EA031524B1 - Антитела, связывающие ил-23 - Google Patents
Антитела, связывающие ил-23 Download PDFInfo
- Publication number
- EA031524B1 EA031524B1 EA201591368A EA201591368A EA031524B1 EA 031524 B1 EA031524 B1 EA 031524B1 EA 201591368 A EA201591368 A EA 201591368A EA 201591368 A EA201591368 A EA 201591368A EA 031524 B1 EA031524 B1 EA 031524B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- amino acid
- heavy chain
- light chain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
В настоящем изобретении предложено антитело, связывающееся с субъединицей р19 ИЛ-23 человека и характеризующееся высоким сродством, селективностью и нейтрализующими свойствами. Указанное антитело подходит для лечения или профилактики аутоиммунного или воспалительного состояния, выбранного из группы, состоящей из рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительных заболеваний кишечника, анкилозирующего спондилита, реакции трансплантат против хозяина, волчанки и метаболического синдрома. Указанное антитело также применимо для лечения рака.
Description
Настоящее изобретение относится к антителам, связывающим интерлейкин-23 (ИЛ-23) человека, и к их применению.
Интерлейкин-23 (ИЛ-23) представляет собой гетеродимерный цитокин, связанный дисульфидными связями и состоящий из субъединиц р19 и р40. Он входит в семейство цитокинов интерлейкина-12 (ИЛ12). ИЛ-12 является гетеродимерным цитокином массой 70 кДа и состоит из ковалентно связанных субъединиц р40 и р35. ИЛ-12 играет важную роль в развитии защитных врожденных и приобретенных иммунных реакций и в иммунологической противоопухолевой защите организма. ИЛ-12 также участвует в воспалительном ответе за счет способности стимулировать ответ Т-хелперов 1 типа (Th1). Однако функциональная роль ИЛ-12 в воспалительном ответе была пересмотрена с открытием соответствующего цитокина ИЛ-23. ИЛ-23 содержит такую же субъединицу р40, как и ИЛ-12, но ковалентно соединенную с субъединицей р19. Многие из реагентов, используемых для оценки роли ИЛ-12, взаимодействуют с общей для ИЛ-12/ИЛ-23 субъединицей р40; это означает, что активность, ранее приписываемая ИЛ-12, возможно, была опосредована ИЛ-23. Создание ИЛ-23-дефицитных мышей позволило исследователям отличить активность ИЛ-12 от ИЛ-23 и определить, что ИЛ-23 является основным медиатором аутоиммунного/воспалительного ответа.
Функциональный рецептор ИЛ-23 является гетеродимером субъединицы ИЛ-12ИР1, которая также входит в состав рецептора ИЛ-12, и субъединицы ИЛ-23И. Рецептор ИЛ-23 конститутивно связан с Янус-киназой 2 (Jak2) и преимущественно активирует STAT3, в меньшей степени активируя STAT4, чем ИЛ-12.
Рецептор ИЛ-23 экспрессируется на активированных Т-клетках/Т-клетках памяти и естественных киллерах (NK). Моноциты, макрофаги и дендритные клетки также экспрессируют рецептор ИЛ-23 на низком уровне. ИЛ-23 поддерживает дифференцировку и поддержание наивных CD4+ Т-клеток в новой субпопуляции клеток, называемых Th17-клетками, которые отличаются от классических Th1- и Th2клеток. И^-клетки продуцируют интерлейкин-17А (ИЛ-17А) и интерлейкин-17F (HH-17F). ^П-клетки продуцируют ряд других факторов, регулирующих воспалительные реакции, в том числе факторы некроза опухолей, регулирующих воспалительные реакции, в том числе фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-α), интерлейкин-6 (ИЛ-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМКСФ), CXCL1 и CCL20. NK-клетки и врожденные лимфоидные клетки, например клетки, подобные клеткам, индуцирующим лимфоидную ткань (LTi), экспрессируют рецептор ИЛ-23 и орфанный γрецептор, связанный с ретиноевой кислотой (ROR), и продуцируют ИЛ-17 в ответ на ИЛ-23. ИЛ-13 и ИЛ-23 также совместно стимулируют γ-δ-Т-клетки, индуцируя продукцию ИЛ-17 без участия Тклеточного рецептора.
Имеются существенные доказательства того, что клетки, реагирующие на ИЛ-23, связаны с аутоиммунными воспалительными заболеваниями и раком. В частности, специфичный ингибитор ИЛ-23 (т.е. ингибитор, ингибирующий ИЛ-23, но не ИЛ-12) может быть особенно полезен для ингибирования ИЛ23, не затрагивающего ИЛ-12, с целью максимального повышения терапевтического эффекта при минимизации риска подавления иммунных реакций хозяина.
Антитела, специфически связывающиеся с субъединицей р19 ИЛ-23, являются потенциально полезными ингибиторами; см., например, WO 2007/024846 и WO 2007/027714. Проблема с антителами, описанными в WO 2007/024846, состоит, по меньшей мере, в возможной межтканевой перекрестной реакционной способности, в частности возможном связывании с тканью сетчатки, что представляет собой проблему с точки зрения безопасности применения. Кроме того, антитела, описанные в WO 2007/024846, обладают, по меньшей мере, неоптимальными физико-химическими свойствами, например крайне высокой гидрофобностью, которая приводит к агрегации, представляющей собой серьезное ограничение для получения антител в промышленном масштабе. Кроме того, ни одно из антител, мишенью которых является субъединица р19 ИЛ-23, не было одобрено для терапевтического применения.
Таким образом, сохраняется потребность в антителах против ИЛ-23. В частности, сохраняется потребность в антителах против ИЛ-23, которые с высоким сродством связываются с субъединицей р19 ИЛ-23, в частности ИЛ-23 человека, и не связываются с субъединицей р40 родственного члена семейства цитокинов, ИЛ-12. Конкретнее, сохраняется потребность в антителах против ИЛ-23, которые с высоким сродством связываются с субъединицей р19 ИЛ-23 и не проявляют заметной межтканевой перекрестной реакционной способности, в частности, по отношению к ткани сетчатки. Кроме того, существует потребность в антителах против ИЛ-23, обладающих фармацевтически приемлемыми физико-химическими свойствами, которые облегчали бы их разработку, производство или приготовление в виде составов.
В настоящем изобретении предложено антитело, связывающееся с субъединицей р19 ИЛ-23 человека, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, причем легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), а тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), где LCVR содержит аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, a HCVR содержит аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 4, LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 5, LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 6, HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 1, HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 2, a HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 3.
- 1 031524
В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), а тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем аминокислотная последовательность LCVR представляет собой SEQ ID NO: 8, а аминокислотная последовательность HCVR представляет собой SEQ ID NO: 7.
В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит две вариабельные области легкой цепи (LCVR) и две вариабельные области тяжелой цепи (HCVR), причем аминокислотная последовательность каждой LCVR представляет собой SEQ ID NO: 8, а аминокислотная последовательность каждой HCVR представляет собой SEQ ID NO: 7.
В еще одном дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем аминокислотная последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10, а аминокислотная последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9.
В еще одном дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, причем аминокислотная последовательность каждой легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10, а аминокислотная последовательность каждой тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9.
В настоящем изобретении предложено антитело, связывающееся с субъединицей р19 ИЛ-23 человека, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, причем легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), а тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), где LCVR содержит определяющие комплементарность участки LCDR1, LCDR2 и LCDR3, a HCVR содержит определяющие комплементарность участки HCDR1, HCDR2, HCDR3, и где LCDR1 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR2 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, LCDR3 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, HCDR1 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR2 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, a HCDR3 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.
В настоящем изобретении также предложено антитело, связывающее субъединицу р19 ИЛ-23 человека, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, причем легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), а тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем цепь LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, а цепь HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.
В настоящем изобретении также предложено антитело, связывающее субъединицу р19 ИЛ-23 человека, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, причем легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, а тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
В настоящем изобретении также предложено антитело, связывающее субъединицу р19 ИЛ-23 человека, содержащее две легких цепи и две тяжелые цепи, причем каждая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, а каждая тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
Аминокислотные последовательности антител согласно настоящему изобретению приведены ниже.
SEQ ID NO
Антител о | Тяжелая цепь | Легкая цепь | HCVR | LCVR |
I | 9 | 10 | 7 | 8 |
Антитело | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 |
I | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
В настоящем изобретении также предложено антитело, связывающее субъединицу р19 ИЛ-23 человека по конформационному эпитопу в области положений 81-99 и 115-140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15.
В настоящем изобретении также предложено антитело, связывающее субъединицу р19 ИЛ-23 человека по конформационному эпитопу в области положений 81-99 и 115-140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, причем антитело контактирует, по меньшей мере, с аминокислотными остатками 94Р, 95S, 97L, 98Р, 99D, 123W, 130S, 133P и 137W SEQ ID NO: 15.
В еще одном дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело является селективным по отношению к субъединице р19 ИЛ-23 человека.
При связывании с субъединицей р19 ИЛ-23 человека антитело согласно настоящему изобретению
- 2 031524 предотвращает связывание ИЛ-23 человека с ИЛ-23-субъединицей рецептора ИЛ-23. Соответственно, антитело согласно настоящему изобретению ингибирует активность ИЛ-23 человека по отношению к ИЛ-23-субъединице рецептора ИЛ-23.
Антитело согласно настоящему изобретению не предотвращает связывание ИЛ-23 человека с субъединицей ИЛ-12ИР1 рецептора ИЛ-23 и, следовательно, не ингибирует активность ИЛ-23 человека по отношению к субъединице ИЛ-12ИР1 рецептора ИЛ-23.
Антитело не связывается на детектируемом уровне с субъединицей р40, входящей в состав ИЛ-23 человека и ИЛ-12 человека.
В еще одном дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело обладает нейтрализующей активностью по отношению к субъединице р 19 ИЛ-23 человека.
В еще одном дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению обладает IC50, меньшей или равной приблизительно 90 пМ. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению обладает IC50, меньшей или равной приблизительно 74 пМ. Значения IC50 измеряют в ходе анализа с использованием спленоцитов мыши в условиях in vitro, как описано в разделе, озаглавленном Нейтрализация ИЛ-23 человека или яванского макака в условиях in vitro с помощью антитела I в спленоцитах мыши в примере 1.
В еще одном дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению является селективным и обладает нейтрализующей активностью по отношению к субъединице р19 ИЛ-23 человека.
В еще одном дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению обладает равновесной константой диссоциации KD по отношению к ИЛ-23 человека, равной приблизительно 10-30 пМ. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению обладает KD по отношению к ИЛ-23 человека, равной приблизительно 21 пМ. Значения KD устанавливают по кинетике связывания при 37°С, как описано в разделе под названием Измерение сродства связывания антитела I с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore) в примере 1. Антитело согласно настоящему изобретению дополнительно характеризуется скоростью kon по отношению к субъединице р19 ИЛ-23 человека от приблизительно 2,2х106 М-1 с-1 до приблизительно 2,бх106 М-1 с-1. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению обладает скоростью kon по отношению к субъединице р19 ИЛ-23 человека, приблизительно равной 2,43х106 М-1 с-1. Антитело согласно настоящему изобретению дополнительно характеризуется скоростью koff по отношению к субъединице р19 ИЛ-23 человека от приблизительно 0,30х10-4 с-1 до приблизительно 0,70х10-4 с-1. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению обладает скоростью koff по отношению к субъединице р19 ИЛ-23 человека, приблизительно равной 0,52х10-4 с-1.
Антитело согласно настоящему изобретению связывается с субъединицей р19 ИЛ-23 человека с высоким сродством. Для целей настоящего изобретения термин высокое сродство относится к KD, по меньшей мере, равной 21 пМ. Значения KD устанавливают по кинетике связывания при 37°С, как описано в разделе, озаглавленном Измерение сродства связывания антитела I с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore) в примере 1.
В отличие от некоторых известных антител, которые связываются с ИЛ-23 человека, антитело согласно настоящему изобретению не проявляет заметной межтканевой перекрестной реакционной способности. В частности, антитело согласно настоящему изобретению не связывается с тканью сетчатки в степени, которую можно наблюдать.
Антитело согласно настоящему изобретению обладает фармацевтически приемлемыми физикохимическими свойствами, в том числе фармацевтически приемлемой растворимостью в физиологических и лабораторных условиях, и фармацевтически приемлемой химической и физической стабильностью, причем антитело остается в мономерной форме, и при различных условиях наблюдается очень небольшое количество высокомолекулярных (ВМ) агрегатов, как описано в разделе, озаглавленном Физико-химические свойства антитела против ИЛ-23 в примере 1.
В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие антитело по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемые носители, разбавители или вспомогательные вещества. Конкретнее, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит один или несколько дополнительных терапевтических агентов.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения или профилактики состояния у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению, причем указанное состояние представляет собой аутоиммунное или воспалительное состояние, выбранное из группы, состоящей из рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительных заболеваний кишечника, анкилозирующего спондилита, реакции трансплантат против хозяина, волчанки и метаболического синдрома.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения или профилактики состояния у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению, причем указанное состояние представляет собой рак.
- 3 031524
В варианте реализации настоящего изобретения рак представляет собой меланому, рак толстой кишки, рак яичника, рак головы и шеи, рак легких, рак молочной железы или рак желудка.
В настоящем изобретении также предложено антитело согласно настоящему изобретению для терапевтического применения.
Конкретнее, в настоящем изобретении предложено антитело согласно настоящему изобретению для терапевтического или профилактического применения аутоиммунного или воспалительного состояния, выбранного из группы, состоящей из рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительных заболеваний кишечника, анкилозирующего спондилита, реакции трансплантат против хозяина, волчанки и метаболического синдрома.
В настоящем изобретении также предложено антитело согласно настоящему изобретению для терапевтического или профилактического применения при раке.
В варианте реализации настоящего изобретения рак представляет собой меланому, рак толстой кишки, рак яичника, рак головы и шеи, рак легких, рак молочной железы или рак желудка.
В настоящем изобретении предложено применение антитела согласно настоящему изобретению при производстве медикамента для лечения или профилактики состояния, выбранного из группы, состоящей из рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительных заболеваний кишечника, анкилозирующего спондилита, реакции трансплантат против хозяина, волчанки и метаболического синдрома.
В настоящем изобретении также предложено применение антитела согласно настоящему изобретению при производстве медикамента для лечения или профилактики рака.
В варианте реализации настоящего изобретения рак представляет собой меланому, рак толстой кишки, рак яичника, рак головы и шеи, рак легких, рак молочной железы или рак желудка.
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим вышеописанное антитело согласно настоящему изобретению.
В настоящем изобретении предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид легкой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10.
В настоящем изобретении также предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид тяжелой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9.
В одном варианте реализации в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, кодирующий антитело согласно настоящему изобретению, где HCVR закодирован в последовательности SEQ ID NO: 11, a LCVR закодирован в SEQ ID NO: 12.
В дополнительном варианте реализации в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, кодирующий антитело согласно настоящему изобретению, где тяжелая цепь закодирована в последовательности SEQ ID NO: 13, а легкая цепь закодирована в SEQ ID NO: 14.
Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть в форме РНК или в форме ДНК, причем ДНК включает кДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной. Последовательности, кодирующие антитело согласно настоящему изобретению, могут изменяться за счет избыточности или вырожденности генетического кода.
Полинуклеотиды, кодирующие антитело согласно настоящему изобретению, могут содержать только кодирующую последовательность антитела, кодирующую последовательность антитела и дополнительную кодирующую последовательность, например, лидера или секреторной последовательности или последовательность пробелка; кодирующую последовательность антитела и некодирующую последовательность, например, интроны или некодирующую последовательность, расположенную в направлении 5'- и/или 3'- от кодирующей последовательности белка. Таким образом, термин полинуклеотид, кодирующий антитело охватывает полинуклеотид, который может включать не только последовательность, кодирующую белок, но также и полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.
Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению должны экспрессироваться в клетке-хозяине после функционального связывания указанных последовательностей с последовательностью, контролирующей экспрессию. Векторы экспрессии обычно способны к репликации в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде интегральной части хромосомной ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии содержат селективные маркеры, например устойчивости к тетрациклину, неомицину и дигидрофолатредуктазу, для обнаружения клеток, трансформированных желательными последовательностями ДНК.
В настоящем изобретении предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид легкой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, и молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид тяжелой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, причем указанная клетка способна экспрессировать антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем аминокислотная последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность легкой цепи представляет собой
- 4 031524
SEQ ID NO: 10.
Антитело согласно настоящему изобретению легко продуцировать в клетках млекопитающих, например клетках СНО, HEK293, NSO или COS; в бактериальных клетках, например Е. coli, Bacillus subtilis или Pseudomonas fluorescence; или в клетках грибов или дрожжей. Клетки-хозяева культивируют с использованием методик, общеизвестных в данной области техники.
Векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, представляющие интерес (например, полинуклеотиды, кодирующие полипептиды антител и последовательностей, контролирующих экспрессию), можно перенести в клетку-хозяин с помощью общеизвестных способов, которые отличаются в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, трансформацию с использованием хлорида кальция обычно используют для прокариотических клеток, в то время как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно использовать для других клеток-хозяев.
Можно использовать различные способы очистки белка, известные в данной области техники и описанные, например, в Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) и Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994).
В настоящем изобретении также предложен способ продукции антитела, связывающего субъединицу р19 ИЛ-23 человека, содержащего тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, а указанный способ включает этапы:
a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина по п.7 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного антитела; и
b) выделение экспрессированного антитела из указанной клетки-хозяина.
Кроме того, в настоящем изобретении также предложен способ продукции антитела, связывающего субъединицу р19 ИЛ-23 человека, содержащего тяжелую цепь и легкую цепь, причем аминокислотная последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10, а указанный способ включает этапы:
a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, заданную SEQ ID NO: 9, и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, заданную SEQ ID NO: 10, в условиях, обеспечивающих экспрессию указанных полипептидных последовательностей; и
b) выделение антитела, содержащего тяжелую цепь и легкую цепь, из указанной клетки-хозяина, причем полипептидная последовательность указанной тяжелой цепи задана SEQ ID NO: 9, а полипептидная последовательность указанной легкой цепи задана SEQ ID NO: 10.
В варианте реализации вышеописанного способа первая полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептидную последовательность, заданную SEQ ID NO: 9, и вторая полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептидную последовательность, заданную SEQ ID NO: 10, являются частью одной и той же молекулы нуклеиновой кислоты.
В варианте реализации в настоящем изобретении предложено антитело, продуцированное посредством вышеупомянутого способа.
В дополнительном варианте реализации антитело, продуцированное посредством вышеупомянутого способа, содержит две тяжелых цепи и две легких цепи, причем полипептидная последовательность каждой тяжелой цепи задана SEQ ID NO: 9, а полипептидная последовательность каждой легкой цепи задана SEQ ID NO: 10.
Антитело согласно настоящему изобретению является антителом типа IgG и содержит четыре аминокислотные цепи (две тяжелые и две легкие цепи), которые перекрестно сшиты посредством внутри- и межцепочечных дисульфидных связей. При экспрессии в некоторых биологических системах антитела, содержащие нативные Fc-последовательности человека, гликозилированы по Fc-области. Антитела также могут быть гликозилированы по другим положениям.
Каждая тяжелая цепь содержит N-концевую HCVR и константную область тяжелой цепи (HCCR). Тяжелые цепи человека подразделяются на гамма-, мю-, альфа-, дельта- или эпсилон-цепи и определяют изотип антитела IgG, IgM, IgA, IgD или IgE соответственно. IgG-антитела человека могут дополнительно подразделяться на подклассы, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению содержит Fc-фрагмент, полученный из Fc-области IgG4 человека из-за пониженной способности использовать воспалительные механизмы, опосредованные Fc-рецептором, или активировать комплемент, что приводит к снижению эффекторной функции.
Более предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению содержит Fc-фрагмент IgG4PAA. Fc-фрагмент IgG4-PAA содержит мутацию, замену серина на пролин в положении 223 (S223P; SEQ ID NO: 9), мутацию, замену фенилаланина на аланин в положении 229 (F229A; SEQ ID NO: 9) и мутацию, замену лейцина на аланин в положении 230 (L230A; SEQ ID NO: 9). Мутация S223P является мутацией шарнирной области, которая предотвращает образование полуантитела (явление динамического обмена полумолекул в антителах IgG4). Мутации F229A и L230A дополнительно снижают эффекторную
- 5 031524 функцию, и без того низкую у антител человека изотипа IgG4.
Каждый тип тяжелой цепи также характеризуется определенной константной областью с последовательностью, общеизвестной специалистам. Константная область тяжелой цепи IgG содержит три домена (CH1, CH2 и CH3).
Легкие цепи подразделяются на каппа- или лямбда-, каждая из которых характеризуется определенной константной областью, как известно в данной области техники. Каждая легкая цепь содержит LCVR и константную область легкой цепи (LCCR). Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению содержит легкую к-цепь.
Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют связывающий сайт антитела. Области HCVR и LCVR также можно подразделить на области гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), перемежающиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR, выстроенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В настоящем документе три CDR тяжелой цепи обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а три CDR легкой цепи обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. CDR содержат большинство остатков, участвующих в специфическом взаимодействии с антигеном. В настоящее время существуют три системы распределения CDR в антителах, которые используются для описания последовательности. Определение CDR по Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) основано на вариабельности последовательностей антител. Определение CDR по Chothia (Chothia et al., Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) основано на трехмерных структурах антител и топологии CDR-петель. Определение CDR по Chothia идентично определению CDR по Kabat, за исключением HCDR1 и HCDR2. Определение CDR по North (North et al, A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)) основано на кластеризации развития сродства с большим количеством кристаллических структур.
Для целей настоящего изобретения для определения CDR используют единый взгляд с точки зрения трех указанных способов. В случае CDR легкой цепи используют определения CDR по Kabat и Chothia. В случае HCDR1 используют гибридное определение CDR по Kabat и Chothia. HCDR1 по Kabat начинается через восемь остатков после первого остатка цистеина тяжелой цепи и составляет пять остатков в длину, тогда как HCDR1 по Chothia начинается через три остатка после этого остатка цистеина и составляет семь остатков в длину. Начальное положение HCDR1 антитела согласно настоящему изобретению определяют по Chothia, а конечное положение - по Kabat. В случае HCDR2 используют определение CDR по Kabat. В случае HCDR3 используют гибридное определение CDR по North, Kabat и Chothia. HCDR3 по Kabat содержит остатки 95-102 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 13 для антитела согласно настоящему изобретению) и обычно начинается через три остатка после цистеина. Определение HCDR3 по Chothia аналогично определению по Kabat. HCDR3 по North содержит остатки 93-102 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 13 для антитела согласно настоящему изобретению) и обычно начинается непосредственно после остатка цистеина. Начальное положение HCDR3 антитела согласно настоящему изобретению определяют по North, a конечное положение - по Kabat/Chothia/North.
В табл. 1 показано типичное распределение CDR в антителе согласно настоящему изобретению.
Таблица 1
Распределение CDR
CDR | Определение начального положения | Определение конечного положения |
LCDR1 | Kabat/Chothia/North | Kabat/Chothia/North |
LCDR2 | Kabat/Chothia | Kabat/ Chothia/North |
LCDR3 | Kabat/Chothia/North | Kabat/Chothia/North |
HCDR1 | Chothia | Kabat/North |
HCDR2 | Kabat/North | Kabat |
HCDR3 | North | Kabat/Chothia/North |
Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой сконструированное антитело, разработанное с использованием каркасных, шарнирных и константных областей человеческого происхождения, идентичных или практически идентичных (практически человеческих) каркасным и константным областям, полученным из геномных последовательностей человека. Полностью человеческие каркасные, шарнирные и константные области представляют собой эмбриональные последовательности человека, а
- 6 031524 также последовательности, несущие естественные соматические мутации и рекомбинантные мутации. Антитело согласно настоящему изобретению может содержать каркасные, шарнирные или константные области, полученные из полностью человеческих каркасных, шарнирных или константных областей, содержащих одну или более аминокислотных замен, делеций или вставок. Кроме того, антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно практически не обладает иммуногенностью в организме человека.
Целый ряд различных каркасных последовательностей человека можно использовать по отдельности или в комбинации в качестве основы для антитела согласно настоящему изобретению. Предпочтительно каркасные области антитела согласно настоящему изобретению являются областями человеческого или практически человеческого происхождения (по меньшей мере на 95, 97 или 99% человеческого происхождения). Последовательности каркасных областей человеческого происхождения можно получить из The Immunoglobulin Factsbook, by Marie-Paule Lafranc, Gerard Lefranc, Academic Press 2001, ISBN 012441351.
Каркасные последовательности для антитела согласно настоящему изобретению используют в качестве донорной вариабельной каркасной области и можно использовать для создания дополнительных антител с теми же CDR, что указаны в настоящем документе, с использованием методологии, известной в данной области техники. Кроме того, каркасную последовательность для антитела согласно настоящему изобретению можно сравнить с другими известными каркасными последовательностями человека для создания дополнительных антител. Так, эту информацию можно использовать для внесения обратных мутаций в донорные аминокислотные остатки по указанным положениям другой выбранной гомологичной каркасной области человека. Кроме того, можно обнаружить редкие аминокислоты в дополнительных каркасных областях человека таким образом, что в соответствующем положении можно использовать консенсусный или донорный аминокислотный остаток.
Способы получения и очистки антител хорошо известны в данной области техники и могут быть найдены, например, в Harlow and Lane (1988) Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, Chapters 5-8 and 15. Например, можно иммунизировать мышей ИЛ-23 человека или его фрагментами, а затем восстановить, очистить и определить аминокислотные последовательности полученных антител с использованием общепринятых способов, хорошо известных в данной области техники. Антитело согласно настоящему изобретению разработано таким образом, что содержит одну или несколько каркасных областей человека, окружающих CDR, полученных из антитела нечеловеческого происхождения. Последовательности каркасной области антител эмбрионального типа человека можно получить из ImMunoGeneTics (IMGT) через их веб-сайт http://imgt.cines.fr, или из The Immunoglobulin Facts Book, Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Конкретные каркасные области легкой цепи эмбрионального типа для использования в составе антитела согласно настоящему изобретению включают 02.
Конкретные каркасные области тяжелой цепи эмбрионального типа для использования в составе антитела согласно настоящему изобретению включают VH1-69.
Сконструированные антитела согласно настоящему изобретению можно получить и очистить в соответствии с известными способами. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую цепь (например, аминокислотную последовательность, заданную SEQ ID NO: 9) и легкую цепь (например, аминокислотную последовательность, заданную SEQ ID NO: 10), можно клонировать и сконструировать в экспрессирующем векторе GS (глутаминсинтетазы). Сконструированный иммуноглобулинэкспрессирующий вектор затем можно стабильно трансфицировать в клетки СНО. Экспрессия антител в клетках млекопитающих приведет к гликозилированию, обычно по высококонсервативным сайтам Nгликозилирования в Fc-области. Стабильные клоны можно проверить на экспрессию антитела, специфически связывающегося с ИЛ-23 человека. Положительные клоны можно размножить в бессывороточной культуральной среде для продуцирования антител в биореакторах. Среду, в которую секретируются антитела, можно очистить общепринятыми способами. Например, среду можно нанести на колонку с белок А- или G-сефарозой FF, уравновешенную совместимым буфером, например фосфатно-солевым буфером. Колонку промывают для удаления неспецифически связавшихся компонентов. Связанное антитело элюируют, например, градиентом рН и обнаруживают фракции антитела, например, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, а затем объединяют их. Антитело можно концентрировать и/или стерильно фильтровать с помощью распространенных методик. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалить с помощью распространенных методик, включая эксклюзионную, гидрофобную, ионообменную хроматографию или хроматографию на гидроксиапатите. Продукт можно немедленно заморозить, например при -70°С, или лиофилизировать.
Антитела по настоящему изобретению являются моноклональными антителами. В настоящем документе термин моноклональное антитело или мАт относится к антителу, происходящему от единственной копии или клона, включая, например, клон эукариотической, прокариотической клетки или фага, а не к способу, с помощью которого оно получено. Моноклональные антитела можно получить, например, с помощью гибридомных технологий, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий, например CDR-трансплантации, или их комбинации, или иных технологий,
- 7 031524 известных в данной области техники.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения антитело или нуклеиновая кислота, кодирующая его, представлены в выделенной форме.
Антитело согласно настоящему изобретению или содержащие его фармацевтические композиции можно вводить парентеральным путем (например, подкожно, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или трансдермально).
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно получить способами, широкоизвестными в данной области техники (см., например, Remington: The Science and Practice a/Pharmacy, 19th edition (1995), (A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.); указанные композиции содержат антитело, описанное в настоящем документе, и один или более фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Например, можно получить состав антитела согласно настоящему изобретению с такими агентами, как цитрат натрия, лимонная кислота, полисорбат 80, хлорид натрия и сахароза, а затем лиофилизировать полученную композицию и хранить ее при 2-8°С. Лиофилизированную композицию затем можно восстановить с использованием стерильной воды для инъекций перед введением.
Термин связываться (или связывается) с субъединицей р19 ИЛ-23 человека в настоящем документе относится к детектируемому взаимодействию антитела с эпитопом на субъединице р19 ИЛ-23 человека, заданным аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 15. Взаимодействие между антителом согласно настоящему изобретению и субъединицей р19 ИЛ-23 человека измеряют по кинетике связывания при 37°С, как описано в разделе, озаглавленном Измерение сродства связывания антитела I с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore) в примере 1.
Термин эпитоп в настоящем документе относится к аминокислотным остаткам, которые находятся вблизи друг от друга на поверхности белка (антигена) и взаимодействуют с антителом. Существует два широких класса эпитопов: линейные эпитопы и конформационные эпитопы.
Термин линейный эпитоп в настоящем документе относится к непрерывной первичной аминокислотной последовательности конкретной области белка.
Термин конформационный эпитоп в настоящем документе относится к дискретным сегментам аминокислотной последовательности антигена, контактирующим с антителом согласно изобретению. Конформационные эпитопы определяют по структуре, а также последовательности нативного белка; эти эпитопы могут быть непрерывными или дискретными. Компоненты эпитопа могут быть расположены на разрозненных участках белка, которые расположены вблизи друг от друга в трехмерной структуре нативного белка. В контексте настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению связывается с конформационным эпитопом в области аминокислот 81-99 и 115-140 SEQ ID NO: 15, причем антитело контактирует, по меньшей мере, с аминокислотными остатками 94Р, 95S, 97L, 98Р, 99D, 123W, 130S, 133Р и 137W SEQ ID NO: 15. В то же время конформационный эпитоп не ограничивается указанными аминокислотными остатками и может содержать аминокислотные остатки в пределах аминокислот 81-99 и 115-140 SEQ ID NO: 15.
Термин не связывает ткань сетчатки в заметной степени в настоящем документе относится к отсутствию детектируемого взаимодействия антитела согласно настоящему изобретению с тканью сетчатки человека и яванского макака. Взаимодействие между антителом согласно настоящему изобретению и тканью сетчатки человека и яванского макака оценивают в ходе иммуногистохимического анализа, как описано в разделе, озаглавленном Перекрестная реакционная способность с тканью сетчатки: иммуногистохимический анализ in vitro в примере 1. Термин в заметной степени в контексте настоящего документа относится к визуальной оценке ткани сетчатки человека и яванского макака с целью определения связывания антитела согласно настоящему изобретению с указанной тканью сетчатки человека и яванского макака.
Термин селективный в настоящем документе по отношению к антителу согласно настоящему изобретению относится к антителу, связывающему субъединицу р19 ИЛ-23 человека, но не связывающему субъединицу р40 ИЛ-23 человека и ИЛ-12 человека.
Термин нейтрализующий по отношению к нейтрализующему антителу в настоящем документе предназначен для обозначения ингибирования биологической активности ИЛ-23 человека. Измеряя один или несколько показателей биологической активности ИЛ-23 с помощью биологического анализа с использованием спленоцитов мыши (см. раздел под названием Нейтрализация ИЛ-23 человека или яванского макака in vitro антителом в спленоцитах мыши в примере 1) или анализа нейтрализации ИЛ-23 человека (см. раздел под названием Нейтрализация ИЛ-23 человека: острая, местная в примере 1), можно оценить указанное ингибирование биологической активности ИЛ-23 человека.
Термин KD в настоящем документе предназначен для обозначения константы диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело. Ее рассчитывают по формуле
Koff/Ko^Ko
Термин kon в настоящем документе предназначен для обозначения константы скорости ассоциации или удельной скорости прямой, или комплексообразующей, реакции, измеряемой в единицах M’V1.
Термин koff в настоящем документе предназначен для обозначения константы скорости диссоциа
- 8 031524 ции или удельной скорости реакции диссоциации антитела из комплекса антиген/антитело, измеряемой в единицах с-1.
Термин IC50, используемый в настоящем документе, предназначен для обозначения эффективной концентрации антител согласно настоящему изобретению, необходимой для нейтрализации 50% биологической активности ИЛ-23 в спленоцитах мыши в ходе биологического анализа, описанного в разделе под названием Нейтрализация ИЛ-23 человека или яванского макака in vitro антителом в спленоцитах мыши в примере 1.
Считается, что термин полинуклеотид в настоящем документе включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной.
В настоящем документе термин выделенный относится к белку, пептиду или нуклеиновой кислоте, не содержащим или практически не содержащим других макромолекулярных соединений, встречающихся в клеточном окружении.
В настоящем документе термин практически не содержащий означает, что белок, пептид или нуклеиновая кислота, представляющая интерес, состоит из представленных высокомолекулярных соединений более чем на 80% (в молярном соотношении), предпочтительно более чем на 90% и более предпочтительно более чем на 95%.
Пациент является млекопитающим, предпочтительно человеком.
Термин лечение (или лечить или обработка) относится к замедлению, прерыванию, купированию, облегчению, остановке, снижению или обращению вспять развития или тяжести существующего симптома, расстройства, состояния или заболевания.
В настоящей заявке термин эффективное количество относится к количеству или дозе антитела согласно настоящему изобретению, которое при однократном или многократном введении пациенту обеспечивает желательное влияние на пациента, подвергаемого лечению. Эффективное количество может легко определить лечащий диагност, как специалист в данной области техники, путем рассмотрения ряда факторов, например вида млекопитающего; его размера, возраста и общего состояния здоровья; конкретного заболевания; степени или тяжести заболевания; реакции отдельного пациента; конкретного вводимого антитела; режима введения; характеристик биодоступности вводимого препарата; выбранной схемы приема; и применения сопутствующих препаратов.
Следующий пример иллюстрирует настоящее изобретение. В то же время следует понимать, что данный пример изложен в порядке иллюстрации, а не ограничения, и что специалист в данной области техники может внести в них различные изменения.
Пример.
Продукция антител.
Антитело I согласно настоящему примеру содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, причем каждая тяжелая цепь обладает аминокислотной последовательностью, заданной SEQ ID NO: 9), а каждая легкая цепь обладает аминокислотной последовательностью, заданной SEQ ID NO: 10. Антитело I можно получать и очищать следующим образом. Соответствующую клетку-хозяин, например HEK 293 или СНО, временно или стабильно трансфицировали системой экспрессии для секреции антител с использованием оптимального заранее заданного соотношения векторов HC:LC или единой векторной системой, кодирующей как тяжёлую (SEQ ID NO: 9), так и легкую цепь (SEQ ID NO: 10). Просветленную среду, в которую секретировалось антитело, очищали с помощью любой из многочисленных широко используемых методик. Например, среду можно общепринятым образом нанести на колонку с белком А или G, уравновешенную совместимым буфером, например физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7,4). Колонку промывали для удаления неспецифически связавшихся компонентов. Связанное антитело элюировали, например, с помощью градиента рН (например, 0,1М натрий-фосфатный буфер рН 6,8 0,1 М натрий-цитратный буфер рН 2,5). Фракции антитела нейтрализовали (например,путем добавления 1/10 объема 1М трис, рН 8,0), обнаруживали, например, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и затем объединяли. Дальнейшая очистка являлась необязательной и зависела от предполагаемого применения. Антитело можно концентрировать и/или стерильно фильтровать с помощью распространенных методик. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалить с помощью распространенных методик, включая эксклюзионную, гидрофобную, ионообменную хроматографию или хроматографию на гидроксиапатите. Чистота антитела после указанных хроматографических этапов составила более 99%. Продукт можно немедленно заморозить при -70°С или лиофилизировать.
Измерение сродства связывания с помощью поверхностного плазменного резонанса (BIAcore).
Сродство антитела (KD) к ИЛ-23 человека, яванского макака или кролика определяли с помощью биосенсора BIAcore Biosensor 2000 и программного обеспечения BIAevaluation при использовании модели связывания 1:1 с массообменом. Захватывающий белок (белок A, Calbiochem) присоединяли через свободные аминогруппы к карбоксильным группам проточных ячеек 1 и 2 чипа биосенсора СМ4, используя смесь Аэтил-Н-(диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS). Мониторинг проточных ячеек осуществляли при скорости потока 80 мкл/мин, используя буфер, содержащий 0,01М HEPES, рН 7,4, 150 мм NaCl, 0,005% сурфактанта Р20. Антитело I иммобилизовали на проточной ячейке 2, получая в общей сложности 40-60 единиц ответа (РЕ). Затем вводили несколько циклов
- 9 031524
ИЛ-23 с повышающейся концентрацией через проточные ячейки 1 и 2 (0,62-30 нМ для ИЛ-23 человека и обезьяны и 30-240 нМ для ИЛ-23 кролика) с последующим этапом регенерации с использованием глицин-HCl (рН 1,5) после каждого цикла. Проточную ячейку 1 использовали в качестве контроля для мониторинга неспецифического связывания ИЛ-23; данные представляли собой показания проточной ячейки 2 за вычетом показаний проточной ячейки 1. Каждый цикл включал этап иммобилизации антитела с последующей инъекцией ИЛ-23 в одной концентрации с 30-минутным периодом диссоциации, а затем регенерацию. Два цикла с введением буфера вместо ИЛ-23 использовали в качестве контроля для вычитания фонового сигнала и коррекции дрейфа, связанного с диссоциацией антитела I с поверхности белка А. Сродство измеряли при 37°С. Анализ выполняли 2 раза с ИЛ-23 человека, обезьяны или кролика. Антитело I анализировали по 2 раза с использованием ИЛ-23 мыши в концентрации 333 нМ, ИЛ-23 крысы в концентрации 200 нМ, ИЛ-12 человека в концентрации 333 нМ, Ил-27 человека в концентрации 500 нМ или ИЛ-35 человека в концентрации 833 нМ.
Скорость ассоциации (kon) и диссоциации (koff) для каждого антигена оценивали с использованием модели связывания 1:1 с массообменом. Сродство (KD) рассчитывали на основании кинетики связывания согласно отношению: KD = koff/kon.
Таблица 2
Параметры связывания для антитела I
Антиген | Скорость ассоциации (А'ш;) (среднее ± СО) (М 'с ') (106) | Скорость диссоциации (среднее ± СО) (с’1) (КГ4) | Сродство (KD“) (среднее ± СО) (нМ) |
ИЛ-12 | Детектируемое | Детектируемое | Детектируемое |
человека | связывание | связывание | связывание |
отсутствует | отсутствует | отсутствует | |
ИЛ-23 человека | 2,43 ±0,16 | 0,52 ±0,21 | 21 ±9,9 |
ИЛ-27 | Детектируемое | Детектируемое | Детектируемое |
человека | связывание | связывание | связывание |
отсутствует | отсутствует | отсутствует | |
ИЛ-35 | Детектируемое | Детектируемое | Детектируемое |
человека | связывание | связывание | связывание |
отсутствует | отсутствует | отсутствует | |
ИЛ-23 обезьяны | 1,28 ±0,05 | 0,7 ±0,И | 55 ±6,4 |
ИЛ-23 кролика | 0,09 + 0,001 | 47,9 ± 0,4 | 53000±1131 |
ИЛ-23 | Детектируемое | Детектируемое | Детектируемое |
мыши | связывание | связывание | связывание |
- 10 031524
отсутствует | отсутствует | отсутствует | |
ИЛ-23 крысы | Детектируемое связывание отсутствует | Детектируемое связывание отсутствует | Детектируемое связывание отсутствует |
а Рассчитано как KD = код/коп | |||
η = 2 для каждого антигена. ИЛ-12 анализировали в концентрации, 400-кратно превышающей детектируемую концентрацию для ИЛ-23. ИЛ-27 и ИЛ-35 анализировали в концентрации, 800-кратно превышающей детектируемую концентрацию для ИЛ-23. ИЛ-23 мыши и крысы анализировали в концентрациях, 500- и 300-кратно превышающей детектируемую концентрацию для ИЛ-23. |
С помощью данного способа антитело I продуцировало ответ в зависимости от концентрации при использовании ИЛ-23 человека, яванского макака и кролика. Насыщение связывания ИЛ-23 достигалось при концентрации 30 нМ (человека и обезьяны) и 240 нМ (кролика) и 80-100 единицах ответа антитела I, иммобилизованного на поверхности чипа. В условиях анализа сродство (KD) ИЛ-23 человека, обезьяны или кролика к антителу I составило 21, 55 или 53000 пМ соответственно (табл. 1). ИЛ-23 мыши, ИЛ-23 крысы, ИЛ-12 человека, ИЛ-27 человека или ИЛ-35 человека не связывали антитело I при указанных условиях.
Ингибирование связывания ИЛ-23 с рецептором ИЛ-23 in vitro.
Рекомбинантный HH-23R/Fc человека присоединяли через свободные аминогруппы к карбоксильным группам проточной ячейки 2 чипа биосенсора СМ4, используя смесь К-этил-N(диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS). Рекомбинантный Fc IgGi человека (R&D Systems, Inc.) иммобилизовали с использованием аналогичного способа на проточной ячейке 1 этого же чипа. Антитело мыши против бХ HIS (R&D Systems, Inc.) иммобилизовали с использованием аналогичного способа на проточной ячейке 4 этого же чипа. Антитело мыши против бХ HIS использовали для предварительного захвата ИЛ 12Rβ1/Fc человека (R&D Systems, Inc.), содержащего метку HIS. Мониторинг проточных ячеек осуществляли при скорости потока 30 мкл/мин, используя буфер, содержащий 0,01М HEPES, рН 7,4, 150 мм NaCl, 0,005% сурфактанта Р20. Рекомбинантный ИЛ-23 человека предварительно инкубировали в течение 90 мин с добавлением 1б-кратного молярного избытка антитела I или без него. Каждую комбинацию вводили в проточные ячейки 1, 2 и 4 в общем объеме 150 мкл с последующим этапом регенерации с использованием глицин-HCl (рН 1,5) после каждого анализа. Проточную ячейку 1 использовали в качестве контроля для мониторинга неспецифического связывания ИЛ23 с чипом. Программное обеспечение BIAevaluation использовали для подготовки слоев отдельных сенсограмм связывания.
Антитело I нейтрализовало ИЛ-23 человека в ходе функциональных анализов in vitro. Кроме того, антитело I предотвращало связывание ИЛ-23 с HJI-23R/Fc. Данные в табл. 3 показывают, что (A) ИЛ-23 связывается с HJI-23R/Fci (B) комплекс антитело ЕИЛ-23 не связывается с HH-23R/Fc;
(C) ИЛ-23 связывается с ИЛ-12Rβ1/Fc и (D) комплекс антитело ЕИЛ-23 связывается с ИЛ-23Rβ1/Fc.
Таблица 3
Влияние антитела I на связывание ИЛ-23 с HJI-23R
Цитокин | Антитело | Связывание с ИЛ- | Связывание с ИЛ- |
23R | 12Rfil | ||
ИЛ-23 | Отсутствует | ДА | ДА |
ИЛ-23 | I | НЕТ | ДА |
Таким образом, антитело I нейтрализует ИЛ-23, поскольку оно ингибирует связывание ИЛ-23 с субъединицей HJI-23R. Кроме того, антитело I не ингибирует связывание ИЛ-23 с субъединицей ИЛ12RP1.
Нейтрализация ИЛ-23 человека или яванского макака in vitro антителом I в спленоцитах мыши.
Для оценки антитела I использовали концентрацию ИЛ-23 человека или яванского макака, обеспечивающую приблизительно 50% максимальной продукции ИЛ-17 (1б пМ). Оценивали ответ в зависимости от диапазона доз антитела I от 800000 до 4 пМ. Антитело I или контрольное антитело IgG4 объединяли с ИЛ-23 человека или яванского макака в отдельной лунке в течение 90 мин при 37°С перед добавлением к клеткам (прединкубационная смесь).
Спленоциты мышей C57BL/6, стимулированные ИЛ-23 и ИЛ-2, продуцировали ИЛ-17 (Aggarwal, S.
- 11 031524 et al., Interleukin-23 Promotes a Distinct CD4 T Cell Activation State Characterized by the Production of Interleukin-17, Journal of Biological Chemistry, 278 (3): 1910-1914, 2003). Спленоциты мыши ресуспендировали в концентрации 5x10 лейкоцитов/мл в среде для анализа (RPMI1640 с L-глутамином, содержащей 10% FBS, 1% неосновных аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,00035% 2-меркаптоэтанола, 50 нг/мл ИЛ-2 человека) и распределяли по 100 мкл на лунку в 96-луночные планшеты для культивирования. Прединкубационную смесь антитело ЙИЛ-23 распределяли по 100 мкл на лунку и инкубировали при 37°С и 5% CO2. Сорок восемь часов спустя анализировали мИЛ-17 в надосадочной культуральной жидкости с использованием коммерческого набора для твердофазного ИФА от R&D Systems (DY421) согласно инструкции к набору в двух повторностях для каждого разведения. IC50 определяли путем аппроксимации данных 4-параметрической кривой.
Спленоциты мыши продуцировали ИЛ-17 в ответ на ИЛ-23 человека или яванского макака. Антитело I нейтрализовало ИЛ-23 человека или яванского макака. Рассчитанная IC50 составила 82±11 пМ для ИЛ-23 человека и 120±14 пМ для ИЛ-23 яванского макака, при n=2 для каждого из них (табл. 4). Эти результаты продемонстрировали, что антитело I способно нейтрализовать ИЛ-23 человека или яванского макака in vitro.
Таблица 4
IC50 в анализе нейтрализации ИЛ-23 человека и яванского макака in vitro
Вид | № анализа | Антитело | 1С50 (нМ) |
Человека | 1 | I | 90 |
Человека | 2 | I | 74 |
Человека | Среднее значение | 82 (11) | |
(СО) | |||
Яванского | 3 | I | по |
макака | |||
Яванского | 4 | I | 130 |
макака | |||
Яванского | Среднее значение | 120 (14) | |
макака | (СО) |
Нейтрализация ИЛ-23 человека: острая, местная.
Животных (C57BL/шесть восьминедельных самок от Jackson Labs) содержали (не менее 72 ч после прибытия) и кормили обычным образом до эксперимента и в течение всего исследования. Со спины мышей удаляли шерсть электрической машинкой для стрижки, и через 3 дня мыши (n=10 на группу) получали подкожную инъекцию антитела I или контрольного антитела изотипа IgG4 (0,54 мг/мышь). В следующие 2 дня мышам интрадермально вводили ИЛ-23 человека в одну область с одной стороны спины (1 мкг в объеме 50 мкл, разбавленные стерильным физиологическим раствором) с помощью иглы 29-го калибра. Стерильный физиологический раствор вводили в качестве контрольного носителя с другой стороны спины. Мышей умерщвляли через 24 ч после последнего введения ИЛ-23 человека, образцы кожи удаляли со стороны введения ИЛ-23-и со стороны введения стерильного физиологического раствора, оставляя по меньшей мере 5 мм от границы шерсти. Образцы кожи замораживали непосредственно в жидком азоте для исследования мРНК.
Общую РНК выделяли из замороженной ткани кожи путем гомогенизации в пробирках для шейкера с лизирующим матриксом Lysing Matrix A (Qbiogene Inc./Bio101 Systems) с последующей очисткой с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen, Inc.). Концентрацию РНК определяли по спектрофотометрическому поглощению при 260 нм. РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (РЕ Applied Biosystems). Bee реакции выполняли в трех повторностях на ABI Prism 7900HT (РЕ Applied Biosystems) с целью определения относительной распространенности анализируемой мРНК. Наборы праймеров и зондов для ИЛ17А мыши (Mm00439618_m1), ИЛ-171-’ мыши (Mm00521423_m1) и кератина-16 мыши (Mm00492979_g1) получили из РЕ Applied Biosystems. 18S и GAPD измеряли в качестве внутреннего контроля для нормирования изменчивости уровня экспрессии генов. Данные об экспрессии анализировали, используя способ дельта (Δ-Δ) Ct. Отдельные значения Ct рассчитывали как среднее по трем повторным измерениям. Эксперименты выполняли дважды. При необходимости использовали критерий Стъюдента для независимых выборок. Р <0,05 считали статистически значимым.
Для исследования способности антитела I при системном введении нейтрализовать местный ответ на ИЛ-23 человека белок ИЛ-23 человека интрадермально вводили мышам с целью изучения последствий кожного воздействия ИЛ-23. В коже мышей дикого типа, ежедневно получавших физиологический
- 12 031524 раствор, не наблюдали детектируемого уровня ИЛ-17А или ИЛ-17Б мыши.
В то же время инъекции ИЛ-23 человека индуцировали экспрессию мРНК ИЛ-17А и ИЛ-17Б мыши (табл. 5). Обработка антителом I, но не изотипическим контрольным антителом, прекращала экспрессию мРНК ИЛ-17А и ИЛ-17Б, индуцированную ИЛ-23 человека.
Таблица 5 Нейтрализация in vivo экспрессии мРНК ИЛ-17А и ИЛ-17Б мыши, индуцированной ИЛ-23 человека Значения Ct
ФСБ ИЛ-23
Изотипический контроль
Антитело I
ИЛ-17А | ИЛ-17Б | ИЛ-17А | HJI-17F |
>40 | >40 | 35,4 | 31,6 |
>40 | >40 | >40 | >40 |
Кроме того, инъекция ИЛ-23 человека вызывала утолщение эпидермиса, связанное с повышенной экспрессией кератина-16, цитокератина, связанного с пролиферацией. Индукция кератина-16 существенно ингибировалась за счет введения антитела I (кратная индукция кератина-16 мыши составляла 5,21±2,72 для изотипического контрольного антитела по сравнению с 1,23±0,72 для антитела I; p = 0,0003).
Совместно эти результаты показывают, что антитело I эффективно ингибировало продукцию мРНК ИЛ-17А, ИЛ-17Б и кератина-16 мыши, индуцированную ИЛ-23 человека, в остром местном анализе in vivo.
Перекрестная реакционная способность ткани сетчатки: иммуногистохимический анализ in vitro.
Срезы свежезамороженной ткани сетчатки человека и яванского макака (5-7 мкм толщиной) нарезали на криостате. Срезы фиксировали в ацетоне в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, высушивали в течение ночи при комнатной температуре и хранили приблизительно при -80°С до использования. Препараты, фиксированные ацетоном, удаляли из морозильной камеры и высушивали в течение ночи при комнатной температуре. Следующие этапы выполняли при комнатной температуре. Препараты инкубировали в 1X Morphosave™ в течение приблизительно 15 мин с целью сохранения морфологии. Препараты промывали в течение 10 мин в 1X ФСБ и затем инкубировали в 0,3% Н2О2 в 1X ФСБ при комнатной температуре в течение приблизительно 20 мин с целью подавления активности эндогенной пероксидазы. После инкубирования препараты дважды промывали в течение приблизительно 5 мин в 1X ФСБ. Эндогенный биотин блокировали последовательным инкубированием (приблизительно по 15 мин) в растворах авидина и биотина. После инкубирования в биотине тканевые срезы блокировали блокирующим раствором антитела в течение 30 мин. Антитело I или контрольный IgG4 человека наносили на срезы в оптимальных концентрациях (2,5 или 5 мкг/мл) или в концентрации, пятикратно превышающей оптимальную (25 мкг/мл), и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем препараты промывали и инкубировали с биотинилированным анителом мыши против IgG4 человека (2,5 мкг/мл) в течение 30 мин. Связавшиеся комплексы первичного/вторичного антитела обнаруживали с использованием конъюгата стрептавидин-биотин-пероксидаза хрена и хромогенного диаминобензидинового субстрата.
Клетки СНО, трансфицированные ИЛ-23 человека, использовали в качестве положительного контроля в всех экспериментах. Исходные (не трансфицированные) клетки СНО использовали в качестве отрицательного контроля и не окрашивались. На последовательных срезах, окрашенных изотипическим контрольным антителом (IgG4 человека), связывания не наблюдали. Антитело I не связывало ткань сетчатки в заметной степени.
Картирование эпитопов для антитела I: сканирование аланином.
Основы для картирования эпитопов с использованием дрожжевого дисплея антигена.
Исследования по картированию эпитопов выполняли с целью определения конкретных аминокислот в субъединице р19 ИЛ-23 человека (SEQ ID NO: 15), необходимых для связывания антитела I. Картирование эпитопов антитела I выполняли путем сканирования аланином в сочетании с платформой дрожжевого дисплея.
Положения открытых аминокислот субъединицы р19 ИЛ-23 человека выявляли с помощью анализа в PyMOL. Открытые или частично открытые положения субъединицы р19 ИЛ-23 приведены в табл. 6. Выявленные закрытые положения исключили из данного исследования, т. е. мутировали только те аминокислотные положения субъединицы р19 ИЛ-23 человека, которые являлись открытыми или частично открытыми. Соответственно, исследовали не все положения.
Несмотря на то, что картирование эпитопов выполняли только в субъединице р19 ИЛ-23 (картирование эпитопов не выполняли в субъединице р40 ИЛ-23, поскольку антитело I не связывалось с субъединицей р40 в детектируемой степени), субъединицы р19 и р40 ИЛ-23 человека должны совместно экспрессироваться в платформе дрожжевого дисплея.
Конструировали одиночные аланиновые мутанты субъединицы р19 ИЛ-23 человека на платформе
- 13 031524 дрожжевого дисплея и определяли связывание с антителом с целью выявления эпитопа. Измеряя аффинность мутантных антител по сравнению с антигеном дикого типа на платформе дрожжевого дисплея, можно определить энергетический вклад боковой цепи аминокислоты в связывание антитела.
Конструирование библиотеки мутантов.
Ген р40 клонировали в плазмиде pYKY для экспрессии растворимых форм, несущей селективный маркер урацила. Ген субъединицы р19 клонировали в плазмиде для дрожжевого дисплея pEMD3, содержащей селективный маркер триптофана и маркер V5 на N-конце и якорный белок GPDL2 на С-конце, что обеспечивало дисплей на поверхности дрожжевых клеток под контролем селективного маркера триптофана. Сайты рестрикции, используемые для клонирования, представляли собой XhoI и BamHI в плазмиде pYKY и AvrII и XmaI в плазмиде pEMD3 соответственно.
Аланиновые мутации внедряли в каждое открытое положение и проверяли на двойное положительное окрашивание антителом против V5 и антителом I. Панели аланиновых мутантов р19 конструировали в плазмидах pEMD3 с помощью сайт-специфического мутагенеза (мутагенеза Kunkel). Вкратце, урацилсодержащую оцДНК вектора pEMD3 продуцировали после трансформации в CJ236 (New England Biolabs). Одиночную колонию после трансформации выращивали в течение ночи, оцДНК спасали после инфекции с фагом-помощником M13K07 (New England Biolabs) и очищали с использованием набора QIAprep spin M13. Олигонуклеотиды, кодирующие аланиновые мутации, отжигали при молярном соотношении 20:1 с урацилсодержащей матрицей денатурацией при 85°С в течение 5 мин, линейным изменением температуры до 55°С в течение 1 ч, выдерживанием при 55°С в течение 5 мин, затем охлаждением на льду. Затем выполняли синтез второй цепи с участием полимеразы Т4, лигазы Т4 и дНТФ (Invitrogen). Реакционную смесь подвергали электропорации в Top10 E.coli (Invitrogen), отбирали одиночные колонии, выделяли дцДНК с использованием набора the QIAprep miniprep kit (Qiagen) и подтверждали наличие мутации секвенированием. Затем мутантную р19 совместно трансформировали в дрожжевые клетки BJ5464 (АТСС) с плазмидой pYKY, содержащей р40, и выращивали в полной минимальной среде без триптофана и урацила.
Отбор потери связывания с антигеном из библиотеки мутантных антигенов.
Для выявления эпитопа антитела выполняли отбор в библиотеке мутантных антигенов на потерю способности связывания с антителом проточной цитометрией. Дрожжевые клетки окрашивали двумя антителами, одно из которых подвергали картированию, а другое - нет. Среди мутантных антигенов, подвергаемых дрожжевому дисплею, выполняли отбор на потерю способности к связыванию с первым антителом при сохранении связывания со вторым антителом. Сохранение связывания со вторым антителом гарантировало, что отбор мутантов производили на основе мутаций эпитопа, а не ошибок фолдинга или дефектов дисплея.
Для настоящего анализа первым антителом (т.е. антителом, эпитоп которого подвергали картированию) являлось антитело I, а вторым антителом являлось антитело против V5. Дрожжи вначале окрашивали антителом против V5 (Invitrogen) и антителом I, а затем - вторичным антителом козы против IgG2a мыши (Invitrogen, Alexa Fluor® 647) для обнаружения антитела против V5 (экспрессия/дисплей) и антителом козы против κ-RPE человека (Southern Biotech) для обнаружения антитела I. Дрожжи анализировали проточной цитометрией на Becton Dickinson LSRII, где зарегистрировали 50000 событий на основе гейтирования клеток по светорассеянию, окрашиванию V5/Alexa647 и антитело I/PE. Анализ данных связывания с антителом I и антителом против V5 осуществляли с помощью программного обеспечения FACSDiva версии 6.1.2, вычислявшего процент дрожжевых клеток с двойным окрашиванием.
Результаты.
Из-за распределения белка при дисплее в лучшем случае 50% дрожжей осуществляли дисплей р19 ИЛ-23. Обнаружение двойных положительных дрожжевых клеток демонстрировало, что исследуемое положение аминокислоты не влияет на связывание антитела I с ИЛ-23. Обнаружение только окрашивания V5 демонстрировало, что белок экспрессируется и подвергается дисплею на поверхности дрожжевых клеток и что исследуемое положение аминокислоты имеет важное значение для связывания антитела I. Установлено, что остатки, демонстрировавшие >50% снижение двойного положительного окрашивания по сравнению с соседними остатками, были важны для связывания. Указанные остатки выделены в табл. 7. Некоторые положения демонстрировали отсутствие связывания как V5, так и антитела I, что указывало на возможную необходимость данного аминокислотного остатка для образования конформации белка. Систематическое исследование каждого открытого или частично открытого положения аминокислоты в субъединице р19 ИЛ-23 (SEQ ID NO: 15) продемонстрировало, что положения 94Р, 95S, 97L, 98Р, 99D, 123W, 130S, 133Р и 137W имеют важное значение для связывания антитела I с ИЛ-23 человека на основании количественного снижения двойного положительного окрашивания за счет связывания V5 и антитела I (табл. 7).
Картирование эпитопов также выполняли с помощью водород-дейтериевого обмена. Результаты картирования эпитопов с помощью водород-дейтериевого обмена проиллюстрировали, что эпитоп антитела I является конформационным эпитопом, расположенным в области остатков 81-99 и 115-140 ИЛ-23 человека (SEQ ID NO: 15).
- 14 031524
Таблица 6
Открытая или частично открытая аминокислотная последовательность субъединицы р19 зрелого ИЛ-23 человека
I оложение
Аминокислота
Открытая/частично открытая
Положение
Аминокислота
Открытая/частично открытая
Положение
Аминокислота
Открытая/частично открытая
I юложение
Аминокислота
Открытая/частично открытая
Положение
Аминокислота
Открытая/частично открытая
I юложение
Аминокислота
Открытая/частично открытая
I юложение
Аминокислота
Открытая/частично открытая
Положение
Аминокислота
Открытая/частично открытая
I юложение
Аминокислота
Открытая/частично открытая
Положение
Аминокислота
Открытая/частично
- 15 031524
открытая | ||||||||||
Положение | 101 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 | по |
Аминокислота | Р | V | G | Q | L | н | А | S | L | L |
Открытая/частично | X | X | X | X | X | X | ||||
открытая | ||||||||||
Положение | 111 | 112 | 113 | 114 | 115 | 116 | 117 | 118 | 119 | 120 |
Аминокислота | G | L | S | Q | L | L | Q | Р | Е | G |
Открытая/частично | X | X | X | X | X | X | ||||
открытая | ||||||||||
Положение | 121 | 122 | 123 | 124 | 125 | 126 | 127 | 128 | 129 | 130 |
Аминокислота | Н | Н | W | Е | Т | Q | Q | I | Р | S |
Открытая/частично | X | X | X | X | X | X | X | X | X | |
открытая | ||||||||||
Положение | 131 | 132 | 133 | 134 | 135 | 136 | 137 | 138 | 139 | 140 |
Аминокислота | L | S | Р | S | Q | Р | W | Q | R | L |
Открытая/частично | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
открытая | ||||||||||
Положение | 141 | 142 | 143 | 144 | 145 | 146 | 147 | 148 | 149 | 150 |
Аминокислота | L | L | R | F | К | I | L | R | S | L |
Открытая/частично | X | X | X | X | X | X | ||||
открытая | ||||||||||
Положение | 151 | 152 | 153 | 154 | 155 | 156 | 157 | 158 | 159 | 160 |
Аминокислота | Q | А | F | V | А | V | А | А | R | V |
Открытая/частично | X | X | X | X | ||||||
открытая | ||||||||||
Положение | 161 | 162 | 163 | 164 | 165 | 166 | 167 | 168 | 169 | 170 |
Аминокислота | F | А | н | G | А | А | Т | L | S | Р |
Открытая/частично | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
открытая |
- 16 031524
Таблица 7
Данные картирования эпитопа для антитела I
Физико-химические свойства антитела против ИЛ-23
Антитело I обладает фармацевтически приемлемой растворимостью, химической стабильностью и физической стабильностью.
А. Растворимость.
Для удобства приема желательна достаточно высокая растворимость. Например, доза 1 мг/кг при введении посредством 1,0-мл инъекции пациенту весом 100 кг требует растворимости, равной 100 мг/мл. Кроме того, желательно сохранение антитела в мономерном состоянии без образования высокомолекулярных (ВМ) агрегатов при высокой концентрации.
Состав антитела I получали в концентрации приблизительно 1 мг/мл в буфере, аналогичном физиологическому раствору (ФСБ, рН 7,4) и при двух условиях получения состава лекарственного вещества (10 мМ цитрата, рН 6, плюс и минус 150 мМ NaCl). Антитело центрифугировали при 2000 g через фильтр Amicon Ultra для соединений с максимальной молекулярной массой 30 кДа (Millipore, UFC803204) с целью концентрирования антитела при сохранении аналогичного буфера. Центрифугирование продолжали до предела растворимости или достижения минимального перепускного объема устройства. При всех трех условиях достигалась растворимость более 100 мг/мл.
- 17 031524
Эксклюзионную хроматографию (SEC) использовали для оценки увеличения доли высокомолекулярных (ВМ) полимеров после концентрирования состава антитела до более чем 100 мг/мл. Исходный раствор антитела и концентрированный раствор антитела вводили в колонку TSK3000 SWXL (TOSOH Bioscience) с использованием подвижной фазы, состоящей из 12 мМ фосфата, 500 мМ NaCl, рН 7,4. Значительного увеличения доли растворимого полимера не наблюдали при всех протестированных условиях получения состава (<0,6% ВМ-полимера согласно SEC).
B. Химическая стабильность.
Состав антитела I получали в концентрации 1 мг/мл в 10 мМ буфере (10 мМ цитрата для рН 4, 5, 6 и 7; 10 мМ трис для рН 8) и инкубировали в течение 4 недель при 4, 25 или 40°С. Химическую стабильность контролировали с помощью SEC (см. вышеописанный способ), катионообменной хроматографии [СЕХ; Dionex, с использованием градиента между буфером А (20 мМ фосфат натрия, рН 5,8, 0,36% CHAPS) и буфера В (20 мМ фосфат натрия, рН 5,8, 0,36% CHAPS, 200 мМ хлорид натрия)], CE-SDS (Agilent Bioanalyzer с белковым чипом 230 при восстановительных условиях) и оценки характеристик материала посредством ЖХ-МС после ферментативного гидролиза.
Антитело I устойчиво против образования полимера (SEC) в диапазоне рН 5-8 даже после 4 недель при температуре 40°С. При рН 4 значительное содержание полимера наблюдается при температуре 40°С, но не при 25°С (4 нед.). Ожидаемый гидролиз или отщепление пептидных связей очевиден при рН 4 (40°С) согласно CE-SDS. Уровень разложения при рН 4,0 является типичным для антител IgG4. Уровень при рН выше 4 (рН 5-8) является низким и не подвергается постоянному изменению с течением времени и, таким образом, вероятно, представляет собой фоновый шум.
Эта гипотеза согласуется с ЖХ-МС-анализом, при котором не обнаружено отщепления при рН 6, в то время как при рН 4 измерялся типичный для антител уровень отщепления. Изменения заряженных молекул контролировали с помощью СЕХ. Исходный материал содержал три значимых основных пика, что минимизировало разрешающую способность данного анализа. В целом, уровень разложения в образцах, подвергавшихся стрессу при 25 и 40°С, был выше, чем в контрольных образцах при 4°С, однако указанный уровень не увеличивался со временем инкубирования (фактически снижался во многих случаях). Процентное изменение при рН 6,0 (4 нед. при 25°С за вычетом контроля при 4°С) составило 2,5%. ЖХМС-анализ показал, что большинство модификаций расположены вне области CDR и на уровнях, типичных для других IgG/i-антител. Выявлено менее чем 1% изменение трех сайтов разложения в пределах CDR (рН 6; 4 нед. при 25°С за вычетом контроля при 4°С). Отсутствие сайтов разложения в пределах CDR также согласуется отсутствием существенных изменений сродства или стехиометрии согласно BIACore после четырех недель инкубации при температуре 40°С при рН 4, 6 или 8.
C. Физическая стабильность.
i) Устойчивость к замораживанию-размораживанию.
Состав антитела I получали при следующих условиях:
a) 1 мг/мл в 10 мМ цитрате, рН 6,0*;
b) 1 мг/мл в 10 мМ цитрате, рН 6,0, 0,02% Твин-80;
c) 1 или 50 мг/мл в 10 мМ цитрате, рН 6,0, 150 мМ NaCl;
d) 1 или 50 мг/мл в 10 мМ цитрате, рН 6,0, 150 мМ NaCl, 0,02% Твин-80.
Эти составы помещали в контейнер с контролируемым замораживанием со скоростью 1°С/мин (Nalgene, 5100-0001) и замораживали в морозильной камере при -80°С в течение по меньшей мере 8 ч, а затем извлекали и размораживали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 8 ч. Этот цикл замораживания/размораживания повторяли до трех раз. Образцы извлекали после одного и трех циклов замораживания-размораживания и анализировали на содержание ВМ-полимера посредством SEC (см. методику SEC, описанную выше в части А) и образование нерастворимых частиц с помощью счетчика частиц HIAC (Pacific Scientific, модель 9703 с низким объемом вложения). Существенного увеличения образования ВМ-полимера не наблюдали после трех циклов замораживания-размораживания при любых протестированных условиях. Для составов с концентрацией 1 мг/мл значительное увеличение количества частиц при измерении на HIAC наблюдали только в составах, не содержавших Твин-80. При концентрации 50 мг/мл количество частиц было характерным для других хорошо изученных IgG/i-антител и составляло (>10 мкм) приблизительно 1500 шт./мл без Твин-80 и снижалось до приблизительно 280 с Твин80.
ii) Удержание электростатического заряда при высокой концентрации.
Состав антитела I получали в концентрации 50 мг/мл при следующих условиях:
a) 10 мМ цитрат, рН 6,0, 150 мМ NaCl и
b) 10 мМ цитрат, рН 6,0, 150 мМ NaCl, 0,02% Твин-80.
Эти составы удерживали электростатический заряд в течение 4 недель при 4 и 25°С. Изменение количества частиц при измерении на HIAC (Pacific Scientific, модель 9703 с низким объемом вложения) измеряли через 4 недели при 25°С.
Количество частиц при измерении на HIAC (>10 мкм) для Твин-содержащего состава было равно в среднем 290 шт./мл (270 и 310) и было умеренно повышенным, составляя 804 шт./мл (728 и 880) для со
- 18 031524 става без твина. Эти результаты являются типичными для других IgG4-антител, которые демонстрируют хорошую физическую стабильность. Эти два состава также хранили в стеклянной посуде вместо стандартных пластиковых пробирок Eppendorf Количество частиц для образцов, хранящихся в стеклянной посуде, было в 4-8 раз ниже (в среднем 35 и 191 шт./мл, соответственно, для состава с твином и без него).
Список SEQ ID
CDR тяжелой цепи
SEQ ID N0:1 | GYKFTRYVMH |
SEQ ID N0:2 | YINPYNDGTNYNEKFKG |
SEQ ID N0:3 | ARNWDTGL |
CDR легкой цепи
SEQ ID N0:4
SEQ ID N0:5
KASDHILKFLT
GATSLET
SEQ ID N0:6
QMYWSTPFT
Вариабельные области тяжелой цепи
SEQ ID N0:7 (антитело I)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTRYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYN
DGTNYNEKFKGRVTITADKSTS TAYMELS SLRSEDTAVYYC ARNWDTGLWGQGTTVT
VSS
Вариабельные области легкой цепи
SEQ ID N0:8 (антитело I)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHILKFLTWYQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQMYWSTPFTFGGGTKVEIK
Полная последовательность тяжелой цепи
SEQ ID N0:9 (антитело I)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTRYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYN DGTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNWDTGLWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKIYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
- 19 031524
Полная последовательность легкой цепи
SEQ ID N0:10 (антитело I)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHILKFLTWYQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQMYWSTPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Нуклеотидные последовательности
Вариабельная область тяжелой цепи
SEQ ID NO: 11 (антитело I)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA AGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATATAAATTCACTCGTTATGTTATGCACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATATATTAATCCTTACAATGAT GGT АС Т А АС Т AC A ATGAGA AGTTC A AAGGC AGAGTC AC GATT АС С GC GGAC А А. АТ CCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGT GTATTACTGTGCGAGAAACTGGGACACAGGCCTCTGGGGCCAAGGCACCACTGTC ACAGTCTCCTCA
Нуклеотидные последовательности
Вариабельные области легкой цепи
SEQ ID N0:12 (антитело I)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCAAGGCAAGTGACCACATTCTCAAATTTTTAACTTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAACCAGTTTGGAAAC TGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCA TCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAAATGTATTGGAGT ACTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGGTGGAAATAAAA
Нуклеотидная последовательность
Полная последовательность тяжелой цепи
SEQ ID N0:13 (антитело I)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA AGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATATAAATTCACTCGTTATGTTATGCACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATATATTAATCCTTACAATGAT
- 20 031524
GGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAAT
CCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGT GTATTACTGTGCGAGAAACTGGGACACAGGCCTCTGGGGCCAAGGCACCACTGTC ACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTC CAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACA CCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCC ACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAA AACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGG AGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGG AGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG GCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT
Нуклеотидная последовательность
Полная последовательность легкой цепи
SEQ ID N0:14 (антитело I)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCAAGGCAAGTGACCACATTCTCAAATTTTTAACTTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAACCAGTTTGGAAAC TGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCA TCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAAATGTATTGGAGT ACTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGGTGGAAATAAAACGAACTGTGGCTG CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACA
- 21 031524
GCAAGGAC
AGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAAC ACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC
Белковые последовательности
Аминокислотная последовательность субъединицы р!9 зрелого ИЛ-23 человека
SEQ ID N0:15
RAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDG CDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQ PEGHHWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110>
ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ <120>
АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ ИЛ-23 <130>
X19760 <150>
<151>
61/774732
2013-03-08 <160>
<170>
PatentIn version 3.5 <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Artificial Sequence <220>
<223>
synthetic construct <400>
Gly Tyr Lys Phe Thr Arg Tyr Val 1
Met
His <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Artificial Sequence <220>
<223>
synthetic construct <400>
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly
5
Thr
Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
15
Gly
- 22 031524 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400>3
Ala Arg Asn Trp Asp Thr Gly Leu <210>4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400>4
Lys Ala Ser Asp His Ile Leu Lys Phe Leu Thr
510 <210>5 <211>7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400>5
Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr <210> 6 <211>9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400> 6
Gln Met Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr
5
<210> <211> <212> <213> | 7 115 PRT Artificial Sequence |
- 23 031524
<220> <223> | synthetic construct |
<400> | 7 |
Gln Val 1 | Gln Leu Val 5 | Gln Ser | Gly Ala | Glu Val 10 | Lys | Lys | Pro | Gly 15 | Ser | ||||||
Ser | Val | Lys | Val | Ser | Cys | Lys | Ala | Ser | Gly | Tyr | Lys | Phe | Thr | Arg | Tyr |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Val | Met | His | Trp | Val | Arg | Gln | Ala | Pro | Gly | Gln | Gly | Leu | Glu | Trp | Met |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Tyr | Ile | Asn | Pro | Tyr | Asn | Asp | Gly | Thr | Asn | Tyr | Asn | Glu | Lys | Phe |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Lys | Gly | Arg | Val | Thr | Ile | Thr | Ala | Asp | Lys | Ser | Thr | Ser | Thr | Ala | Tyr |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Met | Glu | Leu | Ser | Ser | Leu | Arg | Ser | Glu | Asp | Thr | Ala | Val | Tyr | Tyr | Cys |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ala | Arg | Asn | Trp | Asp | Thr | Gly | Leu | Trp | Gly | Gln | Gly | Thr | Thr | Val | Thr |
100 | 105 | 110 |
Val Ser Ser
115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400> 8
Asp 1 | Ile | Gln | Met | Thr 5 | Gln | Ser | Pro | Ser | Ser 10 | Leu | Ser | Ala | Ser | Val 15 | Gly |
Asp | Arg | Val | Thr | Ile | Thr | Cys | Lys | Ala | Ser | Asp | His | Ile | Leu | Lys | Phe |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Leu | Thr | Trp | Tyr | Gln | Gln | Lys | Pro | Gly | Lys | Ala | Pro | Lys | Leu | Leu | Ile |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Tyr | Gly | Ala | Thr | Ser | Leu | Glu | Thr | Gly | Val | Pro | Ser | Arg | Phe | Ser | Gly |
50 | 55 | 60 |
- 24 031524
Ser 65 | Gly Ser | Gly | Thr Asp 70 | Phe | Thr Leu | Thr | Ile 75 | Ser | Ser | Leu | Gln | Pro 80 | |||
Glu | Asp | Phe | Ala | Thr | Tyr | Tyr | Cys | Gln | Met | Tyr | Trp | Ser | Thr | Pro | Phe |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Phe | Gly | Gly | Gly | Thr | Lys | Val | Glu | Ile | Lys | |||||
100 | 105 |
<210> 9 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400> 9
Gln 1 | Val | Gln Leu | Val 5 | Gln | Ser | Gly Ala | Glu 10 | Val | Lys | Lys | Pro | Gly 15 | Ser | ||
Ser | Val | Lys | Val | Ser | Cys | Lys | Ala | Ser | Gly | Tyr | Lys | Phe | Thr | Arg | Tyr |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Val | Met | His | Trp | Val | Arg | Gln | Ala | Pro | Gly | Gln | Gly | Leu | Glu | Trp | Met |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Tyr | Ile | Asn | Pro | Tyr | Asn | Asp | Gly | Thr | Asn | Tyr | Asn | Glu | Lys | Phe |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Lys | Gly | Arg | Val | Thr | Ile | Thr | Ala | Asp | Lys | Ser | Thr | Ser | Thr | Ala | Tyr |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Met | Glu | Leu | Ser | Ser | Leu | Arg | Ser | Glu | Asp | Thr | Ala | Val | Tyr | Tyr | Cys |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ala | Arg | Asn | Trp | Asp | Thr | Gly | Leu | Trp | Gly | Gln | Gly | Thr | Thr | Val | Thr |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Val | Ser | Ser | Ala | Ser | Thr | Lys | Gly | Pro | Ser | Val | Phe | Pro | Leu | Ala | Pro |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Cys | Ser | Arg | Ser | Thr | Ser | Glu | Ser | Thr | Ala | Ala | Leu | Gly | Cys | Leu | Val |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Lys | Asp | Tyr | Phe | Pro | Glu | Pro | Val | Thr | Val | Ser | Trp | Asn | Ser | Gly | Ala |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Leu | Thr | Ser | Gly | Val | His | Thr | Phe | Pro | Ala | Val | Leu | Gln | Ser | Ser | Gly |
- 25 031524
165
170
175
Leu | Tyr | Ser | Leu 180 | Ser | Ser | Val | Val | Thr 185 | Val | Pro | Ser | Ser | Ser 190 | Leu | Gly |
Thr | Lys | Thr | Tyr | Thr | Cys | Asn | Val | Asp | His | Lys | Pro | Ser | Asn | Thr | Lys |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Val | Asp | Lys | Arg | Val | Glu | Ser | Lys | Tyr | Gly | Pro | Pro | Cys | Pro | Pro | Cys |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Pro | Ala | Pro | Glu | Ala | Ala | Gly | Gly | Pro | Ser | Val | Phe | Leu | Phe | Pro | Pro |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Lys | Pro | Lys | Asp | Thr | Leu | Met | Ile | Ser | Arg | Thr | Pro | Glu | Val | Thr | Cys |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Val | Val | Val | Asp | Val | Ser | Gln | Glu | Asp | Pro | Glu | Val | Gln | Phe | Asn | Trp |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Tyr | Val | Asp | Gly | Val | Glu | Val | His | Asn | Ala | Lys | Thr | Lys | Pro | Arg | Glu |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Glu | Gln | Phe | Asn | Ser | Thr | Tyr | Arg | Val | Val | Ser | Val | Leu | Thr | Val | Leu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
His | Gln | Asp | Trp | Leu | Asn | Gly | Lys | Glu | Tyr | Lys | Cys | Lys | Val | Ser | Asn |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Lys | Gly | Leu | Pro | Ser | Ser | Ile | Glu | Lys | Thr | Ile | Ser | Lys | Ala | Lys | Gly |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Gln | Pro | Arg | Glu | Pro | Gln | Val | Tyr | Thr | Leu | Pro | Pro | Ser | Gln | Glu | Glu |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Met | Thr | Lys | Asn | Gln | Val | Ser | Leu | Thr | Cys | Leu | Val | Lys | Gly | Phe | Tyr |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Pro | Ser | Asp | Ile | Ala | Val | Glu | Trp | Glu | Ser | Asn | Gly | Gln | Pro | Glu | Asn |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Asn | Tyr | Lys | Thr | Thr | Pro | Pro | Val | Leu | Asp | Ser | Asp | Gly | Ser | Phe | Phe |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Leu | Tyr | Ser | Arg | Leu | Thr | Val | Asp | Lys | Ser | Arg | Trp | Gln | Glu | Gly | Asn |
405 | 410 | 415 |
- 26 031524
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435440 <210> 10 <211>214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400> 10
Asp 1 | Ile | Gln | Met | Thr 5 | Gln | Ser | Pro | Ser | Ser 10 | Leu | Ser | Ala | Ser | Val 15 | Gly |
Asp | Arg | Val | Thr | Ile | Thr | Cys | Lys | Ala | Ser | Asp | His | Ile | Leu | Lys | Phe |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Leu | Thr | Trp | Tyr | Gln | Gln | Lys | Pro | Gly | Lys | Ala | Pro | Lys | Leu | Leu | Ile |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Tyr | Gly | Ala | Thr | Ser | Leu | Glu | Thr | Gly | Val | Pro | Ser | Arg | Phe | Ser | Gly |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Asp | Phe | Thr | Leu | Thr | Ile | Ser | Ser | Leu | Gln | Pro |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Glu | Asp | Phe | Ala | Thr | Tyr | Tyr | Cys | Gln | Met | Tyr | Trp | Ser | Thr | Pro | Phe |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Phe | Gly | Gly | Gly | Thr | Lys | Val | Glu | Ile | Lys | Arg | Thr | Val | Ala | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Pro | Ser | Val | Phe | Ile | Phe | Pro | Pro | Ser | Asp | Glu | Gln | Leu | Lys | Ser | Gly |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Thr | Ala | Ser | Val | Val | Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Phe | Tyr | Pro | Arg | Glu | Ala |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Lys | Val | Gln | Trp | Lys | Val | Asp | Asn | Ala | Leu | Gln | Ser | Gly | Asn | Ser | Gln |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Glu | Ser | Val | Thr | Glu | Gln | Asp | Ser | Lys | Asp | Ser | Thr | Tyr | Ser | Leu | Ser |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Ser | Thr | Leu | Thr | Leu | Ser | Lys | Ala | Asp | Tyr | Glu | Lys | His | Lys | Val | Tyr |
- 27 031524
180
185
190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210> 11 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400> 11
caggtgcagc | tggtgcagtc | tggggctgag | gtgaagaagc | ctgggtcctc | ggtgaaggtc | 60 |
tcctgcaagg | cttctggata | taaattcact | cgttatgtta | tgcactgggt | gcgacaggcc | 120 |
cctggacaag | ggcttgagtg | gatgggatat | attaatcctt | acaatgatgg | tactaactac | 180 |
aatgagaagt | tcaaaggcag | agtcacgatt | accgcggaca | aatccacgag | cacagcctac | 240 |
atggagctga | gcagcctgag | atctgaggac | acggccgtgt | attactgtgc | gagaaactgg | 300 |
gacacaggcc | tctggggcca | aggcaccact | gtcacagtct | cctca | 345 |
<210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400> 12
gacatccaga | tgacccagtc | tccatcctcc | ctgtctgcat | ctgtaggaga | cagagtcacc | 60 |
atcacttgca | aggcaagtga | ccacattctc | aaatttttaa | cttggtatca | gcagaaacca | 120 |
gggaaagccc | ctaagctcct | gatctatggt | gcaaccagtt | tggaaactgg | ggtcccatca | 180 |
aggttcagtg | gcagtggatc | tgggacagat | ttcactctca | ccatcagcag | tctgcaacct | 240 |
gaagattttg | caacttacta | ctgtcaaatg | tattggagta | ctccgttcac | gttcggaggg | 300 |
gggaccaagg | tggaaataaa | a | 321 |
<210> <211> <212> <213> | 13 1323 DNA Artificial | Sequence |
<220> <223> | synthetic | construct |
- 28 031524 <400> 13
caggtgcagc | tggtgcagtc | tggggctgag | gtgaagaagc | ctgggtcctc | ggtgaaggtc | 60 |
tcctgcaagg | cttctggata | taaattcact | cgttatgtta | tgcactgggt | gcgacaggcc | 120 |
cctggacaag | ggcttgagtg | gatgggatat | attaatcctt | acaatgatgg | tactaactac | 180 |
aatgagaagt | tcaaaggcag | agtcacgatt | accgcggaca | aatccacgag | cacagcctac | 240 |
atggagctga | gcagcctgag | atctgaggac | acggccgtgt | attactgtgc | gagaaactgg | 300 |
gacacaggcc | tctggggcca | aggcaccact | gtcacagtct | cctcagcctc | caccaagggc | 360 |
ccatcggtct | tcccgctagc | gccctgctcc | aggagcacct | ccgagagcac | agccgccctg | 420 |
ggctgcctgg | tcaaggacta | cttccccgaa | ccggtgacgg | tgtcgtggaa | ctcaggcgcc | 480 |
ctgaccagcg | gcgtgcacac | cttcccggct | gtcctacagt | cctcaggact | ctactccctc | 540 |
agcagcgtgg | tgaccgtgcc | ctccagcagc | ttgggcacga | agacctacac | ctgcaacgta | 600 |
gatcacaagc | ccagcaacac | caaggtggac | aagagagttg | agtccaaata | tggtccccca | 660 |
tgcccaccct | gcccagcacc | tgaggccgcc | gggggaccat | cagtcttcct | gttcccccca | 720 |
aaacccaagg | acactctcat | gatctcccgg | acccctgagg | tcacgtgcgt | ggtggtggac | 780 |
gtgagccagg | aagaccccga | ggtccagttc | aactggtacg | tggatggcgt | ggaggtgcat | 840 |
aatgccaaga | caaagccgcg | ggaggagcag | ttcaacagca | cgtaccgtgt | ggtcagcgtc | 900 |
ctcaccgtcc | tgcaccagga | ctggctgaac | ggcaaggagt | acaagtgcaa | ggtctccaac | 960 |
aaaggcctcc | cgtcctccat | cgagaaaacc | atctccaaag | ccaaagggca | gccccgagag | 1020 |
ccacaggtgt | acaccctgcc | cccatcccag | gaggagatga | ccaagaacca | ggtcagcctg | 1080 |
acctgcctgg | tcaaaggctt | ctaccccagc | gacatcgccg | tggagtggga | aagcaatggg | 1140 |
cagccggaga | acaactacaa | gaccacgcct | cccgtgctgg | actccgacgg | ctccttcttc | 1200 |
ctctacagca | ggctaaccgt | ggacaagagc | aggtggcagg | aggggaatgt | cttctcatgc | 1260 |
tccgtgatgc | atgaggctct | gcacaaccac | tacacacaga | agagcctctc | cctgtctctg | 1320 |
ggt 1323 <210> 14 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic construct <400> 14
gacatccaga | tgacccagtc | tccatcctcc | ctgtctgcat | ctgtaggaga | cagagtcacc | 60 |
atcacttgca | aggcaagtga | ccacattctc | aaatttttaa | cttggtatca | gcagaaacca | 120 |
gggaaagccc | ctaagctcct | gatctatggt | gcaaccagtt | tggaaactgg | ggtcccatca | 180 |
- 29 031524
aggttcagtg | gcagtggatc | tgggacagat | ttcactctca | ccatcagcag | tctgcaacct | 240 |
gaagattttg | caacttacta | ctgtcaaatg | tattggagta | ctccgttcac | gttcggaggg | 300 |
gggaccaagg | tggaaataaa | acgaactgtg | gctgcaccat | ctgtcttcat | cttcccgcca | 360 |
tctgatgagc | agttgaaatc | tggaactgcc | tctgttgtgt | gcctgctgaa | taacttctat | 420 |
cccagagagg | ccaaagtaca | gtggaaggtg | gataacgccc | tccaatcggg | taactcccag | 480 |
gagagtgtca | cagagcagga | cagcaaggac | agcacctaca | gcctcagcag | caccctgacg | 540 |
ctgagcaaag | cagactacga | gaaacacaaa | gtctacgcct | gcgaagtcac | ccatcagggc | 600 |
ctgagctcgc | ccgtcacaaa | gagcttcaac | aggggagagt | gc | 642 |
<210>15 <211>170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>15
Arg 1 | Ala Val | Pro | Gly Gly 5 | Ser | Ser | Pro | Ala 10 | Trp | Thr | Gln | Cys | Gln 15 | Gln | ||
Leu | Ser | Gln | Lys | Leu | Cys | Thr | Leu | Ala | Trp | Ser | Ala | His | Pro | Leu | Val |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | His | Met | Asp | Leu | Arg | Glu | Glu | Gly | Asp | Glu | Glu | Thr | Thr | Asn | Asp |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Val | Pro | His | Ile | Gln | Cys | Gly | Asp | Gly | Cys | Asp | Pro | Gln | Gly | Leu | Arg |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Asp | Asn | Ser | Gln | Phe | Cys | Leu | Gln | Arg | Ile | His | Gln | Gly | Leu | Ile | Phe |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Tyr | Glu | Lys | Leu | Leu | Gly | Ser | Asp | Ile | Phe | Thr | Gly | Glu | Pro | Ser | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Pro | Asp | Ser | Pro | Val | Gly | Gln | Leu | His | Ala | Ser | Leu | Leu | Gly | Leu |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ser | Gln | Leu | Leu | Gln | Pro | Glu | Gly | His | His | Trp | Glu | Thr | Gln | Gln | Ile |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Pro | Ser | Leu | Ser | Pro | Ser | Gln | Pro | Trp | Gln | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Phe |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Lys | Ile | Leu | Arg | Ser | Leu | Gln | Ala | Phe | Val | Ala | Val | Ala | Ala | Arg | Val |
145 | 150 | 155 | 160 |
- 30 031524
Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
165 170
Claims (24)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Антитело, связывающееся с субъединицей р19 ИЛ-23 человека, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), а указанная тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), где указанная LCVR содержит аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, а указанная HCVR содержит аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2, HCDR3, при этом LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 4, LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 5, LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 6, HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 1, HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 2 и HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 3.
- 2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что указанная легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), а указанная тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем аминокислотная последовательность LCVR представляет собой SEQ ID NO: 8, а аминокислотная последовательность HCVR представляет собой SEQ ID NO: 7.
- 3. Антитело по п.2, содержащее две вариабельные области легкой цепи (LCVR) и две вариабельные области тяжелой цепи (HCVR), причем аминокислотная последовательность каждой LCVR представляет собой SEQ ID NO: 8, и аминокислотная последовательность каждой HCVR представляет собой SEQ ID NO: 7.
- 4. Антитело по п.1 или 2, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10, а аминокислотная последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9.
- 5. Антитело по п.4, содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность каждой легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10, а аминокислотная последовательность каждой тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9.
- 6. Молекула ДНК, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10.
- 7. Молекула ДНК, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9.
- 8. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело по любому из пп.1-5.
- 9. Выделенный полинуклеотид по п.8, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи антитела (HCVR) кодируется последовательностью SEQ ID NO: 11 и вариабельная область легкой цепи антитела (LCVR) кодируется последовательностью SEQ ID NO: 12.
- 10. Выделенный полинуклеотид по п.8 или 9, отличающийся тем, что тяжелая цепь антитела кодируется последовательностью SEQ ID NO: 13 и легкая цепь антитела кодируется последовательностью SEQ ID NO: 14.
- 11. Выделенный полинуклеотид по любому из пп.8-10, функционально связанный с последовательностью, контролирующей экспрессию.
- 12. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.11.
- 13. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая молекулу ДНК по п.6 и молекулу ДНК по п.7, причем указанная клетка способна экспрессировать антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 и указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
- 14. Рекомбинантная клетка-хозяин, трансформированная полинуклеотидом по любому из пп.8-10, причем указанная клетка способна экспрессировать антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем указанная аминокислотная последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9, и указанная аминокислотная последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10.
- 15. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.13 или 14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин является клеткой-хозяином млекопитающего, выбранной из группы, состоящей из клеток СНО, NS0, HEK293 и COS.
- 16. Способ получения антитела, связывающего субъединицу р19 ИЛ-23 человека, содержащего тяжелую цепь и легкую цепь, причем указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанный способ включает этапы:a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина по любому из пп.13-15 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного антитела; иb) выделение экспрессированного антитела из указанной клетки-хозяина.
- 17. Антитело, полученное по способу по п.16.- 31 031524
- 18. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики аутоиммунного состояния, воспалительного состояния или рака, содержащая антитело по любому из пп.1-5 и 17 и один или более из фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.
- 19. Способ лечения или профилактики аутоиммунного или воспалительного состояния у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела по любому из пп.1-5 или 17, причем указанное состояние выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительных заболеваний кишечника, анкилозирующего спондилита, реакции трансплантат против хозяина, волчанки и метаболического синдрома.
- 20. Способ лечения или профилактики рака у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела по любому из пп.1-5 или 17.
- 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанный рак представляет собой меланому, рак толстой кишки, рак яичника, рак головы и шеи, рак легких, рак молочной железы или рак желудка.
- 22. Применение антитела по любому из пп.1-5 и 17 для лечения аутоиммунного или воспалительного состояния, при этом указанное состояние выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительных заболеваний кишечника, анкилозирующего спондилита, реакции трансплантат против хозяина, волчанки и метаболического синдрома.
- 23. Применение антитела по любому из пп.1-5 и 17 для лечения рака.
- 24. Применение по п.23, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой меланому, рак толстой кишки, рак яичника, рак головы и шеи, рак легких, рак молочной железы или рак желудка.4^j)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361774732P | 2013-03-08 | 2013-03-08 | |
PCT/US2014/020064 WO2014137962A1 (en) | 2013-03-08 | 2014-03-04 | Antibodies that bind il-23 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201591368A1 EA201591368A1 (ru) | 2015-12-30 |
EA031524B1 true EA031524B1 (ru) | 2019-01-31 |
Family
ID=51488096
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201591368A EA031524B1 (ru) | 2013-03-08 | 2014-03-04 | Антитела, связывающие ил-23 |
Country Status (40)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9023358B2 (ru) |
EP (3) | EP4311558A3 (ru) |
JP (1) | JP6096938B2 (ru) |
KR (2) | KR101775115B1 (ru) |
CN (1) | CN105307681B (ru) |
AP (1) | AP2015008708A0 (ru) |
AR (1) | AR094877A1 (ru) |
AU (1) | AU2014226094B2 (ru) |
BR (1) | BR112015019611B1 (ru) |
CA (1) | CA2901462C (ru) |
CL (1) | CL2015002388A1 (ru) |
CY (2) | CY1123589T1 (ru) |
DK (1) | DK2964258T3 (ru) |
EA (1) | EA031524B1 (ru) |
EC (1) | ECSP15038626A (ru) |
ES (1) | ES2822662T3 (ru) |
FI (1) | FIC20230030I1 (ru) |
FR (1) | FR23C1036I1 (ru) |
HK (1) | HK1212252A1 (ru) |
HR (1) | HRP20201633T1 (ru) |
HU (2) | HUE051357T2 (ru) |
IL (2) | IL240731B (ru) |
JO (1) | JOP20140049B1 (ru) |
LT (1) | LT2964258T (ru) |
MA (1) | MA38382A1 (ru) |
MX (1) | MX370396B (ru) |
MY (1) | MY171226A (ru) |
NL (1) | NL301247I2 (ru) |
PE (1) | PE20151529A1 (ru) |
PH (1) | PH12015501994A1 (ru) |
PL (1) | PL2964258T3 (ru) |
PT (1) | PT2964258T (ru) |
RS (1) | RS60928B1 (ru) |
SG (1) | SG11201507176VA (ru) |
SI (1) | SI2964258T1 (ru) |
TN (1) | TN2015000348A1 (ru) |
TW (1) | TWI636063B (ru) |
UA (1) | UA123198C2 (ru) |
WO (1) | WO2014137962A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201505285B (ru) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR102417A1 (es) * | 2014-11-05 | 2017-03-01 | Lilly Co Eli | Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23 |
CA3003243A1 (en) * | 2015-10-30 | 2017-05-04 | Eli Lilly And Company | Anti-cgrp/anti-il-23 bispecific antibodies and uses thereof |
AR111845A1 (es) | 2017-05-03 | 2019-08-28 | Lilly Co Eli | Anticuerpos biespecíficos anti-cgrp / anti-il-23 y usos de los mismos |
TWI744617B (zh) | 2018-03-30 | 2021-11-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 治療潰瘍性結腸炎之方法 |
TWI725532B (zh) | 2018-09-11 | 2021-04-21 | 美商美國禮來大藥廠 | 治療牛皮癬之方法 |
TW202103734A (zh) | 2019-04-22 | 2021-02-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 治療克隆氏症(crohn's disease)的方法 |
WO2021076620A1 (en) | 2019-10-15 | 2021-04-22 | Eli Lilly And Company | Recombinantly engineered, lipase/esterase-deficient mammalian cell lines |
US11396541B2 (en) | 2019-12-20 | 2022-07-26 | Novarock Biotherapeutics, Ltd. | Anti-interleukin-23 P19 antibodies and methods of use thereof |
CN111718414B (zh) * | 2020-06-12 | 2021-03-02 | 江苏荃信生物医药有限公司 | 抗人白介素23单克隆抗体及其应用 |
WO2022041390A1 (zh) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 | 江苏荃信生物医药股份有限公司 | 包含高浓度抗人白介素23单克隆抗体的低粘度液体制剂及其制备方法 |
TW202224702A (zh) | 2020-09-10 | 2022-07-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 治療性抗體調配物 |
EP4347018A1 (en) | 2021-05-28 | 2024-04-10 | Eli Lilly and Company | Anti-il-23p19 antibody regulation of genes involved in ulcerative colitis |
CN113698480B (zh) * | 2021-09-18 | 2022-07-01 | 东大生物技术(苏州)有限公司 | 一组il-23单克隆抗体及其医药用途 |
WO2023056417A1 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Eli Lilly And Company | Anti-il-23p19 antibody regulation of genes involved in bowel urgency in ulcerative colitis |
WO2024077113A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Eli Lilly And Company | Methods of treating fatigue in ulcerative colitis |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006119062A2 (en) * | 2005-05-03 | 2006-11-09 | Ucb Pharma S.A. | Sclerostin epitopes |
WO2008103432A1 (en) * | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Schering Corporation | Engineered anti-il-23p19 antibodies |
US7723485B2 (en) * | 2007-05-08 | 2010-05-25 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered anti-MUC16 antibodies and antibody drug conjugates |
US7744874B2 (en) * | 2007-03-20 | 2010-06-29 | Eli Lilly And Company | Anti-sclerostin antibodies |
WO2012155019A1 (en) * | 2011-05-12 | 2012-11-15 | Genentech, Inc. | Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature pepides |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6060284A (en) | 1997-07-25 | 2000-05-09 | Schering Corporation | DNA encoding interleukin-B30 |
US7090847B1 (en) | 1999-09-09 | 2006-08-15 | Schering Corporation | Mammalian cytokines; related reagents and methods |
US7422743B2 (en) | 2000-05-10 | 2008-09-09 | Schering Corporation | Mammalian receptor protein DCRS5;methods of treatment |
ES2330220T3 (es) | 2003-03-10 | 2009-12-07 | Schering Corporation | Usos de antagonistas de il-23; reactivos relacionados. |
JP2009501006A (ja) | 2005-06-30 | 2009-01-15 | セントカー・インコーポレーテツド | 抗il−23抗体、組成物、方法および用途 |
CN101248088A (zh) * | 2005-08-25 | 2008-08-20 | 伊莱利利公司 | 抗il-23抗体 |
US7872102B2 (en) * | 2005-08-25 | 2011-01-18 | Eli Lilly And Company | Anti-IL-23 antibodies |
SG165322A1 (en) * | 2005-08-31 | 2010-10-28 | Schering Corp | Engineered anti-il-23 antibodies |
PL1971366T3 (pl) * | 2005-12-29 | 2015-01-30 | Janssen Biotech Inc | Ludzkie przeciwciała skierowane przeciw IL-23, kompozycje, sposoby i zastosowanie |
JP2010518858A (ja) * | 2007-02-23 | 2010-06-03 | シェーリング コーポレイション | 操作された抗−il−23p19抗体 |
WO2009082624A2 (en) * | 2007-12-10 | 2009-07-02 | Zymogenetics, Inc. | Antagonists of il-17a, il-17f, and il-23 and methods of using the same |
EP2435480A1 (en) * | 2009-05-27 | 2012-04-04 | Ablynx N.V. | Biparatopic protein constructs directed against il-23 |
PT2635601T (pt) * | 2010-11-04 | 2016-09-27 | Boehringer Ingelheim Int | Anticorpos anti-il-23 |
-
2014
- 2014-02-25 TW TW103106335A patent/TWI636063B/zh active
- 2014-02-25 AR ARP140100582A patent/AR094877A1/es unknown
- 2014-02-25 JO JOP/2014/0049A patent/JOP20140049B1/ar active
- 2014-03-04 EP EP23207282.7A patent/EP4311558A3/en active Pending
- 2014-03-04 PT PT147610620T patent/PT2964258T/pt unknown
- 2014-03-04 DK DK14761062.0T patent/DK2964258T3/da active
- 2014-03-04 MY MYPI2015702927A patent/MY171226A/en unknown
- 2014-03-04 KR KR1020157024032A patent/KR101775115B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-04 PE PE2015001903A patent/PE20151529A1/es active IP Right Grant
- 2014-03-04 LT LTEP14761062.0T patent/LT2964258T/lt unknown
- 2014-03-04 PL PL14761062T patent/PL2964258T3/pl unknown
- 2014-03-04 UA UAA201508670A patent/UA123198C2/uk unknown
- 2014-03-04 HU HUE14761062A patent/HUE051357T2/hu unknown
- 2014-03-04 EP EP14761062.0A patent/EP2964258B1/en active Active
- 2014-03-04 US US14/195,889 patent/US9023358B2/en active Active
- 2014-03-04 KR KR1020177024414A patent/KR20170103037A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-03-04 EA EA201591368A patent/EA031524B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-03-04 SG SG11201507176VA patent/SG11201507176VA/en unknown
- 2014-03-04 AU AU2014226094A patent/AU2014226094B2/en active Active
- 2014-03-04 BR BR112015019611-0A patent/BR112015019611B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-04 EP EP20193400.7A patent/EP3789037A1/en not_active Withdrawn
- 2014-03-04 ES ES14761062T patent/ES2822662T3/es active Active
- 2014-03-04 MX MX2015011959A patent/MX370396B/es active IP Right Grant
- 2014-03-04 CA CA2901462A patent/CA2901462C/en active Active
- 2014-03-04 CN CN201480012747.7A patent/CN105307681B/zh active Active
- 2014-03-04 RS RS20201236A patent/RS60928B1/sr unknown
- 2014-03-04 MA MA38382A patent/MA38382A1/fr unknown
- 2014-03-04 WO PCT/US2014/020064 patent/WO2014137962A1/en active Application Filing
- 2014-03-04 AP AP2015008708A patent/AP2015008708A0/xx unknown
- 2014-03-04 SI SI201431653T patent/SI2964258T1/sl unknown
- 2014-03-04 JP JP2015561515A patent/JP6096938B2/ja active Active
-
2015
- 2015-05-01 US US14/702,124 patent/US9688753B2/en active Active
- 2015-07-22 ZA ZA2015/05285A patent/ZA201505285B/en unknown
- 2015-08-12 TN TN2015000348A patent/TN2015000348A1/en unknown
- 2015-08-20 IL IL240731A patent/IL240731B/en active IP Right Grant
- 2015-08-26 CL CL2015002388A patent/CL2015002388A1/es unknown
- 2015-09-08 PH PH12015501994A patent/PH12015501994A1/en unknown
- 2015-09-08 EC ECIEPI201538626A patent/ECSP15038626A/es unknown
-
2016
- 2016-01-14 HK HK16100387.3A patent/HK1212252A1/xx unknown
-
2017
- 2017-06-01 US US15/611,008 patent/US20170275356A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-01-14 IL IL272042A patent/IL272042B/en unknown
- 2020-10-09 HR HRP20201633TT patent/HRP20201633T1/hr unknown
- 2020-11-16 CY CY20201101081T patent/CY1123589T1/el unknown
-
2023
- 2023-10-03 FI FIC20230030C patent/FIC20230030I1/fi unknown
- 2023-10-06 NL NL301247C patent/NL301247I2/nl unknown
- 2023-10-06 CY CY2023021C patent/CY2023021I1/el unknown
- 2023-10-13 FR FR23C1036C patent/FR23C1036I1/fr active Active
- 2023-10-18 HU HUS2300036C patent/HUS2300036I1/hu unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006119062A2 (en) * | 2005-05-03 | 2006-11-09 | Ucb Pharma S.A. | Sclerostin epitopes |
WO2008103432A1 (en) * | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Schering Corporation | Engineered anti-il-23p19 antibodies |
US7744874B2 (en) * | 2007-03-20 | 2010-06-29 | Eli Lilly And Company | Anti-sclerostin antibodies |
US7723485B2 (en) * | 2007-05-08 | 2010-05-25 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered anti-MUC16 antibodies and antibody drug conjugates |
WO2012155019A1 (en) * | 2011-05-12 | 2012-11-15 | Genentech, Inc. | Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature pepides |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101775115B1 (ko) | Il-23에 결합하는 항체 | |
US20220267440A1 (en) | Anti-cd47 antibodies | |
JP6140777B2 (ja) | ヒトil−6受容体に対する高親和性抗体 | |
KR101395515B1 (ko) | 항원성 gm-csf 펩티드 및 gm-csf에 대한 항체 | |
KR102344620B1 (ko) | 항-cd137 항체 | |
ES2791333T3 (es) | Anticuerpos anti-MIF para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias | |
AU2012308786A1 (en) | Antibodies to PCSK9 and uses thereof | |
US20220340654A1 (en) | Antibody capable of binding to thymic stromal lymphopoietin and use thereof | |
WO2015070697A1 (zh) | Il-17a结合物及其用途 | |
KR20210049792A (ko) | 인간 il-4r 결합 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 의학적 용도 | |
WO2019184935A1 (zh) | 抗cd27抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
CN111051343B (zh) | Il-6r抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
WO2022247826A1 (zh) | 靶向pd-l1和cd73的特异性结合蛋白 | |
NZ711147B2 (en) | Antibodies that bind il-23 | |
KR20220117307A (ko) | 인간 il-13 및 il-17에 대해 결합 특이성을 갖는 다중 특이적 항체 | |
KR20190049483A (ko) | Scf 및 갈렉틴-1을 표적으로 하는 이중표적항체 및 그 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AZ BY KG TJ TM |