EP1438414A1 - Verfahren zur selektiven oxidation von substituierten toluolen durch mikrobielle peroxidasen aus coprinus - Google Patents

Verfahren zur selektiven oxidation von substituierten toluolen durch mikrobielle peroxidasen aus coprinus

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EP1438414A1
EP1438414A1 EP02774660A EP02774660A EP1438414A1 EP 1438414 A1 EP1438414 A1 EP 1438414A1 EP 02774660 A EP02774660 A EP 02774660A EP 02774660 A EP02774660 A EP 02774660A EP 1438414 A1 EP1438414 A1 EP 1438414A1
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EP
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coprinus
microbial
peroxidase
oxidation
peroxydases
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Withdrawn
Application number
EP02774660A
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Inventor
Bernhard Hauer
Thomas Zelinski
Tilo Habicher
Michael Breuer
Timm Anke
Rainer Russ
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group

Definitions

  • the present invention relates to a process for the selective oxidation of toluene derivatives by microbial peroxidases from microorganisms of the genus Coprinus.
  • Substituted benzaldehydes are valuable intermediates in chemical synthesis.
  • the chemical production of these benzaldehydes by oxidation of the corresponding substituted toluenes is often difficult to achieve, since the methyl side chain is often oxidized to the carboxyl function by the oxidation reaction and does not remain at the stage of the aldehyde function.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a process for the selective oxidation of substituted toluenes by microbial peroxidases which both ensures a high conversion of the substrates and achieves the lowest possible proportion of substituted benzoic acids.
  • the peroxidases used can be used in different degrees of purity. A partially purified peroxidase solution that no longer has laccase activity is preferred.
  • the peroxidase from Coprinus spec DSM 14525 (deposited on September 25, 2001 at DSM) is particularly preferably used.
  • the peroxidase can be used in a variety of solvents. Buffered solutions are preferred which consist of at least 30%, preferably at least 50%, water.
  • the hydrogen peroxide causing the oxidation can be added in stoichiometric or superstoichiometric amounts. A continuous feed of the hydrogen peroxide into the reaction medium is preferred.
  • the reaction temperature can be freely selected between 0 and 50 ° C. At low temperatures, the enzymatic conversion is slowed down considerably, while high temperatures can lead to inactivation of the enzyme.
  • the optimal reaction temperature is therefore between 10 and 30 ° C and can easily be determined by a person skilled in the art on the basis of series tests.
  • the oxidation of the methyl side chain in the process according to the invention depends on the further substituents on the aromatic nucleus and their position in relation to the methyl chain.
  • Preferred further substituents R are methyl, isopropyl, t-butyl, halogen, methyl and nitro groups.
  • the position of the radical R relative to the methyl chain is obviously more important than the nature of the radical R.
  • An exception to this are nitrotoluenes.
  • o-Nitrobenzaldehyde was obtained in a relatively low yield, while the m-Nitrobenzaldehyde yield was comparable to p-Nitrobenzaldehyde.
  • o-Nitrotoluene was also the only substrate on which the corresponding alcohol derivative was found. No oxidation of the methyl chain to alcohol was observed for any other substrate.
  • Another object of the invention is a microbial peroxidase from Coprinus, which is capable of oxidizing toluene so selectively to benzaldehyde by H 2 0 2 that less than 0.4 mol of benzoic acid is formed per mole of oxidized toluene.
  • Coprinus spec. DSM 14525 was fermented in 20 liter medium (soy meal). Mycelium and soy meal were removed by centrifugation. The resulting supernatant was clarified by ultrafiltration (pore size 0.16 ⁇ m). The filtrates were then concentrated by ultrafiltration with a membrane with 10kDa cutoff. The peroxidase was purified from the filtrate using FPLC. Two chromatography steps on Q-Sepharose with pH 5 and pH 7.3 gave a 12-fold activity enrichment (specific activity was 7.6 U / mg protein with ABTS, 2.2 azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) Enzyme preparation showed no laccase activity.
  • This peroxidase preparation was used for the following reactions.
  • reaction batches were incubated at room temperature. With a syringe, 4.5 ⁇ l hydrogen peroxide (50 mM) was added through a membrane every 10 minutes (a total of nine times). At the halfway point of the biotransformation, an additional 25 ⁇ l peroxidase solution was added. The concentration of the compounds was determined by comparison with authentic standards by HPLC. The structure of the compounds obtained was confirmed by GC-MS.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Oxidation von Toluolderivaten durch mikrobielle Peroxidasen aus Mikroorganismen der Gattung Coprinus.

Description

Verfahren zur selektiven Oxidation von substituierten Toluolen durch mikrobielle Peroxidasen aus Coprinus
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Oxidation von Toluolderivaten durch mikrobielle Peroxidasen aus Mikroorganismen der Gattung Coprinus .
Substituierte Benzaldehyde sind wertvolle Zwischenprodukte in der chemischen Synthese. Die chemische Herstellung dieser Benzaldehyde durch Oxidation der entsprechenden substituierten Toluole ist oft schwierig zu erreichen, da die Methylseitenkette durch die Oxidationsreaktion häufig bis zur Carboxylfunktion oxi- diert wird und nicht auf der Stufe der Aldehydfunktion bleibt .
Auch mikrobielle Verfahren zur Oxidation sind häufig technisch nicht brauchbar, da sie entweder eine zu geringe Umsetzung der substituierten Toluole bewirken oder die Oxidation bis zur Benzoesäure abläuft.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur selektiven Oxidation von substituierten Toluolen durch mikrobielle Peroxidasen bereitzustellen, das sowohl eine hohe Umsetzung der Substrate gewährleistet und einen möglichst geringen Anteil an substituierten Benzoesäuren erzielt.
Gefunden wurde ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyden der Formel (I) durch Oxidation von Toluolen der Formel (II) mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart einer mikrobiellen Peroxidase isolierbar aus einem Mikroorganismus der Gattung Coprinus
II I wobei
R = Cι-C4-Alkyl, Cι-C4-Alkoxyl, F, Cl, Br, J, N02, OH und n = 0, 1, 2 bedeutet.
Die verwendeten Peroxidasen können in verschiedenen Reinheitsgraden eingesetzt werden. Bevorzugt wird eine teilgereinigte Peroxidaselösung, die keine Laccaseaktivität mehr besitzt. Besonders bevorzugt wird die Peroxidase aus Coprinus spec DSM 14525 (hinterlegt am 25.09.01 bei DSM) verwendet.
Die Peroxidase kann in einer Vielzahl von Lösungsmitteln ein- gesetzt werden. Bevorzugt werden gepufferte Lösungen, die zu mindestens 30 % bevorzugt mindestens 50 % aus Wasser bestehen.
Das die Oxidation bewirkende Wasserstoffperoxid kann in stöchiometrischen oder überstöchiometrischen Mengen zugegeben werden. Bevorzugt ist eine kontinuierliche Zuführung des Wasserstoffperoxids in das Reaktionsmedium.
Die Reaktionstemperatur kann in breiten Bereichen zwischen 0 und 50°C frei gewählt werden. Bei niedrigen Temperaturen ist die enzy- matische Umsetzung stark verlangsamt, während hohe Temperaturen zu einer Inaktivierung des Enzyms führen können. Die optimale Reaktionstemperatur liegt demzufolge zwischen 10 und 30°C und kann vom Fachmann leicht anhand von Reihenversuchen ermittelt werden.
Die Oxidation der Methylseitenkette im erfindungsgemäßen Verfahren hängt von den weiteren Substituenten am aromatischen Kern und deren Position zur Methylkette ab. Bevorzugte weitere Substituenten R sind Methyl, Isopropyl, t-Butyl, Halogen, Methoyy und Nitrogruppen.
Die Position des Restes R zur Methylkette ist offenbar entscheidender als die Natur des Restes R. Im erfindungsgemäßen Verfahren sind solche Substituenten R bevorzugt, die ortho und para zur Methylkette stehen gegenüber solchen in meta-Position. Eine Ausnahme hiervon sind Nitrotoluole. o-Nitrobenzaldehyd wurde in einer relativ niedrigen Ausbeute erhalten, während die m-Nitro- benzaldehydausbeute vergleichbar zu p-Nitrobenzaldehyd war. o-Nitrotoluol war auch das einzige Substrat, bei dem auch das entsprechende Alkoholderivat gefunden wurde. Bei allen anderen Substraten wurde keine Oxidation der Methylkette zum Alkohol beobachtet .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine mikrobielle Peroxidase aus Coprinus, die in der Lage ist Toluol, durch H202 so selektiv zu Benzaldehyd zu oxidieren, daß pro mol oxidiertem Toluol weniger als 0,4 mol Benzoesäure entstehen. Beispiele 1
Herstellung der Peroxidase
Coprinus spec. DSM 14525 wurde in 20 1 Medium (soy meal) fermen- tiert. Mycel und soy meal wurden durch Zentrifugation entfernt. Der entstandene Überstand wurde durch Ultrafiltration (Porengröße 0,16 μm) geklärt. Die Filtrate wurden anschließend durch Ultrafiltration mit einer Membran mit lOkDa cutoff konzentriert. Die Partiaireinigung der Peroxidase erfolgte aus dem Filtrat mit FPLC. Zwei Chromatographieschritte an Q-Sepharose mit pH 5 und pH 7,3 ergaben eine 12 fache Aktivitätsanreicherung (spezifische Aktivität betrug 7,6 U/mg Protein mit ABTS, 2,2 Azino- bis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) . Die Enzympräparation wies keine Laccase Aktivität auf.
Diese Peroxidasepräparation wurde für die folgenden Umsetzungen verwendet .
Beispiel 2 Allgemeine Vorschrift zur Oxidation mit Peroxidase
10 μl der entsprechenden Ausgangsverbindung (substituiertes Toluol) gelöst in Aceton (100 mM) wurde verdünnt in 350 μl Tartrat-Puffer (200 mM pH 5). Es wurden 4,5 Ml Wasserstoffperoxid (50 mM) , 45 μl Wasser und 25 μl einer Peroxidaselösung, die nach Beispiel 1 hergestellt worden war, und eine Aktivität von 30 U/ml aufwies; d.h. 1 ml dieser Peroxidaselösung oxidiert 30 μmol ABTS pro Minute.
Die Reaktionsansätze wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Mit einer Spritze wurden durch eine Membran alle 10 Minuten 4,5 μl Wasserstoffperoxid (50 mM) zugegeben (insgesamt neun mal) . Zur Halbzeit der Biotransformation wurde zusätzlich 25 μl Peroxidaselösung zugegeben. Die Konzentration der Verbindungen wurde durch Vergleich mit authentischen Standards durch HPLC ermittelt. Die Struktur der erhaltenen Verbindungen wurde durch GC-MS bestätigt.
Gemäß Beispiel 2 wurden die in der Tabelle 1 gezeigten Oxidationen durchgeführt . Tabelle 1
Oxidation verschiedener Toluole mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid
0

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Aldehyden der Formel (I) durch Oxidation von Toluolen der Formel (II) mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart einer mikrobiellen Peroxidase isolierbar aus einem Mikroorganismus der Gattung Coprinus
II I wobei
R = Cι-C4-Alkyl, Cι-C4-Alkoxyl, F, Cl, Br, J, N02, OH und n = 0, 1, 2 bedeutet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrobielle Peroxidase aus Coprinus DSM 14525 verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R = CH3 bedeutet.
4. Mikrobielle Peroxidase aus Coprinus, die in der Lage ist
Toluol, durch H202 so selektiv zu Benzaldehyd zu oxidieren, daß pro mol oxidiertem Toluol weniger als 0,4 mol Benzoesäure entstehen.
EP02774660A 2001-10-05 2002-09-27 Verfahren zur selektiven oxidation von substituierten toluolen durch mikrobielle peroxidasen aus coprinus Withdrawn EP1438414A1 (de)

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