EA029779B1 - Содержащие антитела к dll4 стабилизированные композиции - Google Patents

Abstract

Описаны фармацевтические композиции, специфически связывающиеся с дельта-подобным лигандом 4 человека (DLL4), содержащие 25 ± 3,75 мг/мл антитела IgG1 человека к DLL4, причем антитело содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 2, HCDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 3, HCDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 4, определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 6, LCDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 7 и LCDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 8. Помимо антитела к DLL4 композиции могут содержать 10 мМ ± 3 мМ фосфат, рН 6,0 ± 0,5; 0,2% ± 0,03% полисорбат 20, 150 мМ ± 22,5 мМ хлорида натрия и 10% ± 1,5% сахарозы. Изобретение также предлагает набор для лечения, предотвращения или облегчения заболевания или нарушения, связанного с активностью DLL4, содержащий фармацевтическую композицию, содержащуюся в емкости, и инструкции. Описанные фармацевтические композиции обеспечивают значительную степень стабильности антитела после хранения в течение нескольких месяцев и воздействия термического и других физических стрессов.

Description

изобретение относится к терапевтическим композициям антител. Более точно, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело, которое специфически связывает дельта-подобный лиганд 4 человека (ОЬЬ4).

Перечень последовательностей

В соответствии со статьей 1.821(д) раздела 37 Свода федеральных правил одновременно с настоящей заявкой подан машиночитаемый текстовой файл в формате 8Т.25 с перечнем последовательностей. Содержание этого файла в порядке ссылки включено в настоящую заявку. В соответствии со статьей 1.821(1) раздела 37 Свода федеральных правил в состав настоящей заявки входит и в порядке ссылки включена в нее печатная копия перечня последовательностей, идентичная содержанию машиночитаемого текстового файла в формате 8Т.25.

Уровень техники

Сигнальный путь Ыо1ск является системой межклеточной коммуникации, используемой разнообразными эукариотами во многих биологических процессах, таких как дифференциация, пролиферация и гомеостаз. Дельта-подобный 4 (ОЬ4) или дельта-подобный лиганд-4 (НЬЬ4) (далее - НЬЬ4) входит в дельта-семейство Мо1сЬ-лигандов, которые с высокой селективностью экспрессирует сосудистый эндотелий (ЫшОсг и др. (2000) Сепек Ое\'е1ор. 14:1313-1318). НЬЬ4 является лигандом Ыо1ск-рецепторов, включая рецепторы Ыо1ск-1 и Ыо1ск-4. Аминокислотная последовательность НЬЬ4 человека представлена последовательностью 8ЕО ГО N0:9. С учетом важной роли, которую играет сигнальный путь ОЬЬ4Ыо1ск в регуляции ангиогенеза, и его значении для здоровья человека и медицины желательно разрабатывать и внедрять лекарственные средства на основе НЬЬ4. Одним таким лекарственным средством на основе НЬЬ4 является терапевтическое антитело, специфическое к НЬЬ4. Способы получения антител, применимых в качестве лекарственных препаратов для человека, включают синтез химерных антител и гуманизированных антител (см., например, патент И8 6949245). См., например, заявку XVО 94/02602 (АЪдешх) и патент И8 6596541 (Кедепегоп Рйаттасеийсак), в которых описаны способы производства трансгенных мышей, способных продуцировать антитела человека. В патентах И8 7488806, 7534868 и 7919593, а также патентной заявке И8 2011-0150905А1 описаны антитела к НЬЬ4 человека.

Терапевтические антитела должны применяться в форме, не только делающей их применимыми для введения пациентам, но также обеспечивающей их стабильность при хранении и последующем применении. Например, терапевтические антитела в жидком растворе подвержены распаду, выпадению в осадок, агрегированию и нежелательным химическим модификациям, если раствор не составлен надлежащим образом. Стабильность антитела в жидкой композиции зависит не только от типа наполнителей, используемых в композиции, но также от количеств и взаимных соотношений наполнителей. Кроме того, при составлении жидкой композиции антитела должны приниматься во внимание другие соображения помимо стабильности. Примеры таких дополнительных соображений включают вязкость раствора и концентрацию антитела, которые могут обеспечиваться заданной композицией, и внешний вид или привлекательность композиции. Соответственно, при составлении композиции терапевтического антитела необходимо принимать меры к получению композиции, которая сохраняет стабильность, имеет надлежащую концентрацию антитела и обладает применимой вязкостью, а также другими свойствами, обеспечивающими удобство введения композиции пациентам.

Антитела к НЬЬ4 служат одним из примеров терапевтически применимой макромолекулы, для которой требуется надлежащая композиция. Хотя некоторые антитела к НЬЬ4 известны, в технике сохраняется потребность в новых содержащих антитела к НЬЬ4 фармацевтических композициях, которые являются достаточно стабильными и применимыми для введения пациентам.

Сущность изобретения

Решение упомянутой задачи достигнуто в настоящем изобретении за счет фармацевтических композиций, содержащих антитело человека, которое специфически связывает дельта-подобный лиганд 4 человека (НЬЬ4), причем фармацевтические композиции содержат:

(ί) 25 мг/мл ± 3,75 мг/мл антитела 1дС1 человека к НЬЬ4, причем антитело содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (НСОК) 1 с последовательностью 8ЕО ГО N0: 2, НСОК2 с последовательностью 8Е0 ГО N0: 3, НСОК3 с последовательностью 8Еф ГО N0: 4, определяющую комплементарность область легкой цепи (ЬСОК) 1 с последовательностью 8Еф ГО N0: 6, ЬСОК2 с последовательностью 8Е0 ГО N0: 7 и ЬСОКЗ с последовательностью 8Еф ГО N0: 8,

(ίί) 10 мМ ± 3 мМ фосфат, рН 6,0 ± 0,5,

(ίίί) 0,2% ± 0,03% полисорбат 20,

(ίν) 150 мМ ± 22,5 мМ хлорида натрия, и

(ν) 10% ± 1,5% сахарозы.

Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция состоит из:

- 1 029779

(a) 25 мг/мл ± 3,75 мг/мл антитела,

(b) 10 мМ ± 3 мМ фосфат, рН 6,0 ± 0,5,

(c) 0,2% ± 0,03% полисорбат 20,

(ά) 150 мМ ± 22,5 мМ хлорида натрия, и

(е) 10% ±1,5% сахарозы, в воде.

Согласно одному варианту осуществления изобретения в фармацевтической композиции (а) антитело имеет молекулярную массу около 150 кДа и (б) от около 82% до около 87% антитела фукозилировано.

Согласно одному варианту осуществления, в фармацевтической композиции по меньшей мере 94% антитела имеет нативную конформацию через 28 суток хранения при 45°С. Согласно еще одному варианту осуществления, в фармацевтической композиции по меньшей мере 45% антитела имеет главную зарядовую форму через 28 суток хранения при 45°С, причем главная зарядовая форма антитела представляет собой фракцию антитела, которая элюируется с ионообменной смолы в главном пике. Согласно одному варианту осуществления, фармацевтическая композиция содержится в емкости. Согласно еще одному варианту осуществления, емкостью является флакон или капельница для внутривенного вливания.

В одном из вариантов осуществления вязкость композиции составляет от около 1 сП до около 5 сП. В одном из вариантов осуществления вязкость композиции составляет 1,5 сП ± 0,23 сП, около 1,5 сП или 1,5 сП.

В одном из вариантов осуществления осмотическая концентрация раствора композиции близка к физиологическому диапазону. В одном из вариантов осуществления композиция имеет осмотическую концентрацию раствора от около 300 миллиосмолей (мОсм) на килограмм до около 700 мОсм. В одном из вариантов осуществления осмотическая концентрация композиции имеет осмотическую концентрацию раствора 650 мОсм ± 98 мОсм, около 650 мОсм или 650 мОсм.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 95% антитела к ЭШ4. восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 24 месяца хранения при -80°С, не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 57% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 24 месяца хранения при -80°С, находится в неосновной и некислотной форме (т.е. основной пиковой или главной зарядовой форме или "области двух пиков") по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ЭШ сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности через 24 месяца хранения при -80°С относительно связывающей активности антитела до хранения. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 95% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 18 месяцев хранения при -30°С, не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 57% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 18 месяцев хранения при -30°С, находится в главной зарядовой форме по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ЭШ4 сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности через 18 месяцев хранения при -30°С относительно связывающей активности антитела до хранения. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 95% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 6 месяцев хранения при -20°С, не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 60% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 6 месяцев хранения при -20°С находится в главной зарядовой форме по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ЭШ сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности через 6 месяцев хранения при 20°С относительно связывающей активности антитела до хранения.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 95% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 6 месяцев хранения при 5°С, не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 61% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 6 месяцев хранения при 5°С находится в главной зарядовой форме по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ЭШ сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности через 6 месяцев хранения при 5°С, относительно связывающей активности антитела до хранения. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 97% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 6 месяцев термического стресса при 25°С, не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 53% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 6 месяцев хранения при 25°С, находится в главной зарядовой форме по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ЭШ сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности через 6 месяцев хранения при 25°С относи- 2 029779

тельно связывающей активности антитела до хранения.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 94% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 28 суток термического стресса при 45°С, не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 45% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 28 суток термического стресса при 45°С находится в главной зарядовой форме по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ПЬЬ4 сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности через 28 суток термического стресса при 45°С относительно связывающей активности антитела до применения условий термического стресса. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 96% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 28 суток термического стресса при 37°С, не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 51% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 28 суток термического стресса при 37°С находится в главной зарядовой форме по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ПЬЬ4 сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности через 28 суток термического стресса при 37°С относительно связывающей активности антитела до применения условий термического стресса. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 97% антитела к ОЬЕ4. восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 28 суток термического стресса при 25°С, не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 57% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции через 28 суток термического стресса при 25°С, находится в главной зарядовой форме по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ПЬЬ4 сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности через 28 суток термического стресса при 25°С относительно связывающей активности антитела до применения условий термического стресса. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 98% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции после 120 минут стрессового взбалтывания не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 59% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции после 120 минут стрессового взбалтывания, находится в главной зарядовой форме по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ПЬЬ4 сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности после 120 минут стрессового взбалтывания относительно связывающей активности антитела до применения условий стрессового взбалтывания.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 98% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции после 8 циклов замораживания/оттаивания, не агрегировалось и не распалось по данным эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 58% антитела к ПЬЬ4, восстановленного из жидкой фармацевтической композиции после 8 циклов замораживания/оттаивания, находится в главной зарядовой форме по данным ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления антитело к ПЬЬ4 сохраняет в среднем от около 65% до около 135% своей связывающей активности после 8 циклов замораживания/оттаивания относительно связывающей активности антитела до применения условий стрессового замораживания/оттаивания. В одном из частных вариантов осуществления антитело 1§С1 человека к ПЬЬ4 содержит вариабельную область тяжелой цепи (НСУК) и вариабельную область легкой цепи (ЬСУК), содержащие аминокислотные последовательности о£ 8ЕЦ ГО N0: 1 и 8ЕЦ ГО N0: 5 соответственно (антитело ΚΕΟΝ421 согласно патентам И8 7488806, 7534868 и 7919593 и публикации патентной заявки И8 20110150905).

В одном из вариантов осуществления после нахождения композиции в условиях термического стресса при 45° в течение 28 суток >94% антитела сохраняет свою нативную конформацию, >45% антитела находится в главной зарядовой форме, и >98% антитела сохраняет свою связывающую активность. В другом варианте осуществления после нахождения композиции в условиях термического стресса при 37° в течение 28 суток >97% антитела является нативным, >59% антитела находится в главной зарядовой форме, и около 100% антитела сохраняет свою связывающую активность. В одном из вариантов осуществления после нахождения композиции в условиях термического стресса при 25° в течение 28 суток >97% антитела является нативным, >57% антитела находится в главной зарядовой форме, и около 100% антитела сохраняет свою связывающую активность. В одном из вариантов осуществления этой конкретной композиции после 8 циклов замораживании с последующим оттаиванием >98% антитела является нативным, >59% антитела находится в главной зарядовой форме, и около 100% антитела сохраняет свою связывающую активность. В одном из вариантов осуществления этой конкретной композиции после 120 минут стрессового взбалтывания >98% антитела является нативным, >58% антитела находится в главной зарядовой форме, и по меньшей мере около 98% антитела сохраняет свою связывающую активность.

Согласно одной из особенностей жидкая фармацевтическая композиция согласно любой из пред- 3 029779

шествующих особенностей находится в емкости. В одном из вариантов осуществления емкостью является поликарбонатный флакон. В другом варианте осуществления емкостью является стеклянный флакон, который в некоторых вариантах осуществления является флакон из боросиликатного стекла типа 1 с пробкой из бутилкаучука с фторуглеродным покрытием. В еще одном варианте осуществления емкостью является мешок, такой как капельница для внутривенного вливания, которая в некоторых вариантах осуществления изготовлена из поливинилхлорида или полиолефина. В другом варианте осуществления емкостью является устройство для инъекций, такое как микроинфузионный насос или шприц.

Согласно одному аспекту предложен набор для лечения, предотвращения или облегчения заболевания или нарушения, связанного с активностью ОЬЬ4, содержащий фармацевтическую композицию согласно любому из предшествующих вариантов осуществления, причем фармацевтическая композиция содержится в емкости, и инструкции. В одном из вариантов осуществления емкостью является стеклянный флакон с резиновой пробкой 4023/50 с фторуглеродным покрытием.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения станут ясны при рассмотрении следующего подробного описания.

Подробное описание изобретения

Перед тем, как перейти к описанию настоящего изобретения, следует понять, что изобретение не ограничено описанными конкретными способами и условиями экспериментов, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Следует также понять, что используемая терминология имеет целью описание лишь конкретных вариантов осуществления, а не ограничение объема настоящего изобретения, который ограничен лишь прилагаемой формулой изобретения.

Если не указано иное все используемые научно-технические термины имеют обычно такое же значение, которое принято среди специалистов в области техники, к которой относится изобретение. Термин "около", используемый применительно к конкретно указанному численному значению или интервалу значений, означает, что значение может отличаться от указанного не более, чем на 5%. Например, "около 100" означает от 95 до 105 и все значения в этом интервале (например, 95,00, 95,01, 95,02, 95,03, 95,04, ..., 104,96, 104,97, 104,98, 104,99, 105,00).

Хотя при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения могут использоваться любые способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в изобретении, далее описаны предпочтительные способы и вещества. Фармацевтические композиции

Используемый термин "фармацевтическая композиция" означает сочетание по меньшей мере одного действующего ингредиента (например, малой молекулы, макромолекулы, соединения и т.д., которое способно оказывать биологическое действие на человека или животное) и по меньшей мере одного недействующего ингредиента, который в сочетании с действующим ингредиентом или одним или несколькими дополнительными недействующими ингредиентами применим для терапевтического введения человеку или животному. Используемый термин "композиция" означает "фармацевтическую композицию", если конкретно не указано иное. В настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтическим полипептидом является антитело или его связывающий антиген фрагмент, который специфически связывает белок дельта-подобного лиганда 4 (ΌΕΕ4) человека. Более точно, в настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, которые содержат: (ί) антитело человека, которое специфически связывает ΌΕΕ4 человека, (ίί) фосфатный буфер; (ίίί) органический сорастворитель, представляющий собой неионное поверхностно-активное вещество; и (ίν) стабилизатор, представляющий собой углевод или неорганическую соль или сочетание углевода и неорганической соли. Конкретные примеры компонентов и композиций согласно настоящему изобретению, подробно описаны далее.

Антитела, специфически связывающие ΌΕΕ4

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать антитело человека или его связывающий антиген фрагмент, который специфически связывает ΌΕΕ4 человека. Используемый термин "ΌΕΕ4" означает дельта-подобный лиганд 4 человека, который является сосудистоспецифическим Νοίαΐι-лигандом. Обычно, подразумевается, что сигнальный путь ΩΕΤΛ-ΝοίΟι модулирует ангиогенез путем блокирования ветвления кровеносных сосудов и способствования их созреванию (значение ΌΕΕ4 в качестве отрицательного регулятора ветвления рассмотрено у Зашкш и Нате, Тгепбз ίη Мо1еси1аг Мебюше, Уо1. 13(9): 389-395, Зер. 2007). Доказано, что средства, являющиеся антагонистами пути ΌΕΕ4-ΝοΚΕ, замедляют скорость роста опухолей путем "инициирования избыточного, но нефункционального ангиогенеза" (см. Затзш, стр. 389). ΌΕΕ4 активируется посредством УЕОР и предположительно способствует организованному образованию новых функциональных сосудов. Один из примеров аминокислотной последовательности ΌΕΕ4 человека является ЗЕО ГО ΝΟ: 9. Антитела к ΌΕΕ4 человека описаны в патентах иЗ 7488806, 7534868 и 7919593. Используемый термин "антитело" в целом означает молекулы иммуноглобулина, содержащие четыре полипептидные цепи: две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанные друг с другом дисульфидными мостиками, а также его мультимеры (например, 1дМ); тем не менее, термином "антитело" также обозначаются молекулы иммуноглобулина, состоящие только из тяжелых цепей (т.е. не имеющие легких цепей). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную

- 4 029779

область тяжелой цепи (сокращенно НСУК или Ун) и постоянную область тяжелой цепи. Постоянная область тяжелой цепи содержит три домена: СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно ЬСУК или У_ъ) и постоянную область легкой цепи. Постоянная область легкой цепи содержит один домен (СЬ1). Области У_н и У_ъ могут дополнительно подразделяться на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (СОК), среди которых рассеяны более консервативные области, называемые каркасными областями (РК). Каждая область У_н и У_ъ образована тремя СОК и четырьмя РК, расположенными от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: РК1, СЭРЕ РК2, СЭК2. РК3, С.ПК3. РК4.

Если конкретно не указано иное, подразумевается, что используемый термин "антитело" означает молекулы всего антитела, а также его связывающих антиген фрагментов. Используемый термин "связывающий антиген участок" или "связывающий антиген фрагмент" антитела (или просто "участок антитела" или "фрагмент антитела") означает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связывать ИЬЬ4 человека или его эпитоп.

Используемый термин "изолированное антитело" означает антитело, преимущественно не содержащее других антител со специфичностью к различным антигенам (например, изолированное антитело, которое специфически связывает ИЬЬ4 человека, преимущественно не содержит антител, которые специфически связывают антигены помимо ИЬЬ4 человека), за существенным исключением биспецифических (или полиспецифических) антител, которые специфически связывают ИЬЬ4, с одной стороны, и другой эпитоп, с другой стороны. Кроме того, изолированное антитело может преимущественно не содержать другого клеточного вещества или химических веществ. Термин "специфически связывает" и т.п. означает, что антитело или его связывающий антиген фрагмент образует с антигеном комплекс, относительно стабильный в физиологических условиях. Специфическое связывание может быть охарактеризовано константой диссоциации по меньшей мере около 1х10^-6 М или более. Способы определения наличия специфического связывания двух молекул хорошо известны из техники и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п. Тем не менее, изолированное антитело, которое специфически связывает ИЬЬ4 человека, может обладать перекрестной реактивностью в отношении других антигенов, таких как молекулы ИЬЬ4, источником которых являются другие виды (ортологи). В контексте настоящего изобретения считается, что полиспецифические (например, биспецифические) антитела, которые связывают ИЬЬ4 человека, а также один или несколько дополнительных антигенов, "специфически связывают" ИЬЬ4 человека.

Примеры антител к ИЬЬ4 человека, которые могут быть включены в фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, приведены в патентах И8 7488806, 7534868, 7919593 и патентной заявке И8 2011-0150905.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, антителом к ИЬЬ4 человека является 1§О1 человека, содержащий вариабельную область тяжелой цепи подтипа ЮНУ3-33.01 и вариабельную область легкой цепи подтипа ЮКУ3-11.01 (см. ВагЫе и ЬеРгапе, ТЬе Нитап 1ММииод1оЪи1ш Карра УапаЫе (ЮКУ) Оеиек аиб άοίηίη^ (ЮКТ) 8едтеи18, Ехр. С1ш. 1ММииодеие1. 1998; 15:171-183; и 8сау1иег, И. и др., Рто1еш И18р1ау8 оР 1Ье Нитаи 1ММииод1оЪи1ш Неауу, Карра аиб ЬатЪба УапаЫе аиб боттд Кедюик, Ехр. С1ш. 1ММииодеиеР, 1999; 16:234-240). Приведенные в описании последовательности зародышевых линий ЮНУ3-33 и ЮКУ3-11 и присвоенная нумерация положений аминокислотных последовательностей соответствуют международной системе информации в области иммуногенетики (1МОТ), описанной у ЬеРгаис, М.-Р. и др., 1МОТ®, 1Ье ш1ета1юиа1 1ММииоОеиеТю8 (иРогтабои 8у81ет®, Иис1. Лс1б5 Кек, 37, Ό1006-Ό1012 (2009).

В некоторых вариантах осуществления антитело к ПЬЬ4 человека содержит одну или несколько аминокислотных замен в одной или нескольких каркасных областях относительно канонической вариабельной области тяжелой цепи, что обоснованно предполагает измененное распределение зарядов на незащищенной поверхности антитела и, соответственно, сказывается на взаимодействии с окружающим растворителем и наполнителями. В некоторых вариантах осуществления аминокислотной заменой является замена серина аланином, метиона треонином и/или глутаминовой кислоты глутамином в положениях 54, 86 и 90, соответственно ЮНУ3-33 согласно 1МОТ.

В некоторых вариантах осуществления антитело к ПЬЬ4 человека содержит одну или несколько аминокислотных замен в одной или нескольких СОК относительно канонической вариабельной области легкой цепи, что обоснованно предполагает измененное распределение зарядов на незащищенной поверхности антитела и, соответственно, сказывается на взаимодействии с растворяющей средой. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотной заменой является замена гистидина глутамином в положении 106 ЮКУ3-11 согласно 1МОТ.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к ПЬЬ4 человека или его связывающий антиген фрагмент содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (НСГОВ) 1 с последовательностью 8ЕО ГО N0: 2, НСГОР2 с последовательностью 8ЕО ГО N0: 3 и НСГОР3 с последовательностью 8Е0 ГО N0: 4. В некоторых вариантах осуществления антитело к ПЬЬ4 человека или его связывающий антиген фрагмент содержит НСУЭ с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1.

- 5 029779

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к БЬЬ4 человека или его связывающий антиген фрагмент содержит определяющую комплементарность область легкой (каппа) цепи (ЬСБК) 1 с последовательностью δΕφ ГО N0: 6, ЬСБК2 с последовательностью δΕφ ГО N0: 7 и ЬСБКЗ с последовательностью δΕφ ГО N0: 8. В некоторых вариантах осуществления антитело к БЬЬ4 человека или его связывающий антиген фрагмент содержит ЬСУБ с последовательностью δΕφ ГО N0: 5.

В качестве неограничивающего примера в описании используется антитело ЕЕСХ42Е как и в патентах И8 7488806, υδ 7534868, υδ 7919593 и заявке υδ 2011-0150905. Это антитело содержит аминокислотную парную последовательность НСУК/ЬСУК δΕφ ΙΌ N0: 1/5 и домены НСБК1-НСБК2НСБК3/ЕСБК1-ЕСБК2-ЕСБК3, представленные последовательностями δΕφ ΙΌ N0: 2-3-4/δΕφ ΙΌ N0: 6-7-8.

Количество антитела или его связывающего антиген фрагмента в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению может варьировать в зависимости от конкретных свойств желаемых композиций, а также частных обстоятельств и целей, на применение в которых рассчитаны композиции. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции представляют собой жидкие композиции, которые могут содержать антитело или его связывающий антиген фрагмент, который специфически связывает ПЬЬ4 человека, в концентрации от 20 мг/мл ± 3 мг/мл до 75 мг/мл ± 11,25 мг/мл; от 25 ± 3,75 мг/мл до 70 ± 10,5 мг/мл; от 30 ± 4,5 мг/мл до 65 ± 9,75 мг/мл; от 35 ± 5,25 мг/мл до 60 ± 9 мг/мл; от 40 ± 6 мг/мл до 55 ± 8,25 мг/мл; от 45 ± 6,75 мг/мл до 50 ± 7,5 мг/мл; 25 мг/мл ± 3,75 мг/мл; около 25 мг/мл; 25 мг/мл; 50 мг/мл ± 7,5 мг/мл; около 50 мг/мл или 50 мг/мл.

Наполнители и рН

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат один или несколько наполнителей. Используемый термин "наполнитель" означает любое нетерапевтическое вещество, добавляемое в композицию с целью придания желаемой консистенции, вязкости или эффекта стабилизации.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один органический сорастворитель такого типа и в таком количестве, чтобы стабилизировать антитело к БЬЬ4 человека в условиях небрежного обращения или взбалтывания, такого как, например, встряхивание. В некоторых вариантах осуществления под "стабилизацией" подразумевается, что по меньшей мере 95% антитела к БЬЬ4 остается нативном состоянии, т.е. без фрагментации или агрегирования антител (в молярном отношении) в случае небрежного обращения, такого как встряхивание раствора антител и органического сорастворителя в течение около 60 мин или около 120 мин.

В некоторых вариантах осуществления органическим сорастворителем является неионное поверхностно-активное вещество, такое как алкилполи(этиленоксид). Конкретные неионные поверхностноактивные вещества, которые могут быть включены в композиции согласно настоящему изобретению, включают, например, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 28, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 81 и полисорбат 85; полоксамеры, такие как полоксамер 181, полоксамер 188, полоксамер 407; или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Полисорбат 20 также известен как ТтЕЕЩ 20, сорбитанмонолаурат и полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат. Полоксамер 188 также известен как РЕЕН0МС Р68.

Количество неионного поверхностно-активного вещества, содержащегося в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, может варьировать в зависимости от конкретных свойств желаемых композиций, а также частных обстоятельств и целей, на применение в которых рассчитаны композиции. В некоторых вариантах осуществления композиции могут содержать от 0,01% ± 0,0015% до 1% ± 0,15% поверхностно-активного вещества. Например, композиции согласно настоящему изобретению могут содержать около 0,0085%; около 0,01%; около 0,02%; около 0,03%; около 0,04%; около 0,05%; около 0,06%; около 0,07%; около 0,08%; около 0,09%; около 0,1%; около 0,11%; около 0,12%; около 0,13%; около 0,14%; около 0,15%; около 0,16%; около 0,17%; около 0,18%; около 0,19%; около 0,20%; около 0,21%; около 0,22%; около 0,23%; около 0,24%; около 0,25%; около 0.3%; около 0.4%; около 0,5%; около 0,6%; около 0,7%; около 0,8%; около 0,9%; около 1%; около 1,1%; около 1,15%; или около 1,2% полисорбата 20 или полоксамера 188.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению также могут содержать один или несколько стабилизаторов такого типа и в таком количестве, чтобы стабилизировать антитело к БЦЕ4 человека в условиях термического стресса. В некоторых вариантах осуществления под "стабилизацией" подразумевается, что более около 94% антитела сохраняет нативную конформацию при хранении раствора, содержащего антитело и термостабилизатор, при температуре около 45°С в течение до около 28 суток. В некоторых вариантах осуществления под "стабилизацией" подразумевается, что более около 96% антитела сохраняет нативную конформацию при хранении раствора, содержащего антитело и термостабилизатор, при температуре около 37°С в течение до около 28 суток. Используемый термин "нативный" означает основную форму антитела при эксклюзионном анализе, которой обычно является форма интактного мономера.

В некоторых вариантах осуществления термостабилизатором является сахар или сахарный спирт,

- 6 029779

выбранный из сахарозы, сорбита, глицерина, трегалозы и маннита или любого их сочетания, при этом его количество в композиции может варьировать в зависимости от конкретных обстоятельств и целей, на применение в которых рассчитаны композиции. В некоторых вариантах осуществления композиции могут содержать от около 5% до около 40% сахара или сахарного спирта; от около 1% до около 20% сахара или сахарного спирта; от около 5 % до около 15% сахара или сахарного спирта; от около 7,5% до около 12,5% сахара или сахарного спирта; около 10% сахара или сахарного спирта; 10% ± 1,5% сахара или сахарного спирта; или 10% сахара или сахарного спирта. Например, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать 4%± 0,6%; 5% ± 0,75%; 6% ± 0,9%; 7% ± 1,05%; 8% ± 1,2%; 9% ± 1,35%; 10% ± 1,5%; 11% ± 1,65%; 12% ± 1,8%; 13% ± 1,95%; или около 14% ±2,1% сахара или сахарного спирта (например, сахарозы, трегалозы или маннита).

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению также могут содержать буфер или буферную систему, которая имеет целью поддержание стабильного уровня рН и помощь в стабилизации антитела к ПЬЬ4 человека. В некоторых вариантах осуществления под "стабилизацией" подразумевается, что по меньшей мере 94% антитела имеет нативную конформацию по данным эксклюзионной хроматографии после хранения раствора, содержащего антитело и буфер, при температуре около 45°С в течение до около 28 суток. Под "нативным состоянием" или "нативной конформацией" подразумевается неагрегированная и нефрагментированная доля антитела. Ее обычно определяют путем анализа с измерением относительного размера фрагмента антитела, такого как анализ методом эксклюзионной хроматографии. Фракция неагрегированного и нераспавшегося антитела в элюате равна нативному антителу и обычно является основной фракцией элюирования. Фракция агрегированного антитела в элюате означает больший размер, чем нативное антитело. Фракция фрагментированного антитела означает меньший размер, чем нативное антитело.

В некоторых вариантах осуществления под "стабилизацией" подразумевается, что по меньшей мере 45% антитела сохраняет свою главную зарядовую форму по данным катионообменной хроматографии после хранения раствора, содержащего антитело и буфер, при температуре около 45°С в течение до около 28 суток. Под "главным зарядом" или "главной зарядовой формой" подразумевается фракция антитела, которая элюируется с ионообменной смолы в главном пике, с одной стороны от которого находятся более "основные" пики, а с другой стороны - более "кислотные" пики. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут иметь рН от около 5,5 до около 6,5. Например, композиции согласно настоящему изобретению могут иметь рН около 5,5; около 5,6; около 5,7; около 5,8; около 5,9; около 6,0; около 6,1; около 6,2; около 6,3; около 6,4; или около 6,5. В некоторых вариантах осуществления рН составляет 6,0 ± 0,5; 6,0 ± 0,4; 6,0 ± 0,3; 6,0 ±0,2; 6,0± 0,1; около 6,0; или 6,0.

В некоторых вариантах осуществления буфер или буферная система содержит по меньшей мере один буфер с рабочим диапазоном рН, полностью или частично перекрывающем интервал 5,5-7,4, такой как, например, буфер с рабочим диапазоном рН от 4,8 до 8,8. В одном из вариантов осуществления буфер имеет рКа около 7,21. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления фосфат содержится в концентрации от 5 мМ ± 0,75 мМ до 15 мМ ± 2,25 мМ; от 6 мМ ± 0,9 мМ до 14 мМ ± 2,1 мМ; от 7 мМ ± 1,05 мМ до 13 мМ ± 1,95 мМ; от 8 мМ ± 1,2 мМ до 12 мМ ± 1,8 мМ; от 9 мМ ± 1,35 мМ до 11 мМ ± 1,65 мМ; 10 мМ ± 1,5 мМ или около 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферная система содержит фосфат в концентрации 10 мМ ±1,5 мМ при рН 6,0 ± 0,5.

Примеры композиций

Согласно одной из особенностей настоящего изобретения жидкая фармацевтическая композиция имеет низкую вязкость (т.е. менее 10 сП или около 1,5 сП), осмотическую концентрацию раствора от 600 до 700 мОсм или около 650 мОсм; и содержит (ί) антитело человека, которое специфически связывает ПЬЬ4 человека (например, ΚΕΟΝ421), в концентрации 25 мг/мл ± 3,75 мг/мл или 50 мг/мл ± 7,5 мг/мл; (ίί) буферную систему, действующую при рН около 6,0 ± 0,5; (ίίί) термостабилизатор, содержащий сахар и соль; и (ίν) органический сорастворитель.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция содержит (ί) антитело к 1дО1 человека, которое специфически связывает ПЬЬ4 человека и содержит замещенную вариабельную область тяжелой цепи типа 1ОНУ3-33 и замещенную вариабельную область легкой цепи типа 1ОКУ3-11, в концентрации 20 ± 3 мг/мл до 60 ± 9 мг/мл; (ίί) фосфатный буфер, который действует при рН 6,0 ± 0,5; (ίίί) сахарозу и хлорид натрия; и (ίν) неионный детергент, такой как полисорбат.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция содержит (ί) антитело к 1дО1 человека, которое специфически связывает ПЬЬ4 человека и содержит НСГОР1 с последовательностью 8ЕС ГО ΝΟ: 2, НСГОР2 с последовательностью 5>ЕС ГО ΝΟ: 3, НСГОР3 с последовательностью 5>ЕС ГО ΝΟ: 4, БСГОР1 с последовательностью δ ЕС ГО ΝΟ: 6, ЕСГОВ2 с последовательностью 5>ЕС ГО ΝΟ: 7 и ЕСГОР3 с последовательностью 5>ЕС ГО ΝΟ: 8, в концентрации 25 мг/мл ± 3,75 мг/мл; (ίί) 10 мМ ± 1,5 мМ фосфата с рН 6,0 ± 0,5; (ίίί) 10% ± 1,5% сахарозы; (ίν) 150 мМ ± 22,5 мМ хлорида натрия; и (ν) 0,2% ± 0,03% полисорбата 20.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция содержит (ί) антитело к 1дО1

- 7 029779

человека, которое специфически связывает ОЬЬ4 человека и содержит НСГОЕ1 с последовательностью 8ЕО ГО N0: 2, НСИК.2 с последовательностью 8Еф ГО N0: 3, НСИК.3 с последовательностью 8Еф ГО N0: 4, БСГОГО с последовательностью 8Еф ГО N0: 6, ЬСИК.2 с последовательностью 8Еф ГО N0: 7 и Б-СГОКЗ с последовательностью 8Еф ГО N0: 8, в концентрации 50 мг/мл ± 7,5 мг/мл; (ίί) 10 мМ ± 1,5 мМ фосфата с рН 6,0 ± 0,5; (ίίί) 10% ± 1,5% сахарозы; (ίν) 150 мМ ± 22,5 мМ хлориды натрия; и (ν) 0,2% ± 0,03% полисорбата 20.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция содержит (ί) антитело к 1дС1 человека, которое специфически связывает НЬЬ4 человека и содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью 8Еф ГО N0: 1 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью 8Еф ГО N0: 5, в концентрации 25 мг/мл ± 3,75 мг/мл; (ίί) 10 мМ ±1,5 мМ фосфата при рН 6,0 ± 0,5; (ίίί) 10% ± 1,5% сахарозы; (ίν) 150 мМ ± 22,5 мМ хлорида натрия; и (ίν) 0,2% ± 0,03% полисорбата 20.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция содержит (ί) антитело к 1§С1 человека, которое специфически связывает НЬЬ4 человека и содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью 8Еф ГО N0: 1 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью 8Еф ГО N0: 5, в концентрации 50 мг/мл ± 7,5 мг/мл; (ίί) 10 мМ ± 1,5 мМ фосфата с рН 6,0 ± 0,5; (ίίί) 10% ± 1,5% сахарозы; (ίν) 150 мМ ± 22,5 мМ хлорида натрия; и (ν) 0,2% ± 0,03% полисорбата 20.

Дополнительные неограничивающие примеры фармацевтических композиций, входящих в объем настоящего изобретения приведены в других местах описания, включая представленные далее Примеры. Стабильность и вязкость фармацевтических композиций

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению обычно демонстрируют высокие уровни стабильности. Термин "стабильный", используемый применительно к фармацевтическим композициям, означает, что антитела в фармацевтических композициях в приемлемой степени сохраняют свою химическую структуру или биологическую функцию после хранения в заданных условиях. Композиция может являться стабильной, даже если содержащееся в ней антитело не сохраняет на 100% свою химическую структуру или биологическую функцию после хранения в течение заданного времени. В некоторых условиях "стабильным" может считаться сохранение по меньшей мере около 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% структуры или функции антитела после хранения в течение заданного времени. Стабильность может измеряться в числе прочего путем определения выраженной в процентах нативного состояния антитела, которое сохраняется в композиции после хранения в течение заданного времени при заданной температуре. Процент нативного состояния антитела может определяться в числе прочего методом эксклюзионной хроматографии (например, эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии [ЭВЭЖХ]), при этом нативный означает неагрегированный и нефрагментированный. Используемый оборот "приемлемая степень стабильности" означает, что после хранения композиции в течение заданного времени при заданной температуре в ней может быть обнаружено по меньшей мере 90% антитела в нативной форме. В некоторых вариантах осуществления после хранения композиции в течение заданного времени при заданной температуре в ней может быть обнаружено по меньшей мере около 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% антитела в нативной форме. Заданное время, по истечении которого измеряется стабильность, может составлять по меньшей мере 14 суток, по меньшей мере 28 суток, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяца или более. Заданной температурой, при которой может храниться фармацевтическая композиция, стабильность которой оценивается, может являться любая температура от около -80°С до около 45°С, например, около -80°С, около -30°С, около -20°С, около 0°С, около 4°-8°С, около 5°С. Фармацевтическая композиция может подергаться термическому стрессу с целью оценки ее стабильности. Термический стресс включает, например, хранение композиции в течение около 14 суток или около 28 суток при температуре около 25°С, около 35°С, около 37°С или около 45°С.

Например, фармацевтическая композиция может считаться стабильной, если через 6 месяцев хранения при 5°С по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% антитела, обнаруженного методом ЭВЭЖХ, является нативным (т.е. содержится в нативной пиковой фракции). Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 6 месяцев хранения при 25°С по меньшей мере 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% антитела, обнаруженного методом ЭВЭЖХ, является нативным. Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 28 суток хранения при 37°С, по меньшей мере 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% антитела, обнаруженного методом ЭВЭЖХ, является нативным. Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 28 суток хранения при 45°С по меньшей мере 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% антитела, обнаруженного методом ЭВЭЖХ, является нативным. Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 6 месяцев хранения при -20°С по меньшей мере 98,5%, 99% или 99,5% антитела, обнаруженного методом ЭВЭЖХ, является нативным. Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 18 месяцев хранения при -30°С

- 8 029779

по меньшей мере 99% или 99,5% антитела, обнаруженного методом ЭВЭЖХ, является нативным. Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 6 месяцев хранения при -80°С по меньшей мере 99% или 99,5% антитела, обнаруженного методом ЭВЭЖХ, является нативным.

Стабильность может измеряться в числе прочего путем определения выраженного в процентах количества антитела, которое мигрирует в главную фракцию ("главную зарядовую форму") во время ионного обмена, относительно общей комбинированной площади пика, при этом стабильность пропорциональна фракции антитела в главной зарядовой форме. Вне связи с теорией в результате деамидирования антитело становится более отрицательно заряженным и тем самым более кислотным по сравнению с не деамидированным антителом (см., например, КоЪшкои, Ν., Рго1еш деамидирование, ΡΝΑ8, Аргй 16, 2002, 99(8):5283-5288). Используемый оборот "приемлемая степень стабильности" означает, что после хранения композиции в течение заданного времени при заданной температуре по меньшей мере 53% обнаруженного антитела находится в главной зарядовой форме. В некоторых вариантах осуществления приемлемая степень стабильности означает, что после хранения в течение заданного времени при заданной температуре или в условиях термического стресса, стрессового замораживания/оттаивания или стрессового взбалтывания в главной зарядовой форме может быть обнаружено по меньшей мере около 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% антитела. Заданное время, по истечении которого измеряется стабильность, может составлять по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 28 суток, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяца или более. Заданной температурой, при которой может храниться фармацевтическая композиция, стабильность которой оценивается, может являться любая температура от около 80°С до около 45°С, например, около -80°С, около -30°С, около -20°С, около 0°С, около 4°-8°С, около 5°С, около 25°С, около 37°С, или около 45°С. Например, фармацевтическая композиция может считаться стабильной, если через три месяца хранения при -80°С, -30°С или -20°С не менее около 57%, 58%, 59%, 60% или 61% антитела находится в главной зарядовой форме. Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 6 месяцев хранения при 5°С не менее около 59%, 59,1%, 59,2%, 59,3%, 59,4%, 59,5%, 59,6%, 59,7%, 59,8%, 59,9%, 60%, 60,1%, 60,2%, 60,3%, 60,4%, 60,5%, 60,6%, 60,7%, 60,8%, 60,9%, 61% или 61,1% антитела находится в главной зарядовой форме. Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 6 месяцев хранения при 25°С не менее около 53% антитела находится в главной зарядовой форме. Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 28 суток хранения при 37°С не менее около 50%, 50,5%, 51% или 51,5% антитела находится в главной зарядовой форме. Фармацевтическая композиция также может считаться стабильной, если через 28 суток хранения при 45°С в главной зарядовой форме может быть обнаружено не менее около 45%, 45,1%, 45,2%, 45,3%, 45,4%, 45,5%, 45,6%, 45,7%, 45,8%, 45,9% или 50% антитела.

Для оценки стабильности также может использоваться измерение сродства антитела к связыванию его мишени. Например, композиция согласно настоящему изобретению может считаться стабильной, если после хранения, например, при -80°С, -30°С, -20°С, 5°С, 25°С, 37°С, 45°С и т.д. в течение заданного времени (например, от 14 суток до 24 месяцев) антитело к ПЬЬ4, содержащееся в композиции, сохраняет по меньшей мере от 50% и до около 150% активности в пересчете на сродство антитела к связыванию до хранения. Сродство к связыванию может определяться, например, методом ЕЫ8А или плазменного резонанса. Биологическая активность может определяться путем анализа активности ПЬЬ4, такого как, например, путем введения клетки, которая экспрессирует ΌΚΕ4, в контакт с композицией, содержащей антитело к ΌΚΕ4. Может непосредственно измеряться, например, путем анализа РАС8 связывание антителом такой клетки. В качестве альтернативы, может измеряться последующая активность сигнального пути ΟΡΓ4/ΝοΚΐι в присутствии антитела и сравниваться с активностью сигнального пути ПЬЬ4/№э1сЬ при отсутствии антитела. В некоторых вариантах осуществления может ΌΚΕ4 являться эндогенным по отношению к клетке. В других вариантах осуществления ПЬЬ4 может эктопически (гетерологично) экспрессировать в клетке.

Дополнительные способы оценки стабильности антитела в композиции проиллюстрированы далее в Примерах. Емкости и способы введения

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержаться в любой емкости, применимой для хранения или введения лекарств и других лекарственных композиций. Например, фармацевтические композиции могут содержаться в герметичном и стерилизованном пластмассовом или стеклянном контейнере заданного объема, таком как пробирка, ампула, шприц, картридж, бутылка или капельница для внутривенного вливания. Для композиций согласно настоящему изобретению могут использоваться пробирки различных типов, включая, например, пробирки из прозрачного и матового (например, желтого) стекла или пластмассы. Аналогичным образом, для хранения или введения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению может использоваться шприц любого типа. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержаться в шприцах "со стандартным содержанием вольфрама" или "с низким содержанием вольфрама". Как известно специали- 9 029779

стам в данной области техники, изготовление стеклянных шприцев обычно связано с использованием горячего вольфрамового стержня, которым прокалывают стекло и тем самым создают отверстие, через которое в шприц могут втягиваться жидкости и выпускаться из него. В результате, на внутренней поверхности шприца осаждаются микроколичества вольфрама. Для уменьшения содержания вольфрама в шприце может использоваться последующее промывание и другие технологические операции. Используемый термин "со стандартным содержанием вольфрама" означает, что содержание вольфрама в шприце составляет 500 частей на миллиард (частей/млрд) или более. Термин "с низким содержанием вольфрама" означает, что содержание вольфрама в шприце составляет менее 500 частей/млрд. Например, шприц с низким содержанием вольфрама согласно настоящему изобретению может иметь содержание вольфрама менее около 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 390, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 частей/млрд или менее.

На резиновые плунжеры, используемые в шприцах, и резиновые пробки, используемые, чтобы закрывать отверстия флаконов, может наноситься покрытие во избежание загрязнения лекарственного содержимого шприца или флакон или для сохранения его стабильности. Так, в некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержаться в шприце, который содержит плунжер с покрытием, или во флаконе, укупоренном резиновой пробкой с покрытием. Например, плунжер или пробка может быть покрыта фторуглеродной пленкой. Примеры пробок или плунжеров с покрытием, применимых во флаконах и шприцах, содержащих фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, приведены, например, в патентах И8 4997423, 5908686, 6286699, 6645635 и 7226554. В частности, примеры пробок или плунжеров с покрытием, которые могут использоваться в контексте настоящего изобретения, предлагаются на рынке под торговым наименованием ИитоТее® компанией \Уе81 РЬаттасеийса1 8сгуюс5. 1пс. (Лайонвилл, шт. Пенсильвания, США). ИитоТес® служит примером фторуглеродного покрытия, используемого, чтобы свести к минимуму или предотвратить контакт лекарственного продукта с резиновыми поверхностями.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, фармацевтические композиции могут содержаться в шприце с низким содержанием вольфрама, содержащем плунжер с фторуглеродным покрытием.

Фармацевтические композиции могут вводиться пациенту парентеральными способами, такими как инъекция (например, подкожная, внутривенная, внутримышечная, внутрибрюшинная и т.д.), или чрескожным, чресслизистым, назальным, пульмональным или пероральным путями. Для подкожной доставки фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению может использоваться множество шприцев-ручек или автоинжекторов многоразового использования. Их примеры включают без ограничения ΑυΤΟΡΕΝ™ (О\\'еп МитГотй, 1пс., Вудсток, Великобритания), ΌΙ8ΕΤΚΌΝΙΟ™ (ОЕеЦошс МеФса1 8у51ет5, Бергдорф, Швейцария), НиМАЬОС ΜΙΧ 75/25™, НиМАЬОС™, 11ЕМАЕ1Х 70/30™ (Ε1ί ЬШу апй Со., Индианаполис, шт. Индиана), ΝΟνΟΡΕΝ™ I, II и III (Νονο ΝοΓάίΑ Копенгаген, Дания), ΝΟνΟΡΕΝ ^ΜΟΚ™ (Nονο ШгйВк. Копенгаген, Дания), ΒΌ™ (Вес1оп Эюкнъоп. Франклин Лейке, шт. Нью-Джерси, США), ΟΡΤΊΡΕΝ™, ΟΡΤΊΡΕΝ ΡΚΟ™, ΟΡΤΊΡΕΝ 8ΤΑΗΙ.ΗΤ™ и ΟΡΤΙίΈΙΙΚ™ (8апойΑνеηύδ, Франкфурт, Германия). Примеры шприцев-ручек или автоинжекторов одноразового использования, применимых для подкожной доставки фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, включают без ограничения 8ΟΕΟ8ΤΑΚ™ (8апоП-А\'епЕ8). ΡΕΕΧΡΕΝ™ (Nονο ШгШзк). К\УП<ΡΕΝ™ (Ε1Ϊ ЬШу), 8ЕННСЕ1СК ™ (Атдеп, Саузенд Оукс, шт. Калифорния, США), ΡΕΝΕΕΤ™ (На8е1те1ег, Штутгарт, Германия), ΕΡΡΕΝ (Эеу, Ε.Ρ.) и НиМГОА™ Ρеп (АЬЬой ЬаЬ8, Эббот Парк, шт. Иллинойс, США). Также предусмотрено применение микроинфузора для доставки фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Используемый термин "микроинфузор" означает средство подкожной доставки, рассчитанное на медленное введение больших объемов (например, до около 2,5 мл или более) терапевтической композиция в течение длительного времени (например, около 10, 15, 20, 25, 30 мин или более). Смотри, например, патенты и8 6629949, и8 6659982 и Меекап и др., 1. СоШго11е4 Ке1еа8е 46:107-116 (1996). Микроинфузоры особо применимы для доставки больших доз лекарственных белков, содержащихся в высокой концентрации (например, около 100, 125, 150, 175, 200 мг/мл или более) или вязких растворов. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция вводится посредством капельницы для внутривенного вливания, при этом композиция разбавляется в капельнице, содержащей физиологически приемлемый раствор. В одном из вариантов осуществления фармацевтической композицией является составной стерильный препарат в капельнице для внутривенного вливания, при этом разовая доза лекарственного вещества разбавлена в 100 мл, 250 мл (или другом аналогичном количестве, применимом для доставки путем внутривенного капельного вливания) физиологического буфера (например, 0,9% солевого раствора). В некоторых вариантах осуществления капельница для вливания изготовлен из поливинилхлорида (например, ν^ΡΡΕΧ, Вах1ет, Дирфилд, шт. Иллинойс, США). В некоторых вариантах осуществления капельница для вливания изготовлена из полиолефина (ΕΧΟΕΡ, Вгаип МеФса1 йю.. Бетлехем, шт. Пенсильвания, США). Применение фармацевтических композиций в терапевтических целях Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению применимы среди прочего для лечения, предотвращения или облегчения любого заболевания или нарушения, связанного с

- 10 029779

активностью ОЬЬ4, включая заболевания или нарушения, опосредованный сигнальным путем ОЬЬ4 или ΝοΚίι. Неограничивающие примеры заболеваний и нарушений, лечение или предотвращение которых может осуществляться путем введения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, включают различные заболевания, которым сопутствует ангиогенез, являющийся биологическим процессом, посредством которого формируются кровеносные сосуды. Аберрантный ангиогенез сопутствует различным болезненным состояниям, включая, например, пролиферативные ретинопатии, ревматоидный артрит и псориаз. Кроме того, хорошо известно, что ангиогенез имеет решающее значение для роста и существования опухоли.

Примеры

Следующие далее примеры приведены с целью обеспечения для специалистов в данной области техники полного представления и описания того, как изготавливаются композиции и применяются способы согласно изобретению, и не имеют целью ограничить объем предполагаемого изобретения. Несмотря на меры, предпринятые с целью обеспечения точности в цифрах (например, количествах, показателях температуры и т.д.), следует учитывать возможные экспериментальные погрешности и отклонения. Если не указано иное, долями являются молярные доли, молекулярной массой является средняя молекулярная масса, процентная концентрация (%) означает массу растворенного вещества в граммах, деленную на объем раствора в миллилитрах и умноженную на 100% (например, 10% сахарозы означает 0,1 грамм сахарозы на миллилитр раствора), температура указана в градусах Цельсия, а давлением является атмосферное или близкое к атмосферному давление.

Первоначальные работы по созданию композиции включали скрининг органических сорастворителей, термостабилизаторов и буферов в жидких и лиофилизированных композиций антитела к ПЬЬ4 с целью определения наполнителей, совместимых с белком и повышающих его стабильность с сохранением близкой к физиологической осмотической концентрации раствора и низкой вязкости для внутривенной и подкожной инъекции. Были также исследованы буферные условия с целью определения оптимального значения рН при максимальной стабильности белка.

Пример 1. Пример композиции антитела к 0БС4

Работы по созданию композиции включали скрининг буферов, органических сорастворителей и термостабилизаторов в жидких композициях антитела к ПЬЬ4 с целью определения наполнителей, повышающих стабильность белка. Были также исследованы буферные условия с целью определения оптимального значения рН при максимальной стабильности белка. Полученные результаты этих исследований были использованы для создания стабильной жидкой композиции, применимой в клинических целях. Концентрация антитела к ОБЕ· 4 (ΚΕΟΝ421) в композиции составляет 25 ± 3,75 мг/мл или 50 ± 7,5 мг/мл. В одном из вариантов осуществления в композиции антитела к ПЬЬ4 содержится 10 ± 1,5 мМ фосфата (рН 6,0 ± 0,5), 0,2% ± 0,03% полисорбата 20, 10% ± 1,5% сахарозы и 150 мМ ± 22,5 мМ хлорида натрия. Фосфатный буфер, представляющий собой сочетание одноосновного фосфата и двухосновного фосфата, выбран с учетом его буферной способности при значении рН, оптимальном для стабилизации антитела к ПЬЬ4 и снижения скорости агрегирования. Оптимальная стабильность антитела ΚΕΟΝ421 к ПЬЬ4 с наименьшей скоростью агрегирования и образования вариантов заряда наблюдалась при рН 6,0. В качестве стабилизатора взбалтывания выбран полисорбат 20, снижающий скорость агрегирования и осаждения при взбалтывании антитела или другом небрежном обращении. В качестве одного из компонентов термостабилизатора выбрана сахароза, снижающая согласно наблюдениям скорость агрегирования антитела в растворе. В качестве другого компонента термостабилизатора выбран хлорид натрия, уменьшающий согласно наблюдениям образование заряженных частиц антитела в растворе.

Пример 2. Методика исследования стабильности к стрессовым воздействиям

В ходе исследований с целью оценки физической стабильности композиции антитела к ПЬЬ4 определяли оптическую плотность (на волне 405 нм) и использовали обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФВЭЖХ). Физическая стабильность определяется путем восстановления растворимых форм антитела в растворе. Потери антитела могут являться следствием осаждения или адсорбции. Присутствие твердых частиц может обнаруживаться путем визуального контроля или определения оптической плотности (ОП) на волне 405 нм (определения мутности), при этом увеличение ОП говорит об увеличении мутности вследствие образования твердых частиц. Присутствие твердых частиц, определенное визуально или путем определения ОП, говорит о том, что образец не сохраняет стабильность. Определили восстановление антитела к ПЬЬ4 путем ОФВЭЖХ или УФ-спектрофотометрии на волне 280 нм. Определили концентрации каждого образца для испытаний на основании площади пика элюированного антитела в сравнении со стандартной кривой, генерированной с использованием антитела в заданной концентрации.

Использовали эксклюзионную ВЭЖХ (ЭВЭЖХ), чтобы оценить степень чистоты антитела к ПЬЬ4 и определить показатель относительных количеств агрегатов, фрагментов и примесей антитела, отличающихся размерами молекул от исследуемого антитела к ПЬЬ4. У элюированнного очищенного антитела к ПЬЬ4 в целом наблюдался небольшой пик агрегирования и большой нативный димерный пик, за которым следовал небольшой низкомолекулярный пик. В этих целях использовали эксклюзионную ко- 11 029779

лонну высокого разрешения на силикатной основе и буфер на основе фосфата и хлорида натрия. Зарегистрировали спектральную поглощательную способность на волне 215 нм, которую использовали для определения степени чистоты. Для определения степени чистоты антитела к 0ББ4 путем ЭВЭЖХ требовалось, чтобы площадь главного пика составляла >90,0% общей площади пика. Общие площади низкомолекулярных и высокомолекулярных пиков в процентах приведены в таблицах. Подвергли анализу варианты заряда антитела путем катионообменной хроматографии с использованием катионообменной колонны со слабым обменным взаимодействием производства компании Όίοηθχ (РКОРАС® \УСХ-10. 4x250 мм) при пологом градиенте солености в фосфатном буфере с рН 6,0 (от 40 мМ до 120 мМ ЫаС1 в течение 44 мин со скоростью 1 мл/мин). Зарегистрировали спектральную поглощательную способность на волне 215 нм, которую использовали для оценки неоднородности заряда. Разделили хроматограммы антитела к НЬЬ4 на основании пиков на три большие зарядовые группы: кислотную, главную и основную. Первую группы пиков, полученную при элюировании, назвали кислотной (что определили путем анализа вещества, подвергнутого воздействию высоких рН и температуры). Наибольший пик на хроматограмме назвали как главным пиком, главной зарядовой формой или главным вариантом заряда. Последнюю группу пиков назвали основной. Название дано на основании длительного времени удержания в колонне, вероятно, вследствие высокого уровня положительного заряда. Сравнили схему пиков образца антитела для испытаний со схемой пиков эталона, и определили площади пиков кислотного, главного и основного типов.

Оценили активность или эффективность антитела к НЬЬ4 путем анализа связывания. Определили способность антитела блокировать связывание Ыо1еЫ биотинилированным ЬНЬЬ4-№е методом специфического и чувствительного твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Путем ЕЬ18А измерили количество несвязанного биотинилированного ЬНЕЕ4-ЬЕе в растворе, состоящем из смеси биотинилированного ШЕЕ4-№е и антитела к НЬЬ4. Поместили смесь на титрационные микропланшеты, покрытые Ыо1еЫ человека. Титрировали фиксированное количество биотинилированного ШЕЕ4-№е с использованием различных количеств антитела; и смыли комплекс антитела и биотинилированного ШЕЕ4-№е. Определили остающееся количество связанного биотинилированного ЬНЕЕ4-ЬЕе на планшете с использованием стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (ИКР). Сравнили проанализированные образцы с эталоном, чтобы определить относительную эффективность. Для этого использовали колориметрические субстраты из НКР, и измерили ОП на волне 450 нм. Нанесли значения ОП на волне 450 нм на график в зависимости от концентраций антитела в растворах, и определили 1С₅₀ методом анализа нелинейной регрессии. Определили 1С₅₀ как концентрацию антитела, необходимую для блокирования 50% максимального связывания биотинилированным ЬНЕЕ4-ЬЕе покрытых 1ιΝοΙο1ι1-1ιΡο планшетов, что отражает блокирующую эффективность антитела к ЬНЕЬ4. Определили эффективность путем сравнения с эталонным образцом, помещенным на такой же планшет, и выразили ее в процентах эталонного значения 1С₅₀.

Пример 3

Буфер и рН

Изучили влияние рН и буфера стабильность антитела к НЬЬ4. Наибольшей стабильность обладало антитело ΚΕΟΝ421 ("ΚΕΟΝ421") в композиции с 10 мМ фосфатного буфера или 10 мМ гистидинового буфера. Фосфат был выбран в качестве буфера для композиции с учетом потенциального риска окисления гистидина при хранении в жидком виде. Смесь одноосновного фосфата и двухосновного фосфата обеспечивает рН 6,0 при добавлении всех наполнителей вместе с антителом ΡΕΟΝ421. Анализ забуференного ΡΕΟΝ421, инкубированного при повышенных температурах, показал, что главными путями распада белка являлось образование агрегатов, продуктов распада и вариантов заряда. Соответственно, чтобы оценить влияние рН и буфер на стабильность ΚΕΟΝ421, инкубировали образцы ΚΕΟΝ421 для испытаний при 45°С в различных буферах со значениями рН от 5,0 до 8,0 с целью определения условий, в которых повышается термостабильность белка (табл. 1). По данным как ЭВЭЖХ, так и катионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (КОВЭЖХ) ΡΕΟΝ421 имел максимальную стабильность при использовании в композиции с рН 6,0. ΡΕΟΝ421 имел более высокую стабильность в композиции с фосфатным или гистидиновым буфером с рН 6,0, чем в композиции с сукцинатным или цитратным буфером с рН 6,0. Фосфат был выбран для композиции ΡΕΟΝ421 с учетом потенциального риска окисления гистидина при хранении в жидком виде. Чтобы получить показанные в табл. 1 результаты, выдержали 0,3 мл ΡΕΟΝ421 в концентрации 25 мг/мл в 10 мМ эталонном буфере, содержащем 0,2% полисорбата 20 в 2-мл флаконе из боросиликатного стекла типа 1 с пробкой из покрытого ИигоТее® бутилкаучука 4432/50, в течение 28 суток при 45°С. Определили помутнение раствора с изменением ОП₄₀₅ относительно исходного вещества. Показатели исходного вещества отображают средние показатели исходного вещества для всех 14 композиций. ОП = оптическая плотность; ОФВЭЖХ = обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ЭВЭЖХ = эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография; КОВЭЖХ = катионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография.

- 12 029779

Таблица 1. Влияние буфера и рН на стабильность ΚΕΟΝ421, инкубированного при 45°С в течение 28 суток

Буфер и рН	Внешний вид	Мутность	% всего восстановленного ΚΕΟΝ421 (ОФВЭЖХ)	% восстановленного нативного ΚΕΟΝ421 (ЭВЭЖХ)	% восстановленного нативного ΚΕΟΝ421 (КОВЭЖХ)
(ОП волне нм)	на 405
Исходное вещество* (без инкубации при 45°С)	Удовл.	0,00	100	97,6	58,5
рН 8.0, трис	Не удовл.	0,30	107	85,6	21,0
рН 8.0, фосфат	Не удовл.	0,27	100	65,7	5,6
рН 7,5, фосфат	Не удовл.	0,12	104	80,1	14,6
рН 7.0, фосфат	Не удовл.	0,03	104	83,4	24,9
рН 6.5, фосфат	Удовл.	0,00	100	93,1	35,3
рН 6,0, фосфат	Удовл.	0,00	104	93,9	38,3
рН 6,0, гистидин	Удовл.	0,00	103	94,4	41,6
рН 6,0, сукцинат	Удовл.	0,01	102	92,3	40,7
рН 6,0, цитрат	Удовл.	0,01	99	92,4	36,7
рН 5,5, цитрат	Не удовл.	0,01	105	91Д	34,6
рН 5,0, цитрат	Не удовл.	0,02	103	86,7	26,9
рН 5,0, ацетат	Удовл.	0,01	107	92,3	34,6

Пример 4. Выбор средств защиты от стрессового взбалтывания

Использовали в качестве органического сорастворителя 0,2% полисорбата 20, поскольку он стабилизировал ΚΕΟΝ421 при его взбалтывании в жидком состоянии. Проведенные сначала исследования с целью контроля стабильности ΚΕΟΝ421 после взбалтывания при отсутствии органических сорастворителей, дали изменчивые результаты. По данным одного из конкретных исследований путем ЭВЭЖХ агрегирование ΚΕΟΝ421 увеличилось после взбалтывания, но в большей части остальных исследований не наблюдалось существенного увеличения агрегирования ΚΕΟΝ421 после взбалтывания. В табл. 2 приведены результаты двух репрезентативных исследований стабильности. Тем менее, был применен консервативный подход с добавлением полисорбата 20 в композицию ΚΕΟΝ421, чтобы предотвратить потенциальную нестабильность белка в зависимости от взбалтывания, которое может происходить в процессе изготовления, транспортировки и обращения с ΚΕΟΝ421. Предпочтение среди других органических сорастворителей было отдано полисорбату 20, поскольку он не изменяет термостабильность ΚΕΟΝ421. Чтобы получить показанные в табл. 2 результаты исследования стабильности антитела, смешали в 2-мл флаконе из боросиликатного стекла типа 1 с пробкой из покрытого ПигоТее® бутилкаучука 4432/50 0,3 мл ΚΕΟΝ421 в концентрации 25 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере с рН 6,0 с органическими сорастворителями и встряхивали в течение 120 мин. Определили помутнение раствора с изменением ОП₄₀₅ относительно исходного вещества. Показатели исходного вещества отображают средние показатели исходного вещества для всех пте композиции. ОП = оптическая плотность; ОФВЭЖХ = обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ЭВЭЖХ = эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография.

- 13 029779

Таблица 2. Влияние органических сорастворителей на стабильность антитела при взбалтывании

Органический	Стресс	Внешний	% всего	%	%
сорастворитель		вид	восстановленного ΚΕΟΝ421 (ОФВЭЖХ)	восстановленного нативного ΚΕΟΝ421 (ЭВЭЖХ)	восстановленного агрегата ΚΕΟΝ421 (ЭВЭЖХ)
Исходное вещество*	Нет	Удовл.	100	96,6	1,5
Без сорастворителя	Вихревой поток 120 мин	Удовл.	101	94,9	3,0
Исходное вещество*	Нет	Удовл.	100	97,8	0,7
Без сорастворителя	Вихревой поток 120 мин	Удовл.	101	97,4	0,9
0,2% Полисорбат 20	Вихревой поток 120 мин	Удовл.	99	98,0	0,7
0,2% Полисорбат 80	Вихревой поток 120 мин	Удовл.	100	97,9	0,8
0,2% ПЭГ 3350	Вихревой поток 120 мин	Удовл.	101	98,0	0,7

Пример 5. Выбор средств защиты от термического стресса

Исследовали способность стабилизаторов, таких как сахара, аминокислоты и неорганические соли, повышать термостабильность ΚΕΟΝ421. В табл. 3 указаны термостабилизаторы, которые были исследованы. У композиций, содержащих сахарозу и трегалозу, наблюдалось наименьшее образование агрегатов ΚΕΟΝ421 по данным ЭВЭЖХ. При добавлении хлорида натрия в композицию уменьшалось образование вариантов заряда (КОВЭЖХ), но увеличивалось образование агрегатов (ЭВЭЖХ). Было проведено последующее исследование с целью изучения термостабильности композиции ΚΕΟΝ421 в сочетании с 10% сахарозы и 150 мМ хлорида натрия (\аС1). Задачей этого являлось уменьшение вызванного \аС1 агрегирования путем включения сахарозы в композицию и тем самым сохранения эффекта ИаС1, защищающего композицию от образования вариантов заряда. Снизили концентрацию сахарозы с 20% (без \аС1) до 10% (с ЮаС1) с целью регулирования осмотической концентрации раствора композиции. По данным КОВЭЖХ ΚΕΟΝ421 в этой композиции имел такую же термостабильность (образование вариантов заряда), как и при использовании \аС1 в качестве единственного стабилизатора (табл. 3), что доказывает эффект №С1, защищающий от образования вариантов заряда. Кроме того, скорость образования агрегатов значительно снизилась по сравнению с композицией, в которой \аС1 используется в качестве единственного стабилизатора, что доказывает стабилизирующий эффект сахарозы в композиции. На основании этих результатов использовали композицию ΚΕΟΝ421 в сочетании с 10% сахарозы и 150 мМ №С1. Чтобы получить показанные в табл. 3 результаты исследования стабильности антитела, выдержали 0,3 мл 10 мМ фосфата с рН 6,0, 0,2% полисорбата 20 и ΚΕΟΝ421 в концентрации 25 мг/мл плюс указанный термостабилизатор в 2-мл флаконе из боросиликатного стекла типа 1 с пробкой из покрытого ИигоТес® бутилкаучука 4432/50 в течение 28 суток при 45°С. Определили помутнение раствора с изменением ОП405 относительно исходного вещества. Показатели исходного вещества отображают средние показатели исходного вещества для всех десяти композиции, не инкубированных при 45°С. ОП = оптическая плотность; ОФ = обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; Э = эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография; КО = катионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография.

- 14 029779

Таблица 3. Влияние термостабилизаторов на стабильность

Термостабилизато Р	Внешни й вид	Мутност ь (ОП на волне 405 нм)	% всего восстановленног 0ΚΕΟΝ421 (ОФВЭЖХ)	восстановленног о нативного ΚΕΟΝ421 (ЭВЭЖХ)	восстановленног о агрегата ΚΕΟΝ421 (ЭВЭЖХ)	восстановленног о нативного ΚΕΟΝ421 (КОВЭЖХ)
Исходное вещество* (без инкубации при45°С)	Удовл.	0,00	100	97,7	1,о	58,4
Без термостабилизато ра	Не удовл.	0,00	100	94,0	2,0	41,0
150 мМИаС1	Удовл.	0,01	100	91,4	4,4	44,7
150 мМ ИаС1 +10% сахарозы	Удовл.	0,00	100	94,0	2,1	45,4
20% сахапозы	Удовл.	0,00	98	94,5	1Д	40,8
20% сорбита	Удовл.	0,04	99	92,9	2,6	26,9
10% маннита	Удовл.	0,00	99	93,8	2,0	39,5
20% трегалозы	Удовл.	0,00	99	94,7	1,2	40,2
5% глицерина	Удовл.	0,02	100	85,4	10,9	ΝΡ
3% аргинина	Не удовл.	0,02	100	90,1	5,7	42,7
3% глицина	Удовл.	0,01	106	91,1	5,0	31,9

Пример 6. Исследования стабильности композиции ΚΕΟΝ421 к стрессовым воздействиям Провели ускоренные исследования стабильности ΚΕΟΝ421 к стрессовым воздействиям в условиях

хранения при 25°С в течение 6 месяцев. По данным катионообменной хроматографии (КОВЭЖХ) в этих ускоренных условиях наблюдался сдвиг профиля вариантов заряда в сторону более кислотного типа. По данным денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (8Ό8-ΡΆΟΕ) через 6 месяцев хранения наблюдалось снижение степени чистоты на 2-5%, а по данным ЭВЭЖХ было обнаружено снижение степени чистоты на 1,6% и увеличение на образования высокомолекулярных агрегатов на 1,2%. По данным анализа связывания не обнаружено снижения эффективности ΚΕΟΝ421 через 6 месяцев хранения при 25°С. Дополнительные ускоренные исследования стабильности антитела ΚΕΟΝ421 к стрессовым воздействиям показали, что белок остается физически стабильным после воздействия вихревого потока в течение 60 или 120 мин, после восьми циклов замораживания до -80°С и оттаивании до комнатной температуры, после инкубации при 45°С в течение 28 суток, инкубации при 37°С в течение 28 суток или инкубации при 25°С в течение 28 суток (табл. 4). В ходе этих исследований раствор оставался прозрачным, не наблюдалось потери белка, и не происходило изменения рН после указанных стрессовых воздействий. Тем не менее, путем эксклюзионной ВЭЖХ и катионообменной ВЭЖХ обнаружено снижение степени чистоты ΚΕΟΝ421, когда белок инкубировали при температуре >25°С в течение 28 суток, что говорит о произошедших в ΚΕΟΝ421 изменениях молекулярной массы и вариантов заряда в стрессовых условиях. В случае инкубации при 37°С обнаружен химический распад в меньшей степени, чем при 45°С. ΚΕΟΝ421 оставался физически и химически стабильным в течение 14-суток при 25°С после взбалтывания и циклов замораживания/оттаивания. По данным анализа связывания ИЕЕ4Жо£сЬ не наблюдалось значительного снижения эффективности ни одного из образцов, подвергнутых стрессовому воздействию.

Таблица 4. Стабильность антитела к ΌΕΕ4 в концентрации 25 мг/мл к стрессовым воздействиям

Стрессовое	Инкубация при 25°С	Замораживание /оттаивание
испытание	Без стресса	Взбалтывания	Инкубация при 45°С	Инкубация при 37°С
Длительность	0	60	120	14	28	14	28	14	28	8
стресса	мин	мин	мин	суток	суток	суток	суток	суток	суток	циклов
Внешний вид	Удовл.	Удовл.	Удовл,	Удовл.	Удовл.	Удовл.	Удовл.	Удовл.	Удовл.	Удовл.
Мутность (ОП на волне 405 нм)	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00
рН	5,9	5,9	5,9	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0

- 15 029779

% всего

восстановленного

ΚΕΟΝ421 (ОФВЭЖХ) % восстановленного	100	99	96	96	100	98	100	97	101	99
нативного ΚΕΟΝ421 (ЭВЭЖХ) % восстановленною	98,0	97,9	98,0	95,8	94,0	96,9	96,0	97,9	97,7	98,0
нативного ΚΕΟΝ421 (КОВЭЖХ) Анализ связывания	58,4	58,7	59,4	52,2	45,4	55,5	51,5	59,3	57,7	58,8
(%	89	ΝΡ	94	ΝΡ	88	ΝΡ	101	ΝΡ	94	88

относительной

эффективности)

Чтобы получить показанные в табл. 4 результаты исследования стабильности антитела, смешали в 2-мл флаконе из боросиликатного стекла типа 1 с пробкой из покрытого ПигоТес® бутилкаучука 4432/50 0,3 мл 10 мМ гистидина с рН 6,0, 0,2% полисорбата 20, 10% сахарозы, 150 мМ №С1 и Н1Н685Р в концентрации 25 мг/мл с органическими сорастворителями и подвергли различным указанным стрессовым воздействиям. Определили помутнение как относительно изменение ОП на волне 405 нм относительно исходного вещества. Критерий приемлемости для анализа связывания составлял 50-150% эталона. ОП = оптическая плотность; ОФ = обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; Э = эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография; КО = катионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография.

Пример 7. Стабильность композиции антитела к ВЬЬ4 при хранении

По данным УФ-спектрофотометрии или δΌδ-РАСЕ не наблюдалось значительной потери КЕС№21 через 24 месяца хранения при -80°С, -30°С или -20°С. Путем ЭВЭЖХ было обнаружено снижение степени чистоты на 0,8% и увеличение образования агрегатов на 0,4% после хранения при 5°С в течение 24 месяца. По данным КОВЭЖХ не обнаружено значительного изменения вариантов заряда после хранения в течение 24 месяца в условиях испытания. По данным анализа связывания не обнаружено изменения эффективности в конце срока хранения. Через 24 месяца хранения при 5°С КЕС№21 продолжал отвечать критериям приемлемости всех методик анализа. Смотри табл. 5.

Таблица 5. Стабильность КЕС№21 в концентрации 25 мг/мл (10 мМ фосфата при рН 6,0, 0,2% полисорбата 20, 10% сахарозы и , 150 мМ №С1)

Температура/срок	-80°С/24	-30°С/24	-20°С/12	5°С/24
хранения	месяца	месяца	месяцев	месяца
Внешний вид	Удовл.	Удовл.	Удовл.	Удовл.
рН	6,1	6,1	5,9	5,9
Мутность (ОП на волне 405 нм)1	0,00	0,00	0,00	0,00
% всего восстановленного ΚΕΟΝ421 (ОФВЭЖХ)	105	105	99	105
Чистота по данным эксклюзионной ВЭЖХ % чистоты главного пика	99,4	98,8	98,3	97,7
% высокомолекулярного вещества	0,4	0,5	Нет данных	Нет данных
Анализ вариантов заряда путем КОВЭЖХ % области 1 (кислотной)	18	18	Нет данных	Нет данных
% области 2 (главной)	57	57	59	58,3
% области 3 (основной)	25	25	Нет данных	Нет данных
Анализ связывания (% эталона)	100	99	95,3	ΝΡ

- 16 029779

Пример 8. Совместимость со средством внутривенной доставки

Разбавили композицию ΚΕΟΝ421 в концентрации 25 мг/мл в капельнице для внутривенного вливания из поливинилхлорида (ПВХ) и ди-(2-этилгексил)-фталата (ΌΕΗΡ) с изотоническим раствором. Исследовали три различные дозы ΚΕΟΝ421, включая низкую дозу (0,1 мг/кг для пациента весом 40 кг), среднюю дозу (4 мг/кг для пациента весом 40 кг) и высокую дозу (16 мг/кг для пациента весом 120 кг). Добавили в капельницу с низкой дозой дополнительное "плацебо" для стабилизации ΚΕΟΝ421 при взбалтывании.

Сначала выдержали капельницы для внутривенного вливания с разбавленным ΚΕΟΝ421 при 5°С в течение 24 ч, а затем еще в течение 24 ч при 25 °С. После инкубации подсоединили капельницы для внутривенного вливания к инфузионным наборам, заполнили разбавленным антителом и выдержали в течение 1 часа при температуре окружающего воздуха. Подавали разбавленное антитело через инфузионные наборы со скоростью от 25 до 500 мл/ч. В этом исследовании использовали три инфузионных насоса и три инфузионных набора крупнейших изготовителей (Л1ап§, Вах1ег и Но§р1га). В этих используются все основные материалы (ПВХ с ΌΕΗΡ, ПВХ с триоктил-тримеллитатом (ТОТМ) и полиолефины) для инфузионных наборов со встроенными фильтрами. Все инфузионные наборы имели 0,2-мкм фильтр из полиэфирсульфона.

ΚΕΟΝ421 оставался физически стабильным при хранении в течение 24 ч при 5°С, в течение 24 ч при 25°С (см. табл. 6), в течение 1 ч при температуре окружающего воздуха в различных инфузионных наборах, и подавался через инфузионные наборы с использованием различных инфузионных насосов со скоростью 25 мл/ч или 500 мл/ч. Путем визуального контроля не был обнаружен осадок или помутнение, рН раствора оставался стабильным, и по данным ОФВЭЖХ концентрация белка не снизилась ни одном из испытанных образцов. Белок также оставался химически стабильным. По данным ЭВЭЖХ и КОВЭЖХ соответственно не обнаружено увеличение высокомолекулярного вещества или вариантов заряда.

Таблица 6

Капельница	РЕС N421	Набор для	Всего	%	% ΡΕΟΝ421 в
для	(мг)	внутри ве иного	восстановленного	нативного	главной
внутривенного вливания с физраствором (мл)		вливания	ΡΕΟΝ421 (мг/мл)	ΡΕΟΝ421 (ЭВЭЖХ)	зарядовой форме (КОВЭЖХ)
100	8	А1апз, из ПВХ с/ ϋΕΗΡ	0,059	97,6	60,3
100	8	Вах1ег, ПВХ с/ ТОТМ	0,060	97,3	61,8
100	8	Нозрпа, из ПВХ облицованного полиэтиленом	0,061	97,4	61,3
100	160	А1апз, из ПВХ облицованного слабопоглощающим полиэтиленом	1,40	98,1	59,8
100	160	ВахТег, из ПВХ с/ ВЕнр	1,51	97,5	60,3
100	160	Нозрпа, из ПВХ с/ ТОТМ	1,41	97,7	59,9
250	1920	А1апз, из полипропилена	6,87	97,7	60,6
250	1920	ВахТег, из ПВХ с/ ТОТМ	6,85	97,9	60,4
250	1920	Нозрпа, из ПВХ с/ ϋΕΗΡ	6,77	98,0	60,2

Эти данные подтверждают следующие выводы:

(а) антитело ΚΕΟΝ421 сохраняло стабильность после разбавления 4 мг ΚΕΟΝ421 в 50-мл капельнице для внутривенного вливания с соляным раствором или 1920 мг ΚΕΟΝ421 в 250-мл капельнице для внутривенного вливания с соляным раствором. Капельница для внутривенного вливания с соляным раствором состояла из ПВХ, содержащего ΌΕΗΡ;

(б) разбавленное антитело ΚΕΟΝ421 сохраняло стабильность после инкубации в капельнице для

- 17 029779

внутривенного вливания в течение до 24 ч при 5°С или 24 ч при 25°С;

(в) разбавленное антитело ΡΕΟΝ421 может вводиться с использованием инфузионного раствора;

(г) разбавленное антитело ΡΕΟΝ421 может вводиться с помощью инфузионного набора из ПВХ, содержащего ΌΕΗΡ, ПВХ, содержащего ТОТМ или полиолефин;

(д) с антителом ΚΕΟΝ421 совместимо применение встроенного 0,2-мкм фильтра из полиэфирсульфона;

(е) разбавленное антитело ΡΕΟΝ421 может вводиться со скоростью от 25 до 500 мл/ч.

Пример 9. Определение молекулярной массы

Композиция ΚΕΟΝ421 была охарактеризована с точки зрения структуры и активности белка. Прогнозируемая молекулярная масса нативного ΡΕΟΝ421 без гликозилирования составляет приблизительно 146 кДа. Осуществили δΌδ-ΡΑΟΕ в невосстановительных условиях, чтобы подтвердить молекулярную массу гетеротетрамерной молекулы и определить содержание белка в высоко- и низкомолекулярной формах, очищенного совместно с интактным антителом. Во время подготовки образца добавили алкилирующий агент с целью предотвращения перестановки дисульфида и сведения к минимуму распада антитела вследствие нагрева. Наблюдаемая молекулярная масса гликозилированного антитела, определенная после электрофореза и окрашивания красителем кумасси, составляла приблизительно 150 кДа. Также определили массу ΚΕΟΝ421 методом δΌδ-ΡΛΟΕ в восстановительных условиях. Восстановили и нагрели образцы до электрофореза, и обнаружили области локализации белка путем окрашивания голубым красителем кумасси. Были обнаружены две главные области локализации ΚΕΟΝ421, соответствующие тяжелой цепи (приблизительно 50 кДа) и легкой цепи (приблизительно 25 кДа) антитела.

Также осуществили капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ΟΕ-δΌδ), чтобы оценить массу ΚΕΟΝ421. СБ-δΌδ позволяет различать восстановленные полипептидные цепи 1дО по размеру и представлять в количественной форме неоднородность и варианты, которые могут существовать в антителе ΚΕΟΝ421. Процентная доля негликозилированных тяжелых цепей вычисляется на основании соотношения скорректированной площади пика негликозилированной тяжелой цепи и суммы скорректированных площадей пиков, соответствующих негликозилированным и гликозилированным тяжелым цепям. На полученных путем СБ-δΌδ в восстановительных условиях электроферограммах наблюдали два главных пика антитела ΡΕΟΝ421. Два главных пика партий лекарственного вещества согласуются с обнаруженными двумя главными пиками, соответствующими восстановленным легким (ЬС) и гликозилированным тяжелым цепям (НС) эталонного 1дО. Молекулярные массы обозначенных НС и ЬС пиков ΚΕΟΝ421 и эталонного 1дО, составляют приблизительно 60 и 25 кДа соответственно. Молекулярные массы тяжелых и легких цепей, определенные этим методом, незначительно превышают предполагаемые молекулярные массы 1дО1 человека, что говорит о том, что определенные этим методом молекулярные массы тяжелых и легких цепей незначительно преувеличены. Относительная распространенность негликозилированных тяжелых цепей (ΝΟΗί'.') в испытанных партиях ΡΕΟΝ421 составляет приблизительно 1,5% общей обнаруженной площади пика.

Пример 10. Анализ фукозилирования

Обработали партии лекарственного вещества ΡΕΟΝ421 пептид-Ы-гликозидазой Р (ΡNΟа8е Р), чтобы высвободить Ν-связанные олигосахариды из тяжелой цепи антитела. Затем дериватизировали свободные олигосахариды на восстанавливающем конце с помощью флуоресцентного реагента антраниловой кислоты. Подвергли модифицированные олигосахариды анализу методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и масс-спектрометрии ΜΑΡΌΙ-ΤΟΡ. Изучение полученной путем ВЭЖХ хроматограммы показало, что модифицированные олигосахариды разделены на две главные группы: нефукозилированные 2антенарные олигосахариды и фукозилированные 2-антенарные олигосахариды. Олигосахариды в каждой группе (фукозилированной и нефукозилированной) дополнительно разделены на дигалактозилы (Ο2), моногалактозилы (Ο1) или агалактозилы (Ο0). Распределение олигосахаридов по структуре было определено путем анализа масс каждого фракционированного олигосахарида с использованием массспектрометрии ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ. Путем объединения соответствующих пиков на хроматограммах определили, что проанализированные партии ΚΕΟΝ421 содержали 82,4-87,0% (84,6% ± 1,47%; в среднем ± стандартное отклонение) фуколизированных олигосахаридных цепей (табл. 7). Анализ масс сгруппированных олигосахаридов продемонстрировал, что фукозилированные 2-антенарные олигосахариды являются преобладающей формой, что согласуется с данными анализа ВЭЖХ. Наблюдавшееся различие в степени галактозилирования в Ν-связанных цепях Сахаров между различными испытанными партиями ΚΕΟΝ421 отражает неоднородность, которая может возникать при получении антитела.

- 18 029779

Таблица 7. Схемы гликозилирования ΚΕΟΝ421

	Форма гликана	Партии ΚΕΟΝ421	Формулы гликана
Партия 1	Партия 2	Партия 3	Партия 4	Партия 5
Нефукозилированный	СО (%)	6,9	7,1	7,9	5,2	3,8	(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2
С1 (%)	3,3	3,9	4,3	3,9	3,7	(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2(Са1)1
С2 (%)	0,9	0,8	1,0	1,8	2,1	(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2(Са1)2
Мап-5 (%)	4,5	3,5	4,0	4,6	3,6	(С1сЫАс)2(Мап)5
Фукозилированный	СОР (%)	36,8	37,2	35,9	29,4	25,2	Рис(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2
С1Р (%)	37,1	37,3	36,0	40,7	45,0	Рис(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2(Са1)1
С2Р (%)	10,4	10,3	10,9	14,3	16,7	Рис(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2(Са1)2
% фукозилирования	84,3	84,8	82,8	84,4	86,9

Пример 11. Анализ С-концевого лизина тяжелой цепи

Использовали пептидное картирование, чтобы подтвердить С-концевую последовательность ΚΕΟΝ421. Денатурировали ΚΕΟΝ421 в 6,0 М мочевины, 100 мМ трис с рН 7,5, восстановили с помощью 5 мМ ΌΤΤ и алкилировали с помощью 12,5 мМ йодацетамида. Затем шестикратно разбавили белок, чтобы снизить концентрацию мочевины до 1,0 М, и после этого подвергли ферментативному расщеплению с помощью трипсина (при соотношении фермента к подложке 1:20) при 37°С в течение трех часов. Отделили пептиды путем ВЭЖХ и подвергли анализу путем масс-спектроскопию. В качестве эталонов для идентификации нативного С-концевого пептида в ΚΕΟΝ421 генерировали три синтетических пептида, соответствующих трем наиболее вероятным предполагаемым С-концевым пептидным последовательностям (ЗЬЗЬЗР, ЗЬЗЬЗРО и ЗЬЗЬЗРОК; соответственно, ЗЕО ГО ΝΟ: 10, ЗЕО ГО ΝΟ: 11 и ЗЕО ГО N0: 12), и подвергли анализу путем ВЭЖХ с использованием градиента элюирования растворителя, идентичного градиенту, использованному для элюирования расщепленных трипсином пептидов РЕОШ21, чтобы облегчить идентификацию фактического С-концевого пептида на трипсиновой карте РЕОШ21. Ожидаемый выделенный путем расщепления трипсином С-концевой пептид ЗЬЗЬЗРОК (ЗЕО ГО N0:12) не был обнаружен на трипсиновых картах ни одной из испытанных партий РЕОШ21, что говорит о том, что С-концевой лизин был удален. На трипсиновой карте обнаружен лишь один пептид (время элюирования 46,60 мин), совместно элюированный с одним из синтетических пептидов (ЗЬЗЬЗРО; ЗЕО ГО N0: 11). По данным анализ масс этот пептид соответствует С-концевому пептиду тяжелой цепи РЕОШ21 (расчетная масса 659,69, наблюдаемая масса 660,2). Полученные результаты предполагают, что посттрансляционная обработка приводит к полному удалению ожидаемого лизина из С-конца тяжелой цепи.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Уолш, Скотт Дикс, Дэниел

<120> СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛА К БЬЬ4

<130> 7400Р

<160> 12

<170> Еазб5Е12 £ог ШпЭоу-’з УегзЧоп 4.0

<210> 1

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

- 19 029779

<220>

<223> Синтетический

<400> 1

О1п

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1

О1и

Зег

О1у

О1у

О1у

Уа1

Уа1

О1п

Рго

О1у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

О1у

РЪе

ТЪг

РЪе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

О1у

МеЁ

Ηΐ3

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

РЪе

Ьеи

Тгр

Туг

Азр

О1у

ТЪг

Азп

Ьуз

Азп

Туг

Уа1

О1и

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

РЪе

ТЪг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

МеЁ

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1и

МеЁ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Ηΐ3

Азр

РЪе

Агд

Зег

О1у

Туг

О1и

О1у

Тгр

РЪе

Азр

Рго

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

Зег

Зег

115 120

<210> <211> <212> <213>	2 8 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический
<400>	2
О1у РЪе ТЪг РЪе Зег	Зег Туг О1у
1	5
<210>	3
<211>	8
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 3

Ьеи Тгр Туг Азр О1у ТЪг Азп Ьуз

1	5
<210>	4
<211>	16
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический
<400>	4
А1а Агд Азр Нтз Азр	РЬе Агд Зег О1у Туг О1и О1у Тгр	РЪе Азр
1	5	10	15
<210>	5
<211>	107
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>

Рго

- 20 029779

<223> Синтетический

<400> 5

О1и

11е

Уа1

Беи

ТБг

О1п

Бег

Рго

А1а

ТБг

Беи

Бег

Ьеи

Бег

Рго

О1у

1

5

10

15

О1и

Агд

А1а

ТБг

Беи

Бег

Суз

Агд

А1а

Бег

О1п

Бег

Уа1

Бег

Бег

Туг

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Агд

Беи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Азр

А1а

Бег

Азп

Агд

А1а

ТБг

О1у

11е

Рго

А1а

Агд

РБе

Бег

О1у

50

55

60

Бег

О1у

Бег

О1у

ТБг

Азр

РБе

ТБг

Беи

ТБг

11е

Бег

Бег

Беи

О1и

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РБе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

О1п

Нчз

Агд

Бег

Азп

Тгр

Рго

Рго

85

90

95

ТБг

РБе

О1у

О1у

О1у

ТБг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

<210> 6

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетический

последовательность

<400> 6

О1п Бег Уа1 Бег Бег Туг 1 5

<210> 7

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 7

Азр А1а Бег 1

<210> 8

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетический

последовательность

<400> 8

О1п Нтз Агд Бег Азп

Тгр Рго Рго ТИг

<210> 9

<211> 685

<212> БЕЛОК <213> Ното зартепз

<400> 9

Меб А1а А1а А1а Бег 1 5

Уа1 А1а Беи Тгр О1п

Агд Бег А1а Бег О1у Тгр А1а Беи Беи Беи Беи 10 15

О1п Агд А1а А1а О1у Бег О1у Уа1 РБе О1п Беи

- 21

029779

20

25

30

О1п

Ьеи

О1п

О1и

РЬе

11е

Азп

О1и

Агд

О1у

Уа1

Ьеи

А1а

Бег

О1у

Агд

35

40

45

Рго

Суз

О1и

Рго

О1у

Суз

Агд

ТЬг

РЬе

РЬе

Агд

Уа1

Суз

Ьеи

Ьуз

Н1з

50

55

60

РНе

О1п

А1а

Уа1

Уа1

Бег

Рго

О1у

Рго

Суз

ТЬг

РЬе

О1у

ТЬг

Уа1

Бег

65

70

75

80

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

О1у

ТЬг

Азп

Бег

РЬе

А1а

Уа1

Агд

Азр

Азр

Бег

Бег

85

90

95

О1у

О1у

О1у

Агд

Азп

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Рго

РЬе

Азп

РЬе

ТЬг

Тгр

Рго

100

105

110

О1у

ТЬг

РЬе

Бег

Ьеи

11е

11е

О1и

А1а

Тгр

Н1з

А1а

Рго

О1у

Азр

Азр

115

120

125

Ьеи

Агд

Рго

О1и

А1а

Ьеи

Рго

Рго

Азр

А1а

Ьеи

11е

Бег

Ьуз

11е

А1а

130

135

140

11е

О1п

О1у

Бег

Ьеи

А1а

Уа1

О1у

О1п

Азп

Тгр

Ьеи

Ьеи

Азр

О1и

О1п

145

150

155

160

ТЬг

Бег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Агд

Ьеи

Агд

Туг

Бег

Туг

Агд

Уа1

11е

Суз

Бег

165

170

175

Азр

Азп

Туг

Туг

О1у

Азр

Азп

Суз

Бег

Агд

Ьеи

Суз

Ьуз

Ьуз

Агд

Азп

180

185

190

Азр

Н1з

РЬе

О1у

Н1з

Туг

Уа1

Суз

О1п

Рго

Азр

О1у

Азп

Ьеи

Бег

Суз

195

200

205

Ьеи

Рго

О1у

Тгр

ТЬг

О1у

О1и

Туг

Суз

О1п

О1п

Рго

11е

Суз

Ьеи

Бег

210

215

220

О1у

Суз

Н1з

О1и

О1п

Азп

О1у

Туг

Суз

Бег

Ьуз

Рго

А1а

О1и

Суз

Ьеи

225

230

235

240

Суз

Агд

Рго

О1у

Тгр

О1п

О1у

Агд

Ьеи

Суз

Азп

О1и

Суз

11е

Рго

Н1з

245

250

255

Азп

О1у

Суз

Агд

Н1з

О1у

ТЬг

Суз

Бег

ТЬг

Рго

Тгр

О1п

Суз

ТЬг

Суз

260

265

270

Азр

О1и

О1у

Тгр

О1у

О1у

Ьеи

РЬе

Суз

Азр

О1п

Азр

Ьеи

Азп

Туг

Суз

275

280

285

ТЬг

Н1з

Н1з

Бег

Рго

Суз

Ьуз

Азп

О1у

А1а

ТЬг

Суз

Бег

Азп

Бег

О1у

290

295

300

О1п

Агд

Бег

Туг

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Агд

Рго

О1у

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

Азр

305

310

315

320

Суз

О1и

Ьеи

О1и

Ьеи

Бег

О1и

Суз

Азр

Бег

Азп

Рго

Суз

Агд

Азп

О1у

325

330

335

О1у

Бег

Суз

Ьуз

Азр

О1п

О1и

Азр

О1у

Туг

Н1з

Суз

Ьеи

Суз

Рго

Рго

340

345

350

О1у

Туг

Туг

О1у

Ьеи

Н1з

Суз

О1и

Н1з

Бег

ТЬг

Ьеи

Бег

Суз

А1а

Азр

355

360

365

Бег

Рго

Суз

РЬе

Азп

О1у

О1у

Бег

Суз

Агд

О1и

Агд

Азп

О1п

О1у

А1а

370

375

380

Азп

Туг

А1а

Суз

О1и

Суз

Рго

Рго

Азп

РЬе

ТЬг

О1у

Бег

Азп

Суз

О1и

385

390

395

400

Ьуз

Ьуз

Уа1

Азр

Агд

Суз

ТЬг

Бег

Азп

Рго

Суз

А1а

Азп

О1у

О1у

О1п

405

410

415

Суз

Ьеи

Азп

Агд

О1у

Рго

Бег

Агд

Меб

Суз

Агд

Суз

Агд

Рго

О1у

РЬе

420

425

430

ТЬг

О1у

ТЬг

Туг

Суз

О1и

Ьеи

Н1з

Уа1

Бег

Азр

Суз

А1а

Агд

Азп

Рго

435

440

445

Суз

А1а

Н1з

О1у

О1у

ТЬг

Суз

Н1з

Азр

Ьеи

О1и

Азп

О1у

Ьеи

Меб

Суз

450

455

460

ТЬг

Суз

Рго

А1а

О1у

РЬе

Бег

О1у

Агд

Агд

Суз

О1и

Уа1

Агд

ТЬг

Бег

465

470

475

480

11е

Азр

А1а

Суз

А1а

Бег

Бег

Рго

Суз

РЬе

Азп

Агд

А1а

ТЬг

Суз

Туг

485

490

495

ТЬг

Азр

Ьеи

Бег

ТЬг

Азр

ТЬг

РЬе

Уа1

Суз

Азп

Суз

Рго

Туг

О1у

РЬе

500

505

510

Уа1

О1у

Бег

Агд

Суз

О1и

РЬе

Рго

Уа1

О1у

Ьеи

Рго

Рго

Бег

РЬе

Рго

515

520

525

- 22 029779

тгр ναι 530

А1а

Уа1

Зег

Ьеи

о1у να1 535

О1у

Ьеи

А1а

Уа1 540

Ьеи

Ьеи

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1у

МеЬ

Уа1

А1а

Уа1

А1а

Уа1

Агд

О1п

Ьеи

Агд

Ьеи

Агд

Агд

Рго

545

550

555

560

Азр

Азр

О1у

Зег

Агд

О1и

А1а

МеЬ

Азп

Азп

Ьеи

Зег

Азр

РЪе

О1п

Ьуз

565

570

575

Азр

Азп

Ьеи

11е

Рго

А1а

А1а

О1п

Ьеи

Ьуз

Азп

ТЪг

Азп

О1п

Ьуз

Ьуз

580

585

590

О1и

Ьеи

О1и

Уа1

Азр

Суз

О1у

Ьеи

Азр

Ьуз

Зег

Азп

Суз

О1у

Ьуз

О1п

595

600

605

О1п

Азп

Няз

ТЪг

Ьеи

Азр

Туг

Азп

Ьеи

А1а

Рго

О1у

Рго

Ьеи

О1у

Агд

610

615

620

О1у

ТЪг

МеЬ

Рго

О1у

Ьуз

РЪе

Рго

Няз

Зег

Азр

Ьуз

Зег

Ьеи

О1у

О1и

625

630

635

640

Ьуз

А1а

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

Няз

Зег

О1и

Ьуз

Рго

О1и

Суз

Агд

11е

Зег

645

650

655

А1а

11е

Суз

Зег

Рго

Агд

Азр

Зег

МеЬ

Туг

О1п

Зег

Уа1

Суз

Ьеи

11е

660

665

670

Зег

О1и

О1и

Агд

Азп

О1и

Суз

Уа1

11е

А1а

ТЪг

О1и

Уа1

675

680

685

<210> 10

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 10

Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 1 5

<210>	11
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Синтетический

последовательность

<400> 11

Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго О1у 1 5

<210>	12
<211>	8
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Синтетический

последовательность

<400> 12

Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго О1у Ьуз 1 5

- 23 029779

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Фармацевтическая композиция, специфически связывающаяся с дельта-подобным лигандом 4 человека (ПЬЬ4), содержащая:

   (ί) 25 ± 3,75 мг/мл антитела 1дО1 человека к ΌΤΤ4, причем антитело содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (НСИК) 1 с последовательностью ЗЕС ГО ΝΟ: 2, НСИК2 с последовательностью ЗЕС ГО ΝΟ: 3, НСГОТ3 с последовательностью ЗЕС ГО ΝΟ: 4, определяющую комплементарность область легкой цепи (ЬСИК) 1 с последовательностью ЗЕС ГО ΝΟ: 6, БСГОР2 с последовательностью ЗЕС ГО ΝΟ: 7 и БСОК3 с последовательностью ЗЕС ГО ΝΟ: 8,

   (ίί) 10 ± 3 мМ фосфат, рН 6,0 ± 0,5,

   (ίίί) 0,2 ± 0,03% полисорбат 20,

   (ίν) 150 ± 22,5 мМ хлорида натрия и

   (ν) 10 ± 1,5% сахарозы.
2. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (НСУЭ) с последовательностью ЗЕС ГО ΝΟ: 1 и вариабельную область легкой цепи (ЬСУО) с последовательностью ЗЕС ГО ΝΟ: 5.
3. 3. Фармацевтическая композиция по п.1, состоящая из

   (a) 25 ±3,75 мг/мл антитела,

   (b) 10 ± 3 мМ фосфата, рН 6,0 ± 0,5,

   (c) 0,2 ± 0,03% полисорбата 20,

   (й) 150 ± 22,5 мМ хлорида натрия и

   (е) 10 ± 1,5% сахарозы, в воде.
4. 4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, в которой:

   (а) антитело имеет молекулярную массу около 150 кДа, и

   (б) от около 82% до около 87% антитела фукозилировано.
5. 5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, в которой по меньшей мере 94% антитела имеет нативную конформацию через 28 суток хранения при 45°С.
6. 6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, в которой по меньшей мере 45% антитела имеет главную зарядовую форму через 28 суток хранения при 45°С, причем главная зарядовая форма антитела представляет собой фракцию антитела, которая элюируется с ионообменной смолы в главном пике.
7. 7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, содержащаяся в емкости.
8. 8. Фармацевтическая композиция по п.7, в которой емкостью является флакон или капельница для внутривенного вливания.
9. 9. Набор для лечения, предотвращения или облегчения заболевания или нарушения, связанного с активностью ПЬЬ4, содержащий фармацевтическую композицию по любому из пп.1-6, содержащуюся в емкости, и инструкции.
10. 10. Набор по п.9, в котором емкость представляет собой стеклянный флакон с резиновой пробкой 4023/50 с фторуглеродным покрытием.