EP0738000B1 - Zwischenspeicherung von Ionen für massenspektrometrische Untersuchungen - Google Patents

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EP0738000B1
EP0738000B1 EP95114449A EP95114449A EP0738000B1 EP 0738000 B1 EP0738000 B1 EP 0738000B1 EP 95114449 A EP95114449 A EP 95114449A EP 95114449 A EP95114449 A EP 95114449A EP 0738000 B1 EP0738000 B1 EP 0738000B1
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EP
European Patent Office
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ions
ion
substance
intermediate store
batches
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Application number
EP95114449A
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English (en)
French (fr)
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EP0738000A1 (de
Inventor
Jochen Franzen
Michael Schubert
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Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Original Assignee
Bruker Daltonik GmbH
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Publication date
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Priority to US08/713,812 priority Critical patent/US5811800A/en
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    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/26—Mass spectrometers or separator tubes
    • H01J49/34—Dynamic spectrometers
    • H01J49/42—Stability-of-path spectrometers, e.g. monopole, quadrupole, multipole, farvitrons
    • H01J49/426—Methods for controlling ions
    • H01J49/4295—Storage methods
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/06—Electron- or ion-optical arrangements
    • H01J49/062—Ion guides

Definitions

  • the invention relates to methods and devices for the intermediate storage of Ions to be subjected to a mass spectrometric analysis.
  • Such an intermediate storage of ions in a high-frequency multipole rod system for their analysis in a high-frequency quadrupole ion trap is over US 5 179 278 known.
  • the invention consists in the known buffering for such To use ions that are supplied in an ion source from separate times Thrusts of individual substances or mixtures of substances can be obtained.
  • the Buffer stores enough ions of one batch of substance for several subsequent mass spectrometric studies, so that a mass spectrometric Characterization of substances, which are also different Measurement methods may require, is made possible to the desired extent.
  • ions should be separated from electrophoretically or chromatographically Flushes of substance can be temporarily stored until the mass spectrometric Examinations to the desired extent completed are.
  • Multiple buffers can store the ions from several rapidly consecutive ones Pick up flare-ups. But also short-term flare-ups Laser-desorptive or pyrolytic processes can be stored temporarily to be examined in detail.
  • Mass spectrometric measurement methods on the ever shorter batches of substances adapt to modern substance separation processes. Separation process like Capillary electrophoresis and liquid chromatography with microcapillary columns are becoming faster and faster procedures for the sake of saving time developed. Today they deliver the separated substances in batches that only still take a few 10 to 100 milliseconds. Mass spectrometry is straight still able to get single overview spectra of the substances from the substance batches to deliver.
  • the method for measuring the fragment ions is selected Primary ions (or parent ions), for which the primary ion spectrum is first must be included, from which only the parent ions are determined. It gets even more complicated when recording grandchildren spectra on selected ones Daughter ions.
  • the substances from the substance spurts with one-time supply, i.e. lowest consumption of substances as comprehensive as possible using the mass spectrometric examination methods that are possible today like low-resolution mass spectra, high-resolution mass spectra, Neutral loss spectra, daughter ion spectra (MS / MS) of selected parent ions or even characterize grandchildren spectra (MS / MS / MS) of selected daughters to be able to.
  • the types of desirable exams can even be be be expanded significantly when reactant gases are added and the resulting ones Product ions, in turn, can be analyzed by the various methods It is possible to make statements about the folding structures of complicated molecules.
  • a method and a device can be found with which substances from a or several successive batches of substances in modern substance delivery systems in many different ways with different types of mass spectrometry Examination methods as extensively as possible for different properties can be examined without the addition of substances while increasing substance consumption and extending the duration of the analysis having to repeat several times.
  • the "flare-ups" are characterized by the short period in which the Ions of a substance are available for measurements, the brevity of Time can be seen relative to the total time of the measurements.
  • the delivery systems can be, for example, electrophoretic or chromatographic separation systems, but also around laser desorption Surfaces to deal with rapid pyrolysis processes or other processes where flare-ups are generated. It should be possible to use the substances separated from individual batches, or several batches summarized, to be examined in detail from different points of view.
  • the present object is achieved with a method according to claim 1 and a device according to claim 13.
  • the buffer store should therefore contain as many ions of a substance surge Feeding system can accommodate that in successive mass spectrometric Investigations of these ions from the buffer with various methods a desired characterization of the test substance is made possible. Only a subset is used for each examination of the ions taken from the buffer.
  • the invention is therefore primarily used by these new types of ionization.
  • this invention is expressly not intended to be limited only to these types of ionization can be limited. Even with the usual types of ionization, for example when analyzing the mixture with electron impact and MS / MS, there are large ones Benefits from this invention.
  • mass spectrometric principles can be used for the investigations are used, such as high-frequency quadrupole ion traps, ICR mass spectrometer, or tandem mass spectrometer various Species such as the triple quadrupole mass spectrometer ("Triple Quad ").
  • the test ions (“parent ions ”) are in tandem mass spectrometers filtered out when flying through a first mass spectrometer, in one Collision cell fragmented and ionized in a second mass spectrometer Fragments ("daughter ions”) analyzed.
  • high-frequency quadrupole as well as in ICR ion traps will take these steps in succession in the same memory cell explained, which is why one also calls “temporal tandem mass spectrometry” ("tandem in time”) speaks.
  • the batches of substances can be batches of cleanly separated individual substances act from physico-chemical separation processes, as well Relapses of mixtures of substances with many individual substances, such as in pyrolytic decomposition processes carried out in pulsed fashion or by laser pulses desorbing surface analyzes become free. Also ions from matrix-supported Laser desorption (MALDI), especially after two-dimensional separation by gel electrophoresis belong to this group of delivery systems Flare-ups.
  • MALDI matrix-supported Laser desorption
  • the separation process can after filling the store with ions can be switched off when a next one Substance thrust approaches before the previous substance is fully examined.
  • Either electrophoretic as well as liquid chromatographic methods can be interrupted without the quality of the separation deteriorating significantly becomes.
  • the gas chromatographic separation can also be interrupted, but here the subsequent separation suffers from poorer substance separation since the Substances in the carrier gas can diffuse much more easily, and switching off the Carrier gas flow drastically changes the pressure and volume ratios each time.
  • the separation is already in the analysis completed, the substance batches are done by feeding the carrier plates generated with respect to the scanning beam of the laser.
  • the buffer in US 5 179 278 works as a through memory, the current one
  • the invention is expressly not intended to be limited only to these.
  • Pass-through memory but form the simplest type of temporary storage. They have an input defined as such for the ions to be stored, and a normally opposite exit through which the ions pass Leave memory.
  • the drive of the ions within the buffer towards the ion exit can be realized in different ways. This is the case with all buffers possible to generate a weak direct electric field along the axis, which drives the ions towards the exit, where they are in the desired state during the storage phase Way prevented by the switchable reflection potential from the outflow and so saved.
  • a constant field can be generated by adding all the rods, in addition to supply them with a high-frequency voltage, in the same direction as one Direct current can be flowed through. It is advantageous to make the rods from one To manufacture resistance material.
  • a generation of an axial co-field component in ring systems or in double helix memories is described in German Patent Application No. 195 23 859.1.
  • This disadvantage has the Registration described as a double or multiple helix trained memory, if the turns of the helices also in the further keep the open area of the cone the same distance.
  • the double helix and their higher descendants such as four-fold helix or six-fold helix are therefore suitable in a particularly good way as a buffer.
  • the outflow of ions from the intermediate storage is done by opening the reflector allows at the end of the buffer. It’s cheap here switching lenses insert the outflowing ions from a small area of the buffer aspirate and into the next stage of processing these ions can focus.
  • the small intake area of the switching lens is due to the Afterflow of ions is refilled, especially when the ions are propelled subject to exit.
  • the outflow rate is therefore of the ions only from the ion density in the buffer, i.e. from the degree of filling, dependent.
  • This relationship can be determined experimentally and for example used to fill ion traps in successive fillings always steer straight up to the space charge limit, or even through Changing the lens voltage to produce a steady outflow as he did for a subsequent tandem mass spectrometer.
  • the selective filling of an ion trap with selected parent ions up to can be controlled close to the space charge limit. It will be during the filling, in a known manner, the ions are usually filtered by the irradiation of a frequency mixture that the unwanted ions from the ion trap drives, but leaves the desired in it. From the primary ion spectrum the ratio of the selected parent ions to the total charge is known, and from the known filling speed and the known efficiency of Filtration can control the filling up to the optimal filling level.
  • Figure 1 shows a block diagram of a mass spectrometer with two buffers according to this invention.
  • a substance delivery system carries substances incrementally to an ion source, which in this example is in the vacuum system of the mass spectrometer.
  • batch feeder systems come, for example, all chromatographic and electrophoretic Separation processes, but also pyrolytic or laser desorptive processes.
  • the ions from the substance batches can be stored in the two buffers 1 and 2 must be kept.
  • the ions of the intermediate storage 2 are added in portions examined in the mass spectrometer until sufficient characterization of the substances of the substance boost is reached, or the ions are used up are.
  • the buffers can be dimensioned so that they ionize for a large number of subsequent mass spectrometric examinations be able to record. Space charge limits play with buffers only a subordinate role.
  • FIG. 2 shows such a buffer, which is designed here as a double helix (4) is.
  • the double helix (4) is located between the lens system (1, 2, 3) at the entrance of the buffer and the lens system (7, 8, 9) at the output of the buffer.
  • the diaphragms (3) and (7) there is a potential that the ions drives back into the double helix.
  • the high frequency voltage for storage is supplied via connections (5) and (6). By switching the potential at the lens aperture (8), the ions can be sucked out of the buffer and fed to a subsequent system.
  • Figure 3 shows a special type of reflection of the stored ions at the end the double helix, shown here as an HF-supplied double spiral on an insulating one Carrier (7a).
  • the carrier (7a) replaces the potential aperture (7) of the output lens in Figure 2.
  • the double spiral is supplied by the same high frequency voltage like the double helix (4).
  • the double spiral on the carrier (7a) has opposite a metallic conductive potential diaphragm (7) the advantage of a much smaller one Range of reflective pseudo-potential so that more ions are stored can be, and the removal of the ions from the buffer faster takes place.
  • Figure 4 shows an arrangement of a mass spectrometer with three buffers again as a schematic diagram, the individual functional units being only symbolic, and the electrical and vacuum supply units not at all are shown.
  • the ion source is located here - unlike in the block diagram of Figure 1 - outside the vacuum system of the mass spectrometer.
  • the batch The substances are supplied by a chromatographic or electrophoretic Capillary column separation device taken over, here only symbolically the separation capillary (10) is shown.
  • the substances are initially in a Detection unit (11) detects, for example, a UV absorption unit can, and then fed to the needle (12) of an electrospray ion source.
  • a strong stream of ambient gas is sucked through the inlet capillary (13) into the vacuum chamber (14), which is pumped via the nozzle (25).
  • Some of the ions are viscously entrained in this stream.
  • the gas flow expands adiabatically in the chamber (14) of the first differential pump stage, the entrained ions being accelerated to speeds of approximately 1000 meters per second.
  • Some of the ions can leave the vacuum chamber (14) through the fine opening in the scraper (15) and enter the vacuum chamber (17) of the next differential pump stage, which is pumped through the nozzle (26).
  • the ions enter the buffer (16).
  • the ions are captured in this buffer (16) and remain there until their kinetic energies have thermalized, which takes only a few 10 milliseconds at the prevailing pressure of about 10 -2 millibars.
  • the thermalized ions of the first batch of substances are then stored in the buffer (18) in the buffer (20) and stored there again.
  • the ions are portionwise extracted from this storage into the high-frequency quadrupole ion trap mass spectrometer shown transferred and there analyzed.
  • the ion trap consists of the two end cap electrodes (21) and (23), and the ring electrode (24).
  • the ions become mass-selective in the analysis processes ejected from the ion trap through the end cap (23) and in the ion detector (24) measured.
  • Figure 5 shows a diagram of the separation of substances in a separation system.
  • the substances (a) to (i), which are separated in time, are called substance spurts of the ion source fed and ionized.
  • a mass spectrometer according to FIG three buffers used, so the ions of the rapidly successive Flare-ups (a), (b) and (c) in the last (20), penultimate (18), and third last Buffer (16) brought and stored there.
  • the ions of the Flare-ups (a), (b) and (c) can then be analyzed before flare-up (d) arrives, the ions of which are therefore stored again in the last intermediate store (20) can be.
  • substance surge (e) arrives, the ions of (d) already analyzed.
  • the embodiment described here relates to the coupling of an ion trap mass spectrometer with the separation method of capillary electrophoresis, as they are in particular can be used for the separation of proteins.
  • the ionization is done by electrospraying at atmospheric pressure, which causes the in the electrolyte Proteins dissolved in electrophoresis are fragmentation-free with practically complete Allow yield to ionize.
  • Such an arrangement with three buffers is reproduced as a schematic diagram in Figure 4. Every specialist becomes a sketch create the arrangement of the mostly commercially available functional elements can.
  • This embodiment is particularly cheap in that it is the very fast one Capillary electrophoresis with its very short bursts of substance with one Coupling type of mass spectrometry, which can be varied in a variety of ways, including the acquisition of daughter and grandchildren spectra, and inclusive the activation of ion-molecule reactions with any reactant gases and analysis of the product ions.
  • these types of studies need their time, especially if there are several such procedures in a row with reverse control should take place from the results of the previous analyzes, and were up to Can not be coupled with fast separation methods to this invention at all, even if very few substances were separated in the separation process.
  • the basic sketch in FIG. 4 gives the capillary electrophoresis only symbolically by the Capillary column (10) again.
  • the substance flow is detected at the end of the capillary column, to determine the flare-ups.
  • the detection can, for example, by a commercial UV absorption unit (11) happen within the capillary.
  • the capillary column ends in an electrospray needle (12). Between these electrically conductive needle (12) and the end face of the input capillary (13) is an electrospray voltage applied by a few kilovolts. That at the top of the Needle highly inhomogeneous electric field pulls a practically continuous Stream of tiny droplets from the electrophoresis liquid. It is there expedient to coaxially surround the electrospray needle with a second needle which can balance the liquid flows, because electrophoresis provides an electroosmotic liquid propulsion that is very small and even in the electrospray needle can be directed into it while the electrophoretic migrating test substances out of the needle. The tiny ones Liquid droplets are highly electrically charged and evaporate quickly, whereby usually the large substance molecules in a mechanism that is not yet fully understood stay charged.
  • the charged droplets and the charged molecules are in the electric field moved towards the end face of the input capillary (13), creating an equilibrium from the tensile force of the electric field and braking force in the surrounding gas.
  • This process is known as "ion mobility”.
  • a warmed clean gas mostly nitrogen, is added to promote the evaporation process and not to let the liquid vapor get into the vacuum.
  • This chamber (17) is kept at a pressure of a few 10 -2 millibars by means of a turbomolecular pump via connecting pieces (26).
  • the ions entering the chamber (17) through the stripper (15) are captured and absorbed by the buffer (16) practically without loss. Due to the relatively high vacuum pressure of a few 10 -2 millibars, their kinetic velocities are thermalized in a few 10 milliseconds. It is therefore expedient to initially take up all the ions of a substance batch in this buffer, to store them there for about 30 milliseconds after the substance batch has ended, and only then to forward them to the next memories (18) or (20).
  • the intermediate store (16) consists in the best case of a conically shaped one Double helix, as shown in Figure 2.
  • the two connecting wires (5) and (6) The double helix is one with the two phases of the high frequency voltage corresponding HF generator connected. Reflect the inner walls of the double helix the ions in the same way as the inner walls of a high-frequency multipole rod system, but with the double helix, the reflective pseudo-potential by constant spacing of the filaments even in the case of a conical system are kept at the same level, unlike multi-pole rod systems in which the level of the pseudo-potential decreases towards the open end of the cone.
  • the Conical shape creates a permanent propulsion of the ions towards the more open end of the cone, this drive is due to a weak pseudo-potential in the axial direction given.
  • the buffer (16) is on both sides by reflective electrical potentials locked. At the input to the buffer there is a real potential between Scraper (15) and the center potential of the high-frequency voltage. At the exit can be by a double spiral (7a), as shown in Figure 3, achieve a cheaper deal.
  • the double spiral is with the same high frequency voltage connected, which also supplies the double helix, thereby a reflective pseudo-potential that has a much shorter range than a real potential with extensive expansion.
  • the double spiral can, for example generated by vapor deposition of a spiral conductor on an insulator become. The insulator can in turn be easily attached to the wall of the chamber (17) be attached.
  • the double spiral forms part of a switching lens, which with a central aperture (8) Is provided. If the middle aperture is switched to an ion-repellent potential, so the exit is closed. But if an absorbing potential is created, so the exit is open. The ions from near the lens opening are sucked in, accelerated into the lens, focused, and decelerating into the next buffer (18) has risen.
  • Both buffers (18) and (20) are both in the main chamber (19) of the vacuum system by a turbomolecular pump via nozzle (27) is pumped.
  • Both buffers (18) and (20) have a structure like that Buffer (16), only the input-side potential difference is not from Scraper (15), but from the last aperture of the previous lens Stage formed.
  • the output from the buffer store (20) brings the ions into the ion trap mass spectrometer, that from two end caps (21) and (23) and from the ring electrode (22) exists.
  • the function of the ion trap mass spectrometer is discussed here not discussed further since it is known to any relevant specialist. It should but it should be noted that the filling of such an ion trap mass spectrometer is very critical, since the function is above a threshold for the filling quantity of the mass spectrometer is adversely affected by space charge effects. In particular, the mass resolution decreases.
  • a batch of electrophoresis contains only 10 femtomoles of a substance, this is 6x10 9 molecules.
  • 10 Femtomoles of a substance are extremely little, this small amount is hardly sufficient for UV detection.
  • a stain on a gel electrophoresis plate needs at least 100 picomoles to 10 micromoles to be visible after staining, i.e. at least 10,000 times more substance for visual detection.
  • the molecules of this 10 femtomol substance are practically completely ionized in the electrospray ion source. If you can now transfer 1/1000 of the ions formed into a buffer in a vacuum, 6x10 6 ions are stored.
  • the numbers in the example are still within the limits of what is feasible and can only be achieved today under favorable conditions. However, it is expected that they can be routinely achieved with advancing technology, experience and development. However, a lot more ions can be stored in a buffer than specified in this example. A well-designed buffer stores around 10 9 ions, a good hundred times the example above. Under the favorable conditions indicated above, all ions of a substance burst that corresponds to approximately one picomole of a substance can still be absorbed into the vacuum. With this number of ions, the ion trap can be filled about 2000 times if the filling is carried out without filtering the ions.
  • the measuring method can best be based on the substance flow of an electrophoresis chromatogram be described, as shown in Figure 5. It it is assumed that it is a mixture of peptides that consists of an unknown protein was made by cutting with trypsin. This Procedure is widely used in biochemistry and is standard for identification applied by proteins. As soon as a first through the substance detector (12) Substance thrust (a) of this peptide mixture has been determined, the outcome of the first intermediate store (16) is closed so that the ions of the substance surge (a) can be stored in it. Are the ions of the substance surge (a) Completely ingested, about 30 milliseconds are waited to to complete the thermalization, and the ions of this substance boost (a) then forwarded to the last buffer (20) and stored there.
  • the ions of the substance boost (b) are stored in the intermediate store (18) and the ions of the substance boost (c) in the intermediate storage (16).
  • the buffer (20) simply completely emptied by the high frequency voltage for about 20 milliseconds is switched off.
  • the ions from the buffer (18) transferred to the buffer (20) and analyzed from there.
  • the ions from the intermediate store (16) are brought into the intermediate store (18), and the buffer (16) again stands for the storage of the ions new substance boosts are available.
  • the buffers can hold a very large amount of ions, because at harmful effects of space charge were observed to a very limited extent become.
  • the buffer memory is sufficient, as explained above by the numerical example, well for about 2000 unselected fillings of the ion trap, like them for the acquisition of simple mass spectra. On the one hand stands mostly not as much test substance available to use with a Substance boost to really fill the memory.
  • the Recording the daughter spectra of selected parent ions only the selected ones Parent ions are stored in the ion trap and the remaining ions are destroyed is the number of daughter spectra (and grandchild spectra) for this filtering storage according to the concentration of the parent ions (or even daughter ions) much less.
  • capillary electrophoresis deliver appropriate flare-ups, but also liquid chromatography, especially one with microcolumns. Even gas chromatography can be used in this way it may be favorable for the latter to increase the number of buffers increase.
  • the detection of the batches of substances need not be carried out by UV detectors.
  • splitting a partial stream can be analyzed in any commercially available detector, to detect the flare-ups.
  • the flame ionization detector common in gas chromatography (FID) can be used.
  • FID gas chromatography
  • it can also be a double ion source be used in the case of a partial ion flow for the detection of the substance flare is branched off.
  • Part of the ion current can also be transferred after the ions have been transferred branched off in a vacuum and measured.
  • the batches of substances also do not require physico-chemical separation processes to be delivered.
  • the batches of substances can also be obtained from pulsed pyrolysis, for example the well-known Curie point pyrolysis, or from desorption originate, which were induced by laser pulses. In this case there is a detection the relapses are not necessary because the times for the relapses to occur are already known.
  • the thermalization should continue in its own buffer , two buffers are sufficient, one for thermalization and one for the delivery of the mass spectrometer. Are for pyrolysis but generally very large buffers are required because of pyrolysis mixtures are very complex and many subsequent examinations, often with selective Saving rare ion types, need.
  • This invention is special for the investigation of ions from pyrolysis processes helpful.
  • the substances in the pyrolysis vapors range up to very high molecular weights. These molecules must not be hit by walls, otherwise they will immediately condense out in the form of the known pyrolysis tar. Rather, you need to be ionized immediately, for example by chemical ionization at atmospheric pressure (APCI). As ions, they can then be guided more smoothly than in Form of neutral molecules. The longer storage for several consecutive Examinations are even only possible in the form of ions.
  • APCI chemical ionization at atmospheric pressure
  • That kind of Ionization is particularly beneficial for pyrolysis vapors and desorption vapors, however also for substances that were separated by gas chromatography.
  • the introduction of the ions into the vacuum can also proceed differently than in FIG. 4 shown. They are simple, nozzle-like openings, for example such, with great success with a diameter of 30 micrometers, which were essential larger pumps require than the input capillaries described above.
  • the inlet capillary (13) can also be much shorter, but with a smaller inner diameter, be trained.
  • the gas flow into the vacuum system is then a lot less, and the differential pump stage (14) can be completely saved.
  • the input capillary (13) then leads the ions directly into the first buffer (16) of the differential pump chamber (17).
  • the cheapest way of introducing the ions into the vacuum - opening, wide capillary, narrow capillary - depends on how narrow space the ions are formed and how many ions are formed.
  • the number of buffers in the main vacuum chamber (19) can of course be adapted to the measurement problem. There can only be one cache there be present, for example for the analysis of pyrolysis vapors or desorption ions, four or more buffers can also be installed, if it is primarily the analysis of complex mixtures with fast separation acts. Because the ions are relatively lossless from one storage to the next can be transferred, the number of buffers can be freely selected.
  • the ion trap mass spectrometer (21, 22, 23) can also by other types of Mass spectrometers are replaced.
  • mass spectrometers for recording high-resolution mass spectra ion cyclotron resonance mass spectrometers of primary ions or secondary (daughter) ions are suitable (ICR or FTMS) in a particularly good one Wise. Since the acquisition of mass spectra depends on the requirements of the mass range and mass resolution with the ICR spectrometer take a particularly long time can is a particular advantage for ICR mass spectrometers due to the invention given.
  • mass spectrometers especially all types of Tandem mass spectrometers can be used. Because this mass spectrometer can be supplied with a continuous ion current here the switching lens of the buffer (20) can be controlled so that a long Time continuous discharge is given.
  • the mass spectrometry specialist can with knowledge of his special field within mass spectrometry easily further examples of the advantages of using this invention.
  • Excerpt from BFA 21/95 "Coupling the ion source with chromatographic or electrophoretic separation processes in the substance feeder results in a further advantage of this arrangement.
  • the ions from individual batches of substance can be stored over a long period of time and examined by mass spectrometry by reducing the outflow rate of the ions the needs of the mass spectrometer are adapted.
  • the ions can in successive filling and examination periods under different Aspects are examined. So it is possible to start with a normal mass spectrum to measure, and in subsequent steps daughter ion spectra of all occurring to generate ion types. It’s another benefit of caching, that the period of time for filling can be greatly reduced, and thus a faster sequence in the acquisition of the spectra is achieved.
  • the ion source can in particular be coupled with devices for sample separation, for example with capillary electrophoresis.
  • the capillary electrophoresis then delivers time-separated batches of substance for a short period of time in a very concentrated manner.
  • the intermediate storage of the ions in the first double helix 8 can then be used particularly cheaply to store the ions of a substance for several fillings of the ion trap, which enables numerous MS / MS investigations of daughter ion spectra of different parent ions.Even MS / MS / MS investigations with grandchildren spectra can be carried out, the latter being special Interest in amino acid sequence analysis of proteins.
  • the electrophoresis run can easily be interrupted for a longer period of time by switching off the voltage.
  • Claim 18 from BFA 25/95 "Method according to one of claims 15 to 17, characterized in that the arrangement is used for storing the substance ions of a chromatographic or electrophoretically separated substance batch.”

Landscapes

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  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen für die Zwischenspeicherung von Ionen, die einer massenspektrometrischen Untersuchung zugeführt werden sollen. Eine solche Zwischenspeicherung von Ionen in einem Hochfrequenz-Multipol-Stabsystem für deren Analyse in einer Hochfrequenz-Quadrupol-lonenfalle ist aus US 5 179 278 bekannt.
Die Erfindung besteht darin, die an sich bekannte Zwischenspeicherung für solche Ionen zu verwenden, die in einer lonenquelle aus zeitlich getrennt zugeführten Schüben einzelner Substanzen oder Substanzgemischen gewonnen werden. Der Zwischenspeicher nimmt dabei genügend Ionen eines Substanzschubes für mehrere nachfolgende massenspektrometrische Untersuchungen auf, so daß eine massenspektrometrische Charakterisierung der Substanzen, die auch verschiedenartige Meßmethoden erfordern kann, in gewünschtem Maße ermöglicht wird.
Insbesondere sollen Ionen von elektrophoretisch oder chromatographisch getrennten Substanzschüben solange zwischengespeichert werden können, bis die massenspektrometrischen Untersuchungen in gewünschtem Umfang abgeschlossen sind. Mehrere Zwischenspeicher können die Ionen aus mehreren schnell aufeinanderfolgenden Substanzschüben aufnehmen. Aber auch kurzdauernde Substanzschübe aus laser-desorptiven oder pyrolytischen Vorgängen können durch Zwischenspeicherung eingehend untersucht werden.
Allgemeiner Stand der Technik
Die Speicherung von Ionen in Hochfrequenz-Quadrupol-Stabsystemen ist im Prinzip seit den Zeiten der Erfindung dieses Prinzips durch Wolfgang Paul bekannt.
Eine Anwendung dieser Speicherung ist in US 5 179 278 beschrieben. Hier werden Ionen aus einer lonenquelle vor ihrer Analyse in einer Hochfrequenz-Quadrupol-lonenfalle in einem Hochfrequenz-Multipol-Stabsystem zwischengespeichert. An dem Hochfrequenz-Multipol-Stabsystem wurden zur Speicherung der Ionen an beiden Enden Aperturblenden mit reflektierenden elektrischen Potentialen angebracht. Die Zwischenspeicherung dient der Sammlung von Ionen auch in derjenigen Zeitperiode, in der die lonenfalle für die Analyse der Ionen benutzt wird, und daher keine Ionen aufnehmen kann. Es wird damit der zeitliche Ausnutzungsgrad sowohl der lonenquelle wie auch der lonenfalle erhöht. In US 179 278 wird dabei durch Berechnungen der Speicherfähigkeiten von Hochfrequenz-Multipol-lonenfallen und Hochfrequenz-Quadrupol-Stabsystemen abgeschätzt, daß je nach Ausführung des Stabsystems in dem Stabsystem die Ionen für weit mehr als nur eine Füllung der lonenfalle zwischengespeichert werden können, es wird jedoch ausdrücklich betont, daß in der Speicherung von mehr Ionen als für eine Füllung der lonenfalle kein Sinn gesehen werde ("there is little point in collecting more than the 1.1x107 ions that the ion trap can accept", Spalte 5, Zeile 22 ff.).
Die ungefilterte Zwischenspeicherung von Ionen ergibt jedoch, wie auch schon in US 5 179 278 durch Zahlenbeispiele ausgeführt wurde, an sich keine bedeutende Verbesserung, da sich mit dem Verfahren eine maximale Verbesserung des Ausnutzungsgrades von lonenquellen oder lonenfallen unter günstigsten Umständen um einen Faktor 2 ergibt, wie folgender Betrachtung entnommen werden kann: Liefert die lonenquelle einen so geringen lonenstrom, daß die Zeit der Befüllung der lonenfalle weitaus länger dauert, als die Zeitdauer der Analyse in der lonenfalle, so stellt die Zwischenspeicherung praktisch keine Verbesserung dar, da das Sammeln während der Analysezeit kaum einen Gewinn bringt. Liefert die lonenquelle einen so hohen lonenstrom, daß die Zeit der Befüllung sehr kurz ist im Vergleich zur Zeitdauer der Analyse, so ergibt sich wiederum keine Verbesserung, da das Sammeln während der Analysezeit keinen Sinn macht. Nur wenn die Zeitdauer der Befüllung etwa gleich der Zeitdauer der Analyse ist, ist das Sammeln der Ionen während der Analyse sinnvoll. Es muß für die Verbesserung um einen Faktor 2 aber noch zusätzlich die Bedingung erfüllt werden, die lonenfalle aus dem Zwischenspeicher heraus sehr schnell befüllen zu können. Nur wenn diese Befüllungszeit aus dem Zwischenspeicher sehr kurz ist gegenüber der Zeitdauer der Analyse, läßt sich der maximal mögliche Faktor 2 zur Verbesserung der Ausnutzung erreichen.
Es ist jedoch so, daß Hochfrequenz-Quadrupol-lonenfallen heutzutage außerordentlich schnell arbeiten. Im Massenbereich bis hinauf zu 500 atomaren Masseneinheiten kann ein Spektrum in etwa 15 Millisekunden aufgenommen werden. Selbst für den Massensbereich bis hinauf zu 2000 atomaren Masseneinheiten, der heute insbesondere für biochemische Probleme interessant wird, kann die lonenfalle mit Untersuchungszeiten von etwa 100 Millisekunden arbeiten. Dagegen dauert die Befüllung der lonenfalle aus den als Zwischenspeicher benutzten Hochfrequenz-Multipol-Stabsystemen, wie bereits in US 5 179 278 angegeben, einige 10 Millisekunden, ist also in jedem Falle vergleichbar mit den Zeiten der lonenanalyse.
Diese Verhältnisse sind auch bereits den Zahlenbeispielen in US 5 179 278 zu entnehmen und waren daher auch dem Erfinder bekannt. Der Nutzen der Zwischenspeicherung wird in US 5 179 278 denn auch hauptsächlich darin gesehen, im Zwischenspeicher bereits unerwünschte Ionen ausfiltern zu können. Die Hauptansprüche sind daher bereits so formuliert, nur erwünschte Ionen zwischenzuspeichern, und unerwünschte Ionen von der Speicherung auszuschließen. Für die Filterung der erwünschten Ionen werden verschiedene Methoden angeführt. Erst durch diese filternde Zwischenspeicherung wird der Nutzungsgrad ganz wesentlich erhöht. (Zur Zeit der Erfindung US 5 179 278 war es noch nicht bekannt, daß man in der lonenfalle selbst beim Einspeichern der Ionen bereits unerwünschte Ionen ausfiltern kann).
Für die Ionen aus solchen lonenquellen, die außerhalb des Vakuumsystems lokalisiert sind, und deren Ionen in das Vakuumsystem eingeführt werden, kann das Hochfrequenz-Multipol-Stabsystem auch zur Thermalisierung der während der Einführung beschleunigten Ionen benutzt werden, wie aus US 4 963 736 hervorgeht. US 4 963 736 ist zwar auf die Verwendung in Quadrupol-Massenspektrometern beschränkt, doch liegt es auf der Hand, dieses Verfahren auch für andere Massenspektrometer anzuwenden, die mit Ionen homogener kinetischer Energie arbeiten.
Zwischenspeicherung und Thermalisierung können jedoch nicht nur in Hochfrequenz-Multipol-Stabsystemen vorgenommen werden. Vom Anmelder dieser Patentanmeldung ist in Anmeldung Nr. 195 23 859.1 beim Deutschen Patentamt eine neue Klasse von ionenoptischen Systemen vorgestellt worden, die als Führungssysteme, Speichersysteme und Thermalisierungssysteme verwendet werden können. Der beschreibende Text dieser Anmeldung soll hier vollinhaltlich eingeschlossen werden.
Die Möglichkeit der Zwischenspeicherung von Ionen ist bis auf das zitierte Patent bisher noch nicht weiter verfolgt worden, wenn auch Systeme für die Thermalisierung und Führung von Ionen inzwischen weitere Verbreitung gefunden haben und seit Anfang dieses Jahres in kommerziellen Massenspektrometern verschiedener Art Anwendung finden.
Andererseits ist es ein bisher ungelöstes massenspektrometrisches Problem, die massenspektrometrischen Meßverfahren an die immer kürzer werdenden Substanzschübe moderner Substanztrennverfahren anzupassen. Separationsverfahren wie Kapillarelektrophorese und Flüssigkeitschromatographie mit Mikrokapillarsäulen werden aus Gründen der Zeitersparnis zu immer schneller arbeitenden Verfahren entwickelt. Sie liefern heutzutage die aufgetrennten Substanzen in Schüben, die nur noch einige 10 bis 100 Millisekunden dauern. Die Massenspektrometrie ist gerade noch in der Lage, einzelne Übersichtsspektren der Substanzen aus den Substanzschüben zu liefern.
Für die massenspektrometrischen Untersuchungen an größeren organischen Molekülen, vor allem an Biomolekülen und Polymeren, werden aber heute immer kompliziertere massenspektrometrische Meß- und Charakterisierungsverfahren eingesetzt. Dabei ist es häufig notwendig, mehrere verschiedene Meßverfahren nacheinander einzusetzen, wobei die nachfolgenden Meßverfahren häufig von den vorausgehenden abhängen und von deren Ergebnissen gesteuert werden müssen. Ein Beispiel dazu ist das Verfahren zur Messung der Bruchstückionen (oder Tochterionen) ausgewählter Primärionen (oder Elternionen), für das zunächst das Primärionenspektrum aufgenommen werden muß, woraus dann erst die Elternionen bestimmt werden. Noch komplizierter wird es bei der Aufnahme von Enkelionenspektren an ausgewählten Tochterionen.
Diese komplizierten massenspektrometrischen Meßverfahren lassen sich heute noch gar nicht mit physiko-chemischen Trennverfahren koppeln. Auch andere Formen der schubartigen Zuführung von Substanzen oder Substanzgemischen lassen sich mit diesen Verfahren nicht koppeln, da diese Verfahren bis heute eine kontinuierliche Zuführung der Substanzen über die Zeitdauer aller Messungen hinweg verlangen. Obwohl die einzelnen Meßverfahren nur jeweils einige 100 Millisekunden dauern, und eine sofortige Auswertung der Spektren durch die moderne Datenauswertung in Reichweite ist, kommen selbst bei automatischer Sofort-Auswertung sehr schnell viele Sekunden Meßdauer zusammen, ganz abgesehen davon, daß häufig mehrfache Wiederholungen der Messungen zur Verbesserung der Signal-zu-Rausch-Verhältnisse und zur Bestätigung der Meßergebnisse wünschenswert sind.
Es bleibt also ein ungelöstes Problem, die Substanzen aus den Substanzschüben mit einmaliger Zuführung, also geringstem Substanzverbrauch, möglichst umfassend unter Ausnutzung der heute möglichen massenspektrometrischen Untersuchungsmethoden wie niederauflösende Massenspektren, hochauflösende Massenspektren, Neutralverlustspektren, Tochterionenspektren (MS/MS) ausgewählter Elternionen oder sogar Enkelionenspektren (MS/MS/MS) ausgewählter Töchter charakterisieren zu können. Die Arten der wünschenswerten Untersuchungen können sogar noch wesentlich erweitert werden, wenn Reaktantgase zugeführt und die entstehenden Produkt-Ionen wiederum durch die verschiedenen Verfahren analysiert werden, wodurch Aussagen über die Faltungsstrukturen komplizierter Moleküle möglich werden.
Aufgabe der Erfindung
Es ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zu finden, mit denen Substanzen aus einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Substanzschüben moderner Substanz-Zuführungssysteme in vielfältiger Weise mit verschiedenartigen massenspektrometrischen Untersuchungsmethoden möglichst umfassend auf verschiedenartige Eigenschaften hin untersucht werden können, ohne die Zuführung der Substanzen unter Erhöhung des Substanzverbrauchs und unter Verlängerung der Analysendauer mehrmals wiederholen zu müssen.
Die möglichst umfassende Untersuchung verschiedenartiger Eigenschaften werde hier kurz - der Literatur folgend - mit "Charakterisierung der Substanz" bezeichnet.
Die "Substanzschübe" werden durch die kurze Zeitdauer charakterisiert, in der die Ionen einer Substanz für Messungen zur Verfügung stehen, wobei die Kürze der Zeitdauer relativ zur Gesamtzeit der Messungen zu sehen ist.
Bei den Zuführungssystemen kann es sich beispielsweise um elektrophoretische oder chromatographische Trennsysteme, aber auch um Laser-Desorptionen an Oberflächen, um schnelle Pyrolyseverfahren oder um andere Verfahren handeln, bei denen Substanzschübe erzeugt werden. Dabei soll es möglich sein, die Substanzen aus einzelnen Substanzschüben getrennt, oder aber auch mehrere Substanzschübe zusammengefaßt, unter verschiedenen Gesichtspunkten eingehend zu untersuchen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Aufgabe wird mit einem Verfahren nach Anspruch 1 und einer Vorrichtung nach Anspruch 13 gelöst.
Es ist der Grundgedanke der Erfindung, den an sich bekannten, aber bisher nur in Verbinderung mit lonenfilterung genutzten Zwischenspeicher für Ionen so auszulegen, daß er die Ionen eines Substanzschubs, der der lonenquelle zugeführt wird, möglichst vollständig aufnehmen kann, und die Ionen des Zwischenspeichers dann portionenweise massenspektrometrisch mit verschiedenartigen Verfahren zu untersuchen. Der Zwischenspeicher soll also so viele Ionen eines Substanzschubs des Zuführungssystems aufnehmen können, daß in aufeinanderfolgenden massenspektrometrischen Untersuchungen dieser Ionen aus dem Zwischenspeicher heraus mit verschiedenartigen Verfahren eine gewünschte Charakterisierung der Untersuchungssubstanz ermöglicht wird. Für jede Untersuchung wird dabei nur eine Teilmenge der Ionen aus dem Zwischenspeicher entnommen.
Eine solche Zwischenspeicherung der Ionen hat bis heute nicht nahegelegen. Auch heute noch ist die lonisierung durch Elektronenstoß die vorherrschende lonisierungsmethode für die massenspektrometrische Identifizierung von Substanzen, praktisch alle Massenspektren der kommerziell erhältlichen Spektrenbibliotheken sind so gewonnen. Die Erkennung einer Substanz durch diese lonisierungsmethode beruht aber darauf, daß nicht nur Molekülionen, sondern auch Fragmentionen in bestimmten Proportionen gebildet und gemessen werden. Diese Messung muß schnell geschehen, da ein großer Teil dieser Ionen nicht stabil ist und im Laufe der Zeit zerfällt. Die bekannten Unterschiede der Massenspektren einer Substanz, die mit Magnetfeld-Massenspektrometern, Quadrupol-Massenspektrometern und lonenfallen-Massenspektrometern gemessen wurden, beruhen weitgehend auf diesem Zerfall metastabiler Ionen, der wegen der verschiedenen Laufzeiten der Ionen in diesen Arten der Massenspektrometer verschieden weit fortschreitet, und so scheinbar das Massenspektrum verzerrt. Eine noch viel länger dauernde Zwischenspeicherung dieser Ionen würde das Massenspektrum noch weiter verzerren und einer Identifizierung der Substanzen entgegenstehen.
Für viele der heutigen massenspektrometrischen Untersuchungen an biochemischen Substanzen trifft das aber nicht mehr zu. Die dazu notwendigen lonisierungsverfahren wie das Elektrosprühen (ESI), chemische lonisierung bei Atmosphärendruck (APCI) oder die matrixunterstützte ionisierende Laser-Desorption (MALDI) erzeugen im wesentlichen nur unfragmentierte Ionen des ursprünglichen Moleküls, es werden ohne besondere Maßnahmen praktisch keine Fragmentionen gebildet. Für eine Charakterisierung dieser Substanzen unter Einsatz dieser lonisierungsarten ist es daher mindestens notwendig, die Ionen während der massenspektrometrischen Analyse nachträglich zu fragmentieren, wie es durch die verschiedenartigen MS/MS-Verfahren wie Stoßgasfragmentierung in lonenfallen oder in Stoßkammern von Tandem-Massenspektrometern (CID), Photonenfragmentierung in lonenfallen (PID), oder durch "post source decay" (PSD) in Flugzeitspektrometern geschieht. Intensivere Charakterisierungen verlangen sogar noch weitergehende Untersuchungen, wie MS/MS/MS oder Studien darüber, an welchen Stellen des ionisierten Moleküls Reaktantgasmoleküle angebunden werden können.
Die Erfindung findet ihre Anwendung daher primär durch diese neuen Arten der lonisierung. Es soll jedoch diese Erfindung ausdrücklich nicht nur auf diese Arten der lonisierung beschränkt werden. Auch bei den bisher üblichen lonisierungsarten, etwa bei der Gemischanalyse mit Elektronenstoß und MS/MS, ergeben sich große Vorteile aus dieser Erfindung.
Es können für die Untersuchungen verschiedenartige massenspektrometrische Prinzipien verwendet werden, wie beispielsweise Hochfrequenz-Quadrupol-lonenfallen, ICR-Massenspektrometer, oder auch Tandem-Massenspektrometer verschiedener Arten, wie beispielsweise das Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer ("Triple Quad"). In Tandem-Massenspektrometern werden die Untersuchungs-lonen ("Elternionen") beim Durchfliegen eines ersten Massenspektrometers ausgefiltert, in einer Stoßzelle fragmentiert, und in einem zweiten Massenspektrometer nach ionisierten Bruchstücken ("Tochterionen") analysiert. In Hochfrequenz-Quadrupol- wie auch in ICR-lonenfallen werden diese Schritte in derselben Speicherzelle nacheinander ausgeführt, weswegen man auch von "zeitlicher Tandem-Massenspektrometrie" ("tandem in time") spricht.
Bei diesen Untersuchungen können verschiedenartige massenspektrometrische Untersuchungsverfahren zur Anwendung kommen, wie die Aufnahme von jeweils nieder- und hochaufgelösten Primärspektren, Neutralverlustspektren, Tochterionenspektren ausgewählter Elternionen (MS/MS) oder sogar Enkelionenspektren ausgewählter Töchter (MS/MS/MS). Die Arten der Untersuchungen können sogar noch wesentlich erweitert werden, wenn den untersuchten Ionen Reaktantgase zugeführt und die entstehenden Produkt-Ionen analysiert werden. Die Reaktantgase können wiederum im Massenspektrometer, aber auch bereits im Zwischenspeicher zugeführt werden.
Bei den Substanzschüben kann es sich sowohl um Schübe sauber separierter Einzelsubstanzen aus physiko-chemischen Trennverfahren handeln, wie auch um Schübe aus Substanzgemischen mit vielen einzelnen Substanzen, wie sie etwa in pulsartig durchgeführten pyrolytischen Zersetzungsprozessen oder durch Laserpulse desorbierende Oberflächenanalysen frei werden. Auch Ionen aus matrix-unterstützter Laser-Desorption (MALDI), insbesondere nach zweidimensionaler Trennung durch Gel-Elektrophorese, gehören zu dieser Gruppe von Zuführungssystemen mit Substanzschüben.
Bei Substanzschüben aus Separationsverfahren kann das Separationsverfahren nach der Füllung des Speichers mit Ionen abgeschaltet werden, wenn ein nächster Substanzschub naht, bevor die vorausgehende Substanz fertig untersucht ist. Sowohl elektrophoretische wie auch flüssigkeitschromatographische Verfahren können unterbrochen werden, ohne daß die Güte der Separation wesentlich verschlechtert wird. Auch die gaschromatographische Trennung kann man unterbrechen, aber hier leidet die nachfolgende Separation unter schlechterer Substanztrennung, da die Substanzen im Trägergas viel leichter diffundieren können, und das Abschalten des Trägergasflusses die Druck- und Volumenverhältnisse jedesmal drastisch ändert. Bei zweidimensionaler Gel-Elektrophorese ist die Trennung bei der Analyse bereits abgeschlossen, die Substanzschübe werden durch den Vorschub der Trägerplatten gegenüber dem Abtaststrahl des Lasers erzeugt.
Da nicht alle Separationsverfahren ohne Schaden unterbrechbar sind, auf jeden Fall aber die Unterbrechungen die Analysendauer verlängern, ist es ein weiterer Grundgedanke der Erfindung, mehrere Zwischenspeicher für Ionen aus mehreren Substanzschüben aus solchen elektrophoretischen oder chromatographischen Trennverfahren im Vakuumsystem des Massenspektrometers zu verwenden. Es können damit die Ionen aus Separationsverfahren auch dann ohne Abschalten des Separationsverfahrens zwischengespeichert werden, wenn einige Substanzschübe in so kurzen Zeiten aufeinanderfolgen, daß die Zeit zwischen den Schüben für eine gewünschte massenspektrometrische Charakterisierung nicht ausreicht. Das Auftreten von Situationen, in denen das Separationsverfahren selbst dann unterbrochen werden muß, wird wegen der normalerweise ungleichen Verteilung der Substanzschübe über die Separationszeit ganz wesentlich herabgesetzt.
Der Zwischenspeicher in US 5 179 278 arbeitet als Durchgangsspeicher, die jetzige Erfindung soll aber ausdrücklich nicht nur auf diese beschränkt werden. Durchgangsspeicher bilden aber die einfachste Art der Zwischenspeicherung. Sie haben einen als solchen festgelegten Eingang für die Ionen, die gespeichert werden sollen, und einen normalerweise gegenüberliegenden Ausgang, durch den die Ionen den Speicher verlassen.
Es ist ein weiterer Grundgedanke der Erfindung, den Durchgangsspeicher so auszubilden, daß er die Ionen mit einem permanenten oder temporären Antrieb in Richtung lonenausgang treibt. Dadurch wird die Befüllung des Zwischenspeichers einfacher, da die Ionen sofort vom loneneingang hinweggetrieben werden und sich dort keine Raumladungssperre ausbilden kann. Außerdem wird die Entnahme von Ionen einfacher und schneller, da die Ionen bereits vor dem Ausgang versammelt sind und dort durch den lonenantrieb eine bestimmte lonendichte aufrecherhalten wird. Ohne einen solchen Antrieb der Ionen in Richtung Ausgang werden die Ionen, wie in US 5 179 278 geschildert, innerhalb des Zwischenspeichers mit thermischer Geschwindigkeit zwischen den reflektierenden Potentialen an loneneingang und lonenausgang längs der Achse des Stabsystems hin- und herpendeln, wodurch die Leerungszeit auf mindestens zwei volle Pendelbewegungen, das heißt auf einige 10 Millisekunden, gedehnt wird.
Der Antrieb der Ionen innerhalb des Zwischenspeichers in Richtung lonenausgang kann auf verschiedene Weise verwirklicht werden. So ist es bei allen Zwischenspeichern möglich, ein schwaches elektrisches Gleichfeld längs der Achse zu erzeugen, das die Ionen Richtung Ausgang treibt, wo sie während der Speicherphase in erwünschter Weise durch das schaltbare Reflektionspotential am Ausfluß gehindert und so gespeichert werden.
In Multipol-Stabsystemen kann ein Gleichfeld erzeugt werden, indem alle Stäbe, zusätzlich zu ihrer Versorgung mit einer Hochfrequenzspannung, gleichsinnig von einem Gleichstrom durchflossen werden. Dabei ist es vorteilhaft, die Stäbe aus einem Widerstandsmaterial zu fertigen. Eine Erzeugung einer achsialen Gleichfeldkomponente in Ringsystemen oder in Doppelhelix-Speichern ist in der deutschen Patentanmeldung Nr. 195 23 859.1 beschrieben.
Andererseits kann ein permanenter Antrieb in Richtung lonenausgang auch dadurch erzeugt werden, daß statt eines zylindrischen Speichers ein konischer verwendet wird. Bei einem konischen Multipol-Stabsystem, aber auch bei allen anderen Hochfrequenz-lonenleitsystemen, werden die Ionen innerhalb des Speichers durch ein schwaches Pseudo-Potentialfeld permanent in Richtung der Öffnungserweiterung getrieben. Allerdings ist es ein Nachteil des konischen Multipol-Stabsystems, daß der Pseudo-Potentialwall zum Einsperren der Ionen zum weiter geöffneten Ende des Stabsystems hin immer niedriger wird.
Diesen Nachteil hat der in der o.g. Anmeldung beschriebene, als Doppel- oder Mehrfachhelix ausgebildete Speicher nicht, wenn dabei die Windungen der Helices auch im weiter geöffneten Bereich des Konus den gleichen Abstand behalten. Die Doppelhelix und deren höhere Abkömmlinge wie Vierfachhelix oder Sechsfachhelix eignen sich daher in besonders guter Weise als Zwischenspeicher.
Eine Anordnung von mehreren Zwischenspeichern in Reihe kann leicht durch solche Durchgangsspeicher verwirklicht werden. Bei der Benutzung der Reihenanordnung werden die Ionen des ersten Substanzschubes bis zum letzten Speicher vor dem Massenspektrometer durchgeleitet, und von dort aus massenspektrometrisch in der beschriebenen Weise untersucht. Die Ionen eines kurz darauf erscheinenden Substanzschubes werden bis zum zweitletzten Speicher geleitet und dort gespeichert, wenn die Analyse des vorhergehenden Schubes noch nicht abgeschlossen ist. Die Ionen eines dritten Substanzschubes können in einem drittletzten Speicher untergebracht werden. Ist dann die Analyse der Ionen im letzten Speicher abgeschlossen, so wird dieser letzte Speicher durch kurzfristiges Abschalten der Hochfrequenzspannung vollständig entleert, und die Ionen des vorletzten Speichers werden hierher überführt. In analoger Weise werden dann auch die Ionen der anderen Speicher weitergereicht ("Eimerkettenprinzip").
Der Ausfluß der Ionen aus dem Zwischenspeicher wird durch das Öffnen des Reflektors am Ende des Zwischenspeichers ermöglicht. Es ist günstig, hier Schaltlinsen einzusetzen, die die ausfließenden Ionen aus einem kleinen Bereich des Zwischenspeichers absaugen und in die nächste Stufe der Verarbeitung dieser Ionen hinein fokussieren können. Der kleine Einzugsbereich der Schaltlinse wird durch das Nachströmen der Ionen wieder gefüllt, vor allem dann, wenn die Ionen einem Vortrieb zum Ausgang unterliegen.
Bei gleichen Verhältnissen an der Schaltlinse ist damit die Ausflußgeschwindigkeit der Ionen nur noch von der lonendichte im Zwischenspeicher, also vom Füllgrad, abhängig. Dieser Zusammenhang kann experimentell bestimmt und beispielsweise dazu benutzt werden, die Füllung von lonenfallen in aufeinanderfolgenden Füllungen immer gerade bis zur Raumladungsgrenze zu steuern, oder aber auch durch Veränderung der Linsenspannung einen gleichmäßigen Ausfluß zu erzeugen, wie er etwa für ein nachfolgenden Tandem-Massenspektrometer gebraucht wird.
Auch die selektive Befüllung einer lonenfalle mit ausgewählten Elternionen bis knapp an die Raumladungsgrenze heran kann so gesteuert werden. Dabei wird während der Befüllung in bekannter Weise eine Filterung der Ionen vorgenommen, meist durch die Einstrahlung eines Frequenzgemisches, das die unerwünschten Ionen aus der lonenfalle treibt, die erwünschten aber in ihr beläßt. Aus dem Primärionenspektrum ist das Verhältnis der ausgewählten Elternionen zur Gesamtladung bekannt, und aus der bekannten Füllgeschwindigkeit und dem bekannten Wirkungsgrad der Filterung kann die Befüllung bis zum optimalen Füllungsgrad gesteuert werden.
Kurze Beschreibung der Bilder
Figur 1 zeigt ein Blockdiagramm eines Massenspektrometers mit zwei Zwischenspeichern gemäß dieser Erfindung. Ein Substanzzuführungssystem führt Substanzen schubweise einer lonenquelle zu, die sich in diesem Beispiel im Vakuumsystem des Massenspektrometers befindet. Als schubweise arbeitende Substanzzuführungssysteme kommen beispielsweise alle chromatographischen und elektrophoretischen Trennverfahren, aber auch pyrolytische oder laser-desorptive Verfahren infrage. Die Ionen aus den Substanzschüben können in den beiden Zwischenspeichern 1 und 2 aufbewahrt werden. Die Ionen des Zwischenspeichers 2 werden portionenweise im Massenspektrometer untersucht, bis eine genügende Charakterisierung der Substanzen des Substanzschubes erreicht ist, oder die Ionen verbraucht sind. Die Zwischenspeicher können durchaus so dimensioniert werden, daß sie lonen für eine große Zahl nachfolgender massenspektrometrischer Untersuchungen aufnehmen können. Raumladungsbegrenzungen spielen bei Zwischenspeichern eine nur untergeordnete Rolle.
Figur 2 zeigt einen solchen Zwischenspeicher, der hier als Doppelhelix (4) ausgelegt ist. Die Doppelhelix (4) befindet sich zwischen dem Linsensystem (1, 2, 3) am Eingang des Zwischenspeichers und dem Linsensystem (7, 8, 9) am Ausgang des Zwischenspeichers. An den Blenden (3) und (7) liegt dabei ein Potential, das die Ionen jeweils in die Doppelhelix zurücktreibt. Die Hochfrequenzspannung für die Speicherung wird über die Anschlüsse (5) und (6) zugeführt. Durch die Schaltung des Potentials an der Linsenapertur (8) können die Ionen aus dem Zwischenspeicher ausgesaugt und einem nachfolgenden System zugeführt werden.
Figur 3 zeigt eine besondere Art der Reflektion der gespeicherten Ionen am Ende der Doppelhelix, hier ausgeführt als HF-versorgte Doppelspirale auf einem isolierenden Träger (7a). Der Träger (7a) ersetzt die Potentialblende (7) der Ausgangslinse in Figur 2. Die Doppelspirale wird durch die gleiche Hochfrequenzspannung versorgt wie die Doppelhelix (4). Die Doppelspirale auf dem Träger (7a) hat gegenüber einer metallisch leitenden Potentialblende (7) den Vorteil einer viel geringeren Reichweite des reflektierenden Pseudo-Potentials, so daß mehr Ionen gespeichert werden können, und die Entnahme der Ionen aus dem Zwischenspeicher schneller vonstatten geht.
Figur 4 gibt eine Anordnung eines Massenspektrometers mit drei Zwischenspeichern als Prinzipskizze wieder, wobei die einzelnen Funktionseinheiten nur symbolisch, und die elektrischen und vakuumtechnischen Versorgungseinheiten überhaupt nicht dargestellt sind. Die lonenquelle befindet sich hier - anders als im Blockschaltbild der Figur 1 - außerhalb des Vakuumsystems des Massenspektrometers. Die schubweise Zuführung der Substanzen wird von einer chromatographischen oder elektrophoretischen Kapillarsäulen-Trenneinrichtung übernommen, wobei hier nur symbolisch die Trennkapillare (10) gezeigt ist. Die Substanzen werden zunächst in einer Detektionseinheit (11) detektiert, die beispielsweise eine UV-Absorptionseinheit sein kann, und dann der Nadel (12) einer Elektrosprüh-lonenquelle zugeführt. Zwischen dieser Nadel (12) und der Eingangskapillaren (13), die die Ionen in das Vakuumsystem überführt, liegt eine Elektrosprüh-Spannung von einigen Kilovolt, durch die sowohl die Trägerflüssigkeit wie auch die darin gelösten Untersuchungssubstanzen versprüht werden. Dabei werden in der Regel die Moleküle der Untersuchungssubstanzen vollständig und fragmentierungsfrei ionisiert.
Durch die Eingangskapillare (13) wird ein kräftiger Strom an Umgebungsgas in die Vakuumkammer (14), die über Stutzen (25) bepumpt wird, gesaugt. In diesem Strom wird ein Teil der Ionen viskos mitgenommen. Der Gasstrom dehnt sich in der Kammer (14) der ersten Differenzpumpstufe adiabatisch aus, wobei die mitgenommenen Ionen auf Geschwindigkeiten von etwa 1000 Metern pro Sekunde beschleunigt werden. Ein Teil der Ionen kann die Vakuumkammer (14) durch die feine Öffnung im Abstreifer (15) verlassen und tritt in die Vakuumkammer (17) der nächsten Differenzpumpstufe ein, die durch den Stutzen (26) bepumpt wird. Die Ionen treten dabei in den Zwischenspeicher (16) ein. In diesem Zwischenspeicher (16) werden die lonen eingefangen, sie verbleiben dort so lange, bis sich ihre kinetischen Energien thermalisiert haben, was bei dem herrschenden Druck von etwa 10-2 Millibar nur wenige 10 Millisekunden dauert.
Die thermalisierten Ionen des ersten Substanzschubes werden dann durch den Zwischenspeicher (18) in den Zwischenspeicher (20) geführt und dort wiederum gespeichert. Aus diesem Speicher werden die Ionen portionenweise in das als Hochfrequenz-Quadrupol-lonenfalle dargestellte Massenspektrometer überführt und dort analysiert. Die lonenfalle besteht aus den beiden Endkappen-Elektroden (21) und (23), und der Ringelektrode (24). Die Ionen werden bei den Analysenverfahren massenselektiv aus der lonenfalle durch die Endkappe (23) ausgeworfen und im lonendetektor (24) gemessen.
Figur 5 zeigt ein Diagramm der Trennung von Substanzen in einem Trennsystem. Die zeitlich getrennten Substanzen (a) bis (i) werden als Substanzschübe der lonenquelle zugeführt und ionisiert. Wird ein Massenspektrometer nach Figur 4 mit drei Zwischenspeichern benutzt, so können die Ionen der rasch aufeinanderfolgenden Substanzschübe (a), (b) und (c) in den letzten (20), vorletzten (18), und drittletzten Zwischenspeicher (16) gebracht und dort gespeichert werden. Die Ionen der Substanzschübe (a), (b) und (c) können dann analysiert werden, bevor Substanzschub (d) eintrifft, dessen Ionen daher wieder im letzten Zwischenspeicher (20) eingelagert werden können. Bevor Substanzschub (e) eintrifft, sind die Ionen von (d) bereits analysiert. Die Schübe (e), (f) und (g) können daher wieder zwischengespeichert werden. Anders aber Substanzschub (h), hier muß, etwa bei der gestrichelten Linie, das Separationsverfahren für kurze Zeit unterbrochen werden, allerdings nur so lange, bis die Ionen des Substanzschubs (e) analysiert sind.
Besonders günstige Ausführungsformen
Die hier geschilderte Ausführungsform betrifft die Kopplung eines lonenfallen-Massenspektrometers mit dem Trennverfahren der Kapillar-Elektrophorese, wie sie insbesondere für die Trennung von Proteinen benutzt werden kann. Die lonisierung erfolgt durch Elektrosprühen an Atmosphärendruck, wodurch sich die im Elektrolyten der Elektrophorese gelösten Proteine fragmentierungsfrei mit praktisch vollständiger Ausbeute ionisieren lassen. Eine solche Anordnung mit drei Zwischenspeichern ist als Prinzipskizze in Figur 4 wiedergegeben. Aus der Prinzipskizze wird jeder Fachmann die Anordnung der meist kommerziell erhältlichen Funktionselemente herstellen können.
Diese Ausführungsform ist insofern besonders günstig, als sie die sehr schnelle Kapillar-Elektrophorese mit ihren sehr kurzdauernden Substanzschüben mit einer Art der Massenspektrometrie koppelt, die sich in vielfältiger Weise variieren läßt, einschließlich der Aufnahme von Tochter- und Enkelionenspektren, und einschließlich der Einschaltung von lonen-Molekül-Reaktionen mit beliebigen Reaktantgasen und der Analyse der Produkt-Ionen. Diese Arten der Untersuchungen brauchen jedoch ihre Zeit, zumal wenn mehrere solche Verfahren in Folge mit Rücksteuerung aus den Ergebnissen der vorangehenden Analysen stattfinden sollen, und waren bis zu dieser Erfindung überhaupt nicht mit schnellen Trennverfahren koppelbar, selbst wenn in den Trennverfahren nur sehr wenige Substanzen aufgetrennt wurden.
Die Prinzipskizze in Figur 4 gibt die Kapillarelektrophorese nur symbolisch durch die Kapillarsäule (10) wieder. Am Ende der Kapillarsäule wird der Substanzfluß detektiert, um die Substanzschübe festzustellen. Die Detektion kann beispielsweise durch eine kommerzielle UV-Absorptionseinheit (11) innerhalb der Kapillare geschehen.
Die Kapillarsäule endet in einer Elektrosprühnadel (12). Zwischen dieser elektrisch leitfähigen Nadel (12) und der Stirnfläche der Eingangskapillare (13) wird eine Elektrosprühspannung von einigen Kilovolt Spannung angelegt. Das an der Spitze der Nadel stark inhomogene elektrische Feld zieht dabei einen praktisch kontinuierlichen Strom winziger Tröpfchen aus der Elektrophoreseflüssigkeit. Es ist dabei zweckmäßig, die Elektrosprühnadel koaxial mit einer zweiten Nadel zu umgeben, die einen Ausgleich der Flüssigkeitsströme herbeiführen kann, da die Elektrophorese einen elektroosmotischen Flüssigkeitsvortrieb liefert, der sehr klein ist und sogar in die Elektrosprühnadel hinein gerichtet sein kann, während die elektrophoretisch wandernden Untersuchungssubstanzen aus der Nadel herauswandern. Die winzigen Flüssigkeitströpfchen sind stark elektrisch aufgeladen und verdunsten rasch, wobei in der Regel in einem noch nicht voll geklärten Mechanismus die großen Substanzmoleküle geladen zurückbleiben.
Die geladenen Tröpfchen und die geladenen Moleküle werden im elektrischen Feld auf die Stirnfläche der Eingangskapillare (13) hin bewegt, wobei ein Gleichgewicht aus Zugkraft des elektrischen Feldes und Bremskraft im umgebenden Gas herrscht. Dieser Vorgang ist als "lonenmobilität" bekannt. Normalerweise wird dem Zwischenraum zwischen Elektrosprühnadel (12) und Eingangskapillare (13) ein angewärmtes, sauberes Gas, meist Stickstoff, zugeführt, um den Verdunstungsvorgang zu begünstigen und den Flüssigkeitsdampf nicht in das Vakuum gelangen zu lassen.
Von der Eingangskapillare (13), die etwa 15 Zentimeter Länge und einen inneren Kapillardurchmesser von 500 Mikrometer hat, wird ein kontinuierlicher Gasstrom in das Vakuum der ersten Differenzpumpkammer (14) des Vakuumsystems transportiert. Dabei wird ein Teil der Ionen viskos in die Eingangskapillare (13) eingesaugt, und von diesen Ionen gelangt wiederum ein Teil ohne entladende Wandstöße bis in die Kammer (14). Im letzten Teil der Kapillare findet eine starke Beschleunigung des Gases durch die adiabatische Ausdehnung statt, durch die die Ionen eine Geschwindigkeit von etwa 1000 Metern pro Sekunde bekommen. In der Kammer wird von einer Vorvakuumpumpe über den Pumpstutzen (25) normalerweise ein Druck von einigen Millibar aufrechterhalten.
In der Kammer (14) kann ein Teil der Ionen, unterstützt von einem leichten elektrischen Feld, die Kammer (14) durchqueren und durch eine feine Öffnung von etwa 1,2 Millimeter Durchmesser in der Spitze des Abstreifers (15) in die nächste Kammer (17) der Differenzpumpeinrichtung gelangen. Diese Kammer (17) wird durch eine Turbomolekularpumpe über Stutzen (26) auf einem Druck von einigen 10-2 Millibar gehalten.
Die durch den Abstreifer (15) in die Kammer (17) eintretenden Ionen werden praktisch verlustfrei vom Zwischenspeicher (16) eingefangen und aufgenommen. Durch den relativ hohen Vakuumdruck von einigen 10-2 Millibar werden ihre kinetischen Geschwindigkeiten in wenigen 10 Millisekunden thermalisiert. Es ist daher zweckmäßig, alle Ionen eines Substanzschubes zunächst in diesem Zwischenspeicher aufzunehmen, sie dort nach Beendigung des Substanzschubes noch für etwa 30 Millisekunden zwischenzuspeichern, und erst dann in die nächsten Speicher (18) oder (20) weiterzuleiten.
Der Zwischenspeicher (16) besteht im optimalen Fall aus einer konisch geformten Doppelhelix, wie sie in Figur 2 dargestellt ist. Die beiden Anschlußdrähte (5) und (6) der Doppelhelix werden mit den beiden Phasen der Hochfrequenzspannung eines entsprechenden HF-Generators verbunden. Die Innenwände der Doppelhelix reflektieren die Ionen in gleicher Weise wie die Innenwände eines Hochfrequenz-Multipol-Stabsystems, doch kann bei der Doppelhelix das reflektierende Pseudo-Potential durch gleichbleibende Abstände der Wendeln auch im Falle eines konischen Systems gleich hoch gehalten werden, anders als bei Multipol-Stabsystemen, bei denen die Höhe des Pseudo-Potentials zum offenen Ende des Konus abnimmt. Die konische Form erzeugt einen permanenten Vortrieb der Ionen zum offeneren Ende des Konus zu, dieser Antrieb ist durch ein schwaches Pseudo-Potential in Achsenrichtung gegeben.
Der Zwischenspeicher (16) ist beidseitig durch reflektierende elektrische Potentiale verschlossen. Am Eingang in den Zwischenspeicher ist es ein reales Potential zwischen Abstreifer (15) und dem Mittenpotential der Hochfrequenzspannung. Am Ausgang kann man durch eine Doppelspirale (7a), wie sie in Figur 3 wiedergegeben ist, einen günstigeren Abschluß erreichen. Die Doppelspirale ist mit der gleichen Hochfrequenzspannung verbunden, die auch die Doppelhelix versorgt, dadurch wird ein reflektierendes Pseudo-Potential erzeugt, das eine viel geringere Reichweite hat als ein reales Potential mit flächenhafter Ausdehnung. Die Doppelspirale kann beispielsweise durch Aufdampfen eines spiraligen Leiters auf einem Isolator erzeugt werden. Der Isolator kann wiederum sehr einfach auf der Wand der Kammer (17) befestigt werden. Die Herstellung einer mechanisch außerordentlich stabilen, aber gasdurchlässigen Doppelhelix ist in der deutschen Anmeldung Nr. 195 23 859.1 beschrieben.
Die Doppelspirale bildet einen Teil einer Schaltlinse, die mit einer Mittelapertur (8) ausgestattet ist. Wird die Mittelapertur auf ein ionenabweisendes Potential geschaltet, so ist der Ausgang verschlossen. Wird aber ein saugendes Potential angelegt, so ist der Ausgang geöffnet. Die Ionen aus der Nähe der Linsenöffnung werden angesaugt, in die Linse hinein beschleunigt, dabei fokussiert, und abbremsend in den nächsten Zwischenspeicher (18) geschnellt.
Die beiden Zwischenspeicher (18) und (20) befinden sich beide in der Hauptkammer (19) des Vakuumsystems, die durch eine Turbomolekularpumpe über Stutzen (27) bepumpt wird. Beide Zwischenspeicher (18) und (20) haben einen Aufbau wie der Zwischenspeicher (16), nur wird die eingangsseitige Potentialdifferenz nicht vom Abstreifer (15), sondern von der jeweilig letzten Apertur der Linse der vorausgehenden Stufe gebildet.
Der Ausgang aus dem Zwischenspeicher (20) bringt die Ionen in das lonenfallen-Massenspektrometer, das aus zwei Endkappen (21) und (23) und aus der Ringelektrode (22) besteht. Auf die Funktion des lonenfallen-Massenspektrometers wird hier nicht weiter eingegangen, da sie jedem einschlägigen Fachmann bekannt ist. Es soll aber bemerkt werden, daß die Befüllung eines solchen lonenfallen-Massenspektrometers sehr kritisch ist, da oberhalb einer Schwelle für die Füllmenge die Funktion des Massenspektrometers durch Raumladungseinwirkungen beeinträchtigt wird. Insbesondere nimmt die Massenauflösung ab. Ab der zweiten Befüllung kann nun der Befüllvorgang aus den Ergebnissen der ersten Spektrenmessung, bei der unter anderem auch die Totalladung in der lonenfalle gemessen wird, und aus der bekannten Abnahme der lonenanzahl im Zwischenspeicher (20) so gesteuert werden, daß keine Überladung der lonenfalle eintritt. Der Beladungsvorgang kann experimentell kalibriert werden.
Enthält ein Substanzschub der Elektrophorese nur 10 Femtomol einer Substanz, so sind das 6x109 Moleküle. 10 Femtomol einer Substanz sind außerordentlich wenig, diese geringe Menge ist kaum hinreichend für eine UV-Detektion. Zum Vergleich: Ein Fleck einer Gel-Elektrophoreseplatte braucht mindestens 100 Picomol bis 10 Mikromol, um nach dem Einfärben sichtbar zu werden, also mindestens 10000mal mehr Substanz für eine visuelle Detektion. Die Moleküle dieser 10 Femtomol Substanz werden in der Elektrosprüh-lonenquelle praktisch vollständig ionisiert. Kann man nun 1/1000 der gebildeten Ionen in einen Zwischenspeicher im Vakuum überführen, so werden 6x106 Ionen gespeichert. Die lonenanzahl einer lonenfalle an der Raumladungsgrenze wird häufig fälschlich mit 106 Ionen angegeben, in Wirklichkeit liegt sie bei einer Hochleistungs-lonenfalle bei nur etwa 3x104 Ionen. Kann man jeweils 10 % einer entnommenen lonenportion in die lonenfalle überführen und dort speichern, so reichen die 10 Femtomol des Substanzschubes für 20 Füllungen der lonenfalle. Dieses Zahlenbeispiel demonstriert die hohe Empfindlichkeit massenspektrometrischer Verfahren.
Die Zahlen des Beispiels liegen allerdings heute noch im Grenzbereich des Machbaren und lassen sich heute nur unter günstigen Verhältnissen erreichen. Es ist jedoch zu erwarten, daß sie mit fortschreitender Technik, Erfahrung und Entwicklung routinemäßig erreicht werden können. In einem Zwischenspeicher lassen sich aber sehr viel mehr Ionen speichern, als in diesem Beispiel angegeben. Ein gut konstruierter Zwischenspeicher nimmt etwa 109 Ionen auf, also gut das hundertfache des obigen Beispiels. Unter den oben angegebenen günstigen Verhältnissen können also immer noch alle in das Vakuum überführte Ionen eines Substanzschubs aufgenommen werden, der etwa einem Picomol einer Substanz entspricht. Mit dieser Anzahl von Ionen kann die lonenfalle etwa 2000mal gefüllt werden, wenn die Füllung ohne Filterung der Ionen vorgenommen wird. Es ist aber gerade die Stärke der Verfahren, nur ausgewählte Ionen zu untersuchen, also die Ionen bei ihrer Einspeicherung in die lonenfalle so zu filtern, daß nur eine einzige lonensorte gespeichert wird. Mit dieser Technik geht die Anzahl der möglichen Füllungen wieder stark zurück.
In dem Zahlenbeispiel wurde angenommen, daß nur jeweils ein Ion aus 10000 für die Analyse zur Verfügung steht. Die anderen 9999 Ionen gehen bei der Überführung ins Vakuum umd in die lonenfalle verloren. Wenn in der Zukunft eine verlustfreiere Überführung möglich sein wird, können möglicherweise Substanzmengen von 1 Picomol oder sogar 100 Attomol entsprechend charakterisiert werden.
Das Meßverfahren kann am besten anhand des Substanzflusses eines Elektrophorese-Chromatogramms beschrieben werden, wie es in Figur 5 dargestellt ist. Es werde angenommen, daß sich um eine Mischung aus Peptiden handelt, die sich aus einem unbekannten Eiweiß durch Schneiden mit Trypsin hergestellt wurde. Dieses Verfahren ist in der Biochemie weit verbreitet und wird standardmäßig für die Identifizierung von Eiweißen angewandt. Sobald durch den Substanzdetektor (12) ein erster Substanzschub (a) dieser Peptidmischung festgestellt worden ist, wird der Ausgang des ersten Zwischenspeichers (16) geschlossen, damit die Ionen des Substanzschubs (a) darin gespeichert werden können. Sind die Ionen des Substanzschubs (a) vollständig aufgenommen, wird noch etwa 30 Millisekunden gewartet, um die Thermalisierung zu vollenden, und die Ionen dieses Substanzschubs (a) werden dann bis in den letzten Zwischenspeicher (20) weitergeleitet und dort gespeichert.
Es beginnt sodann die Untersuchung dieser Ionen des Substanzschubs (a). Beispielsweise wird zunächst ein normales, niederaufgelöstes Spektrum aufgenommen, wobei festgestellt wird, daß es sich um n-fach, (n+1)-fach, (n+2)-fach, ..., (n+i)-fach geladene Ionen eines Peptids mit einem aus dem Spektrum berechenbaren Molekulargewicht m handelt. In einem nächsten Untersuchungsschritt können beispielsweise die zweifach geladenen Ionen dieses Peptids mit bekannten Methoden isoliert in die lonenfalle eingespeichert, sodann durch leichte Energiezufuhr stoßfragmentiert und anschließend analysiert werden. Dabei kann ein Fragmentspektrum gemessen werden, das bereits zu einer ersten Aminosäuresequenzanalyse dieses Peptids führt. Da sich jedoch zwei der etwa zwanzig Aminosäuren nicht durch ihr Molekulargewicht unterscheiden, kann es sich als notwendig erweisen, in einem dritten Schritt ein Enkelionenspektrum einer ausgewählten Tochter zu messen, um zu einer eindeutigen Sequenz zu kommen. Diese Art der Analyse gehört zu den einfachsten Untersuchungen, und anhand der Sequenz einiger Peptide läßt sich das untersuchte Eiweiß identifizieren, falls es schon bekannt ist. An unbekannten Eiweißen läßt sich eine Reihe von Teilsequenzen bestimmen.
Mittlerweile sind die Ionen des Substanzschubs (b) im Zwischenspeicher (18) gespeichert, und die Ionen des Substanzschubs (c) im Zwischenspeicher (16). Nach der Untersuchung der Ionen des Substanzschubs (a) wird nun der Zwischenspeicher (20) einfach vollkommen geleert, indem die Hochfrequenzspannung für etwa 20 Millisekunden abgeschaltet wird. Anschließend werden die Ionen aus Zwischenspeicher (18) in den Zwischenspeicher (20) überführt und aus diesem heraus analysiert. Die Ionen aus Zwischenspeicher (16) werden in den Zwischenspeicher (18) gebracht, und Zwischenspeicher (16) steht wieder für die Speicherung der Ionen eines neuen Substanzschubs zur Verfügung.
Auf diese Weise lassen sich die Substanzschübe ohne Abschalten der Elektrophorese nacheinander untersuchen. Nur wenn, wie im Fall der Substanzschübe (e), (f), (g) und (h), die Substanzschübe so dicht aufeinanderfolgen, daß die Zeit zur Untersuchung nicht zur Verfügung steht, muß die Elektrophorese durch Abschalten der Elektrophoresespannung kurzzeitig unterbrochen werden.
Die Zwischenspeicher können eine sehr große Menge an Ionen aufnehmen, da bei ihnen schädliche Einflüsse durch die Raumladung nur in sehr geringem Maße beobachtet werden. Der Zwischenspeicher reicht, wie oben durch das Zahlenbeispiel erläutert, durchaus für etwa 2000 unselektierte Füllungen der lonenfalle aus, wie sie für die Aufnahme einfacher Massenspektren gebraucht werden. Einerseits steht meistens überhaupt nicht soviel Untersuchungssubstanz zur Verfügung, um mit einem Substanzschub den Speicher wirklich zu füllen. Andererseits werden bei der Aufnahme der Tochterspektren von selektierten Elternionen nur die ausgewählten Elternionen in die lonenfalle eingespeichert und die übrigen Ionen vernichtet, somit ist für diese filternde Einspeicherung die Anzahl von Tochterspektren (und Enkelspektren) entsprechend der Konzentration der Elternionen (oder sogar Tochterionen) weitaus geringer.
Die Erfindung ist aber nicht auf die hier beschriebene besonders günstige Ausführungsform beschränkt. Dieser besonders günstigen Ausführungsform stehen vielmehr eine große Anzahl leicht abgewandelter Ausführungsformen gegenüber, die alle ihre speziellen Vorteile haben. Die Abwandlungen können leicht von einem einschlägigen Fachmann vorgenommen werden, sie werden daher nicht in der obigen Ausführlichkeit beschrieben.
So kann nicht nur die Kapillarelektrophorese entsprechende Substanzschübe liefern, sondern auch die Flüssigkeitschromatographie, insbesondere eine mit Mikrosäulen. Selbst die Gaschromatographie läßt sich auf diese Weise einsetzen, wobei es bei der letzteren günstig sein kann, die Anzahl der Zwischenspeicher noch zu erhöhen.
Die Detektion der Substanzschübe braucht nicht durch UV-Detektoren zu erfolgen. Durch das Verfahren der Aufteilung von Trägergas- oder Flüssigkeitsströmen ("splitting") kann ein Teilstrom in jedem handelsüblichen Detektor analysiert werden, um die Substanzschübe zu detektieren. So kann neben vielen anderen Detektoren beispielsweise der in der Gaschromatographie übliche Flammenionisationsdetektor (FID) benutzt werden. Es kann aber insbesondere auch eine Doppelionenquelle verwendet werden, bei der ein Teilionenstrom für die Detektion der Substanzschübe abgezweigt wird. Auch kann ein Teil des lonenstroms nach Überführung der Ionen ins Vakuum abgezweigt und gemessen werden.
Die Substanzschübe brauchen auch nicht von physikalisch-chemischen Trennverfahren geliefert werden. Es können die Substanzschübe auch aus gepulsten Pyrolysen, beispielsweise den bekannten Curie-Punkt-Pyrolysen, oder aus Desorptionen stammen, die durch Laser-Pulse induziert wurden. In diesem Fall ist eine Detektion der Substanzschübe nicht notwendig, da die Zeiten für das Auftreten der Substanzschübe bereits bekannt sind. Für diese Arten der Analyse sind auch weniger Zwischenspeicher erforderlich, da die Taktrate ja vom Verfahren selbst gesteuert werden kann. Soll die Thermalisierung weiterhin in einem eigenen Zwischenspeicher erfolgen, so genügen insgesamt zwei Zwischenspeicher, einer für die Thermalisierung und einer für die Belieferung des Massenspektrometers. Für die Pyrolyse sind aber im allgemeinen sehr große Zwischenspeicher erforderlich, da Pyrolysegemische sehr komplex sind und viele nachfolgende Untersuchungen, häufig mit selektivem Einspeichern seltener lonensorten, benötigen.
Für die Untersuchung von Ionen aus Pyrolysevorgängen ist diese Erfindung besonders hilfreich. Die Substanzen der Pyrolysedämpfe reichen bis zu sehr hohen Molekulargewichten. Diese Moleküle dürfen keine Wandstöße erleiden, da sie sonst sofort in Form des bekannten Pyrolyseteers auskondensieren. Sie müssen vielmehr sofort ionisiert werden, beispielsweise durch chemische lonisierung bei Atmosphärendruck (APCI). Als Ionen können sie dann besser stoßfrei geführt werden als in Form neutraler Moleküle. Die längerdauernde Speicherung für mehrere aufeinanderfolgende Untersuchungen ist sogar nur in Form von Ionen möglich.
Anstelle des Elektrosprühens kann auch die chemische lonisierung bei Atmosphärendruck (APCI) für die lonisierung der Substanzen verwendet werden. Diese Art der lonisierung ist besonders für Pyrolysedämpfe und Desorptionsdämpfe günstig, aber auch für Substanzen, die durch Gaschromatographie getrennt wurden.
Die Einführung der Ionen ins Vakuum kann ebenfalls anders verlaufen, als in Figur 4 gezeigt. Es sind mit viel Erfolg einfache, düsenartige Öffnungen, beispielsweise solche mit 30 Mikrometer Durchmesser, verwendet worden, die allerdings wesentlich größere Pumpen bedingen als die oben geschilderten Eingangskapillaren.
Die Eingangskapillare (13) kann aber auch viel kürzer, dafür aber mit kleinerem Innendurchmesser, ausgebildet sein. Der Gasstrom in das Vakuumsystem ist dann viel geringer, und es kann die Differenzpumpstufe (14) vollkommen eingespart werden. Die Eingangskapillare (13) führt dann die Ionen direkt in den ersten Zwischenspeicher (16) der Differenzpumpkammer (17). Die günstigste Art der Einführung der lonen ins Vakuum - Öffnung, weite Kapillare, enge Kapillare - hängt davon ab, auf wie engem Raum die Ionen gebildet werden, und wieviele Ionen gebildet werden.
Die Anzahl der Zwischenspeicher in der Hauptvakuumkammer (19) kann selbstredend an das Meßproblem angepaßt werden. Es kann dort nur ein Zwischenspeicher vorhanden sein, beispielsweise für die Analyse von Pyrolysedämpfen oder Desorptionsionen, es können aber auch vier oder mehr Zwischenspeicher eingebaut werden, wenn es sich vorwiegend um die Analyse komplexer Gemische mit schneller Trennung handelt. Da die Ionen relativ verlustfrei von einem Speicher in den nächsten überführt werden können, ist die Anzahl der Zwischenspeicher frei wählbar.
Auch das lonenfallen-Massenspektrometer (21, 22, 23) kann durch andere Arten von Massenspektrometern ersetzt werden. Für die Aufnahme von hochaufgelösten Massenspektren von Primärionen oder sekundären (Tochter-)ionen eignen sich lonen-Cyclotron-Resonanz-Massenspektrometer (ICR oder FTMS) in ganz besonders guter Weise. Da die Aufnahme von Massenspektren je nach Anforderungen an Massenbereich und Massenauflösung mit dem ICR-Spektrometer besonders lange dauern kann, ist für ICR-Massenspektrometer durch die Erfindung ein besonderer Vorteil gegeben.
Aber auch andere Arten von Massenspektrometern, insbesondere alle Arten von Tandem-Massenspektrometern, können verwendet werden. Da diese Massenspektrometer mit einem kontinuierlichen lonenstrom versorgt werden müssen, kann hier die Schaltlinse des Zwischenspeichers (20) so gesteuert werden, daß ein über lange Zeit kontinuierlicher Ausfluß gegeben ist.
Der Massenspektrometrie-Fachmann kann mit Kenntnis seines speziellen Fachgebietes innerhalb der Massenspektrometrie leicht weitere Beispiele für die Vorteile des Einsatzes dieser Erfindung finden.
Anhang mit Textauszügen der Patentanmeldungen, die für Prioritäten in Anspruch genommen werden:
1) Anmeldung DE 19 509 939.7 vom 18. 3. 95 (BFA 15/95),
  • 1. Auszug aus BFA 15/95: "Bei Kopplungen der lonenquelle mit chromatographischen oder elektrophoretischen Separationsverfahren in der Substanzzuführung ergibt sich ein weiterer Vorteil dieser Anordnung. Es können die Ionen aus einzelnen Substanzpeaks über längere Zeit gespeichert und in schnell aufeinanderfolgenden Füll- und Untersuchungsperioden unter verschiedenen Aspekten untersucht werden. So ist es möglich, zunächst ein normales Massenspektrum zu messen, und in anschließenden Schritten Tochterionenspektren aller auftretenden lonensorten zu erzeugen."
  • 2. Auszug aus BFA 15/95: "Die lonenquelle kann insbesondere mit Einrichtungen zur Probenseparation, beispielsweise mit kapillarer Elektrophorese, gekoppelt werden. Die kapillare Elektrophorese liefert dann zeitgetrennte Substanzen in sehr kurzen Zeitperioden sehr konzentriert an. Die Zwischenspeicherung der Ionen kann dann besonders günstig eingesetzt werden, um die Ionen einer Substanz für mehrere Füllungen der lonenfalle aufzubewahren, wodurch zahlreiche MS/MS-Untersuchungen von Tochterionenspektren verschiedener Elternionen möglich werden. Sogar MS/MS/MS-Untersuchungen mit Enkelionenspektren können durchgeführt werden; letztere sind von besonderem Interesse für die Aminosäuresequenzanalyse von Proteinen. Der Elektrophoreselauf kann für längerdauernde Untersuchung leicht durch Abschalten der Spannung zwischenzeitlich unterbrochen werden."
    • 2) Anmeldung DE 19 520 282.1 vom 2. 6. 95 (BFA 21/95)
    Auszug aus BFA 21/95: "Bei Kopplungen der lonenquelle mit chromatographischen oder elektrophoretischen Separationsverfahren in der Substanzzuführung ergibt sich ein weiterer Vorteil dieser Anordnung. Es können die Ionen aus einzelnen Substanzschüben über längere Zeit gespeichert und massenspektrometrisch untersucht werden, indem die Ausflußrate der Ionen an die Bedürfnisse des Massenspektrometers angepaßt wird.
    In speichernden Massenspektrometern, beispielsweise lonenfallen, können die lonen in aufeinanderfolgenden Füll- und Untersuchungsperioden unter verschiedenen Aspekten untersucht werden. So ist es möglich, zunächst ein normales Massenspektrum zu messen, und in anschließenden Schritten Tochterionenspektren aller auftretenden lonensorten zu erzeugen. Dabei ist es ein weiterer Vorteil der Zwischenspeicherung, daß die Zeitdauer für die Befüllung stark verkürzt werden kann, und damit eine schnellere Folge in der Aufnahme der Spektren erreicht wird.
    Aber auch in kontinuierlich arbeitenden Massenspektrometern, beispielsweise in Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometern ("Triple Quads") für die Untersuchung von Tochterionenspektren, kann die Anpassung der Ausflußrate sehr förderlich sein."
    3) Anmeldung DE 19 523 859.1 vom 30. 6. 95 (BFA 25/95)
    Auszug aus BFA 25/95: "Die lonenquelle kann insbesondere mit Einrichtungen zur Probenseparation, beispielsweise mit kapillarer Elektrophorese, gekoppelt werden. Die kapillare Elektrophorese liefert dann zeitgetrennte Substanzschübe kurzer Zeitdauer sehr konzentriert an. Die Zwischenspeicherung der Ionen in der ersten Doppel-Helix 8 kann dann besonders günstig eingesetzt werden, um die Ionen einer Substanz für mehrere Füllungen der lonenfalle aufzubewahren, wodurch zahlreiche MS/MS-Untersuchungen von Tochterionenspektren verschiedener Elternionen möglich werden. Sogar MS/MS/MS-Untersuchungen mit Enkelionenspektren können durchgeführt werden; letztere sind von besonderem Interesse für die Aminosäuresequenzanalyse von Proteinen. Der Elektrophoreselauf kann für längerdauernde Untersuchung leicht durch Abschalten der Spannung zwischenzeitlich unterbrochen werden."
    Anspruch 18 aus BFA 25/95: "Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Anordnung für die Speicherung der Substanzionen eines chromatographischen oder elektrophoretisch getrenntem Substanzschubs verwendet wird."

    Claims (19)

    1. Verfahren zur Charakterisierung der Ionen von Substanzen oder Substanzgemischen, die einer lonenquelle in Schüben zugeführt werden, mit Hilfe eines Massenspektrometers und eines Zwischenspeichers zwischen lonenquelle und Massenspektrometer, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionen eines oder mehrerer Substanzschübe zunächst im Zwischenspeicher gespeichert werden, und daß diese Ionen portionenweise massenspektrometrisch untersucht werden.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß noch weitere Zusatz-Zwischenspeicher für Ionen verwendet werden.
    3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatz-Zwischenspeicher zwischen der lonenquelle und dem Zwischenspeicher in Reihe angeordnet sind, und daß diese Zusatz-Zwischenspeicher bei Bedarf die Ionen weiterer Substanzschübe aufnehmen und bei Bedarf an den jeweils nächsten Zwischenspeicher weitergeben.
    4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß multipolare (vielpolige) Hochfrequenz-lonenführungssysteme als Zwischenspeicher benutzt werden, wobei die lonenführungssysteme beidseitig mit reflektierenden Potentialverteilungen abgeschlossen sind, von denen aber mindestens eine Potentialverteilung auf lonendurchgang schaltbar ist.
    5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hochfrequenz-Multipol-Stabsystem als Zwischenspeicher benutzt wird.
    6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein System aus vertikal zu einer Achse angeordneten Ringen, die in abwechselnder Reihenfolge mit den Phasen einer Hochfrequenzspannung verbunden sind, als Zwischenspeicher benutzt wird.
    7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine mit den beiden gegenläufigen Phasen einer Hochfrequenzspannung betriebene Doppel- oder Mehrfachhelix als Zwischenspeicher benutzt wird.
    8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das als Zwischenspeicher benutzte System einen konisch geformten Innenraum hat, so daß ein permanenter Antrieb der Ionen in Achsenrichtung vorhanden ist.
    9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß längs der Achse des Zwischenspeichers zumindest temporär ein elektrisches Gleichfeld erzeugt wird.
    10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine HF-Quadrupol- oder ICR-lonenfalle als Massenspektrometer benutzt wird.
    11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die lonenfalle nur bis zur Raumladungsgrenze befüllt wird, und daß der Füllvorgang durch die Füllrate der vorhergehenden Befüllung, durch die bekannte Abnahme der lonenanzahl im Zwischenspeicher und durch die Wirkrate eines eventuell eingeschalteten lonenfilters gesteuert wird.
    12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Massenspektrometer um ein räumliches Tandem-Massenspektrometer handelt.
    13. Massenspektrometrisches System für die Charakterisierung von Substanzionen, bestehend aus einem Substanzzuführungssystem, das Substanzen in Schüben anliefert, einer lonenquelle für die lonisierung der Substanzmoleküle aus den Substanzschüben, und einem Massenspektrometer für die Untersuchung der lonen, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen lonenquelle und Massenspektrometer mehrere Zwischenspeicher für eine temporäre Speicherung der Ionen aus den Substanzschüben angeordnet sind.
    14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zwischenspeicher als drahtgewendelte Mehrfachhelices mit Anschluß an Spannungen aus je einem HF-Generator und mit jeweils endständigen Reflektoren ausgebildet sind.
    15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Reflektoren eine Doppelspirale mit Anschluß an die Hochfrequenzspannung des HF-Generators der Mehrfachhelix ist.
    16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die lonen in den Zwischenspeichern einem Antrieb in Achsenrichtung des Zwischenspeichers durch elektrische Felder unterliegen.
    17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der lonenantrieb in Achsenrichtung durch das Pseudopotential gebildet wird, das sich durch eine konische Ausbildung des Zwischenspeichers ergibt.
    18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sich der erste Zwischenspeicher in der ersten Stufe einer Differenzpumpeinheit befindet, die durch eine Vakuumpumpe in einem Druckbereich zwischen 5x10-4 und 5x10-2 Millibar gehalten wird.
    19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der letzte Zwischenspeicher eine Gaszuleitung besitzt, durch die ein Reaktantgas zugeführt werden kann.
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