EP1211542A2 - Anordnung zur visuellen und quantitativen 3-D-Untersuchung von Proben - Google Patents

Anordnung zur visuellen und quantitativen 3-D-Untersuchung von Proben Download PDF

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EP1211542A2
EP1211542A2 EP01121978A EP01121978A EP1211542A2 EP 1211542 A2 EP1211542 A2 EP 1211542A2 EP 01121978 A EP01121978 A EP 01121978A EP 01121978 A EP01121978 A EP 01121978A EP 1211542 A2 EP1211542 A2 EP 1211542A2
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EP
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beam path
sample
stereomicroscope
scanning device
confocal scanning
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Johann Dr. Engelhardt
Werner Dr. Knebel
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Leica Microsystems CMS GmbH
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    • G02B21/00—Microscopes
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    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0028—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders specially adapted for specific applications, e.g. for endoscopes, ophthalmoscopes, attachments to conventional microscopes

Definitions

  • the invention relates to an arrangement for visual and quantitative 3-D examination of samples .
  • the invention relates to a Stereo microscope with a confocal scanner that parallel the visual Examination of samples as well as data acquisition with a confocal Scanner enabled.
  • the basic structure of a stereo microscope is from the German Design registration 400 04 640.7 known. There are several Embodiments presented by a stereo microscope.
  • the Stereomicroscope enables the visual three-dimensional observation of a Sample by the observer. If the picture is e.g. with a CCD camera recorded, the viewer only receives a two-dimensional image.
  • the German patent application DE 196 32 637 discloses a method for Generation of parallactic sectional image stacks for the high-resolution Stereo microscopy.
  • the method it is possible to make 3D animations of the spatial object by generating a series of slice stacks or to achieve sectional image stack pairs. This creates a stack of layplanes achieved by moving the depth of field of the microscope objective in discrete steps along the optical axis through the sample. So will won a batch of sectional images.
  • the lay-up stack becomes one parallactic sectional image stack pair formed, the parallactic angle for stereoscopic vision.
  • the 3-D representation of the pictures a display should, however, require considerable computing effort.
  • the basic structure of a confocal scanning microscope with scanning device is from the U.S. Patent 4,863,266 known.
  • the scanning microscope allows it to increase the resolution and contrast in three dimensions. Likewise can to get 3-D information from the object. Unfortunately, the device allows not a visual 3-D view of the sample to be examined.
  • the invention has for its object to provide an arrangement that in addition to a visual 3-D observation of the sample, a quantitative 3-D analysis of the sample to be examined.
  • the invention is also intended enable a 3-D representation of a sample with high quality and thereby the computational effort or other mathematical methods that a require considerable time to reduce.
  • the objective problem is solved by an arrangement that thereby is characterized in that a confocal scanning device with the Stereomicroscope is connected to that of the confocal scanning device defined scan beam path scans a sample to be examined and records data for a 3-D image representation of the sample (6).
  • An advantage of the invention is that with a stereo microscope both Visual as well as confocal scanning of the sample to be examined is possible. It is necessary to have a confocal scanning device connected to the stereomicroscope such that one of the confocal Scanning device defined scan beam path a sample to be examined scans and thereby data for a three-dimensional image representation of the Sample.
  • the Stereophotography are dispensed with, the two illustrations of the object created different perspectives.
  • the three-dimensional thus obtained Pictures are often of disappointing quality.
  • these recordings elaborate to manufacture and require considerable consideration apparatus expenditure.
  • Through the one connected to a stereo microscope confocal scanning device one can consecutively record multiple images create different levels of a sample. This data is e.g.
  • the stereomicroscope 2 has a first and a second eyepiece 8 and 9, both in the first and second observation beam paths 4 and 5, respectively are arranged.
  • a deflection prism 13 is used in each of the observation beam paths 4 and 5, which guides the observation beam path in the stereo microscope 2 accordingly.
  • a plurality of tube lenses 14 are provided in the first and second observation beam paths 4 and 5. Downstream of the tube lenses 14 is an objective 12, which together images the first and second observation beam paths 4 and 5 onto a sample 6.
  • the sample 6 can be located on an object support table 15, for example.
  • the scanning device 1 defines a scanning beam path 3, which is also imaged onto the sample by the objective 12.
  • FIG. 2 Another embodiment of the invention is shown in FIG. 2 . All elements of FIG. 2 that are identical to the elements of FIG. 1 are identified by the same reference numerals.
  • the scanning device 1 is arranged with respect to the scanning microscope in such a way that the scanning beam path 3 can be coupled directly into one of the two observation beam paths 4 and 5.
  • an optical coupling element 7 is provided in one of the observation beam paths 4 or 5, which leads the scan beam path 3 into an observation beam path.
  • the scanning beam path 3 also passes through at least one of the tube lenses 14.
  • the scanning beam path 3 and the illuminating beam paths 4 and 5 are imaged on the sample 6 by the objective 12.
  • the optical coupling element 7 is coated in order to protect the observer from the illumination laser light of the scan beam reflected by the sample.
  • confocal Scanning microscopy is used to scan a sample with a light beam.
  • On confocal scanner or scanning device generally includes one Light source, a focusing optics with which the light of the light source on the a pinhole is focused, a scanning mechanism for Beam control, a detection aperture and detectors to detect the Detection and fluorescent light.
  • the lens 12 is required to Imaging the scan beam onto the sample 6.
  • an optical coupling element 7 is also shown (Beam splitter) required to scan the beam path 3 in the To couple observation beam path 4 or 5.
  • the focus of the scan beam is generally done by tilting two mirrors in one plane within the sample 6 moves, the deflection axes usually perpendicular to each other stand so that one mirror deflects in the x and the other in the y direction.
  • the mirror is tilted, for example, with the help of galvanometer actuators accomplished.
  • the fluorescence from the sample or reflection light comes back through the same scanning mirror
  • the invention has been made in relation to a particular embodiment the detection aperture, behind which detectors are focused, mostly Photomultiplier. Detection light that is not directly from the focus region comes from another light path and passes through the detection diaphragm not, so that one obtains point information which can be obtained by scanning the Sample leads to a three-dimensional image. Depth of field problems occur for reasons of principle not.
  • the scanning device 1 is corresponding electronics (not shown) downstream, the quantitative three-dimensional imaging of the sample evaluates. There will be several levels in a row in a sample scanned, and the stacks so obtained are processed in a similar manner evaluated.
  • the evaluation can e.g. even with a computer (not shown) and an appropriate computer software.

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Abstract

Anordnung zur visuellen und quantitativen 3-D-Untersuchung von Proben mit einem Stereomikroskop (2). Das Stereomikroskop definiert einen ersten und einen zweiten Beobachtungsstrahlengang (4, 5), durch die eine zu untersuchende Probe (6) visuell beobachtet werden kann. Mit dem Stereomikroskop (10) ist eine konfokale Scaneinrichtung (1) derart verbunden, dass ein von der konfokalen Scaneinrichtung (1) definierter Scanstrahlengang (3) die zu untersuchende Probe (6) abrastert und dabei Daten für eine dreidimensionale Bilddarstellung der Probe (6) aufnimmt.

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur visuellen und quantitativen 3-D-Untersuchung von Proben.. Im besonderen betrifft die Erfindung ein Stereomikroskop mit einem konfokalen Scanner das parallel die visuelle Untersuchung von Proben als auch die Datenaufnahme mit einem konfokalen Scanner ermöglicht.
Der prinzipielle Aufbau eines Stereomikroskops ist aus der deutschen Geschmacksmusteranmeldung 400 04 640.7 bekannt. Es sind mehrere Ausführungsformen von einem Stereomikroskop vorgestellt. Das Stereomikroskop ermöglicht die visuelle dreidimensionale Betrachtung einer Probe durch den Beobachter. Wird das Bild z.B. mit einer CCD-Kamera aufgenommen so erhält der Betrachter lediglich ein zweidimensionales Bild.
Die deutsche Offenlegungsschrift DE 196 32 637 offenbart ein Verfahren zur Erzeugung parallaktischer Schnittbildstapel für die hochauflösende Stereomikroskopie. Mittels des Verfahrens ist es möglich 3-D-Animationen des räumlichen Objekts durch Generierung einer Serie von Schnittbildstapeln bzw. Schnittbildstapelpaaren zu erzielen. Ein Schnittbildstapel wird dadurch erzielt, indem man den Schärfentiefe-Bereich des Mikroskop-Objektives in diskreten Schritten entlang der optischen Achse durch die Probe führt. So wird ein Schnittbildstapel gewonnen. Aus dem Schnittbildstapel wird jeweils ein parallaktisches Schnittbildstapelpaar gebildet, das dem parallaktischen Winkel für stereoskopisches Sehen entspricht. Die 3-D-Darstellung der Bilder auf einem Display dürfte aber einen erheblichen Rechenaufwand benötigen.
Der prinzipielle Aufbau eines konfokalen Scanmikroskops mit Scaneinrichtung ist aus dem U.S. Patent 4,863,266 bekannt. Das Scanmikroskop erlaubt es die Auflösung und den Kontrast in drei Dimensionen zu erhöhen. Ebenso kann man 3-D-Information von dem Objekt erhalten. Leider erlaubt die Vorrichtung nicht eine visuelle 3-D-Betrachtung der zu untersuchenden Probe.
Der Artikel "Confocal imaging for 3-D digital microscopy" von Kjell Carlsson und Niels Åslund, in Applied optics, Vol. 26(16), pp.3232-3238, behandelt ein Verfahren zur 3-D-Ansicht von Proben mit einem konfokalen Mikroskop. Vor den Scannvorgang kann der Benutzer die Probe mit herkömmlichen mikroskopischen Verfahren betrachten. Für die 3-D-Ansicht werden entlang der optischen Achse mehrere Ebenen in der Probe aufgenommen. Der Stapel digitaler Bilder aus den verschiedenen Ebenen, ergeben eine 3-D-Matrix der Probe. In einem Computer können daran die verschiedensten Prozesse durchgeführt werden. Diese Methode erlaubt ebenfalls nicht eine visuelle 3-D-Beobachtung der Probe und dabei gleichzeitig eine Aufnahme von Probendaten mit einer konfokalen Scaneinrichtung.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde eine Anordnung zu schaffen, die neben einer visuellen 3-D-Betrachtung der Probe eine quantitative 3-D-Analyse der zu untersuchenden Probe ermöglicht. Ferner soll die Erfindung eine 3-D-Darstellung einer Probe mit hoher Qualität ermöglichen und dabei den Rechenaufwand oder andere mathematische Verfahren, die einen erheblichen Zeitaufwand benötigen, zu reduzieren.
Die objektive Aufgabe wird gelöst durch eine Anordnung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass eine konfokale Scaneinrichtung derart mit dem Stereomikroskop verbunden ist, dass ein von der konfokalen Scaneinrichtung definierter Scanstrahlengang eine zu untersuchende Probe abrastert und dabei Daten für eine 3-D-Bilddarstellung der Probe (6) aufnimmt.
Ein.Vorteil der Erfindung ist es, dass mit einem Stereomikroskop sowohl die Visuelle als auch ein konfokales Abrastern der zu untersuchenden Probe ermöglicht ist. Dabei ist es notwendig dass eine konfokale Scaneinrichtung derart mit dem Stereomikroskop verbunden ist, dass ein von der konfokalen Scaneinrichtung definierter Scanstrahlengang eine zu untersuchende Probe abrastert und dabei Daten für eine drei-dimensionale Bilddarstellung der Probe aufnimmt. Dabei kann in der Stereomikroskopie auf die Stereophotographie verzichtet werden, die zwei Abbildungen de Objekts aus unterschiedlichen Blickwinkeln erstellt. Die so erhaltenen dreidimensionalen Bilder besitzen oft enttäuschende Qualität. Ferner sind diese Aufnahmen aufwendig herzustellen und erfordern für die Betrachtung einen erheblichen apparativen Aufwand. Durch die mit einem Stereomikroskop verbundene konfokale Scaneinrichtung kann man nacheinander mehrere Aufnahmen in jeweils verschiedenen Ebenen einer Probe erstellen. Diese Daten werden z.B. in einem Speicher eines Computers abgelegt und können jederzeit für quantitative Auswertungen, wie z.B. Abstandsmessungen im Raum, Teilchen zählen in alle drei Raumrichtungen oder Verteilung bestimmter chemischer Elemente in den drei Raumrichtungen, herangezogen werden. Durch die Erfindung wird die Auswertung zu untersuchender Proben nicht nur vereinfacht, sondern auch hinsichtlich des Ergebnisses deutlich verbessert.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
Fig. 1
eine schematische Darstellung der Ankopplung der konfokalen Scaneinrichtung durch den Kameraport, und
Fig. 2
eine schematische Darstellung eines Stereomikroskops, bei dem der Scanstrahlengang direkt in einen Beobachtungsstrahlengang eingekoppelt ist.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Ankopplung einer konfokalen Scaneinrichtung 1 durch den Kameraport (nicht dargestellt) eines Stereomikroskops 2. Das Stereomikroskop 2 besitzt ein erstes und ein zweites Okular 8 und 9, die beide jeweils im ersten bzw. zweiten Beobachtungsstrahlengang 4 und 5 angeordnet sind. Im Beobachtungsstrahlengang 4 und 5 ist jeweils ein Umlenkprisma 13 eingesetzt, des den Beobachtungsstrahlengang in Stereomikroskop 2 entsprechend führt. Ferner sind in ersten und zweiten Beobachtungsstrahlengang 4 und 5 mehrere Tubuslinsen 14 vorgesehen. Den Tubuslinsen 14 ist ein Objektiv 12 nachgeschaltet, das den ersten und zweiten Beobachtungsstrahlengang 4 und 5 gemeinsam auf eine Probe abbildet 6. Die Probe 6 kann sich z.B. auf einem Objektauflagetisch 15 befinden. Die Scaneinrichtung 1 definiert einen Scanstrahlengang 3, der ebenfalls durch das Objektiv 12 auf die Probe abgebildet wird. Vor dem Objektiv 12 sind im Scanstrahlengang 3 weitere Linsen 16 eingesetzt, die bis zum Objektiv 12 den Scanstrahlengang 3 parallel zum ersten und zweiten Beobachtungsstrahlengang 4 und 5 führen. Ferner ist zu bemerken , dass der Beobachter vor dem von der Probe reflektierten Beleuchtungslaserlicht des Scanstrahls zu schützen ist. Hierzu können z.B. geeignete Filter vorgesehen sein, die den Beobachter vor dem Beobachtungslichtstrahl schützen.
Eine weiter Ausführungsform der Erfindung ist in Fig. 2 dargestellt. Alle Elemente der Fig. 2 die mit den Elementen der Fig. 1 identisch sind, sind mit dem gleichen Bezugszeichen bezeichnet. Die Scaneinrichtung 1 ist in diesem Ausführungsbeispiel derart bezüglich des Scanmikroskops angeordnet, dass der Scanstrahlengang 3 direkt in einen der beiden Beobachtungsstrahlengänge 4 und 5 einkoppelbar ist. Dazu ist in einem der Beobachtungsstrahlengänge 4 oder 5 ein optisches Einkoppelelement 7 vorgesehen, das den Scanstrahlengang 3 in einen Beobachtungsstrahlengang führt. Der Scanstrahlengang 3 passiert dabei ebenfalls mindestens eine der Tubuslinsen 14. Der Scanstrahlengang 3 und die Beleuchtungsstrahlengänge 4 und 5 werden durch das Objektiv 12 auf die Probe 6 abgebildet. Das optische Einkoppelelement 7 ist vergütet, um den Beobachter vor dem von der Probe reflektierten Beleuchtungslaserlicht des Scanstrahls zu schützen.
Die Arbeitsweise und der Aufbau der Scaneinrichtung werden im folgenden nur der Vollständigkeit halber beschrieben, da eine Scaneinrichtung hinlänglich aus den Stand der Technik bekannt ist. In der konfokalen Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl abgerastert. Ein konfokaler Scanner oder eine Scaneinrichtung umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, ein Fokussieroptik, mit der das Licht der Lichtquelle auf die auf eine Lochblende fokussiert wird, einen Scanmechanismus zur Strahlsteuerung, eine Detektionsblende und Detektoren zum Nachweis des Detektions- und Fluoreszenzlichts. Das Objektiv 12 ist erforderlich, um den Scanstrahl auf die Probe 6 abzubilden. Wie dem Ausführungsbeispiel der Fig. 2 zu entnehmen ist, ist ebenfalls ein optisches Einkoppelelement 7 (Strahlteiler) erforderlich, um den Scanstrahlengang 3 in den Beobachtungsstrahlengang 4 oder 5 einzukoppeln. Der Fokus der Scanstrahls wird im allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel in einer Ebene innerhalb der Probe 6 bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Das von der Probe kommende Fluoreszenz- oder Reflektionslicht gelangt über dieselben Scanspiegel zurück
Die Erfindung wurde in bezug auf eine besondere Ausführungsform wird auf die Detektionsblende fokussiert, hinter der sich Detektoren, meist Photomultiplier, befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt nimmt einen anderen Lichtweg, und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch Abrastern der Probe zu einem dreidimensionalen Bild führt. Schärfentiefeprobleme treten aus prinzipiellen Gründen nicht auf.
Der Scaneinrichtung 1 ist eine entsprechende Elektronik (nicht dargestellt) nachgeschaltet, die die dreidimensionale Abbildung der Probe quantitativ auswertet. Es werden nacheinander mehrere Ebenen in einer Probe gescannt, und die so erhaltenen Stapel werden in entsprechender Weise ausgewertet. Die Auswertung kann z.B. auch mit einen Rechner (nicht dargestellt) und einer entsprechenden Computersoftware realisiert sein.
Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

Claims (6)

  1. Anordnung zur visuellen und quantitativen 3-D-Untersuchung von Proben mit einem Stereomikroskop (2), das einen ersten und einen zweiten Beobachtungsstrahlengang (4, 5) definiert, dadurch gekennzeichnet, dass eine konfokale Scaneinrichtung (1) derart mit dem Stereomikroskop (10) verbunden ist, dass ein von der konfokalen Scaneinrichtung (1) definierter Scanstrahlengang (3) eine zu untersuchende Probe (6) abrastert und dabei Daten für eine drei-dimensionale Bilddarstellung der Probe (6) aufnimmt.
  2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die konfokalen Scaneinrichtung (1) derart an Stereomikroskop angebracht ist, dass der Scanstrahlengang (3) in den ersten oder in den zweiten Beobachtungsstrahlengang (4, 5) einkoppelbar ist.
  3. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das ein optisches Einkoppelelement (7) vorgesehen ist, dass den Scanstrahlengang (3) in einen Beobachtungsstrahlengang (4, 5) ein- und auskoppelt.
  4. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Stereomikroskop mit einem Kameraport versehen ist, an den die konfokale Scaneinrichtung (1) den Scanstrahlengang (3) in das Stereomikroskop einkoppelt.
  5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das der erste und der zweite Beleuchtungsstrahlengang (4, 5) und der Scanstrahlengang (3) durch ein Objektiv (12) des Stereomikroskops (2) gemeinsam auf die zu untersuchende Probe (6) abgebildet werden.
  6. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das die konfokale Scaneinrichtung (1) mit einem Computer verbunden ist, der die durch die konfokale Scaneinrichtung (1) aufgenommenen Bilddaten auswertet und auf einem Display darstellt.
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