DE19536890A1 - Regulatorisches Gen aus Ustilago maydis - Google Patents
Regulatorisches Gen aus Ustilago maydisInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein regulatorisches Gen aus
dem Pilz Ustilago maydis, die Verwendung dieses Gens sowie Pilz
mutanten, die eine Mutation in diesem Gen tragen.
Ustilago maydis, der Erreger des Beulenbrandes bei Mais, hat
einen zweiphasigen Lebenszyklus. Das haploide Stadium wächst
hefeartig und ist nicht pathogen. Das Dikaryon zeigt filamentöses
Wachstum und stellt die pathogene Form dar. Der Pilz besitzt zwei
Kreuzungstyp-Loci. Der a-Lucus, von dem zwei Allele existieren,
ist für die Fusion haploider Zellen und die Ausbildung des
Dikaryons verantwortlich. Der multiallele b-Locus kontrolliert
die Pathogenität und die sexuelle Entwicklung des Pilzes. Er co
diert für zwei Homeodomänenproteine (bW und bE), die funktionelle
Heterodimere bilden.
Ein b-Locus reguliertes Gen egl1 codiert für eine Endoglucanase,
deren Expression in der Filamentphase induziert wird. Die Expres
sion der Glucanase egl1 kann mit Indikatorplatten auf Basis
Carboxymethylcellulose mit Kongorot sicher und eindeutig nachge
wiesen werden. Daher eignet sich egl1 als Reportergen zur Suche
nach Genen mit regulatorischen Funktionen für die Expression
differentiell exprimierter Gene. Da die filamentöse Phase von
Ustilago maydis Mais-pathogen ist, bestand die Aufgabe, Gene
bzw. Genprodukte zu identifizieren, die mit der Regulation der
filamentösen Phase verknüpft sind. Solche Gene bzw. Genprodukte
sollten geeignete Interventionsmöglichkeiten zur Beseitigung der
Pathogenität darstellen.
Es wurde nun ein Nukleinsäurefragment aus dem Pilz Ustilago
maydis gefunden, das ein regulatorisches Gen enthält. Das
Nukleinsäurefragment wurde folgendermaßen isoliert:
Ein haploider Ustilago maydis-Stamm FB1 (a1 b1) (Banuett, F.
and Herskowitz, I. (1989). Different a alleles of Ustilago maydis
are necessary for maintenance of filamentous growth but not for
meiosis. Proc. Acad. Sci. USA 86: 5878-5882), der die Endo
glucanase egl1 nicht exprimiert, wurde einer UV-Mutagenese unter
zogen. Die Durchmusterung der erhaltenen Mutanten nach konstitu
tiver egl1-Expression mittels Screening auf Carboxymethylzellu
loseplatten und anschließender Kongorotfärbung ergab eine Mutante
mit der gesuchten Eigenschaft, d. h. filamentunabhängiger konsti
tutiver egl1-Expression.
Die nähere Untersuchung der erhaltenen Mutante ergab, daß
weitere, normalerweise differentiell exprimierte Gene in dieser
Mutante konstitutiv exprimiert wurden. Zur näheren Charakterisie
rung des durch die Mutation betroffenen Gens wurde eine Komple
mentationsanalyse (wie in Beispiel 3 näher beschrieben) durchge
führt.
Die Analyse des Nukleinsäurefragmentes ergab, daß es sich dabei
um ein regulatorisches Gen mit vermutlich reprimierenden Wirkung
handelt. Dieses regulatorische Gen bzw. das dazugehörige Gen
produkt stellt somit einen möglichen spezifischen Wirkort für
Fungizide dar. Es lassen sich in einem Testverfahren mögliche
fungizide Verbindungen leicht auf Interaktion mit dem gefundenen
Wirkort überprüfen, indem man einen haploiden Ustilago-Stamm, der
keine Endoglucanase egl1 exprimiert, mit dem potentiellen Fungi
zid in Kontakt bringt und ermittelt, ob eine egl1-Expression
stattfindet. Im positiven Fall kann von einer Interaktion des
Fungizids mit dem regulatorischen Genprodukt ausgegangen werden.
Ein solches Testverfahren läßt sich besonders einfach durch
führen, wenn man für das Screening auf egl1-Expresssion Carboxy
methylcellulose-Platten verwendet, die mit Kongorot angefärbt
werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind homologe Nuklein
säurefragmente aus anderen Mikroorganismen, die ebenfalls in der
Lage sind, eine konstitutiv exprimierende Ustilago maydis Mutante
funktionell zu komplementieren. Solche Nukleinsäurefragmente
lassen sich leicht mit üblichen Methoden der Gentechnik wie
Hybridisierung herstellen, indem man ausgehend von dem Ustilago-
Nukleinsäurefragment als Probe entsprechende unter Standard
bedingungen hybridisierende Klone aus anderen Organismen isoliert
und funktionell überprüft.
Der Stamm wurde in YEPS Flüssigmedium (Tsukuda, T., S., Fothe
ringham, S. and Holloman, W.K. (1988). Isolation and characteri
zation of an autonomously replicating seauence from Ustilago
maydis. Mol. Cell. Biol. 8: 3703-3709) angeimpft und bei 28°C
geschüttelt. Die Kulturen wurden bei einer Zellzahl von 1 × 10⁶
bis 3 × 10⁶ abzentrifugiert und in der gleichen Menge H₂O bidest
resuspendiert. 1 ml dieser Zellsuspension wurde in einer Petri
schale mit UV behandelt. Die Bestrahlungszeiten wurden so
gewählt, daß die Überlebensraten unter 1% lagen. Anschließend
wurden Aliquots der UV behandelten Zellsuspension ausplattiert.
Das Screening nach Mutanten erfolgte auf Carboxymethylcellulose-
Platten (0,5% Hefeextrakt, 0,4% Bacto-Pentone, 0,4% Saccha
rose, 2% Carboxymethylcellulose, 1,5 Bitek-Agar).
Die Kolonien aus der UV-Mutagenese wurden auf die Testplatten
replikaplattiert, bzw. bei zu hohen Koloniedichten überpickt und
bei 29°C inkubiert. Die Zellen werden dann zum Test auf egl1
Expression von den Platten abgewaschen. Anschließend werden die
Platten mit 1% Kongorot 20 Minuten überschichtet und mit 1 M
NaCl entfärbt. Die Expression von egl1 ist an einem hellen Hof
erkennbar.
Die Mutante wurde mit einem kompatiblen Wildtypstamm (FB2 a2b2,
Banuett and Herskowitz, 1989) auf CM-Charcoal Platten (Holliday,
R. (1974). In: Handbook of Genetics, Vol 1, R.C. Ring, ed.
(New York: Plenum Press), pp. 575-595) gekreuzt, um Mutationen
im b-Locus auszuschließen. Dabei zeigte sich, daß die Mutante
das gleiche Kreuzungsverhalten zeigt wie der Ausgangsstamm.
Es wurde RNA aus Flüssigkulturen der Mutante in YEPS präpariert
(Schmitt, M.E., Brown, T.A.: and Trumpower, B.L. (1990). A rapid
and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces
cerevisiae. Nucl. Acid Res. 18, 3091-3092) und Northern Analysen
durchgeführt. Standard Methoden zum Blotten von RNA auf Nylon
filtern (Pall) wurden angewendet (Sambrook J., Fritsch, E.F. and
Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Als Sonde für die Northern Blots wurde ein HindIII-SacI-Fragment
aus dem offenen Leserahmen des egl1-Gens verwendet (Dissertation
Florian Schauwecker "Isolierung und Charakterisierung einer fila
mentspezifischen exprimierten Cellulase aus Ustilago maydis",
Freie Universität Berlin, 1995).
Radioaktives Markieren von DNA mit ³²P wurde mit Megaprime® label
ling kit (Amersham) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß
egl1 in der Mutante exprimiert wird. Auch die Expression weiterer
differentiell exprimierter Gene in der Mutante konnte nachgewie
sen werden.
Die erhaltene Mutante ist im haploiden Zustand nicht pathogen.
Wenn man sie mit einem kompatiblen Wildtypstamm kreuzt, kommt es
bei Infektion von Maispflanzen zu Tumorbildung und zur Bildung
von Basidiosporen. Aus den Sporen einer solchen Kreuzung konnte
ein nach Segregation entstandener kompatibler Stamm isoliert
werden, der ebenfalls die Mutation trägt. Eine Kreuzung dieses
Stammes mit der ursprünglich erhaltenen Mutante führt zwar zur
Tumorbildung in der Pflanze, jedoch werden bei dieser Kreuzung
keine Sporen mehr gebildet.
Ein solchermaßen hergestellter mutierter Ustilago Stamm kann
beispielsweise dazu verwendet werden, um in Maispflanzen die
Bildung von Tumoren (Gallen) zu induzieren, ohne daß es zu der
schwarzen Verfärbung durch Sporen kommt.
Da die Gallen der Maispflanzen teilweise als Nahrungsmittel
Verwendung finden, bietet die Infektion mit der beschriebenen
Ustilago-Mutante gegenüber dem Wildtyp den Vorteil, daß die
erhaltenen Gallen optisch ansprechender sind.
Die Mutante wurde mit einer Cosmidbank komplementiert, die aus
genomischer DNA des diploiden Stammes FBD11 (a1a2b1b2) (Banuett
and Herskowitz, 1989 s. o.) hergestellt worden war. Dazu wurden
partiell geschnittene-Mbo-I-Fragmente in Bam HI-Schnittstellen
des Cosmid-Vektors pUMcos kloniert. Bei pUMcos handelt es sich
um einen modifizierten pScos 1 Vector (Stratagene; Wahl, G.M.,
Lewis, K.S., Ruiz, J.C., Rothenberg, B. Zhao, J., Evans, G.A.
(1987) Cosmid vectors for rapid genomic walking, restriction
mapping, and gene transfer Proc Natl Acad Sci USA 84: 2160-2164).
In pScos wurde ein HindIII - Smal Fragment des Neomycin
Resistenzgens mit einem EcoRV - Smal Fragment, das Carboxin
Resistenz in U. maydis vermittelt, ersetzt (in der Figur mit
cbxR gekennzeichnet).
Das EcoRV - Smal Fragment stammt aus pCBX122 (Keon, J.P.R.,
White, G.A., Hargreaves, J.A. 1991). Isolation, characterization
and sequence of a gene conferring resistance to the systemic
fungicide carboxin from the maize smut pathogen, Ustilago maydis.
Curr. Genet. 19: 475-481).
Die Mutante wurde mit der Cosmidbank transformiert. Trans
formation von U. maydis nach Schulz, B., Banuett, F., Dahl,
M., Schlesinger, R., Schäfer, W., Martin, T., Herskowitz, I.
and Kahmann, R. (1990) (The b alleles of U. maydis, whose
combinations program pathogenic development, code for poly
peptides containing a homeodomain-related modif. Cell 60:
295-306). Es wurden Pools von 98 Cosmiden transformiert.
Das Screening nach komplementierten Transformanden erfolgte auf
Carboxymethylcellulose-Platten. Es konnte eine komplementierte
Transformande identifiziert werden. Aus diesem Stamm wurde
chromosomale DNA nach Hoffman, S.S. and Winston, F. (1987) (A
ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases auto
nomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene 57:
267-272) aus YEPS Flüssigkultur isoliert. 1 µg DNA wurde mit Sall
geschnitten und in einem Volumen von 20 µl religiert. Der Ligati
onsansatz wurde in E. coli DH5a transformiert. Die Transformation
wurde mit einer Biorad Elektroporations Einheit nach dem Proto
koll des Herstellers durchgeführt. Die Plasmide wurden aus den
Transformanden durch Boiling Minipräp isoliert (Sambrook, J.,
Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual (Cold Spring Habor, New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press).
Durch Verdau mit EcoRI und SalI wurde ein Fragment aus dem
Rescueplasmid gewonnen, das aus U. maydis DNA besteht. Dieses
wurde radioaktiv markiert und zum Screenen der Einzelfilter des
Cosmidpools, mit dem komplementiert werden konnte, verwendet. Die
Hydridisierung wurde bei 65°C durchgeführt.
Das Cosmid pUMcos7-H2 (s. Fig.), das auf diese Weise identi
fiziert worden war, wurde erneut in die Mutante transformiert.
Dadurch konnte die Komplementation bestätigt werden.
Es wurde eine Restiktionsanalyse des Cosmids durchgeführt. Das
Cosmid wurde mit BamHI verdaut, die Fragmente auf einem 0,8%
Agarosegel aufgetrennt und isoliert. Die Fragmente wurden in den
integrativen Vector pHLN4 kloniert. pHLN4 stammt von pHL1 (Wang,
J., Holden, D.W., and Leong, S.A. (1988). Gene transfer system
for the phythopathogenic fungus U. maydis, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85, 865-869) ab. pHL1 ist ein pUC12 Derivat, welches das
Hydromycin Resistenzgen unter der Kontrolle von U. maydis hsp 70
regulatorischen Sequenzen trägt.
In der SacI site im Polylinker von pHL1 wurden NotI Linker
kloniert. pHLN ist beschrieben bei: Schulz, B., Banuett, F.,
Dahl, M., Schlesinger, R. Schäfer, W., Martin, T., Herskowitz,
I., and Kahmann; R. (1990). The b alleles of U. maydis, whose
combinations program pathogenic development, code for polypep
tides containing a homeodomain-related motif. Cell 60, 295-306.
Diese Plasmide wurden in die Mutante transformiert und die Trans
formanden auf Komplementation getestet. Dabei konnte ein 25 kb
XbaI-Fragment identifiziert werden, das die Mutation komplemen
tiert. Das 25 kb XbaI-Fragment ist in der Figur eingezeichnet
und befindet sich zwischen den Positionen XbaI (32 600) und XbaI
(14 000).
Auf dem gleichen Weg wurde ein ebenfalls komplementierendes etwa
10 kb großes BglII-Fragment gefunden, das in der Figur zwischen
den Positionen BglII (15 000) und BglII (5100) dargestellt ist.
Wie in der Figur dargestellt, besitzen beide komplementierende
Fragmente einen überlappenden Bereich.
Dadurch konnte der komplementierende Bereich auf ein 8,9 kb
großes XbaI-BglII-Fragment eingegrenzt werden. Dieses Fragment
enthält die für die Komplementation notwendige genetische Infor
mation. In der Figur ist es zwischen den Positionen XbaI (14 000)
und BglII (5100) dargestellt. Auf dem Fragment befindet sich
außerdem eine BamHI-Stelle bei Pos. 10 600 und eine ClaI-Stelle
bei Position 6900.
Claims (7)
1. Nukleinsäurefragment aus dem Pilz Ustilago maydis, das durch
das in der Figur dargestellte XbaI-BglII-Fragment charakteri
siert ist.
2. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es eine egl1 konstitutiv exprimierende Ustilago maydis
Mutante funktionell komplementieren kann.
3. Nukleinsäurefragment, das unter Standardbedingungen mit einem
Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 1 hybridisiert, und das
eine egl1 konstitutiv exprimierende Ustilago maydis Mutante
funktionell komplementieren kann.
4. Verwendung des Genproduktes des Nukleinsäurefragments gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 3 als spezifisches Target für
Fungizide.
5. Spezifisches Testverfahren zum Auffinden fungizider Ver
bindungen, indem man einen haploiden Ustilago-Stamm, der kein
egl1 exprimiert, mit einer auf fungizide Wirkung zu über
prüfenden Verbindung in Kontakt bringt, und die Genexpression
von egl1 ermittelt.
6. Verwendung einer Ustilago-Mutante, die eine Mutation in dem
Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 1 trägt, zur Infektion
von Maispflanzen.
7. Nahrungsmittel, erhältlich durch Infektion einer Maispflanze
mit einer Ustilago-Mutante gemäß Anspruch 6.
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19536890A DE19536890A1 (de) | 1995-10-04 | 1995-10-04 | Regulatorisches Gen aus Ustilago maydis |
JP9513964A JPH11514226A (ja) | 1995-10-04 | 1996-09-30 | Ustilago maydis菌から得られる調節遺伝子 |
US09/051,019 US6103229A (en) | 1995-10-04 | 1996-09-30 | Regulator gene from Ustilago maydis |
AU72162/96A AU7216296A (en) | 1995-10-04 | 1996-09-30 | Regulator gene from ustilago maydis |
PCT/EP1996/004254 WO1997012911A1 (de) | 1995-10-04 | 1996-09-30 | Regulatorisches gen aus ustilago maydis |
EP96933423A EP0853631A1 (de) | 1995-10-04 | 1996-09-30 | Regulatorisches gen aus ustilago maydis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19536890A DE19536890A1 (de) | 1995-10-04 | 1995-10-04 | Regulatorisches Gen aus Ustilago maydis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19536890A1 true DE19536890A1 (de) | 1997-04-10 |
Family
ID=7773949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19536890A Withdrawn DE19536890A1 (de) | 1995-10-04 | 1995-10-04 | Regulatorisches Gen aus Ustilago maydis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19536890A1 (de) |
-
1995
- 1995-10-04 DE DE19536890A patent/DE19536890A1/de not_active Withdrawn
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8130 | Withdrawal |