Unter „genetischer Information" werden vorzugsweise Nukleinsäuren ver- standen, deren Einbringung in den Organismus der Gattung Blakeslea zu einer genetischen Veränderung in Organismen der Gattung Blakeslea, also beispielsweise zu einer Verursachung, Erhöhung oder Reduzierung von Enzymaktivitäten im Vergleich zum Ausgangsorganismus führen.
Der Vector kann beispielsweise genetische Information zur Herstellung lipophiler Substanzen enthalten wie z.B. Carotinoide und deren Vorstufen, Phospholipide, Triacylglyceride, Steroide, Wachse, fettlösliche Vitamine, Provitamine und Cofaktoren oder genetische Information zur Herstellung hydrophiler Substanzen wie z.B. Eiweiße, Aminosäuren, Nukleotide und wasserlösliche Vitaminen, Provitamine und Cofaktoren.
Bevorzugterweise enthält der eingesetzte Vector genetische Informationen zur Herstellung von Carotinoiden oder Xanthophyllen oder deren Vorstufen.
Bevorzugterweise enthält der Vektor genetische Information, die eine Lokalisierung der Carotinoidbiosynthese-Enzyme in dem Zellkompartiment bewirkt, in dem die Carotinoidbiosynthese stattfindet.
Besonders bevorzugt sind genetische Informationen zur Herstellung von Astaxanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, Andonixanthin, Adonirubin, Canthaxanthin, 3- und 3'-Hydroxyechinenon, Lycopin, Lutein, ß-Carotin, Phytoen und/oder Phytofluen. Ganz besonders bevorzugt sind genetische Informationen zur Herstellung von Phytoen, Bixin, Lycopin, Zeaxanthin, Canthaxanthin und/oder Astaxanthin. Entsprechend werden in einer bevorzugten Variante der Erfindung Organismen hergestellt und kultiviert, die über eine erhöhte Syntheserate für Zwischenprodukte der Carotinoidbiosynthese verfügen und folglich eine erhöhte Produktivität für Endprodukte der Carotinoidbiosynthese aufweisen. Zur Erhöhung der Syntheserate für Zwischenprodukte der Carotinoidbiosynthese werden insbesondere die Aktivitäten der Enzyme 3- Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMG-CoA-
Reduktase), Isopentenylpyrophosphat-Isomerase und Geranylpy- rophosphatsynthase gesteigert.
Entsprechend werden in einer besonders bevorzugten Variante der Erfindung Organismen hergestellt und kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität aufweisen.
Unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer HMG- CoA-Reduktase (3-Hydroxy-3~Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduktase) verstanden.
Unter einer HMG-CoA-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl- Coenzym-A in Mevalonat umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A bzw. gebildete Menge Mevalonat verstanden.
Bei einer erhöhten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase die umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl- Glutaryl-Coenzym-A bzw. die gebildete Menge Mevalonat erhöht. Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, besonders bevorzugt mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität des Wildtyps.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der HMG- CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase indem man ein Nukleinsäurekon- strukt, enthaltend eine Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase in den Organismus einbringt, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp, einer reduzierten Regulation unterliegt.
Unter einer reduzierten Regulation verglichen mit dem Wildtyp, wird eine im Vergleich zum vorstehend definierten Wildtyp verringerte, vorzugsweise keine Regulation auf Expressions- oder Proteinebene verstanden.
Die reduzierte Regulation kann vorzugsweise durch einen im Nukleinsäu- rekonstrukt mit der kodierenden Sequenz funktioneil verknüpften Promotor erreicht werden, der in dem Organismus verglichen mit dem Wildtyp- Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt.
Beispielsweise unterliegen die Promotoren ptefl aus Blakeslea trispora und pgpdA aus Aspergillus nidulans nur einer reduzierten Regulation und sind daher insbesondere als Promotoren bevorzugt. Diese Promotoren zeigen eine annähernd konstitutive Expression in Blakeslea trispora, so dass die transkriptioneile Regulation nicht mehr über die Intermediate der Carotinoidbiosynthese abläuft.
Die reduzierte Regulation kann in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dadurch erreicht werden, dass man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, ortholo- gen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Nukleinsäure, die nur den katalytischen Bereich der HMG-CoA-Reduktase kodiert (trunkierte (t- )HMG-CoA-Reduktase). Die für die Regulation verantwortliche Membran- Domäne fehlt. Die verwendete Nukleinsäure unterliegt somit einer redu- zierten Regulation und führt zu einer Erhöhung der Genexpression der HMG-CoA-Reduktase.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man Nukleinsäuren in Blakeslea trispora ein, welche die Sequenz SEQ ID. NO. 75 enthal- ten.
Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Orga- nismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Homologievergleiche der Sequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID. NO. 75 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID. NO. 75 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR- Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die reduzierte Regulation dadurch erreicht, dass man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, orthologen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt und einen Promotor verwendet, der in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp-Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt.
Entsprechend wird in einer bevorzugten Variante der Erfindung durch die Transformation die Genexpression der Phytoendesaturase ausgeschaltet, so dass das von den Organismen produzierte Phytoen gewonnen werden kann. Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector umfasst daher in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codierend für ein Fragment des Gens der Phytoendesaturase, insbesondere carB aus Blakeslea trispora mit der SEQ ID NO: 69.
Entsprechend wird in einer bevorzugten Variante der Erfindung durch Transformation die Genexpression der Lycopincyclase ausgeschaltet, so dass das von den Organismen produzierte Lycopin gewonnen werden kann. Der in der Transformation eingesetzte Vektor umfasst daher in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codierend für ein Fragment des Gens der Lycopincyclase, insbesondere carR aus Blakeslea trispora.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Organismen der Gattung Blakeslea beispielsweise dadurch in die Lage versetzt Xanthophylle, wie beispielsweise Canthaxanthin, Zeaxanthin oder Astaxanthin herzustellen, Bixin oder Phytoen, indem in den genetisch veränderten Organismen der Gattung Blakeslea im Vergleich zum Wildtyp eine Hydroxylase- Aktivität und/oder Ketolase-Aktivität verursacht wird.
Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector enthält also in einer weiteren, bevorzugten Variante der Erfindung genetische Informationen, die nach Expression eine Ketolase- und/oder Hydroxylase-Aktivität entfalten, so dass die Organismen Zeaxanthin oder Astaxanthin produzieren.
Unter Ketolase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Ketolase verstanden.
Unter einer Ketolase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-lonon-Ring von Carotinoiden eine Keto-Gruppe einzuführen.
Insbesondere wird unter einer Ketolase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Canthaxanthin umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Ketolase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Ketolase umgesetzte Menge ß-Carotin bzw. gebildete Menge Canthaxanthin verstanden.
Unter dem Begriff "Wildtyp" wird erfindungsgemäß der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus der Gattung Blakesleaa verstanden.
Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff Organismus" der Aus- gangsorganismus (Wildtyp) der Gattung Blakesleaa oder ein erfindungs- gemäßer, genetisch veränderter Organismus der Gattung Blakesleaa oder beides verstanden werden.
Vorzugsweise wird unter "Wildtyp" für die Verursachung der Ketolase- Aktivität und für die Verursachung der Hydroxylase-Aktivität jeweils eine Referenz Organismus verstanden.
Dieser Referenzorganismus der Gattung Blakeslea ist Blakeslea trispora ATCC 14271 oder ATCC 14272, die sich lediglich im Paarungstyp unter- scheiden.
Die Bestimmung der Ketolase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismen der Gattung Blakesleaa und in Wildtyp- bzw. Referenzorganismen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Die Bestimmung der Ketolase-Aktivität in Organismen der Gattung Blakeslea erfolgt in Anlehnung an die Methode von Frazer et al., (J. Biol. Chem. 272(10): 6128-6135, 1997). Die Ketolase-Aktivität in Extrakten wird mit den Substraten beta-Carotin und Canthaxanthin in Gegenwart von Lipid (Sojalecithin) und Detergens (Natriumcholat) bestimmt. Substrat/Produkt- Verhältnisse aus den Ketolase-Assays werden mittels HPLC ermittelt.
Der erfindungsgemäße genetisch veränderte Organismus der Gattung Blakesleaa weist in dieser, bevorzugten Ausführungsform im Vergleich zum genetisch nicht veränderten Wildtyp eine Ketolase-Aktivität auf und ist somit vorzugsweise in der Lage, transgen eine Ketolase zu exprimieren.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verursachung der Ketolase-Aktivität in den Organismen der Gattung Blakesleaa durch Ver- ursachung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase. In dieser bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verursachung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase vorzugsweise durch Einbringen von Nukleinsäuren, die Ketolasen kodieren in die Aus- gangsorganismus der Gattung Blakesleaa.
Dazu kann prinzipiell jedes Ketolase-Gen, also jede Nukleinsäuren die eine Ketolase codiert verwendet werden.
Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können beispielsweise eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.
Bei genomischen Ketolase-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das der Wirtsorganismus der Gattung Blakesleaa nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Ketolase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.
Beispiele für Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase und die entsprechenden Ketolasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können sind beispielsweise Sequenzen aus:
Haematoccus pluvialis, insbesondere aus Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Accession NO: X86782; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 11 , Protein SEQ ID NO: 12),
Haematoccus pluvialis, NIES-144 (Accession NO: D45881; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 13, Protein SEQ ID NO: 14), Agrobacterium aurantiacum (Accession NO: D58420; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 15, Protein SEQ ID NO: 16),
Alicaligenes spec. (Accession NO: D58422; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 17, Protein SEQ ID NO: 18),
Paracoccus marcusii (Accession NO: Y15112; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 19, Protein SEQ ID NO: 20).
Synechocystis sp. Strain PC6803 (Accession NO: NP442491 ; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 21, Protein SEQ ID NO: 22).
Bradyrhizobium sp. (Accession NO: AF218415; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 23, Protein SEQ ID NO: 24).
Nostoc sp. Strain PCC7120 (Accession NO: AP003592, BAB74888; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 25, Protein SEQ ID NO: 26),
Nostoc punctiforme ATTC 29133, Nukleinsäure: Acc.-No. NZ_AABC01000195, Basenpaar 55,604 bis 55,392 (SEQ ID NO: 27); Protein: Acc.-No. ZP_00111258 (SEQ ID NO: 28) (als putatives Protein annotiert),
Nostoc punctiforme ATTC 29133, Nukleinsäure: Acc.-No. NZ_AABC01000196, Basenpaar 140,571 bis 139,810 (SEQ ID NO: 29), Protein: (SEQ ID NO: 30) (nicht annotiert),
Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, lassen sich bei- spielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen und insbesondere mit den Sequenzen SEQ ID NO: 12, 26 und/oder 33 leicht auffinden.
Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO: 12, 26 und/oder 30 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich be- kannter Weise leicht auffinden.
Die Hybridisierung kann unter moderaten (geringe Stringenz) oder vorzugsweise unter stringenten (hohe Stringenz) Bedingungen erfolgen.
Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit 2X SSC bei 50_C) und solchen mit hoher Stringenz (mit 0.2X SSC bei 50_C, bevorzugt bei 65_C) (20X SSC: 0,3 M Na- triumcitrat, 3 M Natriumchlorid, pH 7.0).
Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von moderaten Bedingungen bei Raumtemperatur, 22°C, bis zu stringenten Bedingungen bei 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS ein- gesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt.
Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:
(1) Hybridiserungsbedingungen mit zum Beispiel (i) 4X SSC bei 65°C, oder
(ii) 6X SSC bei 45°C, oder
(iii) 6X SSC bei 68°C, 100 mg/ml denaturierter Fischsperma-DNA, oder (iv) 6X SSC, 0.5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oder
(v) 6XSSC, 0.5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50 % Formamid bei 42°C, oder (vi) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, oder (vii) 50 % (vol/vol) Formamid, 0.1 % Rinderserumalbumin, 0.1 % Ficoll, 0.1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.5, 750 mM NaCI, 75 mM Natriumeitrat bei 42°C, oder (viii) 2X oder 4X SSC bei 50°C (moderate Bedingungen), oder (ix) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (moderate Be- dingungen).
(2) Waschschritte für jeweils 10 Minuten mit zum Beispiel
(i) 0.015 M NaCI/0.0015 M Natriumcitrat/0.1 % SDS bei 50°C, oder
(ii) 0.1X SSC bei 65°C, oder (iii) 0.1X SSC, 0.5 % SDS bei 68°C, oder
(iv) 0.1X SSC, 0.5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C, oder (v) 0.2X SSC, 0.1 % SDS bei 42°C, oder
(vi) 2X SSC bei 65°C (moderate Bedingungen).
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismen der Gattung Blakeslea bringt man Nukleinsäuren ein, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 12 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, be- vorzugt mindestens 70%, 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, insbesondere 91%, 92%; 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 12 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.
Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die wie vorstehend beschrieben durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 12 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder De- letion von Aminosäuren abgewandelt wurde.
In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man Nukleinsäuren ein die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 26 oder eine von dieser Se- quenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, bevorzugt mindestens 70%, 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, insbesondere 91%, 92%; 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 26 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist. Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ke- tolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 26 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde.
In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man Nukleinsäuren ein die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 30 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, 40 %, 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, 70 %, bevor- zugter mindestens 80 %, 85 % besonders bevorzugt mindestens 90 %, insbesondere 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 ■ %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO 30 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.
Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 30 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder De- letion von Aminosäuren abgewandelt wurde.
Unter dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchge- führt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gin durch Asn, Val durch He, Leu durch lle, Ser durch Thr.
Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.
Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptidkette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.
Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, ine. Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151- 1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Multiple alignment parameter:
Gap penalty 10
Gap length penalty 10'
Pairwise alignment parameter:
K-tuple 1 Gap penalty 3
Window 5
Diagonals saved 5
Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 20% auf Amino- säureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 12 oder 26 oder 30 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 12 oder 26 oder 30, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 20 %, bevorzugt 30%, 40%, 50%, besonders bevorzugt 60%, 70%, 80%, insbesondere 85%, 90, 95% aufweist.
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Blakesleaaspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene von Organismen der Gattung Blakesleaa leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nu- kleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 11 in die Organismus der Gattung ein.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 25 in die Orga- nismus der Gattung ein.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 29 in die Organismus der Gattung ein.
Alle vorstehend erwähnten Ketolase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector umfasst daher in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codie- rend für eine Ketolase, insbesondere der Ketolase Nostoc punctiforme aus mit der SEQ ID NO: 72.
Unter Hydroxylase-Aktivität die Enzymaktivität einer Hydroxylase verstanden.
Unter einer Hydroxylase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-lonon-Ring von Carotinoiden eine Hydroxy-Gruppe einzuführen.
Insbesondere wird unter einer Hydroxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin oder Canta- xanthin in Astaxanthin umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Hydroxyase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase umgesetzte Menge ß-Carotin oder Cantaxanthin bzw. gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin verstanden.
Bei einer erhöhten Hydroxylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase die umgesetzte Menge ß-Carotin oder Cantaxantin bzw. die gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin erhöht.
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität minde- stens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Hydroxylase-Aktivität des Wildtyps.
Die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismen und in Wildtyp- bzw. ReferenzOrganismen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Die Aktivität der Hydroxylase wird nach Bouvier et al. (Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328) in vitro bestimmt. Es wird zu einer bestimmten Menge an Organismenextrakt Ferredoxin, Ferredoxin-NADP Oxidoreduc- tase, Katalase, NADPH sowie beta-Carotin mit Mono- und Digalaktosyl- glyzeriden zugegeben.
Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, Keller, d'Harlingue und Ca- mara (Xanthophyll biosynthesis: molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L.; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328):
Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 0.250 ml Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7.6), 0.025 mg Ferredoxin von Spinat, 0.5 Einheiten Ferredoxin-NADP+ Oxidoreduktase von Spinat, 0.25 mM NADPH, 0.010 mg beta-Carotin (in 0.1 mg Tween 80 emulgiert), 0.05 mM einer Mischung von Mono- und Digalaktosylglyzeri- den (1:1), 1 Einheit Katalyse, 200 Mono- und Digalaktosylglyzeriden, (1:1), 0.2 mg Rinderserumalbumin und Organismenextrakt in unterschiedlichem Volumen. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei 30C inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden mit organischem Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform/Methanol (2:1) extrahiert und mittels HPLC bestimmt.
Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, d'Harlingue und Camara (Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition; Arch. Biochem. Biophys. 346(1) (1997) 53-64):
Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 250 DI Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7.6), unterschiedliche Mengen an Organismenextrakt, 20 nM Lycopin, 250 Dg an chromoplasti- därem Stromaprotein aus Paprika, 0.2 mM NADP+, 0.2 mM NADPH und 1 mM ATP. NADP/NADPH und ATP werden in 10 ml Ethanol mit 1 mg Tween 80 unmittelbar vor der Zugabe zum Inkubationsmedium gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 30C wird die Reaktion durch Zugabe von Chloroform/Methanol (2:1) beendet. Die in Chloroform extrahierten Reaktionsprodukte werden mittels HPLC analysiert.
Ein alternativer Assay mit radioaktivem Substrat ist beschrieben in Fräser und Sandmann (Biochem. Biophys. Res. Comm. 185(1) (1992) 9-15).
Die Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressions- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression von Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase gegenüber dem Wildtyp.
Die Erhöhung der Genexpression der Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Induzierung des Hydroxylase-Gens durch Aktivatoren oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Hydro- xylase-Genkopien, also durch Einbringen mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase in denb Organismus der Gattung Blakesleaa.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase in den Organismus der Gattung Blakesleaa.
Dazu kann prinzipiell jedes Hydroxylase-Gen, also jede Nukleinsäure, die eine Hydroxylase und jede Nukleinsäure, die eine ß-Cyclase codiert, verwendet werden.
Bei genomischen Hydroxylase-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechende Hydroxylase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nu- kleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.
Ein Beispiel für ein Hydroxylase-Gen ist eine Nukleinsäure, kodierend eine Hydroxylase aus Haematococcus pluvialis mit der Accession No. AX038729 (WO 0061764; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 31 , Protein: SEQ ID NO: 32), aus Erwinia uredovora 20D3 (ATCC 19321, Accession No. . D90087; Nukleinsäure: SEQ ID NO: 33, Protein: SEQ ID NO: 34) oder Hydroxylase aus Thermus thermophilus (DE 102 34 126.5) kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76.
sowie Hydroxylasen der folgenden Accession Nummern: |emb|CAB55626.1, CAA70427.1, CAA70888.1, CAB55625.1,
AF499108 , AF315289 , AF296158 , AAC49443.1, NP 94300.1, NP_200070.1 , AAG10430.1, CAC06712.1 , AAM88619.1, CAC95130.1 , AAL80006.1 , AF162276 /I, AA053295.1 , AAN85601.1 , CRTZ_ERWHE, CRTZ_PANAN, BAB79605.1 , CRTZ_ALCSP, CRTZ_AGRAU, CAB56060.1 , ZP_00094836.1 , AAC44852.1 , BAC77670.1 , NP_745389.1 , NP_344225.1, NP_849490.1, ZP_00087019.1, NP_503072.1, NP_852012.1 , NP_115929.1 , ZP_00013255.1
In den erfindungsgemäßen bevorzugten transgenen Organismen der Gattung Blakeslea liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegen- über dem Wildtyp mindestens ein weiteres Hydroxylase-Gen vor.
In dieser bevorzugten Ausführungsform weist die genetisch veränderte Organismus beispielsweise mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Hydroxylase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Hydroxylase auf.
Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Hydroxylase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 32, 34 oder kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 80 %, am bevorzugtesten mindestens 90%, insbesondere 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO: 32, 34 oder kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76 und die die enzymatische Eigenschaft einer Hydroxylase aufweisen.
Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologieverglei- ehe der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID. NO: 31 , 33 oder 76 leicht auffinden.
Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 31 , 33 oder 76 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Hydroxylase der Sequenz SEQ ID NO: 32, 34 oder kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76.
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Organismenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO: 31, 33 oder 76 in den Organismus ein.
Alle vorstehend erwähnten Hydroxylase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector umfasst daher in weiteren Ausführungsformen der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codierend für eine Hydroxlase, insbesondere eine Hydroxlase aus Haemato- coccus pluvialis mit der SEQ ID NO: 70 oder eine Hydroxlase aus Erwinia uredova mit der SEQ ID NO: 71. oder eine Hydroxylase aus Thermus thermophilus kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76.
Vorzugsweise wird durch die Transformation das Gen der Phytoendesaturase ausgeschaltet.
Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector enthält vorzugsweise ferner die Expression regelnde und unterstützende Bereiche, insbesondere Promotoren und Terminatoren.
Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector enthält vorzugsweise den gpd und/oder den ptefl Promotor und/oder den trpC Terminator. Diese haben sich zur Transformation der Blakeslea besonders bewährt. Auch der Einsatz von dem Fachmann geläufigen "inverted repeats" (IR, Römpp Lexikon der Biotechnologie 1992, Thieme Verlag Stuttgart, Seite 407 "In- vers repetitive Sequenzen") zur Regelung der Expression bzw. Transkription liegt im Rahmen der Erfindung. Vorteilhafterweise weist der im Vector eingesetzte gpd Promotor die Sequenz SEQ ID NO: 1 auf. Vorteilhafterweise weist der im Vector eingesetzte trpC Terminator die Sequenz SEQ ID NO: 2 auf. Vorteilhafterweise weist der im Vector eingesetzte ptefl Promotor die Sequenz SEQ ID NO: 35 auf.
Insbesondere werden dabei der gpd Promotor und der trpC Terminator aus Aspergillus nidulans und der ptefl Promotor aus Blakeslea trispora eingesetzt.
Insbesondere enthält der in der Transformation (i) eingesetzte Vector ein Resistenzgen. Bevorzugterweise handelt es sich um ein Hygromycin- Resistenzgen (hph), insbesondere eines aus E. coli. Dieses Resistenzgen hat sich bei dem Nachweis der Transformation und Selektion der Zellen als besonders geeignet herausgestellt.
Als Promotor für hph wird also bevorzugt p-gpdA, der Promotor der Glyce- rinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase aus Aspergillus nidulans genutzt. Als Terminator für hph wird bevorzugt t-trpC, der Terminator des Gens trpC, codierend für Anthranilatsynthasekomponenten aus Aspergillus nidulans genutzt.
Als Vectoren haben sich Abkömmlinge des pBinAHyg Vectors als beson- ders geeignet herausgestellt. Der zur Transformation eingesetzte Vector umfasst also bevorzugterweise die SEQ ID NO: 3. Hinzu kommen je nach gewünschtem Carotinoid oder dessen Vorstufe eine Sequenz codierend für eine Hydroxylase, Ketolase, Phytoendesaturase usw. wie diese zuvor beschrieben wurden. Die Vectoren umfassen also in einer Ausführugsform der Erfndung die Sequenz SEQ ID NO: 69 codierend für die Phytoendesaturase. Die Vectoren umfassen ferner in einer weiteren Ausführugsform der Erfndung die Sequenz SEQ ID NO: 72 codierend für eine Ketolase. Die Vectoren umfassen weiter in einer weiteren Ausführugsform der Erfndung die Sequenz SEQ ID NO: 70 oder 71 oder 76 codierend für eine Hydoxylase. Entsprechende Kombinationen der zuvorgenannten Sequenzen liegen ebenso im Rahmen der Erfindung. So umfasst der Vector in einer Ausführungsform sowohl eine Sequenz SEQ ID NO: 72 codierend für eine Ketolase als auch die Sequenz SEQ ID NO: 70 oder 71 oder 76 codierend für eine Hydoxylase und ermöglicht so die Herstellung von Astaxanthin.
Insbesondere sind Vectoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NO: 37 bis 51 und 62 im Rahmen der Erfindung einsetzbar.
Die genetisch veränderten Organismen können zur Produktion von Caroti- noiden, Xanthophyllen oder deren Vorstufen, insbesondere Bixin, Phytoen, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin verwendet werden. Auch können neue, im Wildtyp natürlicherweise nicht vorkommende Carotinoide durch Einbringung der entsprechenden genetischen Information von den gezielt genetisch veränderten Zellen bzw. dem durch sie gebilde- ten Mycel erzeugt und anschließend isoliert werden.
Die gentechnisch verändertem Zellen werden nach der Selektion kultiviert, so daß Carotinoiden oder deren Vorstufen bereitgestellt werden können.
Bevorzugterweise ist die Gewinnung von Carotinoiden oder deren Vorstufen mit den gezielt genetisch veränderten Zellen bzw. das durch sie gebildete Mycel möglich.
Die Kultivierung der Organismen unterliegt keinen Besonderheiten. Vor- teilhafterweise werden, insbesondere bei der Verwendung von Blakeslea trispora, entgegengesetzte Paarungstypen gemeinsam kultiviert, da dies zu besserem Wachstum und Produktion führt.
Wird die gentechnische Veränderung nur in Zellen eines der vorkommen- den Paarungstypen (bei Blakeslea trispora (+) oder (-)) durchgeführt, so wird zur Kultivierung der entsprechend andere, nicht veränderte Paarungstyp zugesetzt, da so eine gute Produktion der Carotinoide oder deren Vorstufen aufgrund der von dem zweiten, nicht veränderten Paarungstyp abgegebenen Substanzen (z. B. Trisporsäuren) zu erreichen ist. Vorteilhaft- erweise wird jedoch die gentechnische Veränderung in Zellen beider Paarungstypen vorgenommen und diese zusammen kultiviert. Hierdurch wird ein besonders gutes Wachstum und eine optimale Produktion der Carotinoiden oder deren Vorstufen erreicht. Auch eine (künstliche) Zugabe der Trisporsäuren ist möglich und sinnvoll.
Trisporsäuren sind Sexualhormone in Mucorales Pilzen, wie Blakeslea, welche die Bildung von Zygophoren und die Produktion von ß-Carotin stimulieren (van den Ende 1968, J. Bacteriol. 96:1298 - 1303, Austin et al. 1969, Nature 223:1178 - 1179, Reschke Tetrahedron Lett. 29:3435 - 3439, van den Ende 1970, J. Bacteriol. 101:423 -428).
Es können alle dem Fachmann geläufigen Medien eingesetzt werden, so weit sich diese zur Kultivierung der eingesetzten Organismen und deren Carotinoid Produktion eigenen. Insbesondere müssen bei Einsatz der GVO keine Carotinoidbiosynthese Inhibitoren eingesetzt werden. Die eingesetzten Medien beinhalten vorzugsweise Zusätze, wie eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, eine oder mehrere Stickstoffquellen, Mineralsalze und Thiamine. Bevorzugterweise werden Zusätze eingesetzt, wie sie aus der WO 03/038064 A2, Seite 4, Zeile 30 bis Seite 5 Zeile 7 hervorgehen. Besonders bevorzugt wird als Kohlenstoffquelle Glukose und als Stick- stoffquelle Asparagin, pflanzliche oder tierische Extrakte, wie Baumwoll- saatöl, Sojaöl, Baumwollsamenmehl oder Hefe-Extrakt zugesetzt.
Die Kultivierung kann entweder unter aeroben oder anaeroben Bedingun- gen durchgeführt werden. Auch eine gemischte, zunächst aerobe und anschließend anaerobe Kultivierung, wie sie aus der DE 101 30 323 bekannt ist, ist möglich. Temperatur und Luftfeuchtigkeit werden dabei jeweils zum optimalen Wachstum eingestellt. Bevorzugterweise liegt die Temperatur bei der Kultivierung zwischen ca. 20 und ca. 34 °C, insbesondere zwi- sehen ca. 26°C und ca. 28°C. Die Kultivierung kann ferner kontinuierlich, batch- oder satzweise erfolgen.
Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise bis zu einem Feststoffgehalt zwischen etwa 1 und etwa 20 %, bevorzugt 3 und 15 % und besonders be- vorzugt 4 und 11 %. Insbesondere ist wichtig dass die Kulturbrühe pumpbar bleibt, so dass sie in den nachfolgenden Verfahrensschritten ver- und bearbeitbar bleibt. Ist der Feststoffgehalt zu klein, so muss ein großer Aufwand bei der Auf konzentrierung oder Trocknung betrieben werden.
Die Kultivierung bzw. Fermentation kann in den üblichen Apparaturen durchgeführt werden. Hierzu kommen alle für die jeweils eingesetzten Mikroorganismen und deren Produkte geeigneten Apparaturen in Betracht. Insbesondere solche, wie sie aus dem Römpp Lexikon Biotechnologie (1992 Georg Thieme Verlag, Stuttgart) unter dem Stichwort "Bioreaktor" auf Seiten 123 - 126 angegeben sind. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Rührkesselreaktoren mit versch. Einbauten, Blasensäulen verschiedener Bauarten, etc.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellten Carotinoiden oder deren Vorstufen, insbesondere Bixin, Phytoen oder Xanthophylle, besonders bevorzugt Astaxanthin oder Zeaxanthin eignen sich besonders zur Herstellung von Zusätzen für Futter-, Nahrungs- und Nahrungsergän- zungsmittel, kosmetischen, pharmazeutischen oder dermatologischen Zubereitungen.
Die Bereitstellung des von den gentechnisch veränderten Zellen produzierten Carotinoids oder der von den gentechnischen veränderten Zellen produzierten Carotinoidvorstufe aus der Kultur der gentechnisch veränderten Mikroorganismen erfolgt nach zwei Varianten a) oder b), becorzugt ist auch eine Kombination aus a) und b);
a:
I) Abtrennung der Biomasse,
IA) ggf. Waschen der Biomasse mit einem Carotinoide nicht lösenden Lösungsmittel, insbesondere Wasser, IB) Sterilisation und Zellaufschluß der Biomasse,
IC) ggf. Trocknung und/oder homogene Verteilung und
II) partielle Extraktion der Carotinoide aus der aufgeschlossenen Biomasse mittels eines Carotinoide lösenden Lösungsmittels und Trennung des Lösungsmittels von der Biomasse, IIA)
1) Entfernung von Lösemittelresten aus der Carotinoid- haltigen Biomasse,
2) ggf. homogene Suspension der Biomasse mit einem Biomasse-Feststoffgehalt > 2 % und < 50 %, und 3) Trocknung der Biomasse bzw. Suspension zur Herstellung des Nahrungsmittels,
IIB)
1) Kristallisation der Carotinoide aus dem verwendeten Lösungsmittel und Isolierung der Carotinoid-Kristalle, insbe- sondere durch Filtration; oder b):
I) Homogene Suspendierung der Feststoffe der Kulturbrühe und
IIA) bei einem Feststoffgehalt der Kulturbrühe von > 2 %
1) ggf. Konzentration der Kulturbrühe auf einen Feststoffgehalt < 50 % und 2) Trocknung der Kulturbrühe zur Herstellung des Nahrungsmittels oder
IIB) bei einem Feststoffgehalt von < 2 % der Kulturbrühe, 1) Konzentration der Kulturbrühe auf einen Feststoffgehalt > 2 % und < 50 % und
2) Trocknung der Suspension zur Herstellung des Nahrungsmittels, oder
MC) unabhängig vom Feststoffgehalt der Kulturbrühe,
1) Abtrennung der Biomasse,
2) ggf. Waschen der Biomasse mit Carotinoide nicht lösenden Lösungsmitteln, insbesondere Wasser, 3) Sterilisation und Zellaufschluß,
4) ggf. Trocknung und homogene Verteilung,
5) partielle Extraktion der Carotinoide aus der Biomasse mittels eines Carotinoide lösendes Lösungsmittels,
5a) Abtrennung der Carotinoid-haltigen Biomasse vom Carotinoid-haltigen Lösungsmittel, 5b) Entfernung von Lösemittelresten aus der Biomasse und
5c) Trocknung der Biomasse zur Herstellung des Nahrungsmittels, 6) Kristallisation der Carotinoide aus dem in 5a) verwendeten Lösungsmittel und Isolierung der Carotinoid- Kristalle, insbesondere durch Filtration.
Die erfindungsgemäße Bereitstellung des von den gentechnisch veränderten Zellen produzierten Carotinoids oder der von den gentechnischen veränderten Zellen produzierten Carotinoidvorstufe aus der Kultur der gentechnisch veränderten Mikroorganismen erfolgt nach zwei Varianten a) oder b) ermöglicht die gleichzeitige Herstellung von zwei Produkten.
Durch die erfindungsgemäße Kombination der Herstellung von zwei Produkten, insbesondere bei der Bereitstellung gemäß Variante a), nämlich dem mindestens einem Carotinoid und dem Carotinoid-haltigem Nahrungsmittel ist keine vollständige Extraktion der Carotinoide aus der Bio- masse nötig, so dass der Aufwand bei der Extraktion geringer ausfällt. Das Carotinoid muss trotz vollständiger Verwertung nur partiell extrahiert werden, ohne dass es zu Produktverlusten kommt. Dies bedingt geringere Lösungsmittelmengen und damit einhergehend einen geringeren Aufwand bei den Maßnahmen zu deren Wiederverwendung. Zudem werden Abfälle weitestgehend vermieden, da die Biomasse nicht als Abfall anfällt, sondern zum hochwertigen Nahrungsmittel weiten/erarbeitet wird. Somit ergeben sich geringere Kosten für die Verfahren durch Ausnutzen von Synergien.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Bereitstellung gemäß Variante b) erhältliche Nahrungsmittel enthalten also bereits nach der Herstel- lung große Mengen an Carotinoiden, die nicht zugesetzt werden müssen. Dadurch, dass das Nahrungsmittel neben dem mindestens einen Carotinoid auch Blakeslea trispora enthält ist sein Nährstoffgehalt zudem gesteigert. Insbesondere ist der Nährstoffgehalt nach den bevorzugten Altemati- ven IIA und IIB stark gesteigert, da es neben dem mindestens einen Carotinoid und Blakeslea trispora zusätzlich alle Medienbestandteile der Fermentation enthält. Ferner benötigt das Verfahren keine zusätzlichen, aufwendigen Aufarbeitungs- und Herstellungsschritte, sondern die homogenisierte und ggf. entwässerte Blakeslea trispora-haltige Kulturbrühe kann direkt ohne Umwege zur Herstellung des Nahrungsmittels getrocknet werden. Es fallen demnach praktisch keine Abfälle an, abgesehen vom wäss- rigem Medium bei der Alternative IIB, welches jedoch unproblematisch in einer Kläranlage gereinigt werden kann. Zusätzlich wird in allen drei Alternativen die gesamte Produktionsmenge Carotinoide ohne oder mit nur marginalen Verlusten verwertet, da gemäß IIA und IIB keine verlustreichen Trenn- bzw. Aufarbeitungsschritte vorgenommen werden müssen. Bei der Alternative IIIC wird ebenfalls die gesamte Produktionsmenge Carotinoide ohne oder mit nur marginalen Verlusten verwertet, da ein Teil in der Biomasse zum Nahrungsmittel verarbeitet wird und der andere Teil zur Ge- winnung reiner Carotinoide extrahiert wird. Durch die erfindungsgemäße Kombination der Herstellung von zwei Produkten gemäß IIC, nämlich dem Carotinoid-haltigem Nahrungsmittel und den Carotinoiden an sich, ist vorteilhaft, dass wiederum im wesentlichen keine Abfälle entstehen und eine vollständige Extraktion der Carotinoide aus der Biomasse unnötig ist, so dass sonst bei der Extraktion anfallende Aufwand geringer ausfällt. Das oder die wertvollen Carotinoide müssen trotz vollständiger Verwertung nur partiell extrahiert werden, ohne dass es zu Produktverlusten kommt. Dies bedingt geringere Lösungsmittelmengen und damit einhergehend einen geringeren Aufwand bei den Maßnahmen zu deren Wiederverwendung. Zudem werden Abfälle weitestgehend vermieden, da die Biomasse nicht als Abfall anfällt, sondern zum hochwertigen Nahrungsmittel verarbeitet wird. Somit ergeben sich geringere Kosten für die Verfahren durch Ausnutzen von Synergien.
Unter "hochrein" soll in der vorliegenden Anmeldung eine Reinheit des mindestens einen Carotinoids von mindestens 95%, bevorzugt > 95%, vorzugsweise > 96%, besonders bevorzugt > 97%, ganz besonders bevorzugt > 98%, höchst bevorzugt > 99% verstanden werden.
Als nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbare Carotinoide kommen alle natürlichen und künstlichen Carotine und Xanthophylle in Betracht. Insbesondere ist das mindestens eine Carotinoid aus der Gruppe bestehend aus Astaxanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, Andonixanthin, Adonirubin, Canthaxanthin, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Lycopin, ß-Carotin, Lutein, Phytofluen, Bixin und Phytoen ausgewählt. Bevorzugterweise handelt es sich um Astaxanthin oder Zeaxanthin. Die Carotinoide können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einzeln oder als Gemische von zwei oder mehrerer der zuvor genannten Carotinoide erhalten werden. Insbesondere bei Einsatz der weiter unten angegebenen gentechnisch veränderten Organismen (GVO) kann das oder können die Carotinoide gezielt hergestellt werden.
Als Nahrungsmittel werden Zusammensetzungen angesehen, die der Ernährung dienen. Darunter fallen auch Zusammensetzungen für die Ergänzung der Ernährung. Insbesondere werden als Nahrungsmittel Tierfutter- mittel und Tierfutterergänzungsmittel angesehen.
Nach der Kultivierung kann, gemäß Variante a) der Bereitstellung, die Biomasse von der Kulturbrühe abgetrennt. Hierzu können alle dem Fachmann geläufigen und üblicherweise einsetzbaren Methoden zur fest/flüssig-Trennung eingesetzt werden. Hierunter fallen insbesondere die mechanischen Verfahren, wie Filtration und Zentrifugation, die auf der Ausnutzung von Schwerkraft, Zentrifugalkraft, Druck oder Vakuum beruhen. Zu den einsetzbaren Verfahren und Apparaten gehören daneben u. a. Querstromfiltration bzw. Mebrantechniken wie Osmose, umgekehrte Osmose, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration, Kuchenfiltrationsver- fahren (z.B. mittels Pressfilterautomaten, (Membran-, Rahmen- oder Kammer-)Filterpressen, (Rühr-)drucknutschen, Saugnutschen, (Vakuum- )bandfiltern, (Vakuum-)Trommelfiltem, Drehfiltern, Kerzenfiltern), Zentrifu- gationsverfahren mittels kontinuierlich oder diskontinuierlich betriebener Zentrifugen oder Filterzentrifugen (z.B. Stülpfilterzentrifugen, Schälzentri- fugen, Schubzentrifugen, Siebschneckenzentrifugen, Gleitzentrifugen, Separatoren oder Dekantern), Verfahren unter Ausnutzung der Schwerkraft wie Flotation, Sedimentation, Sink-Schwimm-Aufbereitung und Klären. Bevorzugterweise erfolgt die Abtrennung der Biomasse von der Kulturbrühe durch Zentrifugation mittels eines Dekanters oder durch Filtration, mit- tels einer Mebranfiltrationseinheit durchgeführt.
In dem zweiten Schritt der Bereitstellung nach Variante b) wird eine homogen verteilte Suspension der Feststoffe in der Kulturbrühe erzeugt. Hierzu können alle dem Fachmann geläufigen und üblicherweise einsetz- baren Methoden verwendet werden. Insbesondere kommen dazu Disper- giergeräte, wie ein Ultra-Turrax® (im Labormaßstab) zum Einsatz. Ein Zellaufschluss ist nicht notwendig, kann aber vorgenommen werden.
Falls notwendig, kann die Kulturbrühe entwässert werden, um einen ge- eigneten Feststoffgehalt zwischen > 2 % und < 50 % zu erreichen. Hierzu können alle dem Fachmann geläufigen und üblicherweise einsetzbaren Methoden zur fest/flüssig-Trennung eingesetzt werden. Hierunter fallen insbesondere die mechanischen Verfahren, wie Filtration und Zentrifugation, die auf der Ausnutzung von Schwerkraft, Zentrifugalkraft, Druck oder Vakuum beruhen. Zu den einsetzbaren Verfahren und Apparaten gehören daneben u. a. Querstromfiltration bzw. Mebrantechniken wie Osmose, umgekehrte Osmose, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration, Kuchenfiltrationsverfahren (z.B. mittels Pressfilterautomaten, (Membran-, Rahmen- oder Kammer-)Filterpressen, (Rühr-)drucknutschen, Saugnutschen, (Vakuum-)bandfiltern, (Vakuum-)Trommelfiltern, Drehfiltern, Kerzenfiltern), Zentrifugationsverfahren mittels kontinuierlich oder diskontinuierlich betriebener Zentrifugen oder Filterzentrifugen (z.B. Stülpfilterzentrifugen, Schälzentrifugen, Schubzentrifugen, Siebschneckenzentrifugen, Gleitzentrifugen, Separatoren oder Dekantern), Verfahren unter Ausnutzung der Schwerkraft wie Flotation, Sedimentation, Sink-Schwimm-Aufbereitung und Klären. Bevorzugterweise erfolgt die Abtrennung der Biomasse von der Kulturbrühe durch Zentrifugation mittels eines Dekanters oder wird durch Filtration, mittels einer Mebranfiltrationseinheit durchgeführt. Anschließend wird die Kulturbrühe getrocknet. Hierzu können wiederum alle dem Fachmann bekannten Verfahren und Apparate eingesetzt wer- den. Insbesondere eignen sich Apparate zur thermischen Trocknung wie Konvektions-, Kontakt- und Strahlungstrocknung, z.B. Horden-, Kammer-, Kanal-, Flachbahn-, Teller-, Drehtrommel-, Rieselschacht-, Siebband-, Strom-, , Wirbelschicht-, Fließbett-, Schaufel-, Kugelbett-, , Heizteller-, Dünnschicht-, Walzen-, Band-, Siebtrommel-, Schnecken-, Taumel-, Kon- takt-Scheiben-, Infrarot-, Mikrowellen- und Gefriertrockner, Sprühtrockner oder Sprühtrockner mit integrierter Wirbelschicht, die durch Dampf, Öl, Gas oder elektrischen Strom ggf. beheizt und ggf. unter Vakuum betrieben werden. Die Betriebsweie kann dabei je nach Apparat kontinuierlich oder diskontinuierlich sein. Daneben oder damit in Kombination können die oben bereits angegeben mechanischen Verfahren zur Fest/flüssig- Trennung verwendet werden.
Eine Granulierung durch Extrusion wie dies aus der WO 97/36996 A2 hervorgeht ist jedoch nicht notwendig. Durch die Trocknung wird das Nahrungsmittel haltbar und lagerfähig. Insbesondere wird die Kulturbrühe sprühgetrocknet. Bevorzugt wird zur Trocknung die Sprühtrocknung eingesetzt, wie sie aus der DE 101 04 494 A1 , DE-A-12 11 911 oder EP 0 410 236 A1 bekannt sind. Ergänzend wird auf vgl. Römpp Lexikon Chemie CD-ROM Version 2.0, Georg Thieme Verlag, 1999, "Sprühtrocknung" und Römpp Lexikon Biotechnologie, Georg Thieme Verlag, 1992, "Zerstäubungstrocknung" verwiesen. Die Sprühtrocknung bietet den Vorteil der kurzen Verweilzeit des Produkts in der heißen Zone des Trockners, so dass eine besonders schonende Trocknung erzielt wird.
Bei der Sprühtrocknung werden Eingangstemperaturen von ca. 115°C - 180°C, bevorzugt 120°C -130°C, und Ausgangstemperaturen von ca. 50°C - 80°C, bevorzugt 55°C - 70°C gewählt. Als Trocknungsgas wird vorzugsweise Stickstoff eingesetzt.
Gegebenenfalls können zur Erzielung einer besseren Rieselfähigkeit Rieselhilfsmittel, wie Kieselsäuren etc. zugesetzt werden. Der Einsatz von inerten Trägermaterialien, d.h. niedermolekularen anorganischen Trägern wie NaCI, CaC03, Na2S04 oder MgS04, organischen Trägern wie Glu- cose, Fructose, Saccharose, Dextrine oder Stärkeprodukten (Roggen-, Gersten-, Hafermehl, Weizengrießkleie) ist denkbar. Das getrocknete Produkt weist bevorzugt eine Restfeuchte von weniger als 10 %, bevorzugt weniger als 5 % bezogen auf die Trockenmasse auf. Sein Carotinoidgehalt liegt zwischen 0,05 und 20 %, insbesondere 1 und 10 % bezogen auf die Trockenmasse.
Das so hergestellte Nahrungsmittel kann entweder direkt verwendet werden oder mittels weiterer Zusätze aufbereitet werden, so wie dies ebenfalls aus der DE 101 04494 A1 bekannt ist. Gemäß der Alternative MC wird nach der Kultivierung und vor der Trocknung der Biomasse, die Biomasse von der Kulturbrühe zunächst abgetrennt. Hierzu können alle dem Fachmann geläufigen und üblicherweise einsetzbaren Methoden zur fest/flüssig-Trennung eingesetzt werden, wie sie bereits oben bei der Entwässerung genannt wurden. Bevorzugterweise erfolgt die Abtrennung der Biomasse von der Kulturbrühe durch Zentrifu- gation mittels eines Dekanters oder durch Membranfiltration durchgeführt.
Anschließend erfolgt optional das Waschen der Biomasse mit einem Caro- tinoide nicht lösenden Lösungsmittel, insbesondere Wasser, wodurch insbesondere Wasser lösliche Komponenten entfernt werden. Dieser Schritt kann gegebenenfalls unter Verwendung weiterer Carotinoide nicht lösenden Lösungsmittel (z. B. Alkohole) ergänzt werden, was aber im Rahmen der Erfindung nicht notwendig ist und zur Vermeidung von Abfällen nicht bevorzugt ist.
Anschließend erfolgen die Sterilisation und der sich anschließende oder gleichzeitige Zellaufschluß der Zellen in der Biomasse. Durch die Sterilisation werden die Mikroorganismen abgetötet und gegebenenfalls vorhan- dene Enzymaktivität beendet. Dies ist zur Verhinderung des Abbaus der Biomasse bzw. der darin enthaltenen Stoffe, insbesondere der Carotinoide und für die Haltbarkeit von Bedeutung.
Die Sterilisation kann mit einem üblichen, dem Fachmann geläufigen Ver- fahren durchgeführt werden. Hierzu gehören die Sterilisation mittels Dampf, insbesondere bei Temperaturen größer 120 °C unter Druck (> 1 bar) und Zeitdauern von > ca. 20 min. sowie die Behandlung mit energiereichen Strahlen, wie UV-, Mikrowellen, Gamma- oder Beta-Strahlen. Bevorzugterweise erfolgt die Sterilisation im Rahmen des erfindungsgemä- ßen Verfahrens mittels Dampf oder Mikrowellenstrahlung. Durch den nachfolgenden oder gleichzeitigen Zellaufschluß, werden die innerhalb der Zellen vorliegenden Carotinoide freigesetzt. Der Zellaufschluß kann ebenfalls mit allen dem Fachmann bekannten üblichen Verfahren erfolgen. Hierzu gehören mechanische und nicht mechanische Me- thoden. Zu den mechanischen Methoden zählen Trockenmahlen, Naßmahlen, Rühren, Homogenisieren (z.B. im Hochdruckhomogenisator) und die Verwendung von Ultraschall oder Mikrowellen. Als nicht mechanische Methoden kommen physikalische, chemische und biochemische Methoden in Betracht. Hierzu gehören Kurzzeiterhitzen, Kurzzeitgefrieren, Os- motischer Schock, Trocknung, Behandlung mit Säuren oder Laugen sowie ein enzymatischer Aufschluss. Günstiger Weise wird zum Zellaufschluss jedoch das zur Sterilisation verwendete Verfahren eingesetzt. Bevorzugterweise wird also ebenfalls der Zellaufschluss mittels Dampf oder Mikrowellen Strahlung durchgeführt.
Die Sterilisation und/oder der Zellaufschluss können kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden.
Die Sterilisation und/oder der Zellaufschluss können im zur Kultivierung eingesetzten Bioreaktor oder in anderen Apparaturen, wie Autoklaven usw. durchgeführt werden. Bei kontinuierlicher Durchführung kann das aus der WO 01/83437 A1 bekannte Mikrowellen verwendende Verfahren und entsprechende Apparaturen eingesetzt werden.
Vor der Extraktion wird die Biomasse gegebenenfalls getrocknet und/oder homogenisiert. Hierzu können wiederum alle dem Fachmann bekannten üblichen Verfahren und Geräte eingesetzt werden. Insbesondere eignen sich Apparate zur thermischen Trocknung wie Konvektions-, Kontakt- und Strahlungstrocknung, z.B. Horden-, Kammer-, Kanal-, Flachbahn-, Teller-, Drehtrommel-, Rieselschacht-, Siebband-, Strom-, , Wirbelschicht-, Fließbett-, Schaufel-, Kugelbett-, , Heizteller-, Dünnschicht-, Walzen-, Band-, Siebtrommel-, Schnecken-, Taumel-, Kontakt-Scheiben-, Infrarot-, Mikrowellen- und Gefriertrockner, Sprühtrockner oder Sprühtrockner mit integrierter Wirbelschicht, die durch Dampf, Öl, Gas oder elektrischen Strom ggf. beheizt und ggf. unter Vakuum betrieben werden. Die Betriebsweise kann dabei je nach Apparat kontinuierlich oder diskontinuierlich sein. Daneben oder damit in Kombination können die oben bereits angegeben mechanischen Verfahren zur Fest/flüssig-Trennung verwendet werden.
Eine Granulierung durch Extrusion wie dies aus der WO 97/36996 A2 her- vorgeht ist jedoch nicht notwendig.
Anschließend erfolgt die partielle Extraktion der Carotinoide aus der aufgeschlossenen Biomasse mittels eines Carotinoide lösenden Lösungsmittels und Trennung des Lösungsmittels von der Biomasse. Sowohl in dem Lösungsmittel als auch in der Biomasse sind nun Carotinoide enthalten, wobei sich in dem Lösungsmittel bevorzugterweise der Großteil der Carotinoide befindet.
Aus dem Lösungsmittel werden anschließend die hochreinen Carotinoide isoliert, wohingegen die Biomasse zu einem hochwertigen, Carotinoid- haltigen Nahrungsmittel weiterverarbeitet wird, welches durch den vorhergehenden Zellaufschluss auch eine gute Bioverfügbarkeit der Carotinoide aufweist.
Unter partieller Extraktion soll demnach die bewusst unvollständige Extraktion der Carotinoiden aus der Biomasse verstanden werden (vgl. oben). Bevorzugterweise wird im Rahmen der Erfindung durch die Extraktion also weniger als 100 % der in der Biomasse enthaltenen Gesamtmenge der Carotinoide aus dieser extrahiert. Dies ist von großem Vorteil, da der Aufwand zur Extraktion mit der abnehmenden Menge Carotinoid in der Biomasse überproportional zunimmt. Zur Extraktion werden Lösungsmittel eingesetzt, die Carotinoide lösen, wie z. B. Hexan, Ethylacetat, Dichlormethan oder überkritisches Kohlendioxid. Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß als Lösungsmittel Dichlormethan oder überkritisches Kohlendioxid eingesetzt, wobei beim Einsatz von überkritischem Kohlendioxid die darin enthaltenen Carotinoide anschließend in Dichlormethan überführt werden können oder das Wertprodukt direkt durch Entspannung des Kohlendioxids gewonnen werden kann. Dabei werden die Mengen der Lösungsmittel und Durchmischungszeiten derart gewählt, dass die gewünschte Menge Carotinoide aus der Biomasse extrahiert wird. Insbesondere wird der Extraktionsschritt nur einmal durchgeführt, was technisch und wirtschaftlich sinnvoll ist (vgl. oben).
Zur Durchführung der Extraktion können alle üblichen Verfahren und Ap- paraturen eingesetzt werden. Insbesondere wird bei nicht getrockneter, aber aufgeschlossener Biomasse eine flüssig/flüssig (Carotinoid liegt in flüssigen Zellbestandteilen gelöst vor und wird daraus extrahiert und bei getrockneter Biomasse eine fest/flüssig Extraktion durchgeführt. Es können Kalt- und Heißextraktion in bestimmten Temperaturbereichen, sowohl kontinuierliche (z.B. Soxhiet-Extraktion, Perforation und Perkolation) als auch diskontinuierliche Verfahren, zu denen beispielsweise Ausschütteln, Auslaugen, Auskochen und Digerieren gehören, verwendet werden. Sie können auch im Gegenstromverfahren durchgeführt werden.
Für die flüssig/flüssig Extraktion können beispielsweise Blasensäulen, , pulsierende Kolonnen, Kolonnen mit rotierenden Einbauten, Mixer-Settler- Batterien oder Rührkessel usw. verwendet werden.
Die fest/flüssig Extraktion kann mittels üblicher Apparaturen durchgeführt werden. Vorzugsweise werden Rührkessel oder Mixer-Settler-Apparate eingesetzt. Alternativ kann der Zellaufschluß ohne vorherige Abtrennung des Fermen- taionsmediums erfolgen und sich dann eine direkte Trennung einer sich bildenden Carotinoidsuspension von der Biomasse z. B. mittels eines De- kanters durchgeführt werden. Anschließend wird die Carotinoidsuspension in Dichlormethan aufgenommen und weiterverarbeitet oder alternativ durch Wäschen mit verschiedenen wässrigen Lösungen aufgereinigt.
Zur Isolierung der hochreinen Carotinoide aus dem Lösungsmittel wird eine Kristallisation der Carotinoide aus dem verwendeten Lösungsmittel und Isolierung der Carotinoid-Kristalle, insbesondere durch Filtration durchgeführt. Die verbleibende Mutterlauge kann nach Destillation dem Verfahren erneut zugeführt werden, so dass Produktverluste trotz geringem Aufwand minimiert werden.
Die Kristallisation kann wie üblich erfolgen. Ergänzend wird auf vgl. Römpp Lexikon Chemie CD-ROM Version 2.0, Georg Thieme Verlag, 1999, "Kristallisation" verwiesen.
Bevorzugterweise erfolgt die Kristallisation durch graduellen Lösungsmittelaustausch gegen ein Carotinoide nicht lösendes Lösungsmittel. Es wird also kontinuierlich die Löslichkeit der Carotinoide erniedrigt, bis diese als reine Kristalle ausfallen. Hierbei wird vorzugsweise ein "niederer Alkohol" oder Wasser verwendet. Als niederer Alkohol werden aliphatische Alkoho- le mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen angesehen. Hierzu gehören Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, 1-Butanol, tert.-Butanol und sec.-Butanol. Bevorzugterweise wird Methanol eingesetzt.
Die Carotinoid-Lösung kann dabei erwärmt werden, wobei die Temperatur vorzugsweise < 100 °C, insbesondere < 60 °C gehalten wird, so dass
Dichlormethan abdestilliert wird. Auch der Einsatz von Vakuum ist denk- bar. Anschließend werden die CarotinoidKristalle isoliert, welches durch übliche Maßnahmen, insbesondere durch Filtration erfolgen kann. Es können sich, falls gewünscht, weitere optionale Trocknungs- und/oder Reinigungsschritte anschließen. Notwendig sind diese jedoch nicht, da die Ca- rotinoid Kristalle bereits hochrein sind.
Die Carotinoide fallen als hochreine Kristalle an und weisen eine Reinheit von mindestens 95%, bevorzugt > 95%, vorzugsweise > 96%, besonders bevorzugt > 97%, ganz besonders bevorzugt > 98%, höchst bevorzugt > 99% auf.
Die erzielbaren Ausbeuten liegen zwischen 45% und 95%, bevorzugt zwischen 70% und 95% bezogen auf die in der Kulturbrühe vorliegende Menge (0,5 - 15 g/L, bevorzugt 1 - 10 g/L).
Zur Weiterverarbeitung der ebenfalls Carotinoid-haltigen Biomasse zu einem hochwertigen Nahrungsmittel wird zunächst eine Entfernung von Lösemittelresten aus der Carotinoid-haltigen Biomasse vorgenommen. Hierzu erfolgt bevorzugterweise eine Wasserdampfdestillationen bzw. ein so genanntes Strippen mit Wasserdampf (vgl. Römpp Lexikon Chemie CD- ROM Version 2.0, Georg Thieme Verlag, 1999, "Strippen").
Danach kann gegebenenfalls die Biomasse in der oben abgetrennten Kulturbrühe homogen suspendiert werden, wobei ein Feststoffgehalt > 100 g/L und < 600 g/L eingehalten werden sollte, so daß die nachfolgende Trocknung der Biomasse bzw. Suspension zur Herstellung des Nahrungsmittels ohne technische Schwierigkeiten erfolgen kann. D.h. die Suspension muß pumpbar sein. Als Trocknungsverfahren kommen alle bereits genannten Verfahren und Apparaturen in Frage. Insbesondere wird zur Trocknung die Sprühtrocknung eingesetzt. Dabei kann wie aus der DE 101 04494 A1 bekannt verfahren werden. Bei der Sprühtrocknung werden Eingangstemperaturen von ca. 100°C - 180°C, bevorzugt 120°C -130°C, und Ausgangstemperaturen von ca. 50 - 80°C, bevorzugt 55°C - 70°C gewählt. Als Trocknungsgas wird vorzugs- weise Stickstoff eingesetzt.
Das so hergestellte Nahrungsmittel kann entweder direkt verwendet werden oder mittels weiterer Zusätze aufbereitet werden, so wie dies ebenfalls aus der DE 101 04494 A1 bekannt ist.
Als Nahrungsmittel werden Zusammensetzungen angesehen, die der Ernährung dienen. Darunter fallen auch Zusammensetzungen für die Ergänzung der Ernährung. Insbesondere werden als Nahrungsmittel Tierfuttermittel und Tierfutterergänzungsmittel angesehen. Ergänzend wird auf Römpp Lexikon Chemie CD-ROM Version 2.0, Georg Thieme Verlag, 1999, "Nahrungsmittel" verwiesen.
Das trockene Produkt weist bevorzugt eine Restfeuchte von weniger als 5 % bezogen auf die Trockenmasse auf. Sein Carotinoidgehalt liegt zwi- sehen 0,05 und 20 %, insbesondere 1 und 10 % bezogen auf die Trok- kenmasse. Der gewünschte Carotinoidgehalt ist über das Ausmaß der Extraktion steuerbar (vgl. oben).
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Nahrungsmittel ent- halten also bereits nach der Herstellung große Mengen an Carotinoiden, die nicht zugesetzt werden müssen. Dadurch, dass das Nahrungsmittel neben dem mindestens einen Carotinoid auch Biomasse enthält ist sein Nährstoffgehalt zudem gesteigert. Insbesondere ist der Nährstoffgehalt nach der bevorzugten Alternative stark gesteigert, im dem es neben dem mindestens einen Carotinoid und Biomasse zusätzlich alle Medienbestandteile der Fermentation enthält. Es fallen demnach praktisch keine Abfälle an, abgesehen von wässrigen Medien, welche jedoch unproblematisch in einer Kläranlage gereinigt werden können. Zusätzlich wird die gesamte Produktionsmenge Carotinoide ohne oder mit nur marginalen Verlusten verwertet, da keine verlustreichen Trenn- bzw. Aufarbeitungsschrit- te vorgenommen werden müssen, um die gesamte Menge Carotinoid zu extrahieren.
Die in dem oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Lösungsmittel werden alle soweit wie möglich aufbereitet und an- schließend wieder verwendet bzw. dem Verfahren erneut zugeführt. Insbesondere wird das eingesetzte Dichlormethan bereits beim Lösungmittelaustausch gereinigt und steht anschließend zur erneuten Verwendung bereit. Der niedere Alkohol bzw. das Methanol wird z. B. destillativ gereinigt und ebenfalls wieder verwendet. Als Abfall fallen lediglich der Destillationssumpf an, der zusammen mit den wässrigen Medien gefahrlos einer Kläranlage zugeführt werden kann, wo letztendlich nur eine geringe Menge Klärschlamm als tatsächlicher Abfall anfällt. Somit ist das beschriebene Verfahren im wesentlichen abfallfrei.
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Beispielen näher ausgeführt.
A. Kultivierung von Blakeslea trispora
Folgende Medien wurden zur Fermentation von Blakeslea trispora zur Produktion der Carotinoide eingesetzt: Medium 1:
Glucose 10,00 g/l Baumwollsaatoel 30,00 g/l
Sojaoel 30,00 g/l Dextrin 60,00 g/l
Baumwollsamenmehl 75,00 g/l
Triton X 100 1,20 g/l
Ascorbinsäure 6,00 g/l Milchsäure 2,00 g/l
KH2P04 0,50 g/l
MnS04 x H20 100 mg/l
Thiamin-HCI 2 mg/l
Isoniazid (Isonieotinsäurehydrazid) 0,75 g/l Der pH wurde auf 6,5 eingestellt.
Medium 2:
Glucose 20 g/l
Asparagin 2,00 g/l KH2P04 5,00 g/l
MgS04 x 7 H20 0,50 g/l
CaCI2 28 mg/l
Thiamin-HCI 1 ,00 mg/l
Citronensäure 2,00 mg/l Fe(N03)3 x 9 H20 1 ,50 mg/l
ZnS04 x 7 H20 1 ,00 mg/l
MnS04 x H20 0,30 mg/l
CuS04 x 5 H20 0,05 mg/l
Na2Mo04 x 2 H20 0,05 mg/l
Medium 3
Glucose 70,00 g/l Asparagin 2,00 g/l
Hefe Extrakt 1 ,00 g/l
MgS04 x 7 H20 0,50 g/l
Span 20 1,00 g/l
Thiamin-HCI 5,0 mg/l Der pH wurde auf 5,5 eingestellt.
Mit Sporensuspensionen von Blakeslea trispora ATCC 14272 Mating Type (-) die 108 (für Medium 2) bzw. 107 (für Medium 1 und 3) Sporen enthielten, wurden je 200 ml der beschriebenen Medien angeimpft. Die Kultivie- rung erfolgte jeweils in 1-l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Mit jedem Medium wurden sechs identische Kolben angesetzt und über 7 Tage bei 28°C und 140 UpM im Schüttler inkubiert.
B) Gentechnische Veränderung von Blakeslea Trispora
Material und Methoden
Molekulargenetische Arbeiten wurden, wenn nicht anders beschrieben, nach den Methoden in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999, John Wiley & Sons) durchgeführt.
Stämme und Wachstumsbedingungen
Die Blakeslea trispora Stämme ATCC 14271 (Paarungstyp(+)) und ATCC14272 (-) (ein Wildtyp) wurde erhaltenPaarungstyp (-)) wurden von der American Type Culture Collection. erhalten. Die Anzucht von B. trispo- ra erfolgte in MEP-Medium (Malzextrakt-Pepton-Medium): 30 g/l Malzextrakt (Difco), 3 g/l Pepton (Soytone, Difco), 20 g/l Agar, Einstellung pH 5,5, ad 1000 ml mit H2O bei 28 °C.
Die Anzucht von Agrobacterium tumefaciens LBA4404 erfolgte nach Hoe- kema et al. (1983, Nature 303:179-180) bei 28 °C für 24 h in Agrobacteri- en-Minimal Medium (AMM): 10 mM K2HP04, 10 mM KH2P04, 10 mM Glu- cose, MM-Salze (2,5 mM NaCI, 2 mM MgS04, 700 μM CaCI2, 9 μM Fe- S04, 4 mM (NH4)2S04).
Transformation von Agrobacterium tumefaciens Das Plasmid pBinAHyg wurde in den Agrobakterienstamm LBA 4404 (Hoekema et al., 1983, Nature 303:179-180) elektroporiert (Mozo and Ho- oykaas, 1991, Plant Mol. Biol. 16:917-918). Zur Selektion wurden bei der Agrobakterienanzucht folgende Antibiotika verwendet: Rifampicin 50 mg/l (Selektion auf das A. tumefaciens Chromosom), Streptomycin 30 mg/l (Se- lektion auf das Helferplasmid) und Kanamycin 100 mg/l (Selektion auf den binären Vektor).
Transformation von Blakeslea trispora
Zur Transformation wurden die Agrobakterien nach 24 h Anzucht in AMM auf eine OD6oo von 0,15 in Induktionsmedium (IM: MM-Salze, 40 mM MES (pH 5,6), 5 mM Glucose, 2 mM Phosphat, 0,5% Glycerol, 200 μM Acetosyringone) verdünnt und erneut über Nacht in IM bis zu einer ODeoo von ca. 0,6 angezogen.
Zur Co-Inkubation von Blakeslea ATCC 14271 bzw. ATCC14272 und Agrobacterium wurden 100 μl Agrobakteriensuspension mit 100 μl Blakeslea Sporensuspension (107 Sporen/ml in 0,9% NaCI) gemischt und steril auf einer Nylon Membran (Hybond N, Amersham) auf IM-Agarose Platten (IM + 18 g/l Agar) verteilt. Nach 3 Tagen Inkubation bei 26 °C wurde die Membran auf eine MEP-Agarplatte (30 g/l Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/l Agar) überführt. Zur Selektion auf transformierte Blakesleazel- len enthielt das Medium Hygromycin in einer Konzentration von 100 mg/l sowie zur Selektion gegen Agrobakterien 100 mg/l Cefotaxim. Die Inkubation erfolgte für ca. 7 Tage bei 26 °C. Anschließend erfolgte der Transfer von Mycel auf frische Selektionsplatten. Gebildete Sporen wurden mit 0,9% NaCI abgespült und auf CM 17-1 -Agar (3 g/l Glucose, 200 mg/l L- Asparagin, 50 mg/l MgS04 x 7H20, 150 mg/l KH2P04, 25 μg/l ThiaminHCI, 100 mg/l Yeast Extract, 100 mg/l Na-desoxycholat, 100 mg/L Hygromycin, 100 mg/L Cefotaxim, pH 5,5,18 g/l Agar) ausplattiert. Zur Isolierung einzelner gentechnisch veränderter Sporen wurden die Sporen durch ein FACS Gerät der Fa. BectonDickson (Modell Vantage+Diva Option) einzeln auf Selektivmedium abgelegt.
Mutagenese mit MNNG
Zur Reduzierung der Anzahl von Kernen pro Spore wurde eine Behand- lung von Sporensuspensionen mit MNNG (N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin) durchgeführt. Hierfür wurde zunächst eine Sporensuspension mit 1 x 107 Sporen/ml in Tris/HCI-Puffer, pH 7,0 hergestellt. Der Sporensuspension wurde MNNG in einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben. Die Zeit der Inkubation in MNNG wurde so gewählt, dass die Überlebensrate der Sporen ca. 5% betrug. Nach Inkubation mit MNNG wurden die Sporen dreimal mit 1g/l Span 20 in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen und plattiert.
Selektion homonukleater Zellen Die Selektion homonukleater Zellen von Blakeslea trispora carB" erfolgte analog zum Versuchsprotokoll für Phycomyces blakesleeanus (Roncero et al., 1984, Mutation Research, 125:195-204), modifiziert durch Wachstum in Gegenwart von 5-Carbon-5-Deazariboflavin (1 μg/ml) und Hygromycin 100 (μg/ml).
Herstellung genetisch veränderter Blakeslea trispora durch Agrobac- terium-vermittelte Transformation Herstellung des rekombinanten Plasmids pBinAHyg
Aus dem Plasmid pANsCosI (Fig.1 , Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26:87- 90, SEQ ID NO: 4) wurde die gpdA-hph-trpC-Kassette als Bglll/Hindlll Fragment isoliert und in das mit BamHl/Hindlll geöffnete binäre Plasmid pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12:8711-8721) ligiert. Der so erhaltene Vektor wurde als pBinAHyg bezeichnet (Fig. 2, SEQ ID NO: 3) und enthielt das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hph) unter Kontrolle des gpd Promotors (SEQ ID NO: 1) und des trpC Terminators (SEQ ID NO: 2) aus Aspergillus nidulans sowie die entsprechenden Borderse- quenzen, die für den DNA-Transfer von Agrobacterium notwendig sind. Die in den weiter unten beschriebenen Ausführungsbeispielen genannten Vektoren sind Abkömmlinge von pBinAHyg.
Übertragung von pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Agrobacterium tumefaciens
Nachfolgend wird beispielhaft die Übertragung des Plasmids pBinAHyg in Agrobacterien beschrieben. Die Übertragung der Abkömmlinge erfolgte analog.
Das Plasmid pBinAHyg wurde in den Agrobakterienstamm LBA 4404 (Hoekema et al., 1983, Nature 303:179-180) elektroporiert (Mozo and Ho- oykaas, 1991 , Plant Mol. Biol. 16:917-918). Zur Selektion wurden bei der Agrobakterienanzucht folgende Antibiotika verwendet: Rifampicin 50 mg/l (Selektion auf das A. tumefaciens Chromosom), Streptomycin 30 mg/l (Se- lektion auf das Helferplasmid) und Kanamycin 100 mg/l (Selektion auf den binären Vektor).
Übertragung von pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Blakeslea trispora Zur Transformation wurden die Agrobakterien nach 24 h Anzucht in AMM auf eine OD66o von 0,15 in Induktionsmedium (IM: MM-Salze, 40 mM MES (pH 5,6), 5 mM Glucose, 2 mM Phosphat, 0,5% Glycerol, 200 μM Acetosyringone) verdünnt und erneut über Nacht in IM bis zu einer ODββo von ca. 0,6 angezogen.
Zur Co-Inkubation von Blakeslea trispora (B.t.) und Agrobacterium tumefaciens (A.t.) wurden 100 μl Agrobakteriensuspension mit 100 μl Blakeslea Sporensuspension (107 Sporen/ml in 0,9% NaCI) gemischt und steril auf einer Nylon Membran (Hybond N, Amersham) auf IM-Agarose Platten (IM + 18 g/l Agar) verteilt. Nach 3 Tagen Inkubation bei 26 °C wurde die Mem- bran auf eine MEP-Agarplatte (30 g/l Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/l Agar) überführt.
Zur Selektion auf transformierte Blakeslea-Zellen enthielt das Medium Hygromycin in einer Konzentration von 100 mg/l sowie zur Selektion gegen Agrobakterien 100 mg/l Cefotaxim. Die Inkubation erfolgte für ca. 7 Tage bei 26 °C. Anschließend erfolgte der Transfer von Mycel auf frische Selektionsplatten. Gebildete Sporen wurden mit 0,9% NaCI abgespült und auf CM 17-1 -Agar (3 g/l Glucose, 200 mg/l L-Asparagin, 50 mg/l MgS04 x 7H20, 150 mg/l KH2P04, 25 μg/l Thiamin-HCI, 100 mg/l Yeast Extract, 100 mg/l Na-desoxycholat, pH 5,5, 100 mg/l Cefotaxim, 100 mg/l Hygromycin, 18 g/l Agar) ausplattiert. Die Übertragung von Sporen auf frische Selektionsplatten wurde dreimal wiederholt. Auf diese Weise wurde die Transformante Blakeslea trispora GVO 3005 isoliert. Alternativ erfolgte zur Selektion der GVO (gentechnisch veränderten Organismen) die Einzelab- läge der Sporen durch den BectonDickinson FacsVantage+Diva Option auf CM-17 Agar mit 100 mg/l Cefotaxim, 100 mg/l Hygromycin. In diesem Fall wurde nur dort Pilzmycel gebildet, wo die Sporen gentechnisch verändert waren.
Nachweis der genetischen Veränderung durch Übertragung von pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Blakeslea trispora Nachfolgend wird beispielhaft der Nachweis der Übertragung für pBinAHyg in Blakeslea trispora beschrieben. Der Nachweis der Übertragung der Abkömmlinge erfolgte analog.
200 ml MEP-Medium (30 g/l Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5) wurden mit 105 bis 107 Sporen der Transformante Blakeslea trispora GVO 3005 beimpft und 7 Tage bei 26 °C mit 200 Upm auf einem Rundschüttler inkubiert. Zum Nachweis der erfolgreichen Transformation wurde DNA aus dem Mycel isoliert (Peqlab Fungal DNA Mini Kit) und in einer PCR (Pro- gramm: 94 °C 1 min, dann 30 Zyklen mit 1 min. 94°C, 1 min. 58 °C, 1 min. 72 °C) eingesetzt.
Zum Nachweis des Hygromycinresistenzgens (hph) wurden die Primer hph-forward (5'-CGATGTAGGAGGGCGTGGATA, SEQ ID NO: 5) und hph-reverse (5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT, SEQ ID NO: 6) verwendet. Das erwartete Fragment von hph wies eine Länge von 800 bp auf.
Zur Amplifikation des Kanamycinresistenzgens nptlll und damit als Kontrolle auf Agrobakterien wurden die Primer nptlll-forward (5'- TGAGAATATCACCGGAATTG, SEQ ID NO: 7) und nptlil-reverse (5'- AGCTCGACATACTGTTCTTCC, SEQ ID NO: 8) verwendet. Das erwartete Fragment von nptlll wies eine Länge von 700 bp auf.
Zur Amplifikation eines Fragmentes des Glycerinaldehyd-3- phosphatdehydrogenasegens gpdl und damit als Kontrolle auf Blakeslea trispora wurden die Primer MAT292 (5'-
GTGAATGGAAATCCCATCGCTGTC, SEQ ID NO: 9) und MAT293 (5'- AGTGGGTACTCTAAAGGCCATACC, SEQ ID NO: 10) verwendet. Das erwartete Fragment von gpdl wies eine Länge von 500 bp auf. Das Ergebnis der PCR der Blakeslea trispora DNA ist in Fig. 3 anhand eines Standard-Gels gezeigt. Die Spuren des Gels wurden folgendermaßen belegt:
1) 100 bp Größenmarker (100 bp - 1 kb)
2) B.t. GVO 3005 primer nptlll-for / nptlll-rev
3) B.t. GVO 3005 primer hph-for / hph-rev
4) B.t. GVO 3005 primer MAT292 / MAT293 (gpd)
5) A.t. mit Plasmid pBinAHyg primer nptlll-for / nptlll-rev 6) A.t. mit Plasmid pBinAHyg primer hph-for / hph-rev
7) B.t. 14272 WT primer nptlll-for / nptlll-rev
8) B.t. 14272 WT primer hph-for / hph-rev
9) B.t. 14272 WT primer MAT292 / MAT293 (gpd)
In der DNA von Blakeslea trispora wurde das Hygromycinresistenzgens (hph) und als Positivkontrolle Glycerinaldehyd-3- phosphatdehydrogenasegen (gpdl) nachgewiesen, nptlll konnte demgegenüber nicht nachgewiesen werden.
Somit wurde die genetische Veränderung von Blakeslea trispora durch Agrobacterium-vermittelte Transformation nachgewiesen.
Isolierung homokaryotischer GVO von Blakeslea trispora:
Herstellung homonukleater Stämme
Durch erfolgreichen Transfer des Vectors pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Blakeslea trispora entstandenentstehen genetisch veränderte Organismen. In GVO von Blakeslea trispora. Jedoch liegen in Blakeslea liegen in allen Stadien des vegetativen und des sexuellen Zell- zyklus mehrkernige Zellen vor. Daher erfolgte erfolgt die Insertion der Vec- torFremd-DNA in der Regel nur in einem Kern. Ziel ist es aber, dass, Stämme von Blakeslea zu erhalten, bei denen die Insertion der Vectör- Fremd-DNA in allen Kernen vorliegt., d.h. Ziel ist ein homonukleates re- kombinantes Pilzmycel.
Zur Herstellung solcher homokaryotischer Zellen wurden zunächst Sporensuspensionen der rekombinanten Stämme mit MNNG behandelt. Hierfür wurde eine Sporensuspension mit 1 x 107 Sporen/ml in Tris/HCI-Puffer, pH 7,0 hergestellt. Der Sporensuspension wurde MNNG in einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben. Die Dauer der Inkubation mit MNNG wurde so gewählt, dass die Überlebensrate der Sporen ~5% betrug. Nach Inkubation mit MNNG wurden die Sporen dreimal mit 1g/l Span 20 in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen und plattiert.
1) Herstellung homonukleater rekombinanter Stämme durch FACS (fluorescence-activated cell sorting)
Ein geringer Anteil der Sporen von Blakeslea trispora bzw. der gentechnisch veränderten Stämme von Blakeslea trispora ist von Natur aus einkernig. Zur Herstellung homonukleater rekombinanter Stämme, die Fremd- DNA von pBinAHyg oder pBinAHyg-Abkömmlingen enthielten, wurden die einkernigen Sporen durch FACS aussortiert und auf MEP (30 g/l Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/l Agar) mit 100 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Hygromycin plattiert. Die hier gebildten Mycelien waren homonukleat. Zur Sortierung mit FACS wurden die Sporen eines 3 Tage alten Ausstriches mit 10 ml Tris-HCI 50mMol + 0,1 % Span20 pro Agar-Platte abge- schwemmt. Die Sporenkonzentration betrug 0,5 bis 0,8 x 107 Sporen pro ml. Zu 9 ml Sporensuspension wurden 1ml DMSO und 10 μl Syto 11 (Farbstoff-Stammlösung in DMSO Molecular Probes Nr.S-7573) zugegeben. Danach wurde 2 h bei 30°C gefärbt. Die Selektion und Ablage erfolgte mittels eines BectonDickinson FacsVantage+Diva Option. Die Selektion erfolgt zuerst nach Größe, um einzelne Sporen von Aggregaten und Verunreinigungen zu trennen. Dann wurden diese Sporen nach ihrer Fluores- zenz (Anregung = 488nm Emission = 530 nm) sortiert abgelegt. Die linke Schulter der Gauß-Kurve der Fluoreszenzhäufigkeitsverteilung enthielt die einkernigen Sporen.
Anschließend wurden die Sporen auf MEP-Agarplatten ausplattiert und neue Sporen erzeugt.
Diese Sporen wurden analog zur Vorschrift von Roncero et al. auf Medium mit 5-Carbon-5-deazariboflavin plattiert, das zusätzlich Hygromycin ent- hielt.
Hierdurch wurden homokaryonte Zellen des Genotyps hygR und dar" selektiert.
2) Herstellung homonukleater Stämme durch Kernreduktion und Selektion mit FACS
Zur Reduzierung der Anzahl von Kernen pro Spore wurde vor der Selektion eine Behandlung von Sporensuspensionen mit MNNG (N-Methyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidin) durchgeführt, und so durch chemische Mutagenese eine Kernreduktion erzielt.
Hierfür wurde zunächst eine Sporensuspension mit 1 x 107 Sporen/ml in Tris/HCI-Puffer, pH 7,0 hergestellt. Der Sporensuspension wurde MNNG in einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben. Die Zeit der Inkubation in MNNG wurde so gewählt, dass die Überlebensrate der Sporen ca. 5% betrug. Nach Inkubation mit MNNG wurden die Sporen dreimal mit 1 g/l Span 20 in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen und nach der unter 1 ) beschriebenen Methode sortiert bzw. selektiert. Alternativ konnten zur Reduktion der Kernzahl in den Sporen auch Röntgen - und UV-Strahlen eingesetzt werden, wie es von Cerdä-Olmedo und Patricia Reau in Mutation Res., 9 (1970), 369-384 beschrieben wurde.
3) Herstellung homonukleater Stämme durch Selektion auf rezessive Selektionsmarker
Als rezessiver Selektionsmarker zur Selektion homonukleater Mycelien kommt beispielsweise der rezessive Selektionsmarker pyrG in Frage. Wildtyp-Stämme von Blakeslea trispora sind pyrG+. Diese Stämme können nicht in Gegenwart des Pyrimidin-Analogs 5-Fluororotat (FOA) wachsen, weil sie FOA durch die Orotidin-5'-monophosphatdecarboxylase zu letha- len Metaboliten umsetzen. Gentechnisch veränderte Blakesleaa, die ho- monukleat pyrG" sind, fehlt die Enzymaktivität Orotidin-5'- monophosphatdecarboxylase. Folglich können diese pyrG~-Stämme 5- Fluororotat nicht verwerten. Die Stämme wachsen daher in Gegenwart von FOA und Uracil. Im Fall der Kopplung der Mutation pyrG" und der Insertion von Fremd-DNA auf dem Kern einer einkernigen Spore, kann aus dieser Spore homonukleates rekombinantes Pilzmycel gebildet werden.
Zunächst wurde durch Insertion eines Fragentes von pyrG (SEQ ID NO: 65) aus Blakeslea trispora in pBinAHyg das Plasmid pBinAHygBTpyrG- SCO (SEQ ID NO: 36, Fig. 4) erzeugt. Dieses Plasmid wurde in Blakelea trispora transformiert und führte dort durch homologe Rekombination zur Disruption von pyrG.
Homonukleate GVO von Blakeslea trispora mit dem Phänotyp pyrG" wurden folgendermaßen selektiert. Zur Agrobakterium-vermittelten Transformation von pBinAHygBTpyrG-SCO wurde wie oben beschrieben auf MEP (30 g/l Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/l Agar) mit 100 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Hygromycin plattiert. Die Sporen der Transformanten wurden mit 10 ml Tris-HCI 50mM + 0,1% Span20 pro Agar-Platte abgeschwemmt. Die Sporenkonzentration betrug 0,5 bis 0,8 x 107 Sporen pro ml. Die Sporen wurden anschließend auf FOA-Medium mit 100 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Hygromycin ausplattiert. FOA-Medium enthielt pro Li- ter 20 g Glucose, 1 g FOA, 50 mg Uracil, 200 ml Citrat-Puffer (0,5 M, pH 4,5) und 40 ml Spurensalzlösung nach Sutter, 1975, PNAS, 72:127). Ho- monukleate pyrG"-Mutanten zeigten Wachstum auf dem Uracil-haltigen FOA-Medium; aber kein Wachstum bei Plattierung auf FOA-Medium ohne Uracil. Auf die gleiche Weise wurden aus den im folgenden beschriebenen GVO von Blakeslea trispora zur Herstellung von Xanthophyllen homo- nukleate GVO hergestellt.
Alternativ ist es möglich die Sporen analog zur Vorschrift von Roncero et al. auf Medium mit 5-Carbon-5-deazariboflavin zu plattieren, das zusätz- lieh Hygromycin enthält (Roncero et al., 1984, Mutation Research, 125: 195 - 204). Hierdurch werden homokaryonte Zellen des Genotyps hygR und dar" selektiert. Nach diesem Prinzip werden homokaryonte Stämme von Blakeslea trispora mit dem Phänotyp hygR und dar" erzeugt.
Ausführungsbeispiele zur Herstellung von gentechnisch veränderten Organismen von Blakeslea trispora für die Herstellung von Carotinoiden und Carotinoidvorstufen
Die Erzeugung der im folgenden genannten Plasmide erfolgte durch die Methode „overiap-extension PCR" und durch anschließende Insertion der Amplifikationsprodukte in das Plasmid pBinAHyg. Die Methode „overiap- extension PCR" erfolgte wie in Innis et al. (Eds.) PCR protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, San Diego beschrieben. Die Transformation der pBinAHyg-Abkömmlinge und die Herstellung homo- nukleater gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispora erfolgte wie oben beschrieben. Gentechnisch veränderte Stämme von Blakeslea trispora zur Herstellung von Zeaxanthin
Folgende Piasmide (Abkömmlinge von pBinAHyg) wurden zur gentechni- sehen Veränderung von Blakeslea trispora für die Herstellung von Zeaxanthin verwendet, codieren also u.a. Hydroxylasen (crtZ): p-tef1-HPcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ (SEQ ID NO: 70) aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 (Accession No. AF162276) unter Kontrolle des ptefl Promotors aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpTEFI -HPcrtZ, SEQ ID NO: 37, Fig. 5); p-carRA-HPcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHyg- BTpcarRA-HPcrtZ, SEQ ID NO: 38, Fig. 6) - p-carB-HPcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des Promotors pcarB aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-HPcrtZ, SEQ ID NO: 39, Fig. 7) p-carRA-HPcrtZ-TAG-3'carA-IR, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora. Stromabwärts des Gens der Hydroxylase ist eine Inverted-Repeat-Struktur lokalisiert, die aus dem 3'-Ende von carA und der stromabwärts von carA gelegenen Region stammt (IR, SEQ ID NO: 74, .Inverted Repeat 1' ca. 350 bp von carA, dann ca. 200 bp ,Loop' und anschließend ca.
350 bp .Inverted Repeat 2') (Seq. pBinAHyg-BTpcarRA-HPcrtZ- TAG-3'carA-IR, SEQ ID NO: 40, Fig. 8); p-carRA-HPcrtZ-GCG-3'carA-IR, enthaltend Gen der Hydroxylase
HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kon- trolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora. Das Gen der Hydroxylase ist mit einer Inverted-Repeat-Struktur fusioniert, die aus dem 3'-Ende von carA und der stromabwärts von carA gelegenen Region stammt (IR, SEQ ID NO: 74, nverted Repeat V ca. 350 bp von carA, dann ca. 200 bp ,Loop' und anschließend ca. 350 bp Jnverted Repeat 2'). Das abgeleitete Fusionsprotein besteht folglich aus der Hydroxylase von Haematococcus pluvialis und dem Carboxyterminus von CarA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHyg- BTpcarRA-HPcrtZ-GCG-3'carA-IR, SEQ ID NO: 41 , Fig. 9); p-tef1-EUcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase EUcrtZ (SEQ ID NO: 71) aus Erwinia uredova 20D3 (Accession No. D90087) unter
Kontrolle des ptefl Promotors (Seq. pBinAHygBTpTEFI -EUcrtZ, SEQ ID NO: 42, Fig. 10); p-carRA-EUcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase EUcrtZ aus Erwinia uredova 20D3 unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Bla- keslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-EUcrtZ, SEQ ID NO: 43,
Fig. 11); p-carB-EUcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase EUcrtZ aus Erwinia uredova 20D3 unter Kontrolle des Promotors pcarB aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-EUcrtZ, SEQ ID NO: 44, Fig. 12); p-gpdA-HPcrtZ-t-crtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des gpdA Promotors und des Terminators t-crtZ; d.h. des stromabwärts von crtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 gelegenen Sequenzabschnitts (SEQ ID NO: 73) (Seq. pBinAHyg-gpdA-HPcrtZ- tcrtZ, SEQ ID NO: 45, Fig. 13). p-gpdA-BTcarR-HPcrtZ-BTcarA, enthaltend Genfusion aus Genen der Lycopincyclase carR aus Blakeslea trispora, der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 und der Phytoensynthase carA aus Blakeslea trispora unter Kontrolle des gpdA Promotors aus Aspergillus nidulans (Seq. pBinAHyg- carR_crtZ_carA, SEQ ID NO: 46, Fig. 14);
Herstellung gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispora zur Herstellung von Canthaxanthin
Folgende Plasmide (Abkömmlinge von pBinAHyg) wurden zur gentechnischen Veränderung von Blakeslea trispora für die Herstellung von Canthaxanthin verwendet, codieren also u.a. Ketolasen (crtW): - p-tef1-NPcrtW, enthaltend das Gen der Ketolase NPcrtW (SEQ ID
NO: 72) aus Nostoc punctiforme PCC73102 (ORF148, Accesion No. NZ__AABC01000196) unter Kontrolle des ptefl Promotors aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpTEFI-NpucrtW, SEQ ID NO: 47, Fig. 15); - p-carRA-NPcrtW, enthaltend das Gen der Ketolase NPcrtW aus
Nostoc punctiforme PCC73102 unter der Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO: 48, Fig. 16); p-carB-NPcrtW, enthaltend das Gen der Ketolase NPcrtW aus No- stoc punctiforme PCC73102 unter der Kontrolle des Promotors pcarB aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-NpucrtW, SEQ ID NO: 49, Fig. 17);
Herstellung gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispo- ra zur Herstellung von Astaxanthin
Folgende Plasmide (Abkömmlinge von pBinAHyg) wurden zur gentechnischen Veränderung von Blakeslea trispora für die Herstellung von Astaxanthin verwendet, codieren also u.a. für Hydroxylasen (crtZ) und Ketolasen (crtW): p-carRA-HPcrtZ-pcarRA-NPcrtW, enthaltend das Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 und das Gen der Ketolase NPcrtW aus Nostoc punctiforme PCC73102 (ORF148, Accesion No. NZ_AABC01000196) beide jeweils unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHyg BTpcarRA-HPcrtZ-BTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO: 50, Fig. 18); p-carRA-EUcrtZ-pcarRA-NPcrtW, enthaltend das Gen der Hydroxylase EUcrtZ aus Erwinia uredova20D3 (Accession No. D90087) und das Gen der Ketolase NPcrtW aus Nostoc punctiforme PCC73102 beide jeweils unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-EUcrtZ-BTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO: 51, Fig. 19);
Klonierung und Sequenzanalyse von Genen und Promotoren, die beispielhaft für die gentechnische Veränderung von Blakeslea trispora genutzt werden können.
Nachfolgend werden beispielhaft die Klonierung und Sequenzierung verschiedener Gene und Promotoren aus Blakeslea trispora beschrieben.
Klonierung und Sequenzanalyse ptefl
Die Klonierung von p-tef aus Blakeslea trispora erfolgte auf der Grundlage einer bereits in GenBank veröffentlichten Sequenz des Strukturgens für den Translations-Elongationsfaktor 1-α aus Blakeslea trispora (AF157235). Ausgehend von dem Sequenzeintrag AF157235 wurden Primer für die inverse PCR ausgewählt, um die stromaufwärts des Strukturgens gelegene Promotoregion zu amplifizieren und zu sequenzieren. In der inversen nested PCR an 200 ng Xhol-gespaltener und zirkularisier- ter genomischer DNA von Blakeslea trispora ATCC14272 wurde ein 3000- bp-Fragment in folgendem Ansatz erhalten: Matrizen-DNA (1 μg genomi- sehe DNA von Blakeslea trispora ATCC 14272) Primer MAT344 5'- GGCGTACTTGAAGGAACCCTTACCG-3' (SEQ ID NO: 63) und MAT 345 5'-ATTGATGCTCCCGGTCACCGTGATT-3' (SEQ ID NO: 64) je 0,25 μM, 100 μM dNTP, 10 μl Herculase-Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 μl. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus); 85 °C, 5 min (1 Zyklus); 60 °C, 30 s. 72 °C, 60 s, 95 °C, 30 s (30 Zyklen); 72 °C, 10 min (1 Zyklus). Der Sequenzabschnitt, der stromaufwärts des vermutlichen Startcodons des Gens tefl innerhalb 3000-bp- Fragmentes liegt, wurde als Promotor ptefl bezeichnet.
Klonierung Sequenzanalyse des Gens der HMG-CoA-Reduktase aus Blakeslea trispora
Zunächst wurde mit dem Cosmidvektor pANsCosI eine Genbank von Blakeslea trispora ATCC 14272, Mating Type (-) hergestellt. Der Vektor wur- de durch Spaltung mit Xbal linearisiert und anschließend dephosphoryliert. Eine weitere Spaltung mit mit BamHI schuf die Insertionsstelle, in welche die mit Sau3AI partiell gespaltene und dephosphorylierte genomische DNA von Blakeslea trispora ligiert wurde. Die derart gebildeten Cosmide wurden anschließend in vitro verpackt und in Escherichia coli übertragen. Auf der Grundlage der bekannten Sequenz eines Fragmentes des HMG- CoA-Reduktase codierenden Gens aus Blakeslea trispora (Eur. J. Biochem 220, 403-408 (1994)) wurde eine 315-bp-DNA-Sonde durch folgende PCR hergestellt. Reaktionsansatz: 1 μg genomische DNA von Blakeslea trispora ATCC 14272, Primer MAT314 5'- CCGATGGCGACGACGGAAGGTTGTT-3' [SEQ ID NO 79] und MAT315 5'-CATGTTCATGCCCATTGCATCACCT-3' [SEQ ID NO 80] je 0,25 μM, 100 μM dNTP, 10 μl Herculase-Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 μl. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus); 85 °C, 5 min (1 Zyklus); 58 °C, 30 s. 72 °C, 30 s, 95 °C, 30 s (30 Zyklen); 72 °C, 10 min (1 Zyklus). Mit dieser DNA-Sonde wurde die Cosmid-Genbank durchmustert. Es wurde ein Klon identifiziert, dessen Cosmid mit der DNA-Sonde hybridisierte. Die Insertion dieses Cosmids wurde sequenziert. Die DNA-Sequenz enthielt einen Abschnitt, der dem Gen einer HMG-CoA-Reduktase zugeord- net wurde [HMG-CoA-Red.gb].
Klonierung und Sequenzanalyse carB
(carB = Gen der Phytoendesaturase aus Blakeslea trispora)
Aus dem Sequenzvergleich der Peptidsequenzen von Phytoendesatura- sen und dem Vergleich der zugehörigen DNA-Sequenzen von Phycomyces blakesleeanus, Cercospora nicotianae, Phaffia rhodozyma und Neurospora crassa wurden die degenerierten Primer MAT182 5'- GCNGARGGNATHTGGTA-3' (SEQ ID 52) und MAT192 5'- TCNGCNAGRAADATRTTRTG-3' (SEQ ID 53) abgeleitet. Die PCR wurde in 100 μl Ansätzen durchgeführt. Diese enthielten 200 ng genomische DNA von Blakeslea trispora ATCC14272, 1 μM MAT182, 1 μM MAT192, 100 μM dNTP, 10 μl Pfu-Polymerasepuffer 10x, 2,5 U Pfu-Polymerase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 μl.
Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus); 85 °C, 5 min (1 Zyklus); 40 °C, 30 s, 72 °C, 30 s, 95 °C, 30 s (35 Zyklen); 72 °C, 10 min (1 Zyklus).
Hiermit wurde ein 358-bp-Fragment erhalten, dessen abgeleitete Peptid- sequenz Ähnlichkeit zu den Sequenzen der Phytoendesaturasen aufwies. Durch die Methode der inversen PCR (Innis et al. in PCR protocols: a guide to methods and applications. 1990. S. 219-227) wurden nach dem Prinzip des Chromosome-Walking die Genregionen stromaufwärts und stromabwärts des 350-bp-Fragmentes folgendermaßen amplifiziert, Moniert und sequenziert: (i) ein 1,1-kbp-Fragment durch PCR mit den Primern MAT219 5'- AAGTGACACCGGTTACACGCTTGTCTT-3' (SEQ ID 54) und MAT 220 5'-GCTTATCACCATCTGTTACCTCCTTGC-3' (SEQ ID 55) erhalten aus 200 ng EcoRI-gespaltener und zirkularisierter genomischer DNA von Blakeslea trispora ATCC14272, 0,25 μM MAT219, 0,25 μM MAT220, 100 μM dNTP, 10 μl Herculase- Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad
100 μl. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus); 85 °C, 5 min (1 Zyklus); 60 °C, 30 s. 72 °C, 60 s, 95 °C, 30 s (30 Zyklen); 72 °C, 10 min (1 Zyklus), (ii) ein 2,9-kbp-Fragment durch PCR mit den Primern MAT219 und MAT220 erhalten aus 200 ng Xbal-gespaltener und zirkularisierter genomischer DNA von Blakeslea trispora ATCC14272, 0,25 μM MAT219, 0,25 μM MAT220, 100 μM dNTP, 10 μl Herculase- Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 μl. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus); 85 °C, 5 min (1 Zyklus); 60 °C, 30 s, 72 °C, 3 min, 95 °C, 30 s (30 Zyklen); 72 °C,
10 min (1 Zyklus); Der klonierte Sequenzabschnitt ist schematisch in Fig. 20 (SEQ ID NO 77) dargestellt. Die Sequenzierung erfolgte in Strang- und Gegenstrangrich- tung mit den klonierten Fragmenten sowie mit den PCR-Produkten. Die Sequenz des klonierten Sequenzabschnitts ist in Fig. 21 (SEQ ID NO 78) gezeigt.
Sequenzvergleiche
Die Nukleotidsequenz von carB und die Peptidsequenz des abgeleiteten Proteins CarB wurden mit den bekannten Sequenzen verwandter Proteine verglichen. Zum Sequenzvergleich wurden die Programme GAP und BESTFIT eingesetzt.
CarB - Identische Aminoacylreste nach GAP
Programmeinstellungen: Gap Weight: 8 Length Weight: 2 Average Match: 2.912 Average Mismatch: -2.003 Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Aminosäuren zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC 14272 in % gefunden: Phycomyces blakesleeanus: 72,491 Phaffia rhodozyma: 50,460
Neurospora crassa: 47,943 Cercospora nicotianae: 47,740
CarB -Identische Aminoacylreste nach BESTFIT
Programmeinstellungen:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2.912
Average Mismatch: -2.003
Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Aminosäuren zu
CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden: Phycomyces blakesleeanus: 73,380
Phaffia rhodozyma: 53,175
Neurospora crassa: 51,896
Cercospora nicotianae: 50,791
carB - Identische Basen nach GAP
Programmeinstellungen: Gap Weight: 50
Length Weight: 3 Average Match: 10.000 Average Mismatch: 0.000 Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Basen zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden: Phycomyces blakesleeanus: 64,853 Cercospora nicotianae: 50,143 Phaffia rhodozyma: 43,179
Neurospora crassa: 42,130
carB -Identische Basen nach BESTFIT
Programmeinstellungen: Gap Weight: 50
Length Weight: 3
Average Match: 10.000
Average Mismatch: -9.000
Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Basen zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden:
Phycomyces blakesleeanus: 68,926
Phaffia rhodozyma: 62,403
Neurospora crassa: 60,230
Cercospora nicotianae: 56,884
Klonierung zur Expression von carB
Zur Klonierung und Expression von carB aus Blakeslea trispora wurden von dem oben beschriebenen klonierten Sequenzabschnitt aus Blakeslea trispora in sechs Leserastern die möglichen Proteinsequenzen abgeleitet. Diese Proteinsequenzen wurden mit den Sequenzen der Phytoendesatu- rasen aus Phycomyces blakesleeanus, Phaffia rhodozyma, Neurospora crassa, Cercospora nicotianae verglichen. Auf der Grundlage des Sequenzvergleiches wurden im klonierten Sequenzabschnitt der genomischen DNA von Blakeslea trispora drei Exons identifiziert, die zusammen- gefügt eine codierende Region ergeben, deren abgeleitetes Genprodukt über die gesamte Länge 72,7% identische Aminoacylreste mit der Phy- toendesaturase CarB aus Phycomyces blakesieeanus aufweist. Dieser Sequenzabschnitt aus drei möglichen Exons und zwei möglichen Introns wurde daher als Gen carB bezeichnet. Zur Überprüfung der vorhergesagten Genstruktur wurde die codierende Sequenz von carB aus Blakeslea trispora durch PCR mit cDNA von Blakeslea trispora als Matrize und mit den Primern Bol1425 5'-
AGAGAGGGATCCTTAAATGCGAATATCGTTGC-3' (SEQ ID 56) und Bol1426 δ'-AGAGAGGGATCCATGTCTGATCAAAAGAAGCA-S' (SEQ ID 57) erzeugt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde sequenziert. Die Lokali- sation von Exons und Introns wurde durch Vergleich der cDNA mit der genomischen DNA von carB bestätigt. In Fig. 21 ist die codierende Sequenz von carB schematisch dargestellt. Zur Expression von carB in Escherichia coli wurde zunächst die Ndel-Schnittstelle in carB durch die Methode overlap extension PCR entfernt sowie am 5'-Ende des Gens eine Ndel-Schnittstelle und am 3'-Ende eine Barn HI-Schnittstelle eingefügt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem Vektor pJOE2702 ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pBT4 bezeichnet und zusammen mit pCAR-AE in Escherichia coli XL1-Blue kloniert. Die Expression erfolgte durch Induktion mit Rhamnose. Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgte durch Nachweis der Lycopinsynthese via HPLC. Die Klonierungsschritte sind im folgenden beschrieben:
PCR 1.1 :
Ca. 0,5 μg cDNA von Blakeslea trispora, 0,25 μM MAT350 5"- ACTTTATTGGATCCTTAAATGCGAATATCGTTGCTGC-3' (SEQ ID 58), 0,25 μM MAT244 5'-
GTTCCAATTGGCCACATGAAGAGTAAGACAGGAAACAG-3' (SEQ ID 59), 100 μM dNTP, 10 μl Pfu-Polymerase-Puffer (lOx), 2,5 U Pfu- Polymerase (Zugabe bei 85 °C, "hot start") und H20 ad 100μL. Temperaturprofil: 1.95 °C 10 min, 2.85 °C 5 min, 3.40 °C 30s, 4.72 °C 1 min 30 s, 5.95 °C 30 s, 6.50 °C 30 s, 7.72 °C 1 min 30 s, 8.95 °C 30 s, 9.72 °C 10min Zyklen: (1-2.) 1x, (3-5.) 5x, (6-8.) 25x, (9.) 1x
PCR1.2:
Ca. 0,5 μg cDNA von Blakeslea trispora, 0,25 μM MAT243 5'- CCTGTCTTACTCTTCATGTGGCCAATTGGAACCAACAC-3' (SEQ ID 60), 0,25 μM MAT353 5'-
CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3' (SEQ ID 61), 100 μM dNTP, 10 μl Pfu-Polymerase-Puffer (lOx), 2,5 U Pfu-Polymerase (Zugabe bei 85 °C, "hot start") und H20 ad 100 μL. Temperaturprofil:
1. 95 °C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 40 °C 30s, 4. 72 °C 1 min 30 s, 5. 95 °C 30 s, 6. 50 °C 30 s, 7. 72 °C 1 min 30 s, 8. 95 °C 30s, 9. 72 °C 10min Zyklen: (1 -2.) 1x, (3-5.) 5x, (6-8.) 25x, (9.) 1x
Reinigung der PCR-Fragmente aus PCR 1.1, 1.2
Dazu wurde PCR 2 zur Herstellung der codierenden Sequenz von carB aus Blakeslea trispora für die Klonierung in pJOE2702 durchgeführt: Ca. 50 ng Produkt aus PCR 1.1 und ca. 50 ng Produkt aus PCR1.2 mit 0,25 μM MAT350 5'-
ACTTTATTGGATCCTTAAATGCGAATATCGTTGCTGC-3' (SEQ ID NO 58), 0,25 μM MAT353 5'-
CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3' (SEQ ID NO 61), 100 μM dNTP, 10 μL Pfu-Polymerase-Puffer (lOx), 2,5 U Pfu- Polymerase (Zugabe bei 85 °C, "hot start") und H20 ad 100 μL. Temperaturprofil:
1. 95°C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 59 °C 30 s, 4. 72 °C 2 min, 5. 95 °C 30 s, 6.72°C 10 min Zyklen: (1-2.) 1x, (3-5.) 22x, (6.) 1x Anschließend erfolgte eine Reinigung des erhaltenen Fragmentes (~ 1,7 kbp), eine Ligation in Vektor pPCR-Script-Amp, eine Klonierung in Escherichia coli XL1-Blue, Sequenzierung der Insertion, Spaltung mit Ndel und BamHI sowie eine Ligation in pJOE2702. Das erhaltene Plasmid wurde als pBT4 bezeichnet.
Charakterisierung und Nachweis der Enzymaktivität von CarB (Phytoendesaturase)
Das von carB abgeleitete Genprodukt wurde als CarB bezeichnet. CarB weist auf Grundlage der Peptidsequenzanalyse folgende Eigenschaften auf:
Länge: 582 Aminoacylreste
Molekulare Masse: 66470
Isoelektrische Punkt: 6,7 Katalytische Aktivität: Phytoendesaturase
Edukt: Phytoen
Produkt: Lycopin
EC-Nummer: EC 1.14.99-
Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgte in vivo. Wenn das Plasmid (pCAR-AE) in Escherichia coli XL1-Blue übertragen wird, entsteht der Stamm Escherichia coli XL1-Blue (pCAR-AE). Dieser Stamm synthetisiert Phytoen. Wenn zusätzlich das Plasmid pBT4 in Escherichia coli XL1-Blue übertragen wird, entsteht der Stamm Escherichia coli XL1-Blue (pCAR- AE)(pBT4). Da ausgehend von carB eine enzymatisch aktive Phytoende- saturase gebildet wird, produziert dieser Stamm Lycopin.
Die Plasmide pCAR-AE und pBT4 wurden daher in Escherichia coli übertragen. Nach Wachstum in Flüssigkultur wurden die Carotinoide aus den Zellen extrahiert und charakterisiert (vgl. oben). Durch HPLC Analyse wurde nachgewiesen, daß der Stamm Escherichia coli XL1-Blue (pCAR-AE) Phytoen und der Stamm Escherichia coli XL1- Blue (pCAR-AE)(pBT4) Lycopin produziert. CarB weist folglich die Enzymaktivität einer Phytoendesaturase auf.
Hersteilung gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispora zur Herstellung von Phytoen
Nachfolgend werden beispielhaft die Herstellung von gentechnisch veränderten Organismen zur Herstellung von Phytoen beschrieben.
Vector pBinAHygΔcarB zur Erzeugung von carB- -Mutanten von Blakeslea trispora
Für die Deletion von carB in Blakeslea trispora wurde der Vektor pBinAHygΔcarB (SEQ. ID. NO:62, Fig. 22) konstruiert. Der Vorläufer von pBi- nAHygΔcarB ist pBinAHyg (SEQ. ID. NO:3, Fig. 2). pBinAHyg wurde folgendermaßen konstruiert:
Aus dem Plasmid pANsCosI (SEQ. ID. NO:4, Fig. 1 , Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26:87-90) wurde die gpdA-hph Kassette als Bglll/Hindlll Fragment isoliert und in das BamHI/Hindlll geöffnete binäre Plasmid pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12:8711-8721) ligiert. Der so erhaltene Vektor wurde als pBinAHyg bezeichnet und enthält das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hph) unter Kontrolle des gpd Promotors und des trpC Terrminators aus Aspergillus nidulans sowie die entsprechenden Bordersequenzen, die für den DNA-Transfer von Agrobacterium notwen- dig sind.
Die Amplifikation der codierenden Sequenz von carB mit den Primern MAT350 (SEQ ID NO 58) und MAT353 (SEQ ID NO 61) mittels PCR wurde mit den folgenden Parametern durchgeführt: 50 ng pBT4 mit 0,25 μM MAT350 5'-ACTTTATTGGATCCTTAAAT- GCGAATATCGTTGCTGC-3', 0,25 μM MAT353 5'- CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3', 100 μM dNTP, 10 μL Pfu-Polymerase-Puffer, 2,5 U Pfu-Polymerase (Zugabe bei 85 °C, "hot start") und ad 100 μL H20 Temperaturprofil: 1. 95 °C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 58 °C 30s, 4. 72°C 2 min, 5. 95 °C 30s, 6. 72 °C 10 min. Zyklen: (1.-2.) 1x, (3-5.) 30x, (6.) 1x
Anschließend erfolgte eine Reinigung des erhaltenen Fragmentes (~ 1,7 kbp), eine Spaltung mit Hindlll, eine weitere Reinigung des 364-bp-Hindlll- Fragments-carB, gefolgt von einer Spaltung von pBinAHyg mit Hindlll, eine Ligation von 364-bp-Hindlll-Fragments-carB in pBinAHyg, eine Transformation des Vektors in Escherichia coli und eine Isolierung des Konstruktes und Bezeichnung als pBinAHygΔcarB wie oben beschrieben. Alternativ erfolgte eine partielle Spaltung mit Hindlll und die Klonierung eines größeren Hindill-Fragmentes aus carB in pBinAHyg zur Herstellung von pBinAHygΔcarB.
Erzeugung von carB" -Mutanten von Blakeslea trispora
Zunächst wurde das Plasmid pBinAHygΔcarB in den Agrobakterienstamm LBA 4404 übertragen, z. B. durch Elektroporation (vgl. oben). Anschließend wurde das Plasmid von Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 in Blakeslea trispora ATCC 14272 und in Blakeslea trispora ATCC 14271 übertragen (vgl. oben). Der erfolgreiche Nachweis des Gentransfers in Blakesleslea trispora erfolgte über Polymerase-Kettenreaktion nach folgendem Protokoll:
Ca. 0,5 ug DNA aus Blakeslea trispora ATCC 14272 carB" bzw. ATCC 14271 carB" wurden mit 0,25 μM Primer hph forward 5'- CGATGTAGGAGGGCGTGGATA-3' (SEQ ID NO 5), 0,25 μM Primer hph reverse 5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT-3' (SEQ ID NO 6), 100 μM dNTP, 10 μL Herculase-Polymerase-Puffer, 2,5 U Herculase-DNA- Polymerase (Zugabe bei 85 °C, "hot start") und ad 100 μl H20 umgesetzt. Temperaturprofil:
1. 95°C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 58 °C 1 min, 4. 72 °C 1 min, 5. 94 °C 1 min, 6.72°C 10 min.
Zyklen: (1.-2.) 1x, (3-5.) 30x, (6.) 1x
Als Negativkontrolle wurde eine Amplifikation des Kanamycinresistenz- gens aus Agrobacterium versucht. Dazu wurden folgende PCR- Bedingungen verwendet:
Ca. 0,5 μg DNA aus Blakesiea trispora ATCC 14272 carB" bzw. ATCC 14271 carB- wurden mit 0,25 μM Primer nptlll forward 5'- TGAGAATATCACCGGAATTG-3' (SEQ ID NO 7), 0,25 μM Primer nptlll reverse 5'-AGCTCGACATACTGTTCTTCC-3' (SEQ ID NO 8), 100 μM dNTP, 10 μL Herculase-Polymerase-Puffer, 2,5 U Herculase-DNA- Polymerase (Zugabe bei 85 °C, "hot start") und ad 100 μL H20 umgesetzt. Temperaturprofil:
1. 95 °C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 58 °C 1 min, 4. 72 °C 1 min, 5. 94 °C 1 min, 6. 72 °C 10 min- Zyklen: (1-2.) 1x, (3-5.) 30x, (6.) 1x
C) Produktion von Carotinoiden und Carotinoidvorstufen mit Blakesiea trispora Zur Produktion der Carotinoide Zeaxanthin, Canthaxanthin, Astaxanthin und Phytoen wurden die entsprechenden gentechnisch veränderten Blakeslea trispora (+) und (-) Stämme fermentiert, das produzierte Carotinoid mittels HPLC Analyse nachgewiesen und isoliert. Das Flüssigmedium zur Produktion von Carotinoiden enthielt pro Liter: 19 g Maismehl, 44 g Sojamehl, 0,55 g KH2P0 , 0,002 g Thiaminhydochlorid, 10 % Sonnenblumenöl. Der pH wurde mit KOH auf 7,5 eingestellt.
Zur Herstellung der Carotinoiden wurden Schüttelkolben mit Sporensuspensionen von (+) und (-) Stämmen der GVO von Blakeslea trispora beimpft. Die Schüttelkolben wurden bei 26 °C mit 250 rpm für 7 Tage inkubiert. Alternativ wurde zu Mischungen der Stämme nach 4 Tagen Trisporsäuren zugegeben und weitere 3 Tage inkubiert. Die Endkonzentration der Trisporsäuren betrug 300 - 400 μg/ml.
Extraktion und Analytik Extraktion:
1. Entnahme von 10 ml Kultursuspension 2. Zentrifugation, 10 min, 5.000 x g
3. Verwerfen des Überstandes
4. Resuspendierung des Pellets in 1 ml Tetrahydrofuran (THF) durch Vortexen
5. Zentrifugation, 5 min, 5.000 x g 6. Abnahme der THF-Phase
7. Wiederholung der Schritte 4.-6. (2 x)
8. Vereinigung der THF-Phasen
9. Zentrifugation der vereinigten THF-Phasen 5 min bei 20.000 x g, um Reste der wäßrigen Phase abzutrennen
Analytik
Messung von Phytoen mittels HPLC
Säule: ZORBAX Eclipse XDB-C8, 5 um, 150*4,6 mm Temperatur: 40 °C
Flußrate: 0,5 ml/min Injektionsvolumen: 10 μl Detektion: UV 220 nm
Stoppzeit: 12 min
Nachlaufzeit 0 min
Maximaldruck: 350 bar
Eluent A: 50 mM NaH2P04, pH 2,5 mit Perchlorsäure
Eluent B: Acetonitril
Gradient:
Zeit [min] A [%] B [%] Fluß [ml/min]
0 50 50 0,5
12 50 50 0,5
Als Matrix wurden Extrakte der Fermentationsbrühen verwendet. Vor der HPLC wurde jede Probe wird durch ein 0,22 μm Filter filtriert. Die Proben wurden kühl gehalten und vor Licht geschützt. Zur Kalibrierung wurden jeweils 50 - 1000 mg/l eingewogen und in THF gelöst. Als Standard wurde Phytoen verwendet, welches unter den gegebenen Bedingungen eine Re- tentionszeit von 7,7 min. aufweist.
Messung von Lycopin, ß-Carotin, Echinenon, Canthaxanthin, Crypto- xanthin, Zeaxanthin und Astaxanthin mittels HPLC
Säule: Nucleosil 100-7 C18, 250*4,0 mm (Macherey & Nagel)
Temperatur: 25 °C
Flußrate: 1,3 ml/min Injektionsvolumen: 10 μl
Detektion: 450 nm
Stoppzeit: 15min
Nachlaufzeit: 2 min
Maximaldruck: 250 bar Eluent A: 10% Aceton, 90% H20
Eluent B: Aceton ient:
Zeit [min] A [%] B [%] Fluß [ml/min]
0 30 70 1 ,3
10 5 95 1 ,3
12 5 95 1 ,3
13 30 70 1,3
Als Matrix wurden Extrakte der Fermentationsbrühen verwendet. Vor der HPLC wurde jede Probe wird durch ein 0,22 μm Filter filtriert. Die Proben wurden kühl gehalten und vor Licht geschützt. Zur Kalibrierung wurden jeweils 10 mg eingewogen und in 100 ml THF gelöst. Als Standard wurden folgende Carotinoide mit folgenden Retentionszeiten eingesetzt ß-Carotin (12,5 min), Lycopin (11 ,7 min), Echinenon (10,9 min), Cryptoxanthin (10,5 min), Canthaxanthin (8,7 min), Zeaxanthin (7,6 min) und Astaxanthin (6,4 min) [s. Fig. 23].
Produktion von Zeaxanthin mit gentechnisch veränderten Stämmen von Blakeslea trispora
Nachfolgend wird beispielhaft die Herstellung von Zeaxanthin mit gen- technisch veränderten Organismen (GVO) von Blakeslea trispora beschrieben.
Durch Agrobakterium-vermittelte Transformation wurde der Vektor pBinA- HygBTpTEFI-HPcrtZ in Blakeslea trispora übertragen (s.o.). Ein Hygro- mycin-resistenter Klon wurde isoliert und auf eine Kartoffel-Glucose- Agarplatte (Merck KGaA, Darmstadt) übertragen.
Nach drei Tagen Inkubation bei 26°C wurde ausgehend von dieser Platte ein Sporensuspension hergestellt. Ein 250-ml-Erlenmeyerkolben ohne Schikanen mit 50 ml Growth-Medium (Maismehl 47 g/l, Sojamehl 23 g/l, KH2P04 0,5 g/l, Thiamin-HCI 2.0 mg/l, pH mit NaOH vor der Sterilisa- tion auf 6,2-6,7 eingestellt) wurde mit 1x105 Sporen beimpft. Diese Vorkultur inkubierte 48 Stunden bei 26 °C und 250 upm. Für die Hauptkultur wurde ein 250-ml-Erlenmeyerkolben ohne Schikane enthaltend 40 ml Produktionsmedium mit 4 ml der Vorkultur beimpft und 8 Tage bei 26 °C und 150 upm inkubiert. Das Produktionsmedium enthielt Glucose 50 g/l, Ca- sein Acid Hydrolisate 2 g/l, Hefeextrakt 1 g/l, L-Asparagin 2 g/l, KH2P04 1,5 g/l, MgSO-4 x 7 H20 0,5 g/l, Thiamin-HCI 5 mg/l, Span20 10 g/l, Tween 80 1 g/l, Linolsäure 20 g/l, Maisquellwasser 80 g/l. Nach 72 Stunden erfolgte die Zugabe von Kerosin in einer Endkonzentration von 40 g/l Kero- sin. Nach der Ernte der Kulturen werden die verbliebenen ungefähr 35 ml Kul- tur mit Wasser auf 40 ml aufgefüllt. Anschließend werden die Zellen im Hochdruckhomogenisator, Typ Micron Lab 40, Fa. APV Gaulin, 3 x bei 1500 bar aufgeschlossen.
Die Suspension mit den aufgeschlossenen Zellen wurde mit 35 ml THF versetzt und 60 min bei RT im Dunkeln bei 250 upm geschüttelt. Danach wurden 2 g NaCI zugegeben und das Gemisch nochmals geschüttelt. Der Extraktionsansatz wurde dann 10 min bei 5000 x g zentrifugiert. Die gefärbte THF-Phase wurde abgenommen, die Zellmasse war vollständig entfärbt. Die THF-Phase wurde am Rotationsverdampfer bei 30 mbar und 30 °C auf 1 ml eingeengt und danach nochmals in 1 ml THF aufgenommen. Nach Zentrifugation 5 min bei 20 000 x g wurde ein Aliquot der oberen Phase entnommen und durch HPLC analysiert (Fig. 24, Fig. 23).
D) Aufarbeitung und Isolierung der Carotinoide bzw. des Nahrungsmittels
Die oben unter A) angegebenen Kulturbrühen wurden wie nachfolgend aufgearbeitet, um hochreine Carotinoide und ein entsprechendes Nah- rungsmittel zu erhalten. Der Carotinoidgehalt der Kulturbrühen 1, 2, 3 betrug zwischen 0,5 und 1,5 g/L.
D1) Beispiel gemäß Varainte a) IIA und Variante b) IIA bzw. IIB Die Kulturen mit identischen Medien (insgesamt ca. 1 L) wurden am Ende des Kultivierungszeitraums vereinigt und mit Hilfe eines Dispergiergeräts (Ultra.Turrax ®) homogenisiert.
Die Feststoffkonzentration in den Medien 1 und 2 betrug 37 g/l bzw. 11 g/L. Die Entwässerung der Kulturbrühe erfolgte durch eine Zentrifuge. Bei hohen Zellkonzentrationen bzw. hohem Feststoffgehalt des Mediums kann dieKulturbrühe auch ohne vorherige fest-flüssig-Trennung weiterverarbeitet werden (Medium 3: 127 g Feststoff/L. Nach vorheriger Homogenisation mit einem Dispergiergerät (Ultra-Turrax ®) und unter ständigem Rühren der Suspension wurde die Zellmasse über eine Schlauchpumpe auf den Trockner aufgegeben. Die Eindüsung in den Zylinder des Laborsprühtrockners erfolgte dabei über eine Zweistoffdüse mit dem Durchmesser 2,0 mm. Eingedüst wurde mit 2 bar und 4,5 Nm3/h Stickstoff. Die Temperatur am Eintritt betrug ca. 125°C bis 127°C. Das Trocknungsgas war Stickstoff mit einer Flussrate von 22 Nm3/h. Die Austrittstemperatur betrug zwischen 59°C und 61 °C. Bei jeder der drei Fermentationsbrühen konnte am Zyklon des Sprühtrockners rieselfähiges Produkt abgeschieden werden. Die Wandbeläge im Turm (sofern vorhanden) platzten automatisch von der Gefäßwand ab und werden als unproblematisch eingestuft.
Es wurden zwischen 8 und 100 g pulvriges Nahrungsmittel erhalten, welches direkt als Tierfuttermittel verwendet werden könnte. Es enthielt ca. 1- 10 % Carotinoide bezogen auf das Trockengewicht. Die Restfeuchte betrug weniger als 5%. Beispiel gemäß Variante b. IIC
D2) Extraktion mit Tetrahydrofuran
Die Zellen aus je 40 ml der Kulturbrühen 1, 2, 3 wurden 3 x bei 1500 bar durch einen Hochdruckhomogenisator, Typ Micron Lab 40, Fa. APV Gaulin aufgeschlossen. Je 20 ml der Suspensionen mit den aufgeschlossenen Zellen wurden mit 20 ml Tetrahydrofuran versetzt und 30 min, bei 30°C im Rundschüttler bei 200 Upm geschüttelt. Danach wurden 2 g NaCI zugesetzt und zur Phasentrennung 5 min bei 5000 x g zentrifugiert. Die THF- Phase wurde abgenommen. Danach wurde die wässrige Phase nochmals mit 20 ml THF extrahiert. Die Extrakte wurde vereinigt. Die Carotinoidkon- zentration wurde durch HPLC quantifiziert.
D3) Extraktion mit Methylenchlorid Die Biomassenabtrennung aus der Kulturbrühe (200 mL) erfolgte durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 10 min. in einer Laborzentrifuge.
Die abgetrennte Biofeuchtmasse (jeweils ca. 10 g bis 100 g) wurde mit 10 - 100 mL Wasser vermischt, um wasserlösliche Komponenten zu entfer- nen. Die Biomasse wurde abgetrennt (Laborzentrifuge) und danach mit Dampf (T = 121 , t = 30 min, 1 bar) im Autoklaven sterilisiert und so die Zellen aufgeschlossen.
Zu den Zelltrümmern wurden 25 - 250 g Methylenchlorid zugegeben und das Carotinoid aus der Biomasse mittels Ausschütteln extrahiert. Die Biomasse wurde in einer Laborzentrifuge abgetrennt.
Es wurde ein Lösungsmitteltausch von Methylenchlorid zu Methanol durchgeführt, wozu die Carotinoidlösung ca. vier Stunden bei 40°C bis 60°C gehalten und über diesen Zeitraum kontinuierlich mit insgesamt 20 -
200 mL Methanol versetzt wurde. Methylenchlorid wurde dabei als Lö- sungsmittel zurückgewonnen. Erste Carotinoid Kristalle fielen aus. Anschließend wurde langsam, über 6 h auf ca. 10 °C abgekühlt, wobei die Carotinoid Kristalle an Größe und Anzahl zunahmen. . Danach wurde die Mutterlauge abfiltriert und die Carotinoid Kristalle getrocknet. Ein Teil der Mutterlauge kann zum Lösungsmitteltausch wieden/erwendet werden. Der andere Teil wird destilliert und das so gereinigte Methanol im Lösungsmitteltausch wieden/erwendet.
Es wurden 0,0,08 g bis 0,24 g Carotinoid Kristalle erhalten, welche eine Reinheit (HPLC, vgl. oben) von 95 % aufwiesen. Die Ausbeute an Carotinoid Kristallen betrug 80 % bezogen auf die Konzentration an Carotinoid in der Biomasse.
Die abgetrennte methylenchloridfeuchte Biomasse wurde nach Wasserdampfdestillation sprühgetrocknet (TE = 125 °C, TA = 60 °C) und kann als Tierfuttermitteladditiv eingesetzt werden.
Hierzu wurde nach vorheriger Homogenisation mit einem Dispergiergerät (Ultra-Turrax) und unter ständigem Rühren der Suspension die Zellmasse über eine Schlauchpumpe auf den Trockner aufgegeben.
Die Eindüsung in den Zylinder des Laborsprühtrockners erfolgte dabei über eine Zweistoffdüse mit dem Durchmesser 2,0 mm. Eingedüst wurde mit 2 bar und 4,5 Nm3/h Stickstoff. Die Temperatur am Eintritt betrug ca. 125°C bis 127°C. Das Trocknungsgas war Stickstoff mit einer Flussrate von 22 Nm3/h. Die Austrittstemperatur betrug zwischen 59°C und 61 °C. Bei jeder der drei Fermentationsbrühen konnte am Zyklon des Sprühtrockners rieselfähiges Produkt abgeschieden werden. Die Wandbeläge im Turm (sofern vorhanden) platzten automatisch von der Gefäßwand ab und wurden als unproblematisch eingestuft. Es wurden ca. 2,5 - 25 g pulvriges Nahrungsmittel erhalten, welches direkt als Tierfuttermittel verwendet werden könnte. Es enthielt ca. 0,5% - 1 ,5% Carotinoide bezogen auf das Trockengewicht. Die Restfeuchte be- trug weniger als 5%.
Insgesamt (einschließlich des aufgereinigeten Carotinoid-Nahrungsmittels betrug die Ausbeute an Carotinoid ca, 95 % bezogen auf die Ausgangsmenge Carotinoid in der Kulturbrühe.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen mittels gentechnisch veränderter Organismen der Gattung Blakeslea um- fassend
(i) Transformation mindestens einer der Zellen,
(ii) ggf. Homokaryotisierung der aus (i) erhaltenen Zellen, so dass Zellen entstehen, in denen die Kerne in einem oder in mehreren genetischen Merkmalen alle gleichartig verändert sind und diese genetische Veränderung zur Ausprägung bringen, und
(vi) Selektion und Vermehrung der gentechnisch veränderten Zelle oder Zellen,
(vii) Kultivierung der gentechnisch veränderten Zellen,
(viii) Bereitstellung des von den gentechnisch veränderten Zellen produzierten Carotinoids oder der von den gentechnischen veränderten Zellen produzierten Carotinoidvorstufe.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Zellen von Pilzen der Art Blakeslea trispora handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der Transformation (i) ein Vector oder freie Nukleinsäuren verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der in der Transformation (i) eingesetzte Vector in das Genom mindestens einer der Zellen integriert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der in der Transformation (i) eingesetzte Vector einen Promotor und/oder einen Terminator enthält.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 3 bis 5, da- durch gekennzeichnet, dass in der Transformation (i) ein Vector enthaltend den gpd, pcarB, pcarRA und/oder ptefl Promotor und/oder den trpC Terminator eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 3 bis 6, da- durch gekennzeichnet, dass in der Transformation (i) ein Vector enthaltend ein Resistenzgen eingesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der in der Transformation (i) eingesetzte Vector ein Hygromycin- Resistenzgen (hph), insbesondere aus E. coli enthält.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 5 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass der gpd Promotor die Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 5 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass der trpC Terminator die Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist.
11.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 5 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass der tefl Promotor die Sequenz SEQ ID NO: 35 aufweist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11 , dadurch gekenn- zeichnet, dass der gpd Promotor und der trpC Terminator aus Aspergillus nidulans stammen.
13. Verfahren nach einem Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Vector die SEQ ID NO: 3 umfasst.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Transformation (i) mittels Agrobakterien, Kon- jugation, Chemikalien, Elektroporation, Beschuss mit DNA-beladenen
Partikeln, Protoplasten oder Mikroinjektion durchgeführt wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der Homokaryontisierung (ii) ein mutagenes Agens eingesetzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass als mutagenes Agens N-Methyl-N'-nitro-nitrosoguanidin (MNNG), UV- Strahlung oder Röntgenstrahlung eingesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion durch Markierung und/oder Auswahl der einkernigen Zellen erfolgt.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 - 17, dadurch gekennzeichnet, dass in der Selektion 5-Carbon-5-deazariboflavin (darf) und Hygromycin (hyg) oder 5-Fluororotat (FOA) und Uracil und Hygromycin eingesetzt werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der in der Transformation (i) eingesetzte Vector genetische Informationen zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen enthält.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 19, dadurch gekenn- zeichnet, dass der in der Transformation (i) eingesetzte Vector genetische Informationen zur Herstellung von Carotinen oder Xanthophyllen enthält.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der in der Transformation (i) eingesetzte Vector genetische Informationen zur Herstellung von Astaxanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, Andonixanthin, Adonirubin, Canthaxanthin, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Lycopin, ß-Carotin, α- Carotin, Lutein, Phytofluen, Bixin oder Phytoen enthält.
22. Verfahren zur Bereitstellung mindestens eines hochreinen Carotinoids und eines Nahrungsmittels, enthaltend Carotinoide-produzierende Organismen und mindestens das eine Carotinoid, umfassend nach der Kultivierung von Carotinoide-produzierenden Organismen der Gattung
Blakeslea die Schritte
I) Abtrennung der Biomasse,
IA) ggf. Waschen der Biomasse mit einem Carotinoide nicht lösenden Lösungsmittel, insbesondere Wasser, IB) Sterilisation und Zellaufschluß der Biomasse,
IC) ggf. Trocknung und/oder homogene Verteilung und
II) partielle Extraktion der Carotinoide aus der aufgeschlossenen Biomasse mittels eines Carotinoide lösenden Lösungsmittels und Trennung des Lösungsmittels von der Biomasse, IIA) 1) Entfernung von Lösemittelresten aus der Carotinoid- haltigen Biomasse,
2) ggf. homogene Suspension der Biomasse mit einem Biomasse-Feststoffgehalt > 10 3) Trocknung der Biomasse bzw. Suspension zur Herstellung des Nahrungsmittels,
IIB)
1) Kristallisation der Carotinoide aus dem verwendeten Lösungsmittel und Isolierung der Carotinoid-Kristalle, insbesondere durch Filtration.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Carotinoid aus der Gruppe bestehend aus Carotinen und Xanthophyllen ausgewählt ist.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Carotinoid aus der Gruppe bestehend aus Astaxanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, Andonixanthin, Ado- nirubin, Canthaxanthin, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Lycopin, ß-Carotin, Lutein, Phytofluen, Bixin und Phytoen ausgewählt ist.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Carotinoid Astaxanthin, Zeaxanthin, Bixin oder Phytoen ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 22-25, dadurch gekennzeichnet, dass die Sterilisation und der Zellaufschluß mittels Wasserdampf oder Mikrowellenstrahlung durchgeführt werden.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 22-26, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion der Carotinoide aus der Biomasse mittels Me- thylenchlorid oder überkritischem Kohlendioxid oder Tetrahydrofuran durchgeführt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die im überkritischen Kohlendioxid gelösten Carotinoide direkt isoliert werden oder in Methylenchlorid aufgenommen werden.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22-28, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion der Carotinoide aus der Biomasse ein oder ggf. mehrstufig erfolgt.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 22-29, dadurch gekennzeich- net, dass die Entfernung von Lösungsmitteln aus der Biomasse im
Schritt IA1) mittels Wasserdampf-Destillation .
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 22-30, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung in Schritt IIA3) mittels Sprühtrocknung oder Kontakttrocknung durchgeführt wird.
32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kristallisation im Schritt IIB1) durch graduellen Lösungsmittelaustausch gegen ein Carotinoide nicht lösendes Lösungsmittel erfolgt.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass der Austausch des verwendeten Lösungsmittels gegen Wasser oder einen niederen Alkohol, insbesondere Methanol erfolgt.
34. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der gentechnisch veränderte Organismus der Gattung Blakeslea durch Transformation mit einem Vector, der eine Sequenz aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NO: 37 - 51 und 62 aufweist, herstellbar ist.
5. Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittels enthaltend Organismen der Gattung Blakeslea und mindestens ein Carotinoid, umfassend nach der Kultivierung von Carotinoide-produzierenden Organismen der Gattung Blakeslea die Schritte
I) Homogene Suspendierung der Feststoffe der Kulturbrühe und
IIA) bei einem Biomasse-Feststoffgehalt der Kulturbrühe von > 2 % 1) ggf. Konzentration der Kulturbrühe auf einen Feststoffgehalt < 50 % und 2) Trocknung der Kulturbrühe zur Herstellung des Nahrungsmittels oder
IIB) bei einem Feststoffgehalt von < 2 % der Kulturbrühe,
1) Konzentration der Kulturbrühe auf einen Feststoffgehalt > 2 % und < 50 % und
2) Trocknung der Suspension zur Herstellung des Nah- rungsmittels, oder
MC) unabhängig vom Feststoffgehalt der Kulturbrühe, 1) Abtrennung der Biomasse, 2) ggf. Waschen der Biomasse mit Carotinoide nicht lösenden Lösungsmitteln, insbesondere Wasser,
3) Sterilisation und Zellaufschluß,
4) ggf. Trocknung und homogene Verteilung,
5) partielle Extraktion der Carotinoide aus der Biomasse mittels eines Carotinoide lösendes Lösungsmittels, 5a) Abtrennung der Carotinoid-haltigen Biomasse vom Carotinoid-haltigen Lösungsmittel, 5b) Entfernung von Lösemittelresten aus der Biomasse und 5c) Trocknung der Biomasse zur Herstellung des
Nahrungsmittels, 6) Kristallisation der Carotinoide aus dem in 5a) verwendeten Lösungsmittel und Isolierung der Carotinoid- Kristalle, insbesondere durch Filtration.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Carotinoid aus der Gruppe bestehend aus Carotinen und Xanthophyllen ausgewählt ist.
37. Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Carotinoid aus der Gruppe bestehend aus Asta- xanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, Andonixanthin, Ado- nirubin, Canthaxanthin, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Lycopin, ß-Carotin, Lutein, Bixin, Phytoen ausgewählt ist.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 35-37, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Carotinoid Astaxanthin, Zeaxanthin, Bi- xin oder Phytoen ist.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 35-38, dadurch gekennzeichnet, dass die Sterilisation und der Zellaufschluß im Schritt II3) mittels Wasserdampf oder Mikrowellenstrahlung durchgeführt wird.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 35-39, dadurch gekennzeich- net, dass die Extraktion der Carotinoide aus der Biomasse im Schritt
IIC5) mittels Methylenchlorid oder überkritischen Kohlendioxid durchgeführt wird.
41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass die im überkritischen Kohlendioxid gelösten Carotinoide direkt isoliert werden oder in Methylenchlorid aufgenommen werden..
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 35-41 , dadurch gekennzeich- net, dass die Extraktion der Carotinoide aus der Biomasse ein- oder ggf. mehrstufig erfolgt.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 35-42, dadurch gekennzeichnet, dass die Entfernung von Lösungsmitteln aus der Biomasse im Schritt IIC5b) mittels Wasserdampf-Destillation.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 35-43, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung in einem der Schritte IIA1), IIB2) oder IIC5c) mittels Sprühtrocknung oder Kontakt durchgeführt wird.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 35-44, dadurch gekennzeichnet, dass die Kristallisation im Schritt IIC6) durch graduellen Lö- sungsmittelaustausch gegen ein Carotinoide nicht lösendes Lösungsmittel erfolgt.
46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass der Austausch des verwendeten Lösungsmittels gegen Wasser oder einen niederen Alkohol, insbesondere Methanol erfolgt.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 35-46, dadurch gekennzeichnet, dass der gentechnisch veränderte Organismus der Gattung Blakeslea durch Transformation mit einem Vector, der eine Sequenz aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NO: 37 - 51 und 62 aufweist, herstellbar ist.
48. Nahrungsmittel, insbesondere Tierfuttermittel herstellbar nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 47.
49. Nahrungsergänzungsmittel, insbesondere Tierfutterergänzungsmittel herstellbar nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 47.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-49 dadurch gekennzeichnet, daß Nahrungsmittel und Tierfuttermittel aus einer Fermentation erhält- lieh sind.
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-49 dadurch gekennzeichnet, daß Nahrungsergänzungsmittel und Tierfutterergänzungsmittel aus einer Fermentation erhältlich sind.
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-49 dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Produkte aus der Gruppe Nahrungsmittel, Nahrungsergänzungsmittel, Tierfuttermittel und Tierfutterergänzungsmittel aus einer Fermentation erhältlich sind.
53. Verwendung der nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 14 erhältlichen Carotinoide zur Herstellung von kosmetischen, pharma- zeutischen, dermatologischen Zubereitungen, Nahrungsmitteln, Nah- rungsergänzungsmitteln, Tierfuttermittel oder Tierfutterergänzungsmittel.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108893486A (zh) * 2018-08-01 2018-11-27 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7663021B2 (en) 2002-12-06 2010-02-16 Del Monte Fresh Produce Company Transgenic pineapple plants with modified carotenoid levels and methods of their production
WO2004074490A2 (en) * 2003-02-24 2004-09-02 Genoclipp Biotechnology B.V. Method for transforming blakeslea strains
DE102004007624A1 (de) * 2004-02-17 2005-09-15 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Neue Ketolasen und Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden
US7091031B2 (en) * 2004-08-16 2006-08-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Carotenoid hydroxylase enzymes
EP1696032A1 (de) * 2005-02-23 2006-08-30 Bayer CropScience GmbH Verfahren und Mittel zur Herstellung von Hyaluronan in Pilzen
CN103589650A (zh) 2005-03-18 2014-02-19 米克罗比亚公司 产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生
WO2008042338A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
JP5706056B2 (ja) 2006-10-17 2015-04-22 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 サケ類の肉色改善方法
BRPI0823327A2 (pt) 2007-03-16 2013-10-22 Genomatica Inc Biocatalisadores microbianos que não ocorrem naturalmente e métodos para a biosíntese de ácido 4-hidroxibutanóico e 1,4-butanodiol
JP4969370B2 (ja) * 2007-08-29 2012-07-04 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 カロテノイドの製造方法
JP5762691B2 (ja) 2010-03-15 2015-08-12 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 発酵によるアスタキサンチン製造方法
EP2571996B1 (de) 2010-05-17 2017-03-08 Dynadis Biotehc (India) Private Limited Verfahren zur herstellung von hochreinem beta-karotin und lycopenkristallen aus pilzbiomasse
CN105308180A (zh) * 2012-12-20 2016-02-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 胡萝卜素羟化酶及其用于产生类胡萝卜素的用途
KR101963946B1 (ko) * 2014-05-20 2019-03-29 아스타 파마슈티칼즈 가부시키가이샤 카로테노이드 유도체, 그 약학상 허용되는 염 또는 그 약학상 허용되는 에스테르류 혹은 아미드류
KR101631057B1 (ko) * 2014-08-22 2016-06-17 영남대학교 산학협력단 발효된 감 슬러지를 이용한 카로티노이드의 생산방법
US11229095B2 (en) 2014-12-17 2022-01-18 Campbell Soup Company Electromagnetic wave food processing system and methods
CA3046436A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Deinove Methods of producing phytoene
EP3794017A4 (de) 2018-05-17 2022-03-09 Lumen Bioscience, Inc. Orale arthrospira-platensis-impfstoffabgabeplattform
US12252513B2 (en) 2018-07-16 2025-03-18 Lumen Bioscience, Inc. Thermostable phycobiliproteins produced from recombinant arthrospira
CA3143735A1 (en) 2019-07-03 2021-01-07 Lumen Bioscience, Inc. Arthrospira platensis non-parenteral therapeutic delivery platform
CN112226376A (zh) * 2020-09-25 2021-01-15 西北农林科技大学 酿造酵母Bei-29的健康营养型果酒的制备方法及检测方法
IT202200015231A1 (it) * 2022-07-20 2024-01-20 Bioinnova S R L S Microalghe esprimenti prodotti biologicamente attivi

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1184464A2 (de) * 1999-06-09 2002-03-06 Vitatene, S.A. Herstellungsverfahren für lycopen

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5466599A (en) * 1993-04-19 1995-11-14 Universal Foods Corporation Astaxanthin over-producing strains of phaffia rhodozyma
JP2000515742A (ja) * 1996-07-19 2000-11-28 ギスト ブロカデス ベスローテン フェンノートシャップ 天然原料からの結晶β―カロチンの回収方法
JP5303084B2 (ja) * 1997-04-11 2013-10-02 コニンクリーケ デーエスエム ナムローゼ フェンノートシャップ 工業的組み換え生物を溝築するための手段としての遺伝子変換
DE69841382D1 (de) * 1997-05-02 2010-01-28 Dsm Ip Assets Bv Isolierung von carotenoiden kristallen aus mikrobieller biomasse
EP1238068A1 (de) * 1999-12-08 2002-09-11 California Institute Of Technology Zielgerichtete evolution von biosynthese- und abbauwegen
RU2211862C2 (ru) * 2001-10-29 2003-09-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (-) ШТАММ ГЕТЕРОТАЛЛИЧНОГО ФИКОМИЦЕТА Blakeslea trispora, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЛИКОПИН В ПАРЕ С РАЗНЫМИ (+)ШТАММАМИ Blakeslea trispora, И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЛИКОПИНА
DE10300649A1 (de) * 2003-01-09 2004-07-22 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden durch Kultivierung von genetisch veränderten Organismen
KR20050092740A (ko) * 2003-01-09 2005-09-22 바스프 악티엔게젤샤프트 블라케슬레아 속 유기체의 유전자 변형 방법, 해당 유기체및 그의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1184464A2 (de) * 1999-06-09 2002-03-06 Vitatene, S.A. Herstellungsverfahren für lycopen

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mehta et al. (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 836-838. *
Mehta et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63, 3657-3661. *
Murillo et al. (1976) Mol. Gen Genet. 148, 19-24. *
Roncerro et al. (1984) Mut. Res. 125, 195-204. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108893486A (zh) * 2018-08-01 2018-11-27 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004063359A2 (de) 2004-07-29
RU2005125072A (ru) 2006-06-10
US20060234333A1 (en) 2006-10-19
KR20050092739A (ko) 2005-09-22
WO2004063359A3 (de) 2005-01-27
JP2006515516A (ja) 2006-06-01

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