EP0941343A1 - Lipases pancreatiques et/ou colipases recombinantes et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations - Google Patents

Lipases pancreatiques et/ou colipases recombinantes et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations

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Publication number
EP0941343A1
EP0941343A1 EP97911287A EP97911287A EP0941343A1 EP 0941343 A1 EP0941343 A1 EP 0941343A1 EP 97911287 A EP97911287 A EP 97911287A EP 97911287 A EP97911287 A EP 97911287A EP 0941343 A1 EP0941343 A1 EP 0941343A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plants
recombinant
colipase
pancreatic lipase
lph
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP97911287A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Véronique 44Avenue Jean-Jaures GRUBER
Philippe Bournat
Bertrand Merot
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meristem Therapeutics SA
Original Assignee
Meristem Therapeutics SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meristem Therapeutics SA filed Critical Meristem Therapeutics SA
Publication of EP0941343A1 publication Critical patent/EP0941343A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the present invention is the production by plants of recombinant pancreatic lipases and colipases, in particular recombinant human pancreatic lipase (LPH) and / or human pancreatic colipase (COLPH), in a combined or separate manner, and other derivatives of the latter having a lipase activity or a lipase cofactor activity if appropriate, as well as their uses, in particular as functional foods, as pharmaceutical compositions, or in enzymatic formulations for agrifood or industrial applications.
  • LPH human pancreatic lipase
  • COLPH human pancreatic colipase
  • Patent WO 93004216 which relates to a pancreatic mammalian lipase and its variants, is known in the prior art. The description is based on the cloning and sequencing of the pancreatic guinea-pig lipase and the mode of production described is expression in the fungus. filamentous Aspergillus oryzae. However, no indication is given in WO 9300426 to overcome the unforeseeable peculiarities and difficulties specific to transgenesis and to such production in plants, for example in tobacco, corn or rapeseed.
  • pancreatic lipase and colipase allows the hydrolysis of fats in the duodenum.
  • the natural substrate of pancreatic lipase consists of triglycerides with long chains dispersed in the solution of micellar bile salts.
  • lipase is strongly inhibited by bile salts.
  • this inhibition is overcome.
  • the pancreatic lipase-pancreatic colipase complex is formed, catalyzed by long chain fatty acids that increase the binding by a factor of 100.
  • the lipase: colipase stoichiometry is 1: 1, the concentration ratio lipase-colipase is variable depending on the species considered (Erlanson-
  • LPH Human pancreatic lipase
  • AA amino acid glycoprotein with an apparent molecular mass of approximately 50 kilodaltons (kDa) synthesized as a 465 AA precursor containing a signal peptide from 16 AA to 1 N-terminus
  • lipases proteins or C
  • the amino acid sequences have a homology percentage of at least 80%, especially from at least 80.6% to about 84.6 (Table 1).
  • the nucleotide sequences have between them a percentage of homology of at least 79%, in particular from at least 79.3% to about 87% (Table 1).
  • pancreatic lipases are as follows: they are activated by the lipid-water interfaces (interfacial activation), they are inhibited by bile salts but reactivated by colipase (activating protein); they do not significantly hydrolyze phospholipids
  • Pancreatic lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3 1 1 3)) plays a key role in the absorption of edible fats by the hydrolysis of triglycerides to diglycerides, then monoglycerides and free fatty acids.
  • pancreatic lipase The hydrolysis of triglycerides by pancreatic lipase is inhibited by physiological concentrations of bile acids This inhibition is overcome by the addition of colipase which binds to lipase and lipid micelles
  • the three-dimensional structure of human pancreatic lipase has been determined by X-ray crystallography (Winkler et al 1990) It made it possible to identify the catalytic residue Ser 152 belonging to the Asp-His-Ser triad which is chemically analogous but structurally different from serine proteases. This catalytic site is covered by a surface loop, and therefore inaccessible to the solvent.
  • pancreatic lipase consists of two domains, an N-terminal domain comprising residues 1 to 335, and a C-terminal domain
  • the N-terminal domain contains the active site, a glycosylation site (Asn 166), a Ca 2 binding site + , and probably an intestinal pheparin binding site
  • the C-terminal domain contains the colipase binding site
  • Pancreatic colipase is secreted from the pancreas in the form of a precursor, procolipase (Borgstrom et al 1979) It facilitates the hydrolysis of interfacial lipids catalyzed by pancreatic lipase Pancreatic colipase, of apparent molecular mass of lOkDa, confers catalytic activity to pancreatic lipase under physiological conditions (high concentrations of bile salts) Procolipase
  • pancreatic colipases have been isolated from mammals For example, pancreatic rabbit colipase has 82.7% AA sequence homology with human colipase Crystallographic study of the structure of colipase and its interaction with lipase pancreatic have been studied (Egloff et al, 1995): The surface of the colipase can be divided into a relatively hydrophilic part interacting with lipase and a more hydrophobic part at the ends of protein loops The interaction between colipase and the C- domain lipase terminal is stabilized by 8 hydrogen bonds and approximately
  • transgenesis of mammalian genes in a plant cell could offer a production route in large quantities of new recombinant proteins, at a reduced production cost and without the risk of viral or subviral contamination.
  • 1983 several laboratories discovered that it was possible to transfer a heterologous gene into the genome of a plant cell and to regenerate transgenic plants from these genetically modified cells. All the cells of the plant then have the genetically modified character which is transmitted to the offspring by sexual fertilization. Thanks to this work, various teams have taken an interest in the production of recombinant mammalian proteins in plant cells or in transgenic plants (Barta et a, 1986).
  • One of the first truly significant results in this area was the production of antibodies in transgenic tobacco plants.
  • hepatitis B surface antigen hepatitis B surface antigen
  • interferons a mouse antibody to -Streptococcus mutons
  • caries agent fragments of anti- cancer cells
  • an anti-Herpes antibody an anti-Herpes antibody
  • cholera toxin human epidermis growth factor (EGF).
  • pancreatic lipase in particular recombinant LPH or proteins or polypeptides derived from the latter, having sufficient enzymatic activity for be developed in an industrial application.
  • the aim of the present invention is to provide a new process for obtaining recombinant pancreatic lipases from mammals, and more particularly from LPH, by plants, or from proteins or polypeptides derived from the latter, having enzymatic activity, and more particularly lipase activity, such as said recombinant lipases, or their derived polypeptides can be used industrially.
  • Another object of the present invention is to provide the tools for the implementation of such a method, in particular new recombinant nucleotide sequences, genetically transformed plant cells, plants or parts of plants (in particular leaves, stems, fruits , seeds or seeds, roots) genetically transformed, and fragments of these genetically transformed plants or parts of plants.
  • the object of the invention is also to provide novel recombinant pancreatic lipases from mammals, in particular LPH, or any protein or polypeptide derived therefrom, enzymatically active and as obtained from plant or plant cells. , genetically transformed.
  • the invention also aims to provide new enzymatic compositions which can be used in the context of the implementation of enzymatic reactions, in particular on an industrial scale.
  • the invention also aims to provide new pharmaceutical compositions, in particular in the context of the treatment of pathologies associated with a deficit in lipase production in the body, such as cystic fibrosis as well as the treatment of pathologies associated with an eating disorder, such as obesity.
  • Another object of the present invention is to provide new fuels, also known as biofuels, having the advantage of being less polluting than petroleum-based fuels, and of being of lower cost price.
  • the subject of the present invention is the use of a recombinant nucleotide sequence containing, on the one hand, a cDNA coding for a pancreatic lipase of mammals or for a derived protein or polypeptide, and on the other hand, the elements allowing a plant cell to produce the pancreatic lipase, or the protein or the derived polypeptide, coded by said cDNA, in particular a promoter and a transcription terminator recognized by the transcriptional machinery of plant cells, for the transformation of plant cells with a view to obtaining, from these cells, or from plants obtained from the latter, a recombinant pancreatic lipase from mammals, or a derived protein or polypeptide.
  • the subject of the present invention is the use of a recombinant nucleotide sequence containing, on the one hand, a cDNA coding for any pancreatic lipase from mammals or for a protein or a derived polypeptide, namely proteins or polypeptides whose nucleotide sequences coding for the latter have between them a percentage of homology of at least about 75%, in particular of at least about 77% to about 85%, and whose amino acid sequences have between them a percentage of homology of at least about 75%, in particular of at least about 80% to about 90%, and have a lipase activity of the pancreatic type, in particular a cDNA coding for any pancreatic mammalian lipase, or a cDNA coding for any protein or polypeptide derived from the aforementioned pancreatic lipases by addition and / or deletion and / or substitution of one (or more) amino acid (s), this protein or this polyp derived eptide having
  • a more particular subject of the present invention is the use of a recombinant nucleotide sequence containing on the one hand, the cDNA coding for the LPH (Lowe ME et al 1989), or a nucleotide sequence derived from this cDNA, in particular by addition and / or deletion and / or substitution of one (or more) nucleotide (s), said derived sequence being capable of coding for a polypeptide whose amino acid sequence is identical to that of LPH, or for a polypeptide derived from LPH by addition and / or deletion and / or substitution of one (or more) amino acid (s), this derived polypeptide having a pancreatic type lipase activity, and on the other hand, the elements allowing a plant cell to produce the polypeptide encoded by said cDNA or by a derivative sequence mentioned above, in particular a promoter and a transcription terminator recognized by the machinery transcription of plant cells (and more particularly by the RNA polymerases of the latter), for the
  • the invention also relates to a recombinant nucleotide sequence, characterized in that it contains on the one hand the coding sequence for a pancreatic lipase or a derived protein or polypeptide and on the other hand, the elements allowing a plant cell to produce a pancreatic pancreatic lipase or a derivative protein or polypeptide encoded by said sequence, in particular a promoter and a transcription terminator recognized by the transcriptional machinery of plant cells,
  • a recombinant nucleotide sequence characterized in that it contains on the one hand the coding sequence for a colipase or a derived protein or polypeptide and on the other hand, the elements allowing a plant cell to produce a pancreatic colipase or a protein or derived polypeptide encoded by said sequence, in particular a promoter and a transcription terminator recognized by the transcription machinery of plant cells,
  • a recombinant nucleotide sequence characterized in that it contains on the one hand the sequences coding for a pancreatic lipase and a colipase or the proteins or polypeptides derived and on the other hand, the elements allowing a plant cell to produce a pancreatic lipase and a colipase or the proteins or polypeptides derived encoded by said sequence, in particular a promoter and a transcription terminator recognized by the transcriptional machinery of plant cells.
  • the invention also relates to any recombinant nucleotide sequence as described above, in particular that containing, as cDNA, that of the LPH or a nucleotide sequence derived therefrom as defined above.
  • the recombinant nucleotide sequences according to the invention contain one (or more) sequence (s) coding for a peptide responsible for the addressing of the recombinant polypeptides of the invention (namely recombinant LPH or the above-mentioned derived polypeptides) in a determined compartment of the plant cell, in particular in the endoplasmic reticulum or in the vacuoles, or even outside the cell, in the pectocellulosic wall or in the extracellular space also called apoplasm.
  • a peptide responsible for the addressing of the recombinant polypeptides of the invention namely recombinant LPH or the above-mentioned derived polypeptides
  • transcription terminators which can be used for the transformation of plant cells in the context of the present invention, mention may be made of the polyA 35S terminator of the cauliflower mosaic (CaMV), or the polyA NOS terminator , which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the nopaline synthase gene of the Ti plasmid of Agrobacterium lumefaciens nopaline strain.
  • CaMV cauliflower mosaic
  • NOS terminator which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the nopaline synthase gene of the Ti plasmid of Agrobacterium lumefaciens nopaline strain.
  • the invention relates to any recombinant nucleotide sequence as described above containing downstream of said cDNA or its derived sequence, the polyA 35S terminator of CaMV, or the polyA NOS terminator of Agrobacterium tiimefaciens.
  • transcription promoters capable of being used for the transformation of plant cells in the context of the present invention, there may be mentioned:
  • the chimeric PSP super-promoter (Ni M et al., 1995), consisting of the fusion of a triple repetition of a transcriptional activating element of the promoter of the octopine synthase gene from Agrobacterium tumefaciens, of a transcriptional activating element of the promoter of the mannopine synthase gene and of the mannopine synthase promoter of Agrobacterium tumefaciens,
  • the subject of the invention is any recombinant nucleotide sequence as described above, containing upstream of said cDNA or its derived sequence, the constitutive double promoter 35S (Pd35S) of CaMV, or the promoter PCRU of the gene radish cruciferin, or the PGEA1 or PGEA6 promoter from Arabidop is thaliana, or the PSP super-promoter from Agrobacterium tumefaciens, or the PAR-IAR promoter from rice, the HMGW promoter from barley or the p ⁇ zein promoter from corn.
  • sequences coding for an addressing peptide used in the context of the present invention can be of plant, human or animal origin.
  • nucleotide sequence of 69 nucleotides (indicated in the examples which follow) coding for the prepeptide (signal peptide) of 23 amino acids of sporamine A in sweet potato, this signal peptide allowing the entry of the recombinant polypeptides of the invention in the secretion system of plant cells transformed according to the invention (namely mainly in the endoplasmic reticulum),
  • nucleotide sequence of 42 nucleotides (indicated in the examples which follow) coding for the N-terminal propeptide for vacuolar addressing of 14 amino acids of sporamine A in sweet potato, allowing the accumulation of the recombinant polypeptides of the invention in the vacuoles of plant cells transformed according to the invention,
  • the invention has for ob
  • the subject of the invention is also
  • the subject of the invention is also any recombinant nucleotide sequence as described above, containing a sequence
  • the recombinant nucleotide sequences of the invention also contain a nucleotide sequence which can be used as a marker for said recombinant sequences, in particular for differentiating (and thus selecting) those of plant cells which are transformed by said recombinant sequences from those which are not. not.
  • such a nucleotide sequence which can be used as a marker for said recombinant sequences is chosen from the antibiotic resistance genes, in particular the kanamycin resistance gene.
  • the subject of the invention is also any vector, in particular plasmid, containing a recombinant nucleotide sequence according to the invention, inserted at a site which is not essential for its replication.
  • the invention also relates to any cell host, in particular any bacterium such as Agrobacterium tumefaciens, transformed by a vector as defined above.
  • the invention also relates to a process for obtaining recombinant pancreatic lipase, or a protein or a derived polypeptide, characterized in that it comprises:
  • the subject of the present invention is any process for obtaining a recombinant human pancreatic lipase in the form of an active enzyme, and / or a (or more) polypeptide (s) derived therefrom , in particular by addition and / or deletion and / or substitution of one (or more) amino acid (s), this (or these) derived polypeptide (s) having lipase activity, characterized in that 'He understands:
  • the transformation of plant cells can be carried out by transfer of the recombinant nucleotide sequence of the invention into the protoplasts, in particular after incubation of the latter in a polyethylene glycol (PEG) solution ) in the presence of divalent cations (Ca- + )
  • PEG polyethylene glycol
  • the transformation of plant cells can also be carried out by electroporation
  • the transformation of plant cells can also be carried out by using a gene cannon allowing the projection, at very high speed, of metallic particles covered with recombinant nucleotide sequences according to the invention, thus delivering genes to the cell nucleus.
  • Another method of transformation of plant cells is that of cytoplasmic or nuclear micro-injection
  • plant cells are transformed by bringing the latter into contact with a cellular host transformed by a vector according to the invention, as described above, said host cellulan e being capable of infecting said plant cells by permitting integration into the genome of the latter, recombinant nucleotide sequences of the invention initially contained in the genome of the abovementioned vector
  • the above-mentioned cell host used is Agrobacterium tumefaciens, in particular according to the methods described in the articles by Bevan,
  • rapeseed tobacco, but, peas, tomato, carrot, wheat, barley, potato, soy, sunflower, lettuce, rice and alfalfa
  • the plant cells transformed according to the invention are cultured in vitro, in particular in bioreactors, in a liquid medium, or in immobilized form, or even by cultivation of transformed roots / // viii o
  • the culture media /// vili mentioned above are then recovered to extract, and if necessary purify, in particular by chromatography, the pancreatic lipase, in particular LPH, the ecombinant and / or the proteins or polypeptide (s ) derivative (s) defined above pi oduits by said transformed cells cultured /// vitro
  • the ti ans oi mation of plant cells is followed by a step of obtaining transformed plants by culturing said transf cells formed in an appiated environment Pancre
  • the transformed plants used for the recovery of pancreatic lipase, in particular of the recombinant LPH, and / or of the protein (s) or polypeptide (s) derived in the context of the aforementioned process are those of the TO generation, namely those obtained from culture of transformed cells of the invention on an appropriate medium, or advantageously those of the following generations (T1, T2, etc.) obtained, for example by self-fertilization of plants of the previous generation and in which the recombinant nucleotide sequences of the invention reproduce according to Mendel's laws.
  • the invention relates more particularly to a process for obtaining, as described above, the recombinant LPH, characterized in that it comprises:
  • the plant cells transformed in the methods described above are advantageously chosen from those of tobacco, rapeseed, but, peas, tomato, carrot, wheat, barley, potato, soy, sunflower, lettuce, rice and alfalfa.
  • the invention relates more particularly to a process for obtaining recombinant LPH, characterized in that it comprises
  • the invention has also poui ob
  • the invention also relates to any transgenic cell as described above, containing one (or more) protein otein (s) or recombinant polypeptide (s) according to the invention, such as the LPH said plant cell still being designated plant cell with enzymatic activity, and more particularly with lipase activity as defined below
  • the invention also relates to genetically transformed seeds containing one (or more) nucleotide sequence (s) recombinant (s) as (s) as dec ⁇ ⁇ te (s) above, according to the invention, integrated (s) stably in their genome
  • the invention also relates to the transgenic seeds described above, and containing one (or more) protein (s) or recombinant polypeptide (s) according to the invention, such as LPH u-tombin me. said seeds also being designated seeds with enzymatic activity, and more particularly with activity as defined below
  • the seeds transformed according to the invention are those harvested from plants genetically transformed according to the invention, these transformed plants being either those of the TO generation mentioned above and obtained by culturing cells transformed according to the invention, or those of the generations following (Tl, T2 etc) obtained for example by auto-fertilization or by crossing plants of previous generations (as indicated above)
  • the invention also relates to plants and parts of plants (in particular explants, stems, leaves, seeds, acines, seeds, pollen, etc.) genetically transformed, characterized in that they (they) contain one (or more) overlapping nucleotide sequence (s) according to the invention, integrated so stable in their genome
  • the invention also relates to the transgenic plants or parts of plants described above, containing one (or more) protein (s) or recombinant polypeptide (s) according to the invention, such as LPH, the said (e) s plants or parts of plants still being designated plants or parts of plants with enzymatic activity, and more particularly with lipase activity as defined below.
  • the invention has more particularly for obi and, the aforementioned transformed plants, as obtained by culturing cells or seeds as described above, according to the invention
  • the plants, or parts of plants, transferred according to the invention are advantageously chosen from rapeseed, tobacco, corn, peas, tomatoes, carrots, wheat, barley, apple, soia, sunflower, rice, lettuce, alfalfa and beetroot, or parts of these plants
  • the present invention has poui ob
  • the lipase (or lipolytic) activity of plants or parts of plants, and plant extracts with enzymatic activity of the invention can be measured in particular according to the method of Duan R et al 1991 using a short chain triglyceride (such as t ⁇ butynne) as a substitute or by Egloff's method
  • the enzymatic activity is i provided in U units, a U unit corresponding to the quantity of enzyme required to release one ⁇ mole of free fatty acids per minute at 37 ° C. under optimal pH conditions
  • the plant extracts with enzymatic activity of the invention are advantageously such that the percentage by weight of enzymatically active recombinant polypeptides, represents approximately 0.1% to 20%, in particular approximately 1% to approximately 15%, relative to the total weight of pi oteines pi esentes in these extracts
  • the invention relates more particularly to the following plant extracts with enzymatic activity - extracts of leaves and / or of seeds and / or seeds of plants, as obtained by transformation of the cells of explants of these plants with the sequence Pd35S-PSLPH- LPH, or the sequence Pd35S-PS- LPH, or the sequence Pd35S-PPS-LPH, or the sequence Pd35S-PSLGL-LPH, according to one of the methods described above, and containing the recombinant LPH.
  • the tobacco leaf extract as obtained by transformation of tobacco leaf explant cells with the sequence Pd35S-PS- LPH, or the sequence Pd35S-PPS- LPH, according to the method described above,
  • the tobacco leaf extract as obtained by transformation of tobacco leaf explant cells with the sequence Pd35S-PSLGL-LPH or the sequence Pd35S-PSLPH-LPH, according to the method described above,
  • rapeseed extract as obtained by transformation of explant cells from rapeseed leaves with the PCRU-PS-LPH sequence, or the PCRU-PPS-LPH sequence, or the PGEA I - PSLPH sequence - LPH, or the sequence PGEA6- PSLPH -LPH, according to the method described above,
  • the subject of the present invention is a recombinant pancreatic lipase or derivative protein or polypeptide characterized in that it is obtained according to the method according to the invention.
  • the present invention relates in particular to any enzymatically active recombinant pancreatic lipase, in particular LPH, or proteins or polypeptides derived therefrom, in particular by addition and / or deletion and / or substitution of one (or more) amino acid (s) , these derived polypeptides having lipase activity, as obtained in essentially pure form by implementing one of the methods described above of the invention, these methods comprising a step of purifying the recombinant polypeptides of the invention, in particular by chromatography carried out from the enzymatic extracts described above.
  • pancreatic lipase or derived polypeptides exhibiting lipase activity, according to the invention, is understood to mean any recombinant polypeptide capable of exhibiting lipase activity of the pancreatic type, for example as measured according to the Duan method or the Egloff method.
  • the invention relates more particularly to recombinant LPH as obtained by purification of the enzymatic extract of tobacco leaves or seeds, these leaves or seeds coming from transformed tobacco plants, themselves obtained from transformed tobacco cells with the sequence Pd35S-PSLGL-LPH or sequence Pd35S-PSLPH-LPH according to the method described above, said recombinant LPH exhibiting lipase activity as described above.
  • the invention relates to antibodies directed against the recombinant polypeptides of the invention, and more particularly those directed against the recombinant LPH according to the invention.
  • Such antibodies can be obtained by immunization of an animal with these polypeptides followed by the recovery of the antibodies formed. It goes without saying that this production is not limited to polyclonal antibodies.
  • the invention also relates to the use of plants, parts of plants, plant cells, or seeds transformed according to the invention, for obtaining one (or more) proteins or recombinant polypeptide (s) according to the invention.
  • invention such as recombinant LPH, or its derived polypeptides as defined above, in particular by implementing one of the above-mentioned methods of the invention, said recombinant polypeptides being in essentially pure form or contained in plant extracts with enzymatic activity as defined above.
  • the invention relates in particular to:
  • the invention relates more particularly to the use as food of plants, or parts of plants, in particular leaves, fruits, seeds with enzymatic activity according to the invention.
  • the subject of the invention is more particularly functional food consisting of a plant with enzymatic activity as described above, or of parts of this plant, in particular of leaves or fruits or of seeds derived from the latter, and likely (s) to have an edible character in l 'Man or animal
  • the invention also relates to any functional food containing one (or more) plant (s) with enzymatic activity as described above, and / or parts of this (these ) plant (s), in particular leaves and / or seeds and / or fruits of this (these) plant (s), and / or one (or more) plant extract (s)
  • plants with enzymatic activity as described above, and / or one (or more) protein or recombinant polypeptide (s) of the invention, if necessary in combination with a ( or more) other edible compound (s).
  • the subject of the invention is more particularly any food composition mentioned above containing recombinant LPH obtained according to the invention in essentially pure or partially pure form or in the form of plants and / or enzymatic extracts as described above possibly associated with one or more other enzymatic activities useful for digestion, preferably an enzymatic activity of the amylase, protease type (in particular trypsin and chymotrypsin and / or elastase)
  • the plants or parts of plants, contained in the aforementioned food composition are in the form of ground materials
  • the foods according to the invention also referred to as functional foods, or the food compositions according to the invention are more particularly intended to facilitate the absorption of animal or vegetable fats ingested by a healthy individual or suffering from one or more pathologies affecting or not The rate of production of gastric and / or pancreatic lipase
  • the foods or food compositions of the invention are advantageously used as nutritional supplements
  • the invention also relates to the use of plants, or parts of plants, especially leaves and / or fruits and / or seeds, or plant cells with enzymatic activity according to the invention, or plant extracts with enzymatic activity as defined above, or contain recombinant polypeptides according to invention, such as the recombinant LPH, or its derived polypeptides as defined above, for obtaining medicaments (or compositio pharmaceuticals) intended to facilitate the absorption of animal or plant gi aisses ingested by a healthy individual or suffering from one or more pathologies affecting or not affecting the rate of production
  • compositions according to the invention are also more particularly intended for the treatment of pathologies linked to the insufficiency of lipases (in particular gastric and / or pancreatic episodes) in the organism, and more particularly of pathologies such as cystic fibrosis, exocrine pancreatic insufficiency, and P obesity
  • the invention relates more particularly to any pharmaceutical composition, characterized in that it comprises plants, or parts of plants according to the invention, and / or plant extracts according to the invention, and / or proteins or of polypeptides or of association thereof according to the invention, where appropriate in combination with one or more pharmaceutically acceptable vehicles or excipients
  • the invention relates more particularly to any pharmaceutical composition mentioned above containing recombinant LPH in essentially pure form or in the form of enzymatic extracts as described above.
  • the subject of the invention is more particularly any pharmaceutical composition mentioned above containing recombinant LPH in essentially pure or partially pure form or in the form of enzymatic extracts as described above associated with one or more other enzymatic activities useful for digestion, preferably an enzymatic activity of the amylase, protease type (in particular trypsin and chymotrypsin and / or elastase).
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are preferably administrable by oral route, and are presented in particular in the form of capsules, tablets or powders to be diluted.
  • the daily dosage in humans is advantageously from approximately 200 mg to approximately 1000 mg, preferably distributed at the time of the main meals, when said pharmaceutical compositions contain enzymatic extracts as described above, and from approximately 100 mg to about 500 mg, when said pharmaceutical compositions contain recombinant polypeptides according to the invention in essentially pure form.
  • a subject of the invention is also the use of plants, or parts of plants, in particular leaves and / or fruits and / or seeds, or plant cells with enzymatic activity according to the invention, or plant extracts with activity enzymatic as defined above, or of recombinant polypeptides according to the invention, such as recombinant LPH, or its derived polypeptides as defined above, for the implementation of enzymatic reactions in the industrial, agro- food or agro-industrial, in particular in the fat industry, lipochemistry and the dairy industry.
  • the invention relates to any process, in particular of enzymatic bioconversion, or of biocatalysis, by implementation of one or more enzymatic reactions in the industrial, agro-food or agro-industrial field, in particular in the industry of fatty substances, lipochemistry and the dairy industry, these enzymatic reactions being carried out by means of plants, or parts of plants, in particular leaves and / or fruits and / or seeds, or plant cells with enzymatic activity according to • l invention, or plant extracts with enzymatic activity as defined above, or of recombinant polypeptides according to the invention, such as recombinant LPH, or its derived polypeptides as defined above.
  • a more particular subject of the invention is enzymatic preparations for industrial, food-processing or agro-industrial use, capable of being used in the context of the implementation of a process as described above, and comprising plants, or parts of plants according to the invention, and / or extracts of plants according to the invention, and / or proteins or polypeptides or association of these according to the invention if necessary in combination with one (or more) additives) or other enzyme (s) capable of being used in the context of the aforementioned industrial application .
  • the invention relates more particularly to the use of plants, or parts of plants, in particular leaves and / or fruits and / or seeds, or plant cells with enzymatic activity according to the invention, for the implementation, with industrial scale, reactions of enzymatic bioconversions, or biocatalysts, such as hydrolyses, or enzymatic trans-esterifications.
  • the plants with enzymatic activity, or parts of these plants, in particular the leaves and / or fruits and / or seeds, or of plant cells, according to the invention are used both as an enzymatic source and reaction substrate.
  • the subject of the invention is also any biocatalysis process using plants, or parts of plants, in particular leaves and / or fruits and / or seeds, or plant cells with enzymatic activity according to the invention, and more particularly plants containing LPH, said plants, or parts of plants, being used both as an enzymatic source and reaction substrate.
  • the invention relates more particularly to the use of plants with enzymatic activity, or of parts of these plants, according to the invention, for obtaining biofuels.
  • the subject of the present invention is any process for obtaining biofuel by adding alcohol, in particular methanol or ethanol, to a ground material of all or part of plants transformed according to the invention, advantageously to a ground material rapeseed, sunflower or soybean seeds, transformed according to the invention, and recovery of biofuel, in particular by filtration.
  • the invention also relates to the esters of vegetable fatty acids as obtained by implementing the aforementioned process, in particular the methyl ester of oleic acid.
  • the subject of the invention is also any biofuel as obtained by implementing a method as described above, and more particularly any aforementioned biofuel comprising esters of vegetable fatty acids.
  • the invention relates more particularly to any biofuel as obtained by implementing the aforementioned method from rapeseed, and comprising a methylester of oleic acid.
  • the invention also relates to the use of the above-mentioned antibodies directed against the recombinant polypeptides of the invention, for the implementation of a method for detecting or assaying LPH in a biological sample likely to contain it
  • the invention relates more particularly to the use of these antibodies for the implementation of a method of /// in vitro diagnosis of pathologies linked to overproduction, or conversely, to insufficiency, or absence of lipase production in the body
  • This diagnostic method /// vnio carried out from a biological sample taken from a patient, includes a step of bringing this sample into contact with one or more anticoips according to the invention, followed by a step of detecting possible antibody-LPH complexes formed during the previous step.
  • the invention also relates to a kit for carrying out a method of detection or diagnostic /// vitro mentioned above, comprising
  • Antibodies as described above, advantageously labeled in a radioactive or enzymatic manner, as well as the active agents for the constitution of a medium suitable for carrying out the immunological leaction between these antibodies and LPH,
  • the invention also relates to the association of the lipase activity of pancreatic type obtained according to the invention with an activity of colipase type and the use of the product of this association especially in the context of the treatment of pathologies associated with a deficit of lipid pioduction in the organism, such as cystic fibrosis or in the context of the treatment of food disorders, such as obesity
  • the colipase type activity can come from plant extracts expressing a recombinant colipase (for example human colipase) or a derivative of this colipase, a derivative being any protein or polypeptide derived from the abovementioned colipase by addition and / or suppiession and / or substitution of one (or more) amino acid (s), this protein or this polypeptide derived having a colipase type activity More particularly, the colipase type activity can come from a colipase or from a derivative thereof purifies or partially purified from plants or plant extracts expressing a recombinant colipase (for example human pancreatic colipase) or a nve of this colipase
  • the activity of colipase type for example human colipase can therefore be produced from a transgenic plant according to the methods described above for the production of pancreatic lipase Colipase can in particular be co-expressed in has the same transgenic plant as pancre
  • the invention therefore also relates, if appropriate analogously to what is described for the pancreatic lipase activity according to the invention, the use of a recombinant nucleotide sequence containing, on the one hand, a cDNA coding for a colipase mammals or for a derived protein or polypeptide, and on the other hand, the elements allowing a plant cell to produce the colipase, or the derived protein or polypeptide, encoded by said cDNA, in particular a promoter and a transcription terminator recognized by the transcriptional machinery of plant cells, for the transformation of plant cells with a view to obtaining, from these cells, or from plants obtained from the latter, a recombinant colipase from mammals, or from a derived protein or polypeptide, the use of the sequences for the co-transformation of plant cells with a view to obtaining, from these cells, or from plants o obtained from the latter, from a recombinant mammalian pancreatic lipase and co
  • the recombinant nucleotide sequence characterized in that it contains on the one hand the coding sequence for a colipase or a derived protein or polypeptide and on the other hand, the elements allowing a plant cell to produce a pancreatic colipase or a protein or derived polypeptide encoded by said sequence, in particular a promoter and a transcription terminator recognized by the transcription machinery of plant cells,
  • the recombinant nucleotide sequence characterized in that it contains on the one hand the sequences coding for a pancreatic lipase and a colipase or the proteins or polypeptides derived therefrom and on the other hand, the elements allowing a plant cell to produce a lipase pancreatic and a colipase or the proteins or polypeptides derived encoded by said sequence, in particular a promoter and a transcription terminator recognized by the transcriptional machinery of plant cells.
  • a vector in particular a plasmid, containing a nucleotide sequence as defined above, inserted at a site which is not essential for its replication.
  • a cell host in particular any bacterium such as Agrobacterium tumefaciens, transformed by a vector as defined above, a process for obtaining recombinant colipase, or a protein or a derived polypeptide, characterized in that it understands
  • a process for the co-production of recombinant pancreatic lipase and colipase, or of derived protein or polypeptides characterized in that it comprises:
  • rapeseed tobacco, corn, peas, tomatoes, carrots, wheat, barley, apples of earth, soy, sunflower, lettuce, rice; alfalfa, and beet.
  • pancreatic lipase and colipase recombinant or derived protein or polypeptide characterized in that it is obtained according to the method of the invention
  • the plant extract with enzymatic activity as obtained by implementing a method according to the invention characterized in that it contains recombinant pancreatic lipase and / or recombinant colipase or the proteins or polypeptides derived , - pharmaceutical compositions, characterized in that they comprise an activity of the pancreatic colipase type (for example human pancreatic colipase), or of its derivatives, possibly associated with an activity of the pancreatic lipase type (for example LPH), the case appropriate in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle
  • the process in particular of enzymatic bioconvei sion, or of biocatalysis, by implementing one or more enzymatic reactions in the industrial, agro-food or agro-industrial field, in particular in the industry of fatty substances, of lipochemistry and the dairy industry, these enzymatic reactions being carried out by means of plants, or parts of plants, in particular leaves and / or fruits and / or seeds and / or cells of plants, genetically transformed, according to the invention, from an activity of the pancreatic colipase type (for example human pancreatic colipase), or of derived polypeptides possibly associated with an activity of the pancreatic lipase type (for example LPH) - the enzymatic preparations for industrial, agro-food or agro-industrial use including a (or more) plant (s) with enzymatic activity according to the invention, and / or a purified or partially purified pancreatic colipase (pa xample human pancreatic colipase),
  • pancreatic colipase type for example colipase pancreatic human
  • pancreatic lipase type for example LPH
  • the pancreatic colipase type for example human pancreatic colipase possibly associated with an activity of the pancreatic lipase type (for example LPH)
  • alcohol in particular methanol or ethanol
  • LPH pancreatic lipase
  • the double constitutive promoter 35S (Pd35S) of CaMV (cauliflower mosaic virus). It corresponds to a duplication of the transcription activating sequences located upstream of the TATA element of the natural 35S promoter (Kay et al., 1987);
  • polyA 35S terminator which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the sequence of the circular double-stranded DNA virus of the cauliflower mosaic producing the 35S transcript.
  • pBIOCA This binary plasmid derives from pGA492 (An et al, 1986) which contains between the right and left borders; derived from the plasmid pTiT37 of Agi obacterium tumefaciens, on its transfer DNA, the following sequences: the promoter constituting the NOS gene of nopaline synthase, the coding sequence of the nptll gene coding for the neomycin phosphotransferase II deleted from the region of the first 8 codons including the initiator codon methionine ATG and fused to the sequence of the first 14 codons of the coding sequence of the nos gene, the coding sequence of the nos gene devoid
  • the plasmid pGA492 was doubly digested with Sac1 (restriction site of the polylinker) and by Scal (restriction site present in the sequence of the cat gene) and then subjected to the action of the T4 DNA polymerase enzyme (New England Biolabs) according to the manufacturer's recommendations.
  • Ligation of the modified plasmid (20 ng) was carried out in a 10 ⁇ l reaction medium containing 1 ⁇ l of T4 DNA ligase x 10 buffer (Amersham); 2.5 U of T4 DNA ligase enzyme (Amersham) at I 4 ° C for 16 hours.
  • the Escherichia co / i DH5 ⁇ bacteria, made previously competent, were transformed (Hanahan et al., 1983).
  • the HindIII restriction site of the plasmid DNA of the retained clone was modified into an EcoRI restriction site using a phosphorylated HindIII-EcoRI adapter (Stratagene Cloning Systems).
  • 500 ng of plasmid DNA of the retained clone were digested with Hindlll, dephosphorylated by the enzyme alkaline phosphatase of calf intestine (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's recommendations and coprecipitated in the presence of 1500 ng of DNA adapter HindIII-EcoRI, 1/10 volume of 3M sodium acetate pH 4.8 and 2.5 volumes of absolute ethanol at -S0 ° C for 30 min.
  • the resulting binary plasmid which only has the last 9 codons of the coding sequence of the cat gene and whose EcoRI site is unique, was called pBIOC4.
  • the expression cassette consisting of the Pd35S promoter and the polyA 35S terminator, was isolated from the plasmid p.HT 163 ⁇ .
  • the plasmid pJIT163 ⁇ derives from the plasmid pJIT 163 which itself derives from the plasmid pJIT60 (Guerineau and Mullineaux, 1993). Plasmid pJIT 163 has an ATG codon between the sites Hindlll and Sali du polylinker.
  • the plasmid DNA pJIT163 was digested twice with Hindlll and SalI, purified by electrophoresis on 0.8% agarose gel, electroeluted, precipitated in the presence of 1/10 of 3M volume.
  • the plasmid DNA of the clone pJIT I 63 ⁇ retained was digested with Sacl and Xhol.
  • Sacl-Xhol fragment carrying the expression cassette was purified by electrophoresis on 0.8% agarose gel, electroeluted, precipitated in the presence of 1/10 volume of 3M sodium acetate pH 4.8 and 2 , 5 volumes of absolute ethanol at -80 ° C for 30 min., Centrifuged at 12,000 g for 30 min., Washed with 70% ethanol, dried, then subjected to the action of the enzyme Mung Bean Nuclease ( New England Biolabs) according to the manufacturer's recommendations.
  • This purified insert (200 ng) was cloned into the plasmid DNA of pBIOC4 (20 ng) digested with EcoRI, treated with the enzyme Mung Bean Nuclease and dephosphorylated by the enzyme alkaline phosphatase from calf intestine (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's recommendations.
  • the ligation reaction was carried out in 20 ⁇ l in the presence of 2 ⁇ l of T4 DNA ligase x 10 buffer (Amersham), 2 ⁇ l of 50% polyethylene glycol 8000 and 5 U of T4 DNA ligase enzyme (Amersham) at 14 ° C for 16 hours.
  • LPH Human pancreatic lipase
  • the plasmid containing the complete cDNA coding for LPH was digested in order to suppress the sequence coding for the signal peptide of LPH consisting of 16 amino acids. This sequence has been replaced by that coding for the signal peptide PS of sweet potato sporamine A (Murakami et al., 1986; Matsukoa and Nakamura, 1991) of 23 amino acids (A TG AAA GCC TIC ACA CTC GCT CTC
  • PCR were purified by electrophoresis on 2% agarose gel, electroeluted, precipitated in the presence of 1/10 of volume of 3M sodium acetate pH 4.8 and
  • the plasmid DNA of the clones obtained was extracted according to the alkaline lysis method and analyzed by enzymatic digestion with restriction enzymes.
  • the plasmid DNA of certain retained clones was verified by sequencing using the T7 * M sequencing kit marketed by Pharmacia according to the dideoxynucleotide method.
  • Mature LPH is Ser-Lys. From the resulting plasmid, the fragment carrying the sequence of PS-LPH was isolated by enzymatic digestion, purified by electrophoresis on 0.8% agarose gel, electroeluted, precipitated with alcohol, dried. Then, this fragment of treated DNA was ligated to the plasmid DNA of pBIOC21 digested, treated and dephosphorylated by the enzyme alkaline phosphatase from calf intestine.
  • the plasmid containing the complete cDNA coding for LPH was digested in order to suppress the sequence coding for the signal peptide of LPH consisting of 16 amino acids.
  • This sequence has been replaced by that coding for the signal peptide PPS of sweet potato sporamine A (Murakami et al., 1986; Matsukoa and Nakamura, 1991) of 37 amino acids (A TG AAA GCC TIC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TA T CTC CTG CGC AAT CCA GCC CAT TCC AGG TTC AA T CGC A TC CGC CTC CGC ACC ACA CAC GAA CCC GCC) following the PCR amplification protocol described above in paragraph I. Fragments of DNA from PCR amplification were processed in a similar manner to that described in 1. 1. 1. 1.
  • the PPS and mature LPH sequences were cloned while keeping their reading phases open.
  • the cleavage sequence between the two sequences is Ala-Lys.
  • the resulting plasmid is treated as described in 1. 1. 1.
  • the binary vector plasmid DNA was introduced by direct transformation into the LBA4404 strain of Agrobacterium tumefaciens according to the method of
  • Rabbit gastric lipase is synthesized in the form of a precursor composed of a signal peptide of 22 amino acids, located at the NH 2 ⁇ terminal end and preceding the polypeptide sequence of mature lipase, the clone pJ1010 containing the complete cDNA coding for rabbit gastric lipase is described in European patent application EP542629
  • the plasmid containing the complete cDNA coding for LPH was digested in order to suppress the sequence coding for the signal peptide of LPH consisting of 16 amino acids.
  • This sequence has been replaced by that coding for the signal peptide of rabbit gastric lipase consisting of the following 22 amino acids: MWVLFMVAALLSALGTTHGLFG (A TG TCC, GTG GIT TTC A TG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CA T GGT CTT TTT GGA) by following the PCR amplification protocol described above in paragraph I.
  • the DNA fragments resulting from the PCR amplification were treated in a similar manner to that described in 1. 1 1
  • the PSLGL and mature LPH sequences were cloned by keeping their reading phases open (i.e., so that they constituted a single open reading phase).
  • the cleavage sequence between the PSLGL and mature LPH sequences is Gly-Lys.
  • the resulting plasmid is treated as described in LA. at.
  • the binary vector plasmid DNA was introduced by direct transformation into the LBA4404 strain of Agrobacterium tumefaciens according to the method of Holsters et al. (1978).
  • the plasmid containing the complete cDNA coding for the LPH (465 amino acids) comprises the signal peptide PSLPH of 16 amino acids (A TG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA G TA GCA GGA).
  • the DNA fragment carrying the complete cDNA coding for the LPH was treated in a similar manner to that described in 1.1. 1.
  • the cleavage sequence between the two sequences coding for PSLPH and LPH is GLy-Lys.
  • the binary vector plasmid DNA was introduced by direct transformation into the LBA4404 strain of Agrobacterium tumefaciens according to the method of Holsters et al. (1978).
  • the binary plasmid pB ⁇ OC21 described in II. is also used.
  • Human pancreatic colipase (COLPH) is naturally synthesized in the form of a precursor of 1 12 amino acids
  • the mature COLPH protein consists of 95 amino acids.
  • Rabbit gastric lipase is synthesized in the form of a precursor composed of a signal peptide of 22 amino acids, located at the NH2-terminal end and preceding the polypeptide sequence of mature lipase, the clone pJO101 containing the complete cDNA coding for rabbit gastric lipase is described in European patent application EP542629
  • the plasmid containing the complete cDNA coding for COLPH was digested in order to suppress the sequence coding for the signal peptide of COLPH consisting of 17 amino acids. This sequence has been replaced by that coding for the signal peptide of rabbit gastric lipase consisting of the following 22 amino acids: MWVLFMVAALLSALGTTHGLFG (A TG TGG GTG CTT TTC
  • the PSLGL and mature COLPH sequences were cloned by keeping their reading phases open (i.e., so that they constituted a single open reading phase).
  • the cleavage sequence between the PSLGL and mature COLPH sequences is Gly-Ala.
  • the resulting plasmid is treated as described in 1.1.1.
  • the plasmid DNA of the binary vector was introduced by direct transformation into the LBA4404 strain of Agrobacterium tumefaciens according to the method of Holsters and a /. (1978).
  • the plasmid containing the complete cDNA coding for the COLPH (1 12 amino acids) comprises the signal peptide PSCOLPH of 17 amino acids (A TG GAG AAG ATC CTG A TC CTC CTG CTT GTG GCC CTC TCT GTG GCC TA TGCA).
  • the DNA fragment carrying the full cDNA coding for COLPH was treated in a similar manner to that described in 1. 1.1
  • the cleavage sequence between the two sequences coding for PSCOLPH and COLPH is Ala-Lys. ⁇
  • the binary vector plasmid DNA was introduced by direct transformation into the LBA4404 strain of Agrobacterium tumefaciens according to the method of Holsters et al. (1978).
  • LPH human pancreatic lipase
  • the PCRU promoter corresponding to the 5 ′ non-coding region of the gene for the seed reserve protein, radish CRUCIFERIN A (Depigny-This et al, 1992) and allowing specific expression in the seeds; 2. the transcription terminator sequence, polyA 35S terminator, which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the sequence of the circular double-stranded DNA viais of the cauliflower mosaic producing the 35S transcript.
  • the fragment "EcoRI treated with Klenow-BamHI", containing the promoter PCRU was isolated from the plasmid pBI221 -CRURSP derived from pBI221 (marketed by Clontech) by replacing the 35S promoter with the PCRU promoter.
  • the expression cassette consisting of the PCRU promoter and the polyA 35S terminator, was isolated from pBIOC27 by total Xhol digestion followed by partial EcoRI digestion. It was purified by agarose gel electrophoresis
  • the ligation was carried out with 20 ng of the dephosphorylated vector described above and 200 ng of XhoI-EcoRI DNA fragments described above in a 20 ⁇ l reaction medium in the presence of 2 ⁇ l of T4 DNA ligase x 10 buffer ( Amersham), 2 ⁇ l of 50% polyethylene glycol 8000 and 5 U of T4 DNA ligase enzyme (Amersham) at 14 ° C for 16 hours.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ bacteria previously made competent, have been transformed
  • the fragment carrying the sequence PSLPH-LPH was ligated to the plasmid DNA of pBIOC28 digested, treated and dephosphorylated by the enzyme alkaline phosphatase of intestine of calf (Boehringer Mannheim) according to the recommendations of the manufacturer.
  • the fragment carrying the sequence PSCOLPH-COLPH was ligated to the plasmid DNA of pBIOC28 digested, treated and dephosphorylated by the enzyme phosphatase alkaline calf intestine (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's recommendations.
  • PSCOLPH-COLPH were performed as previously described.
  • the binary vector plasmid DNA was introduced by direct transformation into the LBA4404 strain of Agrobacterium tumefaciens according to the method of Holsters et al. (1978). V. CONSTRUCTION OF CHEMICAL GENES ENCODING THE
  • Ad35S 35S constitutive promoter of CaMV (cauliflower mosaic virus). It corresponds to a duplication of the transcription activating sequences located upstream of the TATA element of the natural 35S promoter (Kay et al., 1987);
  • the transcription terminator sequence polyA 35S terminator, which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the sequence of the circular double-stranded DNA virus of the cauliflower mosaic producing the 35S transcript;
  • the transcription terminator sequence polyA NOS terminator, which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the nopaline synthase gene of the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens nopaline strain.
  • the plasmid where the sequence coding for PSLPH-LPH is placed under the control of PAR-IAR was obtained by cloning the fragment carrying the sequence coding for PSLPH-LPH in pBSU-PAR-1AR-TNOS.
  • the fragment carrying the sequence coding for PSLPH-LPH was isolated by enzymatic digestion, purified by electrophoresis on 0.8% agarose gel, electroeluted, subjected to alcoholic precipitation, dried and then treated.
  • the plasmid pBSII-PAR-IAR-tNOS has been digested, purified, treated and dephosphorylated by the enzyme calf alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim) according to the manufacturers' recommendations Ligation, transformation of bacteria Escherichia coli DH5 ⁇ made previously competent, analysis of the plasmid DNA of the clones obtained and the nucleotide sequence of the fragment coding for the recombinant protein PSLPH-LPH were carried out as previously
  • the plasmid pBSII-PAR-IAR-TNOS results from cloning at the sites "Eco0109I treated with Klenow and Kpnl" of pBSII-TNOS of the SnaBI-Kpnl fi agment carrying the sequence corresponding to "PAR-IAR-start of the coding sequence for the gus "gene isolated from the plasmid pAct I -F4
  • the ligation, the transformation of the Escherichia coli DH5 bacteria made previously competent, the analysis of the plasmid DNA of the clones obtained were carried out as described above
  • the plasmid pBSII-TNOS was obtained by cloning at the dephosphorylated EcoRV site of pBSIISK + as specialized by Su atagene, from the SacI fragment.
  • the plasmid or the coding sequence for PSLPH-LPH is placed under the control of Pd35S was obtained by cloning at the "Kpnl and BamHI" sites of the plasmid pBSII-T35S of the fragment carrying the sequence corresponding to "Pd35S-PSLPH-LPH" isolated.
  • the ligation the transfer of Escherichia coli bacteria
  • the plasmid pBSI1-T35S was obtained by cloning at the Spel site treated with Klenow, dephosphorylated from the plasmid pBSIISK + as qualified by Stratagene, from the Smal-EcoRV fragment carrying the sequence T35S isolated from pJIT163 (described above) by double digestion enzymatic by Smal and EcoRV, subjected to purification by electrophoresis on agai gel at 2% Ligation, transformation of Eschei iclua coli DH5 ⁇ bacteria made previously competent, analysis of the plasmid DNA of the clones obtained were carried out as previously described
  • the plasmid p63 l results from the cloning of P ⁇ zein at the HindIII and Xbal sites of a plasmid pUC18 i enclosing, between its HindIII sites and EcoRI, the expression cassette "P35S-gus-TNOS" from pBI221 marketed by Clontech. It allows an expression in the albumen of corn seeds
  • polyA NOS terminator which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the nopaline synthase gene of the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens strain nopaline
  • the plasmid where the sequence coding for PSLPH-LPH is placed under the control of P ⁇ zein was obtained by cloning in the plasmid p63 of the fragment carrying the sequence coding for PSLPH-LPH Ligation, transformation of the bacteria Escherichia coli DH5 ⁇ made pi eally competent , the analysis of the plasmid DNA of the clones obtained were carried out as described above
  • the fragment carrying the sequence coding for PSCOLPH-COLPH was isolated by enzymatic digestion, purified by electrophoresis on 2% agarose gel, electroeluted, subjected to alcoholic precipitation, dry, then treated
  • the plasmid pBSII-PAR-IAR- TNOS was digested, purified, treated and dephosphorylated by the enzyme alkaline phosphatase from calves (Boehringer Mannheim) according to manufacturers' recommendations Ligation, transformation of bacteria Eschei ichia coli DH5 ⁇ rendered competent beforehand, the analysis of the plasmid DNA of the clones obtained and the nucleotide sequence of the fragment coding for the recombinant protein PSCOLPH-COLPH were carried out as described previously
  • the plasmid pBSII-PAR-IAR-TNOS used was disappointed in V 1 1
  • the plasmid where the sequence coding for PSCOLPH-COLPH is placed under the control of Pd35S was obtained by clon
  • the sequence coding for the tetrapeptide KDEL was introduced upstream of the STOP codon to allow adi essage in the endoplasmic reticulum.
  • the binary plasmid of coexpi ession denve of pBIOC2 II contains two expression cassettes each consisting of a piotor Pd35S and a polyA 35S terminator but which differs in the polylinker separating the promoter from the terminator.
  • One of the expression cassettes is that of pBIOC21 already described in I.
  • the other expression cassette was obtained by replacing the HindIII-BamHI-Smal-EcoRI polylinker of pJIT 163D with a HindIII-EcoRI adapter carrying the sites restriction Pacl, Ascl, Mlul and Hpal.
  • This adapter was obtained by renaturation of the 2 oligodeoxynucleotides 5 'AGC TGA TTA ATT AAG GCG CGC CAC GCG TTA AC 3' and 5 'AAT TGT TAA CGC GTG GCG CGC CTT AAT TAA TC 3' which are complementary for their 28 3 'nucleotides terminals.
  • One hundred microns of each of these two oligodeoxynucleotides were previously phosphorylated by the action of 10 U of T4 polynucleotide kinase enzyme
  • the reaction mixture was incubated at 80 ° C for 10 min; then slowly cooled to room temperature.
  • the DNA was then precipitated in the presence of 2.5 volumes of absolute ethanol at -80 ° C for 30 min., Centrifuged at 14000g at 4 ° C for 1 hour, washed with 70% ethanol, centrifuged at 14000g at 4 ° C for 10 min., dried, taken up in 10 ⁇ l of H20.
  • the Hindi II-EcoRI DNA fragment was then cloned at the HindIII-EcoRI sites of the plasmid DNA pJIT 163D previously dephosphorylated by the enzyme calf intestine alkaline phosphatase (New England Biolabs) according to the manufacturer's recommendations.
  • the ligation reaction was carried out in a reaction volume of 20 ⁇ l in the presence of 1 U of T4 DNA ligase (Gibco-BRL) for a total DNA concentration of 8.5 nM with a vector / insert molar ratio of 1 and 4 ⁇ l of T4 DNA ligase x 5 buffer (Gibco-BRL) at 25 ° C for 16 hours.
  • the bacteria made previously competent, have been transformed.
  • the fiagment coding for the expression cassette consisting of the Pd35S promoter and the poly 35S terminator was isolated by double digestion with Sacl and Xhol II was purified by electrophoresis on agarose gel.
  • the ligation was carried out in a reaction volume of 20 ⁇ l in the presence of 1 U of T4 DNA ligase (Gibco-BRL ) for a total DNA concentration of 8.5 nM with a vector / insert molar i of 1 and 4 ⁇ l of T4 DNA ligase x 5 buffer (Gibco-BRL) at 25 ° C for 16 hours
  • the resulting plasmid has was called pBIOC75 From pBIOC75, the DNA fi ament carrying the expression cassette consisting of the Pd35S promoter and the tei mmateui polyA 35S was isolated by digestion with Kpnl II was punished by electiophoiesis on agarose gel 0, 75%, then subjected to the action of the "Geneclean II" kit as approved by BIO101 according to the manufacturer's instructions Then, this DNA fi gment was ligated to the plasmid DNA of pBIOC21 digested with Kpnl and dephosphorylated by the enzyme calf intestine alkaline phosphatase (New England Biolabs) according to the manufacturer's recommendations The ligation was carried out in a reaction volume of 20 ⁇ l in the presence of 1 U of T4 DNA ligase (Gibco-BRL) for one c total DNA oncentiation of 8.5 nM with a vector / insei t molar
  • the cDNAs coding for the “PSLPH-LPH” and “PSCOLPH-COLPH” sequences were each cloned under the control of the constitutive promoter Pd35S and of the 35S terminator in the coexpression vector pB10C43
  • the ligation, the transformation of the Escherichia coli DH5 ⁇ bacteria made previously competent, the analysis of the plasmid DNA of the clones obtained were carried out as described above.
  • the spring rapeseeds (Brassica napiis cv WESTAR or Limagrain lines) are disinfected for 40 minutes in a 15% solution of Domestos (registered trademark). After 4 rinses with sterile water, the seeds are put to germinate, at a rate of 20 seeds per pot of 7 cm in diameter and 10 cm high, on mineral medium of Murashige and Skoog (Sigma M 5519) with 30g / l of sucrose and solidified with 5g / l agargel. These pots are placed in a culture chamber at 26 ° C with a photopiod of 16h / 8h and under a light intensity of the order of 80 ⁇ E m-- s "1
  • the cotyledons are removed sterile by cutting each petiole about 1 mm above the cotyledon node.
  • a preculture of Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404, containing the plasmids, namely, the plasmid pGAZE into which was inserted the sequence coding for human pancreatic lipase fused with that coding for an addressing signal (PS, PPS, PSLGL, PSPHP) under the control of the PCRU promoter (or Pd35S), is carried out in a 50 ml Erlenmeyer flask for 36 h at
  • This preculture is used to seed at 1% a new bacterial culture carried out under the same conditions. After 14 h the culture is centrifuged for 15 min at 3000 g and the bacteria are taken up in an equivalent volume of liquid germination medium. This suspension is distributed in petri dishes 5 cm in diameter at a rate of 5 ml / box
  • the severed end of the petiole is immersed for a few seconds in the agrobacteria solution thus prepared, then the petiole is pressed a few millimeters into the regeneration medium
  • This medium has the same basic composition as the germination medium with an additional 4 ⁇ ng / 1 of benzyl-amino-purine (BAP), phytohormone favoring the new formation of buds
  • BAP benzyl-amino-purine
  • Ten explants (cotyledon with petiole) are cultured per petri dish 9 cm in diameter (Greiner reference 664102).
  • the explants are subcultured in phytatray boxes (Sigma, reference PI 552) containing the preceding medium supplemented with a selective agent: 45 mg / l of kanamycin sulfate (Sigma, reference K4000) and a bacteriostatic: mixture of 1/6 (by weight) potassium salt of clavulanic acid and 5/6 sodium salt of amoxicillin (Augmentin injectable) at a rate of 600 mg / 1.
  • a selective agent 45 mg / l of kanamycin sulfate
  • a bacteriostatic mixture of 1/6 (by weight) potassium salt of clavulanic acid and 5/6 sodium salt of amoxicillin (Augmentin injectable) at a rate of 600 mg / 1.
  • the green buds that appear at the end of the second or third transplanting are separated from the explant and cultured individually in transparent pots 5 cm in diameter and 10 cm high containing a medium identical to the previous one but free of BAP.
  • the stem of the transformed bud is cut off and the bud is transplanted into a pot of fresh medium.
  • the roots are sufficiently developed to allow acclimatization of the seedling in a phytotron.
  • Buds that are not green or rooted are removed. These seedlings are then transplanted into 7 cm side pots filled with potting soil (standard NF U44551: 40% brown peat, 30% sifted heather and 30%> sand) saturated with water.
  • standard NF U44551 40% brown peat, 30% sifted heather and 30%> sand
  • the seedlings are repotted in 12 cm diameter pots filled with the same potting soil enriched with Osmocote late fertilizer (registered trademark), at a rate of 4 g 1 of potting soil and then transported to the greenhouse (class S2 ) regulated at 18 ° C, with two daily waterings of 2 minutes.
  • Osmocote late fertilizer registered trademark
  • the pods When the pods have reached maturity, they are harvested, dried and then beaten. The seeds obtained are used for the determination of biochemical activity.
  • the selection of the transgenic progeny is done by germination on a medium containing kanamycin sulfate at a rate of 100 to 150 mg / 1 (depending on the genotypes).
  • the operating conditions are identical to those described above except that the germinations are carried out in glass tubes with a single seed per tube. Only the seedlings developing secondary roots during the first three weeks are acclimatized in a phytotron before being transferred to the greenhouse.
  • the tobacco plants used for the transformation experiments are cultivated / ' // in vitro on the base medium of
  • thermoperiod 26 ° C during the day, 24 ° C at night.
  • the transformation technique used is derived from that of Horsch et al. (1985).
  • a preculture of Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 containing the plasmids is carried out for 48 hours at 28 ° C. with stirring, in LB medium supplemented with suitable antibiotics.
  • the preculture is then diluted to 50th in the same medium and cultivated under the same conditions. After one night, the culture is centrifuged (10 min., 3000 g), the bacteria are taken up in an equivalent volume of liquid MS30 medium (30 g / 1 sucrose) and this suspension is diluted with 10.
  • Explants of approximately 1 cm2 are cut from the leaves of the seedlings described above. They are then brought into contact with the bacterial suspension for 1 h, then dried quickly on filter paper and placed on a coculture medium (solid MS30). After 2 days, the explants are transferred to petri dishes on the MS30 regeneration medium, containing a selective agent, kanamycin (200 mg / 1), an antibiotic, augmentin (400 mg / 1) and the hormones necessary for the induction of buds (BAP, 1 mg / 1 and ANA, 0, 1 mg / 1). The explants are subcultured on the same medium after 2 weeks of culture. After 2 additional weeks, the buds are subcultured in petri dishes on the development medium composed of the MS20 medium supplemented with kanamycin and augmentin.
  • Tomato seeds cv. UC82B are sterilized with Domestos 10% 15 min. and rinsed 3 times in sterile water. The last rinse is carried out for 10 min. under agitation.
  • MSSV / 2 medium Merashige and Skoog base medium supplemented with Nitsch vitamins (Thomas and
  • the transformation technique used is derived from that of Fillatti et al. (1987).
  • a preculture of Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 containing the plasmids is carried out for 24 h at 28 ° C. with stirring in LB medium supplemented with suitable antibiotics.
  • the preculture is then diluted to 50th in the same medium and cultivated under the same conditions overnight.
  • the OD at 600 nm is measured, the agrobacteria are centrifuged (10 min, 3000 g) and taken up in liquid KCMS medium (described in the publication by Fillatti et al, 1987) so as to obtain an OD at 600 nm of 0, 8.
  • Technical improvements have been made to certain stages of the Fillatti et al. (1987).
  • the explants preculture and the coculture are carried out as described by Fillatti et al. (1987) except that the KCMS medium is supplemented with acetosyringone (200 mM).
  • the 2Z washing medium differs by the addition of cefotaxime 500 mg / 1 instead of carbenicillin.
  • the development medium used is composed of the basic medium of Murashige and Skoog (Sigma MS6899) added with the vitamins of Nitsch, sucrose at 20 g / 1, kanamycin at 50 mg / 1, augmentin at 200 mg / 1, ANA at 1 mg / 1 and zeatin at 0.5 mg / 1.
  • Seedlings are then regenerated from these calluses by modifying the hormonal and osmotic balance of the cells according to the method described by Vain et al. (1989). These plants are then acclimatized in the greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • the boxes of calluses thus bombarded are then sealed using Scellofrais® and then cultivated in the dark at 27 ° C.
  • the first transplanting takes place 24 hours later, then every fortnight for 3 months on medium identical to the medium of initiation with the addition of a selective agent, the nature and concentration of which may vary depending on the gene used (see paragraph 3)
  • the selective agents which can be used generally consist of active compounds of certain herbicides (Basta®, Round up®) or certain antibiotics (Hygromyci e , Kanamycin ).
  • calluses whose growth is not inhibited by the selection agent, usually and mainly composed of cells resulting from the division of a cell having integrated into its genetic heritage one or more copies of the selection gene
  • the frequency of obtaining such calluses is around 0.8 cal per bombed box
  • calluses are identified, individualized, amplified and then cultivated so as to regenerate seedlings. In order to avoid any interference with untransformed cells, all these operations are carried out on culture media containing the selective agent. The plants thus regenerated are acclimatized then cultivated in a greenhouse where they can be crossed or self-fertilized
  • XI ANALYSIS OF THE EXPRESSION OF HUMAN PANCREATIC LI PASS (LPH) IN TRANSGENIC TOBACCO PLANTS.
  • the lipase extraction protocol from tobacco leaves taken from plants in the greenhouse is as follows: 1 g of leaves (fresh weight) is ground in liquid nitrogen and then at 4 ° C. in 5 ml of Tris- buffer 50mM HCl neutral pH, added with I mM EDTA and ⁇ -mercaptoethanol l OmM, 0.2% Triton X- 100) and 50 mM NaCl. The total ground material is immediately centrifuged at 4 ° C for 15 min at 10,000 g.
  • the lipase activity is determined using a pH-STAT by the titrimetric method of Gargouri et al. (1995) in which the substrate used is tributyrin.
  • the tributyrin emulsion (1 ml for 30 ml of emulsion) is produced by vortexing in a 2.5 mM Tris-HCl buffer pH 8.0, 25 mM NaCl, and 5 mM CaCl 2.
  • the assay consists in neutralizing the butyric acid released under the action of the lipase with a sodium hydroxide solution at a set pH of 8.0 and at 37 ° C.
  • One lipase unit corresponds to the quantity of enzyme which causes the release of a micromole of fatty acids in 1 min. at 37 ° C and under optimal pH conditions (8.0).
  • the protocol for extracting lipase from leaves and tomato fruits is similar to that described for tobacco leaves, except that 1 g of fresh material is taken up in 4 ml of buffer. Lipase activity is determined as described for tobacco leaves. XII.2. DOSAGE IN TOMATO FRUITS.
  • Lipase activity is determined as described for tobacco leaves.
  • XIII. ANALYSIS OF HUMAN PANCREATIC COLIPASE EXPRESSION (COLPH) IN TRANSGENIC TOBACCO PLANTS.
  • the lipase extraction protocol from tobacco leaves taken from plants in the greenhouse is as follows: 1 g of leaves (fresh weight) is ground in liquid nitrogen and then at 4 ° C. in 5 ml of Tris buffer -HCI 50mM pH7.5, supplemented with EDTA ImM and ⁇ -mercaptoethanol l OmM, Triton X-100 0.2% and NaCl 50mM. The total ground material is immediately centrifuged at 4 ° C for 15 min at 10,000 g.
  • the extraction is carried out with 0.1 g of seeds per 4 ml of buffer.
  • the lipase activity is determined using a pH-STAT by the method of
  • the effect of colipase on the delay in hydrolysis of intralipids is determined as follows: the intralipids (0.5 ml) are diluted in 10 ml of a solution composed of 2mM Tris-HCl pH8.0, 150mM NaCl , 4mM taurodeoxycholate, CaCh I mM, at 40 ° C. The colipase is added, then after
  • pancreatic lipase 10 ⁇ 5 M
  • the activity of colipase can also be measured according to the method of
  • the lipase is denatured at pH 2, which however makes it possible to keep the colipase intact.
  • the colipase activity is then evaluated by the ability of the preparation to restore the activity of a colipase-free lipase preparation.
  • the test sample is added to the reaction medium, acidified to pH 2 with PHCI IN, and after one minute, brought to pH 9 with 1M NaOH. An aliquot of semi-purified lipase of known potential activity is added. Colipase is measured based on the level of lipase activity restored from the inactive lipase.
  • XIV. "WESTERN" IMMUNODETECTION OF RECOMBINANT LPH. XIV.1. LPH EXPRESSED IN SHEETS AND SEEDS
  • XIV.1.1 EXPRESSION WITH PEPTIDES PLANT SIGNALS; IMMUNODETECTION IN TRANSFORMED TOBACCO AND CANNED LEAVES AND SEEDS.
  • Immunodetection experiments of the “western” type (“western-blots”) of the LPH were carried out on the proteins of tobacco leaves and of tobacco and rapeseed seeds extracted with the buffer (see extraction protocol below). above).
  • the proteins extracted (30 ⁇ g total proteins per sample) are firstly separated by size on 12.5% denaturing polyacrylamide gel and then transferred to a nitrocellulose membrane.
  • control protein is natural human pancreatic lipase which migrates in the form of a single band with an apparent molecular mass of approximately 50 kDa No band is detected in the protein extracts of tobacco leaves and seeds non-rapeseed rapeseed
  • the control protein is human pancreatic lipase which migrates in the form of a single band of appai ent molecular mass of approximately 50 kDa No band is detected in the pi oteic extracts of unprocessed tobacco leaves (T) XIV 1 3 LPH IN AN EXTRACT CONTAINING PROTEINS
  • the protocol for extracting pi otemes for deglycosylation experiments is as follows: 0.5 g of leaves (dry weight) are ground in liquid nitrogen and then at 4 ° C. in 1 ml of denatui ation buffer (phosphate buffer 100 mM pH7.5, adding 1% ⁇ -mercaptoethanol, 25 mM EDTA and 1% SDS) The ground material is centrifuged at 4 ° C for 1 5 mm at 10000 g The supernatant is incubated for 5 min at 100 ° C in order to make the protein denatui ation then centrifuged for 2 min at 10,000 g The supernatant is then diluted with l Oeme in the deglycosylation buffer (phosphate buffer l OOmM pH7.5, addition of ⁇ -mercaptoethanol 1%, 25 mM EDTA, SDS 0.1%) and 1% octylglucoside)
  • the enzyme (N-glycosidase F, PNGase Boehr
  • the recombinant human pancreatic lipase is purified by ion exchange chromatography on a DEAE-Fast Flow column (Pharmacia) balanced in 50 mM Tris-acetate buffer pH 7.0. The column is washed with the same buffer until the absorption at 280 nm is less than OD 0.05.
  • the fixed enzymatic activity is eluted using a linear salt gradient in the same buffer (0 to 0.5M NaCl) using 5 column volumes.
  • the fractions containing the enzymatic activity are combined. They are subjected to filtration on Sephadex G-100.
  • the protein is purified according to conventional methods for purifying proteins well known to those skilled in the art.
  • the esterification reactions are carried out at 37 ° C. for 16 hours in hermetically sealed glass bottles placed on a stirring table (250 rpm).
  • the organic solvent used is hexane in which the fatty acids are soluble.
  • Methanol is added in stoichiometric proportion to the theoretical amount of triacylglycerol contained in rapeseed.
  • the major component of rapeseed fatty acids is oleic acid, so the reference control chosen is a methyl ester of oleic acid.
  • the synthesis monitoring is done by thin layer chromatography (TLC).
  • the migration solvent is a mixture of hexane, diethyl ether, water (70: 10: 1).
  • the revelation of the plates is carried out hot after spraying with sulfuric acid (5%) in ethanol.
  • pancreatic lipase makes it possible to obtain the expected product which is the methyl ester of oleic acid.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique recombinante contenant, d'une part, un ADNc codant pour un élément du complexe lipase pancréatique-colipase de mammifères ou pour une protéine ou un polypeptide dérivé, et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire cet élément, ou la protéine ou le polypeptide dérivé, codé par ledit ADNc, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionelle des cellules végétales, pour la transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou de plantes obtenues à partir de ces dernières, d'un élément recombinant du complexe lipase pancréatique-colipase de mammifères, ou d'une protéine ou polypeptide dérivé.

Description

LIPASES PANCREATIQUES ET/OU COLI PASES RECOMB INANTES ET
POLYPEPTIDES DERIVES PRODUITS PAR LES PLANTES, LEURS
PROCEDES D'OBTENTION ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet la production par les plantes de lipases pancréatiques et colipases recombinantes, notamment de la lipase pancréatique humaine recombinante (LPH) et/ou de la colipase pancréatique humaine (COLPH), de façon combinée ou séparée, et autres dérivés de ces dernières possédant une activité lipasique ou une activité de cofacteur de lipase le cas échéant, ainsi que leurs utilisations, notamment en tant qu'aliments fonctionnels, que compositions pharmaceutiques, ou dans des formulations enzymatiques à applications agroalimentaires ou industrielles.
On connaît dans l'art antérieur le brevet WO 9300426 qui concerne une lipase pancréatique de mammifère et ses variantes La description est basée sur le clonage et le séquençage de la lipase pancréatique de cobaye et le mode de production décrit est l'expression dans le champignon filamenteux Aspergillus oryzae. Cependant aucune indication n'est donnée dans WO 9300426 pour surmonter les particularités et difficultés imprévisibles propres à la transgénèse et à une telle production dans les plantes, par exemple dans le tabac, le mais ou le colza.
L'action concertée de la lipase pancréatique et de la colipase permet l'hydrolyse des graisses dans le duodénum. En effet, le substrat naturel de la lipase pancréatique consiste en des triglycérides à chaînes longues dispersés dans la solution des sels biliaires micellaires. Cependant la lipase est fortement inhibée par les sels biliaires. Lorsque la lipase et la colipase sont présentes, cette inhibition est surmontée. Dans l'intestin, le complexe lipase pancréatique-colipase pancréatique est formé, catalysé par des acides gras à longues chaînes qui augmentent la liaison d'un facteur 100. Bien que la stoechiométrie lipase:colipase soit de 1 : 1 , le ratio de concentration lipase-colipase est variable selon l'espèce considéré (Erlanson-
AJbertson, 1992). Chez le rat, le ratio lipase-colipase est inférieur à 1 (0,48) tandis que chez l'homme, il en est proche ( 1 ,05) Cette observation pourrait s'expliquer par le rôle potentiel de la colipase dans la régulation du poids de l'animal via son peptide d'activation, l'entérostatine. La lipase pancréatique humaine (LPH) est une glycoprotéine de 449 acides aminés (AA) d'une masse moléculaire apparente d'environ 50 kilodaltons (kDa) synthétisée sous forme d'un précurseur de 465 A A contenant un peptide signal de 16 AA à l'extrémité N-terminale (Lowe et al., 1989) Des lipases (protéines ou ADNc) pancréatiques ont été purifiées à partir de tissus ou organes de mammifères tels que le cheval, le porc, le lapin, le rat ou le cobaye Les séquences en acides aminés présentent entre elles un pourcentage d'homologie d'au moins 80%, notamment d'au moins 80,6% à environ 84,6 (tableau 1). Les séquences nucléotidiques présentent entre elles un pourcentage d'homologie d'au moins 79%, notamment d'au moins 79,3 % à environ 87% (tableau 1).
Tableau 1
Les caractéristiques des lipases pancréatiques sont les suivantes elles sont activées par les interfaces lipides-eau (activation interfaciale) , elles sont inhibées par les sels biliaires mais réactivées par la colipase (protéine activatrice) ; elles n'hydrolysent pas signifîcativement les phospholipides
La lipase pancréatique (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3 1 1 3)) joue un rôle clé dans l'absorption des graisses alimentaires par l'hydrolyse des triglycérides en diglycérides, puis en monoglycérides et en acides gras libres. L'hydrolyse des triglycérides par la lipase pancréatique est inhibée par des concentrations physiologiques d'acides biliaires Cette inhibition est surmontée par l'addition de colipase qui se fixe à la lipase et aux micelles lipidiques La structure tridimensionnelle de la lipase pancréatique humaine a été déterminée par cristallographie aux rayons X (Winkler et al 1990) Elle a permis d'identifier le résidu catalytique Ser 152 appartenant à la triade Asp-His-Ser qui est chimiquement analogue mais structurellement différente des protéases à serine. Ce site catalytique est couvert par une boucle de surface, et par conséquent inaccessible au solvant L'activation interfaciale, propriété caractéristique des enzymes lipolytiques agissant sur des substrats insolubles dans l'eau aux interfaces eau-lipide, nécessite probablement une réorientation La lipase pancréatique humaine est constituée de deux domaines, un domaine N-terminal comprenant les résidus 1 à 335, et un domaine C-terminal Le domaine N-terminal contient le site actif, un site de glycosylation (Asn 166), un site de fixation de Ca2+ , et probablement un site liant Pheparine intestinale Le domaine C-terminal contient le site de liaison de la colipase La colipase pancréatique est sécrétée à partir du pancréas sous forme d'un précurseur, la procolipase (Borgstrom et al 1979) Elle facilite l'hydrolyse des lipides interfaciaux catalysée par la lipase panci eatique La colipase pancréatique, de masse moléculaire apparente de lOkDa, confère une activité catalytique à la lipase pancréatique dans les conditions physiologiques (hautes concentrations en sels biliaires) La procolipase est constituée de 1 12 AA dont 17 correspondent au peptide signal Les séquences en acides aminés et nucléotidique, de la colipase pancréatique humaine sont connues ( Erlanson et al 1974 et Lowe et al 1990).
Des colipases pancréatiques ont été isolées a partir de mammifères Par exemple, la colipase pancréatique de lapin présente 82,7% d'homologie de séquence en AA avec la colipase humaine L'étude cristallographique de la structure de la colipase et son interaction avec la lipase pancréatique ont été étudiées (Egloff et al , 1995) : La surface de la colipase peut être divisée en une partie relativement hydrophile interagissant avec la lipase et une partie plus hydrophobe aux extrémités de boucles protéiques L'interaction entre la colipase et le domaine C-terminal de la lipase est stabilisée par 8 liaisons hydrogène et environ
80 contacts de Van der Waals Lorsque la boucle de surface (ou le «couvercle») couvrant le site catalytique libère l'accès à celui-ci, 3 liaisons hydrogènes et environ 28 contacts de Van der Waals supplémentaires apparaissent, expliquant la haute affinité apparente en présence d'une interface lipides/eau
In vitro, dans certaines conditions, on peut mettre en évidence une synergie d'action entre les lipases gastrique et pancréatique sur l'hydrolyse de triglycérides à chaînes longues (Gargouri, Y. et ai , 1989)
On connaît plusieurs situations pathologiques (mucoviscidose, insuffisance pancréatique exocrine) où les patients sont totalement ou partiellement dépourvus de sécrétion pancréatique exocrine et donc des enzymes nécessaires à l'hydrolyse des aliments (amylases, lipases, protéases) La non-absorption des graisses au niveau intestinal, et notamment des triglycérides à longues chaînes, se traduit par une augmentation très importante de la stéatorrhée chez ces patients et, en particulier dans les cas de la mucoviscidose, par un ralentissement très sensible de la prise de poids chez les jeunes malades Pour corriger cela on administre à ces sujets des extraits pancréatiques de porc ati moment des repas L'efficacité thérapeutique de ces extraits pourrait être nettement améliorée par la prescription de LPH (grâce à sa spécificité d'action sur les triglycérides à longues chaînes) Les cellules de mammifères sont, a priori, plus adaptées à l'expression de gènes de mammifères Leur utilisation pose cependant des problèmes de maturation des protéines L'équipement enzymatique qui réalise la maturation post- traductionnelle est différent d'un tissu, d'un oi gane ou d'une espèce à l'autre Par exemple, il a été rapporté que la maturation post-traductionnelle d'une protéine plasmatique peut être différente lorsqu'elle est obtenue à partir du sang humain ou bien lorsqu'elle est produite par une cellule recombinante comme les cellules d'ovaires de hamster chinois ou dans le lait d'un animal transgénique. Par ailleurs, les faibles niveaux d'expression obtenus avec les cellules des mammifères impliquent la mise en oeuvre de cultures in vitro en très grands volumes à des coûts élevés. La production de protéines recombinantes dans le lait des animaux transgéniques (souris, brebis et vaches) permet de diminuer les coûts de production et de surmonter les problèmes de niveau d'expression. Cependant, il reste des problèmes d'éthique et de contaminations virales et subvirales (prions).
Pour ces raisons, la transgénèse de gènes de mammifères dans une cellule végétale pourrait offrir une voie de production en grandes quantités de protéines recombinantes nouvelles, à un coût de production réduit et sans risque de contaminations virales ou subvirales . En 1983, plusieurs laboratoires ont découvert qu'il était possible de transférer un gène hétérologue dans le génome d'une cellule végétale et de régénérer des plantes transgéniques à partir de ces cellules génétiquement modifiées. Toutes les cellules de la plante possèdent alors le caractère génétiquement modifié qui est transmis à la descendance par fécondation sexuée. Grâce à ces travaux, diverses équipes se sont intéressées à la production de protéines recombinantes de mammifères dans les cellules végétales ou dans des plantes transgéniques (Barta et a , 1986). L'un des premiers résultats vraiment significatif dans ce domaine a été la production d'anticorps dans les plantes de tabac transgéniques. Pour exprimer une protéine hétérologue dans la graine, lieu de stockage des protéines chez les végétaux, l'équipe de Vandekerckhove a fusionné la séquence codant pour la leu-enképhaline au gène codant pour l'albumine 2S à'Arabidopsis thaliana. Avec cette construction, des colza transgéniques ont été produits qui expriment spécifiquement la leu-enképhaline dans les graines à des niveaux d'expression de l'ordre de 0, 1 % des protéines totales. En 1990, le gène de la sérum albumine humaine a été transféré dans des cellules de tabac et de pomme de terre. Quelle que soit l'origine des peptides signaux (humaine ou végétale), des taux de sérum albumine humaine de l'ordre de 0,02% des protéines totales ont été obtenus dans les feuilles, les tiges et les tubercules de pomme de terre. D'autres protéines recombinantes de mammifères ont été aussi produites dans les plantes: l'antigène de surface de l'hépatite B, les interférons, un anticorps de souris an -Streptococcus mutons, agent de la carie, des fragments d'anticorps anti- cellules cancéreuses, un anticorps anti-Herpès, la toxine du choléra et le facteur de croissance de l'épiderme humain (E.G.F).
L'ensemble de ces recherches a permis de montrer que la production de protéines recombinantes de mammifères dans les cellules végétales est possible et que les mécanismes de la synthèse des protéines à partir des séquences d'ADN sont similaires chez les cellules animales et les cellules végétales. De nombreuses différences existent néanmoins entre les cellules végétales et animales, notamment au niveau de la maturation des glycannes polymannosidiques en glycannes complexes, ou encore au niveau des sites de clivage des peptides signaux, ne permettant pas ainsi de garantir l'obtention de protéines de mammifères actives ou suffisamment actives par transformation de cellules végétales.
Les inventeurs ont découvert que l'utilisation de cellules végétales transformées par une séquence nucléotidique recombinante appropriée, permet d'obtenir de la lipase pancréatique, notamment de la LPH, recombinante ou des protéines ou polypeptides dérivés de ces dernières, présentant une activité enzymatique suffisante pour être développés dans une application industrielle.
Le but de la présente invention est de fournir un nouveau procédé d'obtention de lipases pancréatiques recombinantes de mammifères, et plus particulièrement de LPH, par les plantes, ou de protéines ou polypeptides dérivés de ces dernières, présentant une activité enzymatique, et plus particulièrement une activité lipasique, telle que lesdites lipases recombinantes, ou leurs polypeptides dérivés puissent être utilisés industriellement.
Un autre but de la présente invention est de fournir les outils pour la mise en oeuvre d'un tel procédé, notamment de nouvelles séquences nucléotidiques recombinantes, des cellules de plantes transformées génétiquement, des plantes ou parties de plantes (notamment feuilles, tiges, fruits, semences ou graines, racines) transformées génétiquement, et des fragments de ces plantes ou parties de plantes transformées génétiquement.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelle(s) lipases pancréatiques recombinante(s) de mammifères, notamment la LPH, ou toute protéine ou polypeptide dérivé, enzymatiquement actifs et tels qu'obtenus à partir de cellules de plantes ou de plantes, transformées génétiquement.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions enzymatiques susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la mise en oeuvre de réactions enzymatiques, notamment à l'échelle industrielle.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions pharmaceutiques, notamment dans le cadre du traitement de pathologies associées à un déficit de production de lipase dans l'organisme, telles que la mucoviscidose ainsi que du traitement de pathologies associées à un désordre alimentaire, telle que l'obésité.
Un autre but de la présente invention est de fournir de nouveaux carburants, encore désignés biocarburants, présentant l'avantage d'être moins polluants que les carburants dérivés du pétrole, et d'être d'un coût de revient moins élevé.
DESCRIPTION DETAILLE DE L'INVENTION:
La présente invention a pour objet, l'utilisation d'une séquence nucléotidique recombinante contenant, d'une part, un ADNc codant pour une lipase pancréatique de mammifères ou pour une protéine ou un polypeptide dérivé, et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire la lipase pancréatique, ou la protéine ou le polypeptide dérivé, codé par ledit ADNc, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales, pour la transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou de plantes obtenues à partir de ces dernières, d'une lipase pancréatique recombinante de mammifères, ou d'une protéine ou polypeptide dérivé.
En particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique recombinante contenant, d'une part, un ADNc codant pour toute lipase pancréatique de mammifères ou pour une protéine ou un polypeptide dérivé, à savoir les protéines ou les polypeptides dont les séquences nucléotidiques codant pour ces dernières présentent entre elles un pourcentage d'homologie d'au moins environ 75%, notamment d'au moins environ 77% à environ 85%, et dont les séquences en acides aminés présentent entre elles un pourcentage d'homologie d'au moins environ 75%, notamment d'an moins environ 80% à environ 90%, et présentent une activité lipasique de type pancréatique, notamment un ADNc codant pour toute lipase pancréatique de mammifères, ou un ADNc codant pour toute protéine ou polypeptide dérivé des lipases pancréatiques susmentionnées par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), cette protéine ou ce polypeptide dérivé possédant une activité lipasique de type pancréatique, et, d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire la lipase pancréatique, ou la protéine ou le polypeptide dérivé, codé par ledit ADNc, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales, pour la transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou de plantes obtenues à partir de ces dernières, d'une lipase pancréatique recombinante de mammifères, ou d'une protéine ou polypeptide dérivé
La présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique recombinante contenant d'une part, l'ADNc codant pour la LPH (Lowe M.E et al 1989), ou une séquence nucléotidique dérivée de cet ADNc, notamment par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou plusieurs) nucléotide(s), ladite séquence dérivée étant susceptible de coder pour un polypeptide dont la séquence en acides aminés est identique à celle de la LPH, ou pour un polypeptide dérivé de la LPH par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), ce polypeptide dérivé présentant une activité lipase de type pancréatique, et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire le polypeptide codé par ledit ADNc ou par une séquence dérivée susmentionnée, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales (et plus particulièrement par les ARN polymérases de ces dernières), pour la transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou des plantes obtenues à partir de ces dernières, de LPH recombinante sous forme d'enzyme active, ou d'un (ou plusieurs) polypeptide(s) dérivé(s) de cette dernière tel(s) que défini(s) ci-dessus.
L'invention concerne aussi une séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient d'une part la séquence codante pour une lipase pancréatique ou une protéine ou polypeptide dérivé et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire une lipase pancréatique pancréatique ou une protéine ou polypeptide dérivé codé par ladite séquence, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales,
-une séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient d'une part la séquence codante pour une colipase ou une protéine ou polypeptide dérivé et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire une colipase pancréatique ou une protéine ou polypeptide dérivé codé par ladite séquence, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales,
-et une séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient d'une part les séquences codantes pour une lipase pancréatique et une colipase ou les protéines ou polypeptides dérivés et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire une lipase pancréatique et une colipase ou les protéines ou polypeptides dérivés codés par ladite séquence, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus, notamment celle contenant à titre d'ADNc, celui de la LPH ou une séquence nucléotidique dérivée de ce dernier telle que définie ci- dessus.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques recombinantes selon l'invention contiennent une (ou plusieurs) séquence(s) codant pour un peptide responsable de l'adressage des polypeptides recombinants de l'invention (à savoir de la LPH recombinante ou des polypeptides dérivés susmentionnés) dans un compartiment déterminé de la cellule végétale, notamment dans le réticulum endoplasmique ou dans les vacuoles, ou bien même à l'extérieur de la cellule, dans la paroi pectocellulosique ou dans l'espace extracellulaire aussi appelé apoplasme. Parmi les terminateurs de transcription susceptibles d'être utilisés pour la transformation de cellules de plantes dans le cadre de la présente invention, on peut citer le terminateur polyA 35S du viais de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), ou le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium lumefaciens souche à nopaline .
A ce titre, l'invention a pour objet toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus contenant en aval dudit ADNc ou de sa séquence dérivée, le terminateur polyA 35S du CaMV, ou le terminateur polyA NOS d'Agrobacterium tiimefaciens. Parmi les promoteurs de transcription susceptibles d'être utilisés pour la transformation de cellules de plantes dans le cadre de la présente invention, on peut citer:
- le promoteur 35S (P35S), ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (Pd35S) du CaMV, ces promoteurs permettant l'expression des polypeptides recombinants de l'invention dans l'ensemble de la plante obtenue à partir de cellules transformées selon l'invention, et sont décrits dans l'article de Kay ét al, 1987,
- le promoteur PCRU du gène de la cruciférine de radis permettant l'expression des polypeptides recombinants de l'invention uniquement dans les semences (ou graines) de la plante obtenue à partir de cellules transformées selon l'invention, et décrit dans l'article de Depigny-This et al., 1992,
- les promoteurs PGEA1 et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA I et GEA6, respectivement, d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993 ), et permettant une expression spécifique dans les graines,
- le promoteur chimérique super-promoteur PSP (Ni M et al., 1995), constitué de la fusion d'une triple répétition d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de l'octopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens, d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de mannopine synthase et du promoteur mannopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens,
- le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-IAR) contenu dans le plasmide pAct 1 -F4 décrit par McElroy et al ( 1991 ), - le promoteur HMGW (High Molecu/ar Weighl Ghitenine) d'orge
(Anderson O.D. ét l, 1989),
- le promoteur du gène de γzéine de maïs (Pγzéine) contenu dans le plasmide pγ63 décrit dans Reina et al. ( 1990), et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs. A ce titre, l'invention a pour objet toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant en amont dudit ADNc ou de sa séquence dérivée, le promoteur constitutif double 35S (Pd35S) du CaMV, ou le promoteur PCRU du gène de la cruciférine de radis, ou les promoteurs PGEA1 ou PGEA6 d'Arabidop is thaliana, ou le super-promoteur PSP d'Agrobacterium tumefaciens, ou le promoteur PAR-IAR du riz, le promoteur HMGW d'orge ou le promoteur pγzéine du maïs.
Les séquences codant pour un peptide d'adressage utilisées dans le cadre de la présente invention, peuvent être d'origine végétale, humaine ou animale.
Parmi les séquences codant pour un peptide d'adressage d'origine végétale, on peut citer:
- la séquence nucléotidique de 69 nucléotides (indiquée dans les exemples qui suivent) codant pour le prépeptide (peptide signal) de 23 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, ce peptide signal permettant l'entrée des polypeptides recombinants de l'invention dans le système de sécrétion des cellules végétales transformées selon l'invention (à savoir principalement dans le réticulum endoplasmique),
- la séquence nucléotidique de 42 nucléotides (indiquée dans les exemples qui suivent) codant pour le propeptide N-terminal d'adressage vacuolaire de 14 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, permettant l'accumulation des polypeptides recombinants de l'invention dans les vacuoles des cellules végétales transformées selon l'invention,
- la séquence nucléotidique de 1 1 1 nucléotides (indiquée dans les exemples qui suivent) codant pour le prépropeptide de 37 acides aminés de la sporamine A constitué depuis l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale des 23 acides aminés du peptide signal susmentionné suivis par les 14 acides aminés du propeptide susmentionné, ce prépropeptide permettant l'entrée de polypeptides recombinants de l'invention dans le système de sécrétion et leur accumulation dans les vacuoles des cellules végétales transformées selon l'invention. les trois séquences susmentionnées étant décrites dans les articles de Murakami et al, 1986, et Matsuoka et al, 1991 ,
- le propeptide carboxyterminal de la lectine d'orge décrit notamment dans les articles de Schroeder et al , 1993, et de Bednai ek et al, 1 91 - et le PRS (Pathogenesis Related Pi otein, Cornelissen et al 1986) permettant la sécrétion
Parmi les séquences codant pour un peptide d'adressage d'origine humaine ou animale, on peut citer celle codant pour le peptide signal de la lipase pancréatique humaine (LPH) tel que décrit dans Lowe M E et al 1989, ou pour celui de la lipase gastrique de lapin (LGL) tel que décrit dans la demande de brevet européen
EP 542629, dont la séquence est indiquée dans les exemples qui suivent, ou pour celui de la lipase gastrique de chien (LGC)
On peut également citer, parmi les séquences codant pour un peptide d'adressage, celle codant pour les peptides KDEL, SEKDEL et HDEL et permettant un adressage dans le réticulum endoplasmique
A ce titre, l'invention a pour ob|et toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant une séquence codant pour tout ou partie d'un peptide signal tel que celui de la spoi aminé A de la patate douce, ou celui de la LPH, ou de la LGL, ou de la LGC, cette séquence codant pour un peptide signal étant située, dans ladite séquence nucléotidique recombinante, en amont dudit ADNc ou de sa séquence dérivée et en aval du promoteur utilisé, de telle sorte que le dernier acide amme C-terminal du peptide signal soit lié au premier acide aminé N-terminal du polypeptide codé par ledit ADNc ou sa séquence dérivée, dans la protéine codée par ladite séquence nucléotidique recombinante
L'invention a également pour ob|et toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant une séquence codant pour tout ou partie d'un peptide d'adressage vacuolan e, notamment celui de la sporamine A de la patate douce, cette séquence codant pour un peptide d'adressage vacuolaire étant située, dans ladite séquence nucléotidique recombinante, entre la séquence codant pour un peptide signal et celle codant pour ledit ADNc ou sa séquence dérivée, de telle sorte que le premiei acide aminé N-terminal du peptide d'adressage vacuolaire soit lié au dernier acide aminé C-terminal du peptide signal, et que le dernier acide aminé C-termmal dudit peptide d'adressage soit lié au premier acide aminé N-terminal du polypeptide code par ledit ADNc ou sa séquence dérivée, dans la protéine codée pai ladite séquence nucléotidique recombinante L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant une séquence codant pour tout ou partie d'un peptide d'adressage vacuolaire, notamment celui de la lectine d'orge, cette séquence codant pour un peptide d'adressage vacuolaire étant située, dans ladite séquence nucléotidique recombinante, en aval de la séquence codant pour ledit ADNc ou sa séquence dérivée, de telle sorte que le premier acide aminé N- terminal du peptide d'adressage vacuolaire soit lié au dernier acide aminé C- terminal du polypeptide codé par ledit ADNc ou sa séquence dérivée, dans la protéine codée par ladite séquence nucléotidique recombinante. L'invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques recombinantes suivantes:
- celle (désignée Pd35S-PS-LPH) contenant dans le sens 5' -» 3' le promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le peptide signal de la sporamine A, cette dernière étant immédiatement suivie par la séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du
CaMV,
- celle (désignée Pd35S-PPS- LPH) contenant dans le sens 5' — > 3' le promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le prépropeptide de la sporamine A, cette dernière étant immédiatement suivie par la séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du
CaMV,
- celle (désignée Pd35S-PSLPH- LPH) contenant dans le sens 5' — > 3' le promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le peptide signal de la LPH (ou PSLPH) (à savoir pour une séquence constituée des 16 acides aminés décrits dans Lowe M.E. et al. 1989), cette dernière étant immédiatement suivie par la séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée Pd35S-PSLGL- LPH) contenant dans le sens 5' — 3' le promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le peptide signal de la lipase gastrique de lapin (ou PSLGL), cette dernière étant immédiatement suivie par la séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée Pd35S-PRS- LPH) contenant dans le sens 5' — » 3' le promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le peptide signal de la Pathogenesis Related Protein, cette dernière étant immédiatement suivie par la séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV, - celle (désignée PCRU-PS- LPH) contenant dans le sens 5' — 3' le promoteur PCRU de la cruciférine, la séquence codant pour le peptide signal de la sporamine cette dernière étant immédiatement suivie par la séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée PCRU-PPS- LPH) contenant dans le sens 5' -» 3' le promoteur PCRU de la cruciférine, la séquence codant pour le prépropeptide de la sporamine A, cette dernière étant immédiatement suivie par la séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée PCRU- PSLPH - LPH) contenant dans le sens 5' → 3' le promoteur PCRU de la cruciférine, la séquence codant le peptide signal de la LPH (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par l'ADNc codant pour la LPH mature puis le terminateur polyA 35S du CaMV, - celle (désignée PCRU- PSLGL - LPH) contenant dans le sens 5' — > 3' le promoteur PCRU de la cruciférine, la séquence codant le peptide signal de la LGL (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par lΑDNc codant pour la LPH mature puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée PCRU- PRS- LPH) contenant dans le sens 5' → 3' le promoteur PCRU de la cruciférine. la séquence codant le peptide signal de
Pathogenesis Related Protein, cette dernière étant immédiatement suivie par ADNC codant pour la LPH mature puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée PGEA 1 - PSLPH - LPH) contenant dans le sens 5' → 3' le promoteur PGEA1 d'Arahidopsis thaliana, la séquence codant le peptide signal de la LPH (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par l'ADNc codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée PGEA 1 - PSLGL - LPH) contenant dans le sens 5' -> 3' le promoteur PGEA1 d'Arahidopsis thaliana, la séquence codant le peptide signal de la LGL (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par l'ADNc codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée PGEA6- PSLPH - LPH) contenant dans le sens 5' -> 3' le promoteur PGEA6 d'Arahidopsis thaliana, la séquence codant le peptide signal de la LPH, cette dernière étant immédiatement suivie par codant pour la LPH mature ou son précurseur, puis le terminateur polyA 35S du CaMV, - celle (désignée PGEA6- PSLGL - LPH) contenant dans le sens 5' — > 3' le promoteur PGEA1 d'Arahidopsis thaliana. la séquence codant le peptide signal de la LGL (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par l'ADNc codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV, - celle (désignée PAR-IAR- PSLPH - LPH ) contenant dans le sens 5' → 3' le promoteur PAR-IAR du riz, la séquence codant pour le peptide signal de la LPH (telle que décrite ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par lΑDNc codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV, ou le terminateur polyA NOS d'Agrobacterium tumefaciens,
- celle (désignée PAR-IAR- PSLGL - LPH) contenant dans le sens 5' — > 3' le promoteur PAR-IAR du riz, la séquence codant pour le peptide signal de la LGL (telle que décrite ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par l'ADNc codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV, ou le terminateur polyA NOS d'Agrobacterium tumefaciens.
- celle (désignée Pγzéine- PSLPH - LPH) contenant dans le sens 5' — 3' le promoteur pγzéine du maïs, la séquence codant pour le peptide signal de la LPH (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par l'ADNc codant pour la LPH mature, ou son précurseur, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée Pγzéine- PSLGL - LPH ) contenant dans le sens 5' — > 3' le promoteur pγzéine du maïs, la séquence codant pour le peptide signal de la LGL (telle que décrite ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par l'ADNc codant pour la LPH mature, ou son précurseur, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
- celle (désignée Pγzéine- PSLPH - LPH -KDEL) contenant dans le sens 5' — » 3' le promoteur pγzéine du maïs, la séquence codant pour le peptide signal de la LPH (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par l'ADNc codant pour la LPH mature puis la séquence codant pour le tétrapeptide
KDEL, puis le terminateur polyA 35S du CaMV
Avantageusement, les séquences nucléotidiques recombinantes de l'invention contiennent également une séquence nucléotidique utilisable en tant que marqueur desdites séquences recombinantes, notamment pour différencier (et ainsi sélectionner) celles des cellules de plantes qui sont transformées par lesdites séquences recombinantes de celles qui ne le sont pas.
De préférence, une telle séquence nucléotidique utilisable en tant que marqueur desdites séquences recombinantes, est choisie parmi les gènes de résistance aux antibiotiques, notamment le gène de résistance à la kanamycine. L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmidique, contenant une séquence nucléotidique recombinante selon l'invention, insérée en un site non essentiel pour sa réplication L'invention concerne également tout hôte cellulaire, notamment toute bactérie telle que Agrobacterium tumefaciens, transformé par un vecteur tel que défini ci-dessus.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention de lipase pancréatique recombinante, ou d'une protéine ou un polypeptide dérivé, caractérisé en ce qu'il comprend:
- la transformation de cellules végétales, notamment à l'aide d'un hôte cellulaire selon l'invention, lui-même transformé par un vecteur l'invention, de manière à intégrer dans le génome de ces cellules une séquence recombinante selon l'invention
- le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules transformées susmentionnées,
- la récupération de la lipase pancréatique recombinante ou de la protéine ou polypeptide dérivé produit dans lesdites cellules ou plantes transformées susmentionnées, notamment par extraction, suivie, le cas échéant, par une purification.
Par exemple, la présente invention a pour objet tout procédé d'obtention d'une lipase pancréatique humaine, recombinante sous forme d'enzyme active, et/ou d'un (ou plusieurs) polypeptide(s) dérivé(s) de cette dernière, notamment par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), ce (ou ces) polypeptide(s) dérivé(s) présentant une activité lipasique, caractérisé en ce qu'il comprend:
- la transformation de cellules végétales, de manière à intégrer, dans le génome de ces cellules, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) recombinante(s) selon l'invention,
- le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules transformées susmentionnées,
- la récupération de la lipase pancréatique humaine recombinante et/ou du (ou des) polypeptide(s) dérivé(s) susmentionné(s) produit(s) dans lesdites cellules ou plantes transformées susmentionnées, notamment par extraction, suivie, le cas échéant, par une purification
Selon un mode de réalisation du procédé susmentionné de l'invention, la transformation de cellules végétales peut être réalisée par transfert de la séquence nucléotidique recombinante de l'invention dans les protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylène glycol (PEG) en présence de cations divalents (Ca-+)
La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par électroporation La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par utilisation d'un canon a gène permettant la projection, a très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes de séquences nucléotidiques recombinantes selon l'invention, délivrant ainsi des gènes a Pinteneui du noyau cellulaire Une autre méthode de transformation des cellules végétales, est celle de la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire
Selon un mode de réalisation particuliei ement préféré du procédé susmentionné de l'invention, les cellules végétales sont transformées par mise en présence de ces dernières avec un hôte cellulaire transformé par un vecteur selon l'invention, tel que décrit ci-dessus, ledit hôte cellulan e étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'integi ation dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques recombinantes de l'invention initialement contenues dans le génome du vecteur susmentionné
Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon les méthodes decntes dans les articles de Bevan,
1984 et d'An et al , 1986, ou encoi e Agrobac tei min i hizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Jouanin et al , 1987
Parmi les cellules végétales susceptibles d'êti e ti ansfoπnées dans le cadre de la présente invention, on peut citer celles du colza, tabac, mais, pois, tomate, carotte, blé, orge, pomme de terre, soja, tournesol, laitue, riz et luzerne
Selon un mode de réalisation du pi oce e susmentionné de l'invention, les cellules végétales transformées selon l'invention, sont cultivées m vitro, notamment en bioréacteurs, en milieu liquide, ou sous forme immobilisées, ou encore par culture de racines transformées /// viii o Les milieux des cultui es /// vili susmentionnés sont ensuite récupérés pour en extraire, et le cas échéant purifier, notamment par chromatographie, la lipase pancréatique, notamment la LPH, l ecombinante et/ou les protéines ou polypeptide(s) dérivé(s) définis ci-dessus pi oduits par lesdites cellules transformées cultivées /// vitro Selon un mode de réalisation préfère du pi ocedé susmentionné d'obtention de la lipase pancréatique, notamment de la LPH, recombinante et/ou des protéines ou polypeptide(s) déπvé(s) selon l'invention, la ti ans oi mation de cellules végétales est suivie par une étape d'obtention de plantes transformées par mise en culture desdites cellules transformées dans un milieu appi oprié La lipase pancréatique, notamment la LPH, recombinante et/ou le (ou les) protéines ou polypeptide(s) dérivé(s), produit(s) dans les cellules des plantes entières ainsi obtenues, sont récupérés par extraction réalisée a partir des plantes entières, ou de parties de ces plantes (notamment a partir des feuilles ou des tiges ou des fruits), ou encore à partir de semences issues de ces plantes, cette extraction étant le cas échéant suivie par une étape de purification de la lipase pancréatique, notamment de la LPH, recombinante et/ou de la protéine ou du (ou des) polypeptide(s) dérivé(s).
Les plantes transformées utilisées pour la récupération de la lipase pancréatique, notamment de la LPH, recombinante et/ou de la (ou des) protéine (s) ou polypeptide(s) dérivé(s) dans le cadre du procédé susmentionné, sont celles de la génération TO, à savoir celles obtenues à partir de culture de cellules transformées de l'invention sur un milieu approprié, ou avantageusement celles des générations suivantes (T l , T2 etc.) obtenues, par exemple par autofécondation des plantes de la génération précédente et dans lesquelles les séquences nucléotidiques recombinantes de l'invention se reproduisent selon les lois de Mendel.
L'invention vise plus particulièrement un procédé d'obtention tel que décrit ci-dessus de la LPH recombinante, caractérisé en ce qu'il comprend:
- la transformation de cellules d'expiants de feuilles d'une plante, par mise en présence de ces dernières avec une souche d'Agrobacterium tumefaciens transformée par un plasmide tel que décrit ci-dessus contenant la séquence nucléotidique recombinante choisie dans la liste suivante . Pd35S-PS-LPH, Pd35S- PPS-LPH, Pd35S-PSLGL-LPH et Pd35S-PSLPH- LPH susmentionnée, sur un milieu de culture approprié, - sélection des explants transformés sur un milieu contenant de la kanamycine,
- obtention de plantes transformées à partir des explants transformés susmentionnés par culture de ces derniers sur des milieux appropriés,
- extraction de la LPH recombinante notamment par broyage des feuilles et/ou des graines et/ou des fruits des plantes transformées susmentionnées dans un tampon approprié, centrifugation et récupération du surnageant constituant l'extrait végétal à activité enzymatique,
- le cas échéant purification de la LPH recombinante à partir de l'extrait obtenu lors de l'étape précédente, notamment par chromatographie réalisée à partir du surnageant, ce qui conduit à l'obtention de LPH recombinante sous forme essentiellement pure.
Les cellules végétales transformées dans les procédés décrits ci-dessus sont avantageusement choisies parmi celles de tabac, colza, mais, pois, tomate, carotte, blé, orge, pomme de terre, soja, tournesol, laitue, riz et luzerne. L'invention vise plus particulièrement un procédé d'obtention de LPH recombinante, caractérisé en ce qu'il comprend
- la transformation de cellules de cals de mais, par bombardement de ces dernières à l'aide d'un canon à particules, avec des plasmides contenant la séquence nucléotidique recombinante PAR-IAR-PSLPH- LPH et/ou la séquence pγzéine- PSLGL- LPH et/ou la séquence Pγzéine- PSLPH -LPH-KDEL,
- sélection des cals transformes sur un milieu contenant un agent sélectif tel que la kanamycine, - obtention de plantes de mais transformées a partir des cals transformés susmentionnés par culture de ces derniers sur des milieux appropriés,
- extraction de la LPH recombinante; notamment par broyage, dans un tampon approprié, des semences issues des plantes ti ansformées susmentionnées, centrifugation et récupération du surnageant constituant l'extrait végétal à activité enzymatique,
- le cas échéant, purification de la LPH a partir de l'extrait obtenu lors de l'étape précédente, notamment par chromatogi aphie réalisée à partir du surnageant, ce qui conduit à l'obtention de la LPH sous forme essentiellement pure
L'invention a également poui ob|et toute cellule végétale transformée génétiquement, contenant une (ou plusieui ) sequence(s) nucléotidique(s) recombinante(s) selon l'invention, ιntegree(s) de façon stable dans leur génome
L'invention concerne également toute cellule \ egetale transgénique telle que décrite ci-dessus, contenant une (ou plusieui s) pι otéine(s) ou polypeptide(s) recombinant(s) selon l'invention, tels que la LPH ladite cellule végétale étant encore désignée cellule végétale à activité enzymatique, et plus particulièrement à activité lipasique telle que définie ci-apres
L'invention a également pour obiet des semences transformées génétiquement contenant une (ou plusieui s) sequence(s) nucléotidique(s) recombinante(s) telle(s) que décι ιte(s) ci-dessus, selon l'invention, ιntégrée(s) de façon stable dans leur génome
L'invention concerne également les semences transgéniques décrites ci- dessus, et contenant une (ou plusieui s) proteιne(s) ou polypeptide(s) recombinant(s) selon l'invention, tels que la LPH u-tombin me. lesdites semences étant encore désignées semences a activité enzymatique, et plus particulièrement à activité telle que définie ci-après
Les semences transformées selon l'invention sont celles récoltées à partir de plantes transformées génétiquement selon l'invention, ces plantes transformées étant soit celles de la génération TO susmentionnée et obtenues par mise en culture de cellules transformées selon l'invention, soit celles des générations suivantes (Tl, T2 etc ) obtenues par exemple par autofecondation ou par croisement des plantes des générations précédentes (comme indique ci-dessus)
L'invention a également pour ob|et les plantes ou parties de plantes (notamment explants, tiges, feuilles, n uits, l acines, semences, pollen, etc ) transformé(e)s génétiquement, caractéπsé(e)s en ce qu'elles (ils) contiennent une (ou plusieurs) séquence(s) nucleotιdιque(s) l ecombmante(s) selon l'invention, intégrée(s) de façon stable dans leur génome
L'invention concerne également les plantes ou parties de plantes transgéniques décrits ci-dessus, contenant une (ou plusieurs) protéιne(s) ou polypeptide(s) recombιnant(s) selon l'invention, tels que la LPH, lesdit(e)s plantes ou parties de plantes étant encore désigne(e)s plantes ou parties de plantes à activité enzymatique, et plus particulièrement a activité lipasique telle que définie ci-après L'invention a plus particulièrement poui ob|et, les plantes transformées susmentionnées, telles qu'obtenues par mise en cultui e de cellules ou de semences telles que décrites ci-dessus, selon l'invention
Les plantes, ou parties de plantes, transfoi mees selon l'invention sont avantageusement choisis parmi le colza, le tabac, le mais, le pois, la tomate, la carotte, le blé, l'orge, la pomme de teπ e, le soia, le tournesol, le riz, la laitue, la luzerne et la betterave, ou les parties de ces plantes
La présente invention a poui ob|et tout e ti ait végétal a activité enzymatique, et par exemple à activité lipasique définie ci-api es, tel qu'obtenu par mise en oeuvre de l'un des procédés décrits ci-dessus de l'invention, contenant de la lipase pancréatique recombinante et/ou de la colipase l ecombinante ou les protéines ou polypeptides dérivés
L'activité lipasique (ou lipolytique) des plantes ou parties de plantes, et des extraits végétaux à activité enzymatique de l'invention, peut être mesurée notamment selon la méthode de Duan R et al 1991 utilisant un triglycéride à chaîne courte (tel que la tπbutynne) comme substi at ou par la méthode de Egloff
M P. et al 1995 L'activité enzymatique est i apportée en unîtes U, une unité U correspondant à la quantité d'enzyme nécessaire poui libérer une μmole d'acides gras libres par minute à 37°C dans les conditions optimales de pH
Les extraits végétaux a activité enzymatique de l'invention sont avantageusement tels que le pourcentage en poids de polypeptides recombinants enzymafiquement actifs, représente envn on 0, 1 % a 20%, notamment environ 1% à environ 15%, par rapport au poids total de pi oteines pi esentes dans ces extraits
L'invention a plus particuliei ement po i objet les extraits végétaux à activité enzymatique suivants - les extraits de feuilles et/ou de n uits et/ou de graines de plantes, tels qu'obtenus par transformation des cellules d'expiants de ces plantes avec la séquence Pd35S-PSLPH- LPH, ou la séquence Pd35S-PS- LPH, ou la séquence Pd35S-PPS- LPH, ou la séquence Pd35S-PSLGL- LPH, selon l'un des procédés décrits ci-dessus, et contenant la LPH recombinante.
- l'extrait de feuilles de tabac, tel qu'obtenu par transformation de cellules d'expiants de feuilles de tabac avec la séquence Pd35S-PS- LPH, ou la séquence Pd35S-PPS- LPH, selon le procédé décrit ci-dessus,
- l'extrait de feuilles de tabac, tel qu'obtenu par transformation de cellules d'expiants de feuilles de tabac avec la séquence Pd35S-PSLGL- LPH ou la séquence Pd35S-PSLPH- LPH, selon le procédé décrit ci-dessus,
- l'extrait de graines de tabac, tel qu'obtenu par transformation de cellules d'expiants de feuilles de tabac avec la séquence Pd35S-PS-LPH, ou la séquence
Pd35S-PPS-LPH, selon le procédé décrit ci-dessus,
- les extraits de graines de plantes tels qu'obtenus par transformation de cellules d'expiants de ces plantes avec la séquence PCRU-PS- LPH, ou la séquence PCRU-PPS-LPH, ou la séquence PGEA 1 -PSLGL- LPH, ou la séquence PGEA6- PSLPH - LPH, selon l'un des procédés décrits ci-dessus, et contenant la LPH recombinante:
- l'extrait de graines de colza, tel qu'obtenu par transformation de cellules d'expiants de feuilles de colza avec la séquence PCRU-PS-LPH, ou la séquence PCRU-PPS-LPH, ou la séquence PGEA I - PSLPH -LPH, ou la séquence PGEA6- PSLPH -LPH, selon le procédé décrit ci-dessus,
- les extraits de semences de plantes tels qu'obtenus par transformation de cellules d'expiants de ces plantes avec la séquence PAR-IAR- PSLPH -LPH et/ou la séquence Pγzéine- PSLPH -LPH et/ou la séquence Pγzéine- PSLPH -LPH- KDEL, selon l'un des procédés décrits ci-dessus, et contenant la LPH recombinante
- l'extrait de semences de maïs, tel qu'obtenu par transformation de cellules de maïs (notamment de cals de maïs) avec la séquence PAR-IAR- PSLPH -LPH et/ou la séquence Pγzéine-PSLGL-LPH et/ou la séquence Pγzéine- PSLPH -LPH- KDEL, selon le procédé décrit ci-desstis. La présente invention a pour objet une lipase pancréatique recombinante ou protéine ou polypeptide dérivé caractérisé en ce qu'elle est obtenu selon le procédé selon l'invention.
La présente invention a notamment pour objet toute lipase pancréatique recombinante enzymatiquement active, notamment la LPH, ou protéines ou polypeptides dérivés, notamment par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), ces polypeptides dérivés présentant une activité lipasique, tels qu'obtenus sous forme essentiellement pure par mise en oeuvre d'un des procédés décrits ci-dessus de l'invention, ces procédés comprenant une étape de purification des polypeptides recombinants de l'invention, notamment par chromatographie réalisée à partir des extraits enzymatiques décrits ci-dessus.
Par lipase pancréatique recombinante enzymatiquement active, ou polypeptides dérivés présentant une activité lipasique, selon l'invention, on entend tout polypeptide recombinant susceptible de présenter une activité lipasique de type pancréatique par exemple telle que mesurée selon la méthode de Duan ou la méthode de Egloff.
L'invention concerne plus particulièrement la LPH recombinante telle qu'obtenue par purification de l'extrait enzymatique de feuilles ou de graines de tabac, ces feuilles ou graines provenant de plantes de tabac transformées, elles- mêmes obtenues à partir de cellules de tabac transformées avec la séquence Pd35S- PSLGL-LPH ou séquence Pd35S-PSLPH-LPH selon le procédé décrit ci-dessus, ladite LPH recombinante présentant une activité lipasique telle que décrite ci- dessus. L'invention concerne les anticorps dirigés contre les polypeptides recombinants de l'invention, et plus particulièrement ceux dirigés contre la LPH recombinante selon l'invention.
De tels anticorps peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec ces polypeptides suivie de la récupération des anticorps formés. II va de soi que cette production n'est pas limitée aux anticorps polyclonaux.
Elle s'applique encore à tout anticorps monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'un des polypeptides purifiés de l'invention d'une part, et des cellules d'un myélome approprié d'autre part, et d'être sélectionné, par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le polypeptide susmentionné initialement mis en oeuvre pour l'immunisation des animaux.
L'invention concerne également l'utilisation de plantes, parties de plantes, cellules de plantes, ou semences transformés selon l'invention, pour l'obtention d'une (ou plusieurs) protéines ou polypeptide(s) recombinant(s) selon l'invention, tels que la LPH recombinante, ou ses polypeptides dérivés tels que définis ci- dessus, notamment par mise en oeuvre d'un des procédés susmentionnés de l'invention, lesdits polypeptides recombinants étant sous forme essentiellement pure ou contenus dans des extraits végétaux à activité enzymatique tels que définis ci- dessus.
L'invention concerne notamment :
-l'utilisation "de plantes, ou parties de plantes selon l'invention et/ou des extraits de plantes selon l'invention, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon l'invention, pour l'obtention de médicaments destinés au traitement de pathologies associées à un déficit de production de lipase dans l'organisme, telles que la mucoviscidose ou dans le cadre du traitement de désordre alimentaire, telle que l'obésité, -l'utilisation de plantes, ou parties de plantes selon l'invention, et/ou des extraits de plantes selon l'invention, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon l'invention, pour l'obtention d'aliments destinés à l'ali entatio humaine ou animale, notamment d'aliments fonctionnels plus particulièrement destinés à faciliter l'absorption des graisses animales ou végétales ingérées par un individu sain ou atteint d'une ou plusieurs pathologies affectant ou non le taux de production de lipase gastrique et/ou pancréatique,
-et l'utilisation de plantes, ou parties de plantes selon l'invention, et/ou des extraits de plantes selon l'invention, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon l'invention, pour la mise en oeuvre de réactions enzymatiques dans le domaine industriel, agro-alimentaire ou agro-industrielle, notamment dans l'industrie des corps gras, de la lipochimie et l'industrie laitière.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation en tant qu'aliments des plantes, ou parties de plantes, notamment des feuilles, des fruits, des semences à activité enzymatique selon l'invention A ce titre l'invention a plus particulièrement pour objet tout aliment fonctionnel constitué d'une plante à activité enzymatique telle que décrite ci-dessus, ou de parties de cette plante, notamment de feuilles ou fruits ou encore de semences issues de cette dernière, et susceptible(s) de présenter un caractère comestible chez l'Homme, ou l'animal L'invention vise également tout aliment fonctionnel contenant une (ou plusieurs) plante(s) à activité enzymatique telle(s) que décrite(s) ci-dessus, et/ou des parties de cette (ces) plante(s), notamment des feuilles et/ou des semences et/ou des fruits de cette (ces) plante(s), et/ou un (ou plusieurs) extrait(s) végétal
(végétaux) à activité enzymatique tel(s) que décrit(s) ci-dessus, et/ou une (ou plusieurs) protéines ou polypeptide(s) recombinant(s) de l'invention, le cas échéant en association avec un (ou plusieurs) autre(s) composé(s) comestible(s).
Par exemple, l'invention a plus particulièrement pour objet toute composition alimentaire susmentionnée contenant de la LPH recombinante obtenue selon l'invention sous forme essentiellement pure ou partiellement pure ou sous forme de plantes et/ou d'extraits enzymatiques tels que décrits ci-dessus éventuellement associée à une ou plusieurs autres activités enzymatiques utiles pour la digestion, de préférence une activité enzymatique de type amylase, protéase (notamment trypsine et chymotrypsine et/ou élastase) Avantageusement, les plantes ou parties de plantes, contenus dans la composition alimentaire susmentionnée, se présentent sous forme de broyats
Les aliments selon l'invention, encore désignes aliments fonctionnels, ou les compositions alimentaires selon l'invention sont plus particulièrement destinés à faciliter l'absorption des graisses animales ou végétales ingérées par un individu sain ou atteint d'une ou plusieurs pathologies affectant ou non le taux de production de lipase gastrique et/ou pancréatique A ce titre, les aliments ou compositions alimentaires de l'invention, sont avantageusement utilises en tant que compléments nutπtionnels L'invention a également pour objet l'utilisation de plantes, ou de parties de plantes, notamment de feuilles et/ou fruits et/ou semences, ou de cellules végétales à activité enzymatique selon l'invention, ou d'exti aits végétaux a activité enzymatique tels que définis ci-dessus, ou encoie de polypeptides recombinants selon l'invention, tels que la LPH l ecombinante, ou ses polypeptides dérivés tels que définis ci-dessus, pour l'obtention de médicaments (ou compositions pharmaceutiques) destines a faciliter l'absoi ption des gi aisses animales ou végétales ingérées par un individu sain ou atteint d'une ou plusieui s pathologies affectant ou non le taux de production de lipase gastrique et/ou pancréatique ou à corriger un désordre alimentaire, notamment Pobesite Notamment, de telles compositions phai maceutiques sont avantageusement utilisées chez les individus subissant un traitement médical altérant le mécanisme d'absorption des graisses, ou encoi e chez les personnes âgées
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont aussi plus particulièrement destinées au traitement des pathologies liées a l'insuffisance de lipases (notamment de lιpase(s) gastnque et/ou panci eatique) dans l'organisme, et plus particulièrement de pathologies telles que la mucoviscidose, l'insuffisance pancréatique exocrine, et P obésité
L'invention a plus particulièrement poui objet toute composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle compi end des plantes, ou parties de plantes selon l'invention, et/ou des extraits de plantes selon l'invention, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon l'invention, le cas échéant en association avec un ou plusieui s véhicules ou excipients pharmaceutiquement acceptables
L'invention a plus particulièrement poui objet toute composition pharmaceutique susmentionnée contenant de la LPH recombinante sous forme essentiellement pure ou sous forme d'extiaits enzymatiques tels que décrits ci- dessus Par exemple, l'invention a plus particulièrement pour objet toute composition pharmaceutique susmentionnée contenant de la LPH recombinante sous forme essentiellement pure ou partiellement pure ou sous forme d'extraits enzymatiques tels que décrits ci-dessus associée à une ou plusieurs autres activités enzymatiques utiles pour la digestion, de préférence une activité enzymatique de type amylase, protéase (notamment trypsine et chymotrypsine et/ou élastase).
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont de préférence administrables par voie orale, et se présentent notamment sous forme de gélules, de comprimés ou de poudres à diluer. La posologie journalière chez l'homme est avantageusement d'environ 200 mg à environ 1000 mg, répartis de préférence au moment des repas principaux, lorsque lesdites compositions pharmaceutiques contiennent des extraits enzymatiques tels que décrits ci-dessus, et d'environ 100 mg à environ 500 mg, lorsque lesdites compositions pharmaceutiques contiennent des polypeptides recombinants selon l'invention sous forme essentiellement pure.
L'invention a également pour objet l'utilisation de plantes, ou de parties de plantes, notamment de feuilles et/ou fruits et/ou semences, ou de cellules végétales à activité enzymatique selon l'invention, ou d'extraits végétaux à activité enzymatique tels que définis ci-dessus, ou encore de polypeptides recombinants selon l'invention, tels que la LPH recombinante, ou ses polypeptides dérivés tels que définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre de réactions enzymatiques dans le domaine industriel, agro-alimentaire ou agro-industriel, notamment dans l'industrie des corps gras, de la lipochimie et l'industrie laitière.
A ce titre, l'invention concerne tout procédé, notamment de bioconversion enzymatique, ou de biocatalyse, par mise en oeuvre d'une ou plusieurs réactions enzymatiques dans le domaine industriel, agro-alimentaire ou agro-industriel, notamment dans l'industrie des corps gras, de la lipochimie et l'industrie laitière, ces réactions enzymatiques étant effectuées au moyen de plantes, ou de parties de plantes, notamment de feuilles et/ou fruits et/ou semences, ou de cellules végétales à activité enzymatique selon • l'invention, ou d'extraits végétaux à activité enzymatique tels que définis ci-dessus, ou encore de polypeptides recombinants selon l'invention, tels que la LPH recombinante, ou ses polypeptides dérivés tels que définis ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet des préparations enzymatiques à destination industrielle, agro-alimentaire ou agro-industrielle, susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci-dessus, et comprenant des plantes, ou parties de plantes selon l'invention, et/ou des extraits de plantes selon l'invention, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon l'invention le cas échéant en association avec un (ou plusieurs) additifs) ou autre(s) enzyme(s) susceptible(s) d'être utilisé(s) dans le cadre de l'application industrielle susmentionnée.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation de plantes, ou de parties de plantes, notamment de feuilles et/ou fruits et/ou semences, ou de cellules végétales à activité enzymatique selon l'invention, pour la mise en oeuvre, à l'échelle industrielle, de réactions de bioconversions enzymatiques, ou de biocatalyses, telles que hydrolyses, ou trans-estérifications enzymatiques.
Avantageusement, les plantes à activité enzymatique, ou parties de ces plantes, notamment les feuilles et/ou fruits et/ou semences, ou de cellules végétales, selon l'invention, sont utilisées à la fois en tant que source enzymatique et substrat réactionnel.
L'invention a également pour objet tout procédé de biocatalyse utilisant des plantes, ou parties de plantes, notamment des feuilles et/ou fruits et/ou semences, ou de cellules végétales à activité enzymatique selon l'invention, et plus particulièrement des plantes contenant la LPH, lesdites plantes, ou parties de plantes, étant utilisées à la fois en tant que source enzymatique et substrat réactionnel.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation des plantes à activité enzymatique, ou de parties de ces plantes, selon l'invention, pour l'obtention de biocarburants.
A ce titre, la présente invention a pour objet tout procédé d'obtention de biocarburant par addition d'alcool, notamment de méthanol ou d'éthanol, à un broyât de tout ou partie de plantes transformées selon l'invention, avantageusement à un broyât de graines de colza, de tournesol ou de soja, transformées selon l'invention, et récupération de biocarburant, notamment par filtration.
L'invention concerne également les esters d'acides gras végétaux tels qu'obtenus par mise en oeuvre du procédé susmentionné, notamment le méthyl ester d'acide oléique. L'invention a également pour objet tout biocarburant tel qu'obtenu par mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci-dessus, et plus particulièrement tout biocarburant susmentionné comprenant des esters d'acides gras végétaux.
L'invention vise plus particulièrement tout biocarburant tel qu'obtenu par mise en oeuvre du procédé susmentionné à partir de graines de colza, et comprenant un méthylester d'acide oléique.
L'invention vise également l'utilisation des anticorps susmentionnés dirigés contre les polypeptides recombinants de l'invention, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection ou de dosage de la LPH dans un échantillon biologique susceptible de la contenir
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation de ces anticorps pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic /// vitro de pathologies liées à la surproduction, ou à l'inverse, à l'insuffisance, vou e l'absence de production de lipase dans l'organisme
Cette méthode de diagnostic /// vnio, lealisee a partir d'un échantillon biologique prélevé chez un patient, compiend une étape de mise en présence de cet échantillon avec un ou plusieurs anticoips selon l'invention, suivie d'une étape de détection des éventuels complexes anticorps-LPH formes lors de l'étape précédente.
A ce titre l'invention concerne également un kit pour la mtse en oeuvre d'une méthode de détection ou de diagnostic /// vitro susmentionnée, comprenant
- des anticorps tels que décrits ci-dessus, avantageusement marqués de manière radioactive ou enzymatique, ainsi que les l éactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation de la leaction imm nologique entre ces anticorps et la LPH,
- les réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés entre ces anticorps et la LPH L'invention concerne également l'association de l'activité lipasique de type pancréatique obtenue selon l'invention avec une activité de type colipase et l'utilisation du produit de cette association notamment dans le cadre du traitement de pathologies associées à un déficit de pioduction de lipase dans l'organisme, telles que la mucoviscidose ou dans le cadi e du traitement de desordre alimentaire, telle que l'obésité
L'activité de type colipase peut provenir d'extraits de plantes exprimant une colipase recombinante (par exemple la colipase humaine) ou un dérivé de cette colipase, un dérivé étant toute protéine ou polypeptide dérive de la colipase susmentionnée par addition et/ou suppiession et/ou substitution d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), cette protéine ou ce polypeptide denvé possédant une activité de type colipase Plus particulièrement, l'activité de type colipase peut provenir d'une colipase ou d'un dérivé de celle-ci purifie ou partiellement purifié à partir de plantes ou d'extraits de plantes exprimant une colipase recombinante (par exemple la colipase pancréatique humaine) ou un dénve de cette colipase L'activité de type colipase , par exemple la colipase humaine peut donc être produite à partir d'une plante transgénique selon les méthodes décrites ci-dessus pour la production de la lipase pancréatique La colipase peut notamment êti e co-expπmée dans la même plante transgénique que la lipase pancréatique Elle peut également être exprimée dans une plante différente et associée ensuite. L'activité de type colipase peut également provenir d'extraits d'origine animale
L'invention concerne donc également, le cas échéant de façon analogue à ce qui est décrit pour l'activité lipase pancréatique selon l'invention l'utilisation d'une séquence nucléotidique recombinante contenant, d'une part, un ADNc codant pour une colipase de mammifères ou pour une protéine ou un polypeptide dérivé, et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire la colipase, ou la protéine ou le polypeptide dérivé, codé par ledit ADNc, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales, pour la transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou de plantes obtenues à partir de ces dernières, d'une colipase recombinante de mammifères, ou d'une protéine ou polypeptide dérivé, l'utilisation des séquences pour la co-transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou de plantes obtenues à partir de ces dernières, d'une lipase pancréatique et d'une co-lipase recombinantes de mammifères, ou de leur dérivés,
- la séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient d'une part la séquence codante pour une colipase ou une protéine ou polypeptide dérivé et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire une colipase pancréatique ou une protéine ou polypeptide dérivé codé par ladite séquence, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales,
- la séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient d'une part les séquences codantes pour une lipase pancréatique et une colipase ou les protéines ou polypeptides dérivés et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire une lipase pancréatique et une colipase ou les protéines ou polypeptides dérivés codés par ladite séquence, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales.
-un vecteur, notamment plasmide, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, insérée en un site non essentiel pour sa réplication.
-un hôte cellulaire, notamment toute bactérie telle que Agrobacterium tumefaciens, transformé par un vecteur tel que défini ci-dessus, -un procédé d'obtention de colipase recombinante, ou d'une protéine ou un polypeptide dérivé, caractérisé en ce qu'il comprend
- la transformation de cellules végétales, notamment à l'aide d'un hôte cellulaire selon l'invention, lui-même transformé pai un vecteur selon l'invention, de manière à intégrer dans le génome de ces cellules une séquence recombinante selon l'invention
- le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules transformées susmentionnées, - la récupération de la colipase recombinante ou de la protéine ou polypeptide dérivé produit dans lesdites cellules ou plantes transformées susmentionnées, notamment par extraction, suivie, le cas échéant, par une purification.
-un procédé de co-obtention de lipase pancréatique et de colipase recombinantes, ou de protéine ou polypeptides dérivés, caractérisé en ce qu'il comprend:
- la transformation de cellules végétales, notamment à l'aide d'un hôte cellulaire selon l'invention, lui-même transformé par un vecteur selon l'invention, de manière à intégrer dans le génome de ces cellules une séquence recombinante selon l'invention
- le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules transformées susmentionnées,
- la récupération de la lipase pancréatique et de la colipase recombinantes ou des protéines ou polypeptides dérivés produit dans lesdites cellules ou plantes transformées susmentionnées, notamment par extraction, suivie, le cas échéant, par une purification.
-les plantes, ou parties de plantes, notamment feuilles et ou fruits et/ou semences et/ou cellules de plantes, transformés génétiquement, caractérisés en ce qu'elles contiennent une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) recombinante(s) selon l'invention, intégrée(s) de façon stable dans leur génome ces plantes étant choisies notamment parmi le colza, le tabac, le maïs, le pois, la tomate, la carotte, le blé, l'orge, la pomme de terre, le soja, le tournesol, la laitue, le riz; la luzerne, et la betterave.
-la colipase recombinante ou protéine ou polypeptide dérivé caractérisé en ce qu'elle est obtenue selon l'invention.
-l'association de lipase pancréatique et de colipase recombinantes ou protéine ou polypeptide dérivés caractérisé en ce qu'elle est obtenu selon le procédé de l'invention,
-l'extrait végétal à activité enzymatique tel qu'obtenu par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il contient de la lipase pancréatique recombinante et/ou de la colipase recombinante ou les protéines ou polypeptides dérivés, - les compositions pharmaceutiques, caractensee en ce qu'elles comprennent une activité de type colipase panci eatique (par exemple la colipase pancréatique humaine), ou de ses dérives, éventuellement associée a une activité de type lipase pancréatique (par exemple LPH), le cas échéant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable
- le procède, notamment de bioconvei sion enzymatique, ou de biocatalyse, par mise en oeuvre d'une ou plusieurs réactions enzymatiques dans le domaine industriel, agro-alimentaire ou agro-industriel, notamment dans l'industrie des corps gras, de la lipochimie et l'industrie laitière, ces reactions enzymatiques étant effectuées au moyen de plantes, ou parties de plantes, notamment feuilles et/ou fruits et/ou semences et/ou cellules de plantes, transformes génétiquement, selon l'invention, d'une activité de type colipase panci eatique (par exemple la colipase pancréatique humaine), ou des polypeptides dérives éventuellement associée à une activité de type lipase pancréatique (pai exemple LPH) - les préparations enzymatiques a destination industnelle, agro-alimentaire ou agro-industrielle compi enant un (ou plusieui s) e\tι aιt(s) végétal (végétaux) a activité enzymatique selon l'invention, et/ou une colipase pancréatique purifiée ou partiellement purifiée (pai exemple la colipase pancréatique humaine), ou des polypeptides dérives éventuellement associée a une activité de type lipase pancréatique (par exemple LPH),
- l'utilisation de plantes, ou parties de plantes, notamment feuilles et/ou fruits et/ou semences et/ou cellules de plantes, ti anstonnes génétiquement, selon l'invention et exprimant une activité de type colipase pancréatique (par exemple la colipase pancréatique humaine), ou des polypeptides dérives éventuellement associée à une activité de type lipase pancréatique (par exemple LPH), pour la mise en oeuvre, à l'échelle industrielle, de reactions de bioconversions enzymatiques, ou de biocatalyses, telles que hydrolyses, ou trans-esteπfications enzymatiques,
- le procédé de biocatalyse utilisant des plantes, ou parties de plantes, notamment feuilles et/ou fruits et/ou semences et/ou cellules de plantes, transformés génétiquement, selon l'invention lesdites plantes, ou fragments, ou cellules, ou semences, étant utilisées a la fois en tant que source d'une activité de type colipase pancréatique (pai exemple la colipase pancréatique humaine éventuellement associée a une activité de type lipase pancréatique (par exemple LPH) et substrat réactionnel - l'utilisation de plantes, ou parties de plantes, notamment feuilles et/ou fruits et/ou semences et/ou cellules de plantes, transtoi mes génétiquement, selon l'invention et exprimant une activité de type colipase pancréatique (par exemple la colipase pancréatique humaine éventuellement associée a une activité αe type lipase pancréatique (par exemple LPH), pour l'obtention de biocarburants.
- le procédé d'obtention de biocarburant par addition d'alcool, notamment de méthanol ou d'ethanol, à un broyât de tout ou partie de plantes, transformées génétiquement selon la l'invention et/ou d'une activité de type colipase pancréatique (par exemple la colipase pancréatique humaine) éventuellement associée à une activité de type lipase pancréatique (par exemple LPH), et récupération de biocarburant, notamment par filtration.
EXEMPLES I. CONSTRUCTION DE GENES CHIMERIQUES CODANT LA LIPASE
PANCREATIQUE RECOMBINANTE HUMAINE (LPH) ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES FEUILLES ET GRAINES DE SOLANACEES. 1.1. CONSTRUCTION DE GENES CHIMERIQUES CODANT LA LPH RECOMBINANTE ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LE TABAC
L'expression dans les feuilles et les graines de tabac du gène codant pour la lipase pancréatique humaine (LPH) a nécessité les séquences régulatrices suivantes:
1. le promoteur constitutif double 35S (Pd35S) du CaMV (virus de la mosaïque du chou-fleur). II correspond à une duplication des séquences activant la transcription situées en amont de l'élément TATA du promoteur 35S naturel (Kay et al., 1987);
2. la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA 35S, qui correspond à la région 3' non codante de la séquence du virus à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S . Les constructions des différents plasmides via l'utilisation de techniques d'ADN recombinant dérivent de pBIOCA Ce plasmide binaire dérive de pGA492 (An et al, 1986) qui contient entre les bordures droite et gauche; issues du plasmide pTiT37 d'Agi obacterium tumefaciens, sur son ADN de transfert, les séquences suivantes: le promoteur constitutif du gène NOS de la nopaline synthase, la séquence codante du gène nptll codant pour la néomycine phosphotransférase II délétée de la région des 8 premiers codons dont le codon initiateur méthionine ATG et fusionnée à la séquence des 14 premiers codons de la séquence codante du gène nos, la séquence codante du gène nos dépourvue de la région des 14 premiers codons, le terminateur nos, une région contenant des sites multiples de clonage
(encore désignée polylinker) (HindIII-Xbal-SacI-Hpal-Kpnl-CIal-BglII) précédant le gène cat codant pour la chloramphénicol et les séquences terminatrices du gène 6 du plasmide pTiAό d'Agrobacterium tumefaciens (Liu et al, 1993) Pour éliminer la quasi-totalité de la séquence codante du gène cat, le plasmide pGA492 a été doublement digéré par Sacl (site de restriction du polylinker) et par Scal (site de restriction présent dans la séquence du gène cat) puis soumis à l'action de l'enzyme T4 DNA polymérase (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant. La ligation du plasmide modifié (20 ng) a été réalisée dans un milieu réactionnel de 10 μl contenant 1 μl du tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham); 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à I 4°C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia co/i DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan et al., 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 12 μg/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Puis, le site de restriction Hindlll de l'ADN plasmidique du clone retenu a été modifié en un site de restriction EcoRI à l'aide d'un adaptateur HindIII-EcoRI phosphorylé (Stratagene Cloning Systems). Pour réaliser cette modification, 500 ng d'ADN plasmidique du clone retenu ont été digérés par Hindlll, déphosphorylés par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant et coprécipités en présence de 1500 ng d'ADN adaptateur HindIII-EcoRI, 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'ethanol absolu à -S0°C pendant 30 min. Après centrifugation à 12000 g pendant 30 min., l'ADN précipité a été lavé à l'éthanol 70%, séché, repris dans 8 μl d'eau, porté à 65°C pendant 10 min., puis ligué en présence de 1 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Après inactivation de la T4 DNA ligase à 65°C pendant 10 min., le mélange réactionnel de ligation a été digéré par EcoRI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, précipité en présence de 1/10 de volume de
3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes d'ethanol absolu à -80°C pendant 30 min., centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à l'éthanol 70%, séché, puis ligué comme décrit ci-dessus. Les bactéries Escherichia c /i DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 12 μg/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé , par digestion enzymatique par Hindlll et EcoRI notamment. Le plasmide binaire résultant, qui ne possède plus que les 9 derniers codons de la séquence codante du gène cat et dont le site EcoRI est unique, a été appelé pBIOC4. La cassette d'expression, constituée du promoteur Pd35S et du terminateur polyA 35S, a été isolée à partir du plasmide p.HT 163Δ. Le plasmide pJIT163Δ dérive du plasmide pJIT 163 qui dérive lui-même du plasmide pJIT60 (Guerineau et Mullineaux, 1993). Le plasmide pJIT 163 possède un codon ATG entre les sites Hindlll et Sali du polylinker. Pour supprimer cet ATG et obtenir le plasmide pJIT163Δ, l'ADN plasmidique pJIT163 a été digéré doublement par Hindlll et Sali, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué, précipité en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes d'ethanol absolu à -80°C pendant 30 min., centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à l'éthanol 70%, séché, soumis à l'action de l'enzyme Klenow (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant, déproteinisé par extraction avec 1 volume de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25:24: 1) puis 1 volume de chloroforme: alcool isoamylique (24: 1), précipité en présence de 1/10 volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes d'ethanol absolu à -80°C pendant
30 min., centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à l'éthanol 70%, séché, et enfin, ligué en présence de 1 μl du tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 μg/ml ampicilline a été extrait selon la méthode de la lyse et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Pour isoler la cassette d'expression constituée du promoteur Pd35S et du terminateur polyA 35S (fragment Sacl- Xhol), l'ADN plasmidique du clone pJIT I 63Δ retenu a été digéré par Sacl et Xhol. Le fragment Sacl-Xhol, portant la cassette d'expression a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué , précipité en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes d'ethanol absolu à - 80°C pendant 30 min., centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à l'éthanol 70%, séché, puis soumis à l'action de l'enzyme Mung Bean Nuclease (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant. Cet insert purifié (200 ng) a été clone dans l'ADN plasmidique de pBIOC4 (20 ng) digéré par EcoRI, traité par l'enzyme Mung Bean Nuclease et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La réaction de ligation a été effectuée dans 20 μl en présence de 2 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 μl de 50% polyéthylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 12 μl/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Le plasmide résultant a été appelé pBIÔC21. - c,
La lipase pancréatique humaine (LPH) est naturellement synthétisée sous forme d'un précurseur de 465 acides aminés La protéine mature LPH est constituée de 449 acides aminés
1.1.1. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE CONTENANT PS- LPH.
Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la LPH a été digéré afin de supprimer la séquence codant le peptide signal de la LPH constitué de 16 acides aminés. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal PS de la sporamine A de patate douce (Murakami et al., 1986; Matsukoa et Nakamura, 1991 ) de 23 acides aminés (A TG AAA GCC TIC ACA CTC GCT CTC
TTC TTA GCT CT ' TCC CTC TA T CTC CTG (TC A A T CC A GCC CA T TCC) en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe I.
Après digestion enzymatique, les fragments d'ADN issus de l'amplification
PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués , précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de
2,5 volumes d'ethanol absolu à -80°C pendant 30 min , centrifugés à 12000 g pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%, sèches, puis ligués à l'ADN plasmidique digéré, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant La ligation a été réalisée selon le procédé décrit dans à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983) L'ADN plasmidique des clones obtenus, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains clones retenus a été vérifiée par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7 * M commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides.
Les séquences du PS et de LPH mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte La séquence de clivage entre les séquences du PS et de
LPH mature est Ser-Lys. A partir du plasmide résultant, le fragment portant la séquence de PS-LPH a été isolé par digestion enzymatique, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué , précipité à alcool, séché. Puis, ce fragment d'ADN traité a été ligué à l'ADN plasmidique de pBIOC21 digéré, traité et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau
(Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant La ligation, la transformation des bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus et la séquence nucléotidique du fragment codant pour la protéine recombinante PS-LPH ont été réalisées comme décrit précédemment. L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et al. ( 1978) 1.1.2. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE CONTENANT PPS-
LPH.
Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la LPH a été digéré afin de supprimer la séquence codant le peptide signal de la LPH constitué de 16 acides aminés. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal PPS de la sporamine A de patate douce (Murakami et al., 1986; Matsukoa et Nakamura, 1991) de 37 acides aminés (A TG AAA GCC TIC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TA T CTC CTG CGC A A T CCA GCC CAT TCC AGG TTC AA T CGC A TC CGC CTC CGC ACC ACA CAC GAA CCC GCC) en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe I. Les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été traités de façon similaire à celle décrite en 1. 1. 1.
Les séquences du PPS et de LPH mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouvertes. La séquence de clivage entre les deux séquences est Ala-Lys. Le plasmide résultant est traité comme décrit en 1. 1 . 1 . L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de
Holsters et al. (1978).
1.1.3. CONSTRUCTION DU PLASM I DE BINAIRE CONTENANT
PSLGL-LPH. La lipase gastrique de lapin est synthétisée sous forme d'un précurseur composé d'un peptide signal de 22 acides aminés, situé à l'extrémité NH2~terminale et précédant la séquence polypeptidique de la lipase mature, le clone pJOlOl contenant l'ADNc complet codant pour la lipase gastrique de lapin est décrit dans la demande de brevet européen EP542629 Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la LPH a été digéré afin de supprimer la séquence codant pour le peptide signal de la LPH constitué de 16 acides aminés. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal de la lipase gastrique de lapin constituée des 22 acides aminés suivants: MWVLFMVAALLSALGTTHGLFG (A TG TCC, GTG GIT TTC A TG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CA T GGT CTT TTT GGA) en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe I.
Les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été traités de façon similaire à celle décrite en 1. 1 1 Les séquences du PSLGL et de la LPH mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouvertes (c'est-à-dire, de telle sorte qu'elles constituent une phase ouverte de lecture unique). La séquence de clivage entre les séquences PSLGL et LPH mature est Gly-Lys. Le plasmide résultant est traité comme décrit en LA. a.
L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et al. (1978).
1.1.4. CONSTRUCTION DU PLASMI DE BINAIRE CONTENANT PSLPH-LPH.
Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la LPH (465 acides aminés) comprend le peptide signal PSLPH de 16 acides aminés (A TG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA G TA GCA GGA).
Le fragment d'ADN portant le cDNA complet codant pour la LPH a été traité de façon similaire à celle décrite en 1. 1 . 1 .
La séquence de clivage entre les deux séquences codant pour PSLPH et LPH est GLy-Lys.
L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et al. (1978).
1.2. CONSTRUCTION DE GENES CHIMERIQUES CODANT POUR LA LPH RECOMBINANTE ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LA TOMATE.
Les constructions utilisées sont les mêmes que celles citées pour la transformation génétique du tabac.
II. CONSTRUCTION DE GENES CHIMERIQUES CODANT POUR LA PROTEINE RECOMBINANTE DE COLIPASE PANCREATIQUE HUMAINE (COLPH) ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES FEUILLES ET GRAINES DE SOLANACEES. II.1. CONSTRUCTION DE GENES CHIMERIQUES CODANT POUR
LA COLPH RECOMBINANTE ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LE TABAC
L'expression dans les feuilles et les graines de tabac du gène codant pour la colipase pancréatique humaine (COLPH) a nécessité les séquences régulatrices décrites dans le cas de la lipase pancréatique humaine en 1. 1.
Le plasmide binaire pBÏOC21 décrit en I I . est également utilisé. La colipase pancréatique humaine (COLPH) est naturellement synthétisée sous forme d'un précurseur de 1 12 acides aminés La protéine mature COLPH est constituée de 95 acides aminés.
II.1.1. CONSTRUCTION DU PLASM IDE BINAIRE CONTENANT PSLGL-COLPH.
La lipase gastrique de lapin est synthétisée sous forme d'un précurseur composé d'un peptide signal de 22 acides aminés, situé à l'extrémité NH2-terminale et précédant la séquence polypeptidique de la lipase mature, le clone pJOlOl contenant l'ADNc complet codant pour la lipase gastrique de lapin est décrit dans la demande de brevet européen EP542629
Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la COLPH a été digéré afin de supprimer la séquence codant le peptide signal de la COLPH constitué de 17 acides aminés. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal de la lipase gastrique de lapin constituée des 22 acides aminés suivants: MWVLFMVAALLSALGTTHGLFG (A TG TGG GTG CTT TTC
ATG GTG GCA GCT T/ CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CA T GGT CTT TTT GGA) en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe I.
Les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été traités de façon similaire à celle décrite en 1. 1. 1.
Les séquences du PSLGL et de la COLPH mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouvertes (c'est-à-dire, de telle sorte qu'elles constituent une phase ouverte de lecture unique). La séquence de clivage entre les séquences PSLGL et COLPH mature est Gly-Ala Le plasmide résultant est traité comme décrit en 1.1.1.
L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et a/. (1978).
II.1.2. CONSTRUCTION DU PLASMI DE BINAIRE CONTENANT PSCOLPH-COLPH.
Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la COLPH ( 1 12 acides aminés) comprend le peptide signal PSCOLPH de 17 acides aminés (A TG GAG AAG ATC CTG A TC CTC CTG CTT GTG GCC CTC TCT GTG GCC TA TGCA). Le fragment d'ADN portant le cDNA complet codant pour la COLPH a été traité de façon similaire à celle décrite en 1. 1.1
La séquence de clivage entre les deux séquences codant pour PSCOLPH et COLPH est Ala-Lys. ~
L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et al. (1978).
III. CONSTRUCTION DE GENES CHIMERIQUES CODANT LA LIPASE PANCREATIQUE RECOMBINANTE HUMAINE (LPH) ET
PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES GRAINES DE COLZA.
III.1.1. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE CONTENANT LE PROMOTEUR PCRU.
La production dans les graines de colza de la lipase pancréatique humaine (LPH) a nécessité l'insertion de l'ADNc codant pour la LPH entre les séquences régulatrices suivantes:
1. le promoteur PCRU correspondant à la région 5' non codante du gène de la protéine de réserve de graines, la CRUCIFERINE A de radis (Depigny-This et al, 1992) et permettant une expression spécifique dans les graines; 2. la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA 35S, qui correspond à la région 3' non codante de la séquence du viais à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S .
Pour obtenir un plasmide binaire similaire à pBlOC21 mais dont le promoteur Pd35S a été remplacé par le promoteur PCRU, le fragment "EcoRI traité à la Klenow-BamHI", contenant le promoteur PCRU a été isolé à partir du plasmide pBI221 -CRURSP dérivant de pBI221 (commercialisé par Clontech) par remplacement du promoteur 35S par le promoteur PCRU.
Le fragment "EcoRI traité à la Klenow-BamHI" portant le promoteur PCRU a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et ligué à l'ADN plasmidique de pJIT163 (décrit dans le paragraphe 1.), digéré par Kpnl, traité à la T4 DNA
Polymérase (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant, puis digéré par BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué
(Sambrook et al, 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer
Mannheim) selon les recommandations du fabricant La ligation a été réalisée avec
20 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 200 ng de fragments d'ADN
"EcoRI traité à la Klenow-BamHI" dans un milieu réactionnel de 20 μl en présence de 2 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 μl de 50% polyéthylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur un milieu contenant 50 μg/ml d'ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC27
La cassette d'expression, constituée du promoteur PCRU et du terminateur polyA 35S a été isolée à partir de pBIOC27 par digestion totale Xhol suivie d'une digestion partielle EcoRI. Elle a été purifiée par électrophorèse sur gel d'agarose
0,8%, électroéluée, soumise à la précipitation alcoolique, séchée, . traitée à la Klenow (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant et liguée à l'ADN plasmidique de pBIOC4 au site EcoRI traité à la Klenow et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 20 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 200 ng de fragments d'ADN XhoI-EcoRI décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 20 μl en présence de 2 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 μl de 50% polyéthylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées
(Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur un milieu contenant 12 μg/ml de tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction appropriés. Le plasmide résultant a été appelé pB IOC28. III.1.2. CONSTRUCTION DU PLASMI DE BINAIRE CONTENANT
PSLPH-LPH.
Le fragment portant la séquence PSLPH-LPH a été ligué à l'ADN plasmidique de pBIOC28 digéré, traité et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant.
La ligation, la transformation des bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus et la séquence nucléotidique du fragment codant pour la protéine recombinante PSLPH-LPH ont été réalisées comme décrit précédemment. L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans la souche
LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et al. (1978). IV. CONSTRUCTION DE GENES CH IMERIQUES CODANT LA COLIPASE PANCREATIQUE RECOMBINANTE HUMAINE (COLPH) ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES GRAINES DE COLZA. IV.1.1. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE CONTENANT
PSCOLPH-COLPH SOUS CONTROLE DU PROMOTEUR PCRU.
Le fragment portant la séquence PSCOLPH-COLPH a été ligué à l'ADN plasmidique de pBIOC28 digéré, traité et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant.
La ligation, la transformation des bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus et la séquence nucléotidique du fragment codant pour la protéine recombinante
PSCOLPH-COLPH ont été réalisées comme décrit précédemment. L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et al. (1978). V. CONSTRUCTION DE GENES CHIMERIQUES CODANT LA
LIPASE PANCREATIQUE RECOMBINANTE HUMAINE (LPH) ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES SEMENCES DE MAIS.
V. l . l. CONSTRUCTION DE PLASM1 DES CONTENANT PSLPH- LPH ET PERMETTANT UNE EXPRESSION CONSTITUTIVE DANS LES SEMENCES DE MAIS.
L'expression constitutive dans les semences de mais de la séquence nucléotidique animale codant pour la lipase pancréatique humaine (LPH) a nécessité les séquences régulatrices suivantes :
1. un des deux promoteurs permettant une expression constitutive : - promoteur actine de riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-IAR) contenu dans le plasmide pAct 1-F4 décrit par McEIroy et al. ( 1991 ) ;
- promoteur constitutif double 35S (Pd35S) du CaMV (virus de la mosaïque du chou-fleur). Il correspond à une duplication des séquences activant la transcription situées en amont de l'élément TATA du promoteur 35S naturel (Kay ét al., 1987);
2. un des deux terminateurs :
- la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA 35S, qui correspond à la région en 3' non codante de la séquence du virus à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S; - la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline .
Le plasmide où la séquence codant pour PSLPH-LPH est placée sous contrôle de PAR-IAR a été obtenu par clonage du fragment portant la séquence codant pour PSLPH-LPH dans pBSU-PAR-lAR-TNOS.
Le fragment portant la séquence codant pour PSLPH-LPH a été isolé par digestion enzymatique, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué, soumis à la précipitation alcoolique, séché, puis traité. Le plasmide pBSII-PAR-IAR-tNOS a ete digère, purifie, traite et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations des fabricants La ligation, la transformation des bactei ies Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus et la séquence nucléotidique du fragment codant pour la protéine recombinante PSLPH-LPH ont été réalisées comme decnt précédemment
Le plasmide pBSII-PAR-IAR-TNOS résulte du clonage aux sites "Eco0109I traité à la Klenow et Kpnl" de pBSII-TNOS du fi agment SnaBI-Kpnl portant la séquence correspondant à "PAR-IAR-début de la séquence codante pour le gène gus" isolé à partir du plasmide pAct l -F4 La ligation, la transformation des bactéries Escherichia coli DH5 rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus ont ete réalisées comme décrit précédemment
Le plasmide pBSII-TNOS a ete obtenu par clonage au site EcoRV déphosphorylé de pBSIISK+ commei cialise pai Su atagene, du fragment Sacl-
EcoRI portant la séquence TNOS isole a p i tn de pBI 12 1 commercialisé par Clontech par double digestion enzymatique pai Sacl et EcoRV, soumis à une purification par électrophorèse sur gel d'agarose a 2%, et traite a l'enzyme T4 DNA polymérase La ligation, la transformation des bactei ies Eschei ichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ΛDN plasmidique des clones obtenus ont été réalisées comme decnt pi ecedemment
Le plasmide ou la séquence codant poui PSLPH-LPH est placée sous contrôle de Pd35S a ete obtenu pai clonage aux sites "Kpnl et BamHI" du plasmide pBSII-T35S du fragment portant la séquence correspondant a "Pd35S- PSLPH-LPH" isolé La ligation, la transfoi mation des bactéries Escherichia coli
DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus ont été réalisées comme déçut pi ecedemment
Le plasmide pBSIl-T35S a ete obtenu par clonage au site Spel traité à la Klenow, déphosphorylé du plasmide pBSIISK+ commei cialise par Stratagène, du fragment Smal-EcoRV portant la séquence T35S isolé a partir de pJIT163 (décrit ci-dessus) par double digestion enzymatique par Smal et EcoRV, soumis à une purification par électrophorèse sur gel d'agai ose a 2% La ligation, la transformation des bactéries Eschei iclua coli DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus ont été réalisées comme décrit précédemment
V 1 2 CONSTRUCTION DE PLASMI DES CONTENANT PSLPH- LPH ET PSLPH-LPH-KDEL RESPECTIVEMENT ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS L'ALBUMEN DES SEM ENCES DE MAIS L'expression dans l'albumen des semences de mais du gène codant pour la lipase pancréatique humaine (LPH) a nécessité les séquences régulatrices suivantes
1 le promoteur du gène de zéine de mais (Pvzeine) contenu dans le plasmide p63 décrit dans Reina et al , 1990 Le plasmide p63 l ésulte du clonage de Pγzéine aux sites HindlII et Xbal d'un plasmide pUC18 i enfermant, entre ses sites HindlII et EcoRI, la cassette d'expression "P35S-gus-TNOS" de pBI221 commercialisé par Clontech. Il permet une expression dans l'albumen des semences de mais
2 la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche a nopaline
Le plasmide où la séquence codant pour PSLPH-LPH est placée sous contrôle du Pγzéine, a été obtenu par clonage dans le plasmide p63 du fragment portant la séquence codant pour PSLPH-LPH La ligation, la transformation des bactéries Escherichia coli DH5α rendues pi ealablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus ont ete î ealisées comme décrit précédemment
Dans ce plasmide, la séquence codant poui le teti apeptide KDEL a été introduite en amont du codon STOP pour pei metti e un adressage dans le réticulum endoplasmique
VI CONSTRUCTION DE GENES CH I MERIQUES CODANT LA COLIPASE PANCREATIQUE RECOMBINANTE HUMAINE (COLPH) ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES SEMENCES DE MAIS
VI 1 1 CONSTRUCTION DE PLΛSM1 DES CONTENANT PSCOLPH-COLPH ET PERMETTANT UNE EXPRESSION CONSTITUTIVE
DANS LES SEMENCES DE MAIS
L'expression constitutive dans les semences de mais de l'ADNc codant pour la colipase pancréatique humaine (COLPH) a nécessité les séquences régulatrices décrites en V 1 1 Le plasmide où la séquence codant poui PSCOLPH-COLPH est placée sous contrôle de PAR-IAR a été obtenu pai clonage du fragment portant la séquence codant pour PSCOLPH-COLPH dans pBSIl-PAR-1 ΛR-TNOS
Le fragment portant la séquence codant poui PSCOLPH-COLPH a été isolé par digestion enzymatique, purifié par électi ophoi èse sur gel d'agarose 2%, électroélué, soumis à la précipitation alcoolique, sèche, puis traité Le plasmide pBSII-PAR-IAR-TNOS a été digéré, purifie, traite et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations des fabricants La ligation, la transformation des bactei ies Eschei ichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus et la séquence nucléotidique du fragment codant pour la protéine recombinante PSCOLPH-COLPH ont été réalisées comme décrit précédemment Le plasmide pBSII-PAR-IAR-TNOS utilisé est déçut en V 1 1 Le plasmide où la séquence codant pour PSCOLPH-COLPH est placée sous contrôle de Pd35S a été obtenu par clonage aux sites "Kpnl et BamHI" du plasmide pBSII-T35S du fragment portant la séquence correspondant à "Pd35S- PSLPH-LPH" isolé La ligation, la transformation des bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus ont été réalisées comme décrit précédemment
Le plasmide pBSII-T35S a été décrit en V 1 I
VI 1 2 CONSTRUCTION DE PLASMIDES CONTENANT PSCOLPH-COLPH ET PSCOLPH-COLPH-KDEL RESPECTIVEMENT ET PERMETTANT UNE EXPRESSION D ANS L'ALBUMEN DES SEMENCES DE MAIS
L'expression dans l'albumen des semences de mais de l'ADNc codant pour la colipase pancréatique humaine (COLPH ) a nécessité les séquences régulatrices décrites en V 1 2
Le plasmide où la séquence codant pour PSCOLPH-COLPH est placée sous contrôle du Pγzéine, a été obtenu par clonage dans le plasmide p63 du fragment portant la séquence codant poui PSCOLPH-COLPI 1 La ligation, la transformation des bactéries Eschei ichta coli DH5α î endues pi éalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus ont ete î ealisées comme décrit précédemment Dans ce plasmide, la séquence codant pour le tétrapeptide KDEL a été introduite en amont du codon STOP pour permettre un adi essage dans le réticulum endoplasmique
VII CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE BINAIRE COEXPRIMANT
LES GENES CHIMERIQUES CODANT LA LIPASE PANCREATIQUE HUMAINE (LPH) ET DE LA COLIPASE PANCREATIQUE HUMAINE
(COLPH) RECOMBINANTES ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS
LES FEUILLES ET GRAINES DE SOLANACEES
VII 1 CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE DE COEXPRESSION pBIOC43 Le plasmide binaire de coexpi essio permet une expi ession de deux gènes dans le même vecteur binaire
Le plasmide binaire de coexpi ession denve de pBIOC2 l II contient deux cassettes d'expression constituées chacune d'un pi oinoteur Pd35S et d'un terminateur polyA 35S mais qui différent par le polylinker séparant le promoteur du terminateur. L'une des cassettes d'expression est celle de pBIOC21 déjà décrite en I. L'autre cassette d'expression a été obtenue en remplaçant le polylinker HindIII-BamHI-Smal-EcoRI de pJIT 163D par un adaptateur HindIII-EcoRI portant les sites de restriction Pacl, Ascl, Mlul et Hpal. Cet adaptateur a été obtenu par renaturation des 2 oligodésoxynucléotides 5' AGC TGA TTA ATT AAG GCG CGC CAC GCG TTA AC 3' et 5' AAT TGT TAA CGC GTG GCG CGC CTT AAT TAA TC 3' qui sont complémentaires pour leurs 28 nucléotides 3' terminaux. Cent μmoies de chacun de ces deux oligodésoxynucléotides ont été préalablement phosphorylés par action de 10U d'enzyme T4 polynucléotide kinase
(New England Biolabs) dans un volume réactionnel total de 10 μl contenant 1 μl de tampon T4 polynucléotide kinase x 10 (New England Biolabs) et de 3 μl d'ATP (95mM). Les deux mélanges réactionnels ont été incubés à 37°C pendant 1 heure, puis à 65°C pendant 20 min. Ils ont été ensuite rassemblés et leur volume a été complété à 500 μl. Après extraction avec un volume de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24: 1 ) et 1 volume de chlorofoπne:alcool isoamylique (24: 1), 50 μl de 3M acétate de sodium pHό.O ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été incubé à 80°C pendant 10 min;, puis refroidi lentement à température ambiante. L'ADN a ensuite été précipité en présence de 2,5 volumes d'ethanol absolu à -80°C pendant 30 min., centrifugé à 14000g à 4°C pendant 1 heure, lavé à l'éthanol 70%, centrifugé à 14000g à 4°C pendant 10 min., séché, repris dans 10 μl de H20. Le fragment d'ADN Hindi Il-EcoRI a ensuite été clone aux sites HindIII-EcoRI de l'ADN plasmidique pJIT 163D préalablement déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant. La réaction de ligation a été effectuée dans un volume réactionnel de 20 μl en présence de 1 U de T4 DNA ligase (Gibco-BRL) pour une concentration totale d'ADN de 8,5 nM avec un rapport molaire vecteur/insert de 1 et de 4 μl de tampon T4 DNA ligase x 5 (Gibco-BRL) à 25°C pendant 16 heures. Les bactéries, rendues préalablement compétentes, ont été transformées . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 100 μg /ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique. Le clone résultant a été appelé pBIOC42. Sa validité a été vérifiée par séquençage à l'aide du kit "Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing" commercialisé par United States Biochemical (USB) selon la méthode des didésoxynucléotides .Les conditions réactionnelles suivent les indications du fabricant excepté pour la dénaturation et l'hybridation. Le milieu réactionnel contenant l'ADN plasmidique (0,5 à I pmoles), l'amorce oligonucléotidique (2 pmoles , 10% de DMSO et le tampon réactionnel \ I (USB), est incubé à 100°C pendant 10 min , puis refroidi brutalement a - 80°C dans la carboglace
A partir de pBIOC42, le fiagment codant pour la cassette d'expression constituée du promoteur Pd35S et du terminateur poly 35S a ete isolé par double digestion par Sacl et Xhol II a ete purifie par électrophorèse sur gel d'agarose
0,75%, puis soumis a l'action du kit "Geneclean II" commercialisé par BIO101 selon les indications du fabricant La ligation a ete réalisée dans un volume réactionnel de 20 μl en présence de 1 U de T4 DNA ligase (Gibco-BRL) pour une concentration totale d'ADN de 8,5 nM avec un i apport molaire vecteur/insert de 1 et de 4 μl de tampon T4 DNA ligase x 5 (Gibco-BRL) a 25°C pendant 16 heures
Les bactéries, E coli DH5 α rendues préalablement compétentes, ont été transformées L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 30 μg / ml de chloramphénicol, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique Le plasmide résultant a ete appelé pBIOC75 A partir de pBIOC75, le fi agment d'ADN portant la cassette d'expression constituée du promoteur Pd35S et du tei mmateui polyA 35S a été isolée par digestion par Kpnl II a ete punfie par electiophoiese sur gel d'agarose 0,75%, puis soumis à l'action du kit "Geneclean II" commeicialise par BIO101 selon les indications du fabricant Puis, ce fi agment d'ADN a ete ligue a l'ADN plasmidique de pBIOC21 digéré par Kpnl et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) selon les lecommandations du fabricant La ligation a ete réalisée dans un volume réactionnel de 20 μl en présence de 1 U de T4 DNA ligase (Gibco-BRL) pour une concentiation totale d'ADN de 8,5 nM avec un rapport molaire vecteui/insei t de I et 4 μl de tampon T4 DNA ligase x 5 (Gibco-BRL) a 25°C pendant 16 heures Les bacteiies, E coli DH5 α rendues préalablement compétentes, ont ete transformées L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 12 μg /ml de tetiacycline, a ete extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analyse par digestion enzymatique Le plasmide résultant a été appelé pBIOC43 VII 2 CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE COEXPRIMANT
LES GENES CHIMERIQUES CODANT LA LIPASE PANCREATIQUE HUMAINE (LPH) ET DE LA COLIPASE PANCREATIQUE HUMAINE (COLPH) RECOMBINANTES
Les ADNc codant pour les séquences "PSLPH-LPH" et "PSCOLPH- COLPH" ont ete clonees chacune sous contrôle du promoteur constitutif Pd35S et du terminateur 35S dans le vecteur de coexpression pB10C43 La ligation, la transformation des bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus ont été réalisées comme décrit précédemment
VIII. EXEMPLE D'OBTENTION DE PLANTS DE COLZA TRANSGENIQUES.
Les graines de colza de printemps (Brassica napiis cv WESTAR ou lignées Limagrain) sont désinfectées pendant 40 minutes dans une solution de Domestos (marque déposée) à 15%. Après 4 rinçages à l'eau stérile, les graines sont mises à germer, à raison de 20 graines par pot de 7 cm de diamètre et 10 cm de haut, sur du milieu minéral de Murashige et Skoog (Sigma M 5519) avec 30g/l de saccharose et solidifié avec de l'agargel à 5g/l. Ces pots sont placés dans une chambre de culture à 26°C avec une photopéiïode de 16h/8h et sous une intensité lumineuse de l'ordre de 80 μE m-- s" 1
Après 5 jours de germination, les cotylédons sont prélevés stérilement en coupant chaque pétiole environ 1 mm au-dessus du noeud cotylédonaire.
Parallèlement une préculture d'Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404, contenant les plasmides, à savoir, le plasmide pGAZE dans lequel a été inséré la séquence codant pour la lipase pancréatique humaine fusionnée à celle codant pour un signal d'adressage (PS, PPS, PSLGL, PSPHP) sous contrôle du promoteur PCRU (ou Pd35S), est réalisée en erlenmeyer de 50 ml, pendant 36 h à
28°C dans 10 ml de milieu bactérien 2YT complémenté avec les antibiotiques utiles à la sélection de la souche utilisée
Cette préculture sert à ensemencer à 1% une nouvelle culture bactérienne effectuée dans les mêmes conditions Au bout de 14 h la culture est centrifugée 15 min à 3000 g et les bactéries sont reprises dans un volume équivalent de milieu de germination liquide. Cette suspension est distribuée dans des boîtes de pétri de 5 cm de diamètre à raison de 5 ml/boîte
L'extrémité sectionnée du pétiole est immergée quelques secondes dans la solution d'agrobactéries ainsi préparées, puis le pétiole est enfoncé de quelques millimètres dans le milieu de régénération Ce milieu a la même composition de base que le milieu de germination avec en plus 4 ιng/1 de benzyl-amino-purine (BAP), phytohormone favorisant la néoformation de bourgeons Dix explants (cotylédon avec pétiole) sont mis en culture par boîte de pétri de 9 cm de diamètre (Greiner référence 664102). Après 2 jours de coculture dans les mêmes conditions environnementales que les germinations, les explants sont repiqués dans des boîtes phytatray (Sigma, référence PI 552) contenant le milieu précédent complémenté avec un agent sélectif: 45 mg/l de sulfate de kanamycine (Sigma, référence K4000) et un bactériostatique: mélange de 1/6 (en poids) de sel de potassium d'acide clavulanique et de 5/6 sel de sodium d'amoxicilline (Augmentin injectable) à raison de 600 mg/1.
Deux fois de suite, à 3 semaines d'intervalle, les explants sont repiqués stérilement sur du milieu neuf dans les mêmes conditions.
Les bourgeons verts apparus à la fin du deuxième ou du troisième repiquage sont séparés de l'expiant et mis en culture individuellement dans des pots transparents de 5 cm de diamètre et de 10 cm de haut contenant un milieu identique au précédent mais dépourvu de BAP. Après 3 semaines de culture la tige du bourgeon transformé est sectionnée et le bourgeon est repiqué dans un pot de milieu frais. Au bout de trois à quatre semaines les racines sont assez développées pour permettre l'acclimatation de la plantule dans un phytotron. Les bourgeons qui ne sont pas verts ou enracinés sont éliminés. Ces plantules sont alors transplantées dans des godets de 7 cm de côté remplis de terreau (norme NF U44551 : 40% tourbe brune, 30% bruyère tamisée et 30%> sable) saturé en eau. Après deux semaines d'acclimatation en phytotron (température 2 I °C, photopériode 16h/8h et
84%> d'humidité relative), les plantules sont rempotées dans des pots de 12 cm de diamètre remplis du même terreau enrichi en engrais retard Osmocote (marque déposée), à raison de 4 g 1 de terreau puis transportées en serre (classe S2) régulée à 18°C, avec deux arrosages quotidien de 2 minutes à l'eau.
Dès l'apparition de fleurs celles-ci sont ensachées (Crispac, référence SM 570y 300 mm*700 mm) de façon à empêcher la fécondation croisée.
Lorsque les siliques sont arrivées à maturité, elles sont récoltées, séchées, puis battues. Les graines obtenues servent au dosage de l'activité biochimique. La sélection de la descendance transgénique se fait par germination sur un milieu contenant du sulfate de kanamycine à raison de 100 à 150 mg/1 (selon les génotypes). Les conditions opératoires sont identiques à celles décrites ci-dessus à ceci près que les germinations sont effectuées en tubes de verre avec une seule graine par tube. Seules les plantules développant des racines secondaires les trois premières semaines sont acclimatées en phytotron avant d'être passées en serre.
IX. EXEMPLE D'OBTENTION DE PLANTS DE SOLANACEES TRANSGENIQUES.
IX.1. OBTENTION DE PLANTS DE TABAC TRANSGENIQUES
Les plants de tabac utilisés pour les expériences de transformation (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC et PBD6) sont cultivés /'// vitro sur le milieu de base de
Muràshige et Skoog (1962) additionné des vitamines de Gamborg et al. (1968,
Sigma référence M0404) de saccharose à 20 g/1 et d'agar (Merck) à 8 g/1. Le pH du milieu est ajusté à 5,8 avec une solution de potasse avant autoclavage à 120°C pendant 20 min. Les plantules de tabac sont repiquées par bouture des entrenoeuds tous les 30 jours sur ce milieu de multiplication MS20
Toutes les cultures /'// vitro sont réalisées en enceinte climatisée, dans les conditions définies ci-dessous: - intensité lumineuse de 30 μE.m'^.s-' ; photopériode de 16h;
- thermopériode de 26°C le jour, 24°C la nuit.
La technique de transformation utilisée est dérivée de celle de Horsch et al. (1985).
Une préculture d'Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404 contenant les plasmides est réalisée durant 48h à 28°C sous agitation, dans du milieu LB additionné des antibiotiques adéquats. La préculture est ensuite diluée au 50ème dans le même milieu et cultivée dans les mêmes conditions. Après une nuit, la culture est centrifugée ( 10 min., 3000 g), les bactéries sont reprises dans un volume équivalent de milieu MS30 (30 g/1 saccharose) liquide et cette suspension est diluée au lOème.
Des explants d'environ 1 cm2 sont découpés à partir des feuilles des plantules décrites ci-dessus. Ils sont ensuite mis au contact de la suspension bactérienne pendant I h, puis séchés rapidement sur papier filtre et placés sur un milieu de coculture (MS30 solide). Après 2 jours, les explants sont transférés en boîtes de Pétri sur le milieu de régénération MS30, contenant un agent sélectif, la kanamycine (200 mg/1), un antibiotique, l'augmentin (400 mg/1) et les hormones nécessaires à l'induction de bourgeons (BAP, 1 mg/1 et ANA, 0, 1 mg/1). Un repiquage des explants est effectué sur le même milieu après 2 semaines de culture. Après 2 semaines supplémentaires, les bourgeons sont repiqués en boîtes de Pétri sur le milieu de développement composé du milieu MS20 additionné de kanamycine et d'augmentin. Après 15 jours, les bourgeons sont repiqués de moitié. L'enracinement prend environ 20 jours, au terme desquels les plantules peuvent être clonées par bouture d'entre- noeuds ou sorties en serre. IX.2. OBTENTION DE PLANTS DE TOMATE TRANSGENIQUES.
Les graines de tomate cv. UC82B sont stérilisées au Domestos 10% 15 min. et rincées 3 fois dans de l'eau stérile. Le dernier rinçage est effectué pendant 10 min. sous agitation.
Les graines ainsi stérilisées sont mises à germer sur milieu MSSV/2 (milieu de base de Murashige et Skoog additionné des vitamines de Nitsch (Thomas et
Pratt, 1981), de saccharose à 30 g/1, d'agar (Merck) à 8 g 1, pH5,9, pendant 7 ou 8 jours en chambre climatisée (intensité lumineuse de 30 μE.m'2, s"', photopériode de 16 h/8 h, 26°C). La technique de transformation utilisée est dérivée de celle de Fillatti et al. (1987).
Une préculture d'Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404 contenant les plasmides est réalisée pendant 24 h à 28°C sous agitation dans du milieu LB additionné des antibiotiques adéquats. La préculture est ensuite diluée au 50ème dans le même milieu et cultivée dans les mêmes conditions pendant une nuit. La DO à 600 nm est mesurée, les agrobactéries sont centrifugées ( 10 min, 3000 g) et repris dans du milieu KCMS liquide (décrit dans la publication de Fillatti et al, 1987) de manière à obtenir une DO à 600 nm de 0,8. Des améliorations techniques ont été apportées à certaines étapes du protocole de Fillatti et al. ( 1987).
La préculture des explants et la coculture sont réalisées comme décrit par Fillatti et al. (1987) excepté que le milieu KCMS est supplémenté en acétosyringone (200 mM). Le milieu de lavage 2Z diffère par l'addition de céfotaxime à 500 mg/1 au lieu de carbénicilline. Le milieu de développement utilisé est composé du milieu de base de Murashige et Skoog (Sigma MS6899) additionné des vitamines de Nitsch, de saccharose à 20 g/1, de kanamycine à 50 mg/1, d'augmentin à 200 mg/1, d'ANA à 1 mg/1 et de zéatine à 0,5 mg/1. X. OBTENTION DE PLANTS DE MAIS TRANSGENIQUES.
X. l . OBTENTION ET UTILISATION DE CAL DE MAIS COMME CIBLE POUR LA TRANSFORMATION GENETIQUE.
La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée
(électroporation; Agrobacterium, microfibres, canon à particules), requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de maïs.
Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hl II ou
(Al 88 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (Malze Handbook; (1994) M. Freeling, V. Walbot Eds.; pp. 665-671 ). Les cals ainsi obtenus sont multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les quinze jours sur le milieu d'initiation.
Des plantules sont ensuite régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.
X.2. UTILISATION DU CANON À PARTICULES POUR LA TRANSFORMATION GENETIQUE DU MAIS Le paragraphe précédent décrit l'obtention et la régénération des lignées cellulaires nécessaires à la transformation , on décrit ici une méthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à particules; les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le paragraphe
1. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mm- ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boite au centre d'un boite de pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides portant les gènes à introduire sont purifiés sur colonne Qiagen®, en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungsten (M 10) en suivant le protocole décrit par Klein ( 1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. Finer (1992).
Les boites de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de Scellofrais® puis cultivées à l'obscurité à 27°C Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif dont la nature et la concentration peuvent varier selon le gène utilisé (voir paragraphe 3 ) Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en composés actifs de certains herbicides (Basta®, Round up®) ou certains antibiotiques (Hygromyci e, Kanamycine...).
On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélection, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boite bombardée
Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif. Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées
XI. ANALYSE DE L'EXPRESSION DE LA LI PASE PANCREATIQUE HUMAINE (LPH) DANS LES PLANTES DE TABAC TRANSGENIQUES. XI.1. PROTOCOLE. Le protocole d'extraction de la lipase à partir de feuilles de tabac prélevées sur des plantes en serre est le suivant 1 g de feuilles (poids frais) est broyé dans l'azote liquide puis à 4°C dans 5 ml de tampon Tris-HCl 50mM pH neutre, additionné d'EDTA I mM et de β-mercaptoéthanol l OmM, de Triton X- 100 0,2%) et de NaCl 50mM. Le broyât total est immédiatement centrifugé à 4°C pendant 15 min a 10000 g.
Pour les graines de tabac, l'extraction est réalisée à partir de 0, 1 g de graines pour 4 ml de tampon. L'activité lipasique est déterminée à l'aide d'un pH-STAT par la méthode titrimétrique de Gargouri et al. ( 1995) dans laquelle le substrat utilisé est la tributyrine. L'émulsion de tributyrine (1 ml pour 30 ml d'émulsion) est réalisée au vortex dans un tampon Tris-HCl 2,5mM pH 8,0, NaCl 25mM, et CaC12 5mM. Le dosage consiste à neutraliser l'acide butyrique libéré sous l'action de la lipase par une solution de soude à un pH de consigne de 8,0 et à 37°C. Une unité lipase correspond à la quantité d'enzyme qui provoque la libération d'une micromole d'acides gras en 1 min. à 37°C et dans les conditions optimales de pH (8,0).
Sur le surnageant de centrifugation, un dosage des protéines totales solubles est réalisé. Un test ELISA en sandwich est également réalisé sur le surnageant de centrifugation avec des anticorps polyclonaux anti-LPH naturelle.
XI.2. EXPRESSION AVEC LES PEPTIDES SIGNAUX VEGETAUX ; DOSAGES SUR LES FEUILLES ET LES GRAINES DE TABAC TRANSFORMEES ; TEST ELISA. En utilisant les méthodes de dosages appropriées connues de l'homme du métier, l'expression des protéines recombinantes dans les feuilles et les graines de tabac transformées est mesurée.
XI.3. EXPRESSION AVEC LE PEPTIDE SIGNAL DE LA LPH ; DOSAGE DE L'ACTIVITE LIPASE SUR LES FEUILLES DE TABAC. En utilisant les méthodes de dosages appropriées connues de l'homme du métier, l'expression des protéines recombinantes dans les feuilles et les graines de tabac transformées est mesurée.
XII. ANALYSE DE L'EXPRESSION DE LA LIPASE PANCREATIQUE HUMAINE DANS LES PLANTES DE TOMATE TRANSGENIQUES. XII.1. PROTOCOLE.
Le protocole d'extraction de la lipase à partir de feuilles et des fruits de tomate est similaire à celui décrit pour les feuilles de tabac, excepté que 1 g de matériel frais est repris dans 4 ml de tampon. L'activité lipasique est déterminée comme décrit pour les feuilles de tabac. XII.2. DOSAGE DANS LES FRUITS DE TOMATE.
L'activité lipasique est déterminée comme décrit pour les feuilles de tabac. XIII. ANALYSE DE L'EXPRESSION DE LA COLIPASE PANCREATIQUE HUMAINE (COLPH) DANS LES PLANTS DE TABAC TRANSGENIQUES.
XIII.1. PROTOCOLE. Le protocole d'extraction de la lipase à partir de feuilles de tabac prélevées sur des plantes en serre est le suivant: 1 g de feuilles (poids frais) est broyé dans l'azote liquide puis à 4°C dans 5 ml de tampon Tris-HCI 50mM pH7,5, additionné d'EDTA ImM et de β-mercaptoéthanol l OmM, de Triton X-100 0,2% et de NaCl 50mM. Le broyât total est immédiatement centrifugé à 4°C pendant 15 min à 10000 g.
Pour les graines de tabac, l'extraction est réalisée de 0, 1 g de graines pour 4 ml de tampon.
L'activité lipasique est déterminée à l'aide d'un pH-STAT par la méthode de
Patton et al. ( 1978). L'effet de la colipase sur le retard de l'hydrolyse de les intralipides est déterminé comme suit : les intralipides (0,5 ml) sont dilués dans 10 ml d'une solution composée de Tris-HCI 2mM pH8,0, NaCl 150mM, taurodéoxycholate 4mM, CaCh I mM, à 40°C. La colipase est ajoutée, puis après
1 min., le mélange est supplémenté en lipase pancréatique ( 10~5 M) à raison de 10 μl. L'activité de la colipase peut également être mesurée selon la méthode de
Ouaged et al. ( 1982). La lipase est dénaturée à pH 2, ce qui permet cependant de conserver la colipase intacte. L'activité colipase est alors évaluée par la capacité de la préparation à restorer l'activité d'une préparation de lipase exempte de colipase. Pratiquement, l'échantillon à tester est ajouté au milieu réactionnel, acidifié à pH 2 avec de PHCI IN, et après une minute, amené à pH 9 avec du NaOH 1M. Un aliquot de lipase semi-purifiée d'activité potentielle connue est ajoutée. La colipase est mesurée d'après le niveau d'activité lipase restorée à partir de la lipase inactive. XIV. IMMUNODETECTION DE TYPE "WESTERN" DE LA LPH RECOMBINANTE. XIV.1. LPH EXPRIMEE DANS LES FEUILLES ET GRAINES DE
TABAC ET DE COLZA TRANSGENIQUES.
XIV.1.1. EXPRESSION AVEC LES PEPTIDES SIGNAUX VEGETAUX ; IMMUNODETECTION DANS LES FEUILLES ET GRAINES DE TABAC ET DE COLZA TRANSFORMEES. Des expériences d'immunodétection de type "western" ("western-blots") de la LPH ont été réalisées sur les protéines de feuilles de tabac et de graines de tabac et de colza extraites avec le tampon (voir protocole d'extraction ci-dessus). Pour la réalisation de ces expériences, les protéines extraites (30 μg protéines totales par échantillon) sont tout d'abord séparées selon la taille sur gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5% puis transfères sur une membi ane de nitrocellulose On peut également utiliser des gels denatui ants (urée) et séparer sur d'autres critères que la taille Un anticorps polyclonal anti-lipase pancréatique humaine est utilisé comme sonde et la révélation est effectuée au moyen d'un anticorps anti-IgG approprié couplé à la phosphatase alcaline
La protéine témoin est la lipase pancréatique humaine naturelle qui migre sous la forme d'une seule bande d'une masse moléculaire apparente d'environ 50 kDa Aucune bande n'est détectée dans les exti ait proteiques de feuilles et de graines de tabac et de colza non ti ansformees
XIV 1 2 EXPRESSION AVEC LE PEPT I DE SIGNAL DE LA LPH , IMMUNODETECTION DANS LES FEUI LLES ET LES GRAINES DE TABAC TRANSFORMEES Des Western blots ont été réalises sur les pi otemes de feuilles et de graines de tabac extraites selon le protocole décrit pi ecedemment Les protéines extraites sont tout d'abord séparées sut gel de polyaciylamide dénaturant (SDS-PAGE) puis transférées sur une membi ane de nitrocellulose Un anticoi ps polyclonal anti-LPH est utilisé comme sonde et la l evelation est effectuée au moyen d'un anticorps approprié couplé à la phosphatase alcaline
La protéine témoin est la lipase panci eatique humaine qui migre sous la forme d'une seule bande de masse moléculaire appai ente d'environ 50 kDa Aucune bande n'est détectée dans les exti aits pi oteiques de feuilles de tabac non transformées (T) XIV 1 3 LPH DANS UN EXTRAIT CONTENANT DES PROTEINES
DE FEUILLES DE TABAC TRANSFORMEES EXPERIENCE DE DEGLYCOSYLATION
Le protocole d'extraction des pi otemes pour les expériences de déglycosylation est le suivant 0,5 g de feuilles (poids fi ais) sont broyés dans l'azote liquide puis à 4°C dans 1 ml de tampon de denatui ation (tampon phosphate lOOmM pH7,5, additionne de β-mercaptoethanol 1 %, d'EDTA 25mM et de SDS 1%) Le broyât est centrifuge a 4°C pendant 1 5 mm a 10000g Le surnageant est incubé durant 5 min a 100°C afin de réaliser la denatui ation des protéines puis centrifugé 2 min a 10000 g Le surnageant est ensuite dilue au l Oème dans le tampon de déglycosylation (tampon phosphate l OOmM pH7,5, additionne de β- mercaptoéthanol 1%, d'EDTA 25mM, de SDS 0, 1 %) et d'octylglucoside 1%) L'enzyme (N-glycosidase F, PNGase Boehringer) est ajoutée a raison de 1 U pour 100 μl de surnageant Un témoin sans enzyme est réalise pour chaque échantillon La déglycosylation de la protéine témoin (lipase pancréatique humaine) a lieu dans les mêmes conditions. Les différents échantillons protéiques sont incubés à température ambiante durant 8 heures. Les protéines sont ensuite séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et transférées sur membrane de nitrocellulose comme décrit dans le paragraphe précédent.
XV. IMMUNODETECTION DE TYPE "WESTERN" DE LA COLPH RECOMBINANTE.
Des expériences d'immunodétection de type "Western" ("Western-blots") (Renart et Sandoval, 1984) de la COLPH ont été réalisées sur les protéines de feuilles de tabac et de graines de tabac et de colza extraites avec le tampon (voir protocole d'extraction ci-dessus). Pour la réalisation de ces expériences, les protéines extraites (30 μg protéines totales par échantillon) sont tout d'abord séparées sur gel de polyacrylamide dénaturant selon la méthode Tris-tricine d'Okajima et al. ( 1993) puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. Un anticorps polyclonal anti-colipase pancréatique humaine est utilisé comme sonde et la révélation est effectuée au moyen d'un anticorps anti-lgG approprié couplé à la phosphatase alcaline.
XVI. PURIFICATION DE LA LI PASE PANCREATIQUE HUMAINE A PARTIR DE PLANTES. XVI. 1. PURIFICATION DE LA LPH A PARTIR DE FEUILLES DE
TABAC
La lipase pancréatique humaine recombinante est purifiée par chromatographie d'échange d'ions sur colonne DEAE-Fast Flow (Pharmacia) équilibrée dans du tampon Tris-acétate 50mM pH7,0. La colonne est lavée avec le même tampon jusqu'à ce que l'absorption à 280 nm soit inférieure à DO 0,05.
L'activité enzymatique fixée est éluée à l'aide d'un gradient linéaire de sel dans le même tampon (0 à 0,5M NaCl) en utilisant 5 volumes de colonne. Les fractions contenant l'activité enzymatique sont rassemblées. Elles sont soumises à une filtration sur Sephadex G- 100. XVII. PURIFICATION DE LA COLI PASE PANCREATIQUE HUMAINE
A PARTIR DE PLANTES.
La protéine est purifiée selon les procédés classiques de purification des protéines bien connus de l'homme du métier.
XVIII. SYNTHESE D'ESTERS D'ACIDES GRAS. Les essais ont été réalisés avec des graines de colza non transformées, la lipase étant apportée:
- soit sous forme de préparation enzymatique immobilisée (lipozyme (NOVO)) ou libre (lipase pancréatique humaine). - soit sous forme de graines de tabac transformées avec le gène de la lipase pancréatique humaine.
Les réactions d'estérification sont conduites à 37°C pendant 16 heures dans des flacons de verre bouchés hermétiquement disposés sur une table d'agitation (250 rpm). Le solvant organique utilisé est l'hexane dans lequel les acides gras sont solubles. Le méthanol est ajouté en proportion stoechiométrique à la quantité théorique de triacylglycérol contenu dans les graines de colza.
Le composant majeur des acides gras de colza est l'acide oléique, aussi le témoin de référence choisi est-il un ester méthylique de l'acide oléique. Le suivi de synthèse se fait par chromatographie couche mince (CCM). Le solvant de migration est un mélange d'hexane, diéthyléther, eau (70: 10: 1). La révélation des plaques se fait à chaud après pulvérisation d'acide sulfurique (5%) dans de l'éthanol.
L'utilisation de la lipase pancréatique recombinante selon l'invention ermet d'obtenir le produit attendu qui est l'ester de méthyle de l'acide oléique.
XIX. TEST D'ACTIVITE DE LA LIPASE PANCREATIQUE HUMAINE Le test d'activité est réalisé à l'aide des réactifs Lipase - PS™Sigma Diagnostics (Méthode N°805) selon les recommandations du fabricant. La procédure est basée sur la méthode colorimétrique de Imamura et al. (Clin. Chem. 35: 1126, 1989). Le 1,2 diglycéride est hydrolyse en 2-monoglycéride et en acides gras. Le 2-monoglycéride est ensuite mesuré par réactions enzymatiques couplées catalysées par la lipase monoglycéride, la glycérol kinase, la glycérophosphate oxydase et la peroxydase. Le test est hautement sensible et spécifique pour la lipase pancréatique grâce à la colipase et au désoxycholate utilisés comme activateurs. Des mesures ont été réalisées sur les échantillons suivants :
- 2 extraits protéiques de feuilles de tabac transformées avec LBA4404 renfermant la plasmide binaire contenant PSLPH-LPH. Les plantes ont été anlysées après 3 semaines de sortie en serre.
- 1 extrait protéique de feuille de tabac non transformée (témoin négatif) . 1 extrait protéique de feuille de tabac non transformée mélangé à de la lipase pancréatique humaine purifiée commercialisée par Sigma (référence : L9780) à 500 U/l (reconstruction)
Les valeurs obtenues sont les suivantes :
- 270 U/l pour le témoin négatif - 874 U/L pour la reconstruction
- 1113 U/l pour un des échantillons
- 1572 UΛ pour l'autre échantillon.
Ces résultats mettent en évidence la présence d'une activité lipasique chez les deux échantillons. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

"}REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une séquence nucléotidique recombinante contenant, d'une part, un ADNc codant pour un élément du complexe lipase pancréatique-colipase de mammifères ou pour une protéine ou un polypeptide dérivé, et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire cet élément, ou la protéine ou le polypeptide dérivé, codé par ledit ADNc, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales, pour la transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou de plantes obtenues à partir de ces dernières, d'un élément recombinant du complexe lipase pancréatique-colipase de mammifères, ou d'une protéine ou polypeptide dérivé.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'élément du complexe lipase pancréatique-colipase est la lipase pancréatique.
3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'élément du complexe lipase pancréatique-colipase est la colipase.
4. Utilisation des séquences selon les revendications 2 et 3 pour la co-transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou de plantes obtenues à partir de ces dernières, d'une lipase pancréatique et d'une co-lipase recombinantes de mammifères, ou de leur dérivés.
5. Séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient d'une part la séquence codante pour un élément du complexe lipase pancréatique-colipase ou une protéine ou polypeptide dérivé et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire un élément du complexe lipase pancréatique-colipase ou une protéine ou polypeptide dérivé codé par ladite séquence, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales .
6. Séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'élément du complexe lipase pancréatique- colipase est la lipase pancréatique.
7. Séquence nucléotique recombinante selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'élément du complexe lipase pancréatique-colipase est la colipase.
8. Séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient d'une part les séquences codantes pour une lipase pancréatique et une colipase ou les protéines ou polypeptides dérivés et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire une lipase pancréatique et une colipase ou les protéines ou polypeptides dérivés codés par ladite séquence, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales .
9. Vecteur, notamment plasmide, contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 5 à 8, insérée en un site non essentiel pour sa réplication.
10. Hôte cellulaire, notamment toute bactérie telle que Agrobacterium tumefaciens, transformé par un vecteur selon la revendication 9.
11. Procédé d'obtention d'un élément du complexe lipase pancréatique-colipase recombinant, ou d'une protéine ou un polypeptide dérivé, caractérisé en ce qu'il comprend: - la transformation de cellules végétales, notamment à l'aide d'un hôte cellulaire selon la revendication 10, lui-même transformé par un vecteur selon la revendication 9, de manière à intégrer dans le génome de ces cellules une séquence recombinante selon la revendication 5 le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules transformées susmentionnées ,
- la récupération de l'élément du complexe lipase pancréatique-colipase recombinant ou de la protéine ou polypeptide dérivé produit dans lesdites cellules ou plantes transformées susmentionnées, notamment par extraction, suivie, le cas échéant, par une purification.
12. Procédé d'obtention selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'élément du complexe lipase pancréatique-colipase est la lipase pancréatique.
13. Procédé d'obtention selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'élément du complexe lipase pancréatique-colipase est la colipase .
14. Procédé de co-obtention de lipase pancréatique et de colipase recombinantes, ou de to protéine ou polypeptides dérivés, caractérisé en ce qu'il comprend:
- la transformation de cellules végétales, notamment à l'aide d'un hôte cellulaire selon la revendication 10, lui-même transformé par un vecteur selon la revendication 9, de manière à intégrer dans le génome de ces cellules une séquence recombinante selon la revendication 8 le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules transformées susmentionnées ,
- la récupération de la lipase pancréatique et de la colipase recombinantes ou des protéines ou polypeptides dérivés produit dans lesdites cellules ou plantes transformées susmentionnées, notamment par extraction, suivie, le cas échéant, par une purification.
15. Plantes, ou parties de plantes, notamment feuilles et/ou frui ts et/ou semences et/ou cellules de plantes, transformés génétiquement, caractérisés en ce qu'elles contiennent une (ou plusieurs) séquence (s) nucléotidique (s) recombinante (s) selon l'une des revendications 5 à 8, intégrée (s) de façon stable dans leur génome ces plantes étant choisies notamment parmi le colza, le tabac, le maïs, le pois, la tomate, la carotte, le blé, l'orge, la pomme de terre, le soja, le tournesol, la laitue, le riz, la luzerne, et la betterave .
16. Lipase pancréatique recombinante ou protéine ou polypeptide dérivé caractérisé en ce qu'elle est obtenu selon le procédé de la revendication 12 ou 14.
17. Colipase recombinante ou protéine ou polypeptide dérivé, caractérisée en ce qu'elle 6λ est obtenue selon le procédé de la revendication 13 ou 14.
18. Association de lipase pancréatique et de colipase recombinantes ou protéine ou polypeptide dérivés caractérisé en ce qu'elle est obtenue selon le procédé de la revendication 14.
19. Extrait végétal à activité enzymatique tel qu'obtenu par mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce qu'il contient de la lipase pancréatique recombinante et/ou de la colipase recombinante ou les protéines ou polypeptides dérivés .
20. Utilisation de plantes, ou parties de plantes selon la revendication 15, et/ou des extraits de plantes selon la revendication 19, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon les revendications 16 à 18, pour l'obtention de médicaments destinés au traitement de pathologies associées à un déficit de production de lipase dans l'organisme, telles que la mucoviscidose ou dans le cadre du traitement de désordre alimentaire, telles que 1 'obésité.
21. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des plantes, ou parties de plantes selon la revendication 15, et/ou des extraits de plantes selon la revendication 19, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon les revendications 16 à 18, le cas échéant en association avec un ou plusieurs véhicules ou excipients pharmaceutiquement acceptables.
22. Utilisation de plantes, ou parties de plantes selon la revendication 15, et/ou des extraits de plantes selon la revendication 19, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon les revendications 16 à 18, pour l'obtention d'aliments destinés à 1 'alimenta tion humaine ou animale, notamment d'aliments fonctionnels plus particulièrement destinés à faciliter l'absorption des graisses animales ou végétales ingérées par un individu sain ou atteint d'une ou plusieurs pathologies affectant ou non le taux de production de lipase gastrique et/ou pancréatique.
23. Aliments fonctionnels caractérisés en ce qu'ils comprennent des plantes, ou parties de plantes selon la revendication 15, et/ou des extraits de plantes selon la revendication 19, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon les revendications 16 à 18, le cas échéant en association avec un (ou plusieurs) autre (s) composé (s) comestible (s) .
24. Utilisation de plantes, ou parties de plantes selon la revendication 15, et/ou des extraits de plantes selon la revendication 19, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon les revendications 16 à 18, pour la mise en oeuvre de réactions enzymatiques dans le domaine industriel, agroalimentaire ou agro-industrielle, notamment dans l'industrie des corps gras, de la lipochimie et l'industrie laitière.
25. Préparations enzymatiques à destination industrielle, agro-alimentaire ou agroindustrielle, susceptibles d'être utilisées selon la revendication 24, et comprenant des plantes, ou parties de plantes selon la revendication 15, et/ou des extraits de plantes selon la revendication 19, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon les revendications 16 à 18.
26. Utilisation de plantes, ou parties de plantes selon la revendication 15, et/ou des extraits de plantes selon la revendication 19, et/ou de protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon les revendications 16 à 18, pour l'obtention de biocarburants.
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