EP0853631A1 - Regulatorisches gen aus ustilago maydis - Google Patents

Regulatorisches gen aus ustilago maydis

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EP0853631A1
EP0853631A1 EP96933423A EP96933423A EP0853631A1 EP 0853631 A1 EP0853631 A1 EP 0853631A1 EP 96933423 A EP96933423 A EP 96933423A EP 96933423 A EP96933423 A EP 96933423A EP 0853631 A1 EP0853631 A1 EP 0853631A1
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EP
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ala
ser
arg
leu
pro
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Withdrawn
Application number
EP96933423A
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English (en)
French (fr)
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Regine Kahmann
Claudia Quadbeck-Seeger
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to a regulatory gene from the fungus Ustilago maydis, the use of this gene and fungal mutants which carry a mutation in this gene.
  • Ustilago maydis the cause of the bump fire in maize, has a two-phase life cycle.
  • the haploid stage grows yeast-like and is not pathogenic.
  • the dikaryon shows filamentous growth and represents the pathogenic form.
  • the fungus has two crossing-type loci.
  • the a-lucus, of which two alleles exist, is for the fusion of haploid cells and the formation of the
  • the multiallele b locus controls the pathogenicity and sexual development of the fungus. It codes for two homeodomain proteins (bw and bE) that form functional heterodimers.
  • a b-locus regulated gene egl 1 codes for an endoglucanase, the expression of which is induced in the filament phase.
  • the expression of glucanase egll can be reliably and clearly demonstrated with indicator plates based on carboxymethyl cellulose with Congo red. Therefore, egll is suitable as a reporter gene for the search for genes with regulatory functions for the expression of differentially expressed genes. Since the filamentous phase of Ustilago maydis is pathogenic to maize, the task was to identify genes or gene products which are linked to the regulation of the filamentous phase. Such genes or gene products should represent suitable intervention options for eliminating the pathogenicity.
  • a nucleic acid fragment from the fungus Ustilago maydis has now been found which contains a regulatory gene.
  • the invention relates to a nucleic acid fragment from the fungus Ustilago Maydis, which is characterized by the Xbal-Bglll fragment shown in FIG. I and is characterized by the nucleic acid sequence between the Bglll and the Xbal interface shown in FIG. III.
  • the nucleic acid fragment was isolated as follows:
  • a haploid Ustilago maydis strain FBI (al bl) (Banuett, F. and Herskowitz, I. (1989). Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proc. Acad. Be. USA 86: 5878-5882), which does not express the endoglucanase egll, was subjected to UV mutagenesis. Screening of the mutants obtained after constitutive egll expression by screening for carboxymethyl cellulose plates and subsequent Congo red staining revealed a mutant with the property sought, ie filament-independent constituent egll expression.
  • This regulatory gene or the associated gene product thus represents a possible specific site of action for fungicides.
  • possible fungicidal compounds can be easily checked for interaction with the site of action found by using a haploid Ustilago strain that does not contain any endoglucanase expressed, in contact with the potential fungicide and determined whether egll expression takes place. In the positive case, an interaction of the fungicide with the regulatory gene product can be assumed.
  • Such a test method can be carried out particularly easily if carboxy-methylcellulose plates which are stained with Congo red are used for the screening for egll expression.
  • nucleic acid fragments from other microorganisms which are also able to functionally complement a constitutively expressing Ustilago maydis mutant.
  • Such nucleic acid fragments can be easily produced using conventional genetic engineering methods such as hybridization, by starting from the Ustilago nucleic acid fragment as a sample, isolating corresponding clones that hybridize under standard conditions from other organisms and testing them functionally.
  • a gene product of the nucleic acid fragment defined above which is represented by the amino acid sequence shown in FIG. IV (SEQ ID NO: 2) and in particular by the nucleic acid III is encoded by the open reading frame beginning with the ATG start codon from position 1847-1849 and ending with the TAG stop codon in position 8714-8716 (SEQ ID NO: 1);
  • the strain was in YEPS liquid medium (Tsukuda, T., S., Fotherringham, S. and Holloman, WK (1988). Isolation and characterization of an autonomously replicating sequence from Ustilago maydis. Mol. Cell. Biol. 8 : 3703-3709) inoculated and shaken at 28 ° C. The cultures were centrifuged at a cell count of 1 ⁇ IO 6 to 3 ⁇ IO 6 and resuspended in the same amount of H 2 O bidistilled. 1 ml of this cell suspension was treated with UV in a Petri dish. The irradiation times were chosen so that the survival rates were below 1%. Aliquots of the UV-treated cell suspension were then plated out.
  • the screening for mutants was carried out on carboxymethyl cellulose plates (0.5% yeast extract, 0.4% bacto-pentone, 0.4% sucrose, 2% carboxymethyl cellulose, 1.5 Bitek agar).
  • the colonies from the UV mutagenesis were replica-plated onto the test plates or, if the colony densities were too high, picked and incubated at 29 ° C. The cells are then used to test for egll
  • the mutant was obtained with a compatible wild-type strain (FB2 a2b2, Banuett and Herskowitz, 1989) on CM-Charcoal plates (Holliday, R. (1974). In: Handbook of Genetics, Vol 1, RC King, ed. (New York: Plenum Press), pp. 575-595) crossed to mutations excluded in the b locus. It was found that the mutant shows the same crossing behavior as the parent strain.
  • RNA from liquid cultures of the mutant was prepared in YEPS (Schmitt, ME, Brown, TA: and Trumpower, BL (1990).
  • YEPS Schott, ME, Brown, TA: and Trumpower, BL (1990).
  • Hindlll-Sacl fragment from the open reading frame of the egll gene was used as a probe for the Northern blots (dissertation Stammer "Isolation and characterization of a filament-specific expressed cellulase from Ustilago maydis", Freie (2015) Berlin, 1995).
  • Radioactive labeling of DNA with 32 P was Megaprime ® label ling kit (Amersham). It could be shown that egll is expressed in the mutant. The expression of further differentially expressed genes in the mutant could also be demonstrated.
  • the mutant obtained is not pathogenic in the haploid state.
  • tumor formation and the formation of basidiospores occur when maize plants are infected.
  • a compatible strain could be isolated after segregation, which also carries the mutation. Crossing this strain with the mutant originally obtained leads to tumor formation in the plant, but no spores are formed at this cross.
  • An imitation Ustilago strain produced in this way can be used, for example, to induce the formation of tumors (galls) in corn plants without the black discoloration caused by spores.
  • the mutant was complemented with a cosmid bank that had been produced from genomic DNA of the diploid strain FBD11 (ala2blb2) (Banuett and Herskowitz, 1989 see above).
  • PUMcos is a modified pScos 1 vector (Stratagene; Wahl, GM, Lewis, KS, Ruiz, JC, Rothenberg, B. Zhao, J., Evans, GA (1987) Cosmid vectors for rapid genomic walking, restriction mapping , and gene transfer Proc Natl Acad Sei USA 84: 2160-2164).
  • pScos a HindIII-Smal fragment of the neomycin resistance gene was replaced with an EcoRV-Smal fragment which mediates carboxin resistance in U. maydis (identified by cbxR in FIG. 1).
  • the EcoRV-Smal fragment comes from pCBX122 (Keon, J.P.R., White, G.A., Hargreaves, J.A. 1991). Isolation, characterization and sequence of a gene conferring resistance to the systemic fungieide carboxin from the maize smut pathogen, Ustilago maydis. Curr. Genet. 19: 475-481).
  • the mutant was transformed with the cosmid bank. Transformation from U. maydis to Schulz, B., Banuett, F., Dahl, M., Schlesinger, R., Schwarzfer, W., Martin, T., Herskowitz, I. and Kahmann, R. (1990) (The b alleles of U. maydis, whose combinations program pathogenic development, code for poly-peptides containing a homeodomain-related modif. Cell 60: 295-306). Pools of 98 cosmids were transformed.
  • the plasmids were isolated from the transformants by boiling miniprep (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Habor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) . A fragment from the rescue plasmid, which consists of U. maydis DNA, was obtained by digestion with EcoRI and Sall. This was radioactively marked and used to screen the individual filters of the cosmid pool with which it was possible to complement. The hydride was carried out at 65 ° C.
  • pHLN4 is derived from pHLl (Wang, J., Holden, D.W., and Leong, S.A. (1988). Gene transfer system for the phythopathogenic fungus U. maydis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 865-869). pHLl is a pUC12 derivative that
  • Hydromycin resistance gene under the control of U. maydis hsp carries 70 regulatory sequences.
  • Notl linkers were cloned in the Sacl site in the polylinker of pHLl. pHLN is described in: Schulz, B., Banuett, F., Dahl, M., Schlesinger, R. Schulfer, W., Martin, T., Herskowitz, I., and Kahmann; R. (1990).
  • the b alleles of U. maydis whose combinations program pathogenic development, code for polypeptides containing a homeodomain-related motif. Cell 60, 295-306.
  • both complementing fragments have an overlapping area.
  • a 5.4 kb BglII-BamHII fragment and a 3.4 kb BamHI-Xbal fragment were obtained from the Xbal-BglII fragment. Both fragments were cloned into the bluescript vector (Stratagene). The nucleic acid sequence of the 5.4 kb BglII-BamHI insert of clone pl709951 # 3 (FIG. II) and the 3.4 kb BamHI-Xbal insert of clone pl710951 # 9 (FIG. II) were determined by DNA sequencing ( see Figure III).
  • GCA CGC AAA ATG TTC CAG CAC CAG CCA TTT CCG CCT CTG GTT TTC GAT 2383 Ala Arg Lys Met Phe Gin His Gin Pro Phe Pro Pro Leu Val Phe Asp
  • GCT GCC TAC ACC CGC ATC ATC TTG CCC TTT GAA GAG TTT CTT GCA AAA 3007 Ala Ala Tyr Thr Arg Ile Ile Leu Pro Phe Glu Glu Phe Leu Ala Lys
  • GCT GGC AAT CAG GCG CAA GAA GAG CAA ATG TGC GAA ATC TGC CTC CGA 3487 Ala Gly Asn Gin Ala Gin Glu Glu Gin Met Cys Glu Ile Cys Leu Arg
  • AAG AAG ACC CTT GCT CTT GGC CCG ACT CCA CCT CTC AAG ACG CTG AGG 4927 Lys Lys Thr Leu Ala Leu Gly Pro Thr Pro Pro Leu Lys Thr Leu Arg
  • GAG GAT CTC AGG ACC TTT GTC ACC TGC GCC AAC TCG TGG GTG GAG CGG 5023 Glu Asp Leu Arg Thr Phe Val Thr Cys Ala Asn Ser Trp Val Glu Arg
  • GAC CCT GCC GAC GAC CAG AAC AAA CCC AAT GCA CGC AAC TGT ATC TGC 6127 Asp Pro Ala Asp Asp Gin Asn Lys Pro Asn Ala Arg Asn Cys Ile Cys
  • TTC AAA TTC CTC CCT CTG GAA TGG GAC GCC ATC GAG GAA GTG GTT GCC 6415 Phe Lys Phe Leu Pro Leu Glu Trp Asp Ala Ile Glu Glu Val Val Ala
  • ATC ACC AAA CGT GCG CGT CTC 7231 Ile His Ala Glu Glu Val His Ser Gin Ile Thr Lys Arg Ala Arg Leu 1780 1785 1790 1795
  • TCT GCC AAG GCT GAG CCT GTC GCA AAT GGG TCT ACG TTT TCG GCA CTG 8335 Ser Ala Lys Ala Glu Pro Val Ala Asn Gly Ser Thr Phe Ser Ala Leu

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein regulatorisches Nukleinsäurefragment aus Ustilago maydis und seine Verwendung.

Description

Regulatorisches Gen aus Ustilago maydis
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein regulatorisches Gen aus dem Pilz Ustilago maydis, die Verwendung dieses Gens sowie Pilz- mutanten, die eine Mutation in diesem Gen tragen.
Ustilago maydis, der Erreger des Beulenbrandes bei Mais, hat einen zweiphasigen Lebenszyklus. Das haploide Stadium wächst hefeartig und ist nicht pathogen. Das Dikaryon zeigt filamentöses Wachstum und stellt die pathogene Form dar. Der Pilz besitzt zwei Kreuzungstyp-Loci. Der a-Lucus, von dem zwei Allele existieren, ist für die Fusion haploider Zellen und die Ausbildung des
Dikaryons verantwortlich. Der multiallele b-Locus kontrolliert die Pathogenität und die sexuelle Entwicklung des Pilzes. Er co¬ diert für zwei Homeodomänenproteine (bw und bE) , die funktionelle Heterodimere bilden.
Ein b-Locus reguliertes Gen egl 1 codiert für eine Endoglucanase, deren Expression in der Filamentphase induziert wird. Die Expres¬ sion der Glucanase egll kann mit Indikatorplatten auf Basis Carboxymethylcellulose mit Kongorot sicher und eindeutig nachge- wiesen werden. Daher eignet sich egll als Reportergen zur Suche nach Genen mit regulatorisehen Funktionen für die Expression differentiell exprimierter Gene. Da die filamentöse Phase von Ustilago maydis Mais-pathogen ist, bestand die Aufgabe, Gene bzw. Genprodukte zu identifizieren, die mit der Regulation der filamentösen Phase verknüpft sind. Solche Gene bzw. Genprodukte sollten geeignete Interventionsmöglichkeiten zur Beseitigung der Pathogenität darstellen.
Es wurde nun ein Nukleinsäurefragment aus dem Pilz Ustilago maydis gefunden, das ein regulatorisches Gen enthält.
Gegenstand der Erfindung ist ein Nukleinsäurefragment aus dem Pilz Ustilago Maydis, das durch das in der Figur I dargestellte Xbal-Bglll-Fragment charakterisiert ist und durch die in Figur III angegebene Nukleinsäuresequenz zwischen der Bglll und der Xbal-Schnittstelle charakterisiert ist.
Das Nukleinsäurefragment wurde folgendermaßen isoliert:
Ein haploider Ustilago maydis -Stamm FBI (al bl) (Banuett, F. and Herskowitz, I. (1989). Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proc. Acad. Sei. USA 86: 5878-5882), der die Endo- glucanase egll nicht exprimiert, wurde einer UV-Mutagenese unter¬ zogen. Die Durchmusterung der erhaltenen Mutanten nach konstitu¬ tiver egll-Expression mittels Screening auf Carboxymethylzeilu- loseplatten und anschließender Kongorotfärbung ergab eine Mutante mit der gesuchten Eigenschaft, d.h. filamentunabhängiger konsti¬ tutiver egll-Expression.
Die nähere Untersuchung der erhaltenen Mutante ergab, daß weitere, normalerweise differentiell exprimierte Gene in dieser Mutante konstitutiv exprimiert wurden. Zur näheren Charakterisie¬ rung des durch die Mutation betroffenen Gens wurde eine Komple- mentationsanalyse (wie in Beispiel 3 näher beschrieben) durchge¬ führt.
Die Analyse des Nukleinsäurefragmentes ergab, daß es sich dabei um ein regulatorisches Gen mit vermutlich reprimierenden Wirkung handelt. Dieses regulatorische Gen bzw. das dazugehörige Gen¬ produkt stellt somit einen möglichen spezifischen Wirkort für Fungizide dar. Es lassen sich in einem Testverfahren mögliche fungizide Verbindungen leicht auf Interaktion mit dem gefundenen Wirkort überprüfen, indem man einen haploiden Ustilago-Stamm, der keine Endoglucanase egll exprimiert, mit dem potentiellen Fungi¬ zid in Kontakt bringt und ermittelt, ob eine egll-Expression stattfindet. Im positiven Fall kann von einer Interaktion des Fungizids mit dem regulatorischen Genprodukt ausgegangen werden.
Ein solches Testverfahren läßt sich besonders einfach durch¬ führen, wenn man für das Screening auf egll-Expresssion Carboxy- methylcellulose-Platten verwendet, die mit Kongorot angefärbt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind homologe Nuklein¬ säurefragmente aus anderen Mikroorganismen, die ebenfalls in der Lage sind, eine konstitutiv exprimierende Ustilago maydis Mutante funktioneil zu komplementieren. Solche Nukleinsäurefragmente lassen sich leicht mit üblichen Methoden der Gentechnik wie Hybridisierung herstellen, indem man ausgehend von dem Ustilago- Nukleinsäurefragment als Probe entsprechende unter Standard- bedingungen hybridisierende Klone aus anderen Organismen isoliert und funktioneil überprüft.
Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen
a) ein Genprodukt des oben definierten Nukleinsäurefragments, das durch die in Figur IV dargestellte Aminosäuresequenz dar¬ gestellt ist (SEQ ID NO:2) und insbesondere von der Nuklein- säuresequenz nach Figur III durch den offenen Leserahmen be¬ ginnend mit dem ATG-Startcodon von Position 1847-1849 und endend mit dem TAG-Stopcodon in Position 8714-8716 codiert wird (SEQ ID NO: 1) ;
b) die Verwendung des Genproduktes wie in Figur IV dargestellt oder von daraus abgeleitete Teilsequenzen als Target für Fungizide.
Beispiel 1
UV-Mutation des Ustilago maydis Stammes FBI
Der Stamm wurde in YEPS Flüssigmedium (Tsukuda, T. , S., Fothe- ringham, S. and Holloman, W.K. (1988) . Isolation and characteri- zation of an autonomously replicating sequence from Ustilago maydis. Mol. Cell. Biol. 8: 3703-3709) angeimpft und bei 28°C geschüttelt. Die Kulturen wurden bei einer Zellzahl von 1 x IO6 bis 3 x IO6 abzentrifugiert und in der gleichen Menge H20 bidest resuspendiert. 1 ml dieser Zellsuspension wurde in einer Petri- schale mit UV behandelt. Die Bestrahlungszeiten wurden so gewählt, daß die Überlebensraten unter 1 % lagen. Anschließend wurden Aliquots der UV behandelten Zellsuspension ausplattiert.
Das Screening nach Mutanten erfolgte auf Carboxymethylcellulose- Platten (0,5 % Hefeextrakt, 0,4 % Bacto-Pentone, 0,4 % Saccha¬ rose, 2 % Carboxymethylcellulose, 1,5 Bitek-Agar) .
Die Kolonien aus der UV-Mutagenese wurden auf die Testplatten replikaplattiert, bzw. bei zu hohen Koloniedichten überpickt und bei 29°C inkubiert. Die Zellen werden dann zum Test auf egll
Expresssion von den Platten abgewaschen. Anschließend werden die Platten mit 1 % Kongorot 20 Minuten überschichtet und mit 1 M NaCI entfärbt. Die Expression von egll ist an einem hellen Hof erkennbar.
Beispiel 2
Charakterisierung der erhaltenen Mutante
Die Mutante wurde mit einem kompatiblen Wildtypstamm (FB2 a2b2, Banuett and Herskowitz, 1989) auf CM-Charcoal Platten (Holliday, R. (1974) . In: Handbook of Genetics, Vol 1, R.C. King, ed. (New York: Plenum Press), pp. 575-595) gekreuzt, um Mutationen im b-Locus auszuschließen. Dabei zeigte sich, daß die Mutante das gleiche Kreuzungsverhalten zeigt wie der Ausgangsstamm.
Es wurde RNA aus Flüssigkulturen der Mutante in YEPS präpariert (Schmitt, M.E., Brown, T.A. : and Trumpower, B.L. (1990) . A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acid Res. 18, 3091-3092) und Northern Analysen durchgeführt. Standard Methoden zum Blotten von RNA auf Nylon filtern (Pall) wurden angewendet (Sambrook J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) .
Als Sonde für die Northern Blots wurde ein Hindlll-Sacl-Fragment aus dem offenen Leserahmen des egll-Gens verwendet (Dissertation Florian Schauwecker "Isolierung und Charakterisierung einer fila- mentspezifischen exprimierten Cellulase aus Ustilago maydis", Freie Universität Berlin, 1995) .
Radioaktives Markieren von DNA mit 32P wurde mit Megaprime® label- ling kit (Amersham) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß egll in der Mutante exprimiert wird. Auch die Expression weiterer differentiell exprimierter Gene in der Mutante konnte nachgewie¬ sen werden.
Die erhaltene Mutante ist im haploiden Zustand nicht pathogen. Wenn man sie mit einem kompatiblen Wildtypstamm kreuzt, kommt es bei Infektion von Maispflanzen zu Tumorbildung und zur Bildung von Basidiosporen. Aus den Sporen einer solchen Kreuzung konnte ein nach Segregation entstandener kompatibler Stamm isoliert werden, der ebenfalls die Mutation trägt. Eine Kreuzung dieses Stammes mit der ursprünglich erhaltenen Mutante führt zwar zur Tumorbildung in der Pflanze, jedoch werden bei dieser Kreuzung keine Sporen mehr gebildet.
Ein solchermaßen hergestellter imitierter Ustilago Stamm kann beispielsweise dazu verwendet werden, um in Maispflanzen die Bildung von Tumoren (Gallen) zu induzieren, ohne daß es zu der schwarzen Verfärbung durch Sporen kommt.
Da die Gallen der Maispflanzen teilweise als Nahrungsmittel Verwendung finden, bietet die Infektion mit der beschriebenen Ustilago-Mutante gegenüber dem Wildtyp den Vorteil, daß die erhaltenen Gallen optisch ansprechender sind. Beispiel 3
Komplementation der Mutante mit einer Ustilago Cosmidbank
Die Mutante wurde mit einer Cosmidbank komplementiert, die aus genomischer DNA des diploiden Stammes FBD11 (ala2blb2) (Banuett and Herskowitz, 1989 s.o.) hergestellt worden war. Dazu wurden partiell geschnittene-Mbo-I-Fragmente in Bam HI-Schnittstellen des Cosmid-Vektors pUMcos kloniert. Bei pUMcos handelt es sich um einen modifizierten pScos 1 Vector (Stratagene; Wahl, G.M., Lewis, K.S., Ruiz, J.C., Rothenberg, B. Zhao, J. , Evans, G.A. (1987) Cosmid vectors for rapid genomic walking, restriction mapping, and gene transfer Proc Natl Acad Sei USA 84: 2160-2164) . In pScos wurde ein Hindlll - Smal Fragment des Neomycin Resistenzgens mit einem EcoRV - Smal Fragment, das Carboxin Resistenz in U. maydis vermittelt, ersetzt (in der Figur I mit cbxR gekennzeichnet) .
Das EcoRV - Smal Fragment stammt aus pCBX122 (Keon, J.P.R., White, G.A., Hargreaves, J.A. 1991) . Isolation, characterization and sequence of a gene conferring resistance to the systemic fungieide carboxin from the maize smut pathogen, Ustilago maydis. Curr. Genet. 19: 475-481).
Die Mutante wurde mit der Cosmidbank transformiert. Trans- formation von U. maydis nach Schulz, B., Banuett, F., Dahl, M. , Schlesinger, R. , Schäfer, W. , Martin, T., Herskowitz, I. and Kahmann, R. (1990) (The b alleles of U. maydis, whose combinations program pathogenic development, code for poly- peptides containing a homeodomain-related modif. Cell 60: 295-306) . Es wurden Pools von 98 Cosmiden transformiert.
Das Screening nach komplementierten Transformanden erfolgte auf Carboxymethylcellulose-Platten. Es konnte eine komplementierte Transformande identifiziert werden. Aus diesem Stamm wurde chromosomale DNA nach Hoffman, S.S. and Winston, F. (1987) (A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases auto- nomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene 57: 267-272) aus YEPS Flüssigkultur isoliert. 1 μg DNA wurde mit Sall geschnitten und in einem Volumen von 20 μl religiert. Der Ligati- onsansatz wurde in E. coli DH5a transformiert. Die Transformation wurde mit einer Biorad Elektroporations Einheit nach dem Proto¬ koll des Herstellers durchgeführt. Die Plasmide wurden aus den Transformanden durch Boiling Minipräp isoliert (Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) . Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual (Cold Spring Habor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Durch Verdau mit EcoRI und Sall wurde ein Fragment aus dem Rescueplasmid gewonnen, das aus U. maydis DNA besteht. Dieses wurde radioaktiv markiert und zum Screenen der Einzelfilter des Cosmidpools, mit dem komplementiert werden konnte, verwendet. Die Hydridisierung wurde bei 65°C durchgeführt.
Das Cosmid pUMcos7-H2 (s. Figur I), das auf diese Weise identi¬ fiziert worden war, wurde erneut in die Mutante transformiert. Dadurch konnte die Komplementation bestätigt werden.
Beispiel 4
Charakterisierung des komplementierenden Nukleinsäurefragmentes
Es wurde eine Restiktionsanalyse des Cosmids durchgeführt. Das Cosmid wurde mit BamHI verdaut, die Fragmente auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt und isoliert. Die Fragmente wurden in den integrativen Vector pHLN4 kloniert. pHLN4 stammt von pHLl (Wang, J., Holden, D.W., and Leong, S.A. (1988). Gene transfer system for the phythopathogenic fungus U. maydis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 865-869) ab. pHLl ist ein pUC12 Derivat, welches das
Hydromycin Resistenzgen unter der Kontrolle von U. maydis hsp 70 regulatorisehen Sequenzen trägt.
In der Sacl site im Polylinker von pHLl wurden Notl Linker kloniert. pHLN ist beschrieben bei: Schulz, B., Banuett, F., Dahl, M. , Schlesinger, R. Schäfer, W. , Martin, T., Herskowitz, I., and Kahmann; R. (1990) . The b alleles of U. maydis, whose combinations program pathogenic development, code for polypep- tides containing a homeodomain-related motif. Cell 60, 295-306.
Diese Plasmide wurden in die Mutante transformiert und die Trans- formanden auf Komplementation getestet. Dabei konnte ein 25 kb Xbal-Fragment identifiziert werden, das die Mutation komplemen¬ tiert. Das 25 kb Xbal-Fragment ist in der Figur I eingezeichnet und befindet sich zwischen den Positionen Xbal (32600) und Xbal (14000) .
Auf dem gleichen Weg wurde ein ebenfalls komplementierendes etwa 10 kb großes Bglll-Fragment gefunden, das in der Figur I zwischen den Positionen Bglll (15000) und Bglll (5100) dargestellt ist.
Wie in der Figur I dargestellt, besitzen beide komplementierende Fragmente einen überlappenden Bereich.
Dadurch konnte der komplementierende Bereich auf ein 8,9 kb großes Xbal-Bglll-Fragment eingegrenzt werden. Dieses Fragment enthält die für die Komplementation notwendige genetische Infor- mation. In der Figur I ist es zwischen den Positionen Xbal (14000) und Bglll (5100) dargestellt. Auf dem Fragment befindet sich außerdem eine BamHI-Stelle bei Pos. 10600 und eine Clal- Stelle bei Position 6900.
Beispiel 5
Bestimmung der Nukleinsäuresequenz des komplementierenden Xbal-
Bglll-Nukleinsäurefragments
Aus dem Xbal-Bglll-Fragment wurden ein 5,4 kb Bglll-BamHII-Frag¬ ment und ein 3,4 kb BamHI-Xbal-Fragment gewonnen. Beide Fragmente wurden in den Blueskript-Vektor (Stratagene) kloniert. Die Nu¬ kleinsäuresequenz des 5,4 kb Bglll-BamHI-Inserts des Klons pl709951#3 (Figur II) und des 3,4 kb BamHI-Xbal-Inserts des Klons pl710951#9 (Figur II) wurden durch DNA-Sequenzierung bestimmt (s. Figur III) . Zusätzlich wurde aus dem Cosmid pUMcos 7-H2 ein 11 kb Bglll-Fragment isoliert, das den Bereich des Xbal-Bglll-Fragments beinhaltet und in den pSL 1180-Plasmidvektor (Pharmacia) klo¬ niert. Der Klon wurde als p2410951#l bezeichnet (Figur II) . Durch DNA-Sequenzierung des Klons p2410951#l wurde die Sequenz des Bglll-Xba-I-Fragments bestätigt (Figur III). Durch Analyse der offenen Leserahmen wurde ein Genprodukt mit der in Figur IV ange¬ gebenen Aminosäuresequenz identifiziert. Die entsprechende DNA- Sequenz ist in SEQ ID NO:l, die Aminosäuresequenz des Genprodukts in SEQ IDNO:2 dargestellt.
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: Carl-Bosch-Straße 38
(C) ORT: Ludwigshafen
(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-67056
(G) TELEPHON: 0621/6048526 (H) TELEFAX: 0621/6043123 (I) TELEX: 1762175170
(ii) ANMELDETITEL: Regulatorisches Gen aus Ustilago maydis
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 8931 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Ustilago maydis
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR
(B) LAGE: 1..1846
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1847..8716 ( ix ) MERKMALE :
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 3'UTR
(B) LAGE: 8717..8931
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
AGATCTACAC TCTCTTTACG ACCGTCTGTC AGTTAATGTT TCAAAGCCGA GCATCGTCCT 60
GGATGCAGCT TGCTTTGCAG GCGTTAAAAC CACATTTTTT CGATTTCGCT CTTCTCTATC 120
AGTTGTTTCT TGATTATATC TCGTGATACG TTGCATACCT TGTACACGGG TCGCAATTTA 180
AGAGTTTCGT ATTCATGACA CTCGTGACTG ATCTTGGCTT GCTCAAAGTT GGTCGTGCTC 240
TGAAGACAGT GGCGATGCTA ACAGACGATG CGGTATACAG GGAGACAAGG GTATGTCACG 300
GTCGCTGGTT CGGAGATGTG TGAGCAGCAG GTGTGGACGC TAGCGATTCA GAGGTCGAAT 360
GAGCTCCTTC GCAACAAGGC GAGGCAAAGC GTCCGTCAAG GCAGGGCATG CTGATGAGGA 420
GCTGCCACGC GAGTCGCGCC GACAGCGAAG CACACATGAC GAGTCCCACG ACACGGTCGT 480
GGCCCGACGT CTACCACCGG TGCTGGTGTG TGCTGTAGGA TGATTTGGAC AGGGAGAGGA 540
AGGCACACGA CACGCGATCA GCTTGATAGC GAGCAACCCT TGTTCTGCTT GTTTTTGAAC 600
AGAGGGTGCT GTCATACGAG CGGCCAGACG CTGGCAATGG CCCACCGAAT GTGATGGAGG 660
AAAGCGCCAT GGCAAGGCGC AGGCTCAGGA ACGATAAGAT GGTTTGATTC CCTATTCGAC 720
ACACGAGTTG GCTATTAGTC GTGAGCGTGA GTCGTGAGTG TGACTGGCGA AACACGACAG 780
GTGCAGAGCT CGGCAACGAA CTTTCGACTT GCGCCCACTT TACGCGGAGG AGCCGGGCGA 840
GAGACAGCGA GGATGCTTGA AAAATAAAAC AGGACAGGAA TAACAACAAG TCGGCCATGC 900
TTGACAGTCG GTGCATTTGC AGTGTGTCTA ATTCTGCGAG GCATCACGCC TCCTGCCTTT 960
TTTCCTCCAA ACCCACCCTT CCTGGCAGAA AGTGAGGCAG CAGAGAGAGG AAAAGAGAGA 1020
AAGAGTCACG AGTGGGTGCC GCAATCACGA ATATATTAAT AATTCGAAAC CAAAACGCTT 1080
TACAAGCATC AAGCACGAAG CTTAGGCCCT GCGTAATTCA CGATTCACGA TTCACGATTC 1140
ACGATTGTGA CTTGGAGCCA AGGCTGTGGC CTCTGTCGCC TAACCCTTTT TTGACAGAGG 1200
CTTCTGAGCT TGAGCGTGGG TGCCACAAAC TTGTCACGGC CTCCGAAATC AGAGGTCCTC 1260
CTCATCATCT CAATTTTTTT TTGTGTTGGC GTGTCGTTCG CGCTAGCATC AAGACCATCA 1320
CCACCATATC GATCACCGCG GCTGTGCTGC TGTCCGCCGC CCTGTCAGTA CTGCTCCACG 1380
GTTCTCCTCA ATCTCCGCCT CGCTGTTGTG TTTGTCTTCC ACGGTGCTTC GCGCTCAGCT 1440
GCTGTGCTTT GATCACACAT CGGGGTCGAT TCCTAACTTG TGTAAGCGCC TTATCCCACC 1500
CAATTTGCCA AGTCGATACC GCCGTTCTAT CGCGGCTCTG GCCGGCGATT CTTGGCACTT 1560
TCCCAACAGT TGCCTTGTCG GACTAGCCGC AATCTTGGCT CACAACGTGC AAACTATCTG 1620
TCGAGATTCA TGACGGCGCT TCCCTAGTCA GGATCGGAAA ACGCCGCTCT CTCTGTGCCA 1680
CATCGATTTC GCCTGCCACC AAAGGTGCAC CTCTCTGTCT CTCCTGAATA CGTCCGCCGC 1740
TCATCTCAGC ATCCTTCTCC TCCGTTCTAT CTCCCTGCGC CTGCTGTTGT TCATCGATAT 1800
CCGCCAGCAT ACGAGACACA CGTTGGCAGC TCCTCGATCT CTAACC ATG ACA TCC 1855
Met Thr Ser 1
ACC AAG ACA AGC TCT CAG CCC TCA GGC TCG AGT GAC ACT CCT CAA CGC 1903 Thr Lys Thr Ser Ser Gin Pro Ser Gly Ser Ser Asp Thr Pro Gin Arg
5 10 15
ATC GTC GTC AAA TCC GTC AAT GGT CAC GAG CCC ATC AAA GTA GAG CCT 1951 Ile Val Val Lys Ser Val Asn Gly His Glu Pro Ile Lys Val Glu Pro 20 25 30 35
GTC TCC TCG TCC AGC GCA TCA CTG CTT CAC TCC ACA CCG CCC CGG CTC 1999 Val Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Leu His Ser Thr Pro Pro Arg Leu
40 45 50 GCC ACA CCG CTT TCC TCA CCC ACC AAA TCA GCC GCC CCC TCG AGT CCA 2047 Ala Thr Pro Leu Ser Ser Pro Thr Lys Ser Ala Ala Pro Ser Ser Pro
55 60 65
TCC AAG TCT CCA GGA AGG GCG CGA CGT GTA GAT CCT GTC TTG ATC TCG 2095 Ser Lys Ser Pro Gly Arg Ala Arg Arg Val Asp Pro Val Leu Ile Ser
70 75 80
TCT CGC GAG TTT GGC CCT AGT GCT GGA GGA GAC AGC GAT GAC GAT GAG 2143 Ser Arg Glu Phe Gly Pro Ser Ala Gly Gly Asp Ser Asp Asp Asp Glu
85 90 95
TTC AAC AAT GGC GAG CCC GAA GTT TAC AAG GGC GTC AAC ACC ACT GCC 2191 Phe Asn Asn Gly Glu Pro Glu Val Tyr Lys Gly Val Asn Thr Thr Ala 100 105 110 115
AAA AGG CTC AGC CGC AAG AGC AAG GCG GAT GCT ATG TTC GCC ATG TCC 2239 Lys Arg Leu Ser Arg Lys Ser Lys Ala Asp Ala Met Phe Ala Met Ser
120 125 130
GTC AAA GAG TCT TCT CCC GTC CAT GCG CAC GCA ACA TCC ACA TCT ACC 2287 Val Lys Glu Ser Ser Pro Val His Ala His Ala Thr Ser Thr Ser Thr
135 140 145
ACT TCA AAT GCT CCC ACT GCC ATC CCC GGC AAC CCT GCC TCC CAC CCA 2335 Thr Ser Asn Ala Pro Thr Ala Ile Pro Gly Asn Pro Ala Ser His Pro
150 155 160
GCA CGC AAA ATG TTC CAG CAC CAG CCA TTT CCG CCT CTG GTT TTC GAT 2383 Ala Arg Lys Met Phe Gin His Gin Pro Phe Pro Pro Leu Val Phe Asp
165 170 175
ACA GAT CCC ATC TCA TCC ATC TCG CAG TCT CCA TCC GCT TCC AAT GCG 2431 Thr Asp Pro Ile Ser Ser Ile Ser Gin Ser Pro Ser Ala Ser Asn Ala 180 185 190 195
GCT CAG CCC CCC ATT CCA ACT CAT GCC AGC ACG CCA CGC TGC CCT CCG 2479 Ala Gin Pro Pro Ile Pro Thr His Ala Ser Thr Pro Arg Cys Pro Pro
200 205 210
CCC AGG CTC CGT CCC AGA CTC TTT GAG CTC GAC GAA GCG CCC ACT TTC 2527 Pro Arg Leu Arg Pro Arg Leu Phe Glu Leu Asp Glu Ala Pro Thr Phe
215 220 225
TAT CCA TCG CCT GAA GAG TTC TCT GAT CCA ATG AAG TAC ATC GCC TGG 2575 Tyr Pro Ser Pro Glu Glu Phe Ser Asp Pro Met Lys Tyr Ile Ala Trp
230 235 240
ATC GCC GAC CCA CAA GGT GGT AAT GGC AAG GCA TAC GGC ATC GTC AAG 2623 Ile Ala Asp Pro Gin Gly Gly Asn Gly Lys Ala Tyr Gly Ile Val Lys
245 250 255
ATC GTT CCA CCT CAG GGC TGG AAC CCG GAA TGC GTG CTT GAT GAG CAG 2671 Ile Val Pro Pro Gin Gly Trp Asn Pro Glu Cys Val Leu Asp Glu Gin 260 265 270 275
ACC TTC CGC TTT CGC ACC CGC GTT CAG CTC CTC AAC TCG CTC AGT GCA 2719 Thr Phe Arg Phe Arg Thr Arg Val Gin Leu Leu Asn Ser Leu Ser Ala
280 285 290
GAT GCT CGG GCC TCT CAG AAC TAC CAG GAG CAA CTG CAA AAG TTC CAC 2767 Asp Ala Arg Ala Ser Gin Asn Tyr Gin Glu Gin Leu Gin Lys Phe His 295 300 305 GCG CAG CAG GGT CGC AAG CGT GTC TCG GTC CCC GTC ATT GAC GGT CGT 2815 Ala Gin Gin Gly Arg Lys Arg Val Ser Val Pro Val Ile Asp Gly Arg
310 315 320
TCC GTC GAT TTG TAC CAG CTC AAA CTA GTC ATC TCA AGT CTG GGT GGC 2863 Ser Val Asp Leu Tyr Gin Leu Lys Leu Val Ile Ser Ser Leu Gly Gly
325 330 335
TAC GAT GCT GTT TGC CGT GCT CGC AAG TGG TCC GAT GCT ACG CGT AAG 2911 Tyr Asp Ala Val Cys Arg Ala Arg Lys Trp Ser Asp Ala Thr Arg Lys 340 345 350 355
ATC GGC TAC AGT GAC AAG GAA AGC GGT CAG CTC TCG ACG CAA GTC AAA 2959 Ile Gly Tyr Ser Asp Lys Glu Ser Gly Gin Leu Ser Thr Gin Val Lys
360 365 370
GCT GCC TAC ACC CGC ATC ATC TTG CCC TTT GAA GAG TTT CTT GCA AAA 3007 Ala Ala Tyr Thr Arg Ile Ile Leu Pro Phe Glu Glu Phe Leu Ala Lys
375 380 385
GCA AAA GAG CAG TCT CGT CCT AAC GGA TCA TCG GTC AGC CCA CAG CTC 3055 Ala Lys Glu Gin Ser Arg Pro Asn Gly Ser Ser Val Ser Pro Gin Leu
390 395 400
GCG CAG AGT GCC ATC ATG GGC GCC ACC GCC AGC ACG GAC ACC CAA GAG 3103 Ala Gin Ser Ala Ile Met Gly Ala Thr Ala Ser Thr Asp Thr Gin Glu
405 410 415
AAT GGC GTT AAG CAC CCC TCC ATG TCG CCA AGC CTC GAC GCC GCC CCC 3151 Asn Gly Val Lys His Pro Ser Met Ser Pro Ser Leu Asp Ala Ala Pro 420 425 430 435
AGT GGA GAT GCA GGT GAA CAC TTC AAA ACA CCC GAG CCT TTC ACT GCT 3199 Ser Gly Asp Ala Gly Glu His Phe Lys Thr Pro Glu Pro Phe Thr Ala
440 445 450
GCT GGC GCT GCT GAG GCG CTC GCA AAT GCA ACT CCC GTC CTC GAG ACA 3247 Ala Gly Ala Ala Glu Ala Leu Ala Asn Ala Thr Pro Val Leu Glu Thr
455 460 465
CCC ACT CAA AGC CCT TCG ACT GTC GCA AGC ACA CGT CGC AGT GCG CGC 3295 Pro Thr Gin Ser Pro Ser Thr Val Ala Ser Thr Arg Arg Ser Ala Arg
470 475 480
AAG AGA TCG GAA GCA ACC AGC ACA CCT GCT TCG TCG TCG CGT AAC TCT 3343 Lys Arg Ser Glu Ala Thr Ser Thr Pro Ala Ser Ser Ser Arg Asn Ser
485 490 495
TTG CAG CTC ACC TCC ACA CCA ATG ACA CCT TTG ATC TCC AGA CGC AGA 3391 Leu Gin Leu Thr Ser Thr Pro Met Thr Pro Leu Ile Ser Arg Arg Arg 500 505 510 515
AAG GGC GTT AGC CCT CAC CTT GAA GCA GAT TCT TAC CTG CGC GCT CAA 3439 Lys Gly Val Ser Pro His Leu Glu Ala Asp Ser Tyr Leu Arg Ala Gin
520 525 530
GCT GGC AAT CAG GCG CAA GAA GAG CAA ATG TGC GAA ATC TGC CTC CGA 3487 Ala Gly Asn Gin Ala Gin Glu Glu Gin Met Cys Glu Ile Cys Leu Arg
535 540 545
GGC GAG GAT GGT CCC AAC ATG TTG CTC TGC GAC GAG TGC AAT CGT GGC 3535 Gly Glu Asp Gly Pro Asn Met Leu Leu Cys Asp Glu Cys Asn Arg Gly 550 555 560 TAC CAC ATG TAC TGT CTC CAA CCC GCG CTC ACT TCG ATC CCC AAA TCG 3583 Tyr His Met Tyr Cys Leu Gin Pro Ala Leu Thr Ser Ile Pro Lys Ser
565 570 575
CAG TGG TTC TGC CCG CCT TGT CTT GTC GGC ACC GGT CAT GAT TTT GGT 3631 Gin Trp Phe Cys Pro Pro Cys Leu Val Gly Thr Gly His Asp Phe Gly 580 585 590 595
TTT GAC GAT GGT GAA ACA CAC AGC CTC TAC ACT TTT TGG CAA CGT GCT 3679 Phe Asp Asp Gly Glu Thr His Ser Leu Tyr Thr Phe Trp Gin Arg Ala
600 605 610
GAG GCA TTC AAG CGC GAT TGG TGG TCC AAA CAT CAA GAT CAC CTC TGG 3727 Glu Ala Phe Lys Arg Asp Trp Trp Ser Lys His Gin Asp His Leu Trp
615 620 625
AGG CCC GAC TCG GAA GGC CTG GCG ACA TCT GAC TAC GAT CCG CCA ACG 3775 Arg Pro Asp Ser Glu Gly Leu Ala Thr Ser Asp Tyr Asp Pro Pro Thr
630 635 640
AAT GGT CTG GCT CGC CGT GTC CAC GGA ACC GAC CTG GTT GTG TCA GAG 3823 Asn Gly Leu Ala Arg Arg Val His Gly Thr Asp Leu Val Val Ser Glu
645 650 655
GAC GAC GTA GAG CGC GAA TTT TGG AGA CTA GTT CAT AGC CAG AAG GAA 3871 Asp Asp Val Glu Arg Glu Phe Trp Arg Leu Val His Ser Gin Lys Glu 660 665 670 675
GAA GTA GAA GTC GAG TAT GGT GCT GAC GTT CAC TCT ACT ACG CAC GGC 3919 Glu Val Glu Val Glu Tyr Gly Ala Asp Val His Ser Thr Thr His Gly
680 685 690
AGT GCC TTG CCC ACC CAA GAG ACT CAT CCC TTG AGT CTG TAT TCG CGC 3967 Ser Ala Leu Pro Thr Gin Glu Thr His Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Arg
695 700 705
GAC AAG TGG AAC CTC AAT AAC CTA CCC ATC CTG CCT GGC TCG CTG CTC 4015 Asp Lys Trp Asn Leu Asn Asn Leu Pro Ile Leu Pro Gly Ser Leu Leu
710 715 720
CAG TAC ATC AAG TCC GAC ATC TCG GGC ATG ACC GTC CCC TGG ATC TAT 4063 Gin Tyr Ile Lys Ser Asp Ile Ser Gly Met Thr Val Pro Trp Ile Tyr
725 730 735
GTC GGA ATG ATT TTC TCC ACC TTC TGC TGG CAC AAC GAG GAT CAC TAC 4111 Val Gly Met Ile Phe Ser Thr Phe Cys Trp His Asn Glu Asp His Tyr 740 745 750 755
ACT TAC TCG ATC AAC TAT CAG CAT TGG GGT GAG ACT AAG ACA TGG TAC 4159 Thr Tyr Ser Ile Asn Tyr Gin His Trp Gly Glu Thr Lys Thr Trp Tyr
760 765 770
GGC ATT CCG GGT GAA GAT GCC GAA AAG TTC GAG AAT GCC ATG CGC AAG 4207 Gly Ile Pro Gly Glu Asp Ala Glu Lys Phe Glu Asn Ala Met Arg Lys
775 780 785
GCG GCG CCC GAT TTA TTC GAG ACG CTG CCG GAC CTG CTC TTT CAT CTC 4255 Ala Ala Pro Asp Leu Phe Glu Thr Leu Pro Asp Leu Leu Phe His Leu
790 795 800
ACC ACC ATG ATG AGT CCC GAG AAG CTC AAG AAG GAA GGC GTC CGC GTT 4303 Thr Thr Met Met Ser Pro Glu Lys Leu Lys Lys Glu Gly Val Arg Val
805 810 815 GTG GCA TGT GAC CAA CGT GCC AAC GAG TTT GTC GTC ACT TTT CCC AAG 4351
Val Ala Cys Asp Gin Arg Ala Asn Glu Phe Val Val Thr Phe Pro Lys
820 825 830 835
GCC TAC CAC AGC GGC TTT AAC CAC GGT CTC AAC CTG AAT GAA GCT GTC 4399
Ala Tyr His Ser Gly Phe Asn His Gly Leu Asn Leu Asn Glu Ala Val
840 845 850
AAC TTT GCT CTG CCC GAC TGG ATC TTT GAC GAT CTC GAA TCT GTT CGG 4447 Asn Phe Ala Leu Pro Asp Trp Ile Phe Asp Asp Leu Glu Ser Val Arg
855 860 865
AGG TAC CAG CGC TTC CGA AAG CCT GCC GTA TTC TCA CAC GAC CAG CTG 4495 Arg Tyr Gin Arg Phe Arg Lys Pro Ala Val Phe Ser His Asp Gin Leu
870 875 880
CTC ATT ACC GTC TCG CAG CAG AGT CAG ACC ATC GAA ACA GCC GTG TGG 4543 Leu Ile Thr Val Ser Gin Gin Ser Gin Thr Ile Glu Thr Ala Val Trp
885 890 895
CTT GAG GCC GCC ATG CAA GAG ATG GTT GAT CGC GAG ATC GCA AAG CGC 4591 Leu Glu Ala Ala Met Gin Glu Met Val Asp Arg Glu Ile Ala Lys Arg 900 905 910 915
AAC GCA CTT CGT GAG ATC ATT CCG GAT CTC AAA GAA GAG GTA TAC GAC 4639 Asn Ala Leu Arg Glu Ile Ile Pro Asp Leu Lys Glu Glu Val Tyr Asp
920 925 930
GAA GAT GTA GCC GAG AGC CAC TAC ATT TGC AGC CAC TGC ACT CTC TTT 4687 Glu Asp Val Ala Glu Ser His Tyr Ile Cys Ser His Cys Thr Leu Phe
935 940 945
TCC TAC CTC GGC CAG TTG ACA AGT CCA AAG ACC GAT GGT GTC GCT TGT 4735 Ser Tyr Leu Gly Gin Leu Thr Ser Pro Lys Thr Asp Gly Val Ala Cys
950 955 960
CTC GAT CAC GGC TTC GAG GTG TGC AAC GCC GAT GCT CCC GTC AAG TGG 4783 Leu Asp His Gly Phe Glu Val Cys Asn Ala Asp Ala Pro Val Lys Trp
965 970 975
ACG TTG AAG CTT CGC TTC TCG GAC GAT CAG CTT CGC TCC ATT CTA GCG 4831 Thr Leu Lys Leu Arg Phe Ser Asp Asp Gin Leu Arg Ser Ile Leu Ala 980 985 990 995
AAG GTC TGT GAG CGG GCA GCA GTG CCG CGC AAC TGG ATT CAG CGC CTC 4879 Lys Val Cys Glu Arg Ala Ala Val Pro Arg Asn Trp Ile Gin Arg Leu
1000 1005 1010
AAG AAG ACC CTT GCT CTT GGC CCG ACT CCA CCT CTC AAG ACG CTG AGG 4927 Lys Lys Thr Leu Ala Leu Gly Pro Thr Pro Pro Leu Lys Thr Leu Arg
1015 1020 1025
TCG TTG CTG CAC GAA GGC GAA AAG ATT GCC TTC TCG CTA GAG CCG CTC 4975 Ser Leu Leu His Glu Gly Glu Lys Ile Ala Phe Ser Leu Glu Pro Leu
1030 1035 1040
GAG GAT CTC AGG ACC TTT GTC ACC TGC GCC AAC TCG TGG GTG GAG CGG 5023 Glu Asp Leu Arg Thr Phe Val Thr Cys Ala Asn Ser Trp Val Glu Arg
1045 1050 1055
GCC AAT GTT TTC CTG ATG CGC AAG TTG CAT AAG AGA CGC GGC GAG CCT 5071 Ala Asn Val Phe Leu Met Arg Lys Leu His Lys Arg Arg Gly Glu Pro 1060 1065 1070 1075 GCA GCT GCT CCT GCT GGG AGG CGC CGA CGA TCC AAG GGC GGT GCT GTG 5119 Ala Ala Ala Pro Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Lys Gly Gly Ala Val
1080 1085 1090
GCT GAC GAT AGC TTC ACT AGA AGG CAA AGC TTG GAC GCT TCG GTC GAC 5167 Ala Asp Asp Ser Phe Thr Arg Arg Gin Ser Leu Asp Ala Ser Val Asp
1095 1100 1105
GAT GCC GAA TCC ACT TCC GAT CGA AGT CCC GAA GCC TTG TAT GCG TTG 5215 Asp Ala Glu Ser Thr Ser Asp Arg Ser Pro Glu Ala Leu Tyr Ala Leu
1110 1115 1120
ATC GGA GAG CTC GAC AGC CTT CAC TTT GAC GCG CCT GAG ATT GCA TCG 5263 Ile Gly Glu Leu Asp Ser Leu His Phe Asp Ala Pro Glu Ile Ala Ser
1125 1130 1135
CTT CGC ACT ATG GCG CAA GAG CTC GAG GAG TTC ATT GGC CGG TGT GAC 5311 Leu Arg Thr Met Ala Gin Glu Leu Glu Glu Phe Ile Gly Arg Cys Asp 1140 1145 1150 1155
GAG GTC CTA CAA CAG GGT GAC GAG ACT AAT CTC AAA GAC TGT GAA AGC 5359 Glu Val Leu Gin Gin Gly Asp Glu Thr Asn Leu Lys Asp Cys Glu Ser
1160 1165 1170
ATC CTG ACG CTC GGC AGC TCT CTC AAT GTG GAC GCG CCT CAG ATC AAA 5407 Ile Leu Thr Leu Gly Ser Ser Leu Asn Val Asp Ala Pro Gin Ile Lys
1175 1180 1185
GAG CTC TCC GAC TAT GTC GAG CGT CGC AAG TGG ATC CAG GAA GTC ACA 5455 Glu Leu Ser Asp Tyr Val Glu Arg Arg Lys Trp Ile Gin Glu Val Thr
1190 1195 1200
GAA TCG TTC GAC ACA TAT CTC TAT TAC CAC GAA GTT GCG GAA CTG TTG 5503 Glu Ser Phe Asp Thr Tyr Leu Tyr Tyr His Glu Val Ala Glu Leu Leu
1205 1210 1215
GAT CGC GCC GAC AGC TGT GGT CTA CAA GAT CAC GAG CTG CGC AAG AAT 5551 Asp Arg Ala Asp Ser Cys Gly Leu Gin Asp His Glu Leu Arg Lys Asn 1220 1225 1230 1235
CTT GAG CAG AGA CTC GAA GCC GGC CAA CGC TGG ACT GAA AGT GCA AGG 5599 Leu Glu Gin Arg Leu Glu Ala Gly Gin Arg Trp Thr Glu Ser Ala Arg
1240 1245 1250
GAA GCG CTG GGA GGC TCT CAG CCT ATA ACA ATC GAC GTG CTT CAA GAG 5647 Glu Ala Leu Gly Gly Ser Gin Pro Ile Thr Ile Asp Val Leu Gin Glu
1255 1260 1265
CTT TCC GAG TCG TCA GCT GAT GTT CCT GTT GTG CTC GAA GTG GCT CAG 5695 Leu Ser Glu Ser Ser Ala Asp Val Pro Val Val Leu Glu Val Ala Gin
1270 1275 1280
GAT GTT ACC GAC GCT CTC TCC AAG GCC AAA GAG CTG CAA AAG ACC ATC 5743 Asp Val Thr Asp Ala Leu Ser Lys Ala Lys Glu Leu Gin Lys Thr Ile
1285 1290 1295
CAG ACA CTG TAC AAG GCA TTA CAG ACG GGA GCT CAC GGC CAT TCT GCA 5791 Gin Thr Leu Tyr Lys Ala Leu Gin Thr Gly Ala His Gly His Ser Ala 1300 1305 1310 1315
GCC GAT GCG GAT GGT GAC CTA TCA ATG ATC TCG ATC TCG GAA AAT GGC 5839 Ala Asp Ala Asp Gly Asp Leu Ser Met Ile Ser Ile Ser Glu Asn Gly 1320 1325 1330 GAA GCT GCC GAG CGT GTG GCT CTG CTT CCT GAC GCT CGT CGC GTG CTT 5887 Glu Ala Ala Glu Arg Val Ala Leu Leu Pro Asp Ala Arg Arg Val Leu
1335 1340 1345
CGT GCC GCC AGG TCC AAC AAA CTG GAG CTT GAG CAC GCG CAA GAC ATT 5935 Arg Ala Ala Arg Ser Asn Lys Leu Glu Leu Glu His Ala Gin Asp Ile
1350 1355 1360
GAA AAG GCC GTC CAA GTC TAC GAT GCA TGG CGA GCT GCG TTC AAC CAG 5983 Glu Lys Ala Val Gin Val Tyr Asp Ala Trp Arg Ala Ala Phe Asn Gin
1365 1370 1375
ATC ATG CAG ACT ATT GCC GGT GGA TCT CGC CGC CTC ACG GAC GCA GAC 6031 Ile Met Gin Thr Ile Ala Gly Gly Ser Arg Arg Leu Thr Asp Ala Asp 1380 1385 1390 1395
CGC GAC GAG GAG CTC GAC AAG CTG GTG GAG CGA GTC GAG GAT GCC ACC 6079 Arg Asp Glu Glu Leu Asp Lys Leu Val Glu Arg Val Glu Asp Ala Thr
1400 1405 1410
GAC CCT GCC. GAC GAC CAG AAC AAA CCC AAT GCA CGC AAC TGT ATC TGC 6127 Asp Pro Ala Asp Asp Gin Asn Lys Pro Asn Ala Arg Asn Cys Ile Cys
1415 1420 1425
AGG AGC TCA ATG CCC ATC GCC ATT CCT TCG TCG TCA GGG GCA GAA TGC 6175 Arg Ser Ser Met Pro Ile Ala Ile Pro Ser Ser Ser Gly Ala Glu Cys
1430 1435 1440
TCT CGC TGT CGC GTG CAG TAC CAT CTA TCG TGC ATC AAG GTG CGC TCC 6223 Ser Arg Cys Arg Val Gin Tyr His Leu Ser Cys Ile Lys Val Arg Ser
1445 1450 1455
TCT GAG GTA TCA CGC GCC GAG GGC GGC TGG GTT TGT CCA TTC TGC CCG 6271 Ser Glu Val Ser Arg Ala Glu Gly Gly Trp Val Cys Pro Phe Cys Pro 1460 1465 1470 1475
TGG TAC GGG AGC GCT CCG TTC CTC AAA ATG CGC AAG GCG ATC AGC ATT 6319 Trp Tyr Gly Ser Ala Pro Phe Leu Lys Met Arg Lys Ala Ile Ser Ile
1480 1485 1490
GCT GAC CTT TCG AAG CTT GTA TAC GAT CAA GAT CAT CGT CGA GAC CAG 6367 Ala Asp Leu Ser Lys Leu Val Tyr Asp Gin Asp His Arg Arg Asp Gin
1495 1500 1505
TTC AAA TTC CTC CCT CTG GAA TGG GAC GCC ATC GAG GAA GTG GTT GCC 6415 Phe Lys Phe Leu Pro Leu Glu Trp Asp Ala Ile Glu Glu Val Val Ala
1510 1515 1520
AAG GCA AAG CGA TTC GAG ACG GCC GCT AAG CGA ATG ATC AAA ACA CTT 6463 Lys Ala Lys Arg Phe Glu Thr Ala Ala Lys Arg Met Ile Lys Thr Leu
1525 1530 1535
TCG CTG ATG CGC AGA GAT CAA AAG CAG GTC ATC CTT GCC CAC TGG CTA 6511 Ser Leu Met Arg Arg Asp Gin Lys Gin Val Ile Leu Ala His Trp Leu 1540 1545 1550 1555
CGT CGG TCC ATT GGC TGC CCC GTC GAT GTC TTG GGA CCA GAG AAA GTC 6559 Arg Arg Ser Ile Gly Cys Pro Val Asp Val Leu Gly Pro Glu Lys Val
1560 1565 1570
AAC ATG CTT GAC CTC ATC AGC GAA AAT TTG CTC GCC CTT GGT TCA CAG 6607 Asn Met Leu Asp Leu Ile Ser Glu Asn Leu Leu Ala Leu Gly Ser Gin 1575 1580 1585 16
CAG GGT GAT GCT GCA CCC ATG GCG CCT GTT GAG CGT ATC AAG GCG TCG 6655 Gin Gly Asp Ala Ala Pro Met Ala Pro Val Glu Arg Ile Lys Ala Ser
1590 1595 1600
ACT CCA GCG CGA TCC GAC GAG CGC ACG GAA GAA ACA ACG CCC TTG CCT 6703 Thr Pro Ala Arg Ser Asp Glu Arg Thr Glu Glu Thr Thr Pro Leu Pro
1605 1610 1615
CGC TCG TCT CGC GTT CCA GCC CCT GCC GAT CGC GAC TCA GGA TCT CCA 6751 Arg Ser Ser Arg Val Pro Ala Pro Ala Asp Arg Asp Ser Gly Ser Pro 1620 1625 1630 1635
GCT GTC CGA GAC GAT CGC AAG CGC AAA GCC AAG AGA GGC AAG CGT GCC 6799 Ala Val Arg Asp Asp Arg Lys Arg Lys Ala Lys Arg Gly Lys Arg Ala
1640 1645 1650
AAG CTC GTC TTC CAG GAG GAG ATT GGT ATC GGT GCT TAC CGC GAT CGT 6847 Lys Leu Val Phe Gin Glu Glu Ile Gly Ile Gly Ala Tyr Arg Asp Arg
1655 1660 1665
CAG CCC ATC TAC TGT CTG TGC CAT GAG CCA GAG AGC GGT CGC ATG ATT 6895 Gin Pro Ile Tyr Cys Leu Cys His Glu Pro Glu Ser Gly Arg Met Ile
1670 1675 1680
GCT TGT GAC AAG TGC ATG CTC TGG TTT CAT ACC AAT TGT GTT CGC CTC 6943 Ala Cys Asp Lys Cys Met Leu Trp Phe His Thr Asn Cys Val Arg Leu
1685 1690 1695
GAT GAT CCG CCG AAT CTC GGA AAT GAG CCG TGG ATA TGT CCC ATG TGC 6991 Asp Asp Pro Pro Asn Leu Gly Asn Glu Pro Trp Ile Cys Pro Met Cys 1700 1705 1710 1715
TGC ATC AAG GCG GAG CGC AAG TAT CCT CAG GCC GAA GTC AGG GTC AAA 7039 Cys Ile Lys Ala Glu Arg Lys Tyr Pro Gin Ala Glu Val Arg Val Lys
1720 1725 1730
GAC ATT GGC GTC ACC GAC CCG GAT CTG TGG CTC GAC ATC CGT GCC ACG 7087 Asp Ile Gly Val Thr Asp Pro Asp Leu Trp Leu Asp Ile Arg Ala Thr
1735 1740 1745
CTG CGA TCG CTC GAG AAG CCT GTC AGC AAG ATT CAG TCG TGG ACC AGC 7135 Leu Arg Ser Leu Glu Lys Pro Val Ser Lys Ile Gin Ser Trp Thr Ser
1750 1755 1760
CCG GAG AAC AAG CGC ATT GTG CTA CAT CTG GAA AAG TTC ACA CCG GCT 7183 Pro Glu Asn Lys Arg Ile Val Leu His Leu Glu Lys Phe Thr Pro Ala
1765 1770 1775
ATC CAT GCT GAG GAG GTG CAC TCG CAG ATC ACC AAA CGT GCG CGT CTC 7231 Ile His Ala Glu Glu Val His Ser Gin Ile Thr Lys Arg Ala Arg Leu 1780 1785 1790 1795
GAG TCC GAC ACG CCG AGC AAG GCG CGA GTG TCT CTG GGC CGC TCT GAT 7279 Glu Ser Asp Thr Pro Ser Lys Ala Arg Val Ser Leu Gly Arg Ser Asp
1800 1805 1810
TCG ATC TCG ACG CCA GCA AAG GAG AGC GGC GCC GTT CCT TAT GCG GCA 7327 Ser Ile Ser Thr Pro Ala Lys Glu Ser Gly Ala Val Pro Tyr Ala Ala
1815 1820 1825
GCT CCT GTG CCC AGC GAG GCT GTT CGA GGT ATC GTG CCT GCT TTG ACG 7375 Ala Pro Val Pro Ser Glu Ala Val Arg Gly Ile Val Pro Ala Leu Thr 1830 1835 1840 CCG GCG GCT GAT TCA CCC GCC TCC AGA TCA GGA AGG AAC GAC GAT TCA 7423 Pro Ala Ala Asp Ser Pro Ala Ser Arg Ser Gly Arg Asn Asp Asp Ser
1845 1850 1855
TTT GCT GCA GCC TCG CCT CCT TTG TGG GAT GCC AAG ACT GGA CCA TCT 7471 Phe Ala Ala Ala Ser Pro Pro Leu Trp Asp Ala Lys Thr Gly Pro Ser 1860 1865 1870 1875
CCT GGC AAC GCC AGC ATC GAA TGG GCG CAG TCG GCA CGT CGA CGA TAT 7519 Pro Gly Asn Ala Ser Ile Glu Trp Ala Gin Ser Ala Arg Arg Arg Tyr
1880 1885 1890
GCC GAA GGC ATG GAC AAC CTC TAC CGT CGC GGC ATC ACG GAC ACG ATG 7567 Ala Glu Gly Met Asp Asn Leu Tyr Arg Arg Gly Ile Thr Asp Thr Met
1895 1900 1905
CTG GTG CGA TTC TAC GTT GGA TGG AAT GGA CGT ACG CTC TTT CAT CCG 7615 Leu Val Arg Phe Tyr Val Gly Trp Asn Gly Arg Thr Leu Phe His Pro
1910 1915 1920
GTA CGA GAC TCA GCG GGC AAC ATT GTA GAG GTA TCT CTG GGC GAG AAC 7663 Val Arg Asp Ser Ala Gly Asn Ile Val Glu Val Ser Leu Gly Glu Asn
1925 1930 1935
GTC CGT CTG CAT CCA GAT GAT CCC GAG GGC GTG CGG GTA ATT CGT GCT 7711 Val Arg Leu His Pro Asp Asp Pro Glu Gly Val Arg Val Ile Arg Ala 1940 1945 1950 1955
GCC ATT GAA CGA CAC AGC GTC AAA GCG GAC CGT TTA GCC GCA AGT CAT 7759 Ala Ile Glu Arg His Ser Val Lys Ala Asp Arg Leu Ala Ala Ser His
1960 1965 1970
GGC TAT GGC GGC GAG ATG GAC GAT CAT GTG TAC TCT CGC AAC GCT TAC 7807 Gly Tyr Gly Gly Glu Met Asp Asp His Val Tyr Ser Arg Asn Ala Tyr
1975 1980 1985
AGT CGC GAC GAC GGA CGC TAT ACA GCT CAG CGA CGC GAT CCT CCG GTG 7855 Ser Arg Asp Asp Gly Arg Tyr Thr Ala Gin Arg Arg Asp Pro Pro Val
1990 1995 2000
GTA CCG TCG AAT GGC AGA TTC AGC ATG AGA TCG CCT GCC ACG ATT CCT 7903 Val Pro Ser Asn Gly Arg Phe Ser Met Arg Ser Pro Ala Thr Ile Pro
2005 2010 2015
TCG CAA CGA CTT GGC AGC GAT CGC GAC TAT GAA CGC GAG CGG GAG CGT 7951 Ser Gin Arg Leu Gly Ser Asp Arg Asp Tyr Glu Arg Glu Arg Glu Arg 2020 2025 2030 2035
GAC GGG GAT CTT CAT GAT GCC CGT GAT GGT CGT GAT GGC CGA TAT GGC 7999 Asp Gly Asp Leu His Asp Ala Arg Asp Gly Arg Asp Gly Arg Tyr Gly
2040 2045 2050
GAT TCA TTA CGT TCT CCG GCG GCA CCA GTG GCG GCG ATG ACT GCC CCT 8047 Asp Ser Leu Arg Ser Pro Ala Ala Pro Val Ala Ala Met Thr Ala Pro
2055 2060 2065
GGT GCA TTG GAC ACC TCG CCG GCG CTC CGA ACG AAT CTA GCG CGC GAA 8095 Gly Ala Leu Asp Thr Ser Pro Ala Leu Arg Thr Asn Leu Ala Arg Glu
2070 2075 2080
GTC GTG CCG ACA TAC GCG CGA AGC TCA GCT AAT GCA TCG GCA ACC ACA 8143 Val Val Pro Thr Tyr Ala Arg Ser Ser Ala Asn Ala Ser Ala Thr Thr 2085 2090 2095 AGT CCA TAC ACT GGC GCT GCT TCG ACG TAC AGC ATT TAT TCG GCA TCT 8191
Ser Pro Tyr Thr Gly Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Tyr Ser Ala Ser
2100 2105 2110 2115
GAC AGA GCG GCA TCT TAT CCG GTG GGT CGC AGT TCG ATT TCG CAG GCG 8239
Asp Arg Ala Ala Ser Tyr Pro Val Gly Arg Ser Ser Ile Ser Gin Ala
2120 2125 2130
GAT CTG GAT GGA AAT AGG GGG GGA CCT CCA CCG ATG GCG ATG TAT GCT 8287 Asp Leu Asp Gly Asn Arg Gly Gly Pro Pro Pro Met Ala Met Tyr Ala
2135 2140 2145
TCT GCC AAG GCT GAG CCT GTC GCA AAT GGG TCT ACG TTT TCG GCA CTG 8335 Ser Ala Lys Ala Glu Pro Val Ala Asn Gly Ser Thr Phe Ser Ala Leu
2150 2155 2160
GAC CCA GCG ATG ATG GCA GAC GAT GCA GCA GGA CAG ATC GAT CCC AAT 8383 Asp Pro Ala Met Met Ala Asp Asp Ala Ala Gly Gin Ile Asp Pro Asn
2165 2170 2175
TTG ACG AGC. AGT CCG GTT CTA GCT TCC AAC TCG GCA GTT CCC GCA CCG 8431 Leu Thr Ser Ser Pro Val Leu Ala Ser Asn Ser Ala Val Pro Ala Pro 2180 2185 2190 2195
TCG ACC GCA CCG GCA GCA GCA CAT GGT GTT CGG AGC GAG ACG AGG AGC 8479 Ser Thr Ala Pro Ala Ala Ala His Gly Val Arg Ser Glu Thr Arg Ser
2200 2205 2210
CGT CCA CCC AGC GCA GGC AAC GAA GTC GCC CAT GAA GCC GGT TCC GCG 8527 Arg Pro Pro Ser Ala Gly Asn Glu Val Ala His Glu Ala Gly Ser Ala
2215 2220 2225
AAA GCA CCC CCG GGT GCA CCC TCG GGT GGC CAC AGT GGC GAG ATC AAG 8575 Lys Ala Pro Pro Gly Ala Pro Ser Gly Gly His Ser Gly Glu Ile Lys
2230 2235 2240
GAG CAC AAC CCA GAC GAG CAC GAG CTC GAG AGT GTT CGT CAG CAG GCT 8623 Glu His Asn Pro Asp Glu His Glu Leu Glu Ser Val Arg Gin Gin Ala
2245 2250 2255
AGA CAG ATG GCG CGG AAA ATG CGA CCA GAC GCT TCC GAG GCC GAC ATC 8671 Arg Gin Met Ala Arg Lys Met Arg Pro Asp Ala Ser Glu Ala Asp Ile 2260 2265 2270 2275
GAA CGA TTG GTT CAA AAC TTT ATC GGT GGT GGA GAG TCT AAG TAGCGCGCCC 8723 Glu Arg Leu Val Gin Asn Phe Ile Gly Gly Gly Glu Ser Lys
2280 2285 229
TGCCAAGAAT ACATGCGGTT CAATGAAATT GTGAATCAAG AATCATGAAT CGTGAATGTA 8783 CAATCGATAT CACACCACGC AGCACGAATA GCGAGATTCA CGATTCACGA ATCGTGATTC 8843 GTGAATCACG AATGTGCGAA CGAAAATCAG GGTTTGGATT CCAAGAGAAA GAAGCTGATG 8903 AAACAGTGAT GAGTCAAACG AGTCTAGA 8931 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 2289 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Thr Ser Thr Lys Thr Ser Ser Gin Pro Ser Gly Ser Ser Asp Thr
1 5 ' 10 15
Pro Gin Arg Ile Val Val Lys Ser Val Asn Gly His Glu Pro Ile Lys
20 25 30
Val Glu Pro Val Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Leu His Ser Thr Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Ala Thr Pro Leu Ser Ser Pro Thr Lys Ser Ala Ala Pro
50 55 60
Ser Ser Pro Ser Lys Ser Pro Gly Arg Ala Arg Arg Val Asp Pro Val 65 70 75 80
Leu Ile Ser Ser Arg Glu Phe Gly Pro Ser Ala Gly Gly Asp Ser Asp
85 90 95
Asp Asp Glu Phe Asn Asn Gly Glu Pro Glu Val Tyr Lys Gly Val Asn
100 105 110
Thr Thr Ala Lys Arg Leu Ser Arg Lys Ser Lys Ala Asp Ala Met Phe
115 120 125
Ala Met Ser Val Lys Glu Ser Ser Pro Val His Ala His Ala Thr Ser
130 135 140
Thr Ser Thr Thr Ser Asn Ala Pro Thr Ala Ile Pro Gly Asn Pro Ala 145 150 155 160
Ser His Pro Ala Arg Lys Met Phe Gin His Gin Pro Phe Pro Pro Leu
165 170 175
Val Phe Asp Thr Asp Pro Ile Ser Ser Ile Ser Gin Ser Pro Ser Ala
180 185 190
Ser Asn Ala Ala Gin Pro Pro Ile Pro Thr His Ala Ser Thr Pro Arg
195 200 205
Cys Pro Pro Pro Arg Leu Arg Pro Arg Leu Phe Glu Leu Asp Glu Ala
210 215 220
Pro Thr Phe Tyr Pro Ser Pro Glu Glu Phe Ser Asp Pro Met Lys Tyr 225 230 235 240
Ile Ala Trp Ile Ala Asp Pro Gin Gly Gly Asn Gly Lys Ala Tyr Gly
245 250 255
Ile Val Lys Ile Val Pro Pro Gin Gly Trp Asn Pro Glu Cys Val Leu
260 265 270
Asp Glu Gin Thr Phe Arg Phe Arg Thr Arg Val Gin Leu Leu Asn Ser
275 280 285
Leu Ser Ala Asp Ala Arg Ala Ser Gin Asn Tyr Gin Glu Gin Leu Gin 290 295 300 Lys Phe His Ala Gin Gin Gly Arg Lys Arg Val Ser Val Pro Val Ile 305 310 315 320
Asp Gly Arg Ser Val Asp Leu Tyr Gin Leu Lys Leu Val Ile Ser Ser
325 330 335
Leu Gly Gly Tyr Asp Ala Val Cys Arg Ala Arg Lys Trp Ser Asp Ala
340 345 350
Thr Arg Lys Ile Gly Tyr Ser Asp Lys Glu Ser Gly Gin Leu Ser Thr
355 360 365
Gin Val Lys Ala Ala Tyr Thr Arg Ile Ile Leu Pro Phe Glu Glu Phe
370 375 380
Leu Ala Lys Ala Lys Glu Gin Ser Arg Pro Asn Gly Ser Ser Val Ser 385 390 395 400
Pro Gin Leu Ala Gin Ser Ala Ile Met Gly Ala Thr Ala Ser Thr Asp
405 410 415
Thr Gin Glu Asn Gly Val Lys His Pro Ser Met Ser Pro Ser Leu Asp
420 425 430
Ala Ala Pro Ser Gly Asp Ala Gly Glu His Phe Lys Thr Pro Glu Pro
435 440 445
Phe Thr Ala Ala Gly Ala Ala Glu Ala Leu Ala Asn Ala Thr Pro Val
450 455 460
Leu Glu Thr Pro Thr Gin Ser Pro Ser Thr Val Ala Ser Thr Arg Arg 465 470 475 480
Ser Ala Arg Lys Arg Ser Glu Ala Thr Ser Thr Pro Ala Ser Ser Ser
485 490 495
Arg Asn Ser Leu Gin Leu Thr Ser Thr Pro Met Thr Pro Leu Ile Ser
500 505 510
Arg Arg Arg Lys Gly Val Ser Pro His Leu Glu Ala Asp Ser Tyr Leu
515 520 525
Arg Ala Gin Ala Gly Asn Gin Ala Gin Glu Glu Gin Met Cys Glu Ile
530 535 540
Cys Leu Arg Gly Glu Asp Gly Pro Asn Met Leu Leu Cys Asp Glu Cys 545 550 555 560
Asn Arg Gly Tyr His Met Tyr Cys Leu Gin Pro Ala Leu Thr Ser Ile
565 570 575
Pro Lys Ser Gin Trp Phe Cys Pro Pro Cys Leu Val Gly Thr Gly His
580 585 590
Asp Phe Gly Phe Asp Asp Gly Glu Thr His Ser Leu Tyr Thr Phe Trp
595 600 605
Gin Arg Ala Glu Ala Phe Lys Arg Asp Trp Trp Ser Lys His Gin Asp
610 615 620
His Leu Trp Arg Pro Asp Ser Glu Gly Leu Ala Thr Ser Asp Tyr Asp 625 630 635 640
Pro Pro Thr Asn Gly Leu Ala Arg Arg Val His Gly Thr Asp Leu Val
645 650 655
Val Ser Glu Asp Asp Val Glu Arg Glu Phe Trp Arg Leu Val His Ser
660 665 670
Gin Lys Glu Glu Val Glu Val Glu Tyr Gly Ala Asp Val His Ser Thr 675 680 685 Thr His Gly Ser Ala Leu Pro Thr Gin Glu Thr His Pro Leu Ser Leu
690 695 700
Tyr Ser Arg Asp Lys Trp Asn Leu Asn Asn Leu Pro Ile Leu Pro Gly 705 710 715 720
Ser Leu Leu Gin Tyr Ile Lys Ser Asp Ile Ser Gly Met Thr Val Pro
725 730 735
Trp Ile Tyr Val Gly Met Ile Phe Ser Thr Phe Cys Trp His Asn Glu
740 745 750
Asp His Tyr Thr Tyr Ser Ile Asn Tyr Gin His Trp Gly Glu Thr Lys
755 760 765
Thr Trp Tyr Gly Ile Pro Gly Glu Asp Ala Glu Lys Phe Glu Asn Ala
770 775 780
Met Arg Lys Ala Ala Pro Asp Leu Phe Glu Thr Leu Pro Asp Leu Leu 785 790 795 800
Phe His Leu Thr Thr Met Met Ser Pro Glu Lys Leu Lys Lys Glu Gly
805 810 815
Val Arg Val Val Ala Cys Asp Gin Arg Ala Asn Glu Phe Val Val Thr
820 825 830
Phe Pro Lys Ala Tyr His Ser Gly Phe Asn His Gly Leu Asn Leu Asn
835 840 845
Glu Ala Val Asn Phe Ala Leu Pro Asp Trp Ile Phe Asp Asp Leu Glu
850 855 860
Ser Val Arg Arg Tyr Gin Arg Phe Arg Lys Pro Ala Val Phe Ser His 865 870 875 880
Asp Gin Leu Leu Ile Thr Val Ser Gin Gin Ser Gin Thr Ile Glu Thr
885 890 895
Ala Val Trp Leu Glu Ala Ala Met Gin Glu Met Val Asp Arg Glu Ile
900 905 910
Ala Lys Arg Asn Ala Leu Arg Glu Ile Ile Pro Asp Leu Lys Glu Glu
915 920 925
Val Tyr Asp Glu Asp Val Ala Glu Ser His Tyr Ile Cys Ser His Cys
930 935 940
Thr Leu Phe Ser Tyr Leu Gly Gin Leu Thr Ser Pro Lys Thr Asp Gly 945 950 955 960
Val Ala Cys Leu Asp His Gly Phe Glu Val Cys Asn Ala Asp Ala Pro
965 970 975
Val Lys Trp Thr Leu Lys Leu Arg Phe Ser Asp Asp Gin Leu Arg Ser
980 985 990
Ile Leu Ala Lys Val Cys Glu Arg Ala Ala Val Pro Arg Asn Trp Ile
995 1000 1005
Gin Arg Leu Lys Lys Thr Leu Ala Leu Gly Pro Thr Pro Pro Leu Lys
1010 1015 1020
Thr Leu Arg Ser Leu Leu His Glu Gly Glu Lys Ile Ala Phe Ser Leu 1025 1030 1035 1040
Glu Pro Leu Glu Asp Leu Arg Thr Phe Val Thr Cys Ala Asn Ser Trp
1045 1050 1055
Val Glu Arg Ala Asn Val Phe Leu Met Arg Lys Leu His Lys Arg Arg 1060 1065 1070 Gly Glu Pro Ala Ala Ala Pro Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Lys Gly
1075 1080 1085
Gly Ala Val Ala Asp Asp Ser Phe Thr Arg Arg Gin Ser Leu Asp Ala
1090 1095 1100
Ser Val Asp Asp Ala Glu Ser Thr Ser Asp Arg Ser Pro Glu Ala Leu 1105 1110 1115 1120
Tyr Ala Leu Ile Gly Glu Leu Asp Ser Leu His Phe Asp Ala Pro Glu
1125 1130 1135
Ile Ala Ser Leu Arg Thr Met Ala Gin Glu Leu Glu Glu Phe Ile Gly
1140 1145 1150
Arg Cys Asp Glu Val Leu Gin Gin Gly Asp Glu Thr Asn Leu Lys Asp
1155 1160 1165
Cys Glu Ser Ile Leu Thr Leu Gly Ser Ser Leu Asn Val Asp Ala Pro
1170 1175 1180
Gin Ile Lys Glu Leu Ser Asp Tyr Val Glu Arg Arg Lys Trp Ile Gin 1185 1190 1195 1200
Glu Val Thr Glu Ser Phe Asp Thr Tyr Leu Tyr Tyr His Glu Val Ala
1205 1210 1215
Glu Leu Leu Asp Arg Ala Asp Ser Cys Gly Leu Gin Asp His Glu Leu
1220 1225 1230
Arg Lys Asn Leu Glu Gin Arg Leu Glu Ala Gly Gin Arg Trp Thr Glu
1235 1240 1245
Ser Ala Arg Glu Ala Leu Gly Gly Ser Gin Pro Ile Thr Ile Asp Val
1250 1255 1260
Leu Gin Glu Leu Ser Glu Ser Ser Ala Asp Val Pro Val Val Leu Glu 1265 1270 1275 1280
Val Ala Gin Asp Val Thr Asp Ala Leu Ser Lys Ala Lys Glu Leu Gin
1285 1290 1295
Lys Thr Ile Gin Thr Leu Tyr Lys Ala Leu Gin Thr Gly Ala His Gly
1300 1305 1310
His Ser Ala Ala Asp Ala Asp Gly Asp Leu Ser Met Ile Ser Ile Ser
1315 1320 1325
Glu Asn Gly Glu Ala Ala Glu Arg Val Ala Leu Leu Pro Asp Ala Arg
1330 1335 1340
Arg Val Leu Arg Ala Ala Arg Ser Asn Lys Leu Glu Leu Glu His Ala 1345 1350 1355 1360
Gin Asp Ile Glu Lys Ala Val Gin Val Tyr Asp Ala Trp Arg Ala Ala
1365 1370 1375
Phe Asn Gin Ile Met Gin Thr Ile Ala Gly Gly Ser Arg Arg Leu Thr
1380 1385 1390
Asp Ala Asp Arg Asp Glu Glu Leu Asp Lys Leu Val Glu Arg Val Glu
1395 1400 1405
Asp Ala Thr Asp Pro Ala Asp Asp Gin Asn Lys Pro Asn Ala Arg Asn
1410 1415 1420
Cys Ile Cys Arg Ser Ser Met Pro Ile Ala Ile Pro Ser Ser Ser Gly 1425 1430 1435 1440
Ala Glu Cys Ser Arg Cys Arg Val Gin Tyr His Leu Ser Cys Ile Lys 1445 1450 1455 Val Arg Ser Ser Glu Val Ser Arg Ala Glu Gly Gly Trp Val Cys Pro
1460 1465 1470
Phe Cys Pro Trp Tyr Gly Ser Ala Pro Phe Leu Lys Met Arg Lys Ala
1475 1480 1485
Ile Ser Ile Ala Asp Leu Ser Lys Leu Val Tyr Asp Gin Asp His Arg
1490 1495 1500
Arg Asp Gin Phe Lys Phe Leu Pro Leu Glu Trp Asp Ala Ile Glu Glu 1505 1510 1515 1520
Val Val Ala Lys Ala Lys Arg Phe Glu Thr Ala Ala Lys Arg Met Ile
1525 1530 1535
Lys Thr Leu Ser Leu Met Arg Arg Asp Gin Lys Gin Val Ile Leu Ala
1540 1545 1550
His Trp Leu Arg Arg Ser Ile Gly Cys Pro Val Asp Val Leu Gly Pro
1555 1560 1565
Glu Lys Val Asn Met Leu Asp Leu Ile Ser Glu Asn Leu Leu Ala Leu
1570 1575 1580
Gly Ser Gin Gin Gly Asp Ala Ala Pro Met Ala Pro Val Glu Arg Ile 1585 1590 1595 1600
Lys Ala Ser Thr Pro Ala Arg Ser Asp Glu Arg Thr Glu Glu Thr Thr
1605 1610 1615
Pro Leu Pro Arg Ser Ser Arg Val Pro Ala Pro Ala Asp Arg Asp Ser
1620 1625 1630
Gly Ser Pro Ala Val Arg Asp Asp Arg Lys Arg Lys Ala Lys Arg Gly
1635 1640 1645
Lys Arg Ala Lys Leu Val Phe Gin Glu Glu Ile Gly Ile Gly Ala Tyr
1650 1655 1660
Arg Asp Arg Gin Pro Ile Tyr Cys Leu Cys His Glu Pro Glu Ser Gly 1665 1670 1675 1680
Arg Met Ile Ala Cys Asp Lys Cys Met Leu Trp Phe His Thr Asn Cys
1685 1690 1695
Val Arg Leu Asp Asp Pro Pro Asn Leu Gly Asn Glu Pro Trp Ile Cys
1700 1705 1710
Pro Met Cys Cys Ile Lys Ala Glu Arg Lys Tyr Pro Gin Ala Glu Val
1715 1720 1725
Arg Val Lys Asp Ile Gly Val Thr Asp Pro Asp Leu Trp Leu Asp Ile
1730 1735 1740
Arg Ala Thr Leu Arg Ser Leu Glu Lys Pro Val Ser Lys Ile Gin Ser 1745 1750 1755 1760
Trp Thr Ser Pro Glu Asn Lys Arg Ile Val Leu His Leu Glu Lys Phe
1765 1770 1775
Thr Pro Ala Ile His Ala Glu Glu Val His Ser Gin Ile Thr Lys Arg
1780 1785 1790
Ala Arg Leu Glu Ser Asp Thr Pro Ser Lys Ala Arg Val Ser Leu Gly
1795 1800 1805
Arg Ser Asp Ser Ile Ser Thr Pro Ala Lys Glu Ser Gly Ala Val Pro
1810 1815 1820
Tyr Ala Ala Ala Pro Val Pro Ser Glu Ala Val Arg Gly Ile Val Pro 1825 1830 1835 1840 Ala Leu Thr Pro Ala Ala Asp Ser Pro Ala Ser Arg Ser Gly Arg Asn
1845 1850 1855
Asp Asp Ser Phe Ala Ala Ala Ser Pro Pro Leu Trp Asp Ala Lys Thr
1860 1865 1870
Gly Pro Ser Pro Gly Asn Ala Ser Ile Glu Trp Ala Gin Ser Ala Arg
1875 1880 1885
Arg Arg Tyr Ala Glu Gly Met Asp Asn Leu Tyr Arg Arg Gly Ile Thr
1890 1895 1900
Asp Thr Met Leu Val Arg Phe Tyr Val Gly Trp Asn Gly Arg Thr Leu 1905 1910 1915 1920
Phe His Pro Val Arg Asp Ser Ala Gly Asn Ile Val Glu Val Ser Leu
1925 1930 1935
Gly Glu Asn Val Arg Leu His Pro Asp Asp Pro Glu Gly Val Arg Val
1940 1945 1950
Ile Arg Ala Ala Ile Glu Arg His Ser Val Lys Ala Asp Arg Leu Ala
1955 1960 1965
Ala Ser His Gly Tyr Gly Gly Glu Met Asp Asp His Val Tyr Ser Arg
1970 1975 1980
Asn Ala Tyr Ser Arg Asp Asp Gly Arg Tyr Thr Ala Gin Arg Arg Asp 1985 1990 1995 2000
Pro Pro Val Val Pro Ser Asn Gly Arg Phe Ser Met Arg Ser Pro Ala
2005 2010 2015
Thr Ile Pro Ser Gin Arg Leu Gly Ser Asp Arg Asp Tyr Glu Arg Glu
2020 2025 2030
Arg Glu Arg Asp Gly Asp Leu His Asp Ala Arg Asp Gly Arg Asp Gly
2035 2040 2045
Arg Tyr Gly Asp Ser Leu Arg Ser Pro Ala Ala Pro Val Ala Ala Met
2050 2055 2060
Thr Ala Pro Gly Ala Leu Asp Thr Ser Pro Ala Leu Arg Thr Asn Leu 2065 2070 2075 2080
Ala Arg Glu Val Val Pro Thr Tyr Ala Arg Ser Ser Ala Asn Ala Ser
2085 2090 2095
Ala Thr Thr Ser Pro Tyr Thr Gly Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Tyr
2100 2105 2110
Ser Ala Ser Asp Arg Ala Ala Ser Tyr Pro Val Gly Arg Ser Ser Ile
2115 2120 2125
Ser Gin Ala Asp Leu Asp Gly Asn Arg Gly Gly Pro Pro Pro Met Ala
2130 2135 2140
Met Tyr Ala Ser Ala Lys Ala Glu Pro Val Ala Asn Gly Ser Thr Phe 2145 2150 2155 2160
Ser Ala Leu Asp Pro Ala Met Met Ala Asp Asp Ala Ala Gly Gin Ile
2165 2170 2175
Asp Pro Asn Leu Thr Ser Ser Pro Val Leu Ala Ser Asn Ser Ala Val
2180 2185 2190
Pro Ala Pro Ser Thr Ala Pro Ala Ala Ala His Gly Val Arg Ser Glu
2195 2200 2205
Thr Arg Ser Arg Pro Pro Ser Ala Gly Asn Glu Val Ala His Glu Ala 2210 2215 2220 Gly Ser Ala Lys Ala Pro Pro Gly Ala Pro Ser Gly Gly His Ser Gly 2225 2230 2235 2240
Glu Ile Lys Glu His Asn Pro Asp Glu His Glu Leu Glu Ser Val Arg
2245 2250 2255
Gin Gin Ala Arg Gin Met Ala Arg Lys Met Arg Pro Asp Ala Ser Glu
2260 2265 2270
Ala Asp Ile Glu Arg Leu Val Gin Asn Phe Ile Gly Gly Gly Glu Ser
2275 2280 2285
Lys

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäurefragment aus dem Pilz Ustilago maydis, das durch das in der Figur I dargestellte Xbal-Bglll-Fragment charakte¬ risiert ist.
2. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine egll konstitutiv exprimierende Ustilago maydis Mutante funktionell komplementieren kann.
3. Nukleinsäurefragment, das unter Standardbedingungen mit einem Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 1 hybridisiert, und das eine egll konstitutiv exprimierende Ustilago maydis Mutante funktionell komplementieren kann.
4. Verwendung des Genproduktes des Nukleinsäurefragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als spezifisches Target für Fungizide.
5. Spezifisches Testverfahren zum Auffinden fungizider Ver¬ bindungen, indem man einen haploiden Ustilago-Stamm, der kein egll exprimiert, mit einer auf fungizide Wirkung zu über¬ prüfenden Verbindung in Kontakt bringt, und die Genexpression von egll ermittelt.
6. Verwendung einer Ustilago-Mutante, die eine Mutation in dem Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 1 trägt, zur Infektion von Maispflanzen.
7. Nahrungsmittel, erhältlich durch Infektion einer Maispflanze mit einer Ustilago-Mutante gemäß Anspruch 6.
8. Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 1, das durch die in SEQ ID NO:l angegebene Nukleinsäuresequenz zwischen der Bglll und der Xbal-Schnittstelle charakterisiert ist
9. Genprodukt des Nukleinsäurefragments gemäß Anspruch 8, das durch die in SEQ ID NO:2 dargestellte Aminosäuresequenz dargestellt ist.
10. Verwendung des Genproduktes nach Anspruch 9 oder von daraus abgeleiteten Teilsequenzen als spezifisches Target für Fungizide.
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