EP1444503A1 - Verfahren und vorrichtung zum räumlich eng begrenzten anregen eines optischen übergangs - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum räumlich eng begrenzten anregen eines optischen übergangs

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EP1444503A1
EP1444503A1 EP02777141A EP02777141A EP1444503A1 EP 1444503 A1 EP1444503 A1 EP 1444503A1 EP 02777141 A EP02777141 A EP 02777141A EP 02777141 A EP02777141 A EP 02777141A EP 1444503 A1 EP1444503 A1 EP 1444503A1
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EP
European Patent Office
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excitation light
light beam
partial beams
focus
focus point
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EP02777141A
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English (en)
French (fr)
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EP1444503B1 (de
Inventor
Stefan Hell
Marcus Dyba
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Publication of EP1444503B1 publication Critical patent/EP1444503B1/de
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the invention relates to a method for spatially limited excitation of an optical transition, wherein a focus area of an excitation light beam extending across a focus point, the wavelength of which is matched to the optical transition to be excited, with a spatial, an intensity minimum at the focus point and a plurality of intensity maxima on different sides of the focal point, an interference pattern of an influencing optical beam that somehow influences the optical transition, is split into partial beams and is superimposed in the focus area in the form of its focused partial beams from different directions with self-made excitation light beam.
  • the invention relates to a device for carrying out such a method, with an excitation light source emitting the excitation light beam, with a first objective for focusing the excitation light beam onto the focus point, with an excitation light source emitting the excitation light beam, with a beam splitter splitting the excitation light beam into the partial beams, wherein one of the partial beams is focused on the focus point by the first lens, and with at least one second lens for focusing another of the partial beams on the focus point from a different direction in order to bring the partial beams into interference.
  • EP 0 801 759 B1 In the field of fluorescence microscopy it is known from EP 0 801 759 B1 to effectively reduce the area in which a sample is excited for the spontaneous emission of separately detectable fluorescent light by partially overlapping a focus area of an excitation light beam with the focus areas of stimulation light beams , which cause a stimulated emission of the sample, whereby the excited energy state of the sample, from which the spontaneous emission of fluorescent light results, is again de-energized.
  • the spontaneously emitted fluorescent light of interest can be separated from the light due to the stimulated emission on the basis of different wavelengths or different times of the emission.
  • the spontaneously emitted fluorescent light collected from the effectively reduced focus area of the excitation light beam comes from an area which is smaller than the actual one The focus area of the excitation light beam is.
  • Another starting point for reducing the effective focus area of a light beam is to generate an interference pattern in the focus area, for which purpose the excitation light beam is split into partial beams and the partial beams from different, preferably opposite directions are superimposed on one another in the focus area.
  • the delimitations of the intensity maxima of this interference pattern have a lower limit of lambda / 4n.
  • two further intensity maxima occur before and after the focal point in the common focus area of the two partial beams.
  • the present invention is not limited to applications in fluorescence microscopes. Rather, it extends to all cases in which an optical transition can be excited by excitation light, the optical transition being able to be influenced in some way by de-excitation light. This includes the case that the de-energizing light is used to de-energize an energy state by stimulated emission. However, it is also included that the de-excitation light depopulates a basic state from which the optical transition could be excited with the excitation light alone. The optical transition to be excited can also trigger a photochemical process which is in some way prevented or at least hindered by the de-excitation light.
  • de-excitation light or “de-excitation light beam” therefore has no other meaning in the context of this description than that the optical transition to be excited is influenced in some way. It is important for the invention to reduce the effective range of the excitation of the optical transition by using the de-excitation light beam. This does not mean, for example, that the superimposition of the de-excitation light beam with the excitation light beam requires simultaneous incidence in the focus area as long as the desired effect of the de-excitation light beam is still given in a chronological sequence.
  • the object of the present invention is to demonstrate a method and a device of the type described at the outset, with which it is possible to reduce the effective excitation range of the optical transition by the excitation light beam to dimensions of significantly smaller lambda / 2n without this being necessary high adjustment effort is required, which stands in the way of a realization.
  • this object is achieved according to the invention in that the wavefronts of the partial beams of the de-excitation light beam focused on the focus point from opposite directions are aberrated in the same way before focusing on the focus point, so that the intensity maxima of the interference pattern are spatially expanded on each of the sides of the focus point without eliminating the intensity minimum at the focus point.
  • the focus area of the excitation light beam is overlaid with the interference pattern of the de-excitation light beam which is brought into interference with itself, the intensity maxima of the interference pattern forming on both sides of the focus point being lubricated in such a way that only an excitation of the optical transition to be excited is effectively limited around the focal point at which the interference pattern of the de-excitation light beam has an intensity minimum.
  • this intensity minimum remains largely unaffected by the aberrations of the wave fronts of the partial beams of the excitation light beam.
  • the aberrations of the wave fronts have an effect in front of and behind the focus point, at which there is no absolute symmetry between the partial beams, in that the intensity maxima of the interference pattern lose their narrow spatial limitation and expand, so that the entire focus area of the excitation light beam is outside the intensity minimum of the interference pattern is detectable at the focus point.
  • the effective excitation of the optical transition to be excited is concentrated in a small area around the focal point, the dimensions of which fall far below the limit of lambda / 2n. Local resolutions in the range of Lambda / 10 and better can be reached.
  • the partial beams of the de-excitation light beam are focused on the focus point from diametrically opposite directions in order to form the interference pattern.
  • an angle in the range of 80 to 120 ° between the partial beams can also be present, for example.
  • the excitation light beam is preferably not brought into interference with itself in the focus area, because this takes place without one additional significant advantage is. At the same time, however, it significantly increases the adjustment effort when carrying out the new method, because then two interference patterns have to be adjusted to one another.
  • One criterion for a sufficient expansion of the intensity maxima of the interference pattern of the de-excitation light beam to cover the focus area of the excitation light beam outside the focus point is that the first and the second intensity maximum overlap on each side of the focus point. This means that an intensity zero between the first and the second intensity maximum disappears on each side of the focus point.
  • the wavefronts of the partial beams are preferably aberrated in the same way.
  • the wavefronts of the partial beams are aberrated in an identical and simple manner by aberrating the wavefronts of the de-excitation light beam before it is split into the partial beams. This results in a completely identical aberration of the wave fronts of the two partial beams, so that there is no risk that the intensity minimum in the interference pattern of the partial beams will be damaged at the focal point.
  • a central region of the wavefronts can be phase-shifted relative to their edge region.
  • the wave fronts of the partial beams of the de-excitation light beam are aberrated, areas of the wave fronts are phase-shifted from one another, it is preferred to carry out a phase shift by more than the coherence length of the de-excitation light beam so that the de-excitation light can no longer interfere destructively from the individual areas.
  • the intensity minima of the interference pattern of the non-aberrated partial beams are particularly effective in their Intensity increased.
  • its coherence length is synonymous with its pulse length.
  • the partial beams are preferably focused on the focal point with identical optics.
  • the optics are to be selected from the point of view of a large numerical aperture that goes as far as possible beyond 1.0. A half aperture angle of greater than 58 ° is preferred. Since the excitation light beam is also focused on the focus point by one of the two optics, the focus area of the excitation light beam already has the smallest possible spatial dimensions in the direction of the optical axis. The interference pattern of the two partial beams is also concentrated in this area.
  • the excitation light beam and the de-excitation light beam can differ in their wavelength and / or the time of their incidence in the focus area and / or the shape of the laser pulses they have formed.
  • a single laser can be used both as part of an excitation light source for the excitation light beam and as part of an excitation light source for the excitation light beam.
  • the spatial resolution of the new method can additionally be improved by superimposing light intensities of a further de-excitation light beam in the focus area on the excitation light beam.
  • This can be a further de-excitation light beam which differs from the first de-excitation light beam only in the type of aberration of the wave fronts of its partial beams, so that the new method is also implemented with it.
  • it can also be an excitation light beam in which the wave fronts of its partial beams are not aberrated or which is not split into partial beams to form an interference pattern, so that it essentially makes use of the principles known from the prior art.
  • Another addition to the new method is to carry out the method steps simultaneously in a plurality of focal areas lying next to and / or behind one another. This can be done, for example, by splitting the excitation light beam and the de-excitation light beam into a plurality of partial beams running side by side, which are focused in the plurality of focus areas.
  • Known means for such a beam splitting are pinhole diaphragm and microlens arrays.
  • the excitation light beam is used to excite a sample for the spontaneous emission of fluorescent light and the de-excitation light beam is used to change the excitation or to trigger stimulated emission of the sample, the spontaneously emitted fluorescent light being confocal detected.
  • This procedure corresponds to fluorescence microscopy.
  • a defined time sequence can also be used to separate the spontaneously emitted fluorescent light, in which the spontaneously emitted fluorescent light is only detected after the de-excitation light beam has decayed, which in turn follows the excitation light beam or at least decays later.
  • synchronization measures are known per se.
  • the excitation light beam can also be used to excite a state that is the initial state of a photochemical process, and the de-excitation light beam can be used to prevent this photochemical process.
  • optical data carriers can be written to.
  • a device of the type described at the outset is characterized in that in the beam path of the two partial beams focused on the focal point from opposite directions in front of the respective objective Optical element is arranged that aberrates the wavefronts.
  • the first lens and the second lens preferably focus the partial beams from opposite directions onto the focus point.
  • the possible beam paths are designed in such a way that the excitation light beam does not reach the focus area proportionally via the second lens.
  • the optical element aberrating the wave fronts can be arranged in front of the beam splitter in the de-excitation light beam.
  • the optical element aberrating the wavefronts may have an optical element that varies the phase of the de-excitation light across the wavefronts.
  • a possible embodiment of the aberrating optical element has, for example, a phase delay plate in its center, as a result of which a phase stage is introduced into the wave fronts.
  • other optical elements can also be used which cause other aberrations of the wave fronts, for example tilting or even curvatures of the wave fronts.
  • the wavefronts are particularly preferably aberrating optical elements which are computer-addressable in order to set a desired aberration.
  • optical elements are known and available in the form of active optical mirrors, for example as membrane mirrors with mechanical actuating elements, and of ferroelectric optical elements, for example as liquid crystal elements.
  • the two objectives of the new device are preferably identical and have a half aperture angle of greater than 58 °.
  • a phase adjustment element In order to adjust the intensity minimum of the interference pattern of the partial beams of the de-excitation light beam to the focal point, a phase adjustment element must be arranged in the beam path of one of the partial beams.
  • This also includes a phase adjustment element in the form of a beam splitter that can be displaced with a piezo actuator, the displacement of which only affects the Run length affects one of the partial beams.
  • only one active light source is provided, which directly serves either as an excitation light source or as an excitation light source.
  • a passive nonlinear optical element can be used to form the respective other light source.
  • the active light source is e.g. B. a pulsed laser and the passive nonlinear optical element a frequency doubling crystal or an optical parametric oscillator.
  • an adjustable intensity attenuation means can be arranged in at least one of the two partial beams. This can be a cuvette with a solution made of an absorbent material. Copper sulfate, for example, is suitable.
  • a detector for collecting fluorescent light can be arranged in a confocal arrangement to the focal point.
  • FIG. 3 shows a first measurement result achieved with the new device in comparison with the measurement result of a confocal fluorescence microscope and Fig. 4 shows a second measurement result achieved with the new device again in comparison with the measurement result of a confocal fluorescence microscope.
  • the device 1 shown schematically in FIG. 1 has an excitation light source 2 which emits an excitation light beam 3.
  • the excitation light source 2 delivers laser pulses 4 with a wavelength of 554 nm and a pulse duration of 250 fs.
  • the excitation light beam 3 is introduced via a mirror 5, through a first dichroic mirror 6 and a beam splitter 7 and via a second dichroic mirror 8 into a first objective 9 and from the objective 9 in the area of a sample 10 to a focal point 11, which is shown here an enlarged detail view next to the sample 10 is indicated, focused.
  • a partial beam divided by the excitation light beam 3 in the beam splitter 7 is blocked by a wavelength-selective element 40 which does not transmit light with the wavelength of the excitation light beam 13.
  • the excitation light beam 3 is actually not focused by the objective 9 onto the zero-dimensional focus point 11 but into a focus area 12 which has a certain spatial extent, in particular in the direction of the optical axis of the objective 9.
  • a focus area 12 which has a certain spatial extent, in particular in the direction of the optical axis of the objective 9.
  • the entire focus area 12 there is an excitation of the sample 10 into an excited energy state, from which the sample 10 spontaneously emits fluorescent light 13, back through the objective 9 and the dichroic mirror, whose transmission wavelength is matched to the wavelength of the fluorescent light 13, and reaches a detector 17 via a mirror 14 and through a lens 15 and a pinhole 16.
  • the pinhole 16 is arranged confocal to the focal point 11 in order to increase the spatial resolution when registering the fluorescent light with the detector 17.
  • the essential improvement in the local resolution in the detection of the fluorescent light is achieved here, however, with the aid of an de-excitation light beam 18 which comes from an de-excitation light source 19.
  • the de-excitation light source 19 emits laser pulses 20 of 13 ps duration and with a wavelength in the range of 750 nm. While the wavelength of the excitation light beam 3 is matched to an excitation of an energy state of the sample 10, from which the sample spontaneously emits fluorescent light, the wavelength of the de-excitation light beam 18 is selected such that a stimulated emission of the sample 10 is triggered which triggers the de-energized state of energy.
  • the area from which the detector 17 receives fluorescent light 13 can be locally limited to a narrow area around the focus point 11.
  • the detector 17 or an upstream optical element can distinguish the stimulated emission of the sample 10 on the basis of a wavelength deviating from the fluorescent light 13, or a temporal distinction can be made by first a laser pulse 4 of the excitation light beam 3 and then a Laser pulse 20 of the de-excitation light beam 18 is emitted onto the sample 10 and only after the laser pulse 20 and the stimulated emission of the sample 10 triggered by it have decayed, the detector 17 is activated to receive the spontaneously emitted fluorescent light from the sample 10.
  • the de-excitation light beam 18 is first guided through an optical element 21 which aberrates its wave fronts. Subsequently, the excitation light beam 18 is brought together with the excitation light beam 3 by the dichroic mirror 6, which reflects at the wavelength of the de-excitation light beam 18.
  • the de-excitation light beam 18 is split into two partial beams 22 and 23 in the beam splitter 7.
  • the partial beam 22 is guided like the excitation light beam.
  • the partial beam 23 passes through the wavelength-selective element 40, which is transparent at the wavelength of the de-excitation light beam 18, and via a mirror 24 to a second objective 25, which is identical to the objective 9.
  • the partial beam 23 is focused on the focus point 11 by the objective 25.
  • the excitation light beam in the form of its partial beams 22 and 23 is superimposed on itself in the focus area 12.
  • An interference pattern occurs.
  • the phase position of the interference pattern with respect to the focus point 11 is set such that an intensity minimum is formed at the focus point 11. This is done by moving the beam splitter 7 in the direction of a double arrow 26, for example with a piezo actuator.
  • the displacement of the beam splitter 26 only has an effect on the beam path of the partial beam 23 and thus on the relative phase position of the Partial beams 22 and 23 to each other.
  • the interference pattern of the partial beams 22 and 23 is recorded by their aberrated wavefronts 27 in the sense that the intensity maxima are lubricated on both sides of the focus point 11 so that they merge into one another, so that the intensity minima of a higher order of the interference pattern are increased in intensity. This is explained in more detail below in connection with FIG. 3.
  • FIG. 2 shows the mode of operation of the optical element 21 on incoming plane wavefronts 28 of the de-excitation light beam 18.
  • the phase of the wavefronts 28 is locally delayed by a phase plate 29 in the center of the optical element 21, which results in the step-shaped aberrated wavefronts 27, which are located next to the focal point 11 are indicated in Fig. 1.
  • other aberrations can be used and used in the same way. It is crucial that the flat wave fronts are deformed sufficiently to overlap the intensity maxima in the interference pattern of the partial beams 22 and 23 on both sides of the focal point 11.
  • FIG. 3 shows in the upper part (a) the formation of an interference pattern 30 from plane wave fronts 28 incident on the focus area 12 via the objectives 9 and 25 according to FIG. 1.
  • the focus point 11 is located on both sides in the middle of the interference pattern 30 each form 2 intensity maxima 31 and 32 of first and second order. These intensity maxima are sharply separated from one another by intensity minima 33 lying between them.
  • Fig. 3 (b), below outlines the effect achieved by the aberrated wavefronts 27 on the interference pattern 30.
  • the intensity maxima 31 and 32 of the first and second order are pulled apart a little from the focal point 11 and, in particular, expanded to such an extent that they overlap in the area of the intensity minimum 33 between them according to FIG.
  • the detector signal 34 of the device 1 according to FIG. 1 is compared with the detector signal 35 of a corresponding confocal fluorescence microscope. What is striking is the significantly smaller half-value width 39 of the signal 34 around the position of the fluorescent layer.
  • the half-value width here is only 46 +/- 5 nm. This is significantly smaller than one tenth of the wavelength of the excitation light beam.
  • the half-width of the signal 35 of the confocal fluorescence microscope is an order of magnitude larger.
  • FIG. 5 shows images of a bacterium whose membranes are marked with fluorescent dye.
  • FIG. 5 (a) shows on the left a two-dimensional image of the bacterium and on the right the signal curve along a line 36 drawn in the image of the bacterium, which were each recorded with a confocal fluorescence microscope.
  • 5 (b) shows, in comparison, corresponding recordings with the device 1 according to FIG. 1.
  • the membranes 37 of the bacterium 38 are resolved much better and more sharply.
  • a linear filtering of the signal according to FIG. 5 (b) can achieve an even greater resolution improvement.

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Description

Verfahren und Vorrichtung zum räumlich eng begrenzten Anregen eines optischen Übergangs
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum räumlich eng begrenzten Anregen eines optischen Übergangs, wobei ein sich über einen Fokuspunkt hinweg erstreckender Fokusbereich eines Anregungslichtstrahls, dessen Wellenlänge auf den anzuregenden optischen Übergang abgestimmt ist, mit einem räumlichen, ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt und mehrere Intensitatsmaxima auf verschiedenen Seiten des Fokuspunkts aufweisenden Interferenzmuster eines den optischen Übergang auf irgendeine Weise beeinflussenden, in Teilstrahlen aufgespaltenen und in dem Fokusbereich in Form seiner fokussierten Teilstrahlen aus unterschiedlichen Richtungen mit sich selbst zur Interferenz gebrachten Abregungslichtstrahls überlagert wird. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens, mit einer den Anregungslichtstrahl abgebenden Anregungslichtquelle, mit einem ersten Objektiv zum Fokussieren des Anregungslichtstrahls auf den Fokuspunkt, mit einer den Abregungslichtstrahl abgebenden Abregungslichtquelle, mit einem den Abregungslichtstrahl in die Teilstrahlen aufspaltenden Strahlteiler, wobei einer der Teilstrahlen durch das erste Objektiv auf den Fokuspunkt fokussiert wird, und mit mindestens einem zweiten Objektiv zum Fokussieren eines anderen der Teilstrahlen aus einer anderen Richtung auf den Fokuspunkt, um die Teilstrahlen zur Interferenz zu bringen.
Bereits 1873 hat Ernst Abbe herausgefunden, dass von einer Lichtquelle einfallende Lichtstrahlen mit einer Linse tatsächlich nicht in einen nulldimensionalen Fokuspunkt ohne räumliche Ausdehnung, sondern nur in einen im Regelfall zigarrenförmigen Fokusbereich um den geometrischen Fokuspunkt fokussiert werden kann. Die minimale Abmessung des Fokusbereichs beträgt etwa Lambda/(2n), wobei Lambda die Wellenlänge des Lichts und n den Brechungsindex angibt. Diese Grenze wirkt sich auf verschiedenen technischen Gebieten aus. Konkret überall dort, wo kontaktlos mit Licht auf einen räumlich begrenzten Bereich konzentriert werden soll, beispielsweise in der Lichtmikroskopie, der Lithographie oder dem Beschreiben von optischen Datenspeichermedien.
Auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie ist es aus der EP 0 801 759 B1 bekannt, den Bereich, in dem eine Probe zur spontanen Emission von separat detektierbarem Fluoreszenzlicht angeregt wird, effektiv dadurch zu verkleinert, dass ein Fokusbereich eines Anregungslichtstrahls teilweise mit den Fokusbereichen von Stimulationslichtstrahlen überlagert wird, die eine stimulierte Emission der Probe hervorrufen, wodurch der angeregte Energiezustand der Probe, aus dem hieraus die spontane Emission von Fluoreszenzlicht erfolgt, wieder abgeregt wird. Eine Trennung des interessierenden spontan emittierten Fluoreszenzlichts von dem Licht aufgrund der stimulierten Emission kann aufgrund unterschiedlicher Wellenlänge oder unterschiedlicher Zeitpunkte der Emission erfolgen. Das aus dem effektiv verkleinerten Fokusbereich des Anregungslichtstrahls aufgefangene spontan emittierte Fluoreszenzlicht stammt aus einem Bereich, der kleiner als der tatsächliche Fokusbereich des Anregungslichtstrahls ist.
Ein weiterer Ansatzpunkt zur Verkleinerung des effektiven Fokusbereichs eines Lichtstrahls ist es, in dem Fokusbereich ein Interferenzmuster zu erzeugen, wozu der Anregungslichtstrahl in Teilstrahlen aufgespalten wird und die Teilstrahlen aus unterschiedlichen, vorzugsweise entgegengesetzten Richtungen in dem Fokusbereich miteinander überlagert werden. Die Abgrenzungen der Intensitatsmaxima dieses Interferenzmusters haben eine Untergrenze von Lambda/4n. Typischerweise treten bei einem Intensitätsmaximum am Fokuspunkt aber auch noch zwei weitere Intensitatsmaxima vor und hinter dem Fokuspunkt in dem gemeinsamen Fokusbereich der beiden Teilstrahlen auf.
Um diese Nebenmaxima auszuschalten ist es aus Stefan W. Hell: "Increasing the Resolution of Far-Field Fluorescence Light Microscopy by Point-Spread-Function Engineering" in "Topics in Flurescence Spectroscopy"; Volume 5: "Nonlinear and Two- Photon-Induced Fluorescence", edited by J. Lakowicz, Plenum Press, New York, 1997 als Verfahren der eingangs beschriebenen Art bekannt, dem Interferenzmuster der Teilstrahlen des Anregungslichtstrahls ein Interferenzmuster von Teilstrahlen eines Stimulationslichtstrahls zu überlagern, wobei das Interferenzmuster des Stimulationslichtstrahls ein Minimum in dem Fokuspunkt aufweist und wobei die Wellenlänge des Stimulationslichtstrahls doppelt so groß ist wie die Wellenlänge des Anregungslichtstrahls. Auf diese Weise überdecken sich die vor und hinter dem Fokuspunkt liegenden Maxima des Stimulationslichtstrahls mit den Nebenmaxima des Anregungslichtstrahls, so dass effektiv nur das Hauptmaximum des Anregungslichtstrahls am Fokuspunkt zu der spontanen Emission angeregt wird, deren Fluoreszenzlicht detektiert wird. Die Beschränkung auf Fälle, in denen das Stimulationslicht die doppelte Wellenlänge wie das Anregungslicht hat, stellt einen erheblichen Nachteil dar. Darüber hinaus ist eine Vorrichtung zur Realisierung dieses Verfahrens durch einen extremen Justieraufwand gekennzeichnet, weil sowohl der Anregungslichtstrahl als auch der Stimulationslichtstrahl in Teilstrahlen aufgespalten und aus entgegengesetzten Richtungen in demselben Fokusbereich fokussiert werden muss und gleichzeitig die relative Phasenlage beider Teilstrahlenpaare zu dem Fokuspunkt eingestellt werden muss. So ist eine entsprechende Vorrichtung bis heute tatsächlich nicht realisiert worden, obwohl sie potentiell die Möglichkeit eröffnet, den effektiven Bereich der Anregung einer Probe durch den Anregungslichtstrahl weit unter die Grenze von Lambda/2n abzusenken.
Die vorliegende Erfindung beschränkt sich nicht auf Anwendungen bei Fluoreszenzmikroskopen. Sie erstreckt sich vielmehr auf alle Fälle, in denen ein optischer Übergang durch Anregungslicht anregbar ist, wobei der optische Übergang durch Abregungslicht auf irgendeine Weise beeinflussbar ist. Dies schließt den Fall ein, dass mit dem Abregungslicht ein Energiezustand durch stimulierte Emission wieder abgeregt wird. Es ist aber auch eingeschlossen, dass das Abregungslicht einen Grundzustand entvölkert, aus dem allein heraus der optische Übergang mit dem Anregungslicht angeregt werden könnte. Auch kann der anzuregende optische Übergang einen photochemischen Prozess auslösen, der durch das Abregungslicht auf irgendeine Weise verhindert oder zumindest behindert wird. Dem Begriff des Abregungslichts bzw. dem des Abregungslichtstrahls kommt daher im Rahmen dieser Beschreibung keine andere Bedeutung zu, als dass der anzuregende optische Übergang auf irgendeine Weise beeinflusst wird. Für die Erfindung kommt es dabei darauf an, den effektiven Bereich der Anregung des optischen Übergangs durch Einsatz des Abregungslichtstrahls zu verkleinern. Dies bedeutet beispielsweise nicht, dass die Überlagerung des Abregungslichtstrahls mit dem Anregungslichtstrahl ein zeitgleiches Einfallen in den Fokusbereich erfordert, solange die gewünschte Wirkung des Abregungslichtstrahls bei einer zeitlichen Abfolge noch gegeben ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art aufzuzeigen, mit denen es möglich ist, den Bereich der effektiven Anregung des optischen Übergangs durch den Anregungslichtstrahl auf Abmessungen deutlich kleiner Lambda/2n zu reduzieren, ohne dass hierfür ein hoher Justieraufwand erforderlich ist, der einer Realisation entgegen steht.
Bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass die Wellenfronten der aus entgegengesetzten Richtungen auf den Fokuspunkt fokussierten Teilstrahlen des Abregungslichtstrahls vor dem Fokussieren auf den Fokuspunkt in gleicher Weise aberriert werden, so dass auf jeder der Seiten des Fokuspunkts die Intensitatsmaxima des Interferenzmusters räumlich aufgeweitet werden, ohne das Intensitätsminimum am Fokuspunkt zu beseitigen.
Bei dem neuen Verfahren wird der Fokusbereich des Anregungslichtstrahls mit dem Interferenzmuster des mit sich selbst zur Interferenz gebrachten Abregungslichtstrahls überlagert, wobei die sich beiderseits des Fokuspunkts ausbildenden Intensitatsmaxima des Interferenzmusters so ausgeschmiert werden, dass effektiv nur eine Anregung des anzuregenden optischen Übergangs in einem eng begrenzten Bereich um den Fokuspunkt erfolgt, in dem das Interferenzmuster des Abregungslichtstrahls ein Intensitätsminimum aufweist. Dieses Intensitätsminimum bleibt aus Symmetriegründen durch die Aberrationen der Wellenfronten der Teilstrahlen des Anregungslichtstrahls weitgehend unbeeinflusst. Die Aberrationen der Wellenfronten wirken sich aber vor und hinter dem Fokuspunkt, an dem keine absolute Symmetrie zwischen den Teilstrahlen gegeben ist, aus, indem die Intensitatsmaxima des Interferenzmusters ihre enge räumliche Begrenzung verlieren und sich ausdehnen, so dass der gesamte Fokusbereich des Anregungslichtstrahls außerhalb des Intensitätsminimums des Interferenzmusters am Fokuspunkt erfassbar ist. So konzentriert sich die effektive Anregung des anzuregenden optischen Übergangs auf einen kleinen Bereich um den Fokuspunkt, dessen Abmessungen weit unter die Grenze von Lambda/2n fallen. Erreichbar sind Ortsauflösungen im Bereich von Lambda/10 und besser.
Bei dem neuen Verfahren ist es bevorzugt, wenn die Teilstrahlen des Abregungslichtstrahl aus einander diametral entgegengesetzten Richtungen auf den Fokuspunkt fokussiert werden, um das Interferenzmuster auszubilden. Bei der möglichen Verwendung von mehr als zwei Objektiven zur Fokussierung des Anregungslichtstrahls und der Teilstrahlen des Abregungslichtstrahls kann aber beispielsweise auch ein Winkel im Bereich von 80 bis 120° zwischen den Teilstrahlen vorliegen.
Bei dem neuen Verfahren wird der Anregungslichtstrahl in dem Fokusbereich vorzugsweise nicht mit sich selbst zur Interferenz gebracht, weil dies ohne einen zusätzlichen wesentlichen Vorteil ist. Gleichzeitig erhöht es aber den Justieraufwand bei der Durchführung des neuen Verfahren deutlich, weil dann zwei Interferenzmuster zueinander justiert werden müssen.
Ein Kriterium für eine ausreichende Ausweitung der Intensitatsmaxima des Interferenzmusters des Abregungslichtstrahls, um den Fokusbereich des Anregungslichtstrahls außerhalb des Fokuspunkts abzudecken, besteht darin, dass das erste und das zweite Intensitätsmaximum auf jeder Seite des Fokuspunkts überlappen. Dies bedeutet, dass eine Intensitätsnullstelle zwischen dem ersten und dem zweiten Intensitätsmaximum auf jeder Seite des Fokuspunkts verschwindet.
Um die Symmetrie beim Erhalten des Intensitätsminimums des Interferenzmusters der aberrierten Teilstrahlen des Abregungslichtstrahls an dem Fokuspunkt voll auszunutzen, werden die Wellenfronten der Teilstrahlen vorzugsweise in gleicher Weise aberriert.
Auf identische und einfache Weise werden die Wellenfronten der Teilstrahlen aberriert, indem die Wellenfronten des Abregungslichtstrahls vor seiner Aufspaltung in die Teilstrahlen aberriert werden. Hierdurch ist eine vollkommen identische Aberration der Wellenfronten beider Teilstrahlen gegeben, so dass keinerlei Gefahr besteht, dass das Intensitätsminimum im Interferenzmuster der Teilstrahlen am Fokuspunkt Schaden nimmt.
Beim Aberrieren der Wellenfronten der Teilstrahlen des Abregungslichtstrahls kann beispielsweise ein zentraler Bereich der Wellenfronten gegenüber ihrem Randbereich phasenverschoben werden.
Wenn beim Aberrieren der Wellenfronten der Teilstrahlen des Abregungslichtstrahls Bereiche der Wellenfronten gegeneinander phasenverschoben werden, ist es bevorzugt, eine Phasenverschiebung um mehr als die Kohärenzlänge des Abregungslichtstrahls vorzunehmen, damit das Abregungslicht aus den einzelnen Bereichen nicht mehr destruktiv interferieren kann. So werden die Intensitätsminima des Interferenzmusters der nicht aberrierten Teilstrahlen besonders effektiv in ihrer Intensität angehoben. Bei einem gepulsten Abregungslichtstrahl ist seine Kohärenzlänge mit seiner Pulslänge gleichbedeutend.
Vorzugsweise werden die Teilstrahlen bei dem neuen Verfahren mit identischen Optiken auf den Fokuspunkt fokussiert. Dabei sind die Optiken unter dem Gesichtspunkt einer großen, möglichst weit über 1 ,0 hinausgehenden numerischen Apertur auszuwählen. Bevorzugt ist ein halber Aperturwinkel von größer als 58°. Da auch der Anregungslichtstrahl durch eine der beiden Optiken auf den Fokuspunkt fokussiert wird, weist der Fokusbereich des Anregungslichtstrahls so bereits möglichst geringe räumlich Abmessungen in Richtung der optischen Achse auf. Auf dieses Gebiet konzentriert sich auch das Interferenzmuster der beiden Teilstrahlen.
Bei dem neuen Verfahren können sich der Anregungslichtstrahl und der Abregungslichtstrahl in ihrer Wellenlänge und/oder dem Zeitpunkt ihres Einfallens in den Fokusbereich und/oder der Form von von ihnen ausgebildeten Laserpulsen unterscheiden. Insbesondere kann ein einziger Laser sowohl als Teil einer Anregungslichtquelle für den Anregungslichtstrahl als auch als Teil einer Abregungslichtquelle für den Abregungslichtstrahl verwendet werden.
Die räumliche Auflösung des neuen Verfahrens kann zusätzlich dadurch verbessert werden, indem Lichtintensitäten eines weiteren Abregungslichtstrahls in dem Fokusbereich dem Anregungslichtstrahl überlagert werden. Dabei kann es sich um einen weiteren Abregungslichtstrahl handeln, der sich nur in der Art der Aberration der Wellenfronten seiner Teilstrahlen von dem ersten Abregungslichtstrahl unterscheidet, so dass auch mit ihm das neue Verfahren realisiert wird. Es kann sich aber auch um einen Abregungslichtstrahl handeln, bei dem die Wellenfronten seiner Teilstrahlen nicht aberriert werden oder der gar nicht zur Ausbildung eines Interferenzmusters in Teilstrahlen aufgespalten wird, so das er im wesentlichen von den aus dem Stand der Technik bekannten Prinzipien gebraucht macht. Der Einsatz eines weiteren Abregungslichtstrahls ist insbesondere zur Begrenzung des Bereichs der effektiven Anregung durch den Anregungslichtstrahl in radialer Richtung zu dessen Achse als sinnvolle Ergänzung zu der axialen Begrenzung denkbar, die das Hauptanliegen des neuen Verfahrens darstellt. Dazu ist ein einfacher, d.h. nicht mit sich selbst zur Interferenz gebrachter, weiterer Anregungslichtstrahl einsetzbar, dessen Kernbereich so ausgeblendet wird, dass sein verbleibender Rest nach dem Fokussieren eine Doughnut-förmige Intensitätsverteilung um den Fokuspunkt aufweist und der so die effektive Anregung durch den Anregungslichtstrahl in allen radialen Richtungen zu dessen Achse begrenzt.
Eine andere Ergänzung des neuen Verfahrens ist es, die Verfahrensschritte in mehreren neben- und/oder hintereinander liegenden Fokusbereichen gleichzeitig durchzuführen. Dies kann beispielsweise durch Aufspalten des Anregungslichtstrahls und des Abregungslichtstrahls in mehrere nebeneinander verlaufende Teilstrahlen erfolgen, die in den mehreren Fokusbereichen fokussiert werden. Bekannte Mittel für eine derartige Strahlaufspaltung sind Lochblenden- und Mikrolinsenarrays.
In einer konkreten Ausführungsform des neuen Verfahrens wird der Anregungslichtstrahl zur Anregung einer Probe zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht und der Abregungslichtstrahl zur Veränderung der Anregung oder zur Auslösung von stimulierter Emission der Probe verwendet, wobei das spontan emittierte Fluoreszenzlicht konfokal detektiert wird. Dieses Vorgehen entspricht einer Fluoreszenzmikroskopie. Zur Separierung des spontan emittierten Fluoreszenzlichts kann neben wellenlängenselektiven optischen Elementen auch eine definierte Zeitabfolge verwendet werden, bei der das spontan emittierte Fluoreszenzlicht erst nach dem Abklingen des Abregungslichtstrahls detektiert wird, der seinerseits auf den Anregungslichtstrahl folgt oder zumindest später als dieser abklingt. Derartige Synchronisationsmaßnahmen sind aber an sich bekannt.
Der Anregungslichtstrahl kann aber auch zur Anregung eines Zustande, der Ausgangszustand eines photochemischen Prozesses ist, und der Abregungslichtstrahl zur Verhinderung dieses photochemischen Prozesses verwendet werden. So können beispielsweise optische Datenträger beschrieben werden.
Eine Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang der beiden aus entgegengesetzten Richtungen auf dem Fokuspunkt fokussierten Teilstrahlen vor dem jeweiligen Objektiv ein optisches Element angeordnet ist, das die Wellenfronten aberriert.
Vorzugsweise fokussieren das erste Objektiv und das zweite Objektiv die Teilstrahlen aus einander entgegengesetzten Richtungen auf den Fokuspunkt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die möglichen Strahlengänge so angelegt sind, dass der Anregungslichtstrahls nicht anteilig auch über das zweite Objektiv in den Fokusbereich gelangt.
Das die Wellenfronten aberrierende optische Element kann vor dem Strahlteiler in dem Abregungslichtstrahl angeordnet sein.
Das die Wellenfronten aberrierende optische Element kann ein optisches Element aufweisen, das die Phase des Abregungslichts über die Wellenfronten hinweg variiert. Eine mögliche Ausführungsform des aberrierenden optischen Elements weist beispielsweise eine Phasenverzögerungsplatte in seinem Zentrum auf, wodurch eine Phasenstufe in die Wellenfronten eingeführt wird. Es sind aber auch andere optische Elemente einsetzbar, die andere Aberrationen der Wellenfronten bewirken, beispielsweise Verkippungen oder auch Krümmungen der Wellenfronten.
Besonders bevorzugt sind die Wellenfronten aberrierende optische Elemente, die computeradressierbar sind, um eine gewünschte Aberration einzustellen. Derartige optische Elemente sind in Form von aktiven optischen Spiegeln, beispielsweise als Membranspiegel mit mechanischen Stellelementen, und von ferroelektrischen optischen Elementen, beispielsweise als Flüssigkristallelemente, bekannt und verfügbar.
Vorzugsweise sind die beiden Objektive der neuen Vorrichtung identisch und weisen einen halben Aperturwinkel von größer als 58° auf. Um das Intensitätsminimum des Interferenzmusters der Teilstrahlen der Abregungslichtstrahls auf den Fokuspunkt zu justieren, ist in dem Strahlengang eines der Teilstrahlen ein Phasenjustierelement anzuordnen. Hierzu zählt auch ein Phasenjustierelement in Form eines mit einem Piezoaktuator verschieblichen Strahlteilers, dessen Verschiebung sich nur auf die Lauflänge eines der Teilstrahlen auswirkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der neuen Vorrichtung ist nur eine aktive Lichtquelle vorgesehen, die unmittelbar entweder als Anregungslichtquelle oder als Abregungslichtquelle dient. Zur Ausbildung der jeweils anderen Lichtquelle kann dabei ein passives nichtlineares optisches Element eingesetzt werden. Die aktive Lichtquelle ist z. B. ein gepulster Laser und das passive nichtlineare optische Element ein frequenzverdoppelnder Kristall oder ein optisch-parametrischer Oszillator.
In der praktischen Anwendung der neuen Vorrichtung ist es wichtig, die Teilstrahlen des Abregungslichtstrahls auf gleiche Intensität einzustellen, damit das Interferenzmuster tatsächlich eine Intensitätsnullstelle am Fokuspunkt ausbilden kann. Zu dem Abgleich der Intensitäten der Teilstrahlen kann in mindestens einem der beiden Teilstrahlen ein einstellbares Intensitätsabschwächungsmittel angeordnet sein. Dabei kann es sich um eine Küvette mit einer Lösung aus einem absorbierenden Material handeln. Geeignet ist beispielsweise Kupfersulfat.
Zur Realisation eines Fluoreszenzmikroskops als Ausführungsform der neuen Vorrichtung kann ein Detektor zum Auffangen von Fluoreszenzlicht in konfokaler Anordnung zu dem Fokuspunkt angeordnet sein.
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels, das sich auf die Ausbildung eines Fluoreszenzmikroskops bezieht, das aber insoweit nicht als Beschränkung der Erfindung zu interpretieren ist, näher erläutert und beschrieben, dabei zeigt
Fig. 1 den prinzipiellen Aufbau der neuen Vorrichtung,
Fig. 2 die Aberration von Wellenfronten in der neuen Vorrichtung,
Fig. 3 ein erstes mit der neuen Vorrichtung erzieltes Messergebnis im Vergleich mit dem Messergebnis eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops und Fig. 4 ein zweites mit der neuen Vorrichtung erzieltes Messergebnis wieder im Vergleich mit dem Messergebnis eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops.
Die in Fig. 1 schematisch dargestellte Vorrichtung 1 weist eine Anregungslichtquelle 2 auf, die einen Anregungslichtstrahl 3 abgibt. Die Anregungslichtquelle 2 liefert Laserpulse 4 mit einer Wellenlänge von 554 nm und einer Pulsdauer von 250 fs abgibt. Der Anregungslichtstrahl 3 wird über einen Spiegel 5, durch einen ersten dichroitischen Spiegel 6 und einen Strahlteiler 7 sowie über einen zweiten dichroitischen Spiegel 8 in ein erstes Objektiv 9 eingeleitet und von dem Objektiv 9 im Bereich einer Probe 10 auf einen Fokuspunkt 11 , der hier in einer vergrößerten Detaildarstellung neben der Probe 10 angedeutet ist, fokussiert. Ein von dem Anregungslichtstrahl 3 in dem Strahlteiler 7 abgeteilter Teilstrahl wird dabei von einem wellenlängenselektiven Element 40 abgeblockt, das Licht mit der Wellenlänge de Anregungslichtstrahls 13 nicht durchlässt. Aufgrund der Beugungsgrenze wird der Anregungslichtstrahl 3 von dem Objektiv 9 tatsächlich nicht auf den nulldimensionalen Fokuspunkt 11 sondern in einen Fokusbereich 12 fokussiert, der eine gewisse räumliche Ausdehnung, insbesondere in Richtung der optischen Achse des Objektivs 9 aufweist. In dem gesamten Fokusbereich 12 erfolgt eine Anregung der Probe 10 in einen angeregten Energiezustand, aus dem heraus die Probe 10 spontan Fluoreszenzlicht 13 emittiert, das zurück durch das Objektiv 9 und den dichroitischen Spiegel, dessen Durchlasswellenlänge auf die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts 13 abgestimmt ist, und über einen Spiegel 14 sowie durch eine Linse 15 und eine Lochblende 16 in einen Detektor 17 gelangt. Die Lochblende 16 ist konfokal zu dem Fokuspunkt 11 angeordnet, um die Ortsauflösung bei der Registrierung des Fluoreszenzlichts mit dem Detektor 17 zu erhöhen. Die wesentliche Verbesserung der lokalen Auflösung bei der Detektion des Fluoreszenzlichts wird hier aber mit Hilfe eines Abregungslichtstrahls 18 erreicht, der von einer Abregungslichtquelle 19 kommt. Die Abregungslichtquelle 19 gibt Laserpulse 20 von 13 ps Dauer und mit einer Wellenlänge im Bereich von 750 nm ab. Während die Wellenlänge des Anregungslichtstrahls 3 auf eine Anregung eines Energiezustands der Probe 10 abgestimmt ist, aus dem heraus die Probe spontan Fluoreszenzlicht emittiert, ist die Wellenlänge des Abregungslichtstrahls 18 so gewählt, dass eine stimulierte Emission der Probe 10 ausgelöst wird, die den angeregten Energiezustand wieder abregt. Durch eine Überlagerung des Abregungslichtstrahls 18 mit dem Anregungslichtstrahl 3 in dem Fokusbereich 12 auf bestimmte Weise kann der Bereich, aus dem der Detektor 17 Fluoreszenzlicht 13 empfängt, lokal auf einen engen Bereich um den Fokuspunkt 11 eingegrenzt werden. Dabei kann der Detektor 17 oder ein (nicht dargestelltes) vorgeschaltetes optisches Element die stimulierte Emission der Probe 10 aufgrund einer von dem Fluoreszenzlicht 13 abweichenden Wellenlänge unterscheiden, oder es kann eine zeitliche Unterscheidung vorgenommen werden, indem zunächst ein Laserpuls 4 des Anregungslichtstrahls 3 und dann ein Laserpuls 20 des Abregungslichtstrahls 18 auf die Probe 10 abgestrahlt wird und erst anschließend, nachdem der Laserpuls 20 und die durch ihn ausgelöste stimulierte Emission der Probe 10 abgeklungen sind, der Detektor 17 zum Empfangen des spontan emittierten Fluoreszenzlichts von der Probe 10 aktiviert wird.
Um mit dem Abregungslichtstrahl 18 die Probe zwar überall außerhalb des Fokuspunkts 11 wieder abzuregen, aber an dem Fokuspunkt 11 unbeeinflusst zu lassen, wird der Abregungslichtstrahl 18 zunächst durch ein optisches Element 21 geführt, das seine Wellenfronten aberriert. Anschließend wird der Anregungslichtstrahl 18 durch den dichroitischen Spiegel 6, der bei der Wellenlänge des Abregungslichtstrahls 18 reflektiert mit dem Anregungslichtstrahl 3 zusammengeführt. In dem Strahlteiler 7 wird der Abregungslichtstrahl 18 in zwei Teilstrahlen 22 und 23 aufgespalten. Der Teilstrahl 22 wird wie der Anregungslichtstrahl geführt. Der Teilstrahl 23 gelangt durch das bei der Wellenlänge des Abregungslichtstrahls 18 durchlässige wellenlängenselektive Element 40 und über einen Spiegel 24 zu einem zweiten Objektiv 25, das identisch zu dem Objektiv 9 ausgebildet ist. Von dem Objektiv 25 wird der Teilstrahl 23 auf den Fokuspunkt 11 fokussiert. Auf diese Weise wird der Anregungslichtstrahl in Form seiner Teilstrahlen 22 und 23 in dem Fokusbereich 12 mit sich selbst überlagert. Es kommt zu einem Interferenzmuster. Die Phasenlage des Interferenzmusters zu dem Fokuspunkt 11 wird so eingestellt, dass sich an den Fokuspunkt 11 ein Intensitätsminimum ausbildet. Dies geschieht durch Verschieben des Strahlteilers 7 in Richtung eines Doppelpfeil 26, beispielsweise mit einem Piezoaktuator. Die Verschiebung des Strahlteilers 26 wirkt sich nur auf den Strahlengang des Teilstrahls 23 aus und damit auf die relative Phasenlage der Teilstrahlen 22 und 23 zueinander. Das Interferenzmuster der Teilstrahlen 22 und 23 ist durch ihre aberrierten Wellenfronten 27 in dem Sinne verzeichnet, dass die Intensitatsmaxima auf beiden Seiten des Fokuspunkts 11 ausgeschmiert sind, so dass sie ineinander übergehen, so dass die Intensitätsminima höherer Ordnung des Interferenzmusters in der Intensität angehoben werden. Dies wird weiter unten im Zusammenhang mit Fig. 3 näher erläutert.
Fig. 2 zeigt die Wirkungsweise des optischen Elements 21 auf ankommende ebene Wellenfronten 28 des Abregungslichtstrahls 18. Durch eine Phasenplatte 29 im Zentrum des optischen Elements 21 wird die Phase der Wellenfronten 28 lokal verzögert, woraus die stufenförmigen aberrierten Wellenfronten 27 resultieren, welche neben dem Fokuspunkt 11 in Fig. 1 angedeutet sind. Andere Aberrationen sind aber in gleicher Weise nutzbar und geeignet. Entscheidend ist, dass die ebenen Wellenfronten hinreichend verformt werden, um die Intensitatsmaxima im Interferenzmuster der Teilstrahlen 22 und 23 beiderseits des Fokuspunkts 11 zur Überlappung zu bringen.
Fig. 3 zeigt in dem oberen Teil (a) die Entstehung eines Interferenzmusters 30 aus über die Objektive 9 und 25 gemäß Fig. 1 an den Fokusbereich 12 einfallenden ebenen Wellenfronten 28. Dabei ist zu erkennen, dass sich beiderseits des Fokuspunkts 11 in der Mitte des Interferenzmusters 30 jeweils 2 Intensitatsmaxima 31 und 32 erster bzw. zweiter Ordnung ausbilden. Diese Intensitatsmaxima sind durch dazwischen liegende Intensitätsminima 33 scharf voneinander getrennt. Demgegenüber skizziert Fig. 3 (b), unten den Effekt, der durch die aberrierten Wellenfronten 27 auf das Interferenzmuster 30 erzielt wird. Die Intensitatsmaxima 31 und 32 erster und zweiter Ordnung werden von dem Fokuspunkt 11 weg etwas auseinander gezogen und vor allem soweit aufgeweitet, dass sie in dem Bereich des bislang zwischen Ihnen befindlichen Intensitätsminimums 33 gemäß Fig. 3 (a) überlappen und die Intensität des Abregungslichts dort angehoben wird. Aus Symmetriegründen bleibt aber das Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt 11 bestehen. Durch das Interferenzmuster 30 gemäß Fig. 3 (b) kann somit die Anregung der Probe 10 in dem gesamten Fokusbereich 12 gemäß Fig. 1 bis auf den Bereich unmittelbar um den Fokuspunkt 11 wieder zurückgeführt werden. Entsprechend kann Fluoreszenzlicht detektiert werden, dessen Ursprung auf einen engen Bereich um den Fokuspunkt 11 konzentriert ist.
Fig. 4 zeigt als Beispiel das Signal des Detektors 17 über der Probentiefe z in Mikrometern bei Verwendung von Wasserimmersions-Objektiven 9 und 25 mit einer numerischen Apertur von 1 ,2 im Fall einer dünnen Fluoreszenzschicht in der Probe. Das Detektorsignal 34 der Vorrichtung 1 gemäß Fig. 1 ist dabei dem Detektorsignal 35 eines entsprechenden konfokalen Fluoreszenzmikroskops gegenüber gestellt. Auffällig ist die deutlich geringere Halbwertsbreite 39 des Signals 34 um die Lage der Fluoreszenzschicht. Die Halbwertsbreite beträgt hier nur 46 +/- 5 nm. Dies ist deutlich kleiner als ein Zehntel der Wellenlänge des Anregungslichtstrahls. Die Halbwertsbreite des Signals 35 des konfokalen Fluoreszenzmikroskops ist um eine Größenordnung größer.
Fig. 5 zeigt Bilder eines Bakteriums, dessen Membranen mit Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Fig. 5 (a) zeigt dabei links ein zweidimensionales Bild des Bakteriums und rechts den Signalverlauf entlang einer in dem Bild des Bakteriums eingezeichneten Linie 36, die jeweils mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop aufgezeichnet wurden. Fig. 5 (b) zeigt im Vergleich dazu entsprechende Aufnahmen mit der Vorrichtung 1 gemäß Fig. 1. Hier werden die Membranen 37 des Bakteriums 38 viel besser und schärfer aufgelöst. Durch eine lineare Filterung des Signals gemäß Fig. 5 (b) kann eine noch größere Auflösungsverbesserung erreicht werden.
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1 - Vorrichtung
2 - Anregungslichtquelle
3 - Anregungslichtstrahl
4 - Laserpuls
5 - Spiegel
6 - Spiegel
7 - Strahlteiler
8 - Spiegel
9 - Objektiv
10 - Probe
11 - Fokuspunkt
12 - Fokusbereich
13 - Fluoreszenzlicht
14 - Spiegel
15 - Linse
16 - Lochblende
17 - Detektor
18 - Abregungslichtstrahl
19 - Abregungslichtquelle
20 - Laserpuls
21 - optisches Element
22 - Teilstrahl
23 - Teilstrahl
24 - Spiegel
25 - Objektiv
26 - Doppelpfeil - aberrierte Wellenfront - Wellenfront - Phasenplatte - Interferenzmuster
- Intensitätsmaximum - Intensitätsmaximum - Intensitätsminimum - Detektorsignal - Detektorsignal - Linie - Membran - Bakterium - Halbwertsbreite - wellenlängenselektives Element

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E :
1. Verfahren zum räumlich eng begrenzten Anregen eines optischen Übergangs, wobei ein sich über einen Fokuspunkt hinweg erstreckender Fokusbereich eines Anregungslichtstrahls, dessen Wellenlänge auf den anzuregenden optischen Übergang abgestimmt ist, mit einem räumlichen, ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt und mehrere Intensitatsmaxima auf verschiedenen Seiten des Fokuspunkts aufweisenden Interferenzmuster eines den optischen Übergang auf irgendeine Weise beeinflussenden, in Teilstrahlen aufgespaltenen und in dem Fokusbereich in Form seiner fokussierten Teilstrahlen aus unterschiedlichen Richtungen mit sich selbst zur Interferenz gebrachten Abregungslichtstrahls überlagert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenfronten (28) der aus unterschiedlichen Richtungen auf den Fokuspunkt (11 ) fokussierten Teilstrahlen (22, 23) vor dem Fokussieren auf den Fokuspunkt (11) aberriert werden, so dass auf jeder der Seiten des Fokuspunkts (11) die Intensitatsmaxima (31 , 32) des Interferenzmusters (30) räumlich aufgeweitet werden, ohne das Intensitätsminimum am Fokuspunkt (11 ) zu beseitigen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Teilstrahlen (22, 23) aus entgegengesetzten Richtungen auf den Fokuspunkt fokussiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungslichtstrahl (3) in dem Fokusbereich (12) nicht mit sich selbst zur Interferenz gebracht wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitatsmaxima (31, 32) des Interferenzmusters (30) so weit räumlich aufgeweitet werden, dass eine Intensitätsnullstelle zwischen dem ersten und dem zweiten Intensitätsmaximum (31, 32) auf jeder Seite des Fokuspunkts (11 ) verschwindet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenfronten (28) der Teilstrahlen (22, 23) des Abregungslichtstrahls (18) in gleicher Weise aberriert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenfronten (28) des Abregungslichtstrahls (18) vor seiner Aufspaltung in die Teilstrahlen (22, 23) aberriert werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass beim Aberrieren der Wellenfronten (28) der Teilstrahlen (22, 23) des Abregungslichtstrahls (18) ein zentraler Bereich der Wellenfronten (28) gegenüber ihrem Randbereich phasenverschoben wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass beim Aberrieren der Wellenfronten (28) der Teilstrahlen (22, 23) des Abregungslichtstrahls (18) Bereiche der Wellenfronten (28) um mehr als die Kohärenzlänge des Abregungslichtstrahls (18) gegeneinander phasenverschoben werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilstrahlen (22, 23) mit identischen Optiken (9, 25) mit einem halben Aperturwinkel von größer als 58° auf den Fokuspunkt (11 ) fokussiert werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungslichtstrahl (3) und der Abregungslichtstrahl (18) sich in ihrer Wellenlänge und/oder dem Zeitpunkt ihres Einfallens in den Fokusbereich (11) und/oder der Form von von ihnen ausgebildeten Laserpulsen (4, 20) unterscheiden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Lichtintensitäten eines weiteren Abregungslichtstrahls in dem Fokusbereich dem Anregungslichtstrahl überlagert werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte in mehreren neben- und/oder hintereinander liegenden Fokusbereichen gleichzeitig durchgeführt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungslichtstrahl (3) zur Anregung einer Probe (10) zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht (13) und der Abregungslichtstrahl (18) zur Verhinderung der Anregung oder zur Auslösung von stimulierter Emission der Probe (10) verwendet wird, wobei das spontan emittierte Fluoreszenzlicht (13) konfokal detektiert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungslichtstrahl (3) zur Anregung eines Zustande, der Ausgangszustand eines photochemischen Prozesses ist, und der Abregungslichtstrahl (18) zur Verhinderung dieses photochemischen Prozesses verwendet wird.
15. Vorrichtung zum räumlich eng begrenzten Anregen eines optischen Übergangs nach einem der Ansprüche 1 bis 14, mit einer den Anregungslichtstrahl abgebenden Anregungslichtquelle, mit einem ersten Objektiv zum Fokussieren des Anregungslichtstrahls auf den Fokuspunkt, mit einer den Abregungslichtstrahl abgebenden Abregungslichtquelle, mit einem den Abregungslichtstrahl in die Teilstrahlen aufspaltenden Strahlteiler, wobei einer der Teilstrahlen durch das erste Objektiv auf den Fokuspunkt fokussiert wird, und mit mindestens einem zweiten Objektiv zum Fokussieren eines anderen der Teilstrahlen aus einer anderen Richtung auf den Fokuspunkt, um die Teilstrahlen zur Interferenz zu bringen, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang der beiden aus unterschiedlichen Richtungen auf den Fokuspunkt (11) fokussierten Teilstrahlen (22, 23) vor dem jeweiligen Objektiv (9, 25) ein optisches Element (21) angeordnet ist, das die Wellenfronten (28) aberriert.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Objektiv (9) und das zweite Objektiv (25) die Teilstrahlen (22, 23) aus einander entgegengesetzten Richtungen auf den Fokuspunkt (11) fokussieren.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungslichtstrahls (3) nicht anteilig auch über das zweite Objektiv (25) in den Fokusbereich (12) gelangt.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das die Wellenfronten (28) aberrierende optische Element (21 ) vor dem Strahlteiler (7) in dem Abregungslichtstrahl (18) angeordnet ist.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das die Wellenfronten (28) aberrierende optische Element (21) ein optisches Element aufweisen, das die Phase des Abregungslichts über die Wellenfronten (28) hinweg variiert.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das die Wellenfronten (28) aberrierende optische Element (21) computeradressierbar ist, um eine gewünschte Aberration einzustellen.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Objektive (9, 25) identisch sind und einen halben Aperturwinkel größer als 58° aufweisen und dass in dem Strahlengang eines der Teilstrahlen (22, 23) ein Phasenjustierelement angeordnet ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektor (17) zum Auffangen von Fluoreszenzlicht (13) in konfokaler Anordnung zu dem Fokuspunkt (11) angeordnet ist.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem der beiden Teilstrahlen ein einstellbares Intensitätsabschwächungsmittel angeordnet ist, mit dem die Intensitäten der Teilstrahlen (22,23) des Abregungslichtstrahls (18) abgleichbar sind.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass nur eine aktive Lichtquelle vorgesehen, die unmittelbar entweder als Anregungslichtquelle oder als Abregungslichtquelle ausbildet, wobei die jeweils andere Lichtquelle neben der aktiven Lichtquelle zusätzlich ein passives nichtlineares optisches Element aufweist.
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