DE19536890A1 - Regulatorisches Gen aus Ustilago maydis - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein regulatorisches Gen aus dem Pilz Ustilago maydis, die Verwendung dieses Gens sowie Pilz­ mutanten, die eine Mutation in diesem Gen tragen.

Ustilago maydis, der Erreger des Beulenbrandes bei Mais, hat einen zweiphasigen Lebenszyklus. Das haploide Stadium wächst hefeartig und ist nicht pathogen. Das Dikaryon zeigt filamentöses Wachstum und stellt die pathogene Form dar. Der Pilz besitzt zwei Kreuzungstyp-Loci. Der a-Lucus, von dem zwei Allele existieren, ist für die Fusion haploider Zellen und die Ausbildung des Dikaryons verantwortlich. Der multiallele b-Locus kontrolliert die Pathogenität und die sexuelle Entwicklung des Pilzes. Er co­ diert für zwei Homeodomänenproteine (bW und bE), die funktionelle Heterodimere bilden.

Ein b-Locus reguliertes Gen egl1 codiert für eine Endoglucanase, deren Expression in der Filamentphase induziert wird. Die Expres­ sion der Glucanase egl1 kann mit Indikatorplatten auf Basis Carboxymethylcellulose mit Kongorot sicher und eindeutig nachge­ wiesen werden. Daher eignet sich egl1 als Reportergen zur Suche nach Genen mit regulatorischen Funktionen für die Expression differentiell exprimierter Gene. Da die filamentöse Phase von Ustilago maydis Mais-pathogen ist, bestand die Aufgabe, Gene bzw. Genprodukte zu identifizieren, die mit der Regulation der filamentösen Phase verknüpft sind. Solche Gene bzw. Genprodukte sollten geeignete Interventionsmöglichkeiten zur Beseitigung der Pathogenität darstellen.

Es wurde nun ein Nukleinsäurefragment aus dem Pilz Ustilago maydis gefunden, das ein regulatorisches Gen enthält. Das Nukleinsäurefragment wurde folgendermaßen isoliert:

Ein haploider Ustilago maydis-Stamm FB1 (a1 b1) (Banuett, F. and Herskowitz, I. (1989). Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proc. Acad. Sci. USA 86: 5878-5882), der die Endo­ glucanase egl1 nicht exprimiert, wurde einer UV-Mutagenese unter­ zogen. Die Durchmusterung der erhaltenen Mutanten nach konstitu­ tiver egl1-Expression mittels Screening auf Carboxymethylzellu­ loseplatten und anschließender Kongorotfärbung ergab eine Mutante mit der gesuchten Eigenschaft, d. h. filamentunabhängiger konsti­ tutiver egl1-Expression.

Die nähere Untersuchung der erhaltenen Mutante ergab, daß weitere, normalerweise differentiell exprimierte Gene in dieser Mutante konstitutiv exprimiert wurden. Zur näheren Charakterisie­ rung des durch die Mutation betroffenen Gens wurde eine Komple­ mentationsanalyse (wie in Beispiel 3 näher beschrieben) durchge­ führt.

Die Analyse des Nukleinsäurefragmentes ergab, daß es sich dabei um ein regulatorisches Gen mit vermutlich reprimierenden Wirkung handelt. Dieses regulatorische Gen bzw. das dazugehörige Gen­ produkt stellt somit einen möglichen spezifischen Wirkort für Fungizide dar. Es lassen sich in einem Testverfahren mögliche fungizide Verbindungen leicht auf Interaktion mit dem gefundenen Wirkort überprüfen, indem man einen haploiden Ustilago-Stamm, der keine Endoglucanase egl1 exprimiert, mit dem potentiellen Fungi­ zid in Kontakt bringt und ermittelt, ob eine egl1-Expression stattfindet. Im positiven Fall kann von einer Interaktion des Fungizids mit dem regulatorischen Genprodukt ausgegangen werden.

Ein solches Testverfahren läßt sich besonders einfach durch­ führen, wenn man für das Screening auf egl1-Expresssion Carboxy­ methylcellulose-Platten verwendet, die mit Kongorot angefärbt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind homologe Nuklein­ säurefragmente aus anderen Mikroorganismen, die ebenfalls in der Lage sind, eine konstitutiv exprimierende Ustilago maydis Mutante funktionell zu komplementieren. Solche Nukleinsäurefragmente lassen sich leicht mit üblichen Methoden der Gentechnik wie Hybridisierung herstellen, indem man ausgehend von dem Ustilago- Nukleinsäurefragment als Probe entsprechende unter Standard­ bedingungen hybridisierende Klone aus anderen Organismen isoliert und funktionell überprüft.

Beispiel 1 UV-Mutation des Ustilago maydis Stammes FB1

Der Stamm wurde in YEPS Flüssigmedium (Tsukuda, T., S., Fothe­ ringham, S. and Holloman, W.K. (1988). Isolation and characteri­ zation of an autonomously replicating seauence from Ustilago maydis. Mol. Cell. Biol. 8: 3703-3709) angeimpft und bei 28°C geschüttelt. Die Kulturen wurden bei einer Zellzahl von 1 × 10⁶ bis 3 × 10⁶ abzentrifugiert und in der gleichen Menge H₂O bidest resuspendiert. 1 ml dieser Zellsuspension wurde in einer Petri­ schale mit UV behandelt. Die Bestrahlungszeiten wurden so gewählt, daß die Überlebensraten unter 1% lagen. Anschließend wurden Aliquots der UV behandelten Zellsuspension ausplattiert.

Das Screening nach Mutanten erfolgte auf Carboxymethylcellulose- Platten (0,5% Hefeextrakt, 0,4% Bacto-Pentone, 0,4% Saccha­ rose, 2% Carboxymethylcellulose, 1,5 Bitek-Agar).

Die Kolonien aus der UV-Mutagenese wurden auf die Testplatten replikaplattiert, bzw. bei zu hohen Koloniedichten überpickt und bei 29°C inkubiert. Die Zellen werden dann zum Test auf egl1 Expression von den Platten abgewaschen. Anschließend werden die Platten mit 1% Kongorot 20 Minuten überschichtet und mit 1 M NaCl entfärbt. Die Expression von egl1 ist an einem hellen Hof erkennbar.

Beispiel 2 Charakterisierung der erhaltenen Mutante

Die Mutante wurde mit einem kompatiblen Wildtypstamm (FB2 a2b2, Banuett and Herskowitz, 1989) auf CM-Charcoal Platten (Holliday, R. (1974). In: Handbook of Genetics, Vol 1, R.C. Ring, ed. (New York: Plenum Press), pp. 575-595) gekreuzt, um Mutationen im b-Locus auszuschließen. Dabei zeigte sich, daß die Mutante das gleiche Kreuzungsverhalten zeigt wie der Ausgangsstamm.

Es wurde RNA aus Flüssigkulturen der Mutante in YEPS präpariert (Schmitt, M.E., Brown, T.A.: and Trumpower, B.L. (1990). A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acid Res. 18, 3091-3092) und Northern Analysen durchgeführt. Standard Methoden zum Blotten von RNA auf Nylon filtern (Pall) wurden angewendet (Sambrook J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Als Sonde für die Northern Blots wurde ein HindIII-SacI-Fragment aus dem offenen Leserahmen des egl1-Gens verwendet (Dissertation Florian Schauwecker "Isolierung und Charakterisierung einer fila­ mentspezifischen exprimierten Cellulase aus Ustilago maydis", Freie Universität Berlin, 1995).

Radioaktives Markieren von DNA mit ³²P wurde mit Megaprime® label­ ling kit (Amersham) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß egl1 in der Mutante exprimiert wird. Auch die Expression weiterer differentiell exprimierter Gene in der Mutante konnte nachgewie­ sen werden.

Die erhaltene Mutante ist im haploiden Zustand nicht pathogen. Wenn man sie mit einem kompatiblen Wildtypstamm kreuzt, kommt es bei Infektion von Maispflanzen zu Tumorbildung und zur Bildung von Basidiosporen. Aus den Sporen einer solchen Kreuzung konnte ein nach Segregation entstandener kompatibler Stamm isoliert werden, der ebenfalls die Mutation trägt. Eine Kreuzung dieses Stammes mit der ursprünglich erhaltenen Mutante führt zwar zur Tumorbildung in der Pflanze, jedoch werden bei dieser Kreuzung keine Sporen mehr gebildet.

Ein solchermaßen hergestellter mutierter Ustilago Stamm kann beispielsweise dazu verwendet werden, um in Maispflanzen die Bildung von Tumoren (Gallen) zu induzieren, ohne daß es zu der schwarzen Verfärbung durch Sporen kommt.

Da die Gallen der Maispflanzen teilweise als Nahrungsmittel Verwendung finden, bietet die Infektion mit der beschriebenen Ustilago-Mutante gegenüber dem Wildtyp den Vorteil, daß die erhaltenen Gallen optisch ansprechender sind.

Beispiel 3 Komplementation der Mutante mit einer Ustilago Cosmidbank

Die Mutante wurde mit einer Cosmidbank komplementiert, die aus genomischer DNA des diploiden Stammes FBD11 (a1a2b1b2) (Banuett and Herskowitz, 1989 s. o.) hergestellt worden war. Dazu wurden partiell geschnittene-Mbo-I-Fragmente in Bam HI-Schnittstellen des Cosmid-Vektors pUMcos kloniert. Bei pUMcos handelt es sich um einen modifizierten pScos 1 Vector (Stratagene; Wahl, G.M., Lewis, K.S., Ruiz, J.C., Rothenberg, B. Zhao, J., Evans, G.A. (1987) Cosmid vectors for rapid genomic walking, restriction mapping, and gene transfer Proc Natl Acad Sci USA 84: 2160-2164). In pScos wurde ein HindIII - Smal Fragment des Neomycin Resistenzgens mit einem EcoRV - Smal Fragment, das Carboxin Resistenz in U. maydis vermittelt, ersetzt (in der Figur mit cbxR gekennzeichnet).

Das EcoRV - Smal Fragment stammt aus pCBX122 (Keon, J.P.R., White, G.A., Hargreaves, J.A. 1991). Isolation, characterization and sequence of a gene conferring resistance to the systemic fungicide carboxin from the maize smut pathogen, Ustilago maydis. Curr. Genet. 19: 475-481).

Die Mutante wurde mit der Cosmidbank transformiert. Trans­ formation von U. maydis nach Schulz, B., Banuett, F., Dahl, M., Schlesinger, R., Schäfer, W., Martin, T., Herskowitz, I. and Kahmann, R. (1990) (The b alleles of U. maydis, whose combinations program pathogenic development, code for poly­ peptides containing a homeodomain-related modif. Cell 60: 295-306). Es wurden Pools von 98 Cosmiden transformiert.

Das Screening nach komplementierten Transformanden erfolgte auf Carboxymethylcellulose-Platten. Es konnte eine komplementierte Transformande identifiziert werden. Aus diesem Stamm wurde chromosomale DNA nach Hoffman, S.S. and Winston, F. (1987) (A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases auto­ nomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene 57: 267-272) aus YEPS Flüssigkultur isoliert. 1 µg DNA wurde mit Sall geschnitten und in einem Volumen von 20 µl religiert. Der Ligati­ onsansatz wurde in E. coli DH5a transformiert. Die Transformation wurde mit einer Biorad Elektroporations Einheit nach dem Proto­ koll des Herstellers durchgeführt. Die Plasmide wurden aus den Transformanden durch Boiling Minipräp isoliert (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Labo­ ratory Manual (Cold Spring Habor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Durch Verdau mit EcoRI und SalI wurde ein Fragment aus dem Rescueplasmid gewonnen, das aus U. maydis DNA besteht. Dieses wurde radioaktiv markiert und zum Screenen der Einzelfilter des Cosmidpools, mit dem komplementiert werden konnte, verwendet. Die Hydridisierung wurde bei 65°C durchgeführt.

Das Cosmid pUMcos7-H2 (s. Fig.), das auf diese Weise identi­ fiziert worden war, wurde erneut in die Mutante transformiert. Dadurch konnte die Komplementation bestätigt werden.

Beispiel 4 Charakterisierung des komplementierenden Nukleinsäurefragmentes

Es wurde eine Restiktionsanalyse des Cosmids durchgeführt. Das Cosmid wurde mit BamHI verdaut, die Fragmente auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt und isoliert. Die Fragmente wurden in den integrativen Vector pHLN4 kloniert. pHLN4 stammt von pHL1 (Wang, J., Holden, D.W., and Leong, S.A. (1988). Gene transfer system for the phythopathogenic fungus U. maydis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 865-869) ab. pHL1 ist ein pUC12 Derivat, welches das Hydromycin Resistenzgen unter der Kontrolle von U. maydis hsp 70 regulatorischen Sequenzen trägt.

In der SacI site im Polylinker von pHL1 wurden NotI Linker kloniert. pHLN ist beschrieben bei: Schulz, B., Banuett, F., Dahl, M., Schlesinger, R. Schäfer, W., Martin, T., Herskowitz, I., and Kahmann; R. (1990). The b alleles of U. maydis, whose combinations program pathogenic development, code for polypep­ tides containing a homeodomain-related motif. Cell 60, 295-306.

Diese Plasmide wurden in die Mutante transformiert und die Trans­ formanden auf Komplementation getestet. Dabei konnte ein 25 kb XbaI-Fragment identifiziert werden, das die Mutation komplemen­ tiert. Das 25 kb XbaI-Fragment ist in der Figur eingezeichnet und befindet sich zwischen den Positionen XbaI (32 600) und XbaI (14 000).

Auf dem gleichen Weg wurde ein ebenfalls komplementierendes etwa 10 kb großes BglII-Fragment gefunden, das in der Figur zwischen den Positionen BglII (15 000) und BglII (5100) dargestellt ist.

Wie in der Figur dargestellt, besitzen beide komplementierende Fragmente einen überlappenden Bereich.

Dadurch konnte der komplementierende Bereich auf ein 8,9 kb großes XbaI-BglII-Fragment eingegrenzt werden. Dieses Fragment enthält die für die Komplementation notwendige genetische Infor­ mation. In der Figur ist es zwischen den Positionen XbaI (14 000) und BglII (5100) dargestellt. Auf dem Fragment befindet sich außerdem eine BamHI-Stelle bei Pos. 10 600 und eine ClaI-Stelle bei Position 6900.

Claims (7)

1. Nukleinsäurefragment aus dem Pilz Ustilago maydis, das durch das in der Figur dargestellte XbaI-BglII-Fragment charakteri­ siert ist.

2. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine egl1 konstitutiv exprimierende Ustilago maydis Mutante funktionell komplementieren kann.

3. Nukleinsäurefragment, das unter Standardbedingungen mit einem Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 1 hybridisiert, und das eine egl1 konstitutiv exprimierende Ustilago maydis Mutante funktionell komplementieren kann.

4. Verwendung des Genproduktes des Nukleinsäurefragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als spezifisches Target für Fungizide.

5. Spezifisches Testverfahren zum Auffinden fungizider Ver­ bindungen, indem man einen haploiden Ustilago-Stamm, der kein egl1 exprimiert, mit einer auf fungizide Wirkung zu über­ prüfenden Verbindung in Kontakt bringt, und die Genexpression von egl1 ermittelt.

6. Verwendung einer Ustilago-Mutante, die eine Mutation in dem Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 1 trägt, zur Infektion von Maispflanzen.

7. Nahrungsmittel, erhältlich durch Infektion einer Maispflanze mit einer Ustilago-Mutante gemäß Anspruch 6.