EP1368493A2 - Identifizierung und verwendung von inhibitoren der haarbildung - Google Patents

Identifizierung und verwendung von inhibitoren der haarbildung

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EP1368493A2
EP1368493A2 EP02704735A EP02704735A EP1368493A2 EP 1368493 A2 EP1368493 A2 EP 1368493A2 EP 02704735 A EP02704735 A EP 02704735A EP 02704735 A EP02704735 A EP 02704735A EP 1368493 A2 EP1368493 A2 EP 1368493A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
inhibitor
amino acid
hair
protein
cell
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02704735A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Boehm
Thomas Schlake
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority to EP02704735A priority Critical patent/EP1368493A2/de
Publication of EP1368493A2 publication Critical patent/EP1368493A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
    • A61Q7/02—Preparations for inhibiting or slowing hair growth

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying and / or producing an inhibitor of hair formation.
  • the invention also relates to a method for inhibiting hair formation.
  • the invention also relates to a method for producing a medicament.
  • the invention also relates to a medicament which optionally comprises a hair formation inhibitor which has been identified or obtained by one of the methods according to the invention, or a polynucleotide which codes for the inhibitor, in a pharmaceutically acceptable dosage form.
  • the invention also relates to a medicament which optionally comprises a polypeptide comprising the DNA binding domain but not the transactivator domains of Whn, LEF-1 or Hoxc13 or a polynucleotide encoding these polypeptides in a pharmaceutically acceptable dosage form.
  • the invention relates to the use of a polypeptide comprising the DNA binding domain but not the transactivator domains of Whn, LEF-1 or Hoxc13 or a polynucleotide coding for this polypeptide, an inhibitor which was identified and / or obtained by one of the methods according to the invention, or a polynucleotide encoding such an inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of hair growth disorders.
  • the invention relates to a kit for carrying out the method according to the invention.
  • the technical problem on which the invention is based is therefore the provision of means and measures for controlling the hair formation, in particular for inhibiting the same.
  • the invention thus relates to a method for identifying and / or producing an inhibitor of hair formation, the method comprising the steps
  • inhibitor encompasses all substances or mixtures of substances which are able to inhibit hair formation. These substances or mixtures of substances can be, for example, proteins, nucleic acids which code for these proteins or chemicals. Particularly important potential inhibitors of Hair formation are proteins, domains of proteins, protein variants or nucleic acids coding therefor, which are preferred embodiments below are further defined.
  • inhibition means a significant reduction in reporter gene activation in the methods according to the invention. Significance can be achieved using statistical methods known in the art, such as the student's t-test, the ⁇ 2 test or the U-test according to Mann-Whitney. Applicability criteria for statistical methods in individual cases are known to the person skilled in the art. Even more, adaptations of the statistical methods can be carried out by the person skilled in the art with customary effort, preferably the contacting of cells with the potential inhibitor leads at least to an inhibition of the reporter gene activation as described in the example and Table 1.
  • bringing into contact encompasses all types of physical or chemical interactions between the inhibitor molecules and the cell or the cellular constituents.
  • the inhibitor can be in a liquid, for example a nutrient medium for the cell, are present in solution, this nutrient medium then being brought into contact with the cell, for example by incubating the cell in this medium.
  • a liquid it is also possible to use gels and gel-like liquids which comprise the inhibitor "Bringing in contact” also includes introducing the inhibitor into the cell so that it can interact with intracellular components, such as the cellular proteins.
  • the inhibitor can be introduced by various methods known in the art. It goes without saying that the methods for introducing nucleic acids can differ from those for introducing proteins or chemicals.
  • nucleic acids examples include precipitation transfection, such as, for example, calcium phosphate or RbCI precipitation transfection, transfection by means of liposomes, transfection by means of macromolecular polymers, for example fullerenes, electroporation methods or transfection by means of retrovection or Recombinant techniques for integration into the cellular genome.
  • precipitation transfection such as, for example, calcium phosphate or RbCI precipitation transfection
  • liposomes transfection by means of liposomes
  • macromolecular polymers for example fullerenes
  • electroporation methods or transfection by means of retrovection or Recombinant techniques for integration into the cellular genome examples of such methods which are suitable for introducing nucleic acids.
  • electroporation methods such as, for example, calcium phosphate or RbCI precipitation transfection, transfection by means of liposomes, transfection by means of macromolecular polymers, for example fullerenes, electroporation methods or transfection by means of retro
  • Examples of methods for introducing proteins also include introducing using liposomes, introducing using macromolecular polymers such as e.g. Fullerenes.
  • macromolecular polymers such as e.g. Fullerenes.
  • some proteins are also actively absorbed by the cell through import. In this context it is also possible to link proteins that would not normally be included with additional peptide sequences that can mediate the import of these proteins.
  • chemicals are either actively imported from the cell and thus introduced into the cell or reach the cell by diffusion.
  • chemicals can also be introduced into the cell by various methods known in the art. These methods include liposomes, macromolecular polymers.
  • hair formation is to be understood as the entire biological process which leads to the morphological formation of the hair.
  • the term further comprises various steps relevant in hair formation. These include the formation of precursor cells of keratinocytes and mesenchymal cells which are involved in hair formation play a role, their differentiation to mature keratinocytes, their interaction and the actual morphological formation of the hair.Also the formation of so-called stem cells is also part of the biological process which is the basis of the hair formation in the sense of the invention the term "hair formation” also includes the growth of the existing hair and the underlying physiological processes.
  • the term “factor” is to be understood as meaning proteins which are involved in the regulation of hair formation, that is to say one or more steps of the biological process outlined above.
  • proteins comprise proteins which transcribe, translate and / or post regulate translational modification of proteins or the genes coding therefor, which are directly involved in the formation of the hair.
  • Proteins which are directly involved in the formation of the hair are to be understood as proteins such as, for example, the hair keratins which are used for the molecular structure of the hair or the molecular Phenotype of the cells involved in the formation of the hair.
  • proteins that regulate the transcription of the genes for proteins that are involved in hair formation are transcription factors that activate or enhance hair keratin gene expression.
  • factor also encompasses proteins which are able to modulate the activity or gene expression of the regulatory proteins. These include proteins which activate or intensify the activity of the aforementioned regulatory proteins and also activate their gene expression or Since the regulatory proteins also include those which inhibit or weaken the activity of the proteins which are directly involved in the formation of the hair, the term “factor” also encompasses proteins which inhibit the activity of regulatory proteins having an inhibitory effect or weaken and ultimately stimulate hair formation. Regulatory proteins can be divided into different classes, including extracellular proteins, their cellular receptors, intracellular signal transmitters and proteins that modify the activity of the signal transmitters, and transcription factors and their co-factors that directly affect the expression of those involved in the formation of the hair Regulate proteins and be regulated by the aforementioned proteins. In many cases, the members of these classes are connected in series in so-called signal transmission cascades. This
  • Signal transmission cascades serve in particular to interpret a signal mediated by an extracellular protein intracellularly, so that the line can react to it in the form of changed gene expression.
  • the transmission of such extracellular signals through signal transmission cascades consisting of the aforementioned proteins forms the basis of intercellular communication, which is essential during hair formation.
  • these proteins encompassed by the term "factor" have in common that they have a modular structure. This structure results from the function of these proteins, either with different proteins or, in the case of the transcription factors, with other proteins and the cis regulatory DNA sequences must interact physically, meaning a modular one that the factors according to the invention comprise multiple domains either within a single protein or within one Nucleic acid molecules can also be integrated into the cellular genome after introduction into the cell.
  • Examples of methods for introducing proteins also include introducing using liposomes, introducing using macromolecular polymers such as e.g. Fullerenes.
  • macromolecular polymers such as e.g. Fullerenes.
  • some proteins are also actively absorbed by the cell through import. In this context it is also possible to link proteins that would not normally be included with additional peptide sequences that can mediate the import of these proteins.
  • chemicals are either actively imported from the cell and thus introduced into the cell or reach the cell by diffusion.
  • chemicals can also be introduced into the cell by various methods known in the art. These methods include liposomes, macromolecular polymers.
  • hair formation is to be understood as the entire biological process which leads to the morphological formation of the hair.
  • the term further comprises various steps relevant in hair formation. These include the formation of precursor cells of keratinocytes and mesenchymal cells which are involved in hair formation play a role, their differentiation to mature keratinocytes, their interaction and the actual morphological formation of the hair.Also the formation of so-called stem cells is also part of the biological process which is the basis of the hair formation in the sense of the invention the term "hair formation” also includes the growth of the existing hair and the underlying physiological processes.
  • the term “factor” is to be understood as meaning proteins which are involved in the regulation of hair formation, that is to say one or more steps of the biological process outlined above.
  • proteins comprise proteins which transcribe, translate and / or post regulate translational modification of proteins or the genes coding therefor, which are directly involved in the formation of the hair.
  • Proteins which are directly involved in the formation of the hair are to be understood as proteins such as, for example, the hair keratins which are used for the molecular structure of the hair or the molecular Phenotype of the cells involved in the formation of the hair.
  • proteins that regulate the transcription of the genes for proteins that are involved in hair formation are transcription factors that activate or enhance hair keratin gene expression.
  • factor also encompasses proteins which are able to modulate the activity or gene expression of the regulatory proteins. These include proteins which activate or intensify the activity of the aforementioned regulatory proteins and also activate their gene expression or Since the regulatory proteins also include those which inhibit or weaken the activity of the proteins which are directly involved in the formation of the hair, the term “factor” also encompasses proteins which inhibit the activity of regulatory proteins having an inhibitory effect or weaken and ultimately stimulate hair formation.
  • Regulatory proteins can be divided into different classes, including extracellular proteins, their cellular receptors, intracellular signal transmitters and proteins that modify the activity of the signal transmitters, and transcription factors and their co-factors that directly affect the expression of those involved in hair formation Regulate proteins and be regulated by the aforementioned proteins. In many cases, the members of these classes are connected in series in so-called signal transmission cascades. This
  • Signal transmission cascades serve in particular to interpret a signal mediated by an extracellular protein intracellularly, so that the cell can react to it in the form of changed gene expression.
  • the transmission of such extracellular signals through signal transmission cascades consisting of the aforementioned proteins forms the basis of intercellular communication, which is essential during hair formation.
  • these proteins encompassed by the term "factor" have in common that they have a modular structure. This structure results from the function of these proteins, either with different proteins or, in the case of the transcription factors, with other proteins and the cis regulatory DNA sequences must interact physically, a modular structure means that the factors according to the invention have several domains, either within a single protein or within one of different ones 6
  • Subunits of protein built up are defined amino acid sequence sections which form a specific tertiary structure in the region of this domain. These domains can then have a very specific biological function, such as. e.g. the detection of a specific cis-regulatory DNA element or the specific activation or inhibition of a further protein can be assigned by physical interaction. According to the invention, the factors must comprise several domains in order to be able to fulfill their biological function.
  • the factors according to the invention can be introduced into the cell either as nucleic acids or proteins by various methods described in the prior art. According to the invention, however, the factors can already be present endogenously in the cell. In some cases, however, it may still be necessary to increase the concentration of the factors or the factor by exogenous addition. In any case, the factor should be present in the cell in a concentration and / or conformation that allows activation of the reporter gene mediated by the expression control sequence.
  • reporter gene encompasses genes which, owing to their biochemical or physicochemical properties, can be detected directly or by suitable devices or methods. Particularly suitable reporter genes are described below as a preferred embodiment of the method according to the invention.
  • expression control sequence encompasses each of the cis-regulatory elements which are required for the expression of a gene.
  • Cis-regulatory elements are DNA sequences with regulatory properties. These include promoter, enhancer and silencer elements. Promoter elements mediate the basal expression of a gene whereas enhancer elements increase expression, silencer elements bring about a reduction or inhibition of expression. The promoter, enhancer and silencer elements interact physically with regulatory proteins, the transcription factors. Transcription factors can affect gene expression 7
  • transcription factors bind to DNA elements such as the TATA box or other so-called “initiator” elements or to adjacent sequence sections.
  • the basal transcription factors form a complex that ultimately also recruits RNA polymerase, a DNA-dependent RNA-synthesizing enzyme that mediates the actual transcription.
  • Transcription factors that bind to enhancer elements ensure the rapid formation of a stable complex of the basal transcription factors, for example by directly or indirectly recruiting them via additional proteins, the so-called co-factors, and stabilizing the complex initiated in this way.
  • transcription factors that bind to silencing elements negatively interfere with the formation of a complex of the basal transcription factors.
  • transcription factors only change the structure of the DNA and thereby usually bring distant cis-regulatory sequences in close proximity to one another, so that transcription factors binding therein can physically interact with one another. Understandably, such cis-regulatory elements or the transcription factors that bind to them can also influence gene expression as enhancer or silencer elements.
  • the presence and architecture of enhancer and silencer elements in a gene locus are responsible for the tissue-specific expression of a gene, on the one hand, and the tissue-specific expression of the transcription factors binding to these cis-regulatory elements.
  • expression control sequence in the sense of the invention is to be understood as a DNA sequence which comprises various of the cis-regulatory elements described above which are sufficient to mediate the expression of the reporter gene associated with this expression control sequence and which are normally in vivo at the mediation the tissue specificity of gene expression are involved.
  • target gene encompasses genes which are regulated either directly or indirectly by the factors according to the invention.
  • Factors which regulate a target gene directly according to the invention are those which have already been described previously 8th
  • the target genes are genes which encode proteins which are either directly necessary for the morphological formation of the hair or which are characteristic of the molecular phenotype of a cell type which is essential for hair formation.
  • the term "quantitative determination” is to be understood to mean the determination of the entire reporter gene activation or a quantitatively meaningful, detectable part thereof.
  • the determination of the reporter gene activity can be carried out either by quantitative detection of the transcripts of the reporter gene or by quantitative detection of the protein which Suitable methods which are suitable for the quantitative detection of the transcripts of the reporter gene are known in the prior art, including, among others, affinity chromatography methods, mass spectroscopic methods, nucleic acid hybridization methods, such as Northern analyzes or RNase Protection experiments, "nuclear run-on” experiments, PCR methods which are suitable for quantification, such as, for example, normalized PCR, "light-cycling" PCR.
  • Suitable methods for detecting the protein encoded by the reporter gene include methods known in the art, for example specifically Antibody-based detection methods, such as Western analyzes, ELISA or RIA tests, but also methods in which the protein is detected by demonstrating its biochemical properties. Such methods can be carried out as described in the examples. Here, for example, enzymatic activities or chemiluminescence, bioluminescence or fluorescence can be detected. Devices are preferably used for the quantitative determination according to the invention which allow the quantitative evaluation of the signal produced during the detection, for example the emission of photons during chemiluminescence or bioluminescence. Such devices and their respective areas of use are known in the prior art. Depending on the detection method used, prior treatment of the cells may be necessary.
  • Such treatment could include extracting the Reporter gene transcripts or proteins from the cell are used.
  • Such treatment methods are also known in the prior art and are described in detail, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory (1989), NY.
  • the term “relating” means that a relative measure for the reporter gene activation is determined.
  • the reporter gene activation which was determined after carrying out steps (a) and (b) above, compared to the reporter gene activation after in a cell which, as described in step (c), was not brought into contact with the presumed inhibitor, a reduced or even missing reporter gene activation compared to the cell not brought into contact with the inhibitor Step (c) is an indication that the putative inhibitor tested is actually an inhibitor of hair formation, and the reduction in reporter gene activation must be significant for an inhibitor in the sense of the invention, as already described above the comprehensive evaluation of the quantitatively determined reporter gene activation, also by means of a suitable device electronic data processing, e.g. Computer. A large number of suspected inhibitors can thus be analyzed in succession or in parallel and the data sets obtained can be effectively evaluated.
  • Another advantage of the method according to the invention is that, as a result, depending on the choice of the target gene, certain steps of the process of 10
  • Hair formation could be specifically examined and manipulated by the inhibitors found.
  • the knowledge gained in this way allows the development of effective therapies for hair growth disorders and has a wide range of prophylactic and medical applications.
  • the reporter gene being selected from the group consisting of: ⁇ -galactosidase, luciferase, Renilla luciferase, green fluorescent protein (GFP), blue fluorescent protein (BFP), yellow fluorescent protein (YFP), Chloramphenicol transferase.
  • the reporter genes mentioned above are all excellent for quantitative determination using the activity of the proteins they encode, although it is of course also possible to detect the RNA transcripts, ß-galactosidase, luciferase, renilla luciferase and chloramphenicol transferase encode enzymes, their activity based on the converted Substrate can be determined efficiently. This quantitative determination can be carried out using methods known in the art or as described in the examples. The quantitative detection of green fluorescent protein (GFP), blue fluorescent protein (BFP) and yellow fluorescent protein (YFP) can be based on the bioluminescent properties of these proteins.
  • GFP green fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • the target gene being selected from the group consisting of:
  • Keratin human hair keratin genes: hHal, hHa2, hHa3-l, hHa3-ll, hHa4, hHa5, hHa ⁇ , hHa7, hHa8; hHbl, hHb2, hHb3, hHb4, hHb5, hHb6.
  • the hair keratin genes mentioned here are particularly suitable for the methods according to the invention, since they are specifically expressed during hair formation and the proteins encoded by them represent essential morphological building blocks of the hair. Inhibitors that are able to interfere with the gene expression of this keratin are therefore also suitable for preventing the production of the essential keratin proteins. Hence the 11
  • Whn binds to a DNA sequence comprising 10 nucleotides that contains the tetra-nucleotide 5 '-ACGC-3'. Even more preferably, Whn binds to one of the nucleotides 5'-agtaagACGC'cata-3 '(S EQ ID NO: 1) comprehensive sequence.
  • nude mice The outstanding role that this transcription factor plays in hair formation is also evident from its loss of function in mice which have the "nude" phenotype, the so-called nude mice.
  • a characteristic of these nude mice is that they do not form any body hair, ie the process of hair formation is efficient is inhibited.
  • a method according to the invention is likewise preferred, in which the reporter gene is introduced into the cell.
  • the term “introduced” is to be understood to mean that the expression control sequence which is operatively linked to a reporter gene, as also discussed above for contacting, is either introduced into the cell as nucleic acids by various methods described in the prior art, or
  • the reporter gene operatively linked to the expression control sequence can also be stably integrated into the genome of the cell.
  • the reporter gene can be linked to the endogenous expression control sequence of a target gene by recombination techniques. Such a reporter gene would thus be integrated into the locus of the target gene that the cis-regulatory elements of the target gene are still able to regulate gene expression but instead of 12
  • the reporter gene transcribe.
  • An advantage of such a cell with a stably integrated reporter gene under the control of a suitable expression control sequence would be that the step of introducing the reporter gene associated with the expression control sequence, which would otherwise be necessary when carrying out the method, would be eliminated. Eliminating this step would eliminate related normalization methods that may need to be applied to ensure the efficiency of the insertion. Nevertheless, the methods according to the invention can also be carried out by introducing a reporter gene which is linked to the expression control sequence and carried out individually in each procedure. As already stated, however, it could be necessary to carry out suitable normalization methods known in the prior art in order to compare two differently treated cell populations in a meaningful manner.
  • the invention also relates to a method of inhibiting hair formation, the method comprising contacting an inhibitor of hair formation with a cell, the cell comprising a hair stimulating factor that can interact with the inhibitor.
  • Loss of de novo hair formation can occur or inhibit or slow the formation of hair.
  • Hair-stimulating factor interacts physically with this. This inhibits the activity of the factor and inhibits it
  • Models such as cell or organ cultures of the skin or in vivo in 13
  • Animal models are carried out.
  • a phenotype comparable to that of nude mice is a preferred result of the inhibition of hair formation.
  • the method can also be used for the therapy of hair growth disorders as stated in the embodiments relating to uses.
  • the cell used in the methods according to the invention is preferably selected from the group consisting of:
  • COS-1 Heia, COS-1, COS-7, CHO, epithelial cell lines, primary keratinocytes, or
  • a method according to the invention is likewise preferred, the factor being encoded by a polynucleotide which is introduced into the cell.
  • the Bergiff "introduced” has already been defined in more detail above. As already described above, it may be necessary to introduce the factor exogenously into the cell. Particularly suitable here is the introduction of a polynucleotide coding for the factor, which is preferably introduced into the cell in the form of an expression construct In addition to the polynucleotide, this expression construct comprises expression control sequences which allow expression of the factor in the cell.
  • polynucleotide and “nucleic acid” refer to the same items according to the invention and can therefore be exchanged.
  • a method according to the invention is also preferred, wherein the factor stimulating hair formation is a transcription factor.
  • transcription factors which stimulate hair formation are particularly suitable for carrying out the processes according to the invention, since they directly express the expression of the genes relevant for the morphological formation of the hair, such as e.g. control the hair keratins.
  • the factors are proteins of modular construction according to the invention. Transcription factors comprise at least one DNA-binding domain and one domain that mediates protein interaction and thus have a modular structure.
  • a method according to the invention is particularly preferred, the transcription factor being selected from the group consisting of Whn, Hairless, LEF-1 and Hoxc13. These transcription factors have already been shown to play a role in hair formation as these stimulating transcription factors. Furthermore, the transcription factors mentioned here have a modular structure, consisting of at least one DNA-binding domain and a domain which mediates interaction with other factors of the transcription complex. In addition, LEF-1 is known to additionally interact with cytoplasmic regulatory proteins and / or co-factors.
  • a method according to the invention is also preferred, wherein the inhibitor comprises a domain of the transcription factor, as previously defined.
  • a protein that only comprises one domain of the transcription factor also only has the biological properties mediated by this domain.
  • Such a protein lacks the properties which are mediated by the other domains of the modular transcription factor and which are essential for its overall biological function.
  • a protein comprising only one domain can therefore interact either with the other proteins or with the cis-regulatory element, but not with both.
  • a protein competes with the transcription factor for interaction with either DNA or other proteins.
  • other proteins or cis-regulatory elements that have bound the protein comprising the domain can no longer interact with the transcription factor.
  • the protein comprising the single domain does not have the biological activity of the entire transcription factor, the molecular interplay in gene regulation is interrupted by this protein.
  • the described protein can act as an inhibitor by competition and blocking binding sites on either other proteins or cis-regulatory DNA elements.
  • the domain mediates a protein-DNA or protein-protein interaction.
  • a DNA-binding domain comprises amino acids 254 to 372 of the Whn protein, while a protein-protein interaction-mediating domain is the transactivator domain of Whn, comprising amino acids 474 to 648.
  • a protein-protein interaction-mediating domain is the transactivator domain of Whn, comprising amino acids 474 to 648.
  • the inhibitor comprises at least one amino acid exchange, one amino acid deletion or one 16
  • molecular variants which differ from the transcription factor by amino acid exchange, amino acid deletion or an amino acid insertion can also act as competitive inhibitors.
  • the respective amino acid modification in one of the domains of the modular transcription factor leads to the loss of the biological properties of this domain, so that the molecular variant, like the previously described protein, which only comprises one domain of the transcription factor, no longer has the biological function of the Can fill in the transcription factor, but is still able to block the molecular interplay in gene regulation by interacting with either other proteins or cis-regulatory DNA elements.
  • the amino acid sequence of the inhibitor in the method according to the invention is, however, at least 70%, preferably 80%, more preferably 90% or most preferably 95% identical to that of the previously defined transcription factor despite the presence of at least one of the amino acid modifications previously carried out.
  • a method according to the invention is therefore particularly preferred, wherein the amino acid exchange, the amino acid deletion or the amino acid insertion leads to the loss of the function of at least one domain of the transcription factor.
  • a variant Whn protein can have an amino acid exchange of an arginine at position 320 into a cysteine. Such an exchange would lead to the loss of the biological properties of the DNA-binding domain and thus to a Whn protein variant that. is no longer able to bind DNA, but can still interact with other proteins using the transactivator domain.
  • the above-mentioned variant of Whn is known in the prior art and is described, for example, in Schlake (2000) loc. cit. described.
  • the factor stimulating hair formation is a cytoplasmic protein.
  • cytoplasmic proteins represent another large class of regulators with a modular structure.
  • the cytoplasmic proteins according to the invention are distinguished by at least two domains which mediate interaction with different other proteins.
  • Such proteins can transmit signals by, for example, passing from a first protein to the first. Domain itself are activated and then in the activated state bind or activate a second protein via the second domain.
  • a signal transmitted by these cytoplasmic proteins ultimately regulates the gene expression of the target genes described above via transcription factors which are at the end of the signal transmission cascade consisting of the cytoplasmic proteins.
  • Examples of such cytoplasmic proteins are the ⁇ -catenin involved in the regulation of LEF-1.
  • the inhibitor comprising a domain of the cytoplasmic protein, as previously defined.
  • Protein-binding domains can be determined using various methods known in the art. These include e.g. "yeast two-hybrid” method, immunoprecipitation techniques and direct interaction measurements in vitro by affinity chromatography and the so-called surface plasmon resonance.
  • a method according to the invention is therefore particularly preferred in which the domain mediates a protein-protein interaction.
  • the inhibitor has at least one amino acid exchange, one amino acid deletion or one amino acid insertion to the previously defined cytoplasmic protein.
  • competitive inhibition can also result from a molecular variant of a cytoplasmic protein, 18
  • amino acid sequence of the inhibitor in the method according to the invention is identical to that of the previously defined cytoplasmic protein despite the presence of at least one of the amino acid modifications previously carried out, at least 70%, preferably 80%), more preferably 90% or most preferably 95%.
  • a method according to the invention is particularly preferred, wherein the amino acid exchange, the amino acid deletion or the amino acid insertion leads to the loss of the function of at least one domain of the cytoplasmic protein.
  • Receptors are also modular proteins that span at least two domains that mediate protein-protein interactions. On the one hand, this is the extracellular domain, which mediates the interaction with an extracellular protein, the ligand, and the intracellular domain, which mediates interaction with cytoplasmic proteins. Since receptors are so-called transmembrane proteins, they also have another domain, the transmembrane domain. However, this does not mediate a protein-protein interaction but anchors the receptor in the lipid-containing plasma membrane. Receptors, like cytoplasmic proteins or transcription factors, can produce or transmit signals and can thus ultimately modulate gene expression from the previously described target genes by means of the signals they emit.
  • the inhibitor comprises a domain of the receptor, as defined in above.
  • the protein-binding domain of the receptors can be determined using various methods described in the prior art. These include e.g. the "yeast two-hybrid” method, immunoprecipitation methods and direct interaction measurements in vitro by affinity chromatography and the so-called surface plasmon resonance.
  • a method according to the invention is further preferred wherein the inhibitor comprises at least one amino acid exchange, one amino acid deletion or one
  • competitive inhibition can also be mediated by a molecular variant of a receptor in which the biological function is disturbed by the above-mentioned amino acid modification.
  • amino acid sequence of the inhibitor in the method according to the invention is, however, in spite of the presence of at least one of the previously explained ones
  • Amino acid modifications at least 70%, preferably 80%, more preferably 90% or most preferably 95%> identical to that of the previously defined receptor.
  • a method according to the invention is particularly preferred in which the amino acid exchange, the amino acid deletion or the amino acid insertion leads to the loss of the function of at least one domain of the receptor.
  • the invention also relates to a method for producing a medicament, which comprises the steps of the aforementioned method according to the invention and the further step of formulating the identified and / or obtained inhibitor in a pharmaceutically acceptable dosage form.
  • the term “medicament” defines substances and preparations made of substances which are intended to be used on or in the 20
  • medical auxiliaries can be added to the compounds identified with the processes according to the invention.
  • medical auxiliaries are substances which are used for the production (as active ingredients) of medicaments in a method according to the invention.
  • Pharmaceutical-technical adjuvants only serve the appropriate formulation of the drug and can even be removed afterwards, if they are only required during the process, or can be part of the drug as pharmaceutically acceptable carriers. Examples of pharmaceutically acceptable carriers are listed below.
  • the invention also relates to a medicament which optionally comprises a hair formation inhibitor which has been identified or obtained by one of the methods according to the invention, or a polynucleotide which codes for the inhibitor, in a pharmaceutically acceptable dosage form.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers include phosphate-buffered saline, water, emulsions such as oil / water emulsions, various types of detergents, sterile solutions, etc. Drugs comprising such carriers can be made by known conventional methods be formulated.
  • These drugs can be administered to an individual in a suitable dose, for example in a range from 1 ⁇ g to 100 mg per day and patient. Administration can take place in various ways, for example directly on the skin, intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, locally or intradermally. Nucleic acids can also be administered in the form of gene therapy.
  • the treating doctor determines the type of dosage according to the clinical factors. It is known to the person skilled in the art that the type of dosage depends on various factors, such as, for example, the size, the body surface, 21
  • the invention also relates to a medicament which optionally comprises a polypeptide comprising the DNA-binding domain but not the transactivator domains of Whn, LEF-1 or Hoxc13 or a polynucleotide coding for these polypeptides in a pharmaceutically acceptable dosage form.
  • the invention relates to the use of a polypeptide comprising the DNA binding domain but not the transactivator domains of Whn, LEF-1 or Hoxc13 or a polynucleotide coding for this polypeptide, an inhibitor which was identified and / or obtained by one of the methods according to the invention, or a polynucleotide encoding such an inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of hair growth disorders.
  • a use according to the invention is preferred here, the hair growth disorder being increased hair growth.
  • the invention relates to a kit for carrying out the methods according to the invention, the kit comprising a cell which comprises at least one factor which stimulates hair formation, a reporter gene, the reporter gene being operated on.
  • the expression control sequence of a target gene of the factor is linked and / or comprises a medium suitable for the detection of the reporter gene.
  • the components of the kit according to the invention can be in containers such as bottles and tubes, optionally in buffers and / or 22
  • Figure 1 Amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the protein used for the competitive inhibition of the Whn transcription factor.
  • 3 x 105 BHK cells are made with the plasmid DNAs listed below using those known in the art
  • Calcium phosphate transfection method transformed. 24 hours after the start of the transformation, the cells are washed and fresh growth medium is added. 48 hours after the start of the transformation, the cells are washed, residual medium is removed and the cells are harvested by adding TEN buffer (40 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA), centrifuged and finally in 250 ml 250 mM Tris-Cl, pH 7.4 resuspended. The cells are lysed by shock freezing three times to -80 ° C. and then thawing at 37 ° C. for 3 minutes each. The lysate is then centrifuged and the supernatant used to determine the activities of ⁇ -galactosidase and luciferase.
  • TEN buffer 40 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA
  • the ⁇ -galactosidase activity is determined by means of a method known in the prior art using the substrate ONPG.
  • the luciferase activity is determined by means of a method known in the prior art in the luminometer from Berthold.
  • Whn ut Expression vector for the DNA-binding domain of the Whn protein, provided with a nuclear localization signal
  • Sequence 1 shows the amino acid sequence of the protein encoded by the expression vector Whn mut .
  • Table 1 shows the results in the inhibition of Whn-induced gene activation by a truncated Whn protein.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Herstellung eines Inhibitors der Haarbildung. Ausserdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der Haarbildung. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels. Ausserdem betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, das einen Inhibitor der Haarbildung, der nach einem der erfindungsgemässen Verfahren identifiziert oder gewonnen wurde, oder ein Polynucleotid, das für den Inhibitor kodiert, optional in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfasst. Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, das ein die DNA-Bindungsdomäne jedoch nicht die Transaktivatordomäne von Whn, LEF-1 oder Hoxc13 umfassendes Polypeptid oder ein für diese Polypeptid kodierendes Polynucleotid optional in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfasst. Darüberhinaus betrifft die Erfindung die Verwendung eines die DNA-Bindungsdomäne jedoch nicht die Transaktivatordomäne von Whn, LEF-1 oder Hoxc13 umfassenden Polypeptid oder ein für dieses Polypeptid kodierendes Polynucleotid, eines inhibitors, der nach einem der erfindungsgemässen Verfahren identifiziert und/oder gewonnen wurde, oder eines Polynucleotides, das für einen solchen Inhibitor kodiert zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Haarwuchsstörungen. Nicht zu letzt betrifft die Erfindung einen Kit zur Durchführung der erfindungsgemässen Verfahren.

Description

Identifizierung und Verwendung von Inhibitoren der Haarbildung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Herstellung eines Inhibitors der Haarbildung. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der Haarbildung. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels. Außerdem betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, das einen Inhibitor der Haarbildung, der nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert oder gewonnen wurde, oder ein Polynucleotid, das für den Inhibitor kodiert, optional in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfaßt. Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, das ein die DNA- Bindungsdomäne jedoch nicht die Transaktivatordomane von Whn, LEF-1 oder Hoxc13 umfassendes Polypeptid oder ein für diese Polypeptid kodierendes Polynucleotid optional in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfaßt. Darüberhinaus betrifft die Erfindung die Verwendung eines die DNA- Bindungsdomäne jedoch nicht die Transaktivatordomane von Whn, LEF-1 oder Hoxc13 umfassenden Polypeptid oder ein für dieses Polypeptid kodierendes Polynucleotid, eines Inhibitors, der nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert und/oder gewonnen wurde, oder eines Polynucleotides, das für einen solchen Inhibitor kodiert zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Haarwuchsstörungen. Nicht zu letzt betrifft die Erfindung einen Kit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.
Zahlreiche Menschen, vor allem Frauen, leiden an dem Problem unerwünschten Haarwuchses. Dieser kann krankhaft bedingt sein, z.B. als Folge verschiedener hormoneller Störungen, als Folge des Alterungsprozesses auftreten oder auf Veranlagung beruhen. Die bekannteste, Form der Haarentfernung ist die Rasur, welche das Haar an der Hautoberfläche entfernt. Eine weitere Methode ist die Elektrokoagulation der Haarfollikel; dieses Verfahren ist aufwendig und oft von störender Narbenbildung begleitet. Andere Verfahren zielen auf eine durch bestimmte chemische Substanzen ausgelöste Haarstrukturauflösung hin, z.B. Eflornithin als Hemmer der Ornithindecarboxylase. Bislang gibt es kein Verfahren zur Depilation, das in die Bildung des Haares selbst eingreift.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist daher das zur Verfügungstellen von Mitteln und Maßnahmen zur Kontrolle der Haarbilung, insbesondere zur Hemmung derselben.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Herstellung eines Inhibitors der Haarbildung, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt
(a) In-Kontakt-Bringen einer Zelle, die zumindest einen die Haarbildung stimulierenden Faktor sowie ein Reportergen umfaßt, wobei das Reportergen operativ mit der Expressionskontrollsequenz eines Zielgens des Faktors verbunden ist, mit einem vermutlichen Inhibitor in einem zum Nachweis des Reportergens geeigneten Medium;
(b) Quantitative Bestimmung der Reportergen-Aktivierung in der Zelle;-
(c) Quantitative Bestimmung der Reportergen-Aktivierung in einer Zeile wie in (a) definiert, wobei die Zelle nicht mit einem vermutlichen Inhibitor in Kontakt gebracht wurde; und
(d) In-Bezug-Setzen der quantitativ bestimmten Reportergen-Aktivierung aus (b) und (c), wobei eine Verringerung oder ein Fehlen von nachweisbarer Reportergen-Aktivierung in (b) im Vergleich zu (c) ein Anzeichen für einen Inhibitor darstellt.
Der Begriff „Inhibitor" umfaßt sämtliche Stoffe oder Stoffgemische, die in der Lage sind die Haarbildung zu inhibieren. Bei diesen Stoffen oder Stoffgemischen kann es sich beispielsweise um Proteine, Nucleinsäuren, die für diese Proteine kodieren, oder Chemikalien handeln. Besonders wichtige potentielle Inhibitoren der Haarbildung sind Proteine, Domänen von Proteinen, Protein Varianten oder dafür kodierende Nucleinsäuren, die als bevorzugte Ausführungsformen nachstehend weiter definiert sind. Unter Inhibition ist im Sinne der Erfindung, eine signifikante Verringerung der Reportergenaktivierung in den erfindungsgemäßen Verfahren zu verstehen. Die Signifikanz kann hierbei mit im Stand der Technik bekannten statistischen Methoden, wie z.B. den student's T-test, den γ2-test oder den U-test nach Mann-Whitney, erfolgen. Anwendbarkeitskriterien für die statistischen Methoden im Einzelfall sind dem Fachmann bekannt. Mehr noch, Anpassungen der statistischen Methoden können vom Fachmann mit üblichem Aufwand erbracht werden, bevorzugterweise führt das Inkontaktbringen von Zellen mit dem potentiellen Inhibitor zumindest zu einer Inhibierung der Reportergenaktivierung wie sie im Beispiel und Tabelle 1 beschrieben ist.
Der Begriff „In-Kontakt-Bringen" umfaßt sämtliche Arten der physikalischen oder chemischen Interaktionen zwischen den Inhibitor Molekülen und der Zelle bzw. den zellulären Bestandteilen. Zum In-Kontakt-Bringen kann der Inhibitor in einer Flüssigkeit, z.B. einem Nährmedium für die Zelle, in Lösung vorliegen, wobei dieses Nährmedium dann mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, z.B. durch Inkubation der Zelle in diesem Medium. Statt einer Flüssigkeit können auch Gele und Gel-artige Flüssigkeiten, die den Inhibitor umfassen, verwendet werden. Der Begriff des „In- Kontakt-Bringen" umfaßt jedoch auch das Einbringen des Inhibitors in die Zelle, so daß dieser dort mit intrazellulären Komponenten, wie den zellulären Proteinen, interagieren kann. Das Einbringen des Inhibitors kann abhängig von dessen biochemischer Natur durch verschiedene im Stand der Technik bekannte Methoden geschehen. Es versteht sich hierbei von selbst, daß die Methoden zum Einbringen von Nucleinsäuren von denen zum Einbringen von Proteinen oder Chemikalien unterschiedlich sein können. Beispiele für solche Methoden, die für das Einbringen von Nucleinsäuren geeignet sind, sind Präzipitations-Transfektion, wie z.B. Ca- Phosphat oder RbCI Präzipitations-Transfektion, Transfektion mittels Liposomen, Transfektion mittels makromolekularer Polymere, z.B. Fullerenen, Elektroporations- Methoden oder Transfektion durch Retrovieren oder Rekombinantionstechniken zur Integration in das zelluläre Genom. Je nach Methode ist es möglich, daß die Nucleinsäuren mit anderen Nucleinsäuremolekülen verknüpft werden müssen. Beispiele hierfür sind Plasmide, die die Nucleinsäuremoleküle enthalten oder retrovirale Genome, in die die Nucleinsäuren integriert wurde. Nucleinsäuremoleküle können nach dem Einbringen in die Zelle auch in das zelluläre Genom integriert werden.
Beispiele für Methoden zum Einbringen von Proteinen umfassen ebenfalls das Einbringen mittels Liposomen, das Einbringen mittels makromolekularer Polymere, wie z.B. Fullerenen. Manche Proteine werden jedoch auch aktiv von der Zelle durch Import aufgenommen. Es ist in diesem Zusammenhang auch möglich Proteine, die normalerweise nicht aufgenommen würden, mit zusätzlichen Peptidsequenzen zu verknüpfen, die den Import dieser Proteine vermitteln können. Chemikalien werden je nach ihren chemischen und biochemischen Eigenschaften entweder aktiv von der Zelle importiert und somit in die Zelle eingebracht oder gelangen per Diffusion in die Zelle. Darüber hinaus können Chemikalien auch durch verschiedene im Stand der Technik bekannte Methoden in die Zelle eingebracht werden. Diese Methoden umfassen Liposomen, makromolekulare Polymere.
Unter dem Begriff „Haarbildung" ist der gesamte biologische Prozeß zu verstehen, der zur morphologischen Bildung des Haares führt. Der Begriff umfaßt ferner verschiedene bei der Haarbildung relevante Schritte einzeln. Hierzu zählt die Bildung von Vorläuferzellen der Keratinozyten und mesenchymalen Zellen, die bei der Haarbildung eine Rolle spielen, deren Differenzierung zu reifen Keratinozyten, deren Interaktion und die eigentliche morphologische Bildung des Haares. Ebenso zählt auch die Bildung von sogenannten Stammzellen zu dem biologischen Prozeß, der der Haarbildung im Sinne der Erfindung zugrunde liegt. Neben der neuen Bildung von Haaren umfaßt der Begriff "Haarbildung" auch das Wachstum des bestehenden Haares und die hierbei zugrundeliegenden physiologischen Prozesse.
Unter dem Begriff „Faktor" sind im Fall der vorliegenden Erfindung Proteine zu verstehen, die an der Regulation der Haarbildung, also einer oder mehrerer Schritte des oben ausgeführten biologischen Prozesses, beteiligt sind. Solche Proteine umfassen Proteine die die Transkription, Translation und/oder post-translationale Modifikation von Proteine bzw. der dafür kodierenden Gene regulieren, die direkt an der Bildung des Haares beteiligt sind. Unter Proteinen, die direkt an der Bildung des Haares beteiligt sind, sind Proteine wie beispielsweise die Haar-Keratine zu verstehen, die für die molekulare Struktur des Haares oder den molekularen Phänotyp der an der Bildung des Haares beteiligten Zellen verantwortlich sind. Beispiele für Proteine, die die Transkription der Gene für Proteine regulieren, die an der Bildung des Haares beteiligt sind, sind Transkriptionsfaktoren die die Haar- Keratin Genexpression aktivieren oder verstärken. Ebenso sind auch Proteine von dem Begriff „Faktor" umfaßt, die in der Lage sind die Aktivität oder Genexpression der regulatorisch wirkenden Proteine zu modulieren. Hierzu zählen sowohl Proteine, die die Aktivität der zuvor genannten regulatorischen Proteine aktivieren oder verstärken als auch deren Genexpression aktivieren oder verstärken. Da zu den regulatorischen Proteinen auch solche zählen, die die Proteine die direkt an der Bildung des Haares beteiligt sind, inhibieren oder in deren Aktivität schwächen, umfaßt der Begriff „Faktor" auch Proteine, die die Aktivität von inhibititorisch wirkenden regulatorischen Proteinen inhibieren oder schwächen und somit die Haarbildung letztlich stimulieren. Regulatorisch wirkende Proteine können in verschiedene Klassen eingeteilt werden, hierzu zählen extrazelluläre Proteine, deren zelluläre Rezeptoren, intrazelluläre Signalüberträger sowie Proteine, die die Aktivität der Signalüberträger modifizieren, und Transkriptionsfaktoren und deren Ko-Faktoren, die die Expression der direkt an der Bildung des Haares beteiligten Proteine regulieren und durch die zuvor genannten Proteine reguliert werden. In vielen Fällen sind die Mitglieder dieser Klassen in sogenannten Signalübertragungskaskaden hintereinander geschaltet. Diese
Signalübertragungskaskaden dienen insbesondere dazu, ein durch eine extrazelulläres Protein vermitteltes Signal intrazellulär zu interpretieren, so daß die Zeile darauf in Form von geänderter Genexpression reagieren kann. Die Vermittlung solcher extrazellulären Signale durch Signalübertragungskaskaden bestehend aus zuvor genannten Proteinen bildet die Grundlage der interzellulären Kommunikation, die während der Haarbildung von essentieller Bedeutung ist. Strukturell ist diesen von dem Begriff „Faktor" umfaßten Proteinen gemein, daß sie einen modulären Aufbau aufweisen. Dieser Aufbau, ergibt sich aus der Funktion dieser Proteine, die entweder mit verschiedenen Proteinen oder, im Fall der Transkriptionsfaktoren, mit anderen Proteinen und den cis-regulatorischen DNA- Sequenzen physikalisch interagieren müssen. Unter einem modulären verstehen, daß die erfindungsgemäßen Faktoren mehrere Domänen entweder innerhalb eines einzigen Proteins oder innerhalb eines aus Nucleinsäuremoleküle können nach dem Einbringen in die Zelle auch in das zelluläre Genom integriert werden.
Beispiele für Methoden zum Einbringen von Proteinen umfassen ebenfalls das Einbringen mittels Liposomen, das Einbringen mittels makromolekularer Polymere, wie z.B. Fullerenen. Manche Proteine werden jedoch auch aktiv von der Zelle durch Import aufgenommen. Es ist in diesem Zusammenhang auch möglich Proteine, die normalerweise nicht aufgenommen würden, mit zusätzlichen Peptidsequenzen zu verknüpfen, die den Import dieser Proteine vermitteln können. Chemikalien werden je nach ihren chemischen und biochemischen Eigenschaften entweder aktiv von der Zelle importiert und somit in die Zelle eingebracht oder gelangen per Diffusion in die Zelle. Darüber hinaus können Chemikalien auch durch verschiedene im Stand der Technik bekannte Methoden in die Zelle eingebracht werden. Diese Methoden umfassen Liposomen, makromolekulare Polymere.
Unter dem Begriff „Haarbildung" ist der gesamte biologische Prozeß zu verstehen, der zur morphologischen Bildung des Haares führt. Der Begriff umfaßt ferner verschiedene bei der Haarbildung relevante Schritte einzeln. Hierzu zählt die Bildung von Vorläuferzellen der Keratinozyten und mesenchymalen Zellen, die bei der Haarbildung eine Rolle spielen, deren Differenzierung zu reifen Keratinozyten, deren Interaktion und die eigentliche morphologische Bildung des Haares. Ebenso zählt auch die Bildung von sogenannten Stammzellen zu dem biologischen Prozeß, der der Haarbildung im Sinne der Erfindung zugrunde liegt. Neben der neuen Bildung von Haaren umfaßt der Begriff "Haarbildung" auch das Wachstum des bestehenden Haares und die hierbei zugrundeliegenden physiologischen Prozesse.
Unter dem Begriff „Faktor" sind im Fall der vorliegenden Erfindung Proteine zu verstehen, die an der Regulation der Haarbildung, also einer oder mehrerer Schritte des oben ausgeführten biologischen Prozesses, beteiligt sind. Solche Proteine umfassen Proteine die die Transkription, Translation und/oder post-translationale Modifikation von Proteine bzw. der dafür kodierenden Gene regulieren, die direkt an der Bildung des Haares beteiligt sind. Unter Proteinen, die direkt an der Bildung des Haares beteiligt sind, sind Proteine wie beispielsweise die Haar-Keratine zu verstehen, die für die molekulare Struktur des Haares oder den molekularen Phänotyp der an der Bildung des Haares beteiligten Zellen verantwortlich sind. Beispiele für Proteine, die die Transkription der Gene für Proteine regulieren, die an der Bildung des Haares beteiligt sind, sind Transkriptionsfaktoren die die Haar- Keratin Genexpression aktivieren oder verstärken. Ebenso sind auch Proteine von dem Begriff „Faktor" umfaßt, die in der Lage sind die Aktivität oder Genexpression der regulatorisch wirkenden Proteine zu modulieren. Hierzu zählen sowohl Proteine, die die Aktivität der zuvor genannten regulatorischen Proteine aktivieren oder verstärken als auch deren Genexpression aktivieren oder verstärken. Da zu den regulatorischen Proteinen auch solche zählen, die die Proteine die direkt an der Bildung des Haares beteiligt sind, inhibieren oder in deren Aktivität schwächen, umfaßt der Begriff „Faktor" auch Proteine, die die Aktivität von inhibititorisch wirkenden regulatorischen Proteinen inhibieren oder schwächen und somit die Haarbildung letztlich stimulieren. Regulatorisch wirkende Proteine können in verschiedene Klassen eingeteilt werden, hierzu zählen extrazelluläre Proteine, deren zelluläre Rezeptoren, intrazelluläre Signalüberträger sowie Proteine, die die Aktivität der Signalüberträger modifizieren, und Transkriptionsfaktoren und deren Ko-Faktoren, die die Expression der direkt an der Bildung des Haares beteiligten Proteine regulieren und durch die zuvor genannten Proteine reguliert werden. In vielen Fällen sind die Mitglieder dieser Klassen in sogenannten Signalübertragungskaskaden hintereinander geschaltet. Diese
Signalübertragungskaskaden dienen insbesondere dazu, ein durch eine extrazelulläres Protein vermitteltes Signal intrazellulär zu interpretieren, so daß die Zelle darauf in Form von geänderter Genexpression reagieren kann. Die Vermittlung solcher extrazellulären Signale durch Signalübertragungskaskaden bestehend aus zuvor genannten Proteinen bildet die Grundlage der interzellulären Kommunikation, die während der Haarbildung von essentieller Bedeutung ist. Strukturell ist diesen von dem Begriff „Faktor" umfaßten Proteinen gemein, daß sie einen modulären Aufbau aufweisen. Dieser Aufbau, ergibt sich aus der Funktion dieser Proteine, die entweder mit verschiedenen Proteinen oder, im Fall der Transkriptionsfaktoren, mit anderen Proteinen und den cis-regulatorischen DNA- Sequenzen physikalisch interagieren müssen. Unter einem modulären Aufbau ist zu verstehen, daß die erfindungsgemäßen Faktoren mehrere Domänen aufweisen, die entweder innerhalb eines einzigen Proteins oder innerhalb eines aus verschiedenen 6
Untereinheiten aufgebauten Proteins liegen. Diese Domänen sind definierte Aminosäure-Sequenzabschnitte, die eine bestimmte Tertiärstruktur des im Bereich dieser Domäne ausbilden. Diesen Domänen kann dann wiederum eine ganz bestimmte biologische Funktion, wie. z.B. die Erkennung eines bestimmten cis- regulatorischen DNA Elementes oder die spezifische Aktivierung oder Inhibierung eines weiteren Proteins durch physikalische Interaktion zugeordnet werden. Die Faktoren müssen erfindungsgemäß mehrere Domänen umfassen, um ihre biologische Funktion erfüllen zu können.
Die Faktoren können erfindungsgemäß wie auch für das In-Kontakt-Bringen mit den Inhibitoren bereits beschrieben durch verschiedene im Stand der Technik beschriebene Verfahren entweder als Nucleinsäuren oder Proteine in die Zelle eingebracht werden. Die Faktoren können erfindungsgemäß jedoch auch bereits endogen in der Zelle vorliegen. In manchen Fällen könnte es jedoch trotzdem nötig sein, die Konzentration der Faktoren bzw. des Faktors durch exogene Zugabe zu erhöhen. In jedem Fall sollte der Faktor in der Zelle in einer Konzentration und/oder Konformation vorliegen, die die von der Expressionskontrollsequenz vermittelten Aktivierung des Reportergens erlaubt.
Der Begriff „Reportergen" umfaßt Gene, die aufgrund ihrer biochemischen oder physicochemischen Eigenschaften direkt oder durch geeignete Vorrichtungen oder Verfahren leicht nachweisbar sind. Besonders geeignete Reportergene sind nachfolgend als bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.
Der Begriff „Expressionskontrollsequenz" umfaßt jedes der cis-regulatorischen Elemente die für die Expression eines Gens benötigt werden. Unter cis- regulatorischen Elementen versteht man DNA Sequenzen mit regulatorischen Eigenschaften. Hierzu zählen Promotor-, Enhancer- und Silencer-Elemente. Promotor-Elemente vermitteln die basale Expression eines Gens wohingegen Enhancer-Elemente eine Verstärkung der Expression, Silencer-Elemente eine Reduktion oder Inhibition der Expression bewirken. Die Promoter-, Enhancer- und Silencer-Elemente interagieren physikalisch mit regulatorischen Proteinen, den Transkriptionsfaktoren. Transkriptionsfaktoren können die Genexpression auf 7
unterschiedliche Weise beinflußen. Einige Transkriptionsfaktoren, die sogenannten basalen Transkriptionsfaktoren, binden an DNA-Elemente wie die TATA Box oder andere sogenannte "Initiator" Elemente bzw. an dazu benachbarte Sequenzabschnitte. Die basalen Transkriptionsfaktoren bilden einen Komplex, der letztlich auch die RNA Polymerase rekrutiert, ein DNA-abhängiges RNA synthetisierendes Enzym, das die eigentliche Transkription vermittelt. Transkriptionsfaktoren, die an Enhancer-Elemente binden sorgen für die schnelle Bildung eines stabilen Komplexes der basalen Transkriptionsfaktoren, indem sie diese beispielsweise direkt oder indirekt über weitere Proteine, die sogenannten Ko- Faktoren rekrutieren und den so initiierten Komplex stabilisieren. Transkriptionsfaktoren, die an Silencer-Elemente binden interferieren dagegen in negativer Weise mit der Bildung eines Komplexes der basalen Transkriptionsfaktoren. Eine Reihe von Transkriptionsfaktoren verändert jedoch lediglich die Struktur der DNA und bringt dadurch normalerweise weit entfernte cis- regulatorische Sequenzen in Nähe zueinander, so daß darin bindende Transkriptionsfaktoren miteinander physikalisch interagieren können. Verständlicherweise können solche cis-regulatorischen Elemente bzw. die daran bindenden Transkriptionsfaktoren auch die Genexpression als Enhancer- oder Silencer-Elemente beeinflussen. Für die gewebsspezifische Expression eines Gens sind einerseits das Vorhandensein und die Architektur von Enhancer- und Silencer- Elemente in einem Gen-Locus, andererseits die gewebsspezifische Expression der an diese cis-regulatorischen Elemente bindenden Transkriptionsfaktoren verantwortlich.
Unter dem Begriff „Expressionskontrollsequenz" im Sinne der Erfindung ist eine DNA Sequenz zu verstehen, die verschiedene der zuvor beschriebenen cis- regulatorischen Elemente umfaßt, die ausreichend sind, die Expression des mit dieser Expressionskontrollsequenz verbundenen Reportergens zu vermitteln und die normalerweise in vivo an der Vermittlung der Gewebsspezifität der Genexpression beteiligt sind.
Der Begriff „Zielgen" umfaßt solche Gene, die durch die erfindungsgemäßen Faktoren entweder direkt oder indirekt reguliert werden. Bei Faktoren, die ein Zielgen erfindungsgemäß direkt regulieren, handelt es sich um die bereits zuvor 8
genannten Transkriptionsfaktoren, wohingegen Proteine aus einer regulatorischen Signalübertragungskaskade, wie zuvor beschrieben, ein Zielgen indirekt regulieren. Bei den Zielgenen handelt es sich um Gene, die Proteine kodieren, die entweder direkt für die morphologische Bildung des Haares notwendig sind oder charakteristisch für den molekularen Phänotyp eines für die Haarbildung essentiellen Zelltyps sind.
Unter dem Begriff „Quantitative Bestimmung" ist die Bestimmung der gesamten Reportergen-Aktivierung oder eines mengenmäßig aussagekräftigen, nachweisbaren Teils hiervon zu verstehen. Die Bestimmung der Reportergen- Aktivität kann entweder durch quantitative Nachweis der Transkripte des Reportergens erfolgen oder durch quantitativen Nachweis des Proteins, das von dem Reportergen kodiert wird. Geeignete Methoden, die zum quantitativen Nachweis der Transkripte des Reportergens geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt. Hierzu zählen neben anderen, Affinitätschromatographie- Methoden, Massenspektroskopische-Methoden, Nucleinsäure- Hybridisierungsmethoden, wie z.B. Northern Analysen oder RNase Schutzexperimente, „nuclear run-on" Experimente, PCR Methoden die zum Quantifizieren geeignet sind, wie z.B. normalisierte PCR, „light-cycling" PCR. Geeignete Methoden zum Nachweis des vom Reportergen kodierten Proteins umfassen im Stand der Technik bekannte Methoden, z.B. auf spezifischen Antikörpern basierende Nachweismethoden, wie Western Analysen, ELISA- oder RIA-Tests, aber auch Methoden, bei denen das Protein durch Nachweis seiner biochemischen Eigenschaften nachgewiesen wird. Solche Methoden können wie in den Beispielen beschrieben durchgeführt werden. Hier können beispielsweise enzymatische Aktivitäten oder Chemoluminiszenz, Bioluminiszenz oder Fluoreszenz nachgewiesen werden. Für die erfindungsgemäße quantitative Bestimmung werden bevorzugt Vorrichtungen eingesetzt, die die quantitative Auswertung des beim Nachweis produzierten Signals, z.B. die Emission von Photonen bei der Chemoluminiszenz oder der Bioluminiszenz, erlauben. Solche Vorrichtungen sowie ihre jeweiligen Einsatzbereiche sind im Stand der Technik bekannt. Je nach verwendeter Nachweismethode kann eine vorherige Behandlung der Zellen notwendig sein. Eine solche Behandlung könnte beispielsweise der Extraktion der Reportergen Transkripte oder der Proteine aus der Zelle dienen. Solche Behandlungsmethoden sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory (1989), N.Y. ausführlich beschrieben.
Zur effizienten Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren mag es notwendig sein, daß der Fachmann die im Stand der Technik beschriebenen Nachweis- und Behandlungsmethoden, auf die sich vorstehend bezogen wird, an die Gegebenheiten der erfindungsgemäßen Verfahren anpassen muß. Solche Anpassungen können jedoch von dem Fachmann auf dem hier relevanten Fachgebiet mit üblichen Aufwand erbracht werden.
Unter dem Begriff „In-Bezug-Setzen" ist zu verstehen, daß ein relatives Maß für die Reportergen-Aktivierung ermittelt wird. Hierzu wird die Reportergen-Aktivierung, die nach Durchführung der oben aufgeführten Schritte (a) und (b) bestimmt wurde, verglichen mit der Reportergen-Aktivierung nach in einer Zelle, die, wie in Schritt (c) beschrieben, nicht mit dem vermutlichen Inhibitor in Kontakt gebracht wurde. Eine reduzierte oder gar fehlende Reportergen-Aktivierung gegenüber der nicht mit dem Inhibitor in Kontakt gebrachten Zelle aus Schritt (c) ist ein Anzeichen dafür, daß es sich bei dem getesteten vermutlichen Inhibitor tatsächlich um einen Inhibitor der Haarbildung handelt. Die Reduktion der Reportergenaktivierung muß bei einem Inhibitor im Sinne der Erfindung hierbei, wie zuvor bereits beschrieben, signifikant sein. Bevorzugterweise kann die das in Bezug Setzen umfassende Auswertung der quantitativ bestimmten. Reportergen-Aktivierung auch durch hierfür geeignete Vorrichtungen zur elektronischen Datenverarbeitung, wie z.B. Computer, unterstützt werden. Somit kann eine Vielzahl von vermutlichen Inhibitoren nacheinander oder parallel analysiert werden und die gewonnen Datensätze effektiv ausgewertet werden.
it Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich geeignete Mittel wie die zuvor beschriebene Inhibitoren zu identifizieren und somit die Kontrolle der Haarbildung zu beeinflußen. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß hierdurch je nach Wahl des Zielgens bestimmte Schritte des Prozesses der 10
Haarbildung gezielt untersucht und durch die gefundenen Inhibitoren manipuliert werden könnten. Die so gewonnen Erkenntnisse erlauben die Entwicklung effektiver Therapien von Haarwuchsstörungen und finden ein breites prophylaktisches und medizinisches Einsatzgebiet.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: ß-galactosidase, Luziferase, Renilla Luziferase, Grün-fluoreszierendes Protein (GFP), Blau-fluoreszierendes Protein (BFP), Gelb-fluoreszierendes Protein (YFP), Chloramphenicol Transferase.
Die zuvor genannten Reportergene eigenen sich alle hervorragend zur quantitativen Bestimmung mittels der Aktivität der von ihnen kodierten Proteine obwohl es selbstverständlich auch möglich ist die RNA Transkripte nachzuweisen, ß- galactosidase, Luziferase, Renilla Luziferase und Chloramphenicol Transferase kodieren hierbei Enzyme, deren Aktivität anhand des umgesetzten Substrates effizient bestimmt werden kann. Diese quantitative Bestimmung kann mittels im Stand der Technik bekannter Methoden oder wie in den Beispielen beschrieben erfolgen. Der quantitative Nachweis von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP), Blau-fluoreszierendem Protein (BFP) und Gelb-fluoreszϊerendem Protein (YFP) kann basierend auf den bioluminiszierenden Eigenschaften dieser Proteine erfolgen.
Darüber hinaus ist ein erfindungsgemäßes Verfahren bevorzugt wobei das Zielgen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehen aus:
Keratin, Haarkeratingene des Menschen: hHal , hHa2, hHa3-l, hHa3-ll, hHa4, hHa5, hHaθ, hHa7, hHa8; hHbl , hHb2, hHb3, hHb4, hHb5, hHb6.
Die hier genannten Haar-Keratin Gene eignen sich, in besonderem Maße für die erfindungsgemäßen Verfahren, da sie während der Haarbildung spezifisch exprimiert werden und die von ihnen kodierten Proteine essentielle morphologische Bausteine des Haares darstellen. Inhibitoren, die in der Lage sind mit der Genexpression dieser Keratine zu interferieren sind somit auch dazu geeignet die Produktion der essentiellen Keratinproteine zu unterbinden. Folglich wird die 11
morphologische Bildung des Haares effizient gehemmt. Die Expressionskontrollsequenzen, die die Gewebsspezifität und die Effizienz der Transkription vermitteln wurden bei verschiedenen Haar-Keratingene bereits charakterisiert, so daß diese cis-regulatorischen Elemente im Stand der Technik bekannt und erhältlich sind (Schlake, Fokhead/Winged-Helix Transcription Factor Whn Regulates Hair Keratin Gene Expression: Molecular Analysis of the Nude Skin Phenotype", Developmental Dynamics 217 (2000), 368-376; Dünn et al. Regulation of a hair follicle keratin intermediate filament gene promoter. J. Cell Sei. 111 , 3487- 3496 (1998)). Ebenso wie die relevanten cis-regulatorischen Elemente der Keratingene sind daran bindende Transkriptionsfaktoren im Stand der Technik bekannt. Ein Beispiel eines solchen regulatorischen Transkriptionsfaktors ist Whn. Bevorzugterweise bindet Whn an eine 10 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz, die das tetra-Nucleotid 5'-ACGC-3' umfaßt. Noch stärker bevorzugt bindet Whn an eine die Nucleotide 5'-agtaagACGC'cata-3' (SEQ ID NO: 1 ) umfassende Sequenz. Die herausragende Rolle, die dieser Transkriptionsfaktor bei der Haarbildung spielt wird auch ersichtlich durch seinen Funktionsverlust in Mäusen, die den „nude" Phänotyp aufweisen, den sogenannten Nacktmäusen. Ein Charakteristikum dieser Nacktmäuse ist, daß sie keinerlei Körperbehaarung ausbilden, also der Prozeß der Haarbildung effizient gehemmt ist.
Ebenso bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei das Reportergen in die Zelle eingeführt wird.
Unter dem Begriff „eingeführt" ist zu verstehen, daß die Expressionskontrollsequenz, die operativ mit einem Reportergen verbunden ist wie auch für das In-Kontakt-Bringen bereits zuvor diskutiert durch verschiedene im Stand der Technik beschriebene Verfahren entweder als Nucleinsäuren in die Zelle eingebracht wird oder eingebracht wurde. Hierbei kann das mit der Expressionskontrollsequenz operativ verbundene Reportergen auch stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Darüber hinaus kann das Reportergen durch Rekombinationstechniken mit der endogenen Expressionskontrollsequenz eines Zielgens verbunden werden. Ein solches Reportergen würde so in den Locus des Zielgens integriert werden, daß die cis-regulatorischen Elemente des Zielgens weiterhin in der Lage sind, die Genexpression zu regulieren aber statt des 12
eigentlichen Zielgens, das Reportergen transkribieren. Vorteil einer solchen Zelle mit stabil integriertem Reportergen unter der Kontrolle einer geeigneten Expressionskontrollsequenz wäre, daß der Schritt des Einbringens des mit der Expressionskontrollsequenz verbundenen Reportergens, der bei der Durchführung des Verfahrens ansonsten nötig ist, wegfallen würde. Das Wegfallen dieses Schrittes würde damit in Verbindung stehende Normalisierungsmethoden, die möglicherweise angewendet werden müssen um die Effizienz des Einbringens zu gewährleisten, überflüssig machen. Trotzdem können die erfindungsgemäßen Verfahren auch mittels bei jedem Verfahrensdurchlauf einzeln durchgeführten Einbringens eines mit der Expressionskontrollsequenz verbundenen Reportergens durchgeführt werden. Wie bereits ausgeführt könnte es hierbei jedoch notwendig sein geeignete und im Stand der Technik bekannte Methoden zur Normalisierung durchzuführen um zwei unterschiedlich behandelte Zellpopulationen miteinander aussagekräftig zu vergleichen.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der Haarbildung, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen eines Inhibitors der Haarbildung mit einer Zelle umfaßt, wobei die Zelle einen die Haarbildung stimulierenden Faktor umfaßt, der mit dem Inhibitor interagieren kann.
Die Definitionen der Begriffe aus den zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen
Verfahren finden ihre Anwendung mutatis mutandis auf die nachfolgend beschriebene Verfahren.
Der Begriff „Inhibierung der Haarbildung" umfaßt, die Inhibierung von einzelnen
Schritte des zuvor definierten biologischen Prozeß der Haarbildung als auch den gesamten Prozeß. Als Folge dieser Inhibition kann es zu einem vollständigen
Verlust der de novo Haarbildung kommen oder zur Hemmung oder Verlangsamung der Bildung von Haaren.
Unter dem Begriff „interagieren" ist zu verstehen, daß der Inhibitor des die
Haarbildung stimulierenden Faktors mit diesem physikalisch interagiert. Dadurch wird der Faktor in seiner Aktivität gehemmt und es kommt zur Inhibition der
Haarbildung.
Das hier geschilderte erfindungsgemäße Verfahren kann in geeigneten in vitro
Modellen, wie beispielsweise Zeil- oder Organkulturen der Haut oder aber in vivo in 13
Tiermodellen durchgeführt werden. Bei erfindungsgemäßen Verfahren, die an Organkulturen der Haut oder in vivo am Tiermodell durchgeführt werden, ist ein dem von Nackmäusen vergleichbarer Phänotyp ein bevorzugtes Resultat der Inhibierung der Haarbildung. Das Verfahren kann auch zur Therapie von Haarwuchsstörungen eingesetzt werden wie in den Ausführungsformen, die Verwendungen betreffen, ausgeführt.
Bevorzugterweise ist die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Zelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Heia, COS-1 , COS-7, CHO, epitheliale Zellinien, primäre Keratinozyten, oder
Zellinien die aus Keratinozyten abgeleitet wurden.
Diese Zellen oder Zellinien sind besonders zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet, da diese Zellen bereits endogene
Faktoren, die die Haarbildung stimulieren umfassen oder aber besonders zum
Einbringen exogener Faktoren, z.B. durch Transfektion geeignet sind. Von diesen
Zellen ist bekannt, daß sie sich effizient transfizieren lassen, so daß jeweils ein
Großteil der Zellen die erwünschten Eigenschaften erhält.
Bevorzugt ist ebenfalls ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der Faktor von einem Polynucleotid kodiert wird, das in die Zelle eingeführt wird. Der Bergiff „eingeführt" wurde bereits vorstehend näher definiert. Wie bereits zuvor beschrieben könnte es notwendig sein den Faktor exogen in die Zelle einzubringen. Besonders geeignet ist hierbei das Einbringen eines für den Faktor kodierenden Polnucleotids, welches vorzugsweise in Form eines Expressionskonstruktes in die Zelle eingebracht wird. Dieses Expressionskonstrukt umfaßt neben dem Polynucleotid Expressionskontrollsequenzen, die die Expression des Faktors in der Zelle gestatten. Die Begriffe "Polynucleotid" und "Nucleinsäure" betreffen erfindungsgemäß dieselben Gegentstände und können daher ausgetauscht werden.
Aus den zuvor gemachten Ausführungen ergibt sich auch, daß ein erfindungsgemäßes Verfahren bevorzugt ist, wobei der Inhibitor von einem Polynucleotid kodiert wird, das in die Zelle eingeführt wird.. 14
Ebenfalls bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der die Haarbildung stimulierende Faktor ein Transkriptionsfaktor ist. Aus den zuvor gemachten Ausführungen ergibt sich, daß Transkriptionsfaktoren, die die Haarbildung stimulieren besonders zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, da sie direkt die Expression der für die morphologische Bildung des Haares relevanten Gene, wie z.B. den Haar-Keratinen steuern. Des weiteren wurde bereits ausgeführt, daß die Faktoren erfindungsgemäß modulär aufgebaute Proteine sind. Transkriptionsfaktoren umfassen zumindest eine DNA- bindende Domäne und eine Domäne, die Protein Interaktion vermittelt und haben somit einen modulären Aufbau.
In diesem Zusammenhang ist ein erfindungsgemäßes Verfahren besonders bevorzugt wobei der Transkriptionsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Whn, Hairless, LEF-1 und Hoxc13. Für diese Transkriptionsfaktoren konnte bereits gezeigt werden, daß sie eine Rolle bei der Haarbildung als diese stimulierende Transkriptionsfaktoren spielen. Weiterhin weisen die hier genannten Transkriptionsfaktoren einen modulären Aufbau vor, bestehend aus zumindest einer DNA-bindenden Domäne und einer Domäne, die Interaktion mit weiteren Faktoren des Transkriptionskomplexes vermittelt. Darüber hinaus ist für LEF-1 bekannt, daß es zusätzlich mit zytoplasmatischen Regulatorproteinen und/oder Ko-Faktoren interagieren kann.
Die Aminosäuresequenz für die oben genannten Transkriptionsfaktoren sind unter den Genbank Eingangsnummern Whn: Human Y11739, Lef 1 : Human AF288571 , Hoxc13: Human XM006804 hinterlegt.
Ebenfalls bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der Inhibitor eine Domäne des Transkriptionsfaktors, wie zuvor definiert, umfaßt. Ein Protein, das lediglich eine Domäne des Transkriptionsfaktors umfaßt hat auch nur noch die von dieser Domäne vermittelten biologischen Eigenschaften. Einem solchen Protein fehlen die Eigenschaften, die von den anderen Domänen des modulär aufgebauten Transkriptionsfaktors vermittelt werden und für dessen biologische Funktion insgesamt essentiell sind. Bei den modulär aufgebauten Transkriptionsfaktoren gibt es zumindest eine Domäne, die Interaktionen mit 15
anderen Proteinen vermittelt und eine Domäne, die die Interaktion mit den cis- regulatorischen DNA Elementen vermittelt. Ein lediglich eine Domäne umfassendes Protein kann daher entweder mit den weiteren Proteinen oder mit dem cis- regulatorischen Element interagieren, jedoch nicht mit beiden. Somit kompetitiert ein solches Protein mit dem Transkriptionsfaktor um die Interaktion mit entweder DNA oder anderen Proteinen. Andere Proteine oder cis-regulatorische Elemente, die das die Domäne umfassende Protein gebunden haben können jedoch nicht mehr mit dem Transkriptionsfaktor interagieren. Da das die einzelne Domäne umfassende Protein jedoch nicht die biologische Aktivität des gesamten Transkriptionsfaktors besitzt, wird das molekulare Zusammenspiel bei der Genregulation durch dieses Protein unterbrochen. Somit kann das beschriebene Protein durch Kompetition und Blockierung von Bindungsstellen an entweder anderen Proteinen oder cis- regulatorischen DNA Elementen als Inhibitor wirken.
Aus dem zuvor Gesagten ergibt sich daß, in einer besonders bevorzugter Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Domäne eine Protein- DNA- oder Protein-Protein-Interaktion vermittelt.
Eine DNA-bindende Domäne umfaßt in einer bevorzugten Ausführungsform die Aminosäuren 254 bis 372 des Whn Proteins, während eine Protein-Protein- Interaktion vermittelnde Domäne, die Transaktivator Domäne von Whn, umfassend die Aminosäure 474 bis 648, darstellt. Weitere geeignete Deletionsvarianten von Whn, die lediglich eine Domäne umfassen sind im Stand der Technik bekannt- und bei Schorpp, "Genetically Separable Determinants of Hair Keratin Gene Expression" Developmental Dynamics 218 (2000), 537-543 diskutiert. Ebenso sind in dieser Veröffentlichung geeignete Methoden beschrieben, die es dem Fachmann erlauben, die von einer DNA-bindenden Domäne oder von einer Transaktivatordomane umfaßten Aminosäuren zu bestimmen. Diese Bestimmung der Domäne kann auch durch andere im Stand der Technik bekannte Methoden geschehen, wie z.B. mit der "yeast one-hybrid" Methode oder verwandte Verfahren.
Außerdem bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der Inhibitor zumindest einen Aminosäureaustausch, eine Aminosäuredeletion oder eine 16
Aminosäureinsertion gegenüber dem zuvor definierten Transkriptionsfaktor aufweist.
Ebenso wie Proteine, die lediglich eine funktioneile Domäne eines Transkriptionsfaktors umfassen, können auch molekulare Varianten, die sich von dem Transkriptionsfaktor durch Aminosäureaustausch, Aminosäuredeletion oder eine Aminosäureinsertion unterscheiden als kompetitive Inhibitoren wirken. Bei solchen molekularen Varianten führt die jeweilige Aminosäuremodifikation in einer der Domänen des modulär aufgebauten Transkriptionsfaktors zum Verlust der biologischen Eigenschaften dieser Domäne, so daß die molekulare Variante ebenso wie das zuvor beschriebene Protein, das lediglich eine Domäne des Transkriptionsfaktors umfaßt, nicht mehr die biologische Funktion des Transkriptionsfaktors ausfüllen kann, wohl aber noch in der Lage ist das molekulare Zusammenspiel bei der Genregulation durch Interaktion mit entweder anderen Proteinen oder cis-regulatorischen DNA Elementen zu blockieren. Die Aminosäuresequenz des Inhibitors ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch trotz Vorliegens von zumindest einer der zuvor ausgeführten Aminosäuremodifikationen zumindest 70%, bevorzugt 80%, stärker bevorzugt 90% oder am stärksten bevorzugt 95% identisch zu der des zuvor definierten Transkriptionsfaktors.
Besonders bevorzugt ist daher ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der Aminosäureaustausch, die Aminosäuredeletion oder die Aminosäureinsertion zum Verlust der Funktion von zumindest einer Domäne des Transkriptionsfaktors führt. Bevorzugterweise kann ein variantes Whn Protein einen Aminosäureaustausch eines Arginins an Position 320 in ein Cystein aufweisen. Ein solcher Austausch würde zum Verlust der biologischen Eigenschaften der DNA-bindenden Domäne und somit zu einer Whn Proteinvariante führen, die. nicht mehr in der Lage ist DNA zu binden, wohl aber noch mittels der Transaktivatordomane mit anderen Proteinen interagieren kann. Die oben genannte Variante von Whn ist im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in Schlake (2000) loc. cit. beschrieben.
Außerdem bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der die Haarbildung stimulierende Faktor ein zytoplasmatisches Protein ist. 17
Neben Transkriptionsfaktoren stellen zytoplasmatische Proteine eine weitere große Klasse modulär aufgebauter Regulatoren dar. Die erfindungsgemäßen zytoplasmatischen Proteine zeichnen sich durch zumindest zwei Domänen aus, die Interaktion mit unterschiedlichen weiteren Proteinen vermitteln. Solche Proteine können Signale übermitteln, indem sie beispielsweise von einem ersten Protein über die erste. Domäne selbst aktiviert werden und im aktivierten Zustand dann über die zweite Domäne ein zweites Protein binden oder aktivieren. Ein von diesen zytoplasmatischen Proteinen übermitteltes Signal reguliert letztlich über Transkriptionsfaktoren, die am Ende der Signalübertragungskaskade bestehend aus den zytoplasmatische Proteinen stehen, die Genexpression der zuvor beschriebenen Zielgene. Beispiele für solche zytoplasmatischen Proteine sind das an der Regulation von LEF-1 beteiligte ß-catenin.
Hieraus ergibt sich daß, ein erfindungsgemäßes Verfahren ebenfalls bevorzugt ist wobei der Inhibitor eine Domäne des zytoplasmatischen Proteins, wie zuvor definiert, umfaßt.
Im Gegensatz zum Transkriptionsfaktor vermitteln hier die Domänen Protein-Protein Interaktionen, jedoch jede mit einem anderen Protein. Somit ist auch im Fall der hier beschriebene zytoplasmatischen Proteine kompetitive Inhibition möglich. Proteinbindende Domänen können mit verschiedenen im Stand der Technik bekannten Methoden bestimmt werden. Hierzu zählen z.B. "yeast two-hybrid" Methode, Immunopräzipitationstechniken und direkte Interaktionsmessungen in vitro durch Affinitätschromatographie und die sogenannte surface plasmon resonance.
Besonders bevorzugt ist daher ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei die Domäne eine Protein-Protein-Interaktion vermittelt.
Darüber hinaus bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der Inhibitor zumindest einen Aminosäureaustausch, eine Aminosäuredeletion oder eine Aminosäureinsertion zu dem zuvor definierten zytoplasmatischen Protein aufweist. Ebenso wie für die Transkriptionsfaktoren beschrieben, kann die kompetitive Inhibition auch von einer molekularen Variante eines zytoplasmatischen Proteins, 18
bei der durch oben genannte Aminosäuremodifikation die biologische Funktion gestört wird, vermittelt werden.
Die Aminosäuresequenz des Inhibitors ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch trotz Vorliegens von zumindest einer der zuvor ausgeführten Aminosäuremodifikationen zumindest 70%o, bevorzugt 80%), stärker bevorzugt 90%o oder am stärksten bevorzugt 95% identisch zu der des zuvor definierten zytoplasmatischen Proteins.
Somit ist ein erfindungsgemäßes Verfahren besonders bevorzugt wobei der Aminosäureaustausch, die Aminosäuredeletion oder die Aminosäureinsertion zum Verlust der Funktion von zumindest einer Domäne des zytoplasmatischen Proteins führt.
Außerdem bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der die Haarbildung stimulierende Faktor ein Rezeptor ist.
Rezeptoren sind ebenfalls modulär aufgebaute Proteine, die zumindest zwei Domänen umfassen die Protein-Protein-Interaktionen vermitteln. Hierbei handelt es sich einerseits um die extrazelluläre Domäne, die die Interaktion mit einem extrazellulären Protein, dem Ligand, vermittelt und der intrazellulären Domäne, die Interaktion mit zytoplasmatischen Proteinen vermittelt. Da es sich bei Rezeptoren um sogenannte Transmembran Proteine handelt weisen sie noch eine weitere Domäne, die Transmembrandomäne auf. Diese vermittelt jedoch keine Protein- Protein-Interaktion sondern verankert den Rezeptor in der lipidhaltigen Plasmamembran. Rezeptoren können ebenso wie zytoplasmatische Proteine oder Transkriptionsfaktoren Signale produzieren oder weiterleiten und können somit auch letztlich durch diese von ihnen abgegebenen Signale die Genexpression von den zuvor beschriebenen Zielgenen modulieren.
Darüber hinaus bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der Inhibitor eine Domäne des Rezeptors, wie in zuvor definiert, umfaßt.
Wie bereits für zytoplasmatische Proteine beschrieben, eignen sich einzelne Domänen von modulär aufgebauten Proteine, wie Rezeptoren, die durch 19
unterschiedliche Domänen mit unterschiedlichen Proteinen interagieren als kompetitive Inhibitoren, da sie das molekulare Zusammenspiel blockieren. Die Protein-bindenden Domäne der Rezeptoren können mit verschiedenen im Stand der Technik beschriebenen Methoden bestimmt werden. Hierzu zählen z.B. die "yeast two-hybrid" Methode, Immunopräzipitationsmethoden und direkte Interaktionsmessungen in vitro durch Affinitätschromatographie und die sogenannte surface plasmon resonance.
Hieraus folgt, daß ein erfindungsgemäßes Verfahren besonders bevorzugt ist wobei die Domäne eine Protein-Protein-Interaktion vermittelt.
Weiterhin bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der Inhibitor zumindest einen Aminosäureaustausch, eine Aminosäuredeletion oder eine
Aminosäureinsertion zu dem zuvor definierten Rezeptor aufweist.
Ebenso wie für die Transkriptionsfaktoren und zytoplasmatischen Proteine beschrieben, kann die kompetitive Inhibition auch von einer molekularen Variante eines Rezeptors, bei der durch oben genannte Aminosäuremodifikation die biologische Funktion gestört wird, vermittelt werden.
Die Aminosäuresequenz des Inhibitors ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch trotz Vorliegens von zumindest einer der zuvor ausgeführten
Aminosäuremodifikationen zumindest 70%, bevorzugt 80%, stärker bevorzugt 90% oder am stärksten bevorzugt 95%> identisch zu der des zuvor definierten Rezeptors.
Besonders bevorzugt ist hierbei ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei der Aminosäureaustausch, die Aminosäuredeletion oder die Aminosäureinsertion zum Verlust der Funktion von zumindest einer Domäne des Rezeptors führt.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das die Schritte der zuvor genannten erfindungsgemäßen Verfahrens, sowie den weiteren Schritt des Formulierens des identifizierten und/oder gewonnenen Inhibitors in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfaßt. Unter dem Begriff „Arzneimittel" sind erfindungsgemäß Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen definiert, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im 20
menschlichen Körper Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, zu lindern, zu verhüten oder zu erkennen. Während des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens können den mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen medizinische und/oder pharmazeutisch-technische Hilfsstoffe zugesetzt werden. Medizinische Hilfsstoffe sind erfindungsgemäß solche Stoffe, die zur Produktion (als aktive Ingredienzien) von Arzneimitteln in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Pharmazeutisch-technische Hilfsstoffe dienen lediglich der geeigneten Formulierung des Arzneimittels und können sogar, sofern sie nur während des Verfahrens benötigt werden, anschließend entfernt werden oder können als pharmazeutisch verträgliche Träger Teil des Arzneimittels sein. Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Träger sind nachstehend aufgeführt.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, das einen Inhibitor der Haarbildung, der nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert oder gewonnen wurde, oder ein Polynucleotid, das für den Inhibitor kodiert, optional in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfaßt. Die wesentlichen Begriffe dieser Ausführungsform wurden bereits oben erklärt und definiert. Die Arzneimittelformulierung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel. Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden, z.B. in einem Bereich von 1 μg bis 100 mg pro Tag und Patient. Die Verabreichung kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, z.B. direkt auf der Haut, intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär, lokal oder intradermal. Die Verabreichung von Nucleinsäuren kann auch in Form von Gen-Therapie geschehen. Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, daß die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z.B. der Größe, der Körperoberfläche, 21
dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziellen Mittel, welches verabreicht wird, der Dauer und Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, das ein die DNA-Bindungsdomäne jedoch nicht die Transaktivatordomane von Whn, LEF-1 oder Hoxc13 umfassendes Polypeptid oder ein für diese Polypeptid kodierendes Polynucleotid optional in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfaßt.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung eines die DNA- Bindungsdomäne jedoch nicht die Transaktivatordomane von Whn, LEF-1 oder Hoxc13 umfassenden Polypeptid oder ein für dieses Polypeptid kodierendes Polynucleotid, eines Inhibitors, der nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert und/oder gewonnen wurde, oder eines Polynucleotides, das für einen solchen Inhibitor kodiert zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Haarwuchsstörungen.
Symptome für Haarwachsstörungen sind im Stand der Technik bekannt und in medizinischen Standardwerken wie z.B. Pschyrembel ausführlich beschrieben. Die für die erfindungsgemäßen Verfahren beschriebenen weiteren bevorzugten oder besonders bevorzugten Ausführungsform gelten mutatis mutandis auch für die erfindungsgemäßen Verwendungen. ■
Bevorzugt ist hierbei eine erfindungsgemäße Verwendung wobei die Haarwuchsstörung verstärktes Haarwachstum ist.
Nicht zu letzt betrifft die Erfindung einen Kit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, wobei der Kit eine Zelle, die zumindest einen die Haarbildung stimulierenden Faktor umfaßt, ein Reportergen, wobei das Reportergen operativ mit. der Expressionskontrollsequenz eines Zielgens des Faktors verbunden ist und/oder ein zum Nachweis des Reportergens geeignetes Medium umfaßt. Die Bestandteile des erfindungsgemäßen Kits können hierbei in Behältern, wie beispielsweise Flaschen und Röhrchen, gegebenenfalls in Puffern und/oder 22
anderen Lösungen verpackt sein. Unter Umständen können eine oder mehrere Bestandteile in ein- und demselben Behälter verpackt sein. Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) des zur kompetitiven Hemmung des Whn-Transkriptionsfaktors eingesetzten Proteins.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispie! 1
3 x 105 BHK-Zellen werden mit den unten aufgeführten Plasmid-DNAs unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten
Kalziumphosphat-Transfektionsmethode transfomiert. 24 Stunden nach Beginn der Transformation werden die Zellen gewaschen und mit frischem Wachstumsmedium versetzt. 48 Stunden nach Beginn der Transformation werden die Zellen gewaschen, Rest-Medium entfernt und die Zellen geerntet durch Zugabe von TEN- Puffer (40 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA), abzentrifugiert und schließlich in 250 ml 250 mM Tris-Cl, pH 7.4 resuspendiert. Die Zellen werden lysiert durch dreimaliges Schockgefrieren auf -80°C und anschließendem Auftauen bei 37°C für jeweils 3 Minuten. Das Lysat wird anschließend zentrifugiert und der Überstand zur Bestimmung der Aktivitäten von ß-Galaktosidase und Luciferase verwendet.
Die Bestimmung der ß-Galaktosidase-Aktivität erfolgt mittels eines im Stand der Technik bekannten Verfahrens unter Verwendung des Substrates ONPG. Die Luciferase-Aktivität wird mittels eines im Stand der Technik bekannten Verfahrens im Luminometer der Fa. Berthold bestimmt.
Verwendet wurden die folgenden Plasmide:
(a) pBOSßGal: zur Bestimmung der Transfektionseffizienz Ref.: Mizushima &
Nagata. pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acids
Res. 18, 5322 (1990) 23
(b) luc: zur Bestimmung der Hintergrundaktivität von Luciferase Ref.: Schlake et al. The nude gene encodes a sequence- specific DNA binding protein with homologs in organisms that lack an anticipatory immune system. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 3842-3847 (1997)
(c) luc hn: zur Bestimung der durch Bindung des Whn-Transkriptionsfaktors ausgelösten Steigerung der Luciferase-Aktivität Ref.: Schlake et al., op. cit.
(d) Whn**: Expressionsvektor für das normale Whn-Protein Ref.: Schlake et al., 1997
(e) Whn ut: Expressionsvektor für die DNA-bindende Domäne des Whn- Proteins, versehen mit einem nuklearen Lokalisationssignal
Sequenz 1 zeigt die Aminosäuresequenz des vom Expressionsvektor Whnmut kodierten Proteins.
Tabelle 1 gibt die Ergebnisse bei der Hemmung der Whn-induzierten Genaktivierung durch ein verkürztes Whn-Protein an.
Tabelle 1 : Experiment Plasmide Luciferase-Aktivität* (Mittelwert +/- SD)
Whnwt Whnmut luc lucWhn
1 + + 1.0
2 + + 9.65 +/- 2.3
3 + + + 1 ,07 +7- 0.65
Bezogen auf gleiche ß-Galaktosidase-Aktivität

Claims

24Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifizierung und/oder Herstellung eines Inhibitors der Haarbildung, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt
(a) In-Kontakt-Bringen einer Zelle, die zumindest einen die Haarbildung stimulierenden Faktor sowie ein Reportergen umfaßt, wobei das Reportergen operativ mit der Expressionskontrollsequenz eines Zielgens des Faktors verbunden ist, mit einem vermutlichen Inhibitor in einem zum Nachweis des Reportergens geeigneten Medium;
(b) Quantitative Bestimmung der Reportergen-Aktivierung in der Zelle;
(c) Quantitative Bestimmung der Reportergen-Aktivierung in einer Zelle wie in (a) definiert, wobei die Zelle nicht mit einem vermutlichen Inhibitor in Kontakt gebracht wurde; und
(d) In-Bezug-Setzen der quantitativ bestimmten Reportergen-Aktivierung aus (b) und (c), wobei eine Verringerung oder ein Fehlen von nachweisbarer Reportergen-Aktivierung in (b) im Vergleich zu (c) ein Anzeichen für einen Inhibitor darstellt.
2. Verfahren nach Anspruch "1 , wobei das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: ß-galactosidase, Luziferase, Renilla Luziferase, Grün-fluoreszierendes Protein (GFP), Blau-floureszierendes Protein (BFP), Gelb-floureszierendes Protein (YFP), Chloramphenicol transferase.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Zielgen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehen aus:
Keratin, Haarkeratingene des Menschen: hHal , hHa2, hHa3-l, hHa3-ll, hHa4, hHaδ, hHa6, hHa7, hHaδ; hHbl , hHb2, hHb3, hHb4, hHbδ, hHb6.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Reportergen in die Zelle eingeführt wird. 25
5. Verfahren zur Inhibierung der Haarbildung, wobei das Verfahren das Einfügen eines Inhibitors der Haarbildung in eine Zelle umfaßt, wobei die Zelle einen die Haarbildung stimulierenden Faktor umfaßt, der mit dem Inhibitor interagieren kann.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Heia COS-1, COS-7, CHO, epitheliaie Zellinien, primäre Keratinozyten, oder Zellinien die aus Keratinozyten abgeleitet wurden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Faktor von einem Polynucleotid kodiert wird, das in die Zelle eingeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Inhibitor von einem Polynucleotid kodiert wird, das in die Zelle eingeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der die Haarbildung stimulierende Faktor ein Transkriptionsfaktor ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Transkriptionsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Whn, Hairless, LEF-1 und Hoxc13.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Inhibitor eine Domäne des Transkriptionsfaktors, wie in Anspruch 9 oder 10 definiert, umfaßt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Domäne eine Protein-DNA- oder Protein-Protein-Interaktion vermittelt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Inhibitor zumindest einen Aminosäureaustausch, eine Aminosäuredeletion oder eine 26
Aminosäureinsertion zu dem in Anspruch 10 oder 11 definierten Transkriptionsfaktor aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Aminosäureaustausch, die Aminosäuredeletion oder die Aminosäureinsertion zum Verlust der Funktion von zumindest einer Domäne des Transkriptionsfaktors führt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der die Haarbildung stimulierende Faktor ein zytoplasmatisches Protein ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 15, wobei der Inhibitor eine Domäne des zytoplasmatischen Proteins, wie in Anspruch 15 definiert, umfaßt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Domäne eine Protein-Protein- Interaktion vermittelt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 15, wobei der Inhibitor zumindest einen Aminosäureaustausch, eine Aminosäuredeletion oder eine Aminosäureinsertion zu dem in Anspruch 15 definierten zytoplasmatischen Protein aufweist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Aminosäureaustausch, die Aminosäuredeletion oder die Aminosäureinsertion zum Verlust der Funktion von zumindest einer Domäne des zytoplasmatischen Proteins führt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der die Haarbildung stimulierende Faktor ein Rezeptor ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 20, wobei der Inhibitor eine Domäne des Rezeptors, wie in Anspruch 20 definiert, umfaßt. 27
22. Verfahren nach Anspruch 21 , wobei die Domäne eine Protein-Protein- Interaktion vermittelt.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 20, wobei der Inhibitor zumindest einen Aminosäureaustausch, eine Aminosäuredeletion oder eine Aminosäureinsertion zu dem in Anspruch 20 definierten Rezeptor aufweist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Aminosäureaustausch, die Aminosäuredeletion oder die Aminosäureinsertion zum Verlust der Funktion von zumindest einer Domäne des Rezeptors führt.
25. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das die Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 24, sowie den weiteren Schritt des Formulierens des identifizierten und/oder gewonnenen Inhibitors in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfaßt.
26. Arzneimittel, das einen Inhibitor der Haarbildung, der nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24 identifiziert oder gewonnen wurde, oder ein Polynucleotid, das für den Inhibitor kodiert, optional in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfaßt.
27. Arzneimittel, das ein die DNA-Bindungsdomäne jedoch nicht die Transaktivatordomane von Whn umfassendes Polypeptid oder ein für diese Polypeptid kodierendes Polynucleotid optional in einer pharmazeutisch verträglichen Darreichungsform umfaßt.
28. Verwendung eines die DNA-Bindungsdomäne jedoch nicht die Transaktivatordomane von Whn umfassendes Polypeptid oder ein für dieses Polypeptid kodierendes Polynucleotid, eines Inhibitors, der nach einem der Ansprüche 1 bis 24 identifiziert und/oder gewonnen wurde, oder eines Polynucleotides, das für einen solchen Inhibitor kodiert zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Haarwuchsstörungen. 28
29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Haarwuchsstörung verstärktes Haarwachstum ist.
30. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei der Kit eine Zelle, die zumindest einen die Haarbildung stimulierenden Faktor umfaßt, ein Reportergen, wobei das Reportergen operativ mit der Expressionskontrollsequenz eines Zielgens des Faktors verbunden ist und/oder ein zum Nachweis des Reportergens geeignetes Medium umfaßt.
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