EA036006B1 - Мутанты beta vulgaris, толерантные к als-ингибиторным гербицидам - Google Patents

Мутанты beta vulgaris, толерантные к als-ингибиторным гербицидам Download PDF

Info

Publication number
EA036006B1
EA036006B1 EA201692296A EA201692296A EA036006B1 EA 036006 B1 EA036006 B1 EA 036006B1 EA 201692296 A EA201692296 A EA 201692296A EA 201692296 A EA201692296 A EA 201692296A EA 036006 B1 EA036006 B1 EA 036006B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
als
seq
amino acid
sequence
plant
Prior art date
Application number
EA201692296A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201692296A1 (ru
Inventor
Рюдигер Хайн
Юрген Бентинг
Гюнтер Донн
Натали Книттель-Оттлебен
Бернд Хольтшульте
Андреас Лоок
Клеменс Шпрингманн
Рудольф Янсен
Original Assignee
Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх
Квс Заат Се
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх, Квс Заат Се filed Critical Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх
Publication of EA201692296A1 publication Critical patent/EA201692296A1/ru
Publication of EA036006B1 publication Critical patent/EA036006B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/06—Roots
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/12—Leaves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/02—Amaranthaceae or Chenopodiaceae, e.g. beet or spinach
    • A01H6/024—Beta vulgaris [beet]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/023—Methane
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к толерантным к ALS-ингибиторным гербицидам растениям Beta vulgaris и их частям, которые включают мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS), причем этот ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, отличную от триптофана, в позиции 569 ALS полипептида.

Description

Данное изобретение относится к Beta vulgaris растениям и их частям, которые толерантны к ALSингибиторным гербицидам, а также к способам их получения.
Культивируемые формы Beta vulgaris (как определено в Ford-Lloyd (2005) Sources of genetic variation, Genus Beta; в книге Biancardi E., Campbell L.G., Skaracis G.N., De Biaggi M. (eds), Genetics and Breeding of Sugar Beet, Science Publishers, Enfield (NH), США, pp. 25-33) являются важными сельскохозяйственными культурами в умеренных и субтропических областях. Например, около 20% производимого в мире сахара получают из сахарной свеклы. В связи с тем, что рассада и молодые растения свеклы во время первых 6-8 недель их жизни очень чувствительны к сильной конкуренции быстро растущих сорняков, которые выигрывают конкуренцию у молодых культурных растений, необходимы реальные меры контроля сорняков на этих посадках культурных растений.
В последние 40 лет гербициды являются предпочтительным средством для контроля сорняков в культуре свеклы. Продукты, используемые для этих целей, такие как фенмедифам, десмедифам и метамитрон, позволяют подавлять рост сорняков на свекловичных полях, не представляя опасности для культурных растений. Однако при неблагоприятных окружающих условиях эффективность этих продуктов не всегда удовлетворительна, особенно если вредные сорняки, такие как Chenopodium album, Amaranthus retroflexus и/или Tripleurospermum inodorata прорастают в течение продолжительного периода времени.
Инновационные гербицидно активные ингредиенты очень желательны для того, чтобы улучшить контроль сорных растений в посадках свеклы. Такие соединения должны действовать против широкого спектра сорняков предпочтительно от прорастания сорняков вплоть до полного развития сорных растений, не оказывая влияния на культуру свеклы независимо от стадии развития. С помощью классического гербицидного скрининга не удалось обнаружить селективного гербицидно активного ингредиента для свеклы в течение последних десяти лет, который бы удовлетворял всем этим строгим требованиям агрономически предпочтительным образом.
Некоторые химикаты ингибируют энзим ацетогидроксикислоты синтазы (AHAS), также известной как ацетолактатсинтаза (ALS [ЕС 4.1.3.18]). На ALS могут воздействовать пять структурно различных семейств гербицидов, относящихся к классу ALS-ингибиторных гербицидов, таких как (а) сульфонилмочевинные гербициды (Beyer E.M. и др. (1988), Sulfonylureas in Herbicides: Chemistry, Degradation, and Mode of Action; Marcel Dekker, New York, 1988, 117-189), (b) сульфониламинокарбонилтриазолиноновые гербициды (Pontzen, R., Pflanz.-Nachrichten Bayer, 2002, 55, 37-52), (с) имидазолиноновые гербициды (Shaner, D.L. и др., Plant Physiol., 1984, 76, 545-546; Shaner, D.L. и O'Connor, S.L. (Eds.), The Imidazolinone Herbicides, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991), (d) триазолопиримидиновые гербициды (Kleschick W.A. и др., Agric. Food Chem., 1992, 40, 1083-1085) и (e) пиримидинил(тио)бензоатные гербициды (Shimizu T.J., Pestic. Sci., 1997, 22, 245-256; Shimizu Т. и др., Acetolactate Syntehase Inhibitors in Herbicide Classes in Development, Boger P., Wakabayashi K., Hirai K., (Eds.), Springer Verlag, Berlin, 2002, 1-41).
ALS участвует в превращении двух пируват молекул в ацетолактат молекулу и двуокись углерода. В реакции используется тиаминпирофосфат для того, чтобы связать между собой две пируват молекулы. Получаемый в результате продукт реакции, ацетолактат, в конечном счете становится валином, лейцином или изолейцином (Singh (1999) Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine, в Plant Amino Acids, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247).
Ингибиторы ALS прерывают биосинтез валина, лейцина и изолейцина в растениях. Последствием является непосредственное истощение соответствующего аминокислотного инструмента, вызывающее остановку биосинтеза белка, приводящее к прекращению роста растения и в конечном случае к гибели растения, и, как минимум, к его повреждению.
ALS-ингибиторные гербициды широко применяются в современном сельском хозяйстве в связи с эффективностью при умеренных расходных количествах и с их относительной не токсичностью по отношению к животным, эти семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие чувствительных растений, включая многие виды сорняков. Для того чтобы создать растения с повышенной толерантностью даже по отношению к высоким концентрациям ALS-ингибиторных гербицидов, которые могут потребоваться для достаточного контроля сорняков, необходимо дополнительно выводить улучшенные линии или сорта культурных растений, которые устойчивы к ALS-ингибиторным гербицидам, а также создать способы и композиции для производства и применения улучшенных линий или сортов культурных растений, которые устойчивы к ALS-ингибиторным гербицидам.
Широкое разнообразие ALS-ингибиторных гербицидов позволяет фермерам контролировать широкий ряд видов сорняков независимо от их стадии роста, однако эти высокоэффективные гербициды не могут быть применены в свекле в связи с тем, что обычные растения свеклы /коммерческие сорта свеклы очень чувствительны к этим ALS-ингибиторным гербицидам. Однако эти ALS-ингибиторные гербициды обладают очень хорошей гербицидной активностью по отношению к широколистным и злаковым видам сорняков. Первые гербициды, имеющие моду действия по ингибированию ALS, были созданы для применения в сельском хозяйстве уже 30 лет тому назад. В настоящее время активные вещества этого класса гербицидов проявляют строгий контроль сорняков и широко применяются в кукурузе и зерновых культурах, а также в двудольных культурах, за исключением сахарной свеклы.
Единственный ALS-ингибиторный гербицид, о котором известно, что он применяется в настоящее
- 1 036006 время по послевсходовой схеме применения в свекле, является дебут®. Этот гербицид (содержащий трифлусульфурон-метил в качестве активного ингредиента плюс специфические соединения для приготовления препарата) разрушается сахарной свеклой до того, как он может ингибировать эндогенный ALS энзим свеклы, но он имеет несколько пробелов при контроле сорняков на площадях, где выращивают свеклу.
С тех пор как ALS-ингибиторные гербициды были применены в сельском хозяйстве, было замечено, что чувствительные виды растений, включая естественно встречающиеся сорняки, время от времени спонтанно развивают толерантность к этому классу гербицидов. Единичные замещения пары оснований в специфических местах ALS гена обычно приводят к более или менее устойчивым вариантам ALS энзима, который показывает различные уровни ингибирования под воздействием ALS-ингибиторных гербицидов.
Растения, обладающие мутантными ALS аллелями, поэтому показывают различные уровни толерантности к ALS-ингибиторным гербицидам в зависимости от химической структуры ALSингибиторных гербицидов и местоположения точки мутации в ALS гене. Например, Hattori и др., (1995), Mol. Gen. Genet. 246: 419-425, описывают единичную мутацию в Trp 557 кодоне в Brassica napus клеточной линии (согласно нумерации Arabidopsis thaliana последовательности, которую используют в литературе для того, чтобы сравнивать все ALS/AHAS мутанты, это относится к позиции 574), которая соответствует позиции 569 ALS последовательности в свекле. Эти авторы наблюдали устойчивость по отношению к нескольким членам подклассов ALS-ингибиторных гербицидов, подобных сульфонилмочевинам, имидазолинонам и триазолопиримидинам.
Мутанты свеклы описаны в связи с точкой мутации в Ala 122 кодоне, которая приводит к определенной толерантности по отношению к ALS-ингибиторным гербицидам подкласса имидазолинонов (WO 98/02526), но которая недостаточна для контроля сорняков по схеме сельскохозяйственного применения. Никакой перекрестной толерантности к другим ALS-ингибиторным гербицидным классам не было описано при использовании этого мутанта. Более того, растения свеклы, имеющие вторую точку мутации в Pro 197 кодоне, показывают умеренную толерантность к ALS-ингибиторным гербицидам, относящимся к членам подкласса сульфонилмочевинных гербицидов. Также описаны двойные мутанты этих двух (WO 98/02527). Однако ни один из этого многообразия мутантов не был использован для выхода на рынок многообразия свеклы в связи с тем, что уровень гербицидной толерантности к ALS-ингибиторным гербицидам был недостаточно высок в этих мутантах для агрономического применения. Stougaard и др., (1990), J. Cell Biochem., Suppl. 14Е, 310 описывают выделение ALS мутантов из клеточной культуры тетраплоидной сахарной свеклы. Были выделены два различных ALS гена (ALS I и ALS II), которые отличаются только в аминокислотной позиции 37. Мутант 1 содержит в своем ALS I гене 2 мутации, тогда как мутант 2 содержит 3 мутации в его ALS II гене. После того как эти мутации были разделены, при решении вопроса о том, какая мутация придает устойчивость по отношению к ALS ингибитору, выяснилось, что ALS, синтезированный из рекомбинантного Е. coli, был устойчивым к гербицидам в том случае, когда содержал точечную мутацию в Trp 574 кодоне (согласно нумерации Arabidopsis thaliana последовательности, которую используют в литературе, для того чтобы сравнивать всех ALS мутантов), которая соответствует позиции 569 ALS последовательности в свекле, ведущей к замещению аминокислоты Trp аминокислотой Leu. Stougaard и др. не было показано для сахарной свеклы, что мутации в позиции 569 любого из ALS генов сахарной свеклы достаточно для того, чтобы получить приемлемый уровень толерантности к ALS-ингибиторным гербицидам. Кроме того, Stougaard и др. не регенировали или не обращались с растениями сахарной свеклы, содержащими одну мутацию, включая Trp ^ Leu мутацию в позиции 569 ALS сахарной свеклы.
Зная об этом, Stougaard и др. сконструировали трансформационный вектор растения, содержащего различные ALS гены для применения при трансформации растений. Однако до настоящего времени нет дополнительных данных, в частности, отсутствуют данные относительно влияния ALS-ингибиторных гербицидов на растения и/или на сельскохозяйственные области, включающие такие мутации в растениях Beta vulgaris, не были открыты этими или другими авторами как в генной инженерии, так и в мутантных растениях в течение более чем 20 лет после этого.
В WO 99/57965 вообще описаны растения сахарной свеклы, устойчивые к сульфонилмочевинам, и способы их получения путем EMS (этилметансульфонатного) мутагенеза. Однако отдельно от исследований, которые требуются для получения таких мутантов, в данной публикации не предоставляются такие растения и не описывается никаких локализаций в ALS генах, которые могут быть уместны, для получения мутантов, толерантных к ALS-ингиторным гербицидам, не открыто никакой корреляции для агрономического применения для этого. Кроме того, существует большая вероятность того, что путем применения такого сильно мутагенного соединения как EMS могут быть вызваны дополнительные мутации в другом месте в геноме, которые могут привести к недостаткам вплоть до отсутствия фертильности и/или остановки роста полученных таким образом растений. Более того, в связи с их химическим взаимодействием с ДНК, применение EMS может иметь лакуны при индуцировании специфических мутаций, подобные превращению триплета TGG в TTG, поскольку EMS всегда превращает гуанозин в аденозин.
В некоторых видах сорняков, таких как амарантус (Amaranthus), мутация Trp 574 Leu может быть
- 2 036006 обнаружена у популяций растений, которые были подвергнуты повторной экспозиции ALSингибиторным гербицидом. Мутанты Trp 574 Leu показывают высокий уровень толерантности по отношению к нескольким химическим классам ALS-ингибиторных гербицидов, таких как выбираемые из группы, включающей сульфонилмочевины и сульфониламинокарбонилтриазолиноны.
В WO 2008/124495 открыты ALS двойные и тройные мутанты. Согласно WO 2009/046334 были созданы специфические мутации в ALS гене. Однако агрономически используемые толерантные к гербицидам мутанты Beta vulgaris, содержащие такие мутации согласно WO 2009/046334, до сих не были получены.
Более того, с учетом того факта, например, что из сахарной свеклы получают около 20% производимого в мире сахара, также является в высокой степени желательным, чтобы имелись доступные растения сахарной свеклы, которые имеют преимущества в росте по сравнению с высокоэффективными сорняками. Таким образом, в высокой степени желательно иметь доступные, по отношению к ALS генам не трансгенные растения Beta vulgaris, включая растения сахарной свеклы, которые толерантны к ALSингибиторным гербицидам. Следовательно, имеется необходимость в таких не трансгенных растениях Beta vulgaris, в частности растений сахарной свеклы, которые толерантны к ALS-ингибиторным гербицидам, на агрономически эксплуатируемом уровне ALS-ингибиторных гербицидов.
Таким образом, техническая проблема должна быть подчинена этой потребности.
Данное изобретение направлено на удовлетворение этой потребности и обеспечивает решение этой технической проблемы с помощью ALS-ингибиторного гербицида, толерантного к растениям Beta vulgaris и их частям, содержащим мутацию эндогенного ацетолактатсинтазы (ALS) гена, в котором ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, отличную от триптофана в позиции 569 ALS полипептида.
Семена согласно данному изобретению были задепонированы в NCIMB, Aberdeen, Великобритания под номером NCIMB 41705 12 марта 2010 г.
Применяя различные способы разведения, могут быть впоследствии развиты высокоурожайные коммерческие сорта высококонкурентных на всех специфических рынках, обладающих добавленной сильной толерантностью к ALS-ингибиторным гербицидам, при использовании первоначально полученных мутантных растений.
Следует заметить, что используемое в тексте единственное число также охватывает и множественное число, если только в тексте четко не оговорено другое. Так, например, ссылка на реагент (a reagent) охватывает один или более различных реагентов и ссылка на способ (the method) охватывает ссылку на эквивалентные стадии и способы, которые известны специалистам и которые могут быть модифицированы или замещены способами описанными здесь.
Все публикации и патенты, цитированные в этом изобретении, включены в виде ссылки в это описание. В том случае, когда материалы, содержащиеся в ссылках, противоречат или не согласуются с этим описанием, описание исключает любой такой материал.
Если по-другому не оговорено, термин как минимум, предшествующий серии элементов, следует понимать, как относящийся к каждому элементу серии. Специалисты могут опознать или способны установить, используя только рутинные эксперименты, много эквивалентов специфических воплощений изобретения, описанных здесь. Имеется в виду, что такие эквиваленты также включены в данное изобретение.
Во всем описании и в формуле изобретения за исключением случаев, когда контекст говорит о другом, слово включает и его вариации, такие как включают и включая, следует понимать как включение указанного целого или стадии или группы целых или стадий, но не означает исключение любого другого целого или стадии или группы целых или стадий. Слово включает и его вариации, с одной стороны, и содержит и его аналоговые вариации, с другой стороны, могут использоваться взаимозаменяемо, не отдавая предпочтение любому из них.
В данном изобретении были получены растения свеклы, которые включают измененный эндогенный ALS ген (также отнесенный как AHAS ген), имеющий точку мутации в Trp 569 кодоне (по отношению к Beta vulgaris ALS аминокислотной последовательности для сравнения, показанной в SEQ ID NO: 2; это равняется позиции 574 Arabidopsis thaliana последовательности для сравнения, как показано в SEQ ID NO: 6), и точка мутации которой была получена в результате нескольких циклов селекции на специально выбранных ALS-ингибиторных гербицидах.
Принимая во внимание тот факт, что В. vulgaris растения данного изобретения были получены путем выделения спонтанных мутантных клеток растения, которые напрямую регенерируют до полностью фертильных растений свеклы, как описано здесь более детально, эти растения являются не трансгенными в той мере, как это касается ALS гена.
Кроме того, растения данного изобретения сами по себе, а также их потомство являются фертильными и поэтому могут оказаться полезными для целей размножения без любых дополнительных манипуляций, которые могут вызвать стресс, индуцированный дальнейшим изменением генетической основы. Такие растения, полученные согласно процедуре селекции, примененной здесь, могут напрямую применяться для того, чтобы создавать разнообразия свеклы и/или гибриды, предоставляющие агроно- 3 036006 мически полезные уровни толерантности к ALS ингибиторным гербицидам, таким образом, давая возможность для мер инновативного контроля сорняков в местах произрастания свеклы.
Применяемый здесь термин трансгенный означает, что ген, который может быть на той же самой или на отличной частице был введен в растение с помощью подходящего биологического носителя, такого как Agrobacterium tumefaciens, или с помощью другого физического средства, такого как трансформация протопласта или бомбардировка частицами, и который ген может быть экспрессирован в окружении нового хозяина, в частности генетически модифицированного организма (GMO).
В согласии с приведенным выше определением термин не трансгенный означает точно противоположное, т.е. что не было введения соответствующего гена с помощью подходящего биологического носителя или с помощью другого физического средства. Однако мутированный ген может быть перенесен с помощью опыления, или естественно, или с помощью процесса размножения с получением другого не трансгенного растения относительно этого специфического гена.
Эндогенный ген означает ген растения, который не был введен в растение с помощью техники генной инженерии.
Термин последовательность, который применяется здесь, относится к нуклеотидной(ым) последовательности(ям), полинуклеотиду(ам), последовательности(ям) нуклеиновых кислот, нуклеиновой(ым) кислоте(ам), молекуле нуклеиновой кислоты, пептидам, полипептидам и белкам в зависимости от контекста, в котором использован термин последовательность.
Термин нуклеотидная(ые) последовательность(и), полинуклеотид(ы), последовательность(и) нуклеиновых кислот, нуклеиновая(ые) кислота(ы), молекула нуклеиновой кислоты применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к нуклеотидам как к рибонуклеотидам, так и деоксирибонуклеотидам или к комбинациям обоих, в полимерной неразветвленной форме любой длины. Последовательности нуклеиновых кислот включают ДНК, цДНК, геномные ДНК, РНК, синтетические формы и смешанные полимеры, обе сенс и антисенс ветви спирали, или могут содержать неприродные или производные нуклеотидные основания, что может быть без затруднений определено специалистами.
В том случае, когда здесь применяют термин полипептид или белок (оба термина применяются здесь взаимозаменяемо), он означает пептид, белок или полипептид, который включает аминокислотную цепь заданной длины, в которой аминокислотные остатки соединены ковалентными пептидными связями. Однако пептидомиметики таких белков/полипептидов, в которых аминокислота(ы)) и/или пептидная(ые) связь(и) были замещены функциональными аналогами, также охватываются изобретением, как и аминокислоты, отличные от тех 20, которые кодируют ген, такие как селеноцистеин. Пептиды, олигопептиды и белки могут быть объединены термином полипептиды. Термин полипептид также относится к и не исключает модификации полипептида, т.е. гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Такие модификации хорошо описаны в основополагающих текстах и в более детальных монографиях, а также в научно-исследовательской литературе. Полипептид (или белок) который предпочтительно имеется в виду, здесь представляет собой В. vulgaris ALS полипептид (или ALS белок) [последовательность SEQ ID NO: 2].
Аминокислотные замещения охватывают аминокислотные изменения, при которых один аминокислотный остаток замещается на отличающийся, встречающийся в природе аминокислотный остаток. Такие замещения можно классифицировать как консервативные, при которых аминокислотный остаток, содержащийся в диком виде ALS белка, замещают на другой встречающийся в природе аминокислотный остаток похожего типа, например Gly^Ala, Val^Ile^Leu. Asp^Glu. Lys^Arg. Asn^GIn или Phe^Trp^Tyr. Замещения, охватываемые данным изобретением, также могут быть не консервативными, при которых аминокислотный остаток, содержащийся в диком виде ALS белка, замещают на аминокислотный остаток с отличающимися свойствами, такой как встречающийся в природе аминокислотный остаток из отличающейся группы (например, замещение заряженной или гидрофобной аминокислоты на аланин). Термин похожие аминокислоты, применяемый здесь, относится к аминокислотам, которые имеют похожие аминокислотные боковые цепи, т.е. аминокислоты, которые имеют полярные не полярные или практически нейтральные боковые цепи. Не похожие аминокислоты, применяемый здесь, относится к аминокислотам, которые имеют отличающиеся аминокислотные боковые цепи, например аминокислота с полярной боковой цепью является не похожей по отношению к аминокислоте с не полярной боковой цепью. Полярные боковые цепи обычно имеют тенденцию присутствия на поверхности белка, где они могут взаимодействовать с водным окружением, имеющимся в клетках (гидрофильные аминокислоты). С другой стороны, не полярные аминокислоты имеют тенденцию оставаться внутри центра белка, где они могут взаимодействовать с похожими не полярными соседями (гидрофобные аминокислоты). К примерам аминокислот, которые содержат полярные боковые цепи, относятся аргинин, аспарагин, аспартат, цистеин, глутамин, глутамат, гистидин, лизин, серин и треонин (все являются гидрофильными, за исключением цистеина, который гидрофобен). К примерам аминокислот, которые содержат не полярные боковые цепи относятся аланин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин и триптофан (все являются гидрофобными, за исключением глицина, который нейтрален).
Как правило, специалистам известно, исходя из их общих знаний и из контекста, что термины ALS,
- 4 036006
ALSL, AHAS или AHASL применяют, когда имеются в виду как нуклеотидные последовательности или нуклеиновые кислоты, так и аминокислотные последовательности или полипептиды соответственно.
Термин ген, который применяется здесь, охватывает полимерную форму нуклеотидов любой длины как рибонуклеотиды, так и дезоксирибонуклеотиды. Термин охватывает ДНК и РНК с двойной или одинарной прядью спирали. Он также охватывает известные типы модификации, например метилирование, введение защитных групп, замещение одного или более естественно встречающихся нуклеотидов на его аналог. Предпочтительно ген охватывает кодирующую последовательность, которая кодирует приведенные здесь полипептиды. Кодирующая последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, которая транскрибирована в мРНК и/или транслирована в полипептид, когда ее помещают и когда находится под контролем подходящей регулирующей последовательности. Границы кодирующей последовательности определяются трансляционным стартовым кодоном у 5'концевой точки и трансляционным останавливающим кодоном у 3'-концевой точки. Кодирующая последовательность может включать, но не ограничивается им, мРНК, цДНК, рекомбинантную нуклеиновокислотную последовательность или геномный ДНК, в то же время могут присутствовать интроны при определенных обстоятельствах.
В том случае, когда здесь применяют термин Beta vulgaris, в сокращенном виде он имеет вид В. vulgaris. Кроме того, здесь применяют термин свекла. Эти три термина применяют взаимозаменяемо и под ними следует понимать все культивируемые виды Beta vulgaris, как определено в каталоге FordLloyd (2005) Sources of genetic variation, Genus Beta; в книге Biancardi E., Campbell L.G., Skaracis G.N., De Biaggi M. (eds), Genetics and Breeding of Sugar Beet. Science Publishers, Enfield (NH), США, pp. 25-33. Аналогично, например, термин Arabidopsis thaliana имеет сокращенный вид A. thaliana. Оба термина взаимозаменяемо применяются здесь.
Термин позиция, применяемый согласно данному изобретению, означает или позицию аминокислоты в аминокислотной последовательности, приведенной здесь, или позицию нуклеотида внутри нуклеотидной последовательности, приведенной здесь. Термин соответствующая, применяемый здесь, также означает, что позиция определяется не только номером предшествующих нуклеотидов/аминокислот.
Позиция данного нуклеотида в согласии с данным изобретением, которая может быть замещена, может варьироваться в зависимости от стираний или дополнительных нуклеотидов в другом месте ALS 5'-нетрансляционной области (UTR), включая промотор и/или любую другую регулирующую последовательность или ген (включая эксоны и интроны). Подобным образом, позиция данной аминокислоты в согласии с данным изобретением, которая может быть замещена, может варьироваться в зависимости от стираний или добавлений аминокислот где-нибудь в ALS полипептиде.
Под термином соответствующая позиция в согласии с данным изобретением понимают, что нуклеотиды/аминокислоты могут отличаться по указанному номеру, однако могут еще иметь похожие соседние нуклеотиды/аминокислоты. Упомянутые нуклеотиды/аминокислоты, которые могут быть замещены, стерты или добавлены, также охвачены термином соответствующая позиция.
Для того чтобы определить соответствует ли нуклеотидный остаток или аминокислотный остаток в данной ALS-нуклеотидной/аминокислотной последовательности определенной позиции в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, специалисты могут использовать хорошо известные средства и способы, например выравнивание вручную или с применением компьютерных программ, таких как BLAST (Altschul и др., (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403-410), которые являются исследовательскими инструментами для базового локального отнесения Basic Local Alignment Search Tool or ClustalW (Thompson и др., (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680), или любые другие подходящие программы, которые пригодны для генерирования выравнивания последовательностей.
Последовательность SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую Beta vulgaris дикого типа ALS. Последовательность SEQ ID NO: 2 представляет собой Beta vulgaris аминокислотную последовательность, полученную из последовательности SEQ ID NO: 1. Соответственно, кодон в позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 кодирует аминокислоту в позиции 569 (т.е. аминокислоту Trp согласно трехбуквенному коду или W согласно однобуквенному коду) последовательности SEQ ID NO: 2.
Другая возможность состоит в применении для определения того, находится ли нуклеотидный остаток или аминокислотный остаток в данной ALS-нуклеотидной/аминокислотной последовательности в определенной позиции в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, нуклеотидной последовательности, кодирующей A. thaliana дикого типа ALS, показанной в последовательности SEQ ID NO: 5. Последовательность SEQ ID NO: 6 представляет собой A. thaliana аминокислотную последовательность, полученную из последовательности SEQ ID NO: 5.
Соответственно кодон в позиции 1720-1722 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 кодирует аминокислоту в позиции 574 (т.е. аминокислоту Trp согласно трехбуквенному коду или W согласно однобуквенному коду) последовательности SEQ ID NO. 6.
В A. thaliana дикого типа ALS нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, ис- 5 036006 пользуется в качестве последовательности для сравнения (как это делают в большей части литературы по этому вопросу, и поэтому используется для создания возможности более легкого сравнения с такими известными последовательностями), кодон, кодирующий аминокислоту, которая отлична от триптофана, находящийся в позиции, соответствующей позиции 1720-1722 нуклеотидной последовательности A. thaliana ALS гена, показанной в последовательности SEQ ID NO: 5.
Однако последовательность SEQ ID NO: 1 является более предпочтительной в качестве нуклеотидной последовательности для сравнения, и последовательность SEQ ID NO: 2 является более предпочтительной аминокислотной последовательностью для сравнения во всех последующих открытиях.
Следующая таблица представляет обзор последовательностей для сравнения, использованных здесь, когда определяют позицию точки мутации в нуклеотидной последовательности или замещения в аминокислотной последовательности.
Последовательность SEQ ID NO: Тип последовательности Вид
1 Нуклеотидная последовательность В. vulgaris
2 Аминокислотная последовательность В. vulgaris
3 Нуклеотидная последовательность (мутированная) В. vulgaris
4 Аминокислотная последовательность (мутированная) В. vulgaris
5 Нуклеотидная последовательность A. thaliana
6 Аминокислотная последовательность A. thaliana
Так, при любом событии эквивалентную позицию определяют только путем выравнивания с последовательностью для сравнения, такой как SEQ ID NO: 1 или 5 (нуклеотидная последовательность) или SEQ ID NO: 2 или 6 (аминокислотная последовательность).
В связи с различиями между В. vulgaris дикого типа ALS геном и ALS геном, охватываемым В. vulgaris растением данного изобретения, ALS гены (или полинуклеотидные или нуклеотидные последовательности), охватываемые В. vulgaris растениями данного изобретения, могут также рассматриваться как мутантные ALS гены, мутаннтные ALS аллели, мутантные ALS полинуклеотиды или подобные. Так, по всему описанию термины мутантный аллель, мутантный ALS аллель, мутантный ALS ген или мутантный ALS полинуклеотид используются взаимозаменяемо.
Если по-другому здесь не оговорено, эти термины относятся к нуклеотидной последовательности, которая содержит кодон, кодирующий аминокислоту, отличную от триптофана, в позиции, которая соответствует позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанной в последовательности SEQ ID NO: 1. Если сравнить по отношению к А. thaliana последовательности для сравнения, показанной в SEQ ID NO: 5, позиция кодона является 1720-1722.
Таким же образом, эти термины относятся к нуклеотидной последовательности, которая кодирует ALS белок, который имеет в позиции, соответствующей позиции 569 аминокислотной последовательности Beta vulgaris ALS белка, показанной в последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислоту, отличную от триптофана. Если сравнить по отношению к A. thaliana последовательностьи для сравнения, показанной в SEQ ID NO: 6, позиция является 574.
Одна аминокислота, отличная от триптофана (обозначенного как Trp согласно трехбуквенному коду или W эквивалентно согласно однобуквенному коду) охватывает любую встречающуюся в природе аминокислоту, отличную от триптофана. Эти встречающиеся в природе аминокислоты охватывают аланин (А), аргинин (R), аспарагин (N), аспартат (D), цистеин (С), глутамин (Q), глутамат (Е), глицин (G), гистидин (Н), изолейцин (I), лейцин (L), лизин (K), метионин (М), фенилаланин (F), пролин (Р), серин (S), треонин (Т), тирозин (Y) или валин (V).
Однако предпочтительно, когда аминокислота, отличная от триптофана (относящегося к группе нейтрально-полярных аминоксилот), является аминокислотой с физико-химическими свойствами, отличными от свойств триптофана, т.е. относящейся к любой аминокислоте, проявляющей нейтрально- 6 036006 неполярные, кислотные или основные свойства. Предпочтительно аминокислоту, отличную от триптофана, выбирают из группы, включающей аланин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, валин и аргинин. Более предпочтительно указанная аминокислота представляет собой нейтральную не полярную аминокислоту, такую как аланин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин или валин. Еще более предпочтительно указанная аминокислота представляет собой аланин, глицин, изолейцин, лейцин, валин. Наиболее предпочтительным является глицин и лейцин. Самым предпочтительным является лейцин.
В контрасте, если по особому не оговорено, термины дикого типа аллель, дикого типа ALS аллель, дикого типа ALS ген или дикого типа ALS полинуклеотид относятся к нуклеотидной последовательности, которая кодирует ALS белок, в котором отсутствует W569 замещение по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2 (или W574 замещение по отношению к последовательности SEQ ID NO: 6). Эти термины также относятся к нуклеотидным последовательностям, включающим в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанного в последовательности SEQ ID NO: 1, кодону, кодирующему аминокислоту, отличную от триптофана.
Такой дикого типа аллель, дикого типа ALS аллель, дикого типа ALS ген или дикого типа ALS полинуклеотид может включать или не включать мутации, которые отличны от мутаций, которые вызывает W569 замещение.
По существу, что касается ALS гена, единственное различие между диким типом В. vulgaris растения и В. vulgaris растением данного изобретения состоит предпочтительно в том (и особенно), что в нем специфицирована позиция (в частности, позиция, соответствующая позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанной в последовательности SEQ ID NO: 1), В. vulgaris растение данного изобретения содержит кодон, кодирующий аминокислоту, которая отлична от триптофана, предпочтительно кодон кодирует аминокислоту, как специфицировано в другом месте. Однако, как указано выше, могут существовать другие различия, такие как присутствие дополнительных мутаций между диким типом и мутантным ALS аллелем, как указано здесь. Пока эти другие различия неуместны, поскольку присутствуют различия, объясненные перед этим.
Следовательно, W569 замещение (или W574 замещение, в том случае, когда используют A. thaliana ALS аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 для сравнения) является результатом изменения кодона в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1 (или в позиции, соответствующей позиции 1720-1722 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, соответственно). Предпочтительно замещение в позиции 569 является W^L замещением, в котором L кодируется любым из кодонов СТТ, СТС, СТА, CTG, ТТА или TTG.
Более предпочтительно замещение в позиции 569 является W^L замещением, поскольку происходит превращение G нуклеотида в позиции, соответствующей позиции 1706 нуклеотидной последовательности в SEQ ID NO: 1 (или в позиции, соответствующей позиции 1721 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, соответственно), в Т нуклеотид.
Соответственно, кодон в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1 (или в позиции, соответствующей позиции 1720-1722 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, соответственно), меняется из TGG в TTG. В то время как кодон TGG кодирует триптофан, кодон TTG кодирует лейцин.
В результате, в наиболее предпочтительном варианте данного изобретения обеспечивается Beta vulgaris растение, включающее нуклеотидную последовательность эндогенного ALS гена, кодон TTG (кодирующий лейцин) в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS мутантного гена, показанную в последовательности SEQ ID NO: 1, эта нуклеотидная последовательность включает (или менее предпочтительно состоит из) последовательность SEQ ID NO: 3.
В. vulgaris растения, кодируемые ALS полипептидом, имеющим в позиции 569 аминокислотной последовательности Beta vulgaris ALS белка, показанного в последовательности SEQ ID NO: 2, отличную от триптофана аминокислоту, предпочтительно включают в нуклеотидной последовательности эндогенного ALS гена один кодон, кодирующий отличную от триптофана аминокислоту в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанного в последовательности SEQ ID NO: 1.
Термин В. vulgaris ALS или AHAS ген также включает В. vulgaris нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 90, 95, 97, 98 или 99% идентична с В. vulgaris ALS нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или 3, в которой эти на 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичные нуклеотидные последовательности включают в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательностьи SEQ ID NO: 1, один кодон, кодирующий отличную от триптофана аминокислоту.
Таким же образом, эти как минимум на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичные нуклеотидные последовательности кодируют ALS полипептид, включающий в позиции, соответствующей позиции 569 в последовательности SEQ ID NO: 2, отличную от триптофана аминокислоту. Упомянутые идентичные нук- 7 036006 леотидные последовательности кодируют ALS белок, который сохраняет активность, как описано здесь, более предпочтительно таким образом закодированный ALS полипептид является толерантным к одному или нескольким ALS ингибиторным гербицидам, как описано здесь. Этот термин также включает аллельные варианты и гомологи кодированного ALS полипептида, который предпочтительно толерантен к одному или более ALS ингибиторных гербицидов, как описано здесь.
Для того чтобы определить имеет ли последовательность нуклеиновых кислот определенную степень идентичности с последовательностями нуклеиновых кислот данного изобретения, специалисты могут использовать хорошо известные средства и способы, например, выравнивание (выверка), или вручную или с использованием компьютерных программ, которые упомянуты далее ниже в связи с определением термина гибридизация и степени гомологии.
Например, BLAST, который означает основной инструмент поиска локального выравнивания (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), может быть использован для поиска локальных выравниваний последовательностей. BLAST производит выравнивания как нуклеотидных, так и аминокислотных последовательностей, для того чтобы определить схожесть последовательностей. В связи с локальной природой выравнивания BLAST является особенно полезным при определении точных пар или при идентификации похожих последовательностей. Фундаментальной единицей для выработки BLAST алгоритма является высокоапробированная сегментная пара (HSP). Одна HSP состоит из двух фрагментов последовательности произвольной, но одинаковой длины, чье выравнивание является локально максимальным и для которой степень выравнивания совпадает или превышает порог или отсечку, установленную пользователем. BLAST приближение состоит в том, чтобы посмотреть HSPs между стоящей под вопросом последовательность и последовательностью из базы данных, для того чтобы определить статистическую важность любой найденной пары, и сделать доклад только для таких пар, которые удовлетворяют выбранным пользователям порогам важности. Параметр Е устанавливает статистическую важность порога для рассматриваемых пар последовательностей из базы данных. Е интерпретируется как верхний предел ожидаемой частоты возможности появления одной HSP (или ряда HSP) в контексте общего поиска в базе данных. О любой последовательности базы данных, чья пара удовлетворяет Е, сообщается в программном выходе.
Аналогичная компьютерная техника, использующая BLAST (Altschul (1997), цит. выше; Altschul (1993), цит. выше; Altschul (1990), цит. выше) была применена для поиска идентичных или родственных молекул в нуклеотидной базе данных, такой как GenBank или EMBL. Этот анализ является более быстрым, чем основанная на мультиплетной мембране гибридизация. Кроме того, чувствительность компьютерного поиска можно модифицировать для того, чтобы определить, относится ли определенная пара к категории точно соответствующих или похожих. Основой для поиска является результат расчета, который определяется как % идентичности поспедоватепы-юсти х % максимума BLAST расчета
100 и он принимает во внимание как степень похожести двух последовательностей, так и длину пары последовательности. Например, при результате расчета 40 пара является точно соответствующей с ошибкой в пределах 1-2%; и при результате расчета 70 пара является точно соответствующей. Похожесть молекул обычно идентифицируется путем выбора таких, которые показывают результат расчета между 15 и 40, хотя более низкие результаты могут идентифицировать родственные молекулы.
Термин В. vulgaris ALS или AHAS полипептиды также охватывает аминокислотные последовательности, которые как минимум на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичны с ALS аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или 4, в которой эти как минимум на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичные с аминокислотной последовательностью содержат в позиции, соответствующей позиции 569 последовательности SEQ ID NO: 2, одну аминокислоту, отличную от триптофана. Указанная идентичная аминокислотная последовательность сохраняет активность ALS, как описано здесь, более предпочтительно ALS полипептид является толерантным к ALS ингибиторным гербицидам, как описано здесь.
Активность ALS, если потребуется, может быть измерена в соответствии с опытами, описанными в статье Singh, (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4572-4576.
Тем не менее, ALS нуклеотидные последовательности, имеющиеся в виду здесь и кодирующие ALS полипептиды, придают толерантность к одному или более ALS-ингибиторным гербицидам (или, наоборот, меньшую чувствительность к ALS-ингибиторному гербициду), как описано здесь. Это связано с точкой мутации, приводящей к аминокислотному замещению, как описано выше.
Соответственно, толерантность к одному ALS-ингибиторному гербициду (или, наоборот, меньшая чувствительность к ALS-ингибиторному гербициду) может быть измерена путем сравнения ALS активности, определенной для экстрактов клеток растений, которые содержат мутированные ALS последовательности, и растений, у которых отсутствуют мутированные ALS последовательности, в присутствии ALS ингибиторных гербицидов, подобно тому, как описано в статье Singh и др., (1988), [J. Chromatogr., 444, 251-261].
- 8 036006
Однако более предпочтительные опыты по определению активности для ALS полипептидов, кодированных нуклеотидной последовательностью, которая включает кодон, кодирующий аминокислоту, отличную от триптофана в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанных в SEQ ID NO: 1, могут быть представлены, как показано ниже.
Кодирующую последовательность Beta vulgaris дикого типа и мутанта В. vulgaris растения клонируют, например, в Novagen pET-32а(+) векторах и векторы трансформируют, например, в Escherichia coli AD494 согласно инструкциям изготовителя. Бактерии, предпочтительно выращиваемые при температуре 37°С в среде при выбранном давлении, такой как LB-среда, содержащая 100 мг/л карбенциллина и 25 мг/л канамицина, индуцируют, например, 1 мМ изопропил-в-Э-тиогалактопиранозида при OD600 предпочтительно около 0,6, культивированные около 16 ч предпочтительно при температуре 18°С и выделенные центрифугированием. Батериальные пилюли ресуспендируют в 100 мМ буфера из фосфата натрия рН 7,0, содержащего 0,1 мМ тиамин-пирофосфата, 1 мМ MgCl2 и 1 мкМ FAD с концентрацией 1 г влажного веса на 25 мл буфера и разрушают, обрабатывая звуком. Необработанный экстракт белка, полученный после центрифугирования, используют для измерения ALS активности.
После этого проводят опыты с ALS, например, в микротитровальных пластинках с 96-выемками, применяя модификацию процедуры, описанной в статье Ray, (1984), Plant Physiol., 75, 827-831. Реакционная смесь содержит предпочтительно 20 мМ буфера из фосфата калия с рН 7,0, 20 мМ пирувата натрия, 0,45 мМ тиамин-пирофосфата, 0,45 мМ MgCl2, 9 мкМ FAD, ALS энзим и различные концентрации ALS ингибиторов в конечном объеме около 90 мкл.
Опыты инициируют добавлением энзима и заканчивают предпочтительно через 75 мин инкубирования при температуре 30°С путем добавления 40 мкл 0,5М H2SO4. После выдерживания около 60 мин при комнатной температуре добавляют около 80 мкл раствора 1,4% α-нафтола и 0,14% креатина в 0,7М NaOH и дополнительно инкубируют около 45 мин при комнатной температуре, определяют поглощение при длине волны 540 нм. pEo-значения для ингибирования ALS определяют, как описано в статье Ray, (1984), Plant Physiol., 75, 827-831, используя программу для совпадения кривой XLFit Excel add-in version 4.3.1 фирмы ID Business Solutions Limited, Guildford, Великобритания.
В том случае, когда используют растения, ALS активность предпочтительно определяют в экстрактах клеток или экстрактах листьев дикого типа и в экстрактах клеток или экстрактах листьев полученного мутанта В. vulgaris в присутствии различных концентраций ALS ингибиторных гербицидов, предпочтительно сульфонилмочевинных гербицидов или сульфониламинокарбонил-триазолиноновых гербицидов, более предпочтительно в присутствии различных концентраций ALS ингибиторного гербицида форамсульфурона. ALS предпочтительно экстрагируют из листьев сахарной свеклы или из культур тканей сахарной свеклы, как описано в статье Ray, (1984), Plant Physiol., 75, 827-831.
Предпочтительно, чтобы растения В. vulgaris данного изобретения были менее чувствительными к ALS ингибиторам, предпочтительно как минимум в 100 раз менее чувствительны, более предпочтительно в 500 раз, еще более предпочтительно в 1000 раз и наиболее предпочтительно в 2000 раз. Менее чувствительно, как используется здесь, наоборот может рассматриваться как более толерантно или более устойчиво. Аналогично, более толерантное или более устойчивое можно наоборот рассматривать как менее чувствительное.
Например, растения В. vulgaris данного изобретения и, в частности, растения В. Vulgaris, описанные в примерах приложения, являются/является как минимум в 2000 раз менее чувствительным к ALSингибиторному гербициду формасульфурону (представитель ALS-ингибиторного подкласса сульфонилмочевинные гербициды) по сравнению с энзимами дикого типа.
Предпочтительно растения В. vulgaris данного изобретения менее чувствительны к различным представителям ALS-ингибиторных гербицидов, подобным сульфонилмочевинным гербицидам, сульфониламинокарбонилтриазолиноновым гербицидам и имидазолиноновым гербицидам. Сульфонилмочевинные гербициды и сульфониламинокарбонилтриазолиноновые гербициды, по отношению к которым указанные растения менее чувствительны, предпочтительно выбирают. В более предпочтительном варианте изобретения растения В. vulgaris данного изобретения менее чувствительны к ALS ингибиторному гербициду форамсульфурону (сульфонилмочевинный гербицид) или к одному или к комбинации с одним или более ALS-ингибиторных гербицидов или из подкласса сульфонилмочевинных гербицидов или любого другого подкласса ALS-ингибиторных гербицидов.
Следовательно, растения В. vulgaris данного изобретения, которые предпочтительно менее чувствительны к ALS-ингибиторному гербициду, можно таким же образом охарактеризовать, как более толерантные к ALS ингибитору (т.е. растения, толерантные к ALS ингибитору).
Таким образом, растение толерантное к ALS ингибитору представляет собой растение, в частности растение В. vulgaris, которое более толерантно как минимум к одному ALS-ингибиторному гербициду на уровне, при котором он нормально ингибирует рост нормального растения дикого типа, предпочтительно ALS-ингибиторный гербицид контролирует растения нормального или дикого типа. Указанные растения нормального или дикого типа не включают в нуклеотидной последовательности никаких аллелей эндогенного ALS гена, кодона, кодирующего аминокислоту, отличную от триптофана в позиции,
- 9 036006 соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанной в последовательности SEQ ID NO: 1.
Указанная нуклеотидная последовательность может быть вообще также охарактеризована как нуклеотидная последовательность толерантная к ALS-ингибиторному гербициду. Под нуклеотидной последовательностью толерантной к ALS-ингибиторному гербициду подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидную последовательность, содержащую как минимум одну мутацию, которая проявляется кодоном, кодирующим аминокислоту, отличную от триптофана, относительно ALS белка, который не содержит в позиции, соответствующей позиции 569 аминокислотной последовательности В. vulgaris ALS белка, показанной в SEQ ID NO: 2 аминокислоту, отличную от триптофана, в которой указанная как минимум одна мутация выражается в экспрессии как минимум одного ALS белка, чувствительного к ALS-ингибиторному гербициду. Под толерантным к гербициду ALS белком подразумевается, что ALS белок проявляет более высокую ALS активность по сравнению с ALS активностью дикого типа ALS белка в присутствии как минимум одного ALS-ингибиторного гербицида, для которого известно, что он вредит ALS активности, и при концентрации или уровне указанного гербицида, для которых известно, что они ингибируют ALS активность ALS белка дикого типа.
Аналогично, термины ALS-ингибиmорный(ые) гербицид(ы) или просто ALS-ингибиmор(ы) используются взаимозаменяемо. Как используется здесь, ALS-ингибиторный гербицид или ALSингибитор не означает ограничения одним гербицидом, который воздействует на активность ALS энзима. Так, если особо не оговорено или не следует из контекста, ALS-ингибиторный гербицид или ALSингибитор может быть одним гербицидом или смесью двух, трех, четырех или более гербицидов, известных специалистам, предпочтительно, как специализировано здесь, каждый из них воздействует на активность ALS энзима.
Неожиданно было обнаружено, что даже единственная точка мутации согласно данному изобретению предоставляет агрономически полезные и стабильные уровни толерантности к ALS-ингибиторным гербицидам растений В. vulgaris, а также их ростков, в частности, если установлена гомозиготность. По сравнению с толерантными к гербицидам растениями Beta vulgaris той же самой генетической основы, у которых присутствует только гетерозиготно такая мутация, толерантные к гербицидам растения Beta vulgaris, которые являются гомозиготными для мутации, показывают лучший агрономический уровень толерантности к ALS-ингибиторному гербициду.
Поэтому данное изобретение относится к толерантному к ALS-ингибиторному гербициду Beta vulgaris растению, имеющему мутацию эндогенного ацетолактатсинтазы (ALS) гена, в котором ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, которая отлична от триптофана в позиции 569 ALS полипептида. Соответствующая мутация может быть представлена гетерозигозно и предпочтительно может быть единственной мутацией ALS гена. Более предпочтительно соответствующая мутация может быть гомозиготной, и еще более предпочтительно соответствующая мутация является гомозиготной, представленной в виде единственной мутации эндогенного ALS гена.
Оказалось совсем неожиданным, что достаточно только одной единичной мутации ALS гена в Beta vulgaris, поскольку, например, в WO 2010/037061 указано, что необходимы двойные или тройные мутанты в ALS гене для того, чтобы создать агрономически полезную толерантность к ALS-ингибиторным гербицидам.
Следовательно, растения В. vulgaris и их части, которые являются гетерозиготными, менее предпочтительны для мутации, но также охватываются данным изобретением и могут быть достаточными для некоторых схем применения и/или некоторых условий окружающей среды. Также данным изобретением охватываются растения, содержащие как минимум в одном аллеле эндогенного ALS гена один кодон, кодирующий аминокислоту, отличную от триптофана, предпочтительно лейцин в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанной в SEQ ID NO: 1, и содержащую один (в случае диплоидии) или более других аллелей (в случае полиплоидии), имеющих одну или более других мутаций в эндогенном ALS гене.
Соответственно, в том случае, когда здесь используют термин гетерозиготно или гетерозиготный, это означает, что растение данного изобретения имеет различные аллели в определенных местах, в частности в определенных местах ALS гена.
Гомозиготно или гомозиготный указывает на то, что растение данного изобретения имеет две копии одного и того же аллеля в разных прядях ДНК спирали, в частности в месте (локусе) ALS гена.
Как использовано здесь, если четко по-другому не оговорено, термин растение имеет в виду растение на любой стадии развития.
Предпочтительно, когда растение Beta vulgaris данного изобретения является ортоплоидным или анортоплоидным.
Ортоплоидное растение может предпочтительно быть гаплоидным, диплоидным, тетраплоидным, гексаплоидным, октаплоидным, декаплоидным или додекаплоидным, в то время как анортоплоидное растение может быть предпочтительно триплоидным или пентаплоидным.
Части растения могут быть присоединены к или отделены от всего не поврежденного растения. Такие части растения включают, но не ограничиваются ими, органы, ткани и клетки растения и предпочти- 10 036006 тельно семена.
Соответственно, растение В. vulgaris данного изобретения является не трансгенным по отношению к эндогенному ALS гену. Действительно, чужие гены могут быть перенесены в растение путем генетической инженерии или обычными способами, такими как скрещивание. Указанные гены могут быть генами, придающими толерантность к гербицидам, предпочтительно придающие толерантность к гербицидам, отличную от толерантности к ALS-ингибиторным гербицидам, гены, улучшающие урожайность, гены, улучшающие устойчивость к биологическим организмам, и/или гены, относящиеся к модификации содержания.
Другой аспект данного изобретения относится к способу получения растения Beta vulgaris и его частей, который включает следующие стадии:
(a) экспонирование каллюсов предпочтительно из сахарной свеклы в присутствии около 10-7 - 10-9 М ALS-ингибиторного гербицида, предпочтительно форамсульфурона;
(b) отбор колоний клеток, которые могут расти в присутствии примерно до 3х10-6 М одного ALSингибиторного гербицида, предпочтительно форамсульфурона [CAS RN 173159-57-4];
(c) регенерирование ростков в присутствии ALS-ингибиторного гербицида, предпочтительно форамсульфурона;
(d) отбор регенерированных растеньиц с помощью ALS-ингибиторного гербицида, предпочтительно форамсульфурона, йодсульфурон-метил-натрия [CAS RN 144550-36-7] и/или смеси обоих, в которой доза форамсульфурона предпочтительна эквивалентна 7-70 г а.в./га и доза йодсульфурон-метил-натрия предпочтительно эквивалентна 1-10 г а.в./га (а.в. = активное вещество).
В другом аспекте регенерированные растеньица, полученные согласно приведенным выше стадиям (а)-(й), могут применяться для дальнейшего получения растений Beta vulgaris при использовании следующих стадий (е)-(т):
(e) вегетативное микроразмножение отдельных растеньиц со стадии (d) для освобождения различных положительных вариантов путем установления клеточной линий (клонов) для каждого растеньица, толерантного к ALS-ингиторному гербициду;
(f) длительное хранение каждого установленного клона в вегетативном состоянии;
(g) перенос клонированных растений каждого клона из места длительного хранения в теплицу;
(h) яровизация и адаптация в яровизационных камерах для индуцирования цветения;
(i) перенос яровизированных растений в помещения, где происходит рост (контролируется температура и освещение);
(j) отбор лучших по выделению пыльцы растений среди лучших цветущих клонов для скрещивания с выхолощенными растениями элитной, но чувствительной к ALS-ингибиторным гербицидам линии для того, чтобы избежать отрицательного воздействия сомаклональной вариации на генеративную фертильность (плодовитость) (мужскую и женскую) растеньиц со стадии (d);
(k) обратное скрещивание с элитной линией, как только фертильность будет восстановлена, и, наконец, доведение самих гетерозиготных растений до достижения гомозиготного состояния;
(1) производство тестовых скрещиваний с партнером, чувствительным к ALS-ингибиторным гербицидам, и собственных семян каждой линии с обратным скрещиванием для полевых оценок;
(m) применение агрохимически приемлемой дозы различных ALS-ингибиторных гербицидов для того, чтобы выбрать лучшую преобразованную линию, предпочтительно в ее гомозиготном состоянии.
Линии, полученные согласно приведенным выше стадиям (а)-(1п). образуют основу для развития коммерческих многообразий, следуя процедурам, которые известны в сообществе, занимающемся размножением, и поддержаны молекулярной техникой размножения (такой как поддерживаемое маркером размножение или поддерживаемая маркером селекция) для ускорения процесса и обеспечения правильной селекции растений для того, чтобы или получить мутацию в ее гомозиготной форме, или в случае, когда содержится одна или более мутаций в различных местах ALS-кодирующего эндогенного гена, провести правильную селекцию гетерозиготных растений, которые содержат как минимум в одном из аллелей W569 мутацию согласно данному изобретению (для обзора см. Bertrand C.Y. и др., (2008), Phil. Trans. R. Soc, В., 363, 557-572).
Каллюсы получают средствами и способами, которые общеизвестны специалистам, например, как описано в прилагаемых примерах.
Семена, которые были получены на приведенной выше стадии (m), находятся на хранении в NCIMB, Aberdeen, Великобритания, под номером NCIMB 41705.
Другой аспект данного изобретения относится к способу получения толерантных к гербициду Beta vulgaris растения и его частей, который включает (i) мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS), при которой ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, которая отлична от триптофана, в позиции 569 ALS полипептида, и (ii) дополнительную мутацию в эндогенном ALS гене, включающую следующие стадии:
(a) получение толерантного к ALS-ингибиторному гербициду растения Beta vulgaris, которое включает одну мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS), в котором ALS ген кодирует ALS полипептид, который содержит аминокислоту, отличную от триптофана, в позиции 569 ALS полипептида
- 11 036006 (родитель А);
(b) скрещивание родителя А с растением Beta vulgaris (родитель В), которое включает одну или более других мутаций в эндогенном ALS гене в позиции, отличной от аминокислотной позиции 569;
(c) получение потомства Beta vulgaris, которое является гетерозиготным для мутации ALS гена в аминокислотной позиции 569 и для одной или более других мутаций ALS гена, кодируемых родителем В;
(d) в которых процесс размножения контролируется (i) применением маркера, поддерживающего размножение, и/или техники микропоследовательностей, и/или (ii) применение агрономически приемлемых доз одного или более ALS-ингибиторных гербицидов, к которым потомство, созданное согласно стадии (с), является толерантным.
Соответственно, предусмотрено, что данное изобретение также относится к растениям В. Vulgaris, которые получают приведенными выше способами получения.
В одном не ограничивающем примере растения сахарной свеклы данного изобретения получают, осуществляя следующий не ограничивающий протокол. Не связанный с теорией тот же протокол можно применять для получения растений В. Vulgaris, отличных от сахарной свеклы.
Клеточные культуры сахарной свеклы были инициированы из ростков диплоидной сахарной свеклы генотипа 7Т9044 (как описано, например, в реферате Alexander Dovzhenko, PhD Thesis, Title: Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) and sugarbeet (Beta vulgaris L.), Ludwig-MaximiliansUniversitat Munchen, Германия, 2001).
Семена сахарной свеклы погружают на 60 с в 70%-й этанол, затем дважды промывают стерильной водой с 0,01% детергента и после этого инкубируют в течение 1-4 ч в 1%-м NaOCl отбеливателе. Затем семена промывают 3 раза стерильной H2O и семена сохраняют в стерильной воде в течение ночи при температуре 4°С. Эмбрионы выделяют, используя пинцет и скальпель.
Свежеприготовленные эмбрионы помещают в 0,5%-й NaOCl на 30 мин и затем промывают 3 раза стерильной водой. После последней стадии промывания их помещают в свободную от гормонов MS агаровую среду (Murashige и Skoog (1962), Physiol. Plantarum, 15, 473-497). Такие эмбрионы, которые развиваются в стерильные ростки, были использованы для инициирования регенерируемых культур сахарной свеклы.
Семядоли, а также гипокотили были разрезаны на сегменты длиной 2-5 мм и затем были культивированы на агаровой (0,8%) отвержденной MS среде, содержащей или 1 мг/л бензиламинопурина (ВАР), или 0,25 мг/л тидиазурона (TDZ). Спустя 4 недели развившиеся ростковые культуры были перенесены на свежую агаровую среду того же состава и затем меняли культуру с месячным интервалом. Культуры выдерживали при температуре 25°С при сумеречном свете с циклом 12 ч/12 ч светло/темно.
После проведения 7-10 смен среды ростковые культуры, которые выращивались на среде, содержащей тидиазурон, сформировался явный тип каллюса, который быстро рос, был мягким и рыхлым. Цвет этого типа каллюса был желтоватый до слегка зеленого. Некоторые из этих рыхлых каллюсов сообразно производили хлорофилл, содержащий исходные ростковые подобные эмбриону структуры. Эти быстрорастущие регенерируемые каллюсы были использованы для селекции мутантов сахарной свеклы, толерантных к ALS-ингибиторным гербицидам.
Когда этот тип каллюса подвергали экспозиции с 10-9 М сульфонилмочевины форамсульфурона (CAS RN 173159-57-4), клетки выжили, однако произвели менее чем 50% от той биомассы, которую дали их близнецы в среде, которая не содержала ингибитора. В среде, которая содержала 3х10-8 М форамсульфурона, не было обнаружено никакого роста. Для широкой шкалы экспериментов по селекции мутантов была выбрана концентрация 10-7 М форамсульфурона. Колонии выживших и растущих клеток пронумеровывают и переносят по прохождении 4-6 недель на свежую среду, содержащую 3х10-7 М ингибитора. Одна из этих клеточных колоний была способна расти не только при этой концентрации ингибитора, но даже в присутствии 3х10-6 М форамсульфурона. Из этого клона (SB574TL) ростки были регенерированы в присутствии ALS-ингибиторных гербицидов и затем ростки были перенесены в MS среду, содержащую 0,05 мг/л нафталинуксусной кислоты (NAA).
В течение 4-12 недель ростки формируют стебли, и после этого их переносят в стерильные контейнеры для растений, заполненные влажным, стерилизованным перлитом, поливают в половину силы MS неорганическими ингредиентами. Альтернативно, ростки переносят напрямую из агаровой твердой среды в почвенную смесь, содержащую перлит, в теплицу. В течение первых 10-15 дней после переноса в почву, содержащую субстрат, растения выдерживают в окружении с высокой влажностью воздуха. Во время этого и после этого, когда их выдерживают при нормальных условиях влажности в теплице, растения выдерживают в парнике при искусственном освещении (12 ч) при температуре 20±3°С/15±2°С день/ночь.
Спустя 3-5 недель регенерированные растения от полученных выше толерантных к форамсульфурону клеточных культур (SB574TL), а также от дикого типа клеточных культур обрабатывают форамсульфуроном, йодсульфурон-метил-натрием (CAS RN 144550-3-7) и смесью обоих этих активных веществ. Тестируемые гербицидные дозы были эквивалентны 7-70 г а.в./га для форамсульфурона и 1-10 г
- 12 036006
а.в./га для йодсульфурон-метил-натрия. Регенерированные растения и этой линии клеток были толерантны даже при самой высокой дозе гербицида (форамсульфурон, йодсульфурон-метил-натрий и их смеси в соотношении 7:1), тогда как самые низкие дозы уже убивали растения дикого типа.
Ростки тестируют следующим образом (не ограничивающим путем). Основываясь на линии SB574TL F2 и F3 семена экспериментальных гибридов, включающих устойчивые аллели в гетерозиготном состоянии, а также F4-F6 семена, содержащие мутантные аллели в гомозиготном состоянии, были посеяны в поле и обработаны форамсульфуроном, йодсульфурон-метил-натрием, а также смесью обоих ALS-ингибиторных гербицидов, когда в растениях развились 3-5 розеточных листочков. Гомозиготные сеянцы оказались толерантными к смеси 35 г форамсульфурона/га + 7 г йодсульфурон-метил-натрия/га без остановки роста или любых видимых признаков повреждения. В некоторых случаях гетерозиготные линии обнаружили признаки остановки роста и некоторый хлороз листьев при этих расходных количествах, но они восстановились в течение 3-5 недель, тогда как обычные ростки сахарной свеклы были убиты ALS-ингибиторными гербицидами.
ALS мутанты были охарактеризованы следующим образом. Экстракция и анализ последовательности нуклеиновых кислот полученного мутанта был проведен фирмой LGC Genomics GmbH, Berlin, Германия согласно исправленным стандартным протоколам. Последовательность нуклеиновых кислот, полученная для мутанта сахарной свеклы SB574TL, показана в последовательности SEQ ID NO: 3. Последовательность SEQ ID NO: 4 представляет соответствующую аминокислотную последовательность, тогда как последовательность SEQ ID NO: 1 была получена после установления последовательности для дикого типа растения сахарной свеклы, которая была взята в качестве исходного материала. Последовательность SEQ ID NO: 2 представляет соответствующую аминокислотную последовательность дикого типа сахарной свеклы.
Сравнение всех этих последовательностей показывает, что существует только одна мутация в позиции 574, но не существует никаких других изменений в любой другой части этого эндогенного ALS гена.
Последовательность SEQ ID No1 (1) ATGGCGGCTACCTTCACAAACCCAACATTTTCCCCTTCCTCAACTCCATTAACCAAAACC Последовательность SEQ ID No 3 (1) ATGGCGGCTACCTTCACAAACCCAACATTTTCCCCTTCCTCAACTCCATTAACCAAAACC
Последовательность SEQ ID No1 (61) CTAAAATCCCAATCTTCCATCTCTTCAACCCTCCCCTTTTCCACCCCTCCCAAAACCCCA Последовательность SEQ ID No 3 (61) CTAAAATCCCAATCTTCCATCTCTTCAACCCTCCCCTTTTCCACCCCTCCCAAAACCCCA
Последовательность SEQ ID No 1 (121) ACTCCACTCTTTCACCGTCCCCTCCAAATCTCATCCTCCCAATCCCACAAATCATCCGCC Последовательность SEQ ID No 3 (121) ACTCCACTCTTTCACCGTCCCCTCCAAATCTCATCCTCCCAATCCCACAAATCATCCGCC
Последовательность SEQ ID No 1 (181) ATTAAAACACAAACTCAAGCACCTTCTTCTCCAGCTATTGAAGATTCATCTTTCGTTTCT Последовательность SEQ ID No 3 (181) ATTAAAACACAAACTCAAGCACCTTCTTCTCCAGCTATTGAAGATTCATCTTTCGTTTCT
Последовательность SEQ ID No1 (241) CGATTTGGCCCTGATGAACCCAGAAAAGGGTCCGATGTCCTCGTTGAAGCTCTTGAGCGT Последовательность SEQ ID No 3 (241) CGATTTGGCCCTGATGAACCCAGAAAAGGGTCCGATGTCCTCGTTGAAGCTCTTGAGCGT
Последовательность SEQ ID No1 (301) GAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCATCTATGGAAATCCACCAAGCT
- 13 036006
Последовательность SEQ ID No 3 (301)
GAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCATCTATGGAAATCCACCAAGCT
Последовательность SEQ ID No1 (361)
CTCACACGCTCTAAAACCATCCGCAATGTCCTCCCTCGCCATGAACAAGGCGGGGTTTTC
Последовательность SEQ ID No 3 (361)
CTCACACGCTCTAAAACCATCCGCAATGTCCTCCCTCGCCATGAACAAGGCGGGGTTTTC
Последовательность SEQ ID No1 (421)
GCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGAAAGGTTGGTGTCTGCATTGCGACTTCTGGT
Последовательность SEQ ID No 3 (421)
GCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGAAAGGTTGGTGTCTGCATTGCGACTTCTGGT
Последовательность SEQ ID No1 (481)
CCTGGTGCTACCAACCTCGTATCAGGTCTTGCTGACGCTCTCCTTGATTCTGTCCCTCTT
Последовательность SEQ ID No 3 (481)
CCTGGTGCTACCAACCTCGTATCAGGTCTTGCTGACGCTCTCCTTGATTCTGTCCCTCTT
Последовательность SEQ ID No1 (541)
GTTGCCATCACTGGCCAAGTTCCACGCCGTATGATTGGCACTGATGCTTTTCAGGAGACT
Последовательность SEQ ID No 3 (541)
GTTGCCATCACTGGCCAAGTTCCACGCCGTATGATTGGCACTGATGCTTTTCAGGAGACT
Последовательность SEQ ID No1 (601)
CCAATTGTTGAGGTGACAAGGTCTATTACTAAGCATAATTATTTAGTTTTGGATGTAGAG
Последовательность SEQ ID No 3 (601)
CCAATTGTTGAGGTGACAAGGTCTATTACTAAGCATAATTATTTAGTTTTGGATGTAGAG
Последовательность SEQ ID No1 (661)
GATATTCCTAGAATTGTTAAGGAAGCCTTTTTTTTAGCTAATTCTGGTAGGCCTGGACCT
Последовательность SEQ ID No 3 (661)
GATATTCCTAGAATTGTTAAGGAAGCCTTTTTTTTAGCTAATTCTGGTAGGCCTGGACCT
Последовательность SEQ ID No1 (721)
GTTTTGATTGATCTTCCTAAAGATATTCAGCAGCAATTGGTTGTTCCTGATTGGGATAGG
Последовательность SEQ ID No 3 (721)
GTTTTGATTGATCTTCCTAAAGATATTCAGCAGCAATTGGTTGTTCCTGATTGGGATAGG
Последовательность SEQ ID No1 (781)
CCTTTTAAGTTGGGTGGGTATATGTCTAGGCTGCCAAAGTCCAAGTTTTCGACGAATGAG
Последовательность SEQ ID No 3 (781)
CCTTTTAAGTTGGGTGGGTATATGTCTAGGCTGCCAAAGTCCAAGTTTTCGACGAATGAG
Последовательность SEQ ID No1 (841)
GTTGGACTTCTTGAGCAGATTGTGAGGTTGATGAGTGAGTCGAAGAAGCCTGTCTTGTAT
Последовательность SEQ ID No 3 (841)
GTTGGACTTCTTGAGCAGATTGTGAGGTTGATGAGTGAGTCGAAGAAGCCTGTCTTGTAT
Последовательность SEQ ID No1 (901)
GTGGGAGGTGGGTGTTTGAATTCTAGTGAGGAGTTGAGGAGATTTGTTGAGTTGACAGGG
Последовательность SEQ ID No 3 (901)
GTGGGAGGTGGGTGTTTGAATTCTAGTGAGGAGTTGAGGAGATTTGTTGAGTTGACAGGG
Последовательность SEQ ID No1 (961)
ATTCCGGTGGCTAGTACTTTGATGGGGTTGGGGTCTTACCCTTGTAATGATGAACTGTCT
Последовательность SEQ ID No 3 (961)
ATTCCGGTGGCTAGTACTTTGATGGGGTTGGGGTCTTACCCTTGTAATGATGAACTGTCT
Последовательность SEQ ID No1 (1021)
CTTCATATGTTGGGGATGCACGGGACTGTTTATGCCAATTATGCGGTGGATAAGGCGGAT
Последовательность SEQ ID No 3 (1021)
CTTCATATGTTGGGGATGCACGGGACTGTTTATGCCAATTATGCGGTGGATAAGGCGGAT
Последовательность SEQ ID No1 (1081)
TTGTTGCTTGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAGCTCGAGGCGTTT
Последовательность SEQ ID No 3 (1081)
TTGTTGCTTGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAGCTCGAGGCGTTT
Последовательность SEQ ID No1 (1141)
GCTAGCCGTGCTAAGATTGTGCATATTGATATTGACTCTGCTGAGATTGGGAAGAACAAG
Последовательность SEQ ID No 3 (1141)
GCTAGCCGTGCTAAGATTGTGCATATTGATATTGACTCTGCTGAGATTGGGAAGAACAAG
Последовательность SEQ ID No1 (1201)
CAGCCCCATGTGTCCATTTGTGCTGATGTTAAATTGGCATTGCGGGGTATGAATAAGATT
Последовательность SEQ ID No 3 (1201)
CAGCCCCATGTGTCCATTTGTGCTGATGTTAAATTGGCATTGCGGGGTATGAATAAGATT
Последовательность SEQ ID No1 (1261)
CTGGAGTCTAGAATAGGGAAGCTGAATTTGGATTTCTCCAAGTGGAGAGAAGAATTAGGT
Последовательность SEQ ID No 3 (1261)
CTGGAGTCTAGAATAGGGAAGCTGAATTTGGATTTCTCCAAGTGGAGAGAAGAATTAGGT
Последовательность SEQ ID No1 (1321)
GAGCAGAAGAAGGAATTCCCACTGAGTTTTAAGACATTTGGGGATGCAATTCCTCCACAA
Последовательность SEQ ID No 3 (1321)
GAGCAGAAGAAGGAATTCCCACTGAGTTTTAAGACATTTGGGGATGCAATTCCTCCACAA
Последовательность SEQ ID No1 (1381)
TATGCCATTCAGGTGCTTGATGAGTTGACCAATGGTAATGCTATTATAAGTACTGGTGTT
Последовательность SEQ ID No 3 (1381)
TATGCCATTCAGGTGCTTGATGAGTTGACCAATGGTAATGCTATTATAAGTACTGGTGTT
Последовательность SEQ ID No1 (1441)
GGGCAGCACCAAATGTGGGCTGCGCAGCATTACAAGTACAGAAACCCTCGCCAATGGCTG
Последовательность SEQ ID No 3 (1441)
GGGCAGCACCAAATGTGGGCTGCGCAGCATTACAAGTACAGAAACCCTCGCCAATGGCTG
Последовательность SEQ ID No1 (1501)
ACCTCTGGTGGGTTGGGGGCTATGGGGTTTGGGCTACCAGCCGCCATTGGAGCTGCAGTT
Последовательность SEQ ID No 3 (1501)
ACCTCTGGTGGGTTGGGGGCTATGGGGTTTGGGCTACCAGCCGCCATTGGAGCTGCAGTT
Последовательность SEQ ID No1 (1561)
GCTCGACCAGATGCAGTGGTTGTCGATATTGATGGGGATGGCAGTTTTATTATGAATGTT
Последовательность SEQ ID No 3 (1561)
GCTCGACCAGATGCAGTGGTTGTCGATATTGATGGGGATGGCAGTTTTATTATGAATGTT
Последовательность SEQ ID No1 (1621)
CAAGAGTTGGCTACAATTAGGGTGGAAAATCTCCCAGTTAAGATAATGCTGCTAAACAAT
Последовательность SEQ ID No 3 (1621)
CAAGAGTTGGCTACAATTAGGGTGGAAAATCTCCCAGTTAAGATAATGCTGCTAAACAAT
Последовательность SEQ ID No1 (1681)
CAACATTTAGGTATGGTTGTCCAATGGGAAGATAGGTTCTATAAAGCTAACCGGGCACAT
Последовательность SEQ ID No 3 (1681)
CAACATTTAGGTATGGTTGTCCAATTGGAAGATAGGTTCTATAAAGCTAACCGGGCACAT
Последовательность SEQ ID No1 (1741)
ACATACCTTGGAAACCCTTCCAAATCTGCTGATATCTTCCCTGATATGCTCAAATTCGCT
Последовательность SEQ ID No 3 (1741)
ACATACCTTGGAAACCCTTCCAAATCTGCTGATATCTTCCCTGATATGCTCAAATTCGCT
Последовательность SEQ ID No1 (1801)
GAGGCATGTGATATTCCTTCTGCCCGTGTTAGCAACGTGGCTGATTTGAGGGCCGCCATT
Последовательность SEQ ID No 3 (1801)
GAGGCATGTGATATTCCTTCTGCCCGTGTTAGCAACGTGGCTGATTTGAGGGCCGCCATT
Последовательность SEQ ID No1 (1861)
CAAACAATGTTGGATACTCCAGGGCCGTACCTGCTCGATGTGATTGTACCGCATCAAGAG
Последовательность SEQ ID No 3 (1861)
CAAACAATGTTGGATACTCCAGGGCCGTACCTGCTCGATGTGATTGTACCGCATCAAGAG
Последовательность SEQ ID No1 (1921)
CATGTGTTGCCTATGATTCCAAGTGGTGCCGGTTTCAAGGATACCATTACAGAGGGTGAT
Последовательность SEQ ID No 3 (1921)
CATGTGTTGCCTATGATTCCAAGTGGTGCCGGTTTCAAGGATACCATTACAGAGGGTGAT
Последовательность SEQ ID No1 (1981)
GGAAGAACCTCTTATTGA
Последовательность SEQ ID No 3 (1981)
GGAAGAACCTCTTATTGA
Последовательность SEQ ID No. 2 (1)
MAATFTNPTFSPSSTPLTKTLKSQSSISSTLPFSTPPKTPTPLFHRPLQISSSQSHKSSA
Последовательность SEQ ID No.4 (1)
MAATFTNPTFSPSSTPLTKTLKSQSSISSTLPFSTPPKTPTPLFHRPLQISSSQSHKSSA
Последовательность SEQ ID No. 2 (61)
IKTQTQAPSSPAIEDSSFVSRFGPDEPRKGSDVLVEALEREGVTNVFAYPGGASMEIHQA Последовательность SEQ ID No.4 (61)
IKTQTQAPSSPAIEDSSFVSRFGPDEPRKGSDVLVEALEREGVTNVFAYPGGASMEIHQA
Последовательность SEQ ID No. 2 (121)
LTRSKTIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARATGKVGVCIATSGPGATNLVSGLADALLDSVPL
Последовательность SEQ ID No.4 (121)
LTRSKTIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARATGKVGVCIATSGPGATNLVSGLADALLDSVPL
Последовательность SEQ ID No. 2 (181)
VAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRIVKEAFFLANSGRPGP
Последовательность SEQ ID No.4 (181)
VAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRIVKEAFFLANSGRPGP
Последовательность SEQ ID No. 2 (241)
VLIDLPKDIQQQLWPDWDRPFKLGGYMSRLPKSKFSTNEVGLLEQIVRLMSESKKPVLY
- 16 036006
Последовательность SEQ ID No.4 (241) VLIDLPKDIQQQLWPDWDRPFKLGGYMSRLPKSKFSTNEVGLLEQIVRLMSESKKPVLY
Последовательность SEQ ID No. 2 (301)
VGGGCLNSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCNDELSLHMLGMHGTVYANYAVDKAD
Последовательность SEQ ID No.4 (301)
VGGGCLNSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCNDELSLHMLGMHGTVYANYAVDKAD
Последовательность SEQ ID No. 2 (361)
LLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKQPHVSICADVKLALRGMNKI
Последовательность SEQ ID No.4 (361)
LLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKQPHVSICADVKLALRGMNKI
Последовательность SEQ ID No. 2 (421) LESRIGKLNLDFSKWREELGEQKKEFPLSFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGNAIISTGV Последовательность SEQ ID No.4 (421) LESRIGKLNLDFSKWREELGEQKKEFPLSFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGNAIISTGV
Последовательность SEQ ID No. 2 (481) GQHQMWAAQHYKYRNPRQWLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVARPDAWVDIDGDGSFIMNV Последовательность SEQ ID No.4 (481) GQHQMWAAQHYKYRNPRQWLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVARPDAWVDIDGDGSFIMNV
Последовательность SEQ ID No. 2 (541) QELATIRVENLPVKIMLLNNQHLGMWQWEDRFYKANRAHTYLGNPSKSADIFPDMLKFA Последовательность SEQ ID No.4 (541) QELATIRVENLPVKIMLLNNQHLGMWQLEDRFYKANRAHTYLGNPSKSADIFPDMLKFA
Последовательность SEQ ID No. 2 (601) EACDIPSARVSNVADLRAAIQTMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSGAGFKDTITEGD Последовательность SEQ ID No.4 (601) EACDIPSARVSNVADLRAAIQTMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSGAGFKDTITEGD
Последовательность SEQ ID No. 2 (661) GRTSYПоследовательность SEQ ID No.4 (661) GRTSYОднако вообще предпочтительно, чтобы растения В. vulgaris данного изобретения и их части были пригодны для агрономического использования. Агрономическое использование означает, что растения В. vulgaris plants и их части являются полезными для агрономических целей. Например, растения В. vulgaris должны служить цели быть полезными для производства сахара, производства биотоплива (такого как производство биогаза, биобутанола и этанола), производства этанола, производства бетаина и/или уридина. Термин агрономическое использование в том случае, когда он применяется здесь, также включает, что растения В. vulgaris данного изобретения являются предпочтительно менее чувствительными к ALS ингибиторным гербицидам, предпочтительно как минимум в 100 раз менее чувствительными, более предпочтительно как минимум в 500 раз менее чувствительными, еще более предпочтительно как минимум в 1000 раз менее чувствительными и наиболее предпочтительно как минимум в 2000 раз менее чувствительными. К ALS-ингибиторным гербицидам относится один или более из описанных здесь, предпочтительно им является форамсульфурон сам по себе или в комбинации с одним или более другими ALS-ингибиторными гербицидами или из подкласса сульфонилмочевинных гербицидов или из любого другого подкласса ALS-ингибиторных гербицидов, более предпочтителен форамсульфурон в комбинации с другим сульфонилмочевинным гербицидом и/или ALS ингибитором из подкласса сульфониламинокарбонилтриазолинонов.
Предпочтительно агрономически используемые растения В. vulgaris, более предпочтительно растения сахарной свеклы данного изобретения являются полностью фертильными (плодовитыми), более предпочтительно имеют фертильность дикого типа. Фертильность является самым важным свойством растений В. vulgaris данного изобретения для того, чтобы быть агрономически используемыми.
Примером агрономически используемого растения В. vulgaris является сахарная свекла. Растения
- 17 036006 сахарной свеклы данного изобретения при культивировании на площади одного гектара дают урожай (около 80000-90000 сахарных свекол), из которого можно предпочтительно получить как минимум 4 т сахара.
Альтернативно, растение сахарной свеклы данного изобретения предпочтительно имеет содержание сахара 15-20%, предпочтительно как минимум 17% для того, чтобы быть агрономически используемым. Таким образом, растения сахарной свеклы, которые имеют содержание сахара 15-20%, предпочтительно как минимум 17%, являются предпочтительным воплощением данного изобретения.
Растения данного изобретения могут быть идентифицированы, используя любой способ генотипного анализа. Генотипное определение растений включает применение техники, такой как изоферментный электрофорез, полиморфизм ограниченных длин фрагментов (RFLPs), случайно расширенные полиморфные ДНК (RAPDs), произвольно проведенная полимеразная цепная реакция (AP-PCR), аллелезависимая полимеразная цепная реакция (AS-PCR), ДНК расширенные отпечатки пальцев (DAF), характеризуемые последовательностью расширенные области (SCARs), полиморфизм расширенных длин фрагментов (AFLPs), повторение простых последовательностей (SSRs), которое также обозначают как микросателлиты. Дополнительные композиции и способы для анализа генотипа растений, которые предусмотрены здесь, включают способы, открытые в патентах США №№ 2004/0171027, 2005/02080506 и 2005/0283858.
Другим аспектом данного изобретения является применение растения Beta vulgaris, описанного здесь, и/или снимаемых в виде урожая частей растения или материала для размножения, описанного здесь, для получения/размножения растений Beta vulgaris. Способы получения/размножения растений В. vulgaris plants описаны здесь. Такие способы получения/размножения можно применять для создания растений В. vulgaris данного изобретения, которые дополнительно включают новые свойства растений, такие как толерантность к стрессам, таким как, но не ограничиваясь ими, стресс от засухи, жары, холода или стресс от содержания соли в почве и т.п.
Еще один другой аспект данного изобретения предусматривает применение толерантных к гербицидам растений Beta vulgaris, которые описаны здесь, и/или снимаемых в виде урожая частей или материала для размножения, полученных из них, в способе отбора для селекции растений, толерантных к ALS-ингибиторным гербицидам.
Лучшее понимание данного изобретения и многих его преимуществ можно получить из следующих примеров, предлагаемых только для иллюстративных целей, но ни в коем случае никак не ограничивающих охват данного изобретения.
Пример 1. Выделение мутанта.
Клеточные культуры сахарной свеклы были получены из рассады диплоидной сахарной свеклы генотипа 7Т9044 (как описано, например, в реферате Alexander Dovzhenko, PhD Thesis, Title: Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) and sugarbeet (Beta vulgaris L.), Ludwig-MaximiliansUniversitat Munchen, Германия, 2001).
Семена сахарной свеклы погружают на 60 с в 70%-й этанол, затем дважды промывают стерильной водой с 0,01% детергента и после этого инкубируют в течение 1-4 ч в 1%-м NaOCl отбеливателе. Затем семена промывают 3 раза стерильной Н2О и семена сохраняют в стерильной воде в течение ночи при температуре 4°С. Эмбрионы выделяют, используя пинцет и скальпель.
Свежеприготовленные эмбрионы помещают в 0,5%-й NaOCl на 30 мин и затем промывают 3 раза стерильной Н2О. После последней стадии промывания их помещают в свободную от гормонов MS агаровую среду (Murashige и Skoog (1962), Physiol. Plantarum, 15, 473-497). Такие эмбрионы, которые развиваются в стерильные сеянцы, были использованы для инициирования регенерируемых культур сахарной свеклы.
Семядоли, а также гипокотили были разрезаны на сегменты длиной 2-5 мм и затем были культивированы на агаровой (0,8%) отвержденной MS среде, содержащей или 1 мг/л бензиламинопурина (ВАР),или 0,25 мг/л тидиазурона (TDZ). Спустя 4 недели развившиеся ростковые культуры были перенесены на свежую агаровую среду того же состава и затем получали субкультуру с месячным интервалом. Культуры выдерживали при температуре 25°С при сумеречном свете с циклом 12 ч/12 ч светло/темно.
Через 7-10 дней субкультуры ростковых культур, которые выращивались на среде, содержащей тидиазурон, сформировали явный тип каллюса, который быстро рос, был мягким и рыхлым. Цвет этого типа каллюса был желтоватый до слегка зеленого. Некоторые их этих рыхлых каллюсов сообразно производили хлорофилл, содержащий исходные ростковые, подобные эмбриону структуры. Эти быстрорастущие регенерируемые каллюсы были использованы для селекции мутантов сахарной свеклы, толерантных к ALS-ингибиторным гербицидам.
Когда этот тип каллюса подвергали экспозиции с 10-9 М ALS-ингибиторного гербицида форамсульфурона (относящегося к подклассу сульфонилмочевин, см. выше), клетки выжили, однако произвели менее чем 50% от той биомассы, которую дали их близнецы в среде, которая не содержала ингибитора. В среде, которая содержала 3х 10-8 М форамсульфурона, не было обнаружено никакого роста. Для широкой шкалы экспериментов по селекции мутантов была выбрана концентрация 10-7 М форамсульфурона. Ко- 18 036006 лонии выживших и растущих клеток пронумеровывали и переносили по прохождении 4-6 недель на свежую среду, содержащую 3х10-7 М ингибитора. Одна из этих клеточных колоний была способна расти не только при этой концентрации ингибитора, но даже в присутствии 3х 10-6 М форамсульфурона.
Из этого клона (SB574TL) ростки были регенерированы в присутствии ALS-ингибиторных гербицидов и затем ростки были перенесены в MS-среду, содержащую 0,05 мг/л нафталинуксусной кислоты (NAA).
В течение 4-12 недель ростки формируют стебли, после этого их переносят в стерильные контейнеры для растений, заполненные влажным, стерилизованным перлитом, поливают в половину силы MS неорганическими ингредиентами. Альтернативно, растеньица переносят напрямую из агаровой твердой среды в почвенную смесь, содержащую перлит, в теплицу. В течение первых 10-15 дней после переноса в почву, содержащую субстрат, растения выдерживают в окружении с высокой влажностью воздуха. Во время этого и после этого, когда их выдерживают при нормальных условиях влажности в теплице, растения выдерживают в парнике при искусственном освещении (12 ч) при температуре 20±3°С/15±2°С день/ночь.
Спустя 3-5 недель регенерированные растения от полученных выше толерантных к форамсульфурону клеточных культур (SB574TL), а также от дикого типа клеточных культур обрабатывают форамсульфуроном, йодсульфурон-метил-натрием (CAS RN 144550-3-7) и смесью обоих этих активных веществ. Тестируемые гербицидные дозы были эквивалентны 7-70 г а.в./га для форамсульфурона и 1-10 г а.в./га для йодсульфурон-метил-натрия. Регенерированные растения этой толерантной линии клеток были толерантны даже при самой высокой дозе гербицида (форамсульфурон, йодсульфурон-метил-натрий и их смеси в соотношении 7:1), тогда как уже самые низкие дозы убивали растения дикого типа.
Пример 2. Тестирование отпрысков.
Основываясь на линии SB574TL F2 и F3 семена экспериментальных гибридов, включающих устойчивые аллели в гетерозиготном состоянии, а также F4-F6 семена, содержащие мутантные аллели в гомозиготном состоянии, были посеяны в поле и обработаны форамсульфуроном, йодсульфурон-метилнатрием, а также смесью обоих ALS-ингибиторных гербицидов, когда в растениях развились 3-5 розеточных листочков. Гомозиготные сеянцы оказались толерантными к смеси 35 г форамсульфурона/га + 7 г йодсульфурон-метил-натрия/га без остановки роста или любых видимых признаков повреждения. В некоторых случаях гетерозиготные линии обнаружили признаки остановки роста и некоторый хлороз листьев при этих расходных количествах, но они восстановились в течение 3-5 недель, тогда как обычные сеянцы сахарной свеклы были убиты ALS-ингибиторными гербицидами.
Пример 3. Молекулярная характеристика полученного мутанта сахарной свеклы (SB574TL).
Экстракция и анализ последовательности нуклеиновых кислот полученного мутанта был проведен фирмой LGC Genomics GmbH, Berlin, Германия согласно исправленным стандартным протоколам.
Последовательность нуклеиновых кислот, полученная для мутанта сахарной свеклы SB574TL, показана последовательностью SEQ ID NO: 3 с последовательностью SEQ ID NO: 4, представляющей соответствующую аминокислотную последовательность, тогда как последовательность SEQ ID NO: 1 была получена после установления последовательности для дикого типа растения сахарной свеклы, которая была взята в качестве исходного материала. Последовательность SEQ ID NO: 2 представляет соответствующую аминокислотную последовательность дикого типа сахарной свеклы.
Сравнение всех этих последовательностей ясно показывает, что существует только одна мутация в позиции 574, но не существует никаких других изменений в любой другой части этого эндогенного ALS гена этого материала из растения сахарной свеклы.
Пример 4. Измерение активности энзима.
Кодирующая последовательность Beta vulgaris дикого типа и W574L-мутантного (SB574TL) ALS генов были клонированы в Novagen pET-32а(+) векторы и векторы трансформированы в Escherichia coli AD4 94 согласно инструкциям изготовителя. Бактерии выращивают при температуре 37°С в LB-среде (Luria-Broth-среде), содержащей 100 мг/л карбенициллина и 25 мг/л канамицина, индуцированного 1 мМ изопропил-b-D-тиогaлактопирaнозида при поглощении CD600, равном 0,6, культивируют в течение 16 ч при температуре 18°С и выделяют урожай центрифугированием. Бактериальные пилюли ресуспендируют в 100 мМ буфере из фосфата натрия рН 7,0, содержащем 0,1 мМ тиаминфосфата, 1 мМ MgCl2, и 1 мкМ FAD при концентрации 1 г влажного веса на 25 мл буфера и разрушают, обрабатывая звуком. Сырой экстракт белка, полученный после центрифугирования, был использован для измерений активности ALS.
Опыты с ALS проводили на микротитровальных пластинках с 96-углублениями, используя модификацию процедуры, которая описана в работе Ray (1984). Реакционная смесь содержала 20 мМ фосфатно-калиевого буфера рН 7,0, 20 мМ пирувата натрия, 0,45 мМ тиамин-пирофосфата, 0,45 мМ MgCl2, 9 мкМ FAD, ALS энзим и различные концентрации ALS-ингибиторов в конечном объеме 90 мкл. Опыты инициировались добавлением энзима и останавливались через 75 мин инкубирования при температуре 30°С путем добавления 40 мкл 0,5М H2SO4. После выдерживания в течение 60 мин при комнатной температуре добавляют 80 мкл раствора 1,4% α-нафтола и 0,14% креатинина в 0,7М NaOH и дополнительно
- 19 036006 инкубируют 45 мин при комнатной температуре и определяют поглощение при длине волны 540 нм. pI50значения для ингибирования ALS определяют, как описано в статье Ray (1984), используя программу
XLFit Excel add-in version 4.3.1 для подгонки кривой фирмы ID Business Solutions Limited.
В сумме мутантный энзим был как минимум в 2000 раз менее чувствительным по отношению к
ALS-ингибитору форамсульфурону чем дикого типа энзим.
Пример 5. Измерение активности энзима (из растений).
ALS был экстрагирован из культур листьев сахарной свеклы или тканей сахарной свеклы, как описано в статье Ray (1984), Plant Physiol., 75:827-831.
ALS активность была определена в экстрактах листьев дикого типа сахарной свеклы и экстрактах листьев, полученных из SB574TL в присутствии различных концентраций форамсульфурона, как описано в примере 4.
В сумме мутантный энзим был как минимум в 2000 раз менее чувствительным по отношению к ALS-ингибитору форамсульфурону чем дикого типа энзим.
Пример 6. Полевые испытания при применении гомозиготных толерантных к ALS-ингибиторным гербицидам растений сахарной свеклы.
Основываясь на SB574TL F4-F6 семена, включающие мутантные аллели эндогенного ALS гена в гомозиготном состоянии, были использованы для дальнейшего тестирования.
Семена растений гомозиготных SB574TL мутантных растений и семена традиционного сорта KLARINA (обычно используемый для сравнения, чувствительный к ALS-ингибиторам сорт сахарной свеклы, не имеющий соответствующих мутаций в позиции 569 его ALS белка) были посеяны в поле и выращены до различных стадий роста согласно ВВСН стандарту (как описано в монографии Entwicklungsstadien mono- und dikotyler Pflanzen, 2nd edition, 2001, ed. Uwe Meier, Biologische Bundesanstalt fur Land und Forstwirtschaft).
После этого растения были обработаны соответствующими ALS-ингибиторными гербицидами, как специфицировано ниже в табл. 1, которые были идентичны гербицидам, применявшимся во время процедуры селекции. Расходное количество воды, использованной во время различных применений, составляло 200 л/га.
Через 8, 14 и 28 дней (как указано в табл. 1) после применения (ДПП = дней после применения) соответствующего(их) ALS-ингибиторного(ых) гербицида(ов), оценивают повреждение фитотоксичность/фито у различных растений сахарной свеклы в соответствии со шкалой от 0 до 100%.
В этом контексте 0% означает нет фитотоксичности/фито и 100% означает, что все растения убиты (в таблице под фито имеется в виду фитотоксичности/фито).
Виды харатеристик Сорт KLARINA Сахарная свекла на основе SB574TL Сорт KLARINA Сахарная свекла на основе SB574TL Сорт KLARINA Сахарная свекла на основе SB574TL
Стадия во время обработки ВВСН 14 ВВСН 14 ВВСН 14 ВВСН 14 ВВСН 14 ВВСН 14
Отношение %фито % фито % фито % фито % фито % фито
Интервал от обработки до измерения 8 дней 8 дней 14дней 14 дней 28 дней 28 дней
Активное вещество г.а.в./ /га
Форамсульфурон 25 г/га 85 0 83 0 86 0
Форамсульфурон 50 г/га 90 0 92 0 94 0
Йодсульфуронметил-натрий 7 г/га 90 0 97 0 100 0
- 20 036006
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Bayer CropScience AG and KWS SAAT AG <12 0> Мутанты Beta vulgaris, толерантные к ALS ингибиторным гербицидам <130> BCS 09-1021 / KWS 0172 EP <160>6 <170> патент в версии 3.3 <210>1 <211>1998 <212> ДНК <213> Beta vulgaris <400> 1
atggcggcta ccttcacaaa cccaacattt tccccttcct caactccatt aaccaaaacc 60
ctaaaatccc aatcttccat ctcttcaacc ctcccctttt ccacccctcc caaaacccca 120
actccactct ttcaccgtcc cctccaaatc tcatcctccc aatcccacaa atcatccgcc 180
attaaaacac aaactcaagc accttcttct ccagctattg aagattcatc tttcgtttct 240
cgatttggcc ctgatgaacc cagaaaaggg tccgatgtcc tcgttgaagc tcttgagcgt 300
gaaggtgtta ccaatgtgtt tgcttaccct ggtggtgcat ctatggaaat ccaccaagct 360
ctcacacgct ctaaaaccat ccgcaatgtc ctccctcgcc atgaacaagg cggggttttc 420
gccgccgagg gatatgctag agctactgga aaggttggtg tctgcattgc gacttctggt 480
cctggtgcta ccaacctcgt atcaggtctt gctgacgctc tccttgattc tgtccctctt 540
gttgccatca ctggccaagt tccacgccgt atgattggca ctgatgcttt tcaggagact 600
ccaattgttg aggtgacaag gtctattact aagcataatt atttagtttt ggatgtagag 660
gatattccta gaattgttaa ggaagccttt tttttagcta attctggtag gcctggacct 720
gttttgattg atcttcctaa agatattcag cagcaattgg ttgttcctga ttgggatagg 780
ccttttaagt tgggtgggta tatgtctagg ctgccaaagt ccaagttttc gacgaatgag 840
gttggacttc ttgagcagat tgtgaggttg atgagtgagt cgaagaagcc tgtcttgtat 900
gtgggaggtg ggtgtttgaa ttctagtgag gagttgagga gatttgttga gttgacaggg 960
attccggtgg ctagtacttt gatggggttg gggtcttacc cttgtaatga tgaactgtct 1020
cttcatatgt tggggatgca cgggactgtt tatgccaatt atgcggtgga taaggcggat 1080
ttgttgcttg ctttcggggt taggtttgat gatcgtgtga ccgggaagct cgaggcgttt 1140
gctagccgtg ctaagattgt gcatattgat attgactctg ctgagattgg gaagaacaag 1200
cagccccatg tgtccatttg tgctgatgtt aaattggcat tgcggggtat gaataagatt 1260
ctggagtcta gaatagggaa gctgaatttg gatttctcca agtggagaga agaattaggt 1320
gagcagaaga aggaattccc actgagtttt aagacatttg gggatgcaat tcctccacaa 1380
tatgccattc aggtgcttga tgagttgacc aatggtaatg ctattataag tactggtgtt 1440
gggcagcacc aaatgtgggc tgcgcagcat tacaagtaca gaaaccctcg ccaatggctg 1500
acctctggtg ggttgggggc tatggggttt gggctaccag ccgccattgg agctgcagtt 1560
gctcgaccag atgcagtggt tgtcgatatt gatggggatg gcagttttat tatgaatgtt 1620
caagagttgg ctacaattag ggtggaaaat ctcccagtta agataatgct gctaaacaat 1680
caacatttag gtatggttgt ccaatgggaa gataggttct ataaagctaa ccgggcacat 1740
acataccttg gaaacccttc caaatctgct gatatcttcc ctgatatgct caaattcgct 1800
gaggcatgtg atattccttc tgcccgtgtt agcaacgtgg ctgatttgag ggccgccatt 1860
caaacaatgt tggatactcc agggccgtac ctgctcgatg tgattgtacc gcatcaagag 1920
catgtgttgc ctatgattcc aagtggtgcc ggtttcaagg ataccattac agagggtgat 1980
ggaagaacct cttattga1998 <210> 2 <211>665 < 212> PRT < 213> Beta vulgaris < 400> 2
Met Ala Ala Thr Phe Thr Asn Pro Thr Phe Ser Pro Ser Ser Thr Pro 15 1015
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gin Ser Ser lie Ser Ser Thr Leu Pro 20 2530
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu 35 4045
Gin lie Ser Ser Ser Gin Ser His Lys Ser Ser Ala lie Lys Thr Gin 50 5560
Thr Gin Ala Pro Ser Ser Pro Ala lie Glu Asp Ser Ser Phe VaiSer
70 7580
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Vai Leu Vai Glu
Lys Asp He
Lys Leu Gly
Asn Glu Vai
Lys Lys Pre
Glu Leu Arq
Vai Asp Lys
Arq Glu Glu
Thr Phe Gly
Gly Asp Gly
545 550 555 560
Gin His Leu Gly Met Vai Vai Gin 565 Trp Glu Asp 570 Arg Phe Tyr Lys Ala 575
Asn Arg Al a His Thr Tyr Leu Gly 580 Asn Pro Ser 585 Lys Ser Ala Asp lie 590
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala 595 600 Glu Ala Cys Asp lie Pro Ser Ala 605
Arg Vai Se 610 r Asn Vai Ala Asp Leu 615 Arg Ala Ala lie Gin Tt 620 ir Met Leu
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu 625 630 Asp Vai lie 635 Vai Pro His Gin Glu 640
His Vai Leu Pro Met I 645 le Pro Ser Gly Ala Gly 650 Phe Lys Asp Thr lie 655
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser 660 Tyr 665
<210> 3 <211> 1998 <212> ДНК <213> Beta vulgaris
<220> <221> мутация <222> (1706) . . (1706) <223> замещение гуанозина на тимидин
<400> 3 atggcggcta ccttcacaaa cccaacattt : tccccttcct caactccatt : aaccaaaacc 60
ctaaaatccc aatcttccat ctcttcaacc : ctcccctttt ccacccctcc : caaaacccca 120
actccactct ttcaccgtcc : cctccaaatc : tcatcctccc aatcccacaa i atcatccgcc 180
attaaaacac aaactcaagc : accttcttct : ccagctattg aagattcatc : tttcgtttct 240
cgatttggcc ctgatgaacc : cagaaaaggg tccgatgtcc tcgttgaagc : tcttgagcgt 300
gaaggtgtta ccaatgtgtt tgcttaccct : ggtggtgcat ctatggaaat : ccaccaagct 360
ctcacacgct ctaaaaccat ccgcaatgtc ctccctcgcc atgaacaagg cggggttttc 420
gccgccgagg gatatgctag agctactgga i aaggttggtg tctgcattgc : gacttctggt 480
cctggtgcta ccaacctcgt atcaggtctt gctgacgctc tccttgattc tgtccctctt 540
gttgccatca ctggccaagt tccacgccgt atgattggca ctgatgcttt tcaggagact 600
ccaattgttg aggtgacaag gtctattact aagcataatt atttagtttt ggatgtagag 660
gatattccta gaattgttaa ggaagccttt tttttagcta attctggtag gcctggacct 720
gttttgattg atcttcctaa agatattcag cagcaattgg ttgttcctga ttgggatagg 780
ccttttaagt tgggtgggta tatgtctagg ctgccaaagt ccaagttttc gacgaatgag 840
gttggacttc ttgagcagat tgtgaggttg atgagtgagt cgaagaagcc tgtcttgtat 900
gtgggaggtg ggtgtttgaa ttctagtgag gagttgagga gatttgttga gttgacaggg 960
attccggtgg ctagtacttt gatggggttg gggtcttacc cttgtaatga tgaactgtct 1020
cttcatatgt tggggatgca cgggactgtt tatgccaatt atgcggtgga taaggcggat 1080
ttgttgcttg ctttcggggt taggtttgat gatcgtgtga ccgggaagct cgaggcgttt 1140
gctagccgtg ctaagattgt gcatattgat attgactctg ctgagattgg gaagaacaag 1200
cagccccatg tgtccatttg tgctgatgtt aaattggcat tgcggggtat gaataagatt 1260
ctggagtcta gaatagggaa gctgaatttg gatttctcca agtggagaga agaattaggt 1320
gagcagaaga aggaattccc actgagtttt aagacatttg gggatgcaat tcctccacaa 1380
tatgccattc aggtgcttga tgagttgacc aatggtaatg ctattataag tactggtgtt 1440
gggcagcacc aaatgtgggc tgcgcagcat tacaagtaca gaaaccctcg ccaatggctg 1500
acctctggtg ggttgggggc tatggggttt gggctaccag ccgccattgg agctgcagtt 1560
gctcgaccag atgcagtggt tgtcgatatt gatggggatg gcagttttat tatgaatgtt 1620
caagagttgg ctacaattag ggtggaaaat ctcccagtta agataatgct gctaaacaat 1680
caacatttag gtatggttgt ccaattggaa gataggttct ataaagctaa ccgggcacat 1740
acataccttg gaaacccttc caaatctgct gatatcttcc ctgatatgct caaattcgct 1800
gaggcatgtg atattccttc tgcccgtgtt agcaacgtgg ctgatttgag ggccgccatt 1860
caaacaatgt tggatactcc agggccgtac ctgctcgatg tgattgtacc gcatcaagag 1920
catgtgttgc ctatgattcc aagtggtgcc ggtttcaagg ataccattac agagggtgat 1980
ggaagaacct cttattga 1998
<210> 4 <211> 665 <212> PRT <213> Beta vulgaris
MISC СВОЙСТВА
569 .. 569 замещение триптофана
Ser Lys Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gin Lys Lys Glu Phe Pro Leu 435 440445
Ser Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala lie Pro Pro Gin Tyr Ala lie Gin 450 455460
Vai Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala lie lie Ser Thr GlyVai
465 470 475480
Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin His Tyr Lys Tyr Arg AsnPro
485 490495
Arg Gin Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu 500 505510
Pro Ala Ala Tie Gly Ala Ala Vai Ala Arg Pro Asp Ala Vai Vai Vai 515 520525
Asp lie Asp Gly Asp Gly Ser Phe lie Met Asn Vai Gin Glu Leu Ala 530 535540
Thr He Arg Vai Glu Asn Leu Pro Vai Lys He Met Leu Leu AsnAsn
545 550 555560
Gin His Leu Gly Met Vai Vai Gin Leu Glu Asp Arg Phe Tyr LysAla
565 570575
Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Lys Ser Ala Asp lie 580 585590
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp lie Pro Ser Ala 595 600605
Arg Vai Ser Asn Vai Ala Asp Leu Arg Ala Ala lie Gin Thr Met Leu 610 615620
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Vai lie Vai Pro His GinGlu
625 630 635640
His Vai Leu Pro Met He Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp Thrlie
645 650655
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr 660665 <210> 5 <211> 2013 <212> ДНК <213> Arabidopsis thaliana
<400> 5 atggcggcgg caacaacaac aacaacaaca tcttcttcga tctccttctc caccaaacca 60
tctccttcct cctccaaatc accattacca atctccagat tctccctccc attctcccta 120
aaccccaaca aatcatcctc ctcctcccgc cgccgcggta tcaaatccag ctctccctcc 180
tccatctccg ccgtgctcaa cacaaccacc aatgtcacaa ccactccctc tccaaccaaa 240
cctaccaaac ccgaaacatt catctcccga ttcgctccag atcaaccccg caaaggcgct 300
gatatcctcg tcgaagcttt agaacgtcaa ggcgtagaaa ccgtattcgc ttaccctgga 360
ggtgcatcaa tggagattca ccaagcctta acccgctctt cctcaatccg taacgtcctt 420
cctcgtcacg aacaaggagg tgtattcgca gcagaaggat acgctcgatc ctcaggtaaa 480
ccaggtatct gtatagccac ttcaggtccc ggagctacaa atctcgttag cggattagcc 540
gatgcgttgt tagatagtgt tcctcttgta gcaatcacag gacaagtccc tcgtcgtatg 600
attggtacag atgcgtttca agagactccg attgttgagg taacgcgttc gattacgaag 660
cataactatc ttgtgatgga tgttgaagat atccctagga ttattgagga agctttcttt 720
ttagctactt ctggtagacc tggacctgtt ttggttgatg ttcctaaaga tattcaacaa 780
cagcttgcga ttcctaattg ggaacaggct atgagattac ctggttatat gtctaggatg 840
cctaaacctc cggaagattc tcatttggag cagattgtta ggttgatttc tgagtctaag 900
aagcctgtgt tgtatgttgg tggtggttgt ttgaattcta gcgatgaatt gggtaggttt 960
gttgagctta cggggatccc tgttgcgagt acgttgatgg ggctgggatc ttatccttgt 1020
gatgatgagt tgtcgttaca tatgcttgga atgcatggga cggtgtatgc gaattacgct 1080
gtggagcata gtgatttgtt gttggcgttt ggggtgaggt ttgatgatcg cgtcacgggt 1140
aagcttgagg cttttgctag tagggctaag attgttcata ttgatattga ctctgctgag 1200
attgggaaga ataagactcc tcatgtgtct gtgtgtggtg atgtcaagct ggctttgcaa 1260
gggatgaata aggttcttga gaaccgagct gaggagctta agcttgattt tggagtttgg 1320
aggaatgagt tgaacgtaca gaaacagaag tttccgttga gctttaagac gtttggggaa 1380
gctattcctc cacagtatgc gattaaggtc cttgatgagt tgactgatgg aaaagccata 1440
ataagtactg gtgtcgggca acatcaaatg tgggcggcgc agttctacaa ttacaagaag 1500
- 25 036006 ccaaggcagt ggctatcatc aggaggcctt ggagctatgg gttttggact tcctgctgcc1560 attggagcgt ctgttgctaa ccctgatgca atagttgtgg atattgacgg agatggaagc1620 tttataatga atgtgcaaga gctggccaca atccgtgtag agcaacttcc agtgaagata1680 ctcttattaa acaaccagca tcttggcatg gttatgcaat gggaagatcg gttctacaag1740 gctaaccgag ctcacacatt tctcggggat ccggctcagg aggacgagat attcccgaac1800 atgttgctgt ttgcagcagc ttgcgggatt ccagcggcga gggtgacaaa gaaagcagat1860 ctccgagaag ctattcagac aatgctggat acaccaggac cttacctgtt ggatgtgatt1920 tgtccgcacc aagaacatgt gttgccgatg atcccgagtg gtggcacttt caacgatgtc1980 ataacggaag gagatggccg gattaaatac tga2013 <210>6 <211>670 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400>6
Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser lie Ser Phe 15 1015
Ser Thr Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro He Ser 20 2530
Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ser 35 4045
Ser Arg Arg Arg Gly He Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser He Ser Ala 50 5560
Vai Leu Asn Thr Thr Thr Asn Vai Thr Thr Thr Pro Ser Pro ThrLys
70 7580
Pro Thr Lys Pro Glu Thr Phe He Ser Arg Phe Ala Pro Asp Gin Pro
95
Arg Lys Gly Ala Asp He Leu Vai Glu
100 105
Ala Leu Glu Arg Gin Gly Vai 110
Glu Thr Vai Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
115 120
Ala Leu Thr Arg Ser Ser Ser He
130 135
Ala Ser Met Glu He His Gin
125
Arg Asn Vai Leu Pro Arg His Glu
140
Gin Gly Gly Vai Phe Ala Ala Glu 145 150
Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys
155 160
Pro Gly He Cys lie Ala Thr Ser
165
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Vai
170 175
Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu 180
Asp Ser Vai Pro Leu Vai Ala Tie 185 190
Thr Gly Gin Vai Pro Arg Arg Met
195 200 lie Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu
205
Thr Pro He Vai Glu Vai Thr Arg
210 215
Ser lie Thr Lys His Asn Tyr Leu 220
Vai Met Asp Vai Glu Asp lie Pro
225 230
Arg lie lie Glu Glu Ala Phe Phe
235 240
Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly 245
Pro Vai Leu Vai Asp Vai Pro Lys
250 255
Asp He Gin Gin Gin Leu Ala He 260
Pro Asn Trp Glu Gin Ala Met Arg 265 270
Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Met
275 280
Pro Lys Pro Pro Glu Asp Ser His 285
Leu Glu Gin lie Vai Arg Leu lie
290 295
Ser Glu Ser Lys Lys Pro Vai Leu 300
Tyr Vai Gly Gly Gly Cys Leu Asn 305 310
Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg Phe
315 320
Vai Glu Leu Thr Gly lie Pro Vai
325
Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly
330 335
Ser Tyr Pro Cys Asp Asp Glu Leu 340
Ser Leu His Met Leu Gly Met His 345 350
Gly Thr Vai Tyr Ala Asn Tyr Ala
Vai Glu His Ser Asp Leu Leu Leu
- 26 036006
355 360365
Ala Phe Gly Vai Arg Phe Asp Asp Arg Vai Thr Gly Lys Leu Glu Ala
370 375380
Phe Ala Ser Arg Ala Lys lie Vai His lie Asp lie Asp Ser Ala Glu
385 390 395400 lie Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Vai Ser Vai Cys Gly Asp Vai Lys 405 410415
Leu Ala Leu Gin Gly Met Asn Lys Vai Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu 420 425430
Leu Lys Leu Asp Phe Gly Vai Trp Arg Asn Glu Leu Asn Vai Gin Lys
435 440445
Gin Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala lie Pro Pro
450 455460
Gin Tyr Ala lie Lys Vai Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala lie
465 470 475480
He Ser Thr Gly Vai Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin Phe Tyr
485 490495
Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala 500 505510
Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala He Gly Ala Ser Vai Ala Asn Pro
515 520525
Asp Ala He Vai Vai Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe He Met Asn 530 535540
Vai Gin Glu Leu Ala Thr He Arg Vai Glu Asn Leu Pro Vai Lys Vai 545 550 555560
Leu Leu Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met Vai Met Gin Trp Glu Asp
565 570575
Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Phe Leu Gly Asp Pro Ala 580 585590
Gin Glu Asp Glu He Phe Pro Asn Met Leu Leu Phe Ala Ala Ala Cys 595 600605
Gly He Pro Ala Ala Arg Vai Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Glu Ala
610 615620
He Gin Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Vai He
625 630 635640
Cys Pro His Gin Glu His Vai Leu Pro Met He Pro Asn Gly Gly Thr
645 650655
Phe Asn Asp Vai lie Thr Glu Gly Asp Gly Arg lie Lys Tyr
660 665670

Claims (9)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Толерантное к ALS-ингибиторным гербицидам растение Beta vulgaris и его органы, которые включают мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS) в положении, соответствующем положению 1705-1707 эталонной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный мутантный ген ALS кодирует ALS полипептид, который как минимум на 95% идентичен ALS полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем указанный ALS полипептид содержит аминокислоту, отличную от триптофана и выбранную из аланина, глицина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, пролина, валина или аргинина, в положении 569, а растение Beta vulgaris является как минимум в 500 раз менее чувствительным к ALS ингибитору по сравнению с растением дикого типа, не содержащим указанную мутацию.
2. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п.1, в которых ALS полипептид содержит в положении 569 аминокислоту лейцин, а эндогенный ALS ген имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.
3. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п.1, в которых указанная мутация является гомозиготной.
4. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п.1, где ALS-ингибиторные гербициды выбраны из группы, состоящей из сульфонилмочевинных гербицидов, сульфониламинокарбонилтриазолиноновых
- 27 036006 гербицидов, имидазолиноновых гербицидов, триазолопиримидиновых гербицидов и пиримидинил(тио)бензоатных гербицидов и их комбинаций.
5. Органы растения Beta vulgaris согласно п.1, представляющие собой семена.
6. Способ получения растения Beta vulgaris и его органов по п.1, который включает следующие стадии:
(a) экспонирование каллюсов В. vulgaris в присутствии около 10-7-10-9 М ALS-ингибиторного гербицида;
(b) отбор колоний клеток, которые могут расти в присутствии до 3х10-6 М ALS-ингибиторного гербицида;
(c) регенерирование ростков в присутствии ALS-ингибиторного гербицида;
(d) отбор регенерированных растеньиц с помощью ALS-ингибиторного гербицида, которые содержат мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS) в положении, соответствующем положению 1705-1707 эталонной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный мутантный ген ALS кодирует ALS полипептид, который как минимум на 95% идентичен ALS полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем указанный ALS полипептид содержит аминокислоту, отличную от триптофана и выбранную из аланина, глицина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, пролина, валина или аргинина, в положении 569 ALS.
7. Способ по п.6, в котором ALS-ингибиторный гербицид на стадиях (а), (b) и/или (с) является форамсульфуроном.
8. Способ по п.6 или 7, в котором на стадии (d) в качестве ALS-ингибиторного гербицида используют форамсульфурон, йодсульфурон-метил-натрий и/или их комбинацию.
9. Способ по п.8, в котором доза форамсульфурона эквивалентна 7-70 г а.в./га, а доза йодсульфурон-метил-натрия эквивалентна 1-10 г а.в./га.
EA201692296A 2010-10-15 2011-10-13 Мутанты beta vulgaris, толерантные к als-ингибиторным гербицидам EA036006B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10187751 2010-10-15
US39446310P 2010-10-19 2010-10-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201692296A1 EA201692296A1 (ru) 2017-04-28
EA036006B1 true EA036006B1 (ru) 2020-09-11

Family

ID=43466458

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390454A EA027918B1 (ru) 2010-10-15 2011-10-13 Мутанты beta vulgaris, толерантные к als ингибиторным гербицидам
EA201692296A EA036006B1 (ru) 2010-10-15 2011-10-13 Мутанты beta vulgaris, толерантные к als-ингибиторным гербицидам

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390454A EA027918B1 (ru) 2010-10-15 2011-10-13 Мутанты beta vulgaris, толерантные к als ингибиторным гербицидам

Country Status (18)

Country Link
US (2) US10865406B2 (ru)
EP (2) EP3326453B9 (ru)
JP (3) JP6093303B2 (ru)
CN (3) CN108034668A (ru)
CA (1) CA2814591C (ru)
CL (1) CL2013000928A1 (ru)
DK (1) DK3326453T5 (ru)
EA (2) EA027918B1 (ru)
ES (1) ES2954135T3 (ru)
FI (1) FI3326453T3 (ru)
HR (1) HRP20230964T1 (ru)
HU (1) HUE063371T2 (ru)
LT (1) LT3326453T (ru)
MA (1) MA34605B1 (ru)
PL (2) PL3326453T3 (ru)
RS (2) RS61766B1 (ru)
UA (2) UA113721C2 (ru)
WO (1) WO2012049268A1 (ru)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE034803T2 (en) 2010-10-15 2018-02-28 Bayer Ip Gmbh Use of ALS inhibitor herbicides to control undesirable vegetation in ALS inhibitor herbicide-tolerant beta vulgaris plants
US9226505B2 (en) 2011-09-23 2016-01-05 Bayer Intellectual Property Gmbh 4-substituted 1-phenylpyrazole-3-carboxylic acid derivatives as agents against abiotic plant stress
WO2013050324A1 (de) 2011-10-06 2013-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b)
CA2890489C (en) 2012-12-13 2022-05-03 Guy Weyens Method to develop herbicide-resistant sugar beet plants
SI2931034T2 (sl) 2012-12-13 2022-08-31 Bayer Cropscience Ag Uporaba ALS inhibitor herbicidov za zatiranje neželene vegetacije na ALS inhibitor herbicide tolerantnih rastlinah beta vulgaris
DE102013010026A1 (de) 2013-06-17 2014-12-18 Kws Saat Ag Resistenzgen gegen Rizomania
US20160160232A1 (en) 2013-07-12 2016-06-09 Bayer Cropscience Lp Als inhibitor herbicide tolerant mutant plants
EP3155000A1 (en) * 2014-06-12 2017-04-19 SESVanderHave N.V. Use of a selectable marker gene in sugar beet protoplasts transformation method and system
EP3155001A1 (en) * 2014-06-12 2017-04-19 SESVanderHave N.V. Transformation method of sugar beet protoplasts by talen platform technology
CN104206400B (zh) * 2014-09-26 2015-10-07 青岛瀚生生物科技股份有限公司 甲酰氨基嘧磺隆和甲基碘磺隆钠盐复合除草剂
CN105695493A (zh) * 2016-04-12 2016-06-22 江苏省农业科学院 一种als突变型基因在抗除草剂方面的应用
CN105779479B (zh) * 2016-04-12 2017-08-25 江苏省农业科学院 一种als突变型基因及其在抗除草剂方面的应用
EP3567111A1 (en) 2018-05-09 2019-11-13 KWS SAAT SE & Co. KGaA Gene for resistance to a pathogen of the genus heterodera
EP3571925A1 (en) 2018-05-24 2019-11-27 KWS SAAT SE & Co. KGaA Artificial marker allele
EP3623379A1 (en) 2018-09-11 2020-03-18 KWS SAAT SE & Co. KGaA Beet necrotic yellow vein virus (bnyvv)-resistance modifying gene
EP3628160A1 (en) 2018-09-25 2020-04-01 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of glyphosate herbicide for controlling unwanted vegetation in beta vulgaris growing areas
EP3628738A1 (en) * 2018-09-25 2020-04-01 KWS SAAT SE & Co. KGaA Method for controlling weed beets and other weeds
EP3696188A1 (en) 2019-02-18 2020-08-19 KWS SAAT SE & Co. KGaA Gene for resistance to plant disease
JP7375028B2 (ja) 2019-02-18 2023-11-07 カー・ヴェー・エス ザート エス・エー ウント コー． カー・ゲー・アー・アー 植物病害に対する抵抗性の遺伝子
WO2021093943A1 (en) 2019-11-12 2021-05-20 KWS SAAT SE & Co. KGaA Gene for resistance to a pathogen of the genus heterodera
EP3957168A1 (en) 2020-08-17 2022-02-23 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plant resistance gene and means for its identification
WO2022259249A1 (en) 2021-06-08 2022-12-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Sesame plants resistant to acetolactate synthase-inhibiting herbicides, compositions and methods for producing same
CA3230642A1 (en) 2021-09-02 2023-03-09 Bayer Aktiengesellschaft Performance gain in als inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris plants by combination of best fitting als large and small subunits
CA3230641A1 (en) 2021-09-02 2023-03-09 Bayer Aktiengesellschaft Als-inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris hybrids with increased heterosis
WO2023062184A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 KWS SAAT SE & Co. KGaA Als inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris mutants
WO2024161358A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Dlf Seeds A/S Beet yellows virus resistance

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996033270A1 (en) * 1995-04-20 1996-10-24 American Cyanamid Company Structure-based designed herbicide resistant products
WO1998002526A1 (en) * 1996-07-17 1998-01-22 Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
WO1998002527A1 (en) * 1996-07-17 1998-01-22 Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
DE19821613A1 (de) * 1998-05-14 1999-11-18 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrübenmutanten
WO2004062351A2 (en) * 2003-01-09 2004-07-29 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Gene encoding resistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides
WO2006094084A2 (en) * 2005-03-02 2006-09-08 Instituto Nacional De Tecnologia Agropecuaria Herbicide-resistant rice plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
WO2007005581A2 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 Basf Aktiengesellschaft Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide=resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2080506A (en) 1933-04-14 1937-05-18 Western Electric Co Process of and apparatus for electroplating articles
US5378824A (en) 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
WO1997008327A1 (fr) * 1995-08-30 1997-03-06 Nissan Chemical Industries, Ltd. Gene de l'acetolactate synthase resistant aux herbicides
US5859348A (en) 1996-07-17 1999-01-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants
DE19821614A1 (de) 1998-05-14 1999-11-18 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrübenmutanten
US7612255B2 (en) * 1999-02-03 2009-11-03 Jonathan Gressel Transgenic plants for mitigating introgression of genetically engineered genetic traits
AR036712A1 (es) * 2001-10-03 2004-09-29 Syngenta Participations Ag Composicion herbicida
US7595177B2 (en) 2002-10-29 2009-09-29 Advanta Canada, Inc. Assay for imidazolinone resistance mutations in Brassica species
US7432082B2 (en) 2004-03-22 2008-10-07 Basf Ag Methods and compositions for analyzing AHASL genes
US7355098B2 (en) 2004-06-22 2008-04-08 Saskatchewan Wheat Poo1 Brassica AHAS genes and gene alleles that provide resistance to imidazolinone herbicides
AR055593A1 (es) * 2005-08-01 2007-08-29 Basf Ag Un metodo para controlar malezas
AP2009004993A0 (en) 2007-04-04 2009-10-31 Basf Plant Science Gmbh Ahas mutants
GB0712884D0 (en) * 2007-07-03 2007-08-15 Syngenta Ltd Formulations
BR122018070228B1 (pt) 2007-10-05 2023-01-10 Cibus Europe B.V. Método para produção de planta brassica resistente à herbicida
CA2737939C (en) 2008-09-26 2021-04-27 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicide-resistant ahas-mutants and methods of use
CA2890489C (en) 2012-12-13 2022-05-03 Guy Weyens Method to develop herbicide-resistant sugar beet plants

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996033270A1 (en) * 1995-04-20 1996-10-24 American Cyanamid Company Structure-based designed herbicide resistant products
WO1998002526A1 (en) * 1996-07-17 1998-01-22 Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
WO1998002527A1 (en) * 1996-07-17 1998-01-22 Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
DE19821613A1 (de) * 1998-05-14 1999-11-18 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrübenmutanten
WO2004062351A2 (en) * 2003-01-09 2004-07-29 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Gene encoding resistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides
WO2006094084A2 (en) * 2005-03-02 2006-09-08 Instituto Nacional De Tecnologia Agropecuaria Herbicide-resistant rice plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
WO2007005581A2 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 Basf Aktiengesellschaft Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide=resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHARLES AMTZEN, JAMES PEACOCK AND MARC VAN MONTAGU: "MOLECULAR STRATEGIES FOR CROP IMPROVEMENT", JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY, A.R. LISS, vol. 44, no. Supplement, 16 April 1990 (1990-04-16) - 22 April 1990 (1990-04-22), pages 257 - 360, XP007916848, ISSN: 0730-2312 *
S. TAN ; R. EVANS ; B. SINGH: "Herbicidal inhibitors of amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant crops", AMINO ACIDS ; THE FORUM FOR AMINO ACID AND PROTEIN RESEARCH, SPRINGER-VERLAG, VI, vol. 30, no. 2, 1 March 2006 (2006-03-01), Vi, pages 195 - 204, XP019379389, ISSN: 1438-2199, DOI: 10.1007/s00726-005-0254-1 *

Also Published As

Publication number Publication date
UA113721C2 (uk) 2017-03-10
CL2013000928A1 (es) 2013-10-18
DK3326453T3 (da) 2023-09-04
EP3326453B1 (en) 2023-06-07
CN106386474A (zh) 2017-02-15
HRP20230964T1 (hr) 2023-12-08
DK3326453T5 (da) 2024-01-08
HUE063371T2 (hu) 2024-01-28
UA126466C2 (uk) 2022-10-12
WO2012049268A1 (en) 2012-04-19
US20130247253A1 (en) 2013-09-19
CN103200812A (zh) 2013-07-10
EP2627168B1 (en) 2021-03-31
EA201692296A1 (ru) 2017-04-28
ES2954135T3 (es) 2023-11-20
JP2018183168A (ja) 2018-11-22
EA027918B1 (ru) 2017-09-29
US10865406B2 (en) 2020-12-15
CA2814591C (en) 2021-08-31
CA2814591A1 (en) 2012-04-19
FI3326453T3 (fi) 2023-09-05
PL3326453T3 (pl) 2023-11-06
MA34605B1 (fr) 2013-10-02
JP2017108750A (ja) 2017-06-22
EA201390454A1 (ru) 2014-02-28
JP2013542725A (ja) 2013-11-28
RS64602B1 (sr) 2023-10-31
US20210054360A1 (en) 2021-02-25
EP2627168A1 (en) 2013-08-21
PL2627168T3 (pl) 2021-11-02
EP3326453A1 (en) 2018-05-30
EP3326453B8 (en) 2023-07-19
RS61766B1 (sr) 2021-05-31
JP6093303B2 (ja) 2017-03-08
CN108034668A (zh) 2018-05-15
JP6375398B2 (ja) 2018-08-15
EP3326453B9 (en) 2023-10-04
LT3326453T (lt) 2023-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6375398B2 (ja) Ａｌｓインヒビター除草剤耐性ベータ・ブルガリス突然変異体
JP6965219B2 (ja) 変異したプロトポルフィリノーゲンｉｘオキシダーゼ（ｐｐｘ）遺伝子
US8030547B2 (en) Gene coding for acetolactate synthase
US9572315B2 (en) ALS inhibitor herbicide tolerant B. napus mutants
USRE48254E1 (en) Lentil plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
CN111373035B (zh) 油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用
ES2874226T3 (es) Mutantes de Beta vulgaris tolerantes a herbicidas inhibidores de ALS
US20240298601A1 (en) Sesame plants resistant to acetolactate synthase-inhibiting herbicides, compositions and methods for producing same
CN112154207B (zh) 油菜抗嘧啶水杨酸类除草剂基因及其应用
WO2021105408A1 (en) Watermelon with pale microseeds
CN114645028A (zh) 一种als突变蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM TJ TM