EA044473B1 - Рекомбинантная плазмида, способ её конструирования и штамм дрожжей komagataella pastoris - продуцент иммунного интерферона-гамма собаки - Google Patents
Рекомбинантная плазмида, способ её конструирования и штамм дрожжей komagataella pastoris - продуцент иммунного интерферона-гамма собаки Download PDFInfo
- Publication number
- EA044473B1 EA044473B1 EA202100028 EA044473B1 EA 044473 B1 EA044473 B1 EA 044473B1 EA 202100028 EA202100028 EA 202100028 EA 044473 B1 EA044473 B1 EA 044473B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- yeast
- gene
- recombinant
- gamma
- ifn
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 49
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 42
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 title claims description 36
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 title claims description 23
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims description 21
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 101000599926 Canis lupus familiaris Interferon gamma Proteins 0.000 claims description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 claims description 9
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 39
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241001353878 Canine parainfluenza virus Species 0.000 description 3
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 3
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 3
- 208000004467 Infectious Canine Hepatitis Diseases 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000014058 canine distemper Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 3
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 230000014725 late viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N mannan Chemical class O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Description
Изобретение относится к биотехнологии, к генной инженерии, микробиологической промышленности и ветеринарии и представляет собой дрожжевой штамм - продуцент секреторного рекомбинантного иммунного интерферона-гамма собаки, содержащий сконструированную in vitro плазмиду, которая обеспечивает синтез секреторного рекомбинантного иммунного интерферона-гамма собаки.
В настоящее время количество домашних собак в России и мире стремительно растет в связи с чем проблема профилактики и лечения вирусных болезней домашних животных приобретает особую остроту. Наиболее опасными высоколетальными вирусными заболеваниями собак являются чума собак, парвовирус собак, вирус парагриппа собак, инфекционный гепатит собак. Действенным способом лечения может выступать терапия на основе интерферонов, в частности интерферона-гамма. Иммунный интерферон, гамма-интерферон, относится к обширной группе эволюционно родственных белков, получивших название интерферонов. Образование гамма-интерферона происходит в Т-лимфоцитах и ЕК-клетках (естественных киллерах) под воздействием, соответственно, вирусов и опухолевых клеток. Гаммаинтерферон активирует специфический клеточный иммунитет, стимулирует цитотоксичность макрофагов, повышает устойчивость организма к различным инфекциям. Использование аутентичного гаммаинтерферона собаки потенциально обладает гораздо меньшим побочным эффектом со стороны иммунной системы собак и близких видов по сравнению с применением аналогичных белков человека. Однако, систематические исследования спектра биологического действия аутентичного гамма-интерферона собаки Canis familiaris, как и его применение в качестве лекарственного препарата затруднены, так как в настоящее время в России не существует препаратов гамма-интерферона собаки.
Перспективным подходом для получения гамма-интерферона собаки Canis familiaris в значительных количествах является использование микроорганизмов в качестве продуцентов этого препарата. Использование бактерии Escherichia coli для этих целей рискованно, так как указанная бактерия является условно патогенным микроорганизмом, и препараты гамма-интерферона, полученные из бактериальных клеток, могут содержать эндотоксины. Вышеизложенное свидетельствует о перспективности создания штаммов-продуцентов гамма-интерферона собаки на основе других микроорганизмов, в частности, дрожжей [1]. Применение непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов белков животных, позволяет использовать рекомбинантные белки в ветеринарной практике. Дрожжи Komagataella pastoris (Pichia pastoris) выглядят в данном случае особенно перспективными, так как сочетают такие важные параметры как непатогенность, простота культивирования и низкая себестоимость конечного продукта, а также отсутствие иммуногенных альфа-1,3-маннозных связей в составе гликопротеинов.
В качестве прототипа можно рассматривать патент JP11266868. В указанном случае для продукции гамма-интерферона собаки в качестве организма-продуцента применяют дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Для культивирования дрожжей используют среды относительно простого состава, для них разработаны способы повышения уровня продукции и секреции рекомбинантных белков. Недостатком этой системы экспрессии является гипергликозилирование секретируемых гликопротеинов [2]. Кроме того, рекомбинантные гликопротеины содержат маннозные остатки, связанные альфа-1-3 связями, которые являются сильными антигенными детерминантами [3]. Это обстоятельство ограничивает использование рекомбинантных гликопротеинов, синтезированных дрожжами S. cerevisiae, в качестве лекарственных препаратов. Гамма-интерферон собаки относится к гликопротеинам, поэтому для его продукции система экспрессии на основе дрожжей S. cerevisiae не применима.
Заявленное изобретение свободно от указанного недостатка за счет того, что в качестве продуцента используются дрожжи Komagataella pastoris. Поэтому получение гамма-интерферона собаки с помощью дрожжей Komagataella pastoris, которые не обладают указанным ограничивающим фактором, является перспективным.
Целью предлагаемого объекта изобретения является создание штамма дрожжей Komagataella pastoris, который может быть использован для получения ветеринарного препарата на основе интерферонагамма собаки (Canis familiaris) для профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний домашних животных, таких как чума собак, парвовирус собак, вирус парагриппа собак, инфекционный гепатит собак.
Технический результат заключается в создании штамма дрожжей Komagataella pastoris, который может быть использован для получения ветеринарного препарата на основе интерферона-гамма собаки (Canis familiaris) для профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний домашних животных, таких как чума собак, парвовирус собак, вирус парагриппа собак, инфекционный гепатит собак.
Плазмида pPICZ-IFN-Gcf обеспечивающая синтез гамма-интерферона собаки трансформированными ею клетками дрожжей, состоит из следующих элементов:
XhoI-XbaI - фрагмент плазмидной ДНК дрожжевого вектора pPICZaA размером 3 568 п.о.(из которого удалена область сайта множественного клонирования размером 25 п.о. между сайтами распознавания рестриктаз XhoI и XbaI), включающий ген устойчивости к зеоцину, бактериальную область инициации репликации; фрагмент 5'-некодирующей области дрожжевого гена АОХ1 размером 940 п.о., содержащий область, обеспечивающую активацию транскрипции этого гена в присутствии метанола в качестве источника углерода в культуральной среде; фрагмент гена АОХ1 размером 342 п.о., содержащий об
- 1 044473 ласть терминации транскрипции этого гена;
XhoI-XbaI - фрагмент размером 449 и.о., содержащий кодирующую часть гена гамма-интерферона собаки;
Схема плазмидной ДНК pPICZ-IFN-Gcf изображена на фиг. 1, где XhoI и XbaI - сайты распознавания соответствующих рестриктаз. Общий размер плазмиды pPICZ-IFN-Gcf-3949 п.о.
Для достижения цели используют следующий способ конструирования плазмиды, обеспечивающей синтез гамма-интерферона собаки в клетках дрожжей. Из плазмиды pPICZaA (Invitrogen) с помощью ферментов рестрикции XbaI и XhoI вырезают фрагмент сайта множественного клонирования размером 25 и.о., после чего вектор дефосфорилируют. Вставку - кодирующую часть гена гамма-интерферона собаки размером 449 п.о. - получают путем обработки ферментами рестрикции XbaI и XhoI промежуточного вектора pAL2T-IFN-Gcf, сконструированного ранее путем лигирования ПЦР продукта фрагмента гена гамма-интерферона собаки с линеаризованным вектором pAL2T (Евроген). Нуклеотидная последовательность гена гамма-интерферона собаки (SEQ ID NO: 1) была оптимизирована для экспрессии в дрожжах Komagataella pastoris путем замены нативных для млекопитающих кодонов на наиболее часто встречающиеся у данных дрожжей.
Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма XL1-Blue (Евроген), с последующим высеванием на низкосолевую среду LB с добавлением зеоцина. С помощью рестрикционного и ПНР анализа доказывают наличие плазмиды pPICZ-IFN-Gcf у трансформантов.
После интеграции указанной последовательности в вектор pPICZaA открытая рамка считывания итогового рекомбинантного белка гамма-интерферона собаки содержит: сигнал секреции aMF-фактор дрожжей Saccharomyces cerevisiae, фрагмент открытой рамки считывания гена гамма-интерферона собаки, оптимизированного для экспрессии в дрожжах Komagataella pastoris путем замены нативных для млекопитающих кодонов на наиболее часто встречающиеся у данного вида дрожжей, а также последовательностей эпитопа сМус и метки Hisx6 для очистки итогового рекомбинантного белка методом аффинной хроматографии (SEQ ID NO: 2).
Выбор конструкции плазмиды для продукции гамма-интерферона собаки обусловлен следующими причинами. Плазмида pPICZ-IFN-Gcf получена на основе дрожжевого интегративного вектора pPICZaA. В результате трансформации линеаризованной плазмидой и последующей гомологичной рекомбинации происходит встраивание экспрессионной кассеты в хромосому дрожжей Komagataella pastoris, что обеспечивает стабильное поддержание клонированного гена гамма-интерферона. В состав плазмиды входит ген устойчивости к зеоцину, что позволяет селективно отбирать бактериальных и дрожжевых трансформантов на селективной среде с добавлением зеоцина.
Экспрессия гена гамма-интерферона собаки в составе плазмиды pPICZ-IFN-Gcf находится под контролем промотора гена АОХ1, содержащим области, обеспечивающие активацию транскрипции в присутствии метанола в культуральной среде, а также область инициации транскрипции. Промотор гена АОХ1 относится к числу наиболее сильных дрожжевых промоторов. Уровень экспрессии генов, находящихся под контролем АОХ1 промотора, эффективно регулируется источниками углерода. Транскрипция гена АОХ1 полностью блокирована при выращивании дрожжей на среде с глюкозой, на среде с глицерином наблюдается только базальный уровень экспрессии гена. Использование метанола в качестве единственного источника углерода значительно усиливает экспрессию гена АОХ1 и, следовательно, генов, находящихся под контролем АОХ1 промотора. Это позволяет регулировать синтез гамма-интерферона собаки в клетках дрожжей. Регулируемая экспрессия клонированного гена позволяет существенно снизить метаболическую нагрузку на клетку дрожжей.
В качестве продуцента гамма-интерферона используют штамм Y-3489-pPICZ-IFN-Gcf. Штамм Y-3489-pPICZ-IFN-Gcf получен при трансформации штамма дрожжей Komagataella pastoris Y-3489 (wt) (ВКПМ) плазмидой pPICZ-IFN-Gcf. Штамм Y-3489 не несет гена устойчивости к зеоцину, что позволяет селективно отбирать трансформантов, несущих плазмиду pPICZ-IFN-Gcf.
Штамм дрожжей Komagataella pastoris Y-3489-pPICZ-IFN-Gcf характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
На полной дрожжевой среде образует кремоватые колонии, гладкие, блестящие, пастообразной консистенции, клетки от круглых до овальных (2,0-4,0)х(2,2-5,8) мкм. На жидкой среде образует осадок и пленку. Культура имеет характерный запах метилотрофных дрожжей.
Клетки хорошо растут на полной дрожжевой среде YEPD: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы или 1% глицерина.
Кроме того, клетки хорошо растут на минеральной среде SC: 1,34% Yeast Nitrogen Base (Difco, США), 2% глюкозы (1% глицерина, 0,5% метанола), а также на других синтетических средах для дрожжей.
Физиолого-биохимические признаки.
Клетки растут в пределах от 4 до 35°С. Оптимальной температурой выращивания является 30°С. При росте в аэробных условиях клетки незначительно защелачивают среду. Оптимум рН для роста со
- 2 044473 ставляет 4,5-6,5.
В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые соединения, такие как: глюкоза, глицерин, метанол.
В качестве источника азота клетки могут использовать минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину.
Клетки способны к аэробному росту.
Существенными признаками штамма является устойчивость к зеоцину.
Способ получения плазмиды pPICZ-IFN-Gcf проиллюстрирован следующим примером.
Пример 1.
Нуклеотидная последовательность рекомбинантного гена гамма-интерферона собаки (SEQ ID NO: 1) получена методом химического синтеза и включает фрагмент открытой рамки считывания гена гаммаинтерферона собаки, оптимизированный для экспрессии в дрожжах Komagataella pastoris путем замены нативных для млекопитающих кодонов на наиболее часто встречающиеся у данных дрожжей, а также последовательностей эпитопа сМус и метки Hisx6 для очистки итогового рекомбинантного белка методом аффинной хроматографии. Оптимизированная последовательность была лигирована в промежуточный вектор pUC57 и предоставлена в данном виде компанией, осуществлявшей услуги по синтезу гена (Евроген).
Для амплификации указанного фрагмента гена гамма-интерферона собаки использовали следующие праймеры ПЦР (5'->3'): прямой праймер CTCGAGAAAAGACAAGCTATGTTCTT, содержащий сайт рестрикции XhoI, и обратный праймер TCTAGACCCTTAGAAGCTCTTCTACCTCT, содержащий сайт рестрикции XbaI.
Режим реакции ПЦР:
цикл: 95 °C - 3 мин.
130 циклов:
95°С - 30 сек.
55°С - 30 сек.
72°С - 60 сек.
цикл: 72°С - 3 мин.
Далее проводили электрофорез продукта ПЦР реакции в 0,7% агарозном геле в буфере ТВЕ (0,1 М трис-боратный буфер, рН 8,3, содержащий 1 мМ ЭДТА). Для контроля размера амплифицированного фрагмента ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер 1 kb NL001 (Евроген). Результат проверки - электрофореграмма продуктов ПЦР при амплификации фрагмента гена гамма-интерферона собаки - представлен на фиг. 2, где 1 - проба ПЦР продукта, М - маркер молекулярного веса ДНК. Размер ПЦР продукта соответствует расчетному в 449 п.о.
Выделение ПЦР фрагмент гена гамма-интерферона собаки из агарозного геля проводят по методике, разработанной фирмой QIAGEN. Полоску геля с фрагментом ДНК помещают в пробирку и добавляют раствор QX1 (300 мкл на 100 мг геля). Пробу нагревают до 50°С, добавляют реактив QIAEX (10 мкл на 5 мкг ДНК) и инкубируют при температуре 50°С в течение 10 мин, периодически перемешивая. Далее центрифугируют 30 с при 15000 об/мин, супернатант отбрасывают, осадок дважды экстрагируют растворами QX2 и QX3, удаляют супернатант центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 с. Осадок высушивают на воздухе, растворяют в 20 мкл буфера ТЕ, центрифугируют 30 с при 15000 об/мин., супернатант переносят в новую пробирку.
Выделенный ПЦР фрагмент гена гамма-интерферона собаки лигируют с линеаризованным вектором pAL2T (Евроген). Для этого 10 мкл реакционной смеси (2 мкл 5Х Quick ligation буфер, 1 мкл pAL2-T вектор (50 нг/мкл), 1 мкл Quick-TA T4 ДНК лигаза, 3 мкл ПЦР продукт (50 нг/мкл), 3 мкл вода) инкубировали в течение 30 мин при 22°С. Продуктом лигирования выступает плазмида pAL2T-IFN-Gcf.
Полученную лигазную смесь используют для трансформации компетентных бактерий Escherichia coli. 200 мкл компетентных клеток с добавлением 1-2 мкл лигазной смеси инкубируют 15-20 мин во льду. Далее проводят тепловой шок в течение 60-90 с с возвращением клеток на 2 мин в лед. После добавления среды LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% хлористого натрия) проводят инкубацию в течение одного часа. Аликвоту в 100 мкл высевают на твердую среду LB с ампициллином. Колонии трансформантов отбирают после инкубирования в течение 12 ч при температуре 37°С.
Клетки бактерий Escherichia coli, содержащие плазмиду pAL2T-IFN-Gcf выращивают при 37°С в течение ночи в 1л питательной среды LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% хлористого натрия ), содержащей ампициллин в концентрации 50 мг/л. Клетки собирают центрифугированием при 5000об/мин в течение 10 мин при 4°С, суспендируют в 20 мл 25 мМ трис-хлоридного буфера (рН 8,0),
- 3 044473 содержащего 10 мМ ЭДТА и 50 мМ глюкозы, добавляют 30 мг лизоцима и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 40 мл 0,2М гидроокиси натрия, содержащей 1% додецилсульфата натрия, осторожно перемешивают и инкубируют в течение 10 мин при 4°С. Раствор нейтрализуют добавлением 30 мл 3 М ацетата натрия (рН 5,0) и выдерживают в течение 10 мин при 4°С. После этого центрифугируют при 14000 об/мин в течение 40 мин при 4°. К супернатанту добавляют 0,6 объема изо-пропилового спирта, выдерживают 20 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин при 20°С. Полученный осадок промывают 70% этиловым спиртом, высушивают в вакууме и растворяют в 4 мл дистиллированной воды. Далее добавляют 4,2 г хлористого цезия и 0,36 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Полученный раствор выдерживают в течение 1 ч при 4°С, затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант центрифугируют при 70000 об/мин в течение 16 ч в центрифуге TL100 (Beckman). После центрифугирования отбирают полосу плазмидной ДНК (нижнюю из двух флюоресцирующих в ультрафиолетовом свете полос), дважды экстрагируют бромистый этидий равным объемом изо-амилового спирта, разбавляют в два раза дистиллированной водой и осаждают плазмидную ДНК двумя объемами этилового спирта и 1/15 объема 3 М ацетата натрия (рН 5,0). Осадок собирают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин, промывают 70% этиловым спиртом и растворяют в 0,5-1 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-хлоридный буфер, рН8,0, содержащий 1 мМ ЭДТА).
Концентрацию плазмидной ДНК определяют по поглощению раствора при длине волны 260 нм. Чистоту препарата контролируют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле в буфере ТВЕ (0,1 М трис-боратный буфер, рН 8,3, содержащий 1 мМ ЭДТА).
Гидролиз плазмиды pAL2T-IFN-Gcf рестриктазами XbaI и XhoI проводят в 10 мМ трис-хлоридном буфере (рН 8,0), содержащем 100 мМ хлористого калия, 5 мМ хлористого магния, 0,02% тритона Х-100 и 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. К 5 мкг плазмидной ДНК в объеме 20 мкл добавляют по 5 ед. каждой рестриктазы, после чего пробу инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Далее проводят разделение продуктов рестрикции методом электрофореза в агарозном геле и проводят выделение фрагмента, соответствующего вставке синтетического гена гамма-интерферона собаки. Выделение фрагмента вставки ДНК из агарозного геля проводят по указанной выше методике QIAGEN.
Аналогично проводят обработку плазмиды pPICZaA рестриктазами XbaI и XhoI. Дополнительно продукт рестрикции дефосфорилируют с помощью щелочной фосфатазы AnP (NEB). Для этого на 20 мкл реакционной смеси добавляют: 2 мкл десятикратного буфера, 1-3 мкл плазмидной ДНК (50 нг/мкл), деионизованная вода - до 20 мкл, 1 мкл (5 ед.) щелочной фосфатазы. Инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Производят остановку реакции нагревом до 80°С в течение 2 мин. Очищают ДНК гельфильтрацией, на спин-колонках с последующим высаждением 96%-ным этанолом для удаления фосфатазы.
Для получения плазмиды pPICZ-IFN-Gcf проводят дотирование 1 мкг дефосфорилированного линеаризованного вектора pPICZaA, гидролизованного рестриктазами XbaI и XhoI, и 3 мкг вставки целевого гена, гидролизованного рестриктазами XbaI и XhoI, в 10 мкл 70мМ трис-хлоридного буфера (рН 7,6), содержащего 5 мМ дитиотреитола, 5 мМ хлористого магния, 1 мМ АТФ, добавляя 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируя при 14°С в течение ночи.
Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма Escherichia coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacIqZAM15 Tn10 (Tetr)] (Евроген). Для этого клетки Escherichia coli выращивают в 100 мл среды LB при 37°С до достижения культурой густоты клеточной суспензии, соответствующей 0,4-0,6 ед. оптической плотности при длине волны 550 нм. Клеточную суспензию охлаждают в ледяной бане, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Клетки суспендируют в 100 мл 10мМ хлористого натрия, собирают центрифугированием в тех же условиях. Далее клетки суспендируют в 50 мл 75 мМ хлористого кальция, выдерживают в ледяной бане в течение 40 мин, осаждают центрифугированием в тех же условиях и суспендируют в 1 мл 75 мМ хлористого кальция. К суспензии компетентных клеток добавляют глицерин до конечной концентрации 15%, разделяют на аликвоты и хранят при -70°С. Перед трансформацией суспензию компетентных клеток размораживают в ледяной бане, добавляют лигазную смесь и инкубируют в ледяной бане в течение 40 мин. Далее клетки подвергают действию теплового шока при 42°С в течение 2 мин, после чего инкубируют в 1,5 мл среды LB при 37°С в течение 1 ч. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин и высевают на чашки Петри с низкосолевой средой LB, содержащей, 0,5% NaCl, 2% агара и 25 мкг/мл зеоцина. Чашки инкубируют при 37°С в течение 12-16 ч.
Из выросших отдельных клонов трансформантов выделяют плазмидную ДНК при помощи методики, использованной для получения плазмиды pAL2T-IFN-Gcf, за исключением того, что клетки Escherichia coli выращивают в 10 мл LB, и, соответственно, объемы всех растворов уменьшают в 100 раз, и проводят проверку методом ПЦР наличия вставки целевого гена. Для этого используются праймеры к 5'-АОХ1 промотору и 3'-АОХ1 в составе плазмиды: (5'->3'): прямой праймер GACTGGTTCCAATTGACAAGC, соответствующий 5'-АОХ1 промотору, и обратный праймер GCAAATGGCATTCTGACATCC, соответствующий 3'-AOX1 терминатору. Результат проверки - электрофореграмма ПЦР для 4-х проб на матрице плазмиды pPICZ-IFN-Gcf - представлен на фиг. 3, где 1, 2, 3, 4 - пробы ПЦР
- 4 044473 продуктов, М - маркер молекулярного веса ДНК. Размер ПЦР продукта соответствует расчетному в 945 п.о.
Режим реакции ПЦР:
цикл: 95°С - 3 мин.
циклов:
95°С - 30 сек.
55°С - 30 сек.
72°С - 90 сек.
цикл: 72°С - 2 мин.
Из выявленного таким образом клона препаративно выделяют плазмиду pPICZ-IFN-Gcf так же, как описано для плазмиды pAL2T-IFN-Gcf, и гидролизуют рестриктазой PmeI в однократном буфере (50 мМ ацетат натрия, 20 мМ Трис-ацетат, 10 мМ ацетат магния, 100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин, рН 7.9 при 25°С) (NEB). PmeI-фрагмент плазмиды pPICZ-IFN-Gcf размером 3949 п.о, выделяют по описанной выше методике фирмы QIAGEN, исключая стадию нагревания и используют его для трансформации клеток дрожжей, как описано в примере 2.
Пример 2.
Для получения штамма дрожжей Komagataella pastoris Y-3489-pPICZ-IFN-Gcf - продуцента секреторного рекомбинантного иммунного интерферона-гамма собаки, клетки дрожжей штамма Komagataella pastoris Y-3489 (wt) трансформируют плазмидой pPICZ-IFN-Gcf.
Клетки дрожжей выращивают в 100 мл среды YEPD при 30°С до достижения культурой оптической плотности, соответствующей 2-4 ед поглощения при длине волны 600 нм. Клетки дважды промывают стерильной водой, после чего суспендируют в 0,3 мл 100 мМ раствора ацетата лития и инкубируют при 30°С в течение 30 мин. К 50 мкл полученной суспензии клеток добавляют 0,1-1 мкг плазмидной ДНК, 50 мкг ДНК спермы лосося, предварительно денатурированной нагреванием (10 мин при 100°С) и 0,3 мл раствора 100 мМ ацетата лития, содержащего 40% полиэтиленгликоля 4000. Далее пробу инкубируют 30 мин при 30°С и 20 мин при 42°С, помещают на 15 секунд в ледяную баню и центрифугируют 10 с при 10000 об/мин. Клетки суспендируют в 1 мл стерильной воды и высевают на твердую полную дрожжевую среду YPD с содержанием 100 мкг/ мл зеоцина. Клоны трансформантов вырастают через 2-3 суток.
Для анализа продукции интерферона-гамма собаки клетками трансформантов их выращивают при 30°С в 100 мл жидкой среды BMGY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 1% глицерина, 10 мл 1 М калий-фосфатного буфера, рН 6,0, 1,34% Yeast Nitrogen Base (Difco, США) до стационарной фазы роста в течение 2 суток. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, супернатант сливают, и переносят всю биомассу в 100 мл жидкой среды BMMY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 0,5% метанола, 10 мл 1 М калий-фосфатного буфера, рН 6,0, 1,34% Yeast Nitrogen Base (Difco, США) для индукции экспрессии гена гамма-интерферона. Индукцию проводят при 30° в течение 4 суток. По окончании индукции отбирают пробы культуральной жидкости, из которых белок концентрируют осаждением 80% раствором сульфата аммония. Разделение белков проводят в 15% полиакриламидном геле в денаиурирующих условиях (электродный буфер: 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ трис-хлоридный буфер, рН 8,8). Параллельно проводят разделение белков контрольного штамма (штамм дикого типа Y-3489), выращенного в идентичных условиях. В качестве стандартов молекулярной массы используют лактатдегидрогеназу (35,0 кДа), эндонуклеазу рестрикции Bsp98I (25,0 кДа), β-лактоглобулин (18,4 кДа), лизоцим (14,4 кДа). Среди секретируемых белков штамма-продуцента Y-3489-pPICZ-IFN-Gcf появляется дополнительная белковая полоса с молекулярной массой около 19,4 кДа, что соответствует расчетной массе рекомбинантного интерферонагамма собаки (SEQ ID NO: 2), рассчитанной сервисом:
https://sciencegateway.org/tools/proteinmw.htm.
Результаты электрофореза белков культуральной жидкости показаны на фиг. 4, где 1 - белки из культуральной жидкости штамма Y-3489-pPICZ-IFN-Gcf, M - маркер молекулярного веса белков, -К белки из культуральной жидкости штамма дикого типа Y-3489.
Уровень синтеза рекомбинантного интерферона-гамма собаки определяют, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой маркерного белка соответствующего веса. В качестве маркера концентрации был принят Р-лактобулин (молекулярный вес - 18,4 кДа, концентрация 0,1 мг/мл). Согласно полученным данным, штамм Y-3489-IFN-Gcf синтезируют около 527 мг/л культуры дрожжей.
Предложенный штамм дрожжей Komagataella pastoris Y-3489-pPICZ-IFN-Gcf, оказался эффективным продуцентом рекомбинантного интерферона-гамма собаки и может использоваться для получения
- 5 044473 ветеринарного препарата для профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний домашних животных.Источники:
1. Celik Е., Calik Р. Production of recombinant proteins by yeast cells II Biotechnol. Adv.
2012. V. 30(5). P. 1108-1118.
12. Kukuruzinska M.A., Lennon K. Diminished activity of the first N-glycosylation enzyme, dolichol-P-dependent N-acetylglucosamine-l-P transferase (GPT), gives rise to mutant phenotypes in yeast H Biochim. Biophys. Acta. 1995. V.1247. P.51-59
3. Ballou C.E. A study of the immunogenicity of three yeast mannans H J. Biol. Chern. 1970.
Claims (3)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPICZ-IFN-Gcf, обеспечивающая биосинтез секреторного рекомбинантного интерферона-гамма собаки в клетках дрожжей Komagataella pastoris, имеющая размер 3949 п.о. и содержащая:XhoI-XbaI - фрагмент плазмидной ДНК дрожжевого вектора pPICZaA размером 3 568 п.о.(из которого удалена область сайта множественного клонирования размером 25 п.о. между сайтами распознавания рестриктаз XhoI и XbaI), включающий ген устойчивости к зеоцину, бактериальную область инициации репликации; фрагмент 5'-некодирующей области дрожжевого гена АОХ1 размером 940 п.о., содержащий область, обеспечивающую активацию транскрипции этого гена в присутствии метанола в качестве источника углерода в культуральной среде; фрагмент гена АОХ1 размером 342 п.о., содержащий область терминации транскрипции этого гена;XhoI-XbaI - фрагмент размером 449 п.о., содержащий кодирующую часть гена гамма-интерферона собаки;уникальные сайты распознавания следующих рестриктаз: XhoI - 1185 п.о.; HindIII - 873 п.о.; XbaI 628 п.о.; HpaI - 1496 п.о.; BsrGI - 3125 п.о; PmeI - 414 п.о.
- 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pPICZ-IFN-Gcf по п.1, обеспечивающей синтез секреторного рекомбинантного интерферона-гамма собаки в клетках дрожжей Komagataella pastoris, заключающийся в том, что из плазмиды pPICZaA с помощью гидролиза рестриктазами XhoI и XbaI удаляют область сайта множественного клонирования размером 25 п.о. и далее лигируют по данным сайтам рестрикции последовательность рекомбинантного гена гамма-интерферона собаки, включающего фрагмент открытой рамки считывания гена гамма-интерферона, оптимизированного для экспрессии в дрожжах Komagataella pastoris путем замены нативных для млекопитающих кодонов на наиболее часто встречающиеся у данных дрожжей, а также последовательностей эпитопа сМус и метки Hisx6 для очистки итогового рекомбинантного белка методом аффинной хроматографии, затем лигазной смесью трансформируют клетки бактерий Escherichia coli и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмидную ДНК pPICZ-IFN-Gcf.
- 3. Рекомбинантный штамм дрожжей Komagataella pastoris Y-3489-pPICZ-IFN-Gcf - продуцент рекомбинантного интерферона-гамма собаки, полученный на основе штамма дрожжей Komagataella pastoris Y-3489 (ВКПМ) и содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pPICZ-IFN-Gcf по п.1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020107959 | 2020-02-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044473B1 true EA044473B1 (ru) | 2023-08-30 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI95929B (fi) | Hepatitis B pinta-antigeenin tuotanto hiivassa | |
| JP7246100B2 (ja) | 新規融合タンパク質の調製およびそのタンパク質合成の向上における使用 | |
| CN105358694B (zh) | 来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子 | |
| JP2580036B2 (ja) | メチロトローフ酵母におけるヒト血清アルブミンの発現 | |
| CN111778169B (zh) | 一种提高体外蛋白合成效率的方法 | |
| US7790450B2 (en) | Expression vector, a transformant carrying the same and a method for producing heterologous protein | |
| CN110845622A (zh) | 不同结构域缺失融合蛋白的制备及其在提高蛋白质合成的应用 | |
| CN116970503A (zh) | 一种强化囊泡转运的产乳铁蛋白毕赤酵母及促进胞外分泌的方法 | |
| CA3103988A1 (en) | Means and methods for increased protein expression by use of transcription factors | |
| CN117126754A (zh) | 重组i型胶原蛋白毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用 | |
| RU2756852C2 (ru) | Рекомбинантная плазмида, способ её конструирования и штамм дрожжей Komagataella pastoris - продуцент иммунного интерферона-гамма собаки | |
| EA044473B1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, способ её конструирования и штамм дрожжей komagataella pastoris - продуцент иммунного интерферона-гамма собаки | |
| JPS6011557A (ja) | クロ−ンヒツジ成長ホルモン遺伝子 | |
| CN111187765A (zh) | 一种反刍动物瘤胃特异溶菌酶lyz1及其应用 | |
| RU2800472C2 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК, способ ее конструирования и штамм дрожжей Komagataella pastoris - продуцент фрагмента белка VP2 вируса инфекционной бурсальной болезни птиц | |
| CN108977455A (zh) | 用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用 | |
| CN101434965A (zh) | 一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b的构建方法 | |
| RU2315105C1 (ru) | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS PS107(pPIC9HAbIL-2), ЯВЛЯЮЩИЙСЯ ПРОДУЦЕНТОМ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ АЛЬБУМИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pPIC9HAbIL-2 И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ | |
| CN105802989A (zh) | 毕赤酵母表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用 | |
| RU2315806C1 (ru) | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Pichia pastoris PS106(pHIG), ЯВЛЯЮЩИЙСЯ ПРОДУЦЕНТОМ ИММУННОГО ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pHIG И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ | |
| RU2203950C1 (ru) | Штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент лейкоцитарного интерферона-16 человека, рекомбинантная плазмидная днк phin и способ ее конструирования | |
| RU2180687C1 (ru) | Штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент фибробластного интерферона человека, рекомбинантная плазмидная днк phif и способ ее конструирования | |
| CN111925952A (zh) | 一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母 | |
| KR100530988B1 (ko) | 봉입체 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 결핍시키거나 증폭시켜 목적 단백질을 제조하는 방법 | |
| RU2230781C1 (ru) | Штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae 1-60-д578 (msil), - продуцент рекомбинантного интерлейкина-2 человека и способ его получения |