EP1442304A2 - Verfahren zum auffinden von pharmakologisch aktiven wirkstoffen, die die funktion von nervenzellen beeinflussen - Google Patents

Verfahren zum auffinden von pharmakologisch aktiven wirkstoffen, die die funktion von nervenzellen beeinflussen

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EP1442304A2
EP1442304A2 EP02802277A EP02802277A EP1442304A2 EP 1442304 A2 EP1442304 A2 EP 1442304A2 EP 02802277 A EP02802277 A EP 02802277A EP 02802277 A EP02802277 A EP 02802277A EP 1442304 A2 EP1442304 A2 EP 1442304A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
igfbp
igf
cell
activity
sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02802277A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Anton Sendtner
Jennifer Gunnersen
Hans-Harald Sedlacek
Stefan Wiese
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Original Assignee
Sewiras GmbH
Medinnova Gesellschaft fuer Medizinische Innovationen aus Akademischer Forschung mbH,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sewiras GmbH, Medinnova Gesellschaft fuer Medizinische Innovationen aus Akademischer Forschung mbH, filed Critical Sewiras GmbH
Publication of EP1442304A2 publication Critical patent/EP1442304A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4745—Insulin-like growth factor binding protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Definitions

  • the invention relates to a method for finding pharmacologically active substances which influence the function of nerve cells, a sample being brought into contact with a prospective active substance or a mixture of such active substances, with or simultaneously the activity of a biologically active molecule is determined, and a prospective active ingredient or a mixture of such active ingredients is selected if the activity of the biologically active molecule is reduced or increased when it is brought into contact.
  • the invention further relates to uses of active substances identified in this way.
  • Neuropathies are nerve disorders that are associated with motor and / or sensitive nerve conduction disorders.
  • the cause of neuropathies can be toxic, metabolic, infectious or inflammatory, with an inflammatory component involved in practically all cases of neuropathy.
  • the most common neuropathies are motor neuropathies that develop in the course of diabetes mellitus.
  • a special feature of these diabetogenic neuropathies is the degeneration of the motor end plates, the loss of the axons and the atrophy of the motor neurons.
  • the causes of neuropathy ie the toxic, metabolic, infectious or inflammatory causes, are often known, the molecular processes that are involved in the pathogenesis are largely unclear.
  • IGF-1 or -2 IGF-1 and IGF-2 are among those growth factors that support the survival of neurons and glial cells in vitro and in vivo. These factors promote the division of neural progenitor cells, the maturation and survival of motor neurons and Schwanschen cells (Arakawa et al. (1990) J. Neurosci. 10: 3507-3515; Syroid et al. (1999) J Neurosci. 19 : 2059-2068).
  • mice that either contained noisy IGF-1 or IGF-2 or overexpressed IGF-1 indicated that IGF stimulates the formation of myelin (Liu et al. (1993) Gell 75: 59-72 ; Beck et al. (1995) Neuron 14: 717-730; Carson et al. (1993) Neuron 10: 729-740).
  • IGFs In contrast to most growth factors, IGFs are present in the bloodstream in large quantities, but only a very small part of them are in the form of free IGF. The majority forms complexes with the so-called “Insulin-like Growth Factor Binding Proteins” (IGFBP) and another large protein called “Acid Labile Subunit” (ALS) (Blum et al. (1991) in: Modern Concepts in Insulin-Like Growth Factors, published by Spencer, Elsevier, New York, 381-893). So far, six different IGFBPs have been identified (Yamanaka et al. (1997) J Biol. Chem. 272: 30729-30734).
  • IGFBP Insulin-like Growth Factor Binding Proteins
  • ALS Acid Labile Subunit
  • IGFBP-5 is a glycosylated protein with a molecular weight of approximately 26 kDa, which binds to IGF-1 and IGF-2 with high affinity (Drop et al. (1992) Growth Regulation 2: 69-79 ; WO 97/03470).
  • IGFBP-5 can be detected in other organs to a considerable extent in the nervous system, for example in glial cells and in Purkinje cells and cerebellar granule cells (Bondy and Li (1993) J. Neurosci. 13: 5092-5104; Stenvers et al. (1994) J Comp. Neurol. 339: 91-105; Rochier et al. (2001) J Neurochem. 76: 11-20). Immunohistochemical studies show a localization of the protein on the cell membrane of Purkinje cells. IGFBP-5 can also be detected immunohistologically on and in myelinated axons.
  • IGFs promote the growth of nerve cells, complexes of IGF-1 and IGFBP-3 (WO 95/13823 and WO 99/62526), antisense oligonucleotides that are specific for IGFBP, antibodies that are specific for IGFBP, and peptides have been used
  • IGFBP Inhibition of the binding of IGFBP (WO 98/32022, WO 98/45427 and WO 99/32620) for the treatment of a number of diseases is described.
  • diseases also include diseases of the nervous system, such as amyotropic lateral sclerosis (WO 99/32620 and WO 99/62536), central and peripheral neuropathies (WO 99/32620), or Alzheimer's disease or Huntington's disease (WO 95 / 13823), a.
  • the invention is based on the technical problem of specifying a screening method by means of which further substances, in particular also non-natural substances, can be identified that are highly effective, in particular also more effective than IGF-1 or IGF-2, promote the survival of nerve cells.
  • the invention teaches a method for finding pharmacologically active substances which influence the function of nerve cells, which comprises the following steps: a) contacting a sample containing IGFBP-5 or an active part thereof with a potential active substance or a mixture of such active substances, b) determining the activity of IGFBP-5 in the sample and c) selecting an active substance or mixture of active substances which increases or decreases, in particular decreases or inhibits, the activity of IGFBP-5 in the sample.
  • the invention is based on the finding that the increased formation of IGFBP-5 in nerve cells leads to an impairment of the function of the nerve cells.
  • transgenic mice which overexpress in their motor neurons IGFBP-5 show a loss of their axons and a degeneration of their motor neurons and develop the clinical picture of neuropathy which is associated with the typical functional losses of the nerve cells.
  • Another surprising finding in addition to the findings from transgenic animal experiments is that increased amounts of the RNA coding for IGFBP-5 could be detected in nerve cells of patients with diabetes mellitus. This increase in IGFBP-5 is specific to diabetogenic forms of neuropathy because it was not found in the nerves of patients with non-diabetic forms of neuropathy.
  • the surprising finding is that one cause of diabetogenic neuropathy is an increase in the concentration of IGFBP-5 within or in the vicinity of the nerve cells.
  • This finding now enables the targeted search for active substances that allow the prophylaxis or therapy of neuropathies, preferably diabetic forms of neuropathy, with the help of Substances that specifically reduce the concentration and / or the activity of IGFBP-5 within the nerve cells or in the vicinity of the nerve cells.
  • “Functions” of nerve cells are understood to mean, for example, the stimulus conduction and all the biochemical and / or electrochemical processes involved.
  • the term function preferably includes the survival of nerve cells.
  • the survival of nerve cells for example in a cell culture dish, can take place by determining the number of cells that are dying in the cell culture.
  • the death of cells in the central nervous system can be observed, for example, by test methods that detect apoptosis. Such test methods are, for example, "tunnel assay” (Gavrielli et al. (1992) J. Cell Biol. 119: 493-501; Gold et al. (1994) Lab. Invest. 71: 219-225), chromatin fragmentation (Götz et al.
  • the contacting of a sample with at least one potential active ingredient comprises any form of mixing the sample with the potential active ingredient, wherein both the sample can be added to the potential active ingredient and the potential active ingredient to the sample.
  • the sample and / or the potential drug is (s) preferably as a fixed ⁇ material, solution, suspension, slurry or bound to a solid phase. If the sample with which at least one potential active substance is brought into contact is a cell, the step of contacting also includes processes known in the prior art which allow the introduction of substances into intact cells, such as, for example, DNA "guns", infection, transfection and / or transformation.
  • the potential active substance is naked DNA, viruses, viroids, virosomes and / or liposomes, the liposomes or virosomes also being suitable, in addition to a potentially effective nucleic acid olekül, further potential active substances contact with the sample.
  • a number of further methods are known to the person skilled in the art which are used to introduce potential active substances into cells and which are equally suitable for bringing the sample and potential active substance into contact.
  • a sample in the sense of this invention is, for example, at least one cell, at least one cell extract, at least one protein mixture and / or a mixture, the cell, the cell extract, the protein mixture or the mixture containing IGFBP-5 or an active part thereof.
  • the cells include, for example, pro- and eukaryotic cells, in particular, however, cells which express IGFBP-5 as wild-type cells. In cells which do not or only to a small extent express IGFBP-5 as wild-type cells, IGFBP-5 can be expressed or overexpressed by methods known to the person skilled in the art.
  • Such methods include, for example, infection, transfection or transformation of cells with vectors which contain nucleic acids which code for IGFBP-5 or an active part thereof and are under the control of a suitable promoter, in particular for constitutive expression.
  • a preferred sample which can be used in the method according to the invention is a cell which has an increased IGFBP-5 activity compared to wild-type cells of the same cell or tissue type.
  • Such a cell for example, from heterozygous or ho o- zygotic IGFBP-5 transgenic mice • be won. This cell h ⁇ len then the introduced genes included depending on the number, for example, between 1 to about 40 additional genes encoding for IGFBP-5 or an active portion thereof.
  • cells are made from heterozygotes or homozygous IGFBP-5 transgenic mice or mouse embryos are preferred, in particular neurons obtained from them or, more preferably, spinal motor neurons. These cells can be isolated, for example, using the panning technique (Metzger et al. (1998) J. Neurosci. 18: 1735-1742).
  • sample also includes cell extracts that can be obtained, for example, from one of the cells listed above using standard methods known to the person skilled in the art. Suitable methods include, but are not limited to, freeze-thawing, sonification, or French pressing. If necessary, such a cell extract can be worked up or purified in a further step. Preferred steps include, for example, precipitation, filtration and chromatographic process steps. Suitable chromatographic methods are known to the person skilled in the art and include, for example, anion or cation exchange chromatography, affinity chromatography and / or size exclusion chromatography.
  • the sample can also be a mixture of purified or recombinant proteins containing IGFBP-5 or an active part thereof and / or a mixture containing IGFBP5 or an active part thereof, which additionally contains further components, such as, for example, components which are used for the determination of the Activity of IGFBP-5 can be used.
  • the activity of IGFBP-5 in the sample can be determined by a number of direct and indirect detection methods. The appropriate methods depend on the nature of the sample. In cells, the activity of 'is IGFBP-5 for example, determined by the amount of proteins expressed in the cell, IGFBP-5, or to bind by the ability of existing in the cell IGFBP-5 of IGF-1 or IGF-2.
  • the transcription of the gene coding for IGFBP-5 can be repressed, for example, by determining the amount of IGFBP-5 mRNA. Standard methods known in the prior art for determining the amount of IGFBP-5 mRNA include, for example
  • the IGFBP-5 activity which is based on the induction or repression of the transcription of the IGFBP-5 promoter, can also be determined by coupling the IGFBP-5 promoter to suitable reporter constructs.
  • suitable reporter genes are these Chloramphenicol transferase gene, the "green fluorescent protein” (GFP) and variants thereof, the luciferase gene and the Rennilla gene.
  • the expression of IGFBP-5 protein can also be detected at the protein level, in which case the amount of the protein is detected, for example, by antibodies directed against IGFBP-5 proteins, polyclonal or monoclonal.
  • the change in the binding ability of IGFBP-5 to IGF-1 and / or IGF-2 can be checked, for example, in a "two-hybrid" system, the two-hybrid system being carried out, for example, in yeast or in higher eukaryotic cells can be.
  • the interaction strength between IGFBP-5 and IGF-1 and / or IGFBP-5 and IGF-2 is then compared, with or without the addition of the potential active ingredient. If the sample is, for example, a cell extract, a protein mixture and / or a mixture containing IGFBP-5 or an active part thereof, the determination of the activity is preferably aimed at determining the binding ability of IGFBP-5 to IGF-1 and / or IGF-2.
  • IGF-1 and / or IGF-2 Either the amount of free, ie unbound IGFBP-5 and / or the amount of free IGF-1 or IGF-2 or the decrease or increase in free IGFBP, IGF-1 and / or IGF-2 can be determined .
  • Another possibility is the immunoprecipitation of IGFBP-5, the determination of the co-immunoprecipitated IGF-1 and / or IGF-2, the amount of the respectively precipitated IGF-1 or IGF-2 by immunological methods but also by radioactive labeling, fluorescent labeling or similar markings of the IGF can be determined. The amount of free IGFBP-5 or IGF in the treated and untreated sample is compared.
  • Active substances which increase or inhibit the activity of IGFBP-5 in the sample compared to the untreated sample (control) are, according to this invention, pharmacologically active substances which influence the function of nerve cells.
  • a pharmacologically active substance that influences the function of nerve cells changes the activity of IGFBP-5 compared to the control, each determined using the same method, more than approx. 10%, but preferably by at least approx. 50% or by at least 100% , more preferably by at least about 500%.
  • the potential active ingredient reduces the activity of IGFBP-5 compared to the untreated sample.
  • step a) can be followed by an incubation process step, which can vary in length depending on the sample.
  • the activity is increased after approximately one hour to 100 days, preferably after approximately 1 day to approximately 50 days, most preferably after approximately 3 days to approximately 10 days. determined especially after 3 days.
  • the sample is a cell extract, a protein mixture or a mixture
  • the activity can be determined, for example, after a period of about 0 seconds (measurement of the activity immediately when it comes into contact) to about 20 days.
  • the time period for the incubation after the sample has been brought into contact with the potential active ingredient is at least or is approximately 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150, 180 minutes (McDonald et al. (1999) Analyt. Biochem. 268: 318-329).
  • the present method also includes determining the activity of an active portion of IGFBP-5.
  • an active part of IGFBP-5 contains an N- and / or C-terminal deletion and / or optionally one or more internal deletion, but also alternatively or additionally mutations, the ability of the so deleted and / or mutated IGFBP-5 part, in transgenic mice Triggering loss of the axons and degeneration of the motor neurons is not lost.
  • a functionally active portion of IGFBP-5 that is expressed in transgenic mice has at least about 10%, preferably at least about 20%, more preferably at least 50% and most preferably at least about 100% of the activity of wild type IGFBP-5.
  • the sample contains at least one cell, at least one cell extract, at least one protein mixture and / or a mixture containing IGFBP-5 or an active part thereof.
  • the cell is a neuronal cell, in particular a sensory, empathic or motor-neuronal cell, a neuronal stem cell, a neuron, in particular a cholinergic neuron of the basal forebrain, a dopaminergic nerve cell of the midbrain, a granule cell Purkinje cell of the cerebellum or hypocampus, a retinal ganglion cell or a photoreceptor.
  • a cell extract or a protein mixture this is preferably produced or isolated from one of the aforementioned cells.
  • the cell has an increased IGFBP-5 activity compared to a wild-type cell, this increased activity, for example, on the stimulation of the expression of IGFBP-5 and / or the transfection by IGFBP-5 containing vectors and / or insertion of IGFBP-5 coding genes. The same applies in the case of active parts of the IGFBP-5.
  • the activity of IGFBP-5 in the cell is determined by the survival rate of the cells, optionally together with another IGFBP-5-specific method for determining the activity.
  • This determination of the activity is of particular interest in cells which, for example due to the introduction of additional IGFBP-5 genes, have increased IGFBP-5 activity, and which therefore have a comparison with the respective wild-type Cell have a reduced survival rate.
  • An extension of the survival rate of these cells after incubation with at least one potential active ingredient serves as an indirect means of determining the activity of IGFBP-5 in the sample.
  • a pharmacologically active ingredient extends the survival rate of the cells by at least about 20%, preferably by at least about 50%, more preferably by at least about 100%, and even more preferably by at least about 1000% compared to untreated cells. Most preferred are those active ingredients which, when added to the cells, lead to a permanent survival of the cells in the cell culture and / or prevent the loss of the axons and the degeneration of motor neurons in an IGFBP-5 transgenic mouse.
  • the activity of IGFBP-5 in the sample is determined by the amount of IGFBP-5 protein, the amount of nucleic acids coding therefor and / or the binding activity of IGFBP-5.
  • IGFBP-5 in the sample after contacting at least one potential active substance indicates that the potential active substance is a pharmacologically active substance which influences the function of nerve cells. If the potential active ingredient is a
  • Active ingredient mixture the pharmacologically active ingredient is isolated from this active ingredient mixture in a further step, for example by deconvolution.
  • the sample is compartmentalized, for example on a microtiter plate with a plurality of wells, for example 96, 384 or 1525 wells.
  • a microtiter plate with a plurality of wells, for example 96, 384 or 1525 wells.
  • Such microtiter plates are already routinely used in fully automatic, massively parallel test procedures (so-called "high throughput screens"), which allow hundreds of thousands of different active substances to be tested in a short time.
  • high throughput screens massively parallel test procedures
  • everyone is Compartmentalization suitable, which makes it possible to spatially limit the effect of the potential active ingredient brought into contact with the sample, so that the effects of the potential active ingredient used in each case on the activity of IGFBP-5 or an active part thereof in the sample are determined can.
  • the sample can be covalently or non-covalently linked to the surface of the sample carrier, such as a microtiter plate, or can be present as a solution, suspension or slurry.
  • the sample carrier such as a microtiter plate
  • planar sample carriers or, for example, structured by depressions or channels are also suitable.
  • sample areas can be rendered hydrophobic, drops being applied with the sample to such areas. Alternatively, the drops can be applied to delimited, non-hydrophobicized areas.
  • the sample carrier can be made of glass, silicon, metal or plastic, for example.
  • At least one potential active substance is linked covalently or non-covalently to a sample carrier, the surface of the sample carrier preferably being structured in the form of depressions, channels or also planar.
  • the sample is brought into contact with the immobilized potential active substances and the activity of IGFBP-5 in the sample is determined at the respective immobilization point of the potential active substance (s).
  • a protein chip can be produced which contains different peptide fragments on the surface, the influence of which on the activity of IGFBP -5 can be tested.
  • a large number of different chemical substances can be produced on a surface using combinatorial-chemical processes known in the prior art, the effect of which on Activity of IGFBP-5 can be examined by the method according to the invention.
  • the pharmacologically active ingredient or the isolated pharmacologically active ingredient is made up into a medicament or diagnostic agent in a further step, suitable auxiliaries and additives being added to the pharmacologically active ingredient, and a physiologically effective dosage is set.
  • the pharmacologically active ingredient is modified in further process steps using methods known to the person skilled in the art, which include, for example, modifications with halogen, in particular with fluorine or chlorine and / or combinatorial chemical compositions, and is applied again in the process according to the invention investigated the influence on the activity of IGFBP-5, the activity of IGFBP-5 in the sample treated with the modified pharmacologically active ingredient being compared with the activity of IGFBP-5 in the sample using the starting active ingredient and a
  • Improving the effectiveness of the pharmacologically active ingredient in particular a greater reduction in the activity of IGFBP-5 in the sample compared to the starting active ingredient is used as a criterion for selection.
  • a reduction is at least about 5%, preferably at least about 10%, more preferably at least about 50%, compared to the starting active ingredient.
  • standard chemical and / or physical methods such as mass chromatography or GC-MS, 1 H-NMR chromatography, or IR can be used Spectroscopy to determine the structure of the modified drug.
  • Another object of the present invention is a test system for finding pharmacologically active substances, which function the cells of the nervous system influence, comprising: a) at least one sample containing IGFBP-5 or an active part thereof and b) at least one agent for determining the activity of IGFBP-5 in the sample.
  • the present invention furthermore relates to the use of at least one active ingredient for the prophylaxis and / or therapy of diseases which are associated with cell growth disorders in nerve cells, in particular diabetic neuropathy, the active ingredient used being found in the method according to the invention described above.
  • the present invention shows for the first time the importance of IGFBP-5 for the pathogenesis of diabetogenic neuropathy.
  • Another object of the present invention is therefore the use of at least one active substance for the prophylaxis and / or therapy of diabetogenic neuropathy, characterized in that the active substance inhibits the activity of IGFBP-5.
  • one of the following active substances is used: IGF-1, IGF-2, a mutant of IGF-1 and / or IGF-2 with increased binding affinity for IGFBP-5 (Luthi et al., Eur. J Biochem., 205, 483-480 (1992); Lowman et al., Bioche istry, 37, 8870-8878, (1998)), an active fragment of IGF-1 and / or IGF-2, a substance which binds to the heparin-binding domain of IGFBP-5 (Song et al., J. Mol.
  • a substance which inhibits the expression and / or release of IGF-1 and / or IGF-2 a nucleotide sequence coding for IGF-1 and / or IGF-2, a nucleotide sequence for a mutant of IGF-1 and / or a mutant of IGF-2 with increased binding affinity to IGFBP- 5 encodes a nucleotide sequence which encodes ment of IGF-2 for an active fragment of IGF-1 and / or an active Frag ⁇ , and / or a nucleotide sequence for a binding IGFBP-5 antibody or antibody fragment kodi ert.
  • an active substance which expresses and / or Release of IGF-1 and / or IGF-2 stimulated.
  • Preferred active substances which stimulate the expression and / or release of IGF-1 and / or IGF-2 are: antiprogestins, for example tamoxifen (Quin et al., Endocinology, 1,40, 2501-2508 (1999)), antioestrogens, for example Mifepristone (Bitar, et al, Surgery, 127, 687-695 (2000)), the osteogenic protein-1 (OP-1), the "bone morphogenic protein-2" (BMP-2), the "basic fibroblast growth factor "(bFGF), the" transforming growth factor ⁇ -1 "(TGFß-1), the" platelet derived growth factor BB “(PDGFBB), interleukin-1 receptor antagonists, for example IL-RA (Benbassat et al., Horm.
  • Mus musculus NM_010518, XM_129718, AF179369, X81583, AAC37636 and L12447.
  • Rattus norvegicus AF179370, AF139830, NM_012817, AAA53533 and M62781.
  • Active parts of this are in particular the C-terminal region or the heparin-binding domain or a partial sequence of the heparin-binding domain with a minimum length of 4, preferably 8, most preferably 10, amino acids.
  • the heparin-binding domain is in the case of the translation product according to accession number NM000599 aa216-266.
  • the heparin-binding domain is in the case of the translation product according to accession number M62781 aa215-265.
  • the heparin-binding domain is in the case of the translation product according to accession number L12447 aa215-265.
  • homologous sequences under the terms of the IGFBP-5, in particular Amino Text ⁇ rensequenzen to the above-mentioned sequences and partial sequences thereof.
  • the term homology is defined as follows. The expect value is used as the homology criterion, as it is when using the BLASTP program 2.2.4 [Aug-26-2002] results. Homology to a query amino acid sequence longer than 20 aa is when the expect value is less than 0.1, in particular less than 0.01 or 0.001. Homology to a query amino acid sequence of a length of less than or equal to 20 aa exists if the expect value is greater than or equal to 0.1, in particular 0.01 or 0.001, and less than 10, in particular 1.
  • a sample within the meaning of the invention can consequently contain, for example, a polypeptide or an oligopeptide which contains a partial sequence of IGFBP-5, in particular the heparin-binding domain of IGFBP-5, a minimum length of 4, 10, 20 or 40 amino acids, or a homolog For this. Minimum lengths of 20 to 40 amino acids are preferred. It is not critical whether and which amino acid sequences are connected to the partial sequence N- and / or C-terminal.
  • Example 1 Induction of neuropathy in mice by overexpression of IGFBP-5
  • a lambda-ZAPII cDNA library from the brain of a mouse was tested with an 873 bp IGFBP-5 cDNA sample. This sample was analyzed using PCR (primer: forward reaction 5'-GCC CCG AGG TAA AGC CAG ACT-3 '(SEQ ID NO. 1), reverse reaction 5'-GGA TAG GGG GAG GAA GGG AGG-3' (SEQ ID NO . 2)) prepared and contained the entire coding sequence and 48 bp of the 5'-untranslated region.
  • the cDNA was inserted into the EcoRI site of the polylinker of a pßS II SK vector using the Exassist / SOLR system (from Stratagene, La Jolla Ca.) according to the manufacturer's instructions inserted.
  • the identity of the clones was confirmed by DNA sequencing.
  • This NFL-IGFBP-5 DNA construct was used to generate an 8 kB fragment using the restriction enzyme S a I, which is the human neurofilament light chain (NFL) promoter, the cDNA for IGFBP-5 of the mouse, the poly A signal from pMC-Cre and exons 2-4 of the NFL gene (in the downstream region).
  • S a I which is the human neurofilament light chain (NFL) promoter
  • the cDNA for IGFBP-5 of the mouse the poly A signal from pMC-Cre and exons 2-4 of the NFL gene (in the downstream region).
  • the fragment was purified twice over gel and then over Nucleotrap resin (Machery and Nagel, Düren, D), extracted with butanol, then desalted and finally purified with the aid of Elutip (Schleicher and Schüll, Dassel, D).
  • the eluted DNA was extracted with phenol / chloroform and chloroform and then precipitated with ethanol.
  • the DNA was suspended in sterile buffer solution (5 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 mM EDTA) (concentration approx. 500 copies / pl) and this suspension was infected in fertilized mouse oocytes.
  • Southern blot analysis can be identified.
  • the following primers were used for the PCR reaction to determine the genotype: Forward reaction: NFL-SEQ 5'-TCG CAG GCT GCG TCA GGA G-3 1 (SEQ ID NO. 3); Reverse reaction: BP5 PCR 5'- CTT GCA GGT AGA GCA GGT GCT CTC-3 '(SEQ ID NO. 4). 45 cycles of 45 s at 94 ° C, 45 s at 53 ° C and 30 s at 72 ° C were carried out.
  • the DNA sample was digested with Xho I and tested with a radiolabelled IGFBP-5 PCR sample.
  • RNA was presented for each RT-PCR reaction.
  • the first strand of DNA was synthesized with oligo (dT) primer (from Life Technologies).
  • the primers for amplifying IGFBP-5 were: 5 'primer: 5' CTT TCG TGC ACT GTG AAC C-3 '(SEQ ID NO. 5); 3 'primer: 5' -CTC AAC GTT ACT GCT GTC G-3 * (SEQ ID NO.6).
  • the separated proteins were transferred in an electroblotting apparatus to a nitrocellulose membrane (electroblotting apparatus from Biometra GmbH, Goettingen, D).
  • the membranes were labeled with iodine-labeled IGF-2 using the method described by Hossenlopp et al. (1986) Anal Biochem 154: 138-143. Radioactive iodine bound to IGFBP-5 was autoradiographed.
  • the results showed an increased expression of IGFBP-5 in the spinal cord and in the sciatic nerve of transgenic animals.
  • the muscle strength of the forelimbs was determined on the transgenic as well as on the wild-type control mice (method as described by Masu et al. (1993) Nature 365: 27-32). Although there was no difference in body weight between the two animals, a significant reduction in the gripping strength of the forelimbs was found in the transgenic mice. Histomorphological examinations were carried out to analyze these clinical symptoms. They consisted of a morphometric examination of the sciatic nerve, the peritoneum nerve and the ganglia of the anterior horn of the spinal cord. For these investigations, samples of the corresponding tissue after fixation in osmium tetroxide were embedded in epoxy resin and semi-thin sections were produced.
  • Tissue sections were analyzed under the light microscope and evaluated morphometrically using the Quantimed 500 software (Leica GmbH, Bensheim, Germany). The number of intact myelinated nerve fibers in the cross-cut nerves was counted. The number of degenerated fibers was determined using Waller's degeneration.
  • cholinesterase activity on the neuromuscular end plates in muscle samples was histochemically determined using the combined acetylcholinesterase-silver staining (Namba (1971) Exp. Neurol. 33: 322-328; Gurney et al. (1992) J. Neurosci. 12: 3241-3247).
  • acetylcholinesterase activity was carried out in samples of the Gastrocnemius muscle.
  • the muscle samples were homogenized with the addition of 0.5% Triton X-100 for the determination of the total (soluble as well as membrane-bound) enzyme activity and without the addition of Triton X100 for the determination of the soluble acetylcholine esterase activity.
  • the respective enzyme activity was determined after centrifugation of the homogenates (15 min, 15,000 g, 4 ° C.) in the respective supernatants according to the method of Ellmann (Schegg et al. (1990) Neurosci. Lett. 118: 197-200).
  • transgenic mice In order to clarify whether the loss of axons in the transgenic mice is the result or the cause of the death of motor neurons, the number of motor neurons in the facial nucleus as well as in the lumbar section of the spinal cord was counted in transgenic and control mice of different ages ,
  • mice transgenic for IGFBP-5 After cutting the facial nerve in newborn and 3-week-old transgenic mice, no reduction in the motor neurons was found 1 week later. This suggests that motor neuron degeneration in mice transgenic for IGFBP-5 is the cause of axon loss.
  • Example 2 Characterization of nerves from patients with diabetes mellitus.
  • the proteins from nerve biopsy samples were isolated from healthy individuals and from patients with diabetic neuropathy using standard methods (Life Technologies, Düsseldorf, D) and these on a 12% SDS-PAGE -Gel applied.
  • the separated protein samples were transferred to a nitrocellulose membrane, then these membranes were blocked for one hour by incubation in a buffer solution containing horse serum and fat-free dry milk powder.
  • IGFBP-5 was subsequently detected using an IGFBP-5-specific rabbit antibody (Santa Cruz, Göttingen, D, whose specific binding was detected by a peroxidase-coupled anti-rabbit antibody.
  • the peroxidase was determined using the ECL reagent (Messrs.
  • Example 3 Isolation and cultivation of nerve cells, which overexpress IGFBP-5, for testing active substances
  • Embryos 12.5 days old that were either normal or transgenic for IGFBP-5 were spinal motoneurons using the panning technique (Metzger et al. (1998) J Neurosci. 18: 1735-1742) using a monoclonal anti-p75 antibody isolated from the rat (Chemicon, Hofheim, Germany).
  • the ventrolateral parts of the lumbar spinal cord were mechanically comminuted, transferred to hepespuffer solution (containing 10 ⁇ M 2-mercaptoethanol) and incubated with trypsin (0.05%, 10 min).
  • the single cell suspension in the supernatant was transferred to a culture dish coated with the anti p75 antibody and at room temperature for 30 min. incubated.
  • the cells obtained in this way were sown at a density of 20.00 cells / cm 2 in culture plates (Greiner, Nuertingen, Germany) which were precoated with polyornithine and laminin.
  • the cells were kept at 37 ° C. in neurobasal medium (Life Technologies, supplemented with B27 supplement, 10% horse serum, 500 ⁇ M glutamate and 50 ⁇ g / ml apotransferrin) and in a 5% CO 2 atmosphere. 50% of the cell culture medium was replaced on the 1st day and every 2nd day following.
  • Sensory neurons were also isolated from embryos 12.5 days old that were normal or transgenic for the IGFBP-5 gene. For this, dorsal Root ganglia isolated, taken up in PBS and then with trypsin (0.05% in hepespuffer) for 30 min. incubated. The trypsin digestion was stopped by adding L15 medium which contained 10% horse serum and subsequently the cells were plated out in culture plates and incubated for 3-4 hours. Cells in the supernatant were centrifuged (10 min at 400 g) and the cell sediment was kept in the neurobasal medium in the same way as described for spinal motor neurons. Neural stem cells were derived from the brain of normal mouse embryos, or from mouse embryos that are transgenic
  • IGFBP-5 are isolated.
  • the area of the forebrain was removed under a dissecting microscope, and the area of the hippocampus and the periventricular zone in further developed embryos. These brain areas were then transferred to 200 ⁇ l HBSS (Hanks balanced salt solution (HBSS, Life Technologies (Karlsruhe), incubated with 0.1% trypsin (final concentration in HBSS) for 10 min at 37 ° C., the reaction with 0.1% trypsin inhibitor (trypsin inhibitor from egg yolk sack (Sigma, Deisenhofen), stock solution: 1% in HBSS / 25 mM HE-PES) final concentration in HBSS was stopped, then the cells were triturated ten times with a 200 ⁇ l pipette and in Medium [(Neurobasal Medium (Life Technologies), B27 Supplement (Life Technologies Stock 50x, EK lx) Glutamax II (Life Technologies Stock lOOx, EK lx), basicFGF (20ng / ml
  • the neural stem cells were frozen according to the standard protocol, i.e. after centrifugation, the cells were taken up in medium with 10% DMSO and first cooled to -86 ° C at 1 ° C / min (in MrFrosti), before being stored in liquid N2 at - 186 ° C.
  • Example 4 Method for Finding Nerve Cell Protective Substances Nerve cells obtained, for example, with the above-mentioned method can be used to search for substances which inhibit the expression or the function of IGFBP-5 in nerve cells.
  • IGFBP-5 overexpressing and normal motor neurons and sensory neurons are obtained as described above, sown in cell cultures and mixed with the test substance or a mixture of test substances. Substances or mixtures that inhibit the function or expression of IGFBP-5 are able to prevent the death of IGFBP5 overexpressing neurons without affecting the survival of normal neurons.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, welche die Funktion von Nervenzellen beeinflussen, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen einer Probe enthaltend Insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP-5) oder einen aktiven Teil davon mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff und (b) bestimmen der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe.

Description

Verfahren zum Auffinden von pharrαakologisch aktiven Wirkstoffen, die die Funktion von Nervenzellen beeinflussen
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, welche die Funktion von Nervenzellen beeinflussen, wobei eine Probe mit einem prospek- tiven Wirkstoff oder einem Gemisch solcher Wirkstoffe in Kon- takt gebracht wird, wobei zugleich oder danach die Aktivität eines biologisch aktiven Moleküls bestimmt wird, und wobei ein • prospektiver Wirkstoff oder ein Gemisch solcher Wirkstoffe selektiert wird, wenn die Aktivität des biologisch aktiven Moleküls mit der Inkontaktbringung reduziert oder erhöht wird. Die Erfindung betrifft weiterhin Verwendungen solchermaßen identifizierter Wirkstoffe.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Neuropathien sind Nervenleiden, die mit Störungen der motorischen und/oder sensiblen Nervenleitung einhergehen. Die Ursache für Neuropathien können toxisch, metabolisch, infektiös oder entzündlich sein, wobei eine entzündliche Komponente bei praktisch allen Fällen der Neuropathie beteiligt ist. Die häufigsten Neuropathien sind motorische Neuropathien, die im Verlauf von Diabetes mellitus entstehen. Ein besonderes Merkmal dieser diabetogenen Neuropathien ist die Degeneration der Motorendplatten, der Verlust der Axone und die Atrophie der Motoneuronen. Obwohl die Ursachen der Neuropathie, d. h. die toxischen, metabolischen, infektiösen oder entzündlichen Ursa- chen, häufig bekannt sind, sind die molekularen Prozesse, die an der Pathogenese beteiligt sind, weitestgehend ungeklärt. Derzeit beschränken sich daher die therapeutischen Ansätze zur Behandlung der Neuropathie auf die Behebung der Ursachen, was nur in wenigen Fällen erreichbar ist, und auch dann nicht zu einer erfolgreichen Behandlung führt, da der Verlust von Axo- nen nicht wieder rückgängig gemacht werden kann. Eine Vorraussetzung für eine zielgerichtete und frühe Bekämpfung einer sich bildenden Neuropathie ist daher die Kenntnis der Pathogenese der Neuropathie, mit Hilfe derer Wirkstoffe für die Therapie identifiziert und geprüft werden können. Die Proteine "Insulin-like Growth Faktor" -1 bzw. -2 (IGF-1) und (IGF-2) gehören zu denjenigen Wachstumsfaktoren, die das Überleben von Neuronen und Gliazellen in vitro und in vivo unterstützen. Diese Faktoren fördern die Teilung von neuralen Vorläuferzellen, die Reifung und das Überleben von Motoneuronen und von Schwanschen-Zellen (Arakawa et al . (1990) J. Neurosci. 10: 3507-3515; Syroid et al . (1999) J Neurosci. 19: 2059-2068) .
Untersuchungen an transgenen Mäusen, die entweder lautiertes IGF-1 oder IGF-2 enthielten oder die IGF-1 überexpri- mierten, deuteten darauf hin, dass IGF die Bildung von Myelin stimuliert (Liu et al. (1993) Gell 75: 59-72; Beck et al . (1995) Neuron 14: 717-730; Carson et al . (1993) Neuron 10: 729-740) .
Im Gegensatz zu den meisten Wachstumsfaktoren sind die IGFs in großer Menge im Blutkreislauf vorhanden, aber nur ein sehr kleiner Teil davon liegt in Form von freiem IGF vor. Der Großteil bildet mit den sogenannten "Insulin-like Growth Factor Binding Proteins" (IGFBP) und einem weiteren großen Protein, das als "Acid Labile Subunit" (ALS) bezeichnet wird, Korα- plexe (Blum et al . (1991) in: Modern Concepts in Insulin-Like Growth Factors, Herausgeber Spencer, Elsevier, New York, 381-893) . Bisher konnten sechs verschiedene IGFBPs identifiziert werden (Yamanaka et al . (1997) J Biol. Chem. 272: 30729-30734) . Eines dieser Proteine, IGFBP-5, ist ein glyko- siertes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 26 kDa, das mit hoher Affinität an IGF-1 und IGF-2 bindet (Drop et al . (1992) Growth Regulation 2: 69-79; WO 97/03470).
IGFBP-5 ist außer in den Nieren in anderen Organen in beträchtlichem Maße im Nervensystem, beispielsweise in Glia- zellen und in Purkinjezellen und cerebellären Granulazellen nachzuweisen (Bondy und Li (1993) J. Neurosci. 13: 5092-5104; Stenvers et al . (1994) J Comp . Neurol. 339: 91-105; Rochier et al. (2001) J Neurochem. 76: 11-20). Immunhistoche ische Untersuchungen zeigen eine Lokalisation des Proteins an der Zellmembran von Purkinjezellen. IGFBP-5 ist des Weiteren immunhi- stologisch an und in myelinisierten Axonen nachweisbar. Durch seine hohe Affinität zur extrazellulären Matrix kann es in dem extrazellulären Raum zwischen Motoneuronen und Schwanschen- Zellen akkumulieren (Syroid et al . (1999) J Neurosci. 19: 2059-2068; Cheng et al . (1996) Brain Res . Dev. Brain Res. 92: 211-218) . Nach Hypoxy/Ischaemie oder nach Verletzung des Ischiasnervs ist die Expression von IGFBP-5 in Nervenzellen erhöht (Li et al. (1996) J Cereb. Blood. Flow Metab. 16: 227-236; Hammerberg et al . (1998) J Comp. Neurol. 400: 57-72). Es ist jedoch weitgehend unklar, welche physiologische oder pathophysiologische Rolle IGFBP-5 im Nervensystem spielt.
Da IGFs das Wachstum von Nervenzellen fördern, wurden Komplexe aus IGF-1 und IGFBP-3 (WO 95/13823 und WO 99/62526), antisense Oligonukleotide, die spezifisch für IGFBP sind, Antikörper, die spezifisch für IGFBP sind, und Peptide zur Hem- mung der Bindung von IGFBP (WO 98/32022, WO 98/45427 und WO 99/32620) für die Behandlung einer Reihe von Erkrankungen beschrieben. Diese Erkrankungen schließen auch Erkrankungen des Nervensystems, wie beispielsweise der amyotrope Lateralsklerose (WO 99/32620 und WO 99/62536), die zentrale und peripheren Neuropathien (WO 99/32620), oder die Alzheimer Erkrankung bzw. die Huntington Erkrankung (WO 95/13823) , ein. Das Ziel dieser Arbeiten bestand jedoch jeweils darin, die Menge der freien IGF in der Zelle zu erhöhen. Aus keiner der genannten Arbeiten geht jedoch hervor, dass IGFBP-5 kausal an der Entstehung von Neuropathien und dem damit einhergehenden Verlust von Axonen und Degeneration von Motoneuronen beteiligt ist.
Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, ein Screeningverfahren anzugeben, mittels welchem weitere Substanzen, insbesondere auch nichtnatürliche Substanzen, identifiziert werden können, die hochwirksam, insbesondere auch wirksamer als IGF-1 oder IGF-2, das Überleben von Nervenzellen fördern.
Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, welche die Funktion von Nervenzellen beeinflussen, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Inkontaktbrin- gen einer Probe enthaltend IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon mit einem potentiellen Wirkstoff oder einem Gemisch solcher Wirkstoffe, b) Bestimmen der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe und c) Selektion eines Wirkstoffes oder Wirkstoffgemisches, welches die Aktivität von IGFBP-5 in der Probe erhöht oder erniedrigt, insbesondere erniedrigt bzw. hemmt.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass die erhöhte Bildung von IGFBP-5 in Nervenzellen zu einer Beeinträchtigung der Funktion der Nervenzellen führt. Transgene Mäuse, die in ihren Motoneuronen IGFBP-5 überexprirαieren, zei- gen in den der Erfindung zu Grunde liegenden Experimenten einen Verlust ihrer Axone und eine Degeneration ihrer Motoneuronen und entwickeln das klinische Bild einer Neuropathie, das mit den typischen Funktionseinbußen der Nervenzellen einhergeht. Ein weiterer überraschender Befund neben dem Befund aus transgenen Tierexperimenten ist, dass in Nervenzellen von Patienten mit Diabetes mellitus erhöhte Mengen der für IGFBP-5 kodierenden RNA nachgewiesen werden konnten. Diese Erhöhung von IGFBP-5 ist spezifisch für diabetogene Formen der Neuropathie, da sie nicht in Nerven von Patienten mit nicht diabeti- sehen Formen der Neuropathie gefunden wurde. Somit ist der überraschende Befund, dass eine Ursache der diabetogenen Neuropathie die Erhöhung der Konzentration von IGFBP-5 innerhalb oder in der Nachbarschaft der Nervenzellen ist. Dieser Befund ermöglicht nun, die zielgerichtete Suche nach Wirkstoffen, die die Prophylaxe oder Therapie von Neuropathien, vorzugsweise diabetischer Formen der Neuropathie erlauben, mit Hilfe von Substanzen, die gezielt die Konzentration und/oder die Aktivität von IGFBP-5 innerhalb der Nervenzellen oder in der Nachbarschaft der Nervenzellen reduzieren.
Unter "Funktionen" von Nervenzellen werden beispielswei- se die Reizleitung sowie alle daran beteiligten biochemischen und/oder elektrochemischen Prozesse verstanden. Vorzugsweise umfasst der Begriff Funktion jedoch das Überleben von Nervenzellen. Das Überleben von Nervenzellen beispielsweise in einer Zellkulturschale kann durch die Bestimmung der Anzahl der ab- sterbenden Zellen in der Zellkultur erfolgen. Das Absterben von Zellen des zentralen Nervensystems kann beispielsweise durch Testverfahren, die Apoptose nachweisen, beobachtet werden. Solche Testverfahren sind beispielsweise "Tunnel-Assay" (Gavrielli et al . (1992) J. Cell Biol . 119: 493-501; Gold et al. (1994) Lab. Invest. 71: 219-225), Chromatinfragmentierung (Götz et al. (2000) Hum. Mol. Genet. 9: 2479-2489), Zählung von überlebenden und absterbenden Nervenzellen (Arakawa et al. (1990) J. Neurosci. 10: 3507-3515), die Verwendung von Festsubstanzen zur Quantifizierung des Zelltods in Zellkultur (Uliasz und Aewett (2000) J Neurosci . Methods 100: 157-163), Quantifizierung, der Expression von Zelltod-assoziierten Genen in Nervenzellen, wie beispielsweise Cycline (Timsit et al . (1999) Eur. J Neurosci. 11: 263-278) und Bestimmung des neuronalen Zelltods nach Zugabe von a-ß-Peptid (Iwasaki et al . (1996) Mol. Psych. 1: 65-71) oder nach Induktion von oxidati- ven Stress (Manev et al . (1995) Exp . Neurol. 133: 198-206). Das Inkontaktbringen einer Probe mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff umfasst jede Form des Mischens der Probe mit dem potentiellen Wirkstoff, wobei sowohl die Probe zu dem potentiellen Wirkstoff hinzugefügt werden kann, als auch der potentielle Wirkstoff zu der Probe. Die Probe und/oder der potentielle Wirkstoff liegt (en) dabei vorzugsweise als Fest¬ stoff, Lösung, Suspension, Aufschlämmung oder an eine feste Phase gebunden vor. Wenn es sich bei der Probe, mit der zumin- dest ein potentieller Wirkstoff in Kontakt gebracht wird, um Zellen handelt, umfasst der Schritt des Inkontaktbringens auch im Stand der Technik bekannte Verfahren, die das Einführen von Substanzen in intakte Zellen erlauben, wie beispielsweise DNA- "Guns", Infektion, Transfektion und/oder Transformation. Diese Verfahren sind besonders bevorzugt, wenn es sich bei dem po- tentiellen Wirkstoff um nackte DNA, Viren, Viroide, Virosome und/oder Liposomen handelt, wobei die Liposome oder Virosome auch geeignet sind, neben einem potentiell wirksamen Nuklein- säure olekül weitere potentielle Wirkstoffe mit der Probe in Kontakt zu bringen. Dem Fachmann sind eine Reihe weiterer Me- thoden bekannt, die dazu dienen potentielle Wirkstoffe in Zellen einzuführen und die gleichermaßen zum Inkontaktbringen von Probe und potentiellen Wirkstoff geeignet sind.
Eine Probe im Sinne dieser Erfindung ist beispielsweise mindestens eine Zelle, mindestens ein Zellextrakt, mindestens ein Proteingemisch und/oder ein Gemisch, wobei die Zelle, der Zellextrakt, das Proteingemisch oder das Gemisch IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon enthält. Die Zellen umfassen beispielsweise pro- und eukaryotische Zellen, insbesondere jedoch Zellen, die als Wildtyp-Zellen IGFBP-5 exprimieren. In Zellen, die als Wildtyp-Zellen nicht oder nur in geringem Maße IGFBP-5 exprimieren, kann durch dem Fachmann bekannte Methoden IGFBP-5 exprimiert bzw. überexprimiert werden. Solche Methoden umfassen beispielsweise Infektion, Transfektion oder Transformation von Zellen mit Vektoren, die Nukleinsäuren enthalten, die für IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon kodieren und unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, insbesondere zur konsti- tutiven Exprssion, stehen. Eine bevorzugte Probe, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, ist eine Zelle, die eine erhöhte IGFBP-5 Aktivität im Vergleich zu Wildtyp-Zellen desselben Zeil- bzw. Gewebetyps aufweist. Eine solche Zelle kann beispielsweise aus heterozygoten oder ho o- zygoten IGFBP-5 transgenen Mäusen • gewonnen werden. Diese Zel¬ len enthalten dann je nach Anzahl der eingeführten Gene beispielsweise zwischen 1 bis ca. 40 zusätzliche Gene, die für IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon kodieren. Im Rahmen die¬ ses erfindungsgemäßen Verfahrens sind Zellen aus heterozygoten oder homozygoten IGFBP-5 transgenen Mäusen bzw. Mäuseembryonen bevorzugt, insbesondere aus diesen gewonnene Neuronen oder, noch bevorzugter, spinale Motoneuronen. Diese Zellen können beispielsweise mit Hilfe der Panningetechnik (Metzger et al . (1998) J. Neurosci. 18: 1735-1742) isoliert werden.
Des weiteren umfasst der Begriff "Probe" auch Zellextrakte, die beispielsweise aus einer der vorangehend aufgeführten Zellen mit dem Fachmann bekannten Standardverfahren gewonnen werden können. Geeignete Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, "Freeze-thawing", "Sonification" oder "French-Pressing" . Gegebenenfalls kann ein solcher Zellextrakt in einem weiteren Schritt aufgearbeitet bzw. aufgereinigt werden. Bevorzugte Schritte umfassen beispielsweise Präzipitations-, Filtrations- und chromatographische Verfah- rensschritte. Geeignete chromatographische Verfahren sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Anionen- bzw. Kationenaustauschchromatographie, AffinitatsChromatographie und/oder Größenausschlusschromatographie . Des weiteren kann die Probe auch eine Mischung gereinigter oder rekombinanter Proteine enthaltend IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon und/oder ein Gemisch enthaltend IGFBP5 oder einen aktiven Teil davon sein, das zusätzlich weitere Komponenten enthält, wie beispielsweise Komponenten, die für die Bestimmung der Aktivität von IGFBP-5 verwendet werden können. Das Bestimmen der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe ist durch eine Reihe direkter und indirekter Nachweisverfahren möglich. Die jeweils geeigneten Verfahren hängen von der Natur der Probe ab. In Zellen wird die Aktivität von' IGFBP-5 beispielsweise durch die Menge des in der Zelle exprimierten IGFBP-5 bestimmt oder durch die Fähigkeit des in der Zelle vorhandenen IGFBP-5 an IGF-1 oder IGF-2 zu binden. Die Repression der Transkription des für IGFBP-5 kodierenden Gens kann beispielsweise durch die Bestimmung der Menge der IGFBP-5 mRNA erfolgen. Im Stand der Technik bekannte Standardverfahren zur Bestimmung der IGFBP-5-mRNA Menge umfassen beispielsweise
"Northern-Blot" Hybridisierung, RT-PCR, "Primer"-Extension und "RNA-Protection" . Des weiteren kann die Bestimmung der IGFBP-5 Aktivität, die auf der Induktion oder Repression der Transkription des IGFBP-5-Promotors beruht, auch durch die Kopplung des IGFBP-5-Promotors an geeignete Reporterkonstrukte erfol- gen. Beispiele für geeignete Reportergene sind das Chloramphe- nicol-Transferase-Gen, das "Green-Fluorescent-Protein" (GFP) und Varianten davon, das Luciferase-Gen und das Rennilla-Gen. Der Nachweis der Expression von IGFBP-5-Protein kann jedoch auch auf Proteinebene erfolgen, wobei in diesem Falle die Men- ge des Proteins beispielsweise durch gegen IGFBP-5-Proteine gerichtete Antikörper, polyklonal oder monoklonal, nachgewiesen wird.
Die Änderung der Bindungsfähigkeit von IGFBP-5 an IGF-1 und/oder IGF-2 kann beispielsweise in einem "Two-Hybrid"-Sy- stem überprüft werden, wobei das Two-Hybrid-System beispielsweise in Hefe oder in höheren eukaryotischen Zellen durchgeführt werden kann. Verglichen wird dann die Interaktionsstärke zwischen IGFBP-5 und IGF-1 und/oder IGFBP-5 und IGF-2, mit oder ohne Zusatz des potentiellen Wirkstoffs. Handelt es sich bei der Probe beispielsweise um einen Zellextrakt, ein Proteingemisch und/oder ein Gemisch enthaltend IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon, richtet sich die Bestimmung der Aktivität vorzugsweise auf die Bestimmung der Bindungsfähigkeit von IGFBP-5 an IGF-1 und/oder IGF-2. Hierbei kann jeweils entweder die Menge des freien, d.h. ungebundenen IGFBP-5 und/oder die Menge des freien IGF-1 oder IGF-2 bestimmt werden bzw. die Ab- oder Zunahme des freien IGFBP, IGF-1 und/oder IGF-2. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Immunpräzipitation von IGFBP-5, der Bestimmung des jeweils koimmunpräzipitierten IGF-1 und/oder IGF-2, wobei die Menge des jeweils präzipierten IGF-1 oder IGF-2 durch immunologische Verfahren aber auch durch radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung oder ähnliche Markierungen des IGF bestimmt werden kann. Verglichen wird dabei die Menge des freien IGFBP-5 bzw. IGF in der behandelten und unbehandelten Probe. Wirkstoffe, die die Aktivität von IGFBP-5 in der Probe im Vergleich zur unbehandelten Probe (Kontrolle) verstärken oder hemmen, gelten gemäß dieser Erfindung als pharmakologisch aktive Wirkstoffe, die die Funktion von Nervenzellen beein- flussen. Ein pharmakologisch aktiver Wirkstoff, der die Funktion von Nervenzellen beeinflusst, verändert die Aktivität von IGFBP-5 gegenüber der Kontrolle, jeweils mit der gleichen Methode bestimmt, mehr als ca. 10 %, vorzugsweise jedoch um mindestens ca. 50 % oder um mindestens 100 %, noch bevorzugter um mindestens ca. 500 %. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verringert der potentielle Wirkstoff die Aktivität von IGFBP-5 im Vergleich zu der unbehandelten Probe.
In einer weiteren Ausführungsform kann sich an den Schritt a) eine Inkubationsverfahrensstufe anschließen, die abhängig von der Probe unterschiedlich lang dauern kann. Wenn es sich bei der Probe um Zellen handelt, wird die Aktivität (Schritt b) nach ca. einer Stunde bis 100 Tagen, vorzugsweise nach ca. 1 Tag bis ca. 50 Tagen, höchstvorzugsweise nach ca. 3 Tagen bis ca. 10 Tagen, insbesondere nach 3 Tagen bestimmt. Wenn es sich bei der Probe um einen Zellextrakt, ein Proteingemisch oder ein Gemisch handelt, kann die Aktivität beispielsweise nach einem Zeitraum von ca. 0 Sekunden (Messung der Aktivität unmittelbar beim Inkontaktbringen) bis ca. 20 Tagen bestimmt werden. Vorzugsweise beträgt der Zeitraum für die Inkubation nach dem Inkontaktbringen der Probe mit dem potentiellen Wirkstoff jedoch zumindest oder ist gleich ca. 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150, 180 Minuten (McDonald et al. (1999) Analyt. Biochem. 268: 318-329).
Neben der Bestimmung der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe beinhaltet das vorliegende Verfahren auch die Bestimmung der Aktivität eines aktiven Teils von IGFBP-5. Ein aktiver Teil von IGFBP-5 enthält im Vergleich zu Wildtyp-IGFBP-5 eine N- und/oder C-terminale Deletion und/oder gegebenenfalls eine oder mehrere interne Deletion, aber auch alternativ oder zu- sätzlich Mutationen, wobei die Fähigkeit des so deletierten und/oder mutierten IGFBP-5 Teils, in transgenen Mäusen den Verlust der Axone und Degeneration der Motoneuronen auszulösen, nicht verloren geht. Ein funktioneil aktiver Teil von IGFBP-5, der in transgenen Mäusen exprimiert wird, hat mindestens ca. 10 %, vorzugsweise mindestens ca. 20 %, bevorzugter mindestens 50 % und am bevorzugtesten mindestens ca. 100 % der Aktivität von Wildtyp IGFBP-5.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, enthält die Probe mindestens eine Zelle, mindestens einen Zellextrakt, mindestens ein Proteingemisch un- d/oder ein Gemisch enthaltend IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Zelle eine neuronale Zelle, insbesondere eine sensorische, empathische oder motorisch-neuronale Zelle, eine neuronale Stammzelle, ein Neuron, insbesondere ein cholinerges Neuron des basalen Vorderhirns, eine dopaminerge Nervenzelle des Mittelhirns, eine Körnerzelle, eine Purkinje- zelle des Kleinhirns oder des Hypokampus, eine retinale Ganglienzelle oder ein Photorezeptor. Bei Verwendung eines Zellextrakts oder eines Proteingemischs ist dieses vorzugswei- se aus einer der voran genannten Zellen hergestellt bzw. isoliert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzt die Zelle eine erhöhte IGFBP-5 Aktivität im Vergleich zu einer Wildtyp-Zelle, wobei diese erhöhte Aktivität beispielsweise auf der Stimulation der Expression von IGFBP-5 und/oder die Transfektion durch IGFBP-5 enthaltende Vektoren und/oder Insertion von IGFBP-5 kodierenden Genen beruht. Analoges gilt im Falle aktiver Teile des IGFBP-5.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah- rens wird die Aktivität von IGFBP-5 in der Zelle durch die Überlebensrate der Zellen bestimmen, optional zusammen mit einer anderen IGFBP-5 spezifischen Methode zur Bestimmung der Aktivität. Diese Bestimmung der Aktivität ist von besonderem Interesse in Zellen, die beispielsweise auf Grund der Einfüh- rung zusätzlicher IGFBP-5 Gene, erhöhte IGFBP-5 Aktivität besitzen, und die deshalb im Vergleich zur jeweiligen Wildtyp- Zelle eine verringerte Überlebensrate besitzen. Eine Verlängerung der Überlebensrate dieser Zellen nach Inkubation mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff dient dabei als indirektes Mittel der Bestimmung der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe. Ein pharmakologisch aktiver Wirkstoff verlängert dabei die Überlebensrate der Zellen um mindestens ca. 20%, vorzugsweise um mindestens ca. 50%, noch bevorzugter um mindestens ca. 100%, und noch weiter bevorzugter um mindestens ca. 1000% im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Am meisten bevorzugt sind solche Wirkstoffe, die bei Zugabe zu den Zellen zu einem dauerhaften Überleben der Zellen in der Zellkultur führen und/oder in einer IGFBP-5-transgenen Maus den Verlust der Axone und die Degeneration von Motoneuronen verhindern.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Aktivität von IGFBP-5 in der Probe durch die Menge des IGFBP-5 Proteins, die Menge der dafür kodierenden Nukleinsäuren und/oder die Bindungsaktivität von IGFBP-5 bestimmt .
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemä- ßen Verfahrens weist die Verringerung der Aktivität von
IGFBP-5 in der Probe nach Inkontaktbringen mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff darauf hin, dass der potentielle Wirkstoff ein pharmakologisch aktiver Wirkstoff ist, welcher die Funktion von Nervenzellen beeinflusse. Wenn es sich bei dem potentiellen Wirkstoff um eine
Wirkstoffmischung handelt, wird in einem weiteren Schritt aus dieser Wirkstoffmischung der pharmakologisch aktive Wirkstoff isoliert, beispielsweise durch Deconvolution.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah- rens ist die Probe kompartimentalisiert, beispielsweise auf einer Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl von Vertiefungen, z.B. 96, 384, oder 1525 Vertiefungen. Solche Mikrotiterplatten werden bereits routinemäßig in vollautomatischen, massiv parallelen Testverfahren eingesetzt (sogenannte "High throughput screens"), die es erlauben, in kurzer Zeit hunderttausende verschiedene Wirkstoffe zu testen. Grundsätzlich ist jede Kompartimentalisierung geeignet, die es ermöglicht, die Wirkung des mit der Probe in Kontakt gebrachten potentiellen Wirkstoffs räumlich zu beschränken, so dass die Auswirkungen des jeweilig verwendeten potentiellen Wirkstoffs auf die Akti- vität von IGFBP-5 oder eines aktiven Teils davon in der Probe bestimmt werden kann. Die Probe kann kovalent oder nicht-kova- lent mit der Oberfläche des Probenträgers, wie beispielsweise eine Mikrotiterplatte, verknüpft sein oder als eine Lösung, Suspension oder Aufschlämmung vorliegen. Neben den im Stand der Technik bekannten verschiedenen Mikrotiterplatten-Forma- ten, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind, sind jedoch auch planare oder beispielsweise durch Vertiefungen oder Kanäle strukturierte Probenträger geeignet. Im Falle planarer Probenträger können Probenareale hydrophobiert sein, wobei Tropfen mit der Probe auf solche Areale aufgebracht werden. Alternativ können die Tropfen auf voneinander abgegrenzte nicht-hydrophobierte Areale aufgebracht werden. Der Probeträger kann beispielsweise aus Glas, Silizium, Metall oder Kunststoff sein. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist mindestens ein potentieller Wirkstoff kovalent oder nicht-kovalent mit einem Probenträger verknüpft, wobei die Oberfläche des Probenträgers vorzugsweise in Form von Vertiefungen, Kanälen oder auch planar strukturiert ist. Die Pro- be wird darin mit dem immobilisierten potentiellen Wirkstoffen in Kontakt gebracht und die Aktivität von IGFBP-5 in der Probe an der jeweiligen Immobilisierungsstelle des (der) potentiellen Wirkstoffe (e) bestimmt. Beispielsweise kann mit Standardverfahren, die beispielsweise aus WO 89/19977, WO 90/15070, WO 95/35505 und US 5,744,305 bekannt sind, ein Proteinchip hergestellt werden, der an der Oberfläche unterschiedliche Peptid- fragmente enthält, deren Einfluss auf die Aktivität von IGFBP-5 getestet werden kann. Gleichermaßen können auch auf einer Oberfläche mit im Stand der Technik bekannten kombinato- risch-chemischen Verfahren eine Vielzahl verschiedener chemischer Substanzen erzeugt werden, deren Wirkung auf die Aktivität von IGFBP-5 durch das erfindungsgemäße Verfahren untersucht werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der pharmakologisch aktive Wirkstoff bzw. der isolierte pharmakologisch aktive Wirkstoff in einem weiteren Schritt zu einem Medikament oder Diagnostikum konfektioniert, wobei dem pharmakologisch aktiven Wirkstoff gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe zugesetzt werden, und wobei eine physiologisch wirksame Dosierung eingestellt wird. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der pharmakologisch aktive Wirkstoff in weiteren Verfahrensschritten mit dem Fachmann bekannten Methoden, die beispielsweise Modifikationen mit Halogen, insbesondere mit Fluor oder Chlor und/oder kombinatorische chemische Ansät- ze umfassen, modifiziert und erneut in dem erfindungsgemäßen Verfahren auf die Beeinflussung der Aktivität von IGFBP-5 hin untersucht, wobei die Aktivität von IGFBP-5 in der Probe, die mit dem modifizierten pharmakologisch aktiven Wirkstoff behandelt wurde, mit der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe bei Verwendung des Ausgangswirkstoffs verglichen wird und eine
Verbesserung der Wirksamkeit des pharmakologisch aktiven Wirkstoffs insbesondere eine stärkere Verringerung der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe im Vergleich zum Ausgangswirkstoff als Maßgabe für eine Selektion verwendet wird. Eine solche Verringerung beträgt mindestens ca. 5%, vorzugsweise mindestens ca. 10%, noch bevorzugter mindestens ca. 50%, gegenüber dem Ausgangswirkstoff. Nachdem für einen modifizierten pharmakologisch aktiven Wirkstoff eine Verbesserung der Verringerung der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe festgestellt worden ist, kann mit chemischen und/oder physikalischen Standardverfahren, wie beispielsweise Massenchromatographie bzw. GC-MS, lH-NMR-Chromatographie, oder IR-Spektroskopie die Struktur des modifizierten Wirkstoffs bestimmt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testsystem zum Auffinden pharmakologisch aktiver Wirkstoffe, welche die Funktion von Zellen des Nervensystems beeinflussen, enthaltend: a) mindestens eine Probe enthaltend IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon und b) mindestens ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens eines Wirkstoffs zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörun- gen von Nervenzellen einhergehen, insbesondere der diabetoge- nen Neuropathie, wobei der verwendete Wirkstoff in dem vorangehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren aufgefunden wurde.
Die vorliegende Erfindung zeigt erstmals die Bedeutung von IGFBP-5 für die Pathogenese der diabetogenen Neuropathie. Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung mindestens einer Wirksubstanz zur Prophylaxe und/oder Therapie diabetogener Neuropathie, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz die Aktivität von IGFBP-5 hemmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei eine der folgenden Wirksubstanzen verwendet: IGF- 1, IGF-2, eine Mutan- te von IGF-1 und/oder IGF-2 mit erhöhter Bindungsaffinität zu IGFBP-5 (Luthi et al . , Eur. J. Biochem., 205, 483-480 (1992); Lowman et al . , Bioche istry, 37, 8870-8878, (1998)), ein aktives Fragment von IGF- 1 und/oder IGF-2, eine Substanz, welche an die Heparin-bindende Domäne des IGFBP-5 bindet (Song et al., J. Mol. Endocrinol., 24, 43-51 (2000)), eine Substanz, welche die Expression und/oder Freisetzung von IGF-1 und/oder IGF-2 stimuliert, eine Nukleotidsequenz, die für IGF-1 und/oder IGF-2 kodiert, eine Nukleotidsequenz, die für eine Mutante von IGF-1 und/oder eine Mutante von IGF-2 mit erhöhter Bin- dungsaffinität zu IGFBP-5 kodiert, eine Nukleotidsequenz, die für ein aktives Fragment von IGF-1 und/oder ein aktives Frag¬ ment von IGF-2 kodiert, und/oder eine Nukleotidsequenz, die für einen IGFBP-5 bindenden Antikörper oder Antikörperfragment kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Wirksubstanz verwendet, die die Expression und/oder Freisetzung von IGF-1 und/oder IGF-2 stimuliert. Bevorzugte Wirksubstanz, die die Expression und/oder Freisetzung von IGF-1 und/oder IGF-2 stimulieren sind: Antiprogestine, z.B. Tamoxifen (Quin et al . , Endocinology, 1,40, 2501-2508 (1999)), Antioestrogene, z.B. Mifepriston (Bitar, et al, Surgery, 127, 687-695 (2000)), das osteogene Protein-1 (OP-1), das "bone morphogenic protein-2" (BMP-2), der "basic fibroblast growth factor" (bFGF) , der "transforming growth factor ß-1" (TGFß-1), der "platelet derived growth factor BB" (PDGFBB) , Interleukin-1 Rezeptor Antagonisten, z.B. IL-RA (Benbassat et al., Horm. Metab. Res. 31, 209-215 (1999)), Antagonisten des Retinsäure-alpha-Rezeptors (Han et al . , J. Biol. Chem., 272, 13711-13716 (1997), und/oder Inhibitoren des Prostaglandins-2 (McCarthy et al . , J. Biol. Chem., 22, 6666-6671 (1996)). Bezüglich IGFBP-5 mRNA sowie des Translationsproduktes wird auf die folgenden Accession Nummern verwiesen. Homo sapiens: NM_000599, M62782, L27560, L27556, L27557, L27558, L27559 und M65062 (jeweils ursprüngliche sowie Fassung vom 05. Juli 2002). Mus musculus: NM_010518, XM_129718, AF179369, X81583, AAC37636 und L12447. Rattus norvegicus: AF179370, AF139830, NM_012817, AAA53533 und M62781. Aktive Teile hiervon sind insbesondere der C-terminale Bereich bzw. die Heparin bindende Domäne oder eine Teilsequenz der Heparin bindenden Domäne einer Mindestlänge von 4, vorzugsweise 8, höchstvorzugsweise 10, Aminosäuren. Die Heparin bindende Domäne ist im Falle des Translationsproduktes gemäß Accession Nummer NM000599 aa216-266. Die Heparin bindende Domäne ist im Falle des Translationsproduktes gemäß Accession Nummer M62781 aa215-265. Die Heparin bindende Domäne ist im Falle des Translationsproduktes gemäß Accession Nummer L12447 aa215-265.
Unter die Begriffe des IGFBP-5 oder eines aktiven Teils hiervon fallen auch homologe Sequenzen, insbesondere Aminosäu¬ rensequenzen, zu den vorstehend angegebenen Sequenzen und Teilsequenzen hieraus. Der Begriff der Homologie ist dabei wie folgt definiert. Als Homologiekriterium wird der Expect-Wert verwendet, wie er sich bei Anwendung des Programmes BLASTP 2.2.4 [Aug-26-2002] ergibt. Homologie zu einer Query-Aminosäu- resequenz einer Länge von größer 20 aa liegt dann vor, wenn der Expect-Wert kleiner als 0,1, insbesondere kleiner als 0,01 oder 0,001, ist. Homologie zu einer Query-Aminosäuresequenz einer Länge von kleiner oder gleich 20 aa liegt dann vor, wenn der Expect-Wert größer oder gleich 0,1, insbesondere 0,01 oder 0,001, und kleiner als 10, insbesondere 1, ist.
Eine Probe im Sinne der Erfindung kann folglich beispielsweise ein Polypeptid oder ein Oligopeptid enthalten, welches eine Teilsequenz des IGFBP-5, insbesondere der Heparin bindenden Domäne des IGFBP-5, einer Mindestlänge von 4, 10, 20 oder 40 Aminosäuren enthält, oder ein Homolog hierzu. Bevorzugt sind Mindestlängen von 20 bis 40 Aminosäuren. Hierbei ist es unkritisch, ob und welche Aminosäuresequenzen an die Teil- sequenz N- und/oder C-terminal angeschlossen sind.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1: Auslösung einer Neuropathie in Mäusen durch Überexpression von IGFBP-5
a) Isolierung des IGFBP-5 Klones
Eine Lambda-ZAPII cDNA Bibliothek aus dem Hirn einer Maus wurde mit einer 873 bp IGFBP-5-cDNA Probe geprüft. Diese Probe wurde mit Hilfe der PCR (Primer: Hinreaktion 5'-GCC CCG AGG TAA AGC CAG ACT-3' (SEQ ID NO. 1), Rückreaktion 5'-GGA TAG GGG GAG GAA GGG AGG-3' (SEQ ID NO. 2)) hergestellt und enthielt die gesamte kodierende Sequenz und 48 bp der 5'-nichttranslatierten Region.
Klone, von denen mit Hilfe der o.a Primer eine cDNA in kompletter Länge amplifiziert werden konnten, wurden mit Hilfe der Plaque-Technik gereinigt und nachfolgend vermehrt. Die cDNA wurde in die EcoRI-Schnittstelle des Polylinkers eines pßS II SK Vektors mit Hilfe des Exassist/SOLR Systems (Fa. Stratagene, La Jolla Ca.) gemäß der Anleitung des Herstellers eingefügt. Die Identität der Klone wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
b) Herstellung von NFL-IGFBP-5 transgenen Mäusen Ein 1,8 kb EcoRI-Frag ent, welches die IGFBP-5 cDNA enthielt, wurde aus dem PBSII SK-Vektor unter Verwendung der Polylinker Eco RV-Schnittstelle und einer Nse I-Schnittstelle in der 3'UTR isoliert und die PolyA-Region vom pMCCre (Gu et al . (1993) Cell 73: 1155-1164) wurden NSE-BP5 isoliert und mit den stumpfen Enden in den pKS-NFL-Vektor zwischen den Xho I/Cla I-Schnittstellen eingefügt.
Aus diesem NFL-IGFBP-5 DNA-Konstrukt wurde mit Hilfe des Restriktionsenzyms S a I ein Fragment mit 8 kB, das den menschlichen Neurofilament-Leichtketten (NFL) -Promotor, die cDNA für IGFBP-5 der Maus, das poly A Signal von pMC-Cre und die Exons 2-4 des NFL Genes (in der stromabwärts gelegenen Region) enthielt, hergestellt.
Das Fragment wurde zweimal über Gel und nachfolgend über Nucleotrap-Harz (Fa. Machery und Nagel, Düren, D) gereinigt, mit Butanol extrahiert, nachfolgend entsalzt und schließlich mit Hilfe von Elutip (Fa. Schleicher und Schüll, Dassel, D) gereinigt. Die eluierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert und nachfolgend mit Ethanol präzipitiert . Für die Mikroinjektion wurde die DNA in steriler Pufferlösung (5 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0,1 mM EDTA) suspendiert (Konzentration ca. 500 Kopien/pl) und diese Suspension in befruchtete Oozyten der Maus infiziert.
Neun Zuchttiere, die den Vektor integriert hatten, konn- ten in der genomischen DNA der Tiere mit Hilfe von PCR und
Southern Blot Analyse identifiziert werden. Für die PCR-Reakti- on zur Bestimmung des Genotyps wurden folgende Primer benutzt: Hinreaktion: NFL-SEQ 5'-TCG CAG GCT GCG TCA GGA G-31 (SEQ ID NO. 3); Rückreaktion: BP5 PCR 5'- CTT GCA GGT AGA GCA GGT GCT CTC-3' (SEQ ID NO. 4). Es wurden 45 Zyklen von 45 s bei 94°C, von 45 s bei 53 °C und 30 s bei 72 °C durchgeführt. Für Southern Blots wurde die DNA-Probe mit Xho I verdaut und mit einer radioaktiv markierten IGFBP-5 PCR-Probe getestet .
c) Charakterisierung von NFL-IGFBP-5 transgenen Mäusen
Verschiedene Gewebe unter Einschluss von Rückenmark, Kleinhirn und Hippokampus von erwachsenen IGFBP-5 transgenen Mäusen und nicht transgenen Kontrollmäusen wurde in 1 ml TRI- ZOL Reagenz (Fa. Life Technologies) homogenisiert und aus dem Homogenat wurde die Gesamt-RNA nach Angabe des Herstellers gereinigt.
Für jede RT-PCR Reaktion wurde 1 μg der Gesamt-RNA vorgelegt. Der erste DNA-Strang wurde mit Oligo- (dT) Primer synthetisiert (Fa. Life Technologies). Die Primer zur Amplifizie- rung von IGFBP-5 waren: 5' -Primer: 5 ' -CTT TCG TGC ACT GTG AAC C-3' (SEQ ID NO. 5); 3' -Primer: 5 ' -CTC AAC GTT ACT GCT GTC G-3* (SEQ ID NO. 6) .
Zur Kontrolle wurde folgende Primer zur Amplifizierung von ß-Actin verwendet: 5' -Primer: 5' -GTC GGC CGC CCT AGG CAC CAG-3' (SEQ ID NO. 7); 3'-Primer: 5 ' -CTC TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3' (SEQ ID NO. 8) . Jeweils 32 Zyklen wurden bei 94 °C für 30 s, bei 52°C für 30 s und bei 72°C für 1 min durchgeführt .
Während in Rückenmark transgener Tiere im Vergleich zu den Kontrollmäusen eine erhöhte Expression von IGFBP-5 mRNA nachgewiesen werden konnte, war in den anderen getesteten Organen kein eindeutiger Unterschied in der Expression von IGFBP-5 RNA zwischen transgenen und Kontrolltieren nachweisbar. Für die SDS-PAGE Liganden Western-Blot Analyse wurden zwei transgene und zwei Wildtyp Kontrollmäuse mit gleichem genetischem Hintergrund getötet und von allen Organen einschließlich dem Nervensystem (Ischias Nerv, Kleinhirn, Rückenmark Hirnrinde, Hippocampus und Seh-Nerv) Gewebeproben entnom- men. Diese wurden homogenisiert, in Puffer lysiert und zentri- fugiert. Die löslichen Proteine wurden auf einem 12%igen denaturierenden Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch getrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden in einer Elektroblotting Apparatur auf Nitrozellulosemembran überführt (Electroblotting Apparat Fa. Biometra GmbH, Göttingen, D) . Die Membranen wurden mit Jod-markiertem IGF-2 unter Verwendung der von Hossenlopp et al . (1986) Anal Biochem 154: 138-143 beschriebenen Technik getestet. An IGFBP-5 gebundenes radioaktives Jod wurde autoradiographiert .
Die Ergebnisse zeigten eine verstärkte Expression von IGFBP-5 im Rückenmark und im Ischiasnerv transgener Tiere.
d) Diagnose der Neuropathie in IGFBP-5 überexprimierenden, transgenen Mäusen
An den transgenen wie auch an den wildtyp-Kontrollmäusen wurde die Muskelkraft der Vordergliedmaßen (Methode wie beschrieben von Masu et al . (1993) Nature 365: 27-32) bestimmt. Obwohl kein Unterschied im Körpergewicht beider Tiere bestand, wurde bei den transgenen Mäusen eine starke Reduktion in der Greifstärke der Vordergliedmaße festgestellt. Zur Analyse dieser klinischen Symptome wurden histomor- phologische Untersuchungen durchgeführt. Sie bestanden in der morphometrischen Untersuchung des Ischias-Nerven, des Bauchfellnerven und der Ganglien des Vorderhornes des Rückenmarkes. Für diese Untersuchungen wurden Proben der entsprechenden Ge- webe nach Fixation in Osmiumtetroxid in Epoxyd-Harz eingebettet und Semidünnschnitte hergestellt. Gewebeschnitte wurden unter dem Lichtmikroskop analysiert und mit Hilfe der Quanti- med 500 Software (Fa. Leica GmbH, Bensheim, Deutschland) morphometrisch ausgewertet. Hierbei wurde die Anzahl der in- takten myelinisierten Nervenfasern in den quergeschnittenen Nerven gezählt. Die Anzahl degenerierter Fasern wurde an Hand der Wallerschen Degeneration bestimmt.
Während zwischen transgenen und Kontrollmäusen keine Unterschiede in der Myelinisierung der motorischen Nerven (Is- chiasnerv und Bauchfellnerven) , der Vaskularisierung und dem endoneurialem Bindegewebe festgestellt wurden, wiesen die motorischen Nerven der transgenen, IGFBP-5 exprimierenden Mäuse erhebliche Verluste an Axonen und degenerierte Fasern auf.
Zusätzlich wurde die Cholinesterase-Aktivität an den neuromuskulären Endplatten in Muskelproben (Zwerchfell-, Glu- teus- und Stemocleidomastoides-Muskulatur) histochemisch mit Hilfe der kombinierten Acetylcholinesterase-Silber Färbung (Namba (1971) Exp . Neurol. 33: 322-328; Gurney et al . (1992) J. Neurosci. 12: 3241-3247) bestimmt.
Des weiteren erfolgte in Proben des Gastrocnemius-Mus- kels eine quantitative Bestimmung der Acetylcholinesteraseak- tivität. Hierzu wurden die Muskelproben mit Zugabe von 0,5% Triton X-100 für die Bestimmung der gesamten (löslichen wie auch membrangebundenen) Enzymaktivität und ohne Zugabe von Triton X100 für die Bestimmung der löslichen Acetylcholi- nesteraseaktivität homogenisiert. Die Bestimmung der jeweiligen Enzymaktivität erfolgte nach Zentrifugation der Homogenate (15 min, 15.000 g, 4°C) in den jeweiligen Überständen nach der Methode von Ellmann (Schegg et al . (1990) Neurosci. Lett. 118: 197-200) . Während die histo orphologische Untersuchung dieser Muskelproben in Bezug auf motorische Endplatten und des Verhältnisses von Axonen zu Endplatten bei Jungtieren keine Unterschiede zwischen transgenen und Kontrolltieren ergab, waren in älteren, 6 Monate alten transgenen Mäusen in der Gluteusmusku- latur ein vermehrtes terminales Ausknospen der Axone festzustellen. Parallel hierzu war die freie Cholinesterase-Aktivität erhöht und die membrangebundene vermindert.
Um zu klären, ob der Verlust von Axonen in den transgenen Mäusen das Ergebnis oder die Ursache des Absterbens von motoneuralen Zellen ist, wurde die Anzahl der Motoneurone in dem facialem Nucleus wie auch im lumbaren Abschnitt des Rük- kenmarkes bei transgenen und Kontrollmäusen unterschiedlichen Alters gezählt.
Während bei Jungtieren keine Unterschiede nachweisbar waren, zeigten etwa 5-6 Monate alte transgene Mäuse eine deut¬ liche Verminderung der Motoneurone und eine Zunahme von degenerierten Motoneuronen sowohl im facialem Nucleus als auch im ventrolateralen Hörn des Rückenmarkes.
Nach Durchschneiden des Facialisnerven bei neugeborenen und 3-Wochen alten, transgenen Mäusen konnte 1 Woche später keine Verminderung der Motoneurone festgestellt werden. Dies legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Degeneration der Motoneurone bei Mäusen, die transgen für IGFBP-5 sind, die Ursache für den Verlust der Axone darstellt.
Beispiel 2: Charakterisierung von Nerven von Patienten mit Diabetes mellitus Von Gesunden wie auch von Patienten mit diabetischer Neuropathie wurden aus Nerven-Biopsieproben die Proteine nach Standardverfahren (Fa. Life Technologies, Karlsruhe, D) isoliert und diese auf einem 12%igem SDS-PAGE-Gel aufgetragen. Die separierten Proteinproben wurden auf eine Nitrozellulosemembran überführt, anschließend wurden diese Membranen für eine Stunde durch Inkubation in einer Puffer-Lösung, die Pfer- deserum und fettfreies Trockenmilchpulver enthielt, blockiert. Nachfolgend erfolgte der Nachweis des IGFBP-5 mit Hilfe eines IGFBP-5 spezifischen Kaninchen-Antikörpers (Fa. Santa Cruz, Göttingen, D, dessen spezifische Bindung durch einen Peroxydase-gekoppelten anti-Kaninchen-Antikörper nachgewiesen wurde. Die Peroxydase wurde mit dem ECL-Reagenz (Fa. Amersham, Braunschweig, D) entsprechend den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Zur Kontrolle erfolgten die gleichen Reaktionsschritte mit einem anti-ß-Actin-Antikörper aus' der Maus und einem Peroxydase-gekoppelten anti-Maus-Antikörper. Die Ergebnisse zeigen, dass bei Patienten mit diabetischer Neuropathie das IGFBP-5 in den Nervenbiopsien in deutlich größerer Menge anzutreffen ist, als in Gesunden. Beispiel 3: Isolierung und Zucht von Nervenzellen, welche IGFBP-5 überexprimieren, zur Testung von Wirkstoffen
Von Embryonen im Alter von 12,5 Tagen, die entweder normal oder aber für IGFBP-5 transgen waren, wurden spinale Motoneurone mit Hilfe der Panningtechnik (Metzger et al. (1998) J Neurosci. 18: 1735-1742) unter Verwendung eines monoklonalen anti-p75-Antikörpers aus der Ratte (Chemicon, Hofheim, Deutschland) isoliert. Hierzu wurden die ventrolateralen Teile des lumbalen Rückenmarks mechanisch zerkleinert, in Hepespuf- fer-Lösung (enthaltend 10 μM 2-Mercaptoethanol) übertragen und mit Trypsin (0,05%, 10 min) inkubiert. Die Einzelzellsuspension im Überstand wurde in eine mit dem anti p75-Antikörper be- schichteten Kulturschale überführt und bei Raumtemperatur für 30 min. inkubiert.
Nachfolgend wurden die einzelnen Kulturschalen gewaschen, anschließend die anhaftenden Zellen von der Kulturplatte durch 0,8% Kochsalzlösung, die 35 mM KC1 und 1 μM 2-Mercaptoethanol enthielt, abgelöst.
Die so gewonnen Zellen wurden in einer Dichte von 20.00 Zellen/cm2 in Kulturplatten (Greiner, Nürtingen, Deutschland) , die mit Polyornithin und Laminin vorbeschichtet waren, ausgesät. Die Zellen wurden bei 37 °C in Neurobasalmedium (Life Technologies, ergänzt mit B27-Supplement, 10% Pferdeserum, 500 μM Glutamat und 50 μg/ml Apotransferrin) und in einer 5% C02 Atmosphäre gehalten. 50% des Zellkulturrnediums wurden am 1. Tag und nachfolgenden jedem 2. Tag ersetzt.
Die Analyse der mRNA, die für IGFBP-5 kodiert, wurde mit Hilfe der RT-PCR durchgeführt. RNA wurde mittels Trizol-Rea- genz (Life-Technologies, Karlsruhe) isoliert und je 10 ng Gesamt-RNA wurde pro RT-PCR Reaktion eingesetzt. Die RT-PCR wur¬ de, wie im Beispiel 1 c) bereits beschrieben, durchgeführt.
Von Embryonen im Alter von 12,5 Tagen, die hinsichtlich des IGFBP-5-Gens normal oder transgen waren, wurden des weiteren sensorische Neuronen isoliert. Hierzu wurden dorsale Wurzelganglien isoliert, in PBS aufgenommen und anschließend mit Trypsin (0,05% in Hepespuffer) für 30 min. inkubiert. Die Trypsinverdauung wurde durch Zugabe von L15-Medium, das 10% Pferdeserum enthielt, gestoppt und nachfolgend wurden die Zel- len in Kulturplatten ausplattiert und für 3-4 Stunden inkubiert. Zellen im Überstand wurden zentrifugiert (10 min. bei 400 g) und das Zellsediment wurde genauso, wie bereits für spinale Motoneurone beschrieben, im Neurobasalmedium gehalten. Neurale Stammzellen wurden aus dem Gehirn von normalen Mäusembryonen, oder von Mäuseembryonen, die transgen für
IGFBP-5 sind, isoliert. Der Bereich des Vorderhirns wurde unter einem Präparationsmikroskop entnommen, in weiter entwik- kelten Embryonen auch der Bereich des Hippocampus und der pe- riventrikulären Zone. Diese Gehirnareale wurden dann in 200 μl HBSS (Hanks balanced salt solution (HBSS, Fa. Life Technologies (Karlsruhe), transferiert, mit 0,1% Trypsin (Endkonzentration in HBSS) für 10 min bei 37°C, inkubiert, die Reaktion mit 0,1% Trypsin-Inhibitor (Trypsin-Inhibitor aus egg yolk sack (Sigma, Deisenhofen) , Stammlösung: 1% in HBSS/25 mM HE- PES) Endkonzentration in HBSS abgestoppt. Dann wurden die Zellen zehnmal mit einer 200 μl Pipette trituriert und in Medium [ (Neurobasal-Medium (Life Technologies) , B27 Supplement (Life Technologies Stock 50x, EK lx) Glutamax II (Life Technologies Stock lOOx, EK lx), basicFGF (20ng/ml) , EGF (20 ng/ml)l] in ein Volumen von 5 ml überführt. Die dissoziierten Zellen wurden in Kulturschalen (50 ml Sarstedt, ) kultiviert (Brutschrank, 37 °C, 5% C02 feuchtigkeitsgesättigte Atmosphäre) und das Medium alle zwei Tage gewechselt. Die Zellen wachsen als Embroidbodies und attachieren nicht, daher wurden die Zellen zum Mediumwechsel in ein Falcon-Röhrchen überführt und 5 min bei 400 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Zellsediment trituriert und in frisches Medium aufgenommen. Spätestens nach 3 Passagen bildeten sich große Embroidbodies, die trypsiniert (s.o.) und in niedriger Zelldichte (max. 10.000 Zellen/Platte) auf 10 cm Schalen (Sarstedt) plattiert werden können. Einzelzellen wurden dann gepickt und zunächst in 96 "well"-Platten, später in 24 und schließlich 12-"well"-Platten expandiert. Diese Einzelzellklone neuraler Stammzellen können dann auf ihre Differenzierungskapazität hin untersucht werden und anschließend in erfindungsgemäßen Test- verfahren eingesetzt werden.
Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, wurden die Zellen auch als Linien etabliert und für spätere Experimente eingefroren und gelagert.
Das Einfrieren der neuralen Stammzellen erfolgte nach Standardprotokoll, d.h. nach der Zentrifugation wurden die Zellen in Medium mit 10 % DMSO aufgenommen und mit l°C/min zunächst auf -86°C abgekühlt (im MrFrosti) , um dann im flüssigen N2 bei - 186°C gelagert zu werden.
Beispiel 4: Verfahren zum Auffinden von Nervenzell-schützenden Substanzen Nervenzellen, die beispielsweise mit der oben angeführten Methode gewonnen sind, können für die Suche nach Substan- zen benutzt werden, welche in Nervenzellen die Expression oder die Funktion von IGFBP-5 inhibieren.
Hierzu werden IGFBP-5 überexprimierende und normale motorische Neuronen und sensorische Neuronen wie oben beschrieben gewonnen, in Zellkulturen ausgesät und mit der Prüfsub- stanz oder einem Gemisch von PrüfSubstanzen versetzt. Substanzen oder Gemische, welche die Funktion oder die Expression von IGFBP-5 inhibieren, sind in der Lage, das Absterben von IGFBP5 überexprimierender Neuronen zu verhindern, ohne das Überleben von normalen Neuronen zu beeinträchtigen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, welche die Funktion von Nervenzellen beeinflus- sen, das die folgenden Schritte umfasst: a) Inkontaktbringen einer Probe enthaltend IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff, b) Bestimmen der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe, und c) Selektion eines Wirkstoffes, welcher die Aktivität von IGFBP-5 verändert, insbesondere reduziert, gegenüber der Aktivität des IGFBP-5 ohne Inkontakt- bringung oder mit Inkontaktbringung mit einer Refe- renzsubstanz, welche die Aktivität von IGFBP-5 nicht beeinflußt oder um einen definierten Referenzwert verändert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe mindestens eine Zelle, mindestens einen Zellextrakt, mindestens ein Proteingemisch und/oder ein Gemisch enthaltend IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon, enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zelle eine neuronale Zelle, insbesondere eine sensorische, sympathische oder motorische neuronale Zelle, eine neuronale Stammzelle, ein Neuron, insbesondere ein cholinerges Neuron des basalen Vorderhirns, eine dopaminerge Nervenzelle des Mittelhirns, eine Körnerzelle, eine Purkinje-Zelle des Kleinhirns oder des Hippocampus, eine retinale Ganglienzelle oder ein Photorezeptor ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei die Zelle eine erhöhte IGFBP-5 Aktivität hat.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die
Aktivität von IGFBP-5 in der Zelle durch die Überlebensrate der Zelle bestimmt wird.
5 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aktivität von IGFBP-5 in der Probe durch die Menge des IGFBP-5 Proteins, die Menge der für IGFBP-5 kodierenden Nukleinsäure und/oder die Bindungsaktivität von IGFBP-5 bestimmt wird. 10
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verringerung der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe nach Inkontaktbringen mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff darauf hinweist, dass der potentielle Wirkstoff ein
15 pharmakologisch aktiver Wirkstoff ist, welcher die Funktion von Nervenzellen beeinflusse.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in einem weiteren Schritt der pharmakologisch aktive Wirkstoff
20 isoliert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei in einem weiteren Schritt der pharmakologische Wirkstoff, gegebenenfalls mit geeigneten Hilfs- und Zusatzstoffen, als
25 Arzneimittel formuliert wird.
10. Testsystem zum Auffinden pharmakologisch aktiver Wirkstoffe, welche die Funktion von Zellen des Nervensystems beeinflussen, enthaltend:
30 a) mindestens eine Probe enthaltend IGFBP-5 oder einen aktiven Teil davon und b) mindestens ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität von IGFBP-5 in der Probe.
35 11. Verwendung mindestens eines Wirkstoffs zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit Zeilwachstumsstörungen von Nervenzellen einhergehen, dadurch gekennzeichnet, das der Wirkstoff in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 aufgefunden wird.
12. Verwendung mindestens einer Wirksubstanz zur Prophylaxe und/oder Therapie diabetogener Neuropathie, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz die Aktivität von IGFBP-5 reduziert oder hemmt, vorzugsweise spezifisch reduziert oder hemmt.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch charakterisiert, dass die Wirksubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "IGF-1, IGF-2, eine Mutante von IGF-1 und/oder IGF-2 mit erhöhter Bindungsaffinität zu IGFBP-5, ein aktives Fragment von IGF-1 und/oder IGF-2, eine Substanz, welche an die Heparin-bindende Domäne des IGFBP-5 bindet, eine Substanz, welche die Expression und/oder Freisetzung von IGF-1 und/oder IGF-2 stimuliert, eine Nukleotidsequenz, die für IGF- 1 und/oder IGF-2 kodiert, eine Nukleotidse- quenz, die für eine Mutante von IGF-1 und/oder eine Mutante von IGF-2 mit erhöhter Bindungsaffinität zu IGFBP5 kodiert, eine Nukleotidsequenz, die für ein aktives Fragment von IGF-1 und/oder ein aktives Fragment von IGF-2 kodiert, eine IGFBP-5 anti-sense Nukleotidsequenz, ein IGFBP-5 schneidendes Ribozym, eine IGFBP-5 inhiborische RNA, und eine Nukleotidsequenz, die für einen IGFBP-5 bindenden Antikörper oder Antikörperfragment kodiert" .
14. Verwendung eine Wirksubstanz, welche die Expression und/o- der Freisetzung von IGF-1 und/oder IGF-2 stimuliert nach
Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "ein Antipro- gestin, ein Antioestrogen, das osteogene Protein-1 (OP-1), das bone morphogenic Protein-2 (BMP-2) , der basische Fi- broblast growth factor (bFGF) , der transforming growth factor ß-1 (TGSß-1), der platelet derived growth factor BB (PDGFBB) , ein Interleukin-1 Rezeptor Antagonist, ein Antagonist des Retinsäure-alpha-Rezeptors, und ein Inhibitor des Prostaglandins-2" .
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