WO1999052344A1 - Semences et plantes dont le pouvoir germinatif est detruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une reserve energetique indispensable a la germination - Google Patents

Semences et plantes dont le pouvoir germinatif est detruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une reserve energetique indispensable a la germination Download PDF

Info

Publication number
WO1999052344A1
WO1999052344A1 PCT/FR1999/000806 FR9900806W WO9952344A1 WO 1999052344 A1 WO1999052344 A1 WO 1999052344A1 FR 9900806 W FR9900806 W FR 9900806W WO 9952344 A1 WO9952344 A1 WO 9952344A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
germination
seeds
coding
energy reserve
seed
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/000806
Other languages
English (en)
Inventor
Philippe Bournat
Original Assignee
Groupe Limagrain Holding
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Groupe Limagrain Holding filed Critical Groupe Limagrain Holding
Priority to CA002324944A priority Critical patent/CA2324944A1/fr
Priority to AU30420/99A priority patent/AU758821B2/en
Priority to EP99911897A priority patent/EP1069818A1/fr
Publication of WO1999052344A1 publication Critical patent/WO1999052344A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development

Definitions

  • the present invention relates to a method for destroying the germinative power of a plant seed by the introduction, into said seed, of a nucleic acid sequence coding for an enzyme capable of rapidly metabolizing an energy reserve essential for the germination of said seed.
  • the invention is based on the fact that it can happen when cultivating in the open field that a non-negligible quantity of newly formed seeds falls on the ground during cultivation and / or harvesting. These seeds, involuntarily disseminated, will be able to germinate and multiply as soon as the climatic conditions are suitable. Controlling the non-multiplication of plants resulting from this dissemination requires binding monitoring of cultivated plots, consisting for example of a treatment with herbicides, a crop rotation, sometimes for several years for certain plants such as rapeseed, whose seeds can survive a decade.
  • the present invention aims precisely to destroy the germinative power of seeds remaining in the field in order to prevent their multiplication without resorting to the use of a toxic substance.
  • This goal is achieved thanks to the presence in the seeds of enzymes capable of rapidly burning their energy reserve before germination is initiated. By rapidly, it is meant that the energy reserves are burned within a period of between approximately 4 weeks and approximately 12 weeks.
  • This modification gives the seeds of the invention a very clear disadvantage which considerably limits, or even prohibits, their involuntary multiplication. In fact, when the climatic conditions suitable for germination occur, the seeds modified according to the invention will no longer have the energy necessary for their germination and will therefore be unable to multiply.
  • the semen is stored, from harvest, under controlled and regular conditions, the enzymatic activity introduced will be inhibited and the semen will retain its germinative power and may be multiplied.
  • the energy reserves essential for the germination of a seed are, most often, in the form of lipid or starch.
  • Normal conditions suitable for allowing germination, are characterized by sufficient humidity, oxygenation and temperature, depending on the species concerned.
  • a sufficient temperature for rapeseed and tobacco is around 4 ° C to 10 ° C.
  • the subject of the invention is therefore plant seeds whose germinative power is destroyed by the total or partial absence of at least one energy reserve essential for germination, in which the destruction of the germinative power is imparted by an enzyme present in the seed at a level allowing the rapid consumption of said energy reserve.
  • the enzyme is expressed in the plant with an expression rate of at least 0.3% relative to the total of the proteins expressed in the plant.
  • the invention particularly relates to transgenic seeds and plants whose germination power is destroyed by the total or partial absence of at least one energy reserve essential for germination.
  • a first embodiment of a seed of the invention is a transgenic seed which contains at least one heterologous gene coding for an enzyme which confers the destruction of the germinative power of said seed by rapid consumption of at least one energy reserve essential for germination. More particularly, the invention relates to a transgenic seed which contains at least one heterologous gene coding for an enzyme responsible for the consumption of an energy reserve essential for germination.
  • a transgenic seed contains in its cells at least one chimeric gene successively comprising:
  • a promoter for example the double 35S constitutive promoter or more particularly a specific seed promoter
  • the pCRU promoter of the radish cruciferin gene allowing the expression of proteins or polypeptides only in seeds or in the seeds (Depigny-This et al., : Plant Mol. Biol., 20, 467-479, 1992).
  • the three sequences above are described in the articles by Murakami et al. (Plant Mol. Biol., 7, 343-355, 1986) and Matsuoka and Nakamura (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 834-838, 1991).
  • the heterologous sequence coding for the enzyme can be, for example, that of dog gastric lipase described in the PCT patent application published under the number WO 96/33277 or that of human pancreatic lipase (Lowe et al., J. Biol Biochem., 264, 20042-2008, 1989).
  • lipase in the seeds of plants according to the invention leads, when it is not stopped or slowed down by the storage conditions, a reduction in the triglyceride content without modification of the fatty acid composition. Indeed, the action of lipase on the composition of the seed must be identical to that of the enzymes of germination and / or digestion.
  • a second embodiment of a seed according to the invention is a transgenic seed which contains at least one endogenous gene coding for an enzyme responsible for the consumption of an energy reserve essential for germination, placed under the control of a promoter chosen from those allowing the overexpression and activation of said gene before the initiation of the germination process, such as a more or less early specific seed promoter.
  • the invention also relates to a transgenic plant or part of this plant, such as cells, characterized in that it contains:
  • promoters can be those already described above.
  • the seeds and plants or parts of plants according to the invention may also contain one or more heterologous genes of interest, such as genes capable of conferring on the plant an agronomic character or a resistance to a predator or to a herbicide or a gene encoding a protein of pharmaceutical interest.
  • heterologous genes of interest can be introduced into seeds at the same time or before the chimeric genes making it possible to destroy the germinative power of said seeds in accordance with the invention.
  • the seeds of the invention are then remarkable in that they make it possible to limit the involuntary dissemination of seeds carrying these genes of interest.
  • the seeds and plants according to the invention can be dicotyledonous or monocotyledonous seeds and plants, such as those selected from the group consisting of nightshades (tomatoes, tobacco), crucifers (rapeseed), cereals (corn, wheat).
  • the method according to the invention has advantages over techniques coupling male cytoplasmic sterility and a gene of interest. Indeed, the destruction of the germinative power of the seed prohibits the multiplication of seeds from male and female gametes. While male sterility does not prevent the obtaining of seeds from female gametes. In addition, obtaining seeds homozygous for the heterologous gene is easy whereas it is complex in the case of a male sterility technique, since it is necessary to have a technique of restoring fertility.
  • the invention therefore also relates to the use of a gene coding for an enzyme responsible for the consumption of an energy reserve essential for germination to prepare a transgenic plant whose germination is controlled.
  • the invention relates to the use of a gene coding for an enzyme responsible for the consumption of an energy reserve essential for germination to prepare a transgenic plant whose germinative power is destroyed. It is particularly preferred to use, according to the invention, a gene which codes for an enzyme chosen from the group of lipases, proteases, amylases, the action of which on the metabolism of semen is identical to that of the enzymes of germination and / or digestion.
  • FIG. 1 represents the conservation of transgenic rapeseed seeds expressing a lipase under a specific seed promoter.
  • the promoter used is the double 35S promoter. Upstream of the gene coding for dog lipase is placed a sequence coding for a secretory signal peptide.
  • Tobacco plants used for processing experiments ⁇ Nicotiana tabacum var. Xanthi NC and PBD6) are cultured in vitro on the basic medium of Murashige and Skoog (1962) supplemented with vitamins from Gamborg et al. (1968, Sigma reference M0404) sucrose at 20 g / l and agar (Merk) at 8 g / 1.
  • the pH of the medium is adjusted to 5.8 with a potassium hydroxide solution before autoclaving at 120 ° C for 20 min.
  • Tobacco seedlings are transplanted by cutting internodes every 30 days on this MS20 multiplication medium.
  • thermoperiod 26 ° C during the day, 24 ° C at night.
  • the transformation technique used is derived from that of Horsch et al. (Science, 227, 1229-1231, 1985).
  • a preculture of Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 containing the plasmids pBIOC29 or pBIOC26 or pBI0C25 is carried out for 48 h at 28 ° C with stirring, in LB medium (Sambrook et al., Molecular Cloning Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989) supplemented with appropriate antibiotics (rifampicin and tetracycline).
  • the preculture is then diluted to 50th in the same medium and cultivated under the same conditions. After one night, the culture is centrifuged (10 min., 3000 g), the bacteria are taken up in an equivalent volume of liquid MS30 medium (30 g / 1 sucrose) and this suspension is diluted with 10.
  • Explants of about 1 cm 2 are cut from the leaves of the seedlings described above. They are then brought into contact with the bacterial suspension for one hour, then quickly dried on filter paper and placed on a coculture medium (solid MS30). After 2 days, the explants are transferred to petri dishes on the MS30 regeneration medium, containing a selective agent, kanamycin (200 mg / 1), a bacteriostatic, augmentin (400 mg / 1) and the necessary hormones. to the induction of buds (BAP, 1 mg / 1 and ANA, 0.1 mg / 1). The explants are subcultured on the same medium after 2 weeks of culture.
  • the buds are subcultured in petri dishes on the development medium composed of the MS20 medium supplemented with kanamycin and augmentin. After 15 days, the buds are transplanted in half. Rooting takes about 20 days, at the end of which the seedlings can be cloned by cutting internodes or taken out in the greenhouse. According to the same method, it is possible to obtain tobacco seeds expressing human pancreatic lipase under the control of a constitutive promoter.
  • the promoter used is the cruciferin promoter. Upstream of the gene coding for lipase is placed a sequence coding for a secretory signal peptide.
  • the spring rapeseeds (Brassica napus cv WESTAR or Limagrain lines) are disinfected for 40 minutes in a 15% Domestos solution. After 4 rinses with sterile water, the seeds are put to germinate, at a rate of 20 seeds per pot of 7 cm in diameter and 10 cm high, on mineral medium of Murashige and Skoog (Sigma M 5519) with 30g / 1 of sucrose and solidified with agargel at 5 g / 1. These pots are placed in a culture chamber at 26 ° C with a photoperiod of 16h / 8h and under a light intensity of the order of 80 ⁇ E m ⁇ 2 s ⁇ ⁇ .
  • the cotyledons are removed sterile by cutting each petiole about 1mm above the cotyledon node.
  • a preculture of Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404, containing the plasmid pGAZE into which the sequence coding for a PPS (or PS) addressing signal has been inserted under the control of the pCRU promoter (or pd35S), is carried out in Erlenmeyer flask of 50 ml, for 36 h at 28 ° C in 10 ml of 2YT bacterial medium (Sambrook et al., Molecular Cloning Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) supplemented with antibiotics useful for the selection of the strain used .
  • This preculture is used to seed at 1% a new bacterial culture carried out under the same conditions. After 14 h the culture is centrifuged for 15 min at 3000 g and the bacteria are taken up in an equivalent volume of liquid germination medium. This suspension is distributed in petri dishes 5 cm in diameter at a rate of 5 ml / box.
  • the severed end of the petiole is immersed for a few seconds in the solution of agrobacteria thus prepared, then the petiole is pressed a few millimeters into the regeneration medium.
  • This medium has the same basic composition as the germination medium with an additional 4 mg / l of benzylamino-purine (BAP), a phytohormone promoting the new formation of buds.
  • BAP benzylamino-purine
  • Ten explants (cotyledon with petiole) are cultured per Petri dish 9 cm in diameter (Greiner reference 664102).
  • the explants Twice in succession, 3 weeks apart, the explants are transplanted sterile onto new medium under the same conditions.
  • the green buds that appear at the end of the second or third transplanting are separated from the explant and cultured individually in transparent pots 5cm in diameter and 10cm high containing a medium identical to the previous one but devoid of BAP.
  • the stem of the transformed bud is cut off and the bud is transplanted into a pot of fresh medium.
  • the roots are sufficiently developed to allow acclimatization in phytotron (temperature 21 ° C, photoperiod 16h / 8h and 84% relative humidity), the seedlings are repotted in pots 12 cm in diameter filled with the same potting soil enriched with late fertilizer (Osmote, at the rate of 4 g / 1 of potting soil) then transported to a greenhouse (class S2) regulated at 18 ° C, with two daily waterings of 2 minutes.
  • phytotron temperature 21 ° C, photoperiod 16h / 8h and 84% relative humidity
  • the seedlings are repotted in pots 12 cm in diameter filled with the same potting soil enriched with late fertilizer (Osmote, at the rate of 4 g / 1 of potting soil) then transported to a greenhouse (class S2) regulated at 18 ° C, with two daily waterings of 2 minutes.
  • the pods When the pods have reached maturity, they are harvested, dried and then beaten. The seeds obtained are used for assaying biochemical activity.
  • the selection of the transgenic progeny is done by germination on a medium containing kanamycin sulfate at a rate of 100 to 150 mg / 1 (depending on the genotypes).
  • the operating conditions are identical to those described above except that the germinations are carried out in glass tubes with only one seed per tube. Only the seedlings developing secondary roots during the first three weeks are acclimatized in a phytotron before being transferred to the greenhouse. According to the same process, it is possible to obtain rapeseed expressing human pancreatic lipase under the control of a specific seed promoter.
  • the activity of the lipase when it is not slowed down or stopped by conditions of conservation, cold of 4 ° C and reduced hygrometry, involves a reduction in the content of triglyceride without modification of the fatty acid composition.
  • the lipase activity is determined using a pH-STAT by the titrimetric method of Gargouri et al. (Gastroenterology, 91, 919-925, 1986) in which the substrate used is tributyrin.
  • the tributyrin emulsion (4 ml for 30 ml of emulsion) is produced using a vortex in the presence of bile salts (1.04 g / 1) of bovine albumin (0.1 g / 1) and NaCl (9 g / 1).
  • the assay consists in neutralizing the butyric acid released under the action of the lipase with a sodium hydroxide solution at a set pH of 5.5 to 37 ° C.
  • One lipase unit corresponds to the quantity of enzyme which causes the release of a micromole of fatty acid in 1 minute at 37 ° C and under optimal pH conditions (5.5).
  • Purified dog gastric lipase has a specific activity of 570 units / mg of protein. The lipase activity can be measured on the total ground material, on the pellet or on the centrifugation supernatant. Measurements of lipase activity confirm the expression, in the seeds of transformed plants, of the lipase encoded by the heterologous gene. If we follow the evolution of the germination power of these seeds to lipase activity over time, we observe a rapid deterioration in the capacity of these seeds to germinate until disappearance after 16 weeks.
  • transgenic plants according to the invention for example rapeseed expressing dog gastric lipase under the control of the cruciferin promoter radish, and non-transgenic lines, each on identified spaces, and harvest the plants under the same conditions.
  • a part of the seeds produced will fall into the plot during the cultivation or during the harvest, and the following year, the value of the seeds and plants according to the invention is noted by comparing the number of regrowths on each of the plots.
  • transgenic colza homozygous for the transgene cDNA coding for gastric lipase under constitutive promoter was carried out. This field of transgenic rapeseed was surrounded by borders of non-transgenic rapeseed. This test made it possible to confirm in real conditions the potential for re-germination of transgenic seeds expressing the cDNA coding for gastric lipase. Observation of the number of regrows on each plot.
  • the extraction buffer (0.2 M Tris-HCl; 0.25 mM Na-EDTA; 0.25 M NaCl; 0.5% SDS; pH 8.0). Then, the reaction medium is subjected to the vortex for 5 sec. followed by extraction with phenol- chloroform-isoamyl alcohol (25/24/1 v / v / v). The aqueous phase is then precipitated by adding isopropanol at -80 ° C for 15 min. After centrifugation at 4000 g for 15 min. the pellet is washed in 70% ethanol, then recentrifuged and dried. The pellet is taken up in 100 ⁇ l of H20.
  • the PCR amplification reaction of the DNA is carried out in a GeneAmp PCR System 9700 thermocycler in the presence of 0.36 ⁇ l of each of the oligodeoxynucleotide primers 5 'TTCTACCCACACCACTTC 3' and 5 'ACATGCATGTCTGTCAGG 3' at 50 pmol / ⁇ l, 0, 5 ⁇ l lNm dNTP, 3 ⁇ l 98% glycerol, 1.8 ⁇ l MgC12 25mM, 0.36 ⁇ l BSA 10 mg / ml, 3 ⁇ l of Promega xlO DNA polymerase buffer and 0.36 ⁇ l of Taome DNA polymerase 5 U / ⁇ l in a reaction medium of 30 ⁇ l final.
  • a GeneAmp PCR System 9700 thermocycler in the presence of 0.36 ⁇ l of each of the oligodeoxynucleotide primers 5 'TTCTACCCACACCACTTC 3' and 5 'ACATG
  • the DNA is denatured for 5 min at 94 ° C, subjected to 35 cycles each consisting of 30 denaturation at 94 ° C, 1 min. hybridization at 50 ° C, and 1 min. elongation at 72 ° C., then the elongation is continued for 5 min.
  • the regrowth potential of the transgenic seeds is approximately 12 times less important than for non-transgenic seeds - the transgenic seeds which germinated within the framework of this test express half the recombinant lipase than the initial seeds. It therefore seems that when the seeds express lipase at least up to 120 UTC4 / g, they have no potential for re-germination in open field conditions.
  • Rapeseed lipase-expressing rapeseed (T2 and T3) has a fat content of the order of 22 to 24% instead of 40% on average, a drop of around 40%.

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne des semences et des plantes dont le pouvoir germinatif est détruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination, dans laquelle la destruction du pouvoir germinatif est conférée par une enzyme présente dans la semence à un niveau permettant la consommation rapide de ladite réserve énergétique.

Description

SEMENCES ET PLANTES DONT LE POUVOIR GERMINATIF EST DÉTRUIT PAR L'ABSENCE TOTALE OU PARTIELLE D'AU MOINS UNE RÉSERVE ÉNERGÉTIQUE INDISPENSABLE À LA GERMINATION.
La présente invention concerne un procédé pour détruire le pouvoir germinatif d'une semence de plante par l'introduction, dans ladite semence, d'une séquence d'acide nucléique codant pour une enzyme apte à métaboliser rapidement une réserve énergétique indispensable à la germination de ladite semence.
L'invention est fondée sur le fait qu'il peut arriver lorsque 1 ' on réalise une culture en plein champ, qu'une quantité non négligeable de semences nouvellement formées tombe sur le sol au cours de la culture et/ou de la récolte. Ces semences disséminées involontairement seront aptes à germer et à se multiplier dès que les conditions climatiques s'y prêteront . Le contrôle de la non-multiplication des plantes résultant de cette dissémination impose un suivi contraignant des parcelles cultivées, consistant par exemple en un traitement par des herbicides, une rotation des cultures, parfois pendant plusieurs années pour certaines plantes comme le colza, dont les graines peuvent survivre une dizaine d'années.
La présente invention vise précisément à détruire le pouvoir germinatif des semences restées au champ afin d'empêcher leur multiplication sans recourir à l'emploi d'une substance toxique.
Ce but est atteint grâce à la présence dans les semences d ' enzymes aptes à brûler rapidement leur réserve énergétique avant que ne soit initiée la germination. Par rapidement, on entend que les réserves énergétiques sont brûlées dans un délai compris entre environ 4 semaines et environ 12 semaines . Cette modification confère aux semences de 1 ' invention un désavantage très net qui limite considérablement, voir interdit, leur multiplication involontaire. En effet, lorsque les conditions climatiques adaptées à la germination surviendront, les semences modifiées selon l'invention ne disposeront plus de l'énergie nécessaire à leur germination et seront donc incapables de se multiplier.
Si par contre, la semence est stockée, dès la récolte, dans des conditions contrôlées et régulières, l'activité enzymatique introduite sera inhibée et la semence conservera son pouvoir germinatif et pourra être multipliée.
Les réserves énergétiques indispensables à la germination d'une semence sont, le plus souvent, sous forme de lipide ou d'amidon. Les conditions normales, aptes à permettre la germination, sont caractérisées par une humidité, une oxygénation et une température suffisante, selon l'espèce concernée. Par exemple, une température suffisante pour le colza et le tabac est de l'ordre de 4°C à 10°C.
L'invention a donc pour objet des semences de plante dont le pouvoir germinatif est détruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination, dans laquelle la destruction du pouvoir germinatif est conférée par une enzyme présente dans la semence à un niveau permettant la consommation rapide de ladite réserve énergétique. On entend par cela que l'enzyme est exprimée dans la plante avec un taux d'expression d'au moins 0,3% par rapport au total des protéines exprimées dans la plante.
' invention concerne donc tout particulièrement des semences et plantes transgéniques dont le pouvoir de germination est détruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination.
Un premier mode de réalisation d'une semence de 1 ' invention est une semence transgénique qui contient au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme qui confère la destruction du pouvoir germinatif de ladite semence par consommation rapide d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une semence transgénique qui contient au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination. Une telle semence transgénique contient dans ses cellules au moins un gène chimère comprenant successivement :
- un promoteur, par exemple le promoteur constitutif double 35S ou plus particulièrement un promoteur semence spécifique,
- éventuellement une séquence codant pour un peptide signal,
- un gène codant pour une enzyme choisie dans le groupe des lipases, des protéases, des amylases, dont l'action sur le métabolisme de la semence est identique à celle des enzymes de la germination,
- une séquence de terminaison.
Le promoteur est avantageusement choisi parmi :
- Le promoteur double 35S du virus de la mosaïque du chou fleur, ou encore d'autres promoteurs d ' origine virale généralement reconnus comme tel par 1 ' homme du métier . - Le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis permettant l'expression de protéines ou polypeptides uniquement dans les semences ou dans les graines (Depigny-This et al . , : Plant Mol. Biol. , 20, 467-479, 1992) .
Les promoteurs pGEAl et pGEAβ correspondant à la région 5 ' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEAI et GEA6, d' Arabidopsis thaliana permettant une expression spécifique dans les graines (Gaubier et al., Mol. Gen. Genêt., 238, 409-418, 1993).
La séquence codant pour un peptide signal est avantageusement choisie parmi :
La séquence nucléotidique de 69 nucléotides codant pour le prépeptide de 23 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, ce peptide signal permettant 1 ' entrée des polypeptides recombinants dans le système de sécrétion des cellules végétales transformées, principalement dans le reticulum endoplasmique .
La séquence nucléotidique de 42 nucléotides codant pour le propetide N-terminal d'adressage vacuolaire de 14 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, permettant 1 ' accumulation de polypeptides recombinants dans les vacuoles des cellules végétales transformées. - La séquence de 111 nucléotides codant pour le prépropetide de 37 acides aminés de la sporamine A constitué de la partie N-terminale vers la partie C- terminale des 23 acides aminés du prépeptide susmentionné suivi par les 14 acides aminés du propetide susmentionné, ce prépropetide permettant l'entrée de polypeptides recombinants dans le système de sécrétion et leur accumulation dans les vacuoles des cellules végétales transformées.
Les trois séquences ci-dessus sont décrites dans les articles de Murakami et al. (Plant Mol. Biol., 7, 343-355, 1986) et Matsuoka et Nakamura (Pro. Natl . Acad. Sci. USA, 88, 834-838, 1991) . La séquence hétérologue codant pour 1 ' enzyme peut être par exemple celle de la lipase gastrique de chien décrit dans la demande de brevet PCT publiée sous le Numéro WO 96/33277 ou celle de la lipase pancréatique humaine (Lowe et al., J. Biol. Biochem. , 264, 20042- 20048, 1989). L'activité de la lipase dans les semences de plantes selon l'invention entraîne, lorqu ' elle n'est pas arrêtée ou ralentie par les conditions de stockage, une diminution de la teneur en triglycéride sans modification de la composition en acides gras. En effet, l'action de la lipase sur la composition de la graine doit être identique à celles des enzymes de la germination et/ou de la digestion.
Un deuxième mode de réalisation d'une semence selon l'invention, est une semence transgénique qui contient au moins un gène endogène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination, placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi ceux permettant la surexpression et 1 ' activation dudit gène avant l'initiation du processus de germination, comme un promoteur semence spécifique plus ou moins précoce.
L'invention concerne aussi un plante transgénique ou partie de cette plante, comme des cellules, caractérisée en ce qu'elle contient :
- au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme qui confère la destruction du pouvoir germinatif des semences de ladite plante par consommation rapide d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination, comme décrit précédemment, ou - au moins un gène endogène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination, placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi ceux permettant la surexpression et l'activation dudit gène avant l'initiation du processus de germination. Ces promoteurs peuvent être ceux déjà décrits précédemment. Les semences et plantes ou parties de plantes selon 1 ' invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs gènes hétérologues d'intérêt, tels que des gènes capables de conférer à la plante un caractère agronomique ou une résistance à un prédateur ou à un herbicide ou un gène codant pour une protéine d'intérêt pharmaceutique. Ces gènes hétérologues d'intérêt peuvent être introduits dans les semences en même temps ou avant les gènes chimères permettant de détruire le pouvoir germinatif desdites semences conformément à l'invention. Les semences de 1 ' invention sont alors remarquables en ce qu'elles permettent de limiter la dissémination non volontaire de semences portant ces gènes d'intérêt.
Les semences et plantes selon 1 ' invention peuvent être des semences et plantes dicotylédones ou monocotylédones , comme celles sélectionnées dans le groupe constitué par les solanacées (tomate, tabac) , les crucifères (colza), les céréales (maïs, blé).
Le procédé selon 1 ' invention présente des avantages par rapport aux techniques couplant une stérilité mâle cytoplasmique et un gène d'intérêt. En effet, la destruction du pouvoir germinatif de la semence interdit la multiplication des semences issues des gamètes mâles et femelles. Tandis qu'une stérilité mâle n ' empêche pas 1 ' obtention de semences issues de gamètes femelles. En outre, l'obtention de semences homozygotes pour le gène hétérologue est facile alors qu'elle est complexe dans le cas d'une technique stérilité mâle, car il est nécessaire de disposer d'une technique de restauration de la fertilité. L'invention se rapporte donc également à l'utilisation d'un gène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination pour préparer une plante transgénique dont la germination est contrôlée. Plus particulièrement l'invention concerne l'utilisation d'un gène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination pour préparer une plante transgénique dont le pouvoir germinatif est détruit. On préfère tout particulièrement utiliser selon l'invention, un gène qui code pour une enzyme choisie dans le groupe des lipases, des protéases, des amylases, dont l'action sur le métabolisme de la semence est identique à celle des enzymes de la germination et/ou de la digestion.
D ' autres caractéristiques et avantages de 1 ' invention apparaîtront dans la description qui suit se rapportant à la préparation de semences transgéniques de 1 ' invention de tabac et de colza exprimant une lipase hétérologue, et dans laquelle il sera fait référence au dessin en annexe où la figure 1 représente la conservation de semences de colza transgéniques exprimant une lipase sous promoteur semence spécifique.
1) Préparation de graines de tabac exprimant la lipase de chien sous le contrôle d'un promoteur constitutif .
Le promoteur utilisé est le promoteur double 35S. En amont du gène codant pour la lipase de chien est placée une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion.
Les plants de tabac utilisés pour les expériences de transformation {Nicotiana tabacum var. Xanthi NC et PBD6) sont cultivés in vitro sur le milieu de base de Murashige et Skoog (1962) additionné des vitamines de Gamborg et al. (1968, Sigma référence M0404) de saccharose à 20g/l et d'agar (Merk) à 8 g/1 . Le pH du milieu est ajusté à 5,8 avec une solution de potasse avant autoclavage à 120°C pendant 20 min. Les plantules de tabac sont repiquées par bouture des entre- noeuds tous les 30 jours sur ce milieu de multiplication MS20.
Toutes les cultures in vi tro sont réalisées en enceinte climatisée, dans les conditions définies ci- dessous : - intensité lumineuse de 30μE. πT^.S--1; photopériode de 16h;
- thermopériode de 26°C le jour, 24°C la nuit .
La technique de transformation utilisée est dérivée de celle de Horsch et al. (Science, 227, 1229- 1231, 1985) .
Une préculture d ' Agrobactérium tumefaciens souche LBA4404 contenant les plasmides pBIOC29 ou pBIOC26 ou pBI0C25 est réalisée durant 48h à 28°C sous agitation, dans du milieu LB (Sambrook et al., Molecular Cloning Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) additionné des antibiotiques adéquats (rifampicine et tétracycline) . La préculture est ensuite diluée au 50ème dans le même milieu et cultivée dans les mêmes conditions. Après une nuit, la culture est centrifugée (10 min., 3000 g), les bactéries sont reprises dans un volume équivalent de milieu MS30 (30 g/1 saccharose) liquide et cette suspension est diluée au lOème.
Des explants d'environ lcm2 sont découpés à partir des feuilles des plantules décrites ci-dessus. Ils sont ensuite mis au contact de la suspension bactérienne pendant une heure, puis séchés rapidement sur papier filtre et placés sur un milieu de coculture (MS30 solide) . Après 2 jours, les explants sont- transférés en boîtes de Pétri sur le milieu de régénération MS30, contenant un agent sélectif, la kanamycine (200 mg/1) , un bactériostatique, l'augmentin (400 mg/1) et les hormones nécessaires à l'induction de bourgeons (BAP, lmg/1 et ANA, 0,1 mg/1) . Un repiquage des explants est effectué sur le même milieu après 2 semaines de culture.
Après 2 semaines supplémentaires, les bourgeons sont repiqués en boîtes de Pétri sur le milieu de développement composé du milieu MS20 additionné de kanamycine et d'augmentin. Après 15 jours, les bourgeons sont repiqués de moitié. L'enracinement prend environ 20 jours, au terme desquels les plantules peuvent être clonées par bouture d'entre-noeuds ou sorties en serre. Selon le même procédé, il est possible d'obtenir des graines de tabac exprimant la lipase pancréatique humaine sous le contrôle d'un promoteur constitutif .
2 ) Préparation de graines de colza exprimant la lipase de chien sous le contrôle d'un promoteur semence spécifique.
Le promoteur utilisé est le promoteur de la cruciférine. En amont du gène codant pour la lipase est placée une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion.
Les grains de colza de printemps {Brassica napus cv WESTAR ou lignées Limagrain) sont désinfectées pendant 40 minutes dans une solution de Domestos à 15%. Après 4 rinçages à l'eau stérile, les graines sont mises à germer, à raison de 20 graines par pot de 7 cm de diamètre et 10 cm de haut, sur du milieu minéral de Murashige et Skoog (Sigma M 5519) avec 30g/l de saccharose et solidifié avec de 1 ' agargel à 5g/1. Ces pots sont placés dans une chambre de culture à 26°C avec une photopériode de 16h/8h et sous une intensité lumineuse de l'ordre de 80 μE m~2 s~^.
Après 5 jours de germination, les cotylédons sont prélevés stérilement en coupant chaque pétiole environ 1mm au-dessus du noeud cotylédonaire.
Parallèlement une préculture d ' Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404, contenant le plasmide pGAZE dans lequel a été inséré la séquence codant pour un signal d'adressage PPS (ou PS) sous contrôle du promoteur pCRU (ou pd35S) , est réalisée en erlen meyer de 50 ml, pendant 36 h à 28°C dans 10 ml de milieu bactérien 2YT (Sambrook et al., Molecular Cloning Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) complémenté avec les antibiotiques utiles à la sélection de la souche utilisée.
Cette préculture sert à ensemencer à 1% une nouvelle culture bactérienne effectuée dans les mêmes conditions. Au bout de 14 h la culture est centrifugée 15 min à 3000g et les bactéries sont reprises dans un volume équivalent de milieu de germination liquide. Cette suspension est distribuée dans les boîtes de pétri de 5 cm de diamètre à raison de 5ml/boîte.
L'extrémité sectionnée du pétiole est immergée quelques secondes dans la solution d' agrobactéries ainsi préparées, puis le pétiole est enfoncé de quelques millimètres dans le milieu de régénération. Ce milieu à la même composition de base que le milieu de germination avec en plus 4mg/l de benzyl-amino-purine (BAP) , phytohormone favorisant la néoformation de bourgeons. Dix explants (cotylédon avec pétiole) sont mis en culture par boîte de Petri de 9 cm de diamètre (Greiner référence 664102) .
Après 2 jours de coculture dans les mêmes conditions environnementales que les germinations, les explants sont repiqués .dans des boîtes phytatray (Sigma, référence P1552) contenant le milieu précédent complémenté avec un agent sélectif : 45 mg/1. de sulfate de kanamycine (Sigma, référence R4000) et un bactériostatique : mélange de 1/6 (en poids) de sel de potassium d'acide clavulanique et de 5/6 sel de sodium d ' amoxicilline (Augmentin injectable) à raison de 600 mg/1.
Deux fois de suite, à 3 semaines d'intervalle, les explants sont repiqués stérilement sur du milieu neuf dans les mêmes conditions. Les bourgeons verts apparus à la fin du deuxième ou du troisième repiquage sont séparés de l'expiant et mis en culture individuellement dans des pots transparents de 5cm de diamètre et de 10 cm de haut contenant un milieu identique au précédent mais dépourvu de BAP. Après 3 semaines de culture la tige du bourgeon transformé est sectionnée et le bourgeon est repiqué dans un pot de milieu frais. Au bout de trois à quatre semaines les racines sont assez développées pour permettre l'acclimatation en phytotron (température 21°C, photopériode 16h/8h et 84% d'humidité relative), les plantules sont rempotées dans des pots de 12 cm de diamètre remplis du même terreau enrichi en engrais retard (Osmote , à raison de 4 g/1 de terreau) puis transportées en serre (classe S2) régulée à 18°C, avec deux arrosages quotidien de 2 minutes à l'eau.
Dès l'apparition de fleurs celles-ci sont ensachées (Crispac, référence SM 570y 300 mm*700 mm) de façon à empêcher la fécondation croisée.
Lorsque les siliques sont arrivées à maturité, elles sont récoltées, séchées, puis battues. Les graines obtenues servent au dosage de 1 ' activité biochimique. La sélection de la descendance transgénique se fait par germination sur un milieu contenant du sulfate de kanamycine à raison de 100 à 150 mg/1 (selon les génotypes) . Les conditions opératoires sont identiques à celles décrites ci-dessus à ceci près que les germinations sont effectuées en tubes de verre avec une seule graine par tube . Seules les plantules développant des racines secondaires les trois premières semaines sont acclimatées en phytotron avant d'être passées en serre. Selon le même procédé, il est possible d'obtenir des graines de colza exprimant la lipase pancréatique humaine sous le contrôle d'un promoteur semence spécifique.
3) Mesures de l'effet de l'activité de la lipase sur le pouvoir de germination dans les graines des exemples 1 et 2.
L'activité de la lipase, lorsqu'elle n'est pas ralentie ou arrêtée par des conditions de conservation, froid de 4°C et hygrométrie réduite, entraîne une diminution de la teneur en triglycéride sans modification de la composition en acide gras.
L'activité lipasique est déterminée à l'aide d'un pH-STAT par la méthode titrimétrique de Gargouri et al. (Gastroenterology, 91, 919-925, 1986) dans laquelle le substrat utilisé est la tributyrine. L'émulsion de tributyrine (4 ml pour 30 ml d'émulsion) est réalisée au vortex en présence de sels biliaires (1,04 g/1) d'albumine bovine (0,1 g/1) et de NaCl (9 g/1). Le dosage consiste à neutraliser l'acide butyrique libéré sous 1 ' action de la lipase par une solution de soude à un pH de consigne de 5,5 à 37°C. Une unité lipase correspond à la quantité d'enzyme qui provoque la libération d'une micromole d'acide gras en 1 minute à 37°C et dans le conditions optimales de pH (5,5) . La lipase gastrique de chien purifiée a une activité spécifique de 570 unités/mg de protéine. L'activité lipase peut être mesurée sur le broyât total, sur le culot ou sur le surnageant de centrifugation. Les mesures de l'activité lipasique confirment l'expression, dans les graines de plants transformés, de la lipase codée par le gène hétérologue. Si l'on suit l'évolution du -pouvoir de germination de ces graines à l'activité lipasique au cours du temps, on observe une dégradation rapide de la capacité de ces graines à germer jusqu'à disparition après 16 semaines. Par contre, si ces graines sont conservées dans des conditions qui ne permettent pas l'expression de l'activité lipasique (4°C) , leur pouvoir de germination n'est pas dégradé (Figure 1). Ce qui confirme l'effet de l'activité lipasique sur le pouvoir germinatif transgéniques et l'intérêt de son utilisation selon l'invention.
4) Essais au champ .
Pour mettre en évidence la limitation de la dissémination engendrée par l'invention, il suffit de réaliser dans les mêmes parcelles des cultures de plantes transgéniques selon l'invention, par exemple du colza exprimant la lipase gastrique de chien sous contrôle du promoteur de la cruciférine de radis, et les lignées non transgéniques, chacun sur des espaces repérés, et de récolter les plantes dans les mêmes conditions. Une partie des semences produites vont tomber dans la parcelle pendant la culture ou lors de la récolte, et l'année suivante, on note l'intérêt des semences et plantes selon 1 ' invention en comparant le nombre de repousse sur chacune des parcelles.
Un essai en plein champ de colzas transgéniques homozygotes pour le transgène : cDNA codant pour la lipase gastrique sous promoteur constitutif a été réalisé. Ce champ de colzas transgéniques était entouré de bordures de colzas non transgéniques. Cet essai permettait de confirmer en conditions réelles le potentiel de re germination de semences transgéniques exprimant le cDNA codant pour la lipase gastrique. Observation du nombre de repousses sur chaque parcelle.
Chacune de ces parcelles a été récoltée indépendamment avec la même moissonneuse batteuse. Le rendement de production de grains de colza a été a peu près équivalent dans les deux parcelles. Il est donc raisonnable de penser que la quantité de grains de colza tombée au sol lors de la récolte est équivalente pour chaque parcelle.
Deux années après la culture, un prélèvement systématique des repousses de colza a été réalisé dans chacune de ces parcelles et a donné les résultats rapportés dans le tableau ci-dessous :
Bordure Culture Bordure gauche de centrale de droite de colzas Non colzas colzas Non
Transgéniques Transgéniques Transgéniques
Surface de prélèvement 1155 m2 924 m2 924 m2 des repousses
Nombre de repousses 474 44 297 observées
Nombre de
Figure imgf000016_0001
repousses/m2 0,41 0,05 0,32
En moyenne il y a donc eu 7,8 fois moins de repousses au mètre carré sur la parcelle cultivée en colzas transgéniques que sur les parcelles cultivées en colzas non transgéniques .
Confirmation de la nature transgénique des repousses .
Compte tenu des projections de semences hors des limites de chaque parcelle pouvant survenir pendant la récolte des colzas ou lors du travail du sol pendant les deux années suivantes, il a été vérifié que les repousses trouvées sur une parcelle en provenaient bien ; ceci en vérifiant si elles comportaient ou non le gène de la lipase. Une partie des repousses a donc été prélevée et repiquée en serre : 45 pour . ' la bordure droite, 44 (la totalité) pour la culture centrale, 52 pour la bordure gauche. Ces plantes ont été menées à maturité et menées en autofécondation. Des prélèvement de feuilles ont été réalisées pour déterminer la présence ou l'absence du cDNA codant pour la lipase dans ces plantes. Après broyage dans l'azote liquide de l'échantillon, le tampon d'extraction (Tris-HCl 0 , 2M ; Na-EDTA 0,25mM ; NaCl 0,25M ; SDS 0,5% ; pH8 , 0 ) est ajouté. Puis, le milieu reactionnel est soumis au vortex pendant 5 sec. suivi d'une extraction au phénol- chloroforme-alcool isoamylique (25/24/1 v/v/v) . La phase aqueuse est ensuite précipitée en ajoutant de 1 ' isopropanol à -80°C pendant 15 min. Après centrifugation à 4000 g pendant 15 min. le culot est lavé dans l'éthanol 70%, puis recentrifugé et séché. Le culot est repris dans 100 μl de H20. La réaction d'amplification PCR de l'ADN est réalisée dans un thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 en présence de 0,36 μl de chacune des amorces oligodésoxynucléotidiques 5' TTCTACCCACACCACTTC 3' et 5' ACATGCATGTCTGTCAGG 3' à 50 pmoles/μl, 0,5 μl dNTP lOmM, 3 μl glycérol 98%, 1,8 μl MgC12 25mM, 0,36 μl BSA 10 mg/ml, 3 μl de tampon ADN polymerase Promega xlO et 0,36 μl de Taq ADN polymerase Promega à 5 U/μl dans un milieu reactionnel de 30 μl final. L'ADN est dénaturé pendant 5 min à 94°C, soumis à 35 cycles constitués chacun de 30 se dénaturation à 94°C, de 1 min. d'hybridation à 50°C, et de 1 min. d'élongation à 72 °C, puis l'élongation est poursuivie pendant 5 min.
Les résultats obtenus montrent que :
- le cDNA codant pour la lipase gastrique n'est détecté dans aucun échantillon des bordures droites et gauches. - seuls 64% (27/42, et non pas 44 car 2 plantes ont été perdues lors du repiquage en serre) des repousses issues de la parcelle centrale cultivée en colzas transgéniques, possèdent le cDNA codant pour la lipase.
Il n'a donc pas été trouvé de repousses de plantes transgéniques dans la partie initialement cultivée en colzas non transgéniques (ou à un taux non détectable du fait de l'échantillonnage : environ 11% des repousses ont été analysées) . Cela ne signifie pas qu'il n'y a pas eu passage de graines transgéniques dans les autres parcelles, mais que si il y en a eu (ce qui est très probable) elle n'ont pas été capables de regermer .
Ces analyses montrent que le potentiel de re-germination en plein champ des semences transgéniques a été surévalué de 36%. Le nombre de repousses transgéniques dans la zone initialement cultivée en colzas trangéniques est de 0.3 plantes/ m2. Le potentiel de re-germination des semences transgéniques est donc dans le cadre de cet essai 12 fois moins important que celui des colzas non transgéniques.
Vérification de l'expression du transgène codant pour la lipase gastrique
Enfin il a été contrôlé que le transgène s'exprimait bien dans les semences positives au test PCR. Pour cela, l'activité lipasique a été dosée pour chacun des 27 lots de semences récoltés à partir des 27 plantes PCR+, par la technique pH Stat. Tous les lots expriment la lipase. L'activité lipasique moyene est de 74 UTC4/g de grain (valeurs extrêmes : 40 ; 104 UTC4/ g grain, cf résultats ci-joint) contre initialement 125 UTC4/ g grain récolté : soit une baisse d'environ 41% de l'activité lipasique. Seules des semences dont le niveau d'expression du transgène à baissé ( pour quelques raisons que se soit : du fait de conditions physiologiques, de phénomènes d'extinction, ....) sont partiellement aptes à regermer. Cet essai grandeur réelle montre donc clairement que les semences de colzas transgéniques exprimant la lipase gastrique possèdent un très net désavantage sélectif, rendant leur dissémination très fortement improbable du fait de leur perte de pouvoir germinatif :
- le potentiel de repousse des grains transgéniques est environ 12 fois moins important que pour les graines non transgéniques - les graines transgéniques qui ont germées dans le cadre de cet essai expriment deux fois moins la lipase recombinante que les semences initiales. Il semble donc que lorsque les semences expriment la lipase au moins à hauteur de 120 UTC4/ g, elles n'aient pas de potentiel de re germination en condition de plein champ.
Par ailleurs, il a été constaté que la lipase gastrique n'a pas d'effet significatif sur la composition en acides gras, la teneur en matière grasse des semences transgéniques étant significativement diminuée. Les graines (T2 et T3 ) de colza exprimant la lipase ont une teneur en matières grasses de l'ordre de 22 à 24 % au lieu de 40 % en moyenne, soit une baisse d'environ 40%.

Claims

REVENDICATIONS
1) Semence de plante dont le pouvoir germinatif est détruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination, dans laquelle la destruction du pouvoir germinatif est conférée par une enzyme présente dans la semence à un niveau permettant la consommation rapide de ladite réserve énergétique.
2) Semence transgénique dont le pouvoir de germination est détruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination.
3 ) Semence transgénique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination.
4 ) Semence transgénique selon 1 ' une des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme qui confère la destruction du pouvoir germinatif de ladite semence par consommation rapide d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination.
5) Semence selon l'une des quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un gène chimère comprenant successivement :
- un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal, - un gène codant pour une enzyme choisie dans le groupe des lipases, des protéases, des amylases, dont l'action sur le métabolisme de la semence est identique à celle des enzymes de la germination et/ou de la digestion, et
- une séquence de terminaison.
6) Semence selon la revendication 5, caractérisée en ce que le promoteur est choisi parmi :
Le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis permettant l'expression de protéines ou polypeptides uniquement dans les semences ou dans les graines .
Les promoteurs pGEAl et pGEA6 correspondant à la région 5 ' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEAI et GEA6, d'Arajidopsis thaliana permettant une expression spécifique dans les graines.
7 ) Semence selon 1 ' une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que la séquence codant pour un peptide signal est choisie parmi : - La séquence nucléotidique de 69 nucléotides codant pour le prépeptide de 23 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce.
La séquence nucléotidique de 42 nucléotides codant pour le propeptide N-terminal d'adressage vacuolaire de 14 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce .
- La séquence de 111 nucléotides codant pour le prépropetide de 37 acides aminés de la sporamine A constitué de la partie N-terminale vers la partie C- terminale des 23 acides aminés du prépeptide de la sporamine A chez la patate douce suivi par les 14 acides aminés du propeptide N-terminal d'adressage vacuolaire de la sporamine A chez la patate douce.
8) Semence selon l'une quelconque des revendications 3 à 7 , caractérisée en ce que le gène hétérologue code pour la lipase gastrique de chien. 9) Semence selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un gène endogène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination, placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi ceux permettant la surexpression et l'activation dudit gène avant l'initiation du processus de germination.
10) Plante transgénique ou partie de cette plante, caractérisée en ce qu'elle contient :
- au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme qui confère la destruction du pouvoir germinatif des semences de ladite plante par consommation rapide d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination, ou
- au moins un gène endogène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination, placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi ceux permettant la surexpression et l'activation dudit gène avant l'initiation du processus de germination.
11/ Semence transgénique selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 ou plante transgénique selon la revendication 10, caractérisée en qu'elle contient en outre un ou plusieurs gènes hétérologues d'intérêt, tels que des gènes capables de conférer à la plante un caractère agronomique ou une résistance à un prédateur ou à un herbicide ou un gène codant pour une protéine d'intérêt pharmaceutique.
12) Utilisation d'un gène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination pour préparer une plante transgénique dont le pouvoir germinatif est détruit .
13) Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que le gène code pour une enzyme choisie dans le groupe des lipases, des protéases, des amylases, dont l'action sur le métabolisme de la semence est identique à celle des enzymes de la germination et/ou de la digestion.
PCT/FR1999/000806 1998-04-09 1999-04-07 Semences et plantes dont le pouvoir germinatif est detruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une reserve energetique indispensable a la germination WO1999052344A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002324944A CA2324944A1 (fr) 1998-04-09 1999-04-07 Semences et plantes dont le pouvoir germinatif est detruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une reserve energetique indispensable a la germination
AU30420/99A AU758821B2 (en) 1998-04-09 1999-04-07 Seeds and plants whereof the germinating capacity is destroyed by total or partial lack of at least one energy reserve indispensable to germination
EP99911897A EP1069818A1 (fr) 1998-04-09 1999-04-07 Semences et plantes dont le pouvoir germinatif est detruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une reserve energetique indispensable a la germination

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR98/04495 1998-04-09
FR9804495A FR2777155B1 (fr) 1998-04-09 1998-04-09 Semences et plantes dont le pouvoir germinatif est detruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une reserve energetique indispensable a la germination

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1999052344A1 true WO1999052344A1 (fr) 1999-10-21

Family

ID=9525096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1999/000806 WO1999052344A1 (fr) 1998-04-09 1999-04-07 Semences et plantes dont le pouvoir germinatif est detruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une reserve energetique indispensable a la germination

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1069818A1 (fr)
AU (1) AU758821B2 (fr)
CA (1) CA2324944A1 (fr)
FR (1) FR2777155B1 (fr)
WO (1) WO1999052344A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1754790A2 (fr) * 2003-02-27 2007-02-21 CropDesign N.V. Promoteurs d'Arabidopsis

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996033277A2 (fr) 1995-04-20 1996-10-24 Biocem S.A. Lipases preduodenales recombinantes et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations
US5712112A (en) * 1992-11-04 1998-01-27 National Science Council Of R.O.C. Gene expression system comprising the promoter region of the alpha-amylase genes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712112A (en) * 1992-11-04 1998-01-27 National Science Council Of R.O.C. Gene expression system comprising the promoter region of the alpha-amylase genes
WO1996033277A2 (fr) 1995-04-20 1996-10-24 Biocem S.A. Lipases preduodenales recombinantes et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE CABA AN-95:9133 Proc. of the Royal Australian Chemistry Inst. - Cereal Chemistry Division Symposium on Improvement of Cereal Quality by Genetic Engineering (Sidney, September 1993) HENRY, R.J. "Genetic Engineering of Resistance to Starch Hydrolysis caused by pre-harvest sprouting" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1754790A2 (fr) * 2003-02-27 2007-02-21 CropDesign N.V. Promoteurs d'Arabidopsis
EP1754790A3 (fr) * 2003-02-27 2007-05-02 CropDesign N.V. Promoteurs d'Arabidopsis

Also Published As

Publication number Publication date
EP1069818A1 (fr) 2001-01-24
FR2777155B1 (fr) 2000-06-23
AU3042099A (en) 1999-11-01
FR2777155A1 (fr) 1999-10-15
AU758821B2 (en) 2003-04-03
CA2324944A1 (fr) 1999-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Murphy et al. Role of lipid bodies and lipid-body proteins in seeds and other tissues
JP2022009102A (ja) 導入遺伝子の効率的な標的指向化のための構成物及び方法
CN110734916B (zh) OsbHLH98在调控水稻叶夹角中的应用
FR2651504A1 (fr) Plantes transgeniques appartenant a l'espece cucumis melo.
EP0972061B1 (fr) Utilisations de la sterilite male chez les plantes
FR2709496A1 (fr) Procédé de production de plantes transgéniques, entièrement transformées en génération T0, à partir de méristèmes.
EP0822988B1 (fr) Lipases preduodenales recombinantes et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations
WO1999052344A1 (fr) Semences et plantes dont le pouvoir germinatif est detruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une reserve energetique indispensable a la germination
WO2015124799A1 (fr) Plantes a rendement accru et methode d'obtention de telles plantes
FR2687284A1 (fr) Plante portant des genes codant pour des enzymes de la voie de biosynthese des phytosterols, et procede d'obtention.
EP2627772B1 (fr) Obtention de plantes ayant une tolérance améliorée à un déficit hydrique
CA2269025A1 (fr) Lipases pancreatiques et/ou colipases recombinantes et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations
CA2449273A1 (fr) Sur-expression d'une lipoxygenase dans les plantes et diminution de la sensibilite des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogenes
FR2796963A1 (fr) Procede d'obtention de lignees isotransgeniques
EP1121451B1 (fr) Procede d'obtention de plantes transgeniques exprimant une proteine a activite productrice de peroxyde d'hydrogene par transformation par agrobacterium rhizogenes
Regnard Characterization of an MKK3 module involved in the regulation of seed dormancy in Arabidopsis thaliana
WO2002000890A1 (fr) Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications
Nawal et al. www. ijarbs. com Coden: IJARQG (USA)
Mokrani et al. DEVELOPMENT, DORMANCY AND GERMINATION OF SEEDS METABOLISM, HORMONAL CONTROL AND GENETIC CONTROL
Elayaraja Balusamy Jaganath, Kondeti Subramanyam, Subramanian Mayavan, Sivabalan Karthik, Dhandapani
WO2000008188A1 (fr) Cellule vegetale transformee avec au moins la partie codante du gene codant pour la fibrilline
FR2825578A1 (fr) Sur-expression d'une lipoxygenase dans les plantes et diminution de la sensibilite des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogenes
FR2976950A1 (fr) Obtention de plantes ayant une tolerance amelioree a un stress hydrique

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CU CZ DE DK EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SL SZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2324944

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2324944

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09684019

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 30420/99

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999911897

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999911897

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 30420/99

Country of ref document: AU

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1999911897

Country of ref document: EP