EA028344B1 - Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии - Google Patents

Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии Download PDF

Info

Publication number
EA028344B1
EA028344B1 EA201491412A EA201491412A EA028344B1 EA 028344 B1 EA028344 B1 EA 028344B1 EA 201491412 A EA201491412 A EA 201491412A EA 201491412 A EA201491412 A EA 201491412A EA 028344 B1 EA028344 B1 EA 028344B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
isochromen
pyrazin
compound
patient
alkyl
Prior art date
Application number
EA201491412A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491412A1 (ru
Inventor
Гуанмин Чэнь
Амал Дакка
Гари Митчелл Карп
Чуньши Ли
Яна Нарасимхан
Николай Нарышкин
Марла Л. Виталл
Эллен Уэлч
Синь Чжао
Original Assignee
ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. filed Critical ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
Publication of EA201491412A1 publication Critical patent/EA201491412A1/ru
Publication of EA028344B1 publication Critical patent/EA028344B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
    • C07D513/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D513/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/76—Benzo[c]pyrans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D497/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having oxygen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D497/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having oxygen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D497/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к соединениям формулы (Ia1), их композициям и их применениям для лечения спинальной мышечной атрофии

Description

Изобретение относится к соединениям, их композициям и их применению для лечения спинальной мышечной атрофии.
Уровень техники
Спинальная мышечная атрофия (§МА) в своем самом широком смысле описывает совокупность наследственных и приобретенных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), характеризующихся прогрессивной потерей мотонейронов в спинном мозге и стволовой области головного мозга, вызывающей слабость мышц и атрофию мышц. Самая распространенная форма §МА вызывается мутациями в гене выживания мотонейронов (8ΜΝ) и проявляется в широком диапазоне серьезности, передаваясь от взрослых детям (Сга\\Тогб апб Ратбо, №итоЬю1. Όίδ., 1996, 3:97).
Инфантильная §МА является самой тяжелой формой этого нейродегенеративного нарушения. Симптомы включают слабость мышц, недостаточный мышечный тонус, слабый крик, вялость или тенденцию к падению, трудности с сосанием или глотанием, накопление секреций в легких или горле, трудности с кормлением и увеличенную восприимчивость к инфекциям дыхательных путей. Ноги имеют тенденцию быть более слабыми, чем руки, и вехи развития, такие как держание головы или сидение, не могут быть достигнуты. В общем, чем ранее симптомы появляются, тем короче продолжительность жизни. Когда клетки мотонейронов разрушаются, симптомы появляются через короткое время. Тяжелые формы заболевания являются летальными, и все формы не имеют никакого известного лечения. Течение §МА непосредственно связано со скоростью разрушения клеток мотонейронов и серьезностью развивающейся в результате слабости. Младенцы с тяжелой формой §МА часто умирают от респираторного заболевания вследствие слабости мышц, поддерживающих дыхание. Дети с более умеренными формами §МА живут намного дольше, хотя они, возможно, нуждаются в обширной медицинской поддержке, особенно те, которые находятся на более тяжелом конце спектра. Клинический спектр нарушений §МА был разделен на следующие пять групп.
(a) Тип 0 §МА (1п Шето §МА) является самой тяжелой формой заболевания и начинается до рождения. Обычно первый симптом типа 0 §МА проявляется в сниженной двигательной активности плода, что может впервые наблюдаться между 30 и 36 неделями беременности. После рождения эти новорожденные имеют низкую двигательную активность и имеют трудности с глотанием и дыханием.
(b) Тип 1 §МА (инфантильная §МА, или болезнь Верднига-Хоффмана) обычно представляет симптомы между 0 и 6 месяцами. Эта форма §МА также является очень тяжелой. Пациенты никогда не достигают способности сидеть, и смерть обычно наступает в течение первых 2 лет при отсутствии искусственного дыхания.
(c) Тип 2 §МА (промежуточная §МА) имеет возраст начала в 7-18 месяцев. Пациенты достигают способности сидеть без посторонней поддержки, но не могут без посторонней помощи стоять или ходить. Прогноз в этой группе в значительной степени зависит от степени респираторной поддержки.
(б) Тип 3 §МА (ювенильная §МА, или болезнь Кугельберга-Веландера) обычно диагностируется после 18 месяцев. Пациенты с типом 3 §МА в состоянии идти независимо в некоторый момент в ходе развития заболевания, но часто попадают в инвалидное кресло в течение молодости или во взрослом возрасте.
(е) Тип 4 §МА (§МА взрослых). Слабость обычно начинается в позднем пубертатном периоде в языке, руках или стопах, затем распространяется на другие области тела. Течение §МА взрослых намного медленнее и оказывает небольшое воздействие или никакого воздействия на ожидаемую продолжительность жизни.
Ген §ΜN был картирован с помощью анализа сцепления сложной области в хромосоме 5с|. У человека эта область содержит инвертированную дупликацию размером приблизительно 500 тысяч пар оснований (п.о.), приводящую к двум почти идентичным копиям гена §МХ §МА вызывается инактивирующей мутацией или делецией копии теломерного гена (8МШ) в обеих хромосомах, приводя к потере генетической функции 8МШ. Однако все пациенты сохраняют центромерную копию гена (8М№), и число копий гена 8МШ у пациентов с §МА в целом коррелирует обратно пропорционально с серьезностью заболевания; то есть, пациенты с менее тяжелой §МА имеют больше копий 8МШ. Однако 8МШ неспо- 1 028344 собен полностью компенсировать потерю функции 8ΜΝ1 вследствие альтернативного сплайсинга экзона 7, вызванного трансляционно молчаливой мутации С в Т в экзоне 7. В результате большинство транскриптов, произведенных от 8ΜΝ2. не имеют экзона 7 (§ΜΝ2 Δ7) и кодируют обрезанный белок 8тп. который имеет ослабленную функцию и быстро разлагается.
Белок §ши. как считается. играет роль в процессинге РНК и метаболизме. имея хорошо охарактеризованную функцию посредничества в сборке специфического класса комплексов РНК-белок. называемых δηΚΝΡ. §ши может иметь другие функции в мотонейронах. однако его роль в предотвращении селективной дегенерации мотонейронов четко не установлена.
В большинстве случаев 8ΜΆ диагностируют на основании клинических симптомов и отсутствия всех копий экзона 7 в гене 8ΜΝ1. что определяется генетическим тестом. Однако приблизительно в 5% случаев 8ΜΆ вызывается мутациями. отличными от делеции всего гена 8ΜΝ1 или делеции всего экзона 7 в гене 8ΜΝ1. некоторые из которых известны. а другие еще не определены. В таких случаях. когда генетический тест 8ΜΝ1 невыполним или генная последовательность 8ΜΝ1 не показывает никакой аномалии. могут быть показаны другие тесты. такие как электромиография (ЭМГ) или биопсия мышц.
Медицинский уход в отношении пациентов 8ΜΛ в настоящее время ограничен поддерживающей терапией. включая респираторную. пищевую и восстановительную поддержку; нет никакого известного лекарственного средства. направленного на основную причину заболевания. Текущее лечение для 8ΜΛ состоит из профилактики и контроля вторичных эффектов хронической потери моторных единиц. Главной проблемой контроля при типе 1 8ΜΛ является профилактика и раннее лечение легочных проблем. которые являются первичной причиной смерти в большинстве случаев. Хотя некоторые младенцы. пораженные 8ΜΆ. доживают до взрослого возраста. те. у которых выявлен тип 1 8ΜΛ. имеют ожидаемую продолжительность жизни менее двух лет.
Были разработаны несколько мышиных моделей 8ΜΛ. В частности. модель 8ΜΝΔ7 (Ье е! а1.. Нит. Μοί. Сепе!.. 2005. 14:845) несет и ген 8ΜΝ2. и несколько копий кДНК 8ΜΝ2Δ7 и резюмирует многие из фенотипических особенностей типа 1 8ΜΆ. Модель 8ΜΝΔ7 может использоваться как для исследований экспрессии 8ΜΝ2. так и для оценки моторной функции и выживания. Модель мыши С/С-аллель (1аск8оп БаЬогаЮгу линия Νο.: 008714) обеспечивает модель менее тяжелой 8ΜΛ на мышах. имеющих уменьшенные уровни обоих полноразмерной мРНК 8ΜΝ2 (8ΜΝ2 РЬ) и белка 8тп. Фенотип мыши С/С-аллель имеет ген 8ΜΝ2 и гибрид т§тη1-§ΜN2 ген. который подвергается альтернативному сплайсингу. но не имеет явной слабости мышц. Модель мышей С/С-аллель используется для исследований экспрессии 8ΜΝ2.
В результате улучшенного понимания генетического основания и патофизиологии 8ΜΛ были исследованы несколько стратегий лечения. но ни одна все же не продемонстрировала успех в клинике.
Замена гена 3ΜΝ1 с использованием вирусных векторов доставки и замена клеток с использованием дифференцированных стволовых клеток 3ΜΝ1+/+ продемонстрировали эффективность на животных моделях 8ΜΛ. Необходимы дополнительные исследования. чтобы определить безопасность и иммунный ответ и выполнить требование инициации лечения на неонатальной стадии. прежде чем эти подходы могут быть использованы на людях.
Коррекция альтернативного сплайсинга 3ΜΝ2 в культивируемых клетках была также достигнута с использованием синтетических нуклеиновых кислот в качестве терапевтических средств: (ί) антисмысловых олигонуклеотидов. которые нацеливаются на элементы последовательности в пре-мРНК 8ΜΝ2 и изменяют результат реакции сплайсинга на генерацию полноразмерной мРНК 8ΜΝ2 (Ра88Ш1 е! а1.. 8ст Ттап81. Μеб.. 2011. 3:72га18; апб Ниа е! а1.. №Циге. 2011. 478:123) и (ίί) транс-сплайсинговых молекул РНК. которые обеспечивают полностью функциональную последовательность РНК. которые заменяют фрагмент мутанта в течение сплайсинга и производят полноразмерную мРНК 8ΜΝ1 (Соабу апб Ьот8оп. I. №ито8С1.. 2010. 30:126).
Другие подходы при исследовании включают поиск лекарственных средств. которые увеличивают уровни Зтп. усиливают остаточную функцию Зтп или компенсируют потерю 8тп. Было показано. что аминогликозиды усиливают экспрессию стабилизированного белка Зтп. продуцируемого из 8ΜΝ2 Δ7 мРНК. промотируя трансляционный пропуск аберрантного терминирующего кодона. но имеют недостаточное проникновение в центральную нервную систему и являются токсичными после повторного введения. Было показано. что химиотерапевтические средства. такие как акларубицин. увеличивают белок 8тп в клеточной культуре; однако профиль токсичности этих лекарственных средств исключает их долговременное использование в пациентах 8ΜΆ. Некоторые лекарственные средства. находящиеся на стадии клинических исследований. для лечения 8ΜΛ включают активаторы транскрипции. такие как ингибиторы гистон деацетилазы (НЭЛС) (например. бутираты. вальпроевая кислота и гидроксимочевина). и стабилизаторы мРНК (ингибитор декэпирования мРНК КС3039 от РерПдеп). предназначенные для увеличения количества полной РНК. транскрибированной от гена 8ΜΝ2. Однако использование ингибиторов НЭЛС или стабилизаторов мРНК не затрагивает основную причину 8ΜΆ и может привести к общему увеличению транскрипции и экспрессии генов с потенциальными проблемами безопасности у людей.
- 2 028344
В дополнительном варианте нейропротективные средства, такие как олезоксим, были выбраны для исследования. Такие стратегии не направлены на увеличение продукции функционального §тп для лечения 8ΜΑ, а исследуются в отношении возможности защитить §тп-дефицитные мотонейроны от нейродегенерации.
Система, предназначенная для идентификации соединений, которые увеличивают включение экзона 7 8ΜΝ в РНК, транскрибированную от гена 8ΜΝ2, и некоторые бензоксазольные и бензизоксазольные соединения, идентифицированная таким образом, были описаны в международной заявке РСТ/и§2009/003238, поданной 27 мая 2009 г. (опубликована как международная публикация XVО 2009/151546 и публикация США И8 2011/0086833). Система, предназначенная для идентификации соединений, которые производят стабильный белок §тп от §ΜΝ2 Δ7 мРНК, и некоторые изоиндолиновые соединения, идентифицированные таким образом, были описаны в международной заявке РСТ/и§2009/004625, поданной 13 августа 2009 г. (опубликована как международная публикация νΟ 2010/019236 и публикация США И8 2011/0172284). Каждый из указанных документов включен в настоящее описание полностью и во всех целях.
Все другие документы, упомянутые здесь, включены путем ссылки в настоящую заявку, как если бы были полностью описаны здесь.
Несмотря на успехи, достигнутые в понимании генетического основания и патофизиологии §МА, остается потребность в идентификации соединений, которые меняли бы течение спинальной мышечной атрофии, одного из самых разрушительных неврологических заболеваний у детей.
Сущность изобретения
В одном аспекте изобретение относится к соединениям формулы (1а1)
или их свободной кислоте, свободному основанию или фармацевтически приемлемой соли, в которой Κι, К2, Ка и Кь имеют определенные здесь значения. В одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (1а1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
§МА вызывается делецией или мутацией гена 8ΜΝ1, приводя к селективной дегенерации §тпдефицитных мотонейронов. Хотя у человека сохраняются несколько копий гена 8ΜΝ2, небольшое количество функционального белка 8тп, экспрессируемого от 8ΜΝ2, полностью не компенсирует потерю §тп, который экспрессировался бы от гена 8ΜΝ1. Соединения, их композиции и применения, описанные здесь, основаны частично на открытии, что соединение формулы (1а1) увеличивает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от минигена 8ΜΝ2. Этот миниген репродуцирует альтернативную реакцию сплайсинга экзона 7 8ΜΝ2, что приводит к пропуску экзона 7 в большинстве транскриптов 8ΜΝ2. Таким образом, соединения формулы (1а1) или ее формы могут использоваться для модуляции включения экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2. Заявитель также обнаружил, что соединение формулы (1а1) увеличивает включение экзона 7 8ΜΝ1 в мРНК, которая транскрибируется от минигена 8ΜΝ1. Таким образом, соединения формулы (1а1) или ее формы могут использоваться для модуляции включения экзона 7 8ΜΝ1 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ1.
В частном варианте осуществления изобретение относится к соединениям формулы (1а1) или ее формы, которые могут использоваться для модуляции включения экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8ΜΑ у пациентачеловека, включающему введение пациенту эффективного количества соединения формулы (1а1) или ее формы. Соединение формулы (1а1) или ее формы предпочтительно вводят пациенту-человеку в фармацевтической композиции. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (1а 1) для лечения 8ΜΑ, причем соединение усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2. Не будучи ограниченным теорией, соединения формулы (1а1) усиливают включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2, и увеличивают уровни белка 8тп, продуцируемого от гена 8ΜΝ2, и таким образом могут использоваться для лечения 8ΜΑ у пациента-человека.
В другом аспекте изобретение относится к праймерам и/или зондам, описанным ниже в биологических примерах (например, праймеры 8ΜΝ, такие как 5>Еф ГО ΝΟ. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или 5>Еф ГО ΝΟ. 2, 9
- 3 028344 или 12, и/или зонды 8ΜΝ, такие как ЗЕф ГО N0. 3 или 10), и к применению этих праймеров и/или зондов. В частном варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, включающей ЗЕф ГО N0. 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, состоящей, по существу, из ЗЕф ГО N0. 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, состоящей из ЗЕф ГО N0. 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13.
В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, может использоваться как биомаркер для ЗМА, такого как раскрытый здесь. В других вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и включает экзон 7 из 8М№, может использоваться как биомаркер для лечения пациента соединением, таким как раскрытое здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с ЗМА. В другом частном варианте осуществления пациент не является пациентом с ЗМА.
В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и включает экзон 7 из 8М№, а также количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМШ, может использоваться как биомаркеры для лечения пациента соединением, таким как раскрытое здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с ЗМА. В другом частном варианте осуществления пациент не является пациентом с ЗМА.
В соответствии с этими вариантами осуществления праймер(ы) ЗМ^ и/или зонд ЗМ^ описанные ниже, могут использоваться в тестах, таких как РСК (например, цРСК), амплификация по типу катящегося кольца и КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), чтобы оценить и/или количественно определить количество мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и включает или не включает экзон 7 из ЗМШ.
В частном варианте осуществления праймер и/или зонд, описанные ниже в биологических примерах (например, праймеры ЗМ^ такие как ЗЕф ГО N0. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или ЗЕф ГО N0. 2, 9 или 12, и/или зонды ЗМ^ такие как ЗЕф ГО N0. 3 или 10), используют в тесте, таком как КТ-РСК, КТ-цРСК, КТ по окончании РСК, РСК, цРСК, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузернблот (например, такой тест, как описанный ниже в биологических примерах), для того чтобы определить, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы) включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанные ниже в биологических примерах (например, праймеры ЗМЦ такие как ЗЕф ГО N0. 7, 11 или 13 и/или ЗЕф ГО N0. 9 или 12, и/или зонды ЗМ^ такие как ЗЕф ГО N0. 3 или 10), используют в тесте, таком как КТ-РСК, КТ-цРСК, КТ по окончании РСК, РСК, цРСК, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, такой тест, как описанный ниже в биологических примерах), для того чтобы контролировать количество мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и включает экзон 7 из ЗМ№, в пробе пациента. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с ЗМА. В другом частном варианте осуществления пациент не является пациентом с ЗМА.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанные ниже в биологических примерах (например, праймеры ЗМ^ такие как ЗЕф ГО N0. 7, 8, 11 или 13 и/или ЗЕф ГО N0. 9 или 12, и/или зонды ЗМ^ такие как ЗЕф ГО N0. 3 или 10), используют в тесте, таком как КТ-РСК, КТ-цРСК, КТ по окончании РСК, РСК, цРСК, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, такой тест, как описанный ниже в биологических примерах), для того чтобы контролировать реакцию пациента на соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы). В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с ЗМА. В другом частном зарианте осуществления пациент не является пациентом с ЗМА.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу определения, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (1а1), раскрытой здесь) включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМ№, включающему (а) контактирование мРНК, которая транскрибируется от минигена ЗМ№, описанного здесь или в международной заявке РСТ/ИЗ2009/004625, поданной 13 августа 2009 г. (опубликована как международная публикация \У0 2010/019236) или публикация США ИЗ 2011/0172284, в присутствии соединения (например, соединения формулы (1а1), раскрытой здесь) с праймером(ами), описанным(и) здесь (например, ЗЕф ГО N0. 1 и/или 2), наряду с компонентами, применимыми для, например, КТ-РСК, КТ-цРСК, КТ по окончании РСК, РСК, цРСК, амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из ЗМ№, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из ЗМ№, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из ЗМ№, в отсутствие соединения, указывает, что соединение усиливает включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМ№; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из ЗМ№, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из ЗМ№, в отсутствие соединения указывает, что
- 4 028344 соединение не усиливает включение экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу определения, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (1а1), раскрытой здесь) включение экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2, включающему (а) контактирование мРНК, которая транскрибируется от минигена δΜΝ2, описанного здесь или в международной заявке РСТ/и§2009/004625, поданной 13 августа 2009 г. (опубликована как международная публикация \УО 2010/019236) или публикация США И8 2011/0172284 в присутствии соединения (например, соединение формулы (1а1), раскрытой здесь) с зондом, описанным здесь (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 3 или 10), наряду с компонентами, применимыми для, например, КТ-РСК, КТ-цРСК, КТ по окончании РСК, РСК, цРСК, амплификации по типу катящегося кольца и если применимо, Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, в отсутствие соединения, указывает, что соединение усиливает включение экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, в отсутствие соединения указывает, что соединение не усиливает включение экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу определения, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (1а1), раскрытой здесь) включение экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2, включающему (а) контактирование мРНК, которая транскрибируется от минигена δΜΝ2, описанного здесь или в международной заявке РСТГОЬ2009/004625, поданной 13 августа 2009 г. (опубликована как международная публикация \УО 2010/019236) или публикация США υδ 2011/0172284 в присутствии соединения (например, соединения формулы (1а1), раскрытой здесь) с праймером(ами) (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 1 или 2) и/или зондом, описанными здесь (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 3 или 10), наряду с компонентами, применимыми для, например, КТ-РСК, КТ-цРСК, КТ по окончании РСК, РСК, цРСК, амплификации по типу катящегося кольца и если применимо, Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, в отсутствие соединения, указывает, что соединение усиливает включение экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из δΜΝ2, в отсутствие соединения указывает, что соединение не усиливает включение экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2.
В другом аспекте изобретение относится к наборам, включающим праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры δΜΝ, такие как δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 2, 9 или 12 и/или зонды δΜΝ, такие как δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 3 или 10), и к их применению.
Краткое описание фигур
Фиг. 1, на которую имеется ссылка в биологическом примере 1, является схематическим рисунком конструкции минигена δΜΝ2-Α, которая продуцирует два подвергшихся альтернативному сплайсингу транскрипта мРНК: полноразмерная мРНК, которая содержит экзон 7, и Δ7 мРНК, которая не содержит экзон 7. Нуклеотид аденин, вставленный в экзон 7 из δΜΝ2-Α после нуклеинового остатка 48, представлен буквой А. Альтернативно, нуклеотид может также быть выбран из цитозина или тимина. Вследствие вставки одного нуклеотида (А, С или Т) после нуклеинового остатка 48, полноразмерная мРНК не содержит терминирующий кодон в открытой рамке считывания δΜΝ, тогда как Δ7 мРНК имеют терминирующий кодон в экзоне 8, который обозначен словом δΐορ;
фиг. 2, на которую имеется ссылка в биологическом примере 1, показывает последовательность ДНК минигена от конструкции минигена δΜΝ2-Α δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 21 (фиг. 2а). Как показано на фиг. 2Ь, могут быть найдены следующие подпоследовательности:
1-70: 5'иТК (йед);
71-79: экзон 6: старт-кодон и сайт ВатШ (ЩддщИсс);
80-190: экзон 6;
191-5959: интрон 6;
5960-6014: экзон 7 со вставкой нуклеотида аденина А (положение 6008);
6015-6458: интрон 7;
6459-6481: часть экзона 8;
6482-8146: сайт ВатШ (последовательность на 5' конце), последовательность, кодирующая люциферазу, начинающаяся с кодона 2 (без инициирующего кодона), сайт ΝοΐΙ (последовательность на 3' кон- 5 028344 це), терминирующий кодон ТАА; и
8147-8266: 3'ИТК (йед);
фиг. 3, на которую имеется ссылка в биологическом примере 2, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга минигена 8ΜΝ2 в клетках, обработанных возрастающими концентрациями Соединения 65 (фиг. За) и соединения 69 (фиг. 3Ь) за период 24 ч. Уровни полноразмерной мРНК минигена 8ΜΝ2 определяли количественно, используя количественную РСК с обратной транскрипцией (КТцРС’Р). Уровень полноразмерной мРНК минигена 8ΜΝ2 в обработанных соединением образцах подвергали нормализации к уровню в обработанных носителем образцах и выстраивали как функцию концентрации соединения;
фиг. 4, на которую имеется ссылка в биологическом примере 3, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга 8ΜΝ2 в фибробластах пациента с типом 1 8ΜΑ, обработанных возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 4а) и соединения 69 (фиг. 4Ь) за период 24 ч. Уровни полноразмерной и Δ7 мРНК 8ΜΝ2 определяли количественно, используя КТ-цРСК. Уровни полноразмерной и Δ7 мРНК 8ΜΝ2 в обработанных соединением образцах подвергали нормализации к уровню в обработанных носителем образцах и выстраивали как функцию концентрации соединения;
фиг. 5, на которую имеется ссылка в биологическом примере 4, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга 8ΜΝ2 в фибробластах пациента с типом 1 8ΜΑ, обработанных возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 5а) и соединения 69 (фиг. 5Ь) за период 24 ч. Полноразмерную и Δ7 мРНК 8ΜΝ2 амплифицировали, используя обратную транскрипцию по окончании РСК (КТ-РСК), и продукты РСК разделяли, используя электрофорез на агарозном геле. Верхние и нижние диапазоны соответствуют полноразмерной и Δ7 мРНК 8ΜΝ2, соответственно. Интенсивность каждого диапазона пропорциональна количеству РНК, присутствующей в образце;
фиг. 6, на которую имеется ссылка в биологическом примере 5, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга 8ΜΝ2 (как в гене 8ΜΝ2, так и в гибридном гене διηπ1-δΜΝ2 мыши) в тканях мозга и мышц в модели 8ΜΑ на мышах С/С-аллель в результате обработки в течение 10 дней, дважды в сутки (ВГО) с 10 мг/кг соединения 65 (фиг. 6а) и соединения 69 (фиг. 6Ь). Уровни полноразмерной и Δ7 мРНК 8ΜΝ2 определяли количественно, используя КТ-цРСК, объединенное количество полноразмерной и Δ7 мРНК 8ΜΝ2 собирали в момент 1 и вычисляли фракционные количества полноразмерной и Δ7 8ΜΝ2;
фиг. 7, на которую имеется ссылка в биологическом примере 6, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга 8ΜΝ2 (как в гене 8ΜΝ2, так и в гибридном гене 8ιηη1-δΜΝ2 мыши) в тканях мозга и мышц в модели 8ΜΑ на мышах С/С-аллель в результате обработки в течение 10 дней, дважды в сутки с 10 мг/кг соединения 65 (фиг. 7). Полноразмерную и Δ7 мРНК 8ΜΝ2 амплифицировали, используя КТРСК. Продукты РСК разделяли, используя электрофорез на агарозном геле. Верхние и нижние диапазоны соответствуют полноразмерной и Δ7 мРНК 8ΜΝ2 соответственно. Интенсивность каждого диапазона пропорциональна количеству РНК, присутствующей в образце;
фиг. 8, на которую имеется ссылка в биологическом примере 7, показывает дозозависимое увеличение экспрессии белка 8ши в человеческих фибробластах при типе 1 8ΜΑ, обработанных за период 48 ч соединением 65 (фиг. 8а) и соединением 69 (фиг. 8Ь);
фиг. 9, на которую имеется ссылка в биологическом-примере 8, показывает увеличение в единицах ядерного спекла (дешк) в фибробластах пациента с типом 1 8ΜΑ, обработанных соединением 65 (фиг. 9а) и соединением 69 (фиг. 9Ь) за период 48 ч. Спеклы подсчитывали, используя флюоресцентную микроскопию. Число спеклов в обработанных соединением образцах подвергали нормализации к числу в обработанных носителем образцах и выстраивали как функцию концентрации соединения;
фиг. 10, на которую имеется ссылка в биологическом примере 9, показывает увеличение экспрессии белка §шп (черные круги) в мотонейронах, полученных из клеток 1Р§, полученных из фибробластов пациента с типом 1 8ΜΑ, обработанных соединением 65 (фиг. 10а) и соединением 69 (фиг. 10Ь) за период 72 часа. Уровень белка 8шп определяли количественно, используя иммунное окрашивание 8шп и софокусную флюоресцентную микроскопию. Уровень белка 8шп в обработанных соединением образцах подвергали нормализации к уровню в обработанных носителем образцах и выстраивали как функцию концентрации соединения;
фиг. 11, на которую имеется ссылка в биологическом примере 11, показывает увеличенную экспрессию белка 8шп в тканях головного мозга, спинного мозга, мышц и печени в модели 8ΜΑ на мышах С/С-аллель вследствие обработки дважды в сутки в течение 10 дней с 10 мг/кг соединения 65 (фиг. 11а, п=5) и соединения 69 (фиг. 11Ь, п=4), где три звезды (***) на каждой фигуре обозначают р<0,001 ΑΝΟνΑ;
фиг. 12, на которую имеется ссылка в биологическом примере 12, показывает дозозависимое увеличение экспрессии белка 8шп в тканях (головной мозг, фиг. 12а; спиннсй мозг, фигура 12Ь; и мышца, фигура 12с) в мышиных моделях неонатальной Δ7 8ΜΑ в результате обработки в течение 7 дней один раз в сутки (фИ) обозначенными дозами соединения 65, где три звезды (***) на каждой фигуре обозначают р<0,001 ΑΝΟνΑ;
фиг. 13, на которую имеется ссылка в биологическом примере 13, показывает различия в массе тела
- 6 028344 в мышиных моделях неонатальной Δ7 5МЛ в результате обработки вплоть до Послеродового Дня (ΡΝΏ) 140 соединением 65 (фиг. 13а) и до ΡΝΓ) 79 соединением 69 (фиг. 13Ь);
фиг. 14, на которую имеется ссылка в биологическом примере 14, показывает улучшенный выпрямительный рефлекс в мышиных моделях неонатальной Δ7 5МЛ в результате обработки соединением 65 (фиг. 14а) и соединением 69 (фиг. 14Ь);
фиг. 15, на которую имеется ссылка в биологическом примере 15, показывает улучшенное выживание в мышиных моделях неонатальной Δ7 5МЛ в результате обработки соединением 65 (фиг. 15а) и соединением 69 (фиг. 15Ь);
фиг. 16, на которую имеется ссылка в биологическом примере 15, показывает увеличенную экспрессию белка 5тп в тканях мозга и мышц в мышиных моделях Δ7 5МЛ в результате обработки соединением 65 до ΡΝΓ) 144 (фиг. 16а) и соединением 69 до ΡΝΓ) 80 и ΡΝΓ) 83 относительно обработанных носителем и подобранных в соответствии с возрастом гетерозиготных мышей соответственно;
фиг. 17, на которую имеется ссылка в биологическом примере 16, показывает дозозависимое увеличение РЬ мРНК минигена 5ΜΝ1 и дозозависимое уменьшение Δ7 мРНК минигена 5ΜΝ1 в человеческих фибробластах при типе 5МЛ 1, обработанных за период 7 ч соединением 65 (фиг. 17а) и соединением 69 (фиг. 17Ь). Полноразмерную и Δ7 мРНК минигена 5М№ амплифицировали, используя ΚΤ-ΡΟΚ, и полученные продукты ΡΟΚ разделяли, используя электрофорез на агарозном геле. Верхние и нижние диапазоны соответствуют полноразмерной и Δ7 мРНК минигена 5М№ соответственно. Интенсивность каждого диапазона пропорциональна количеству РНК, присутствующей в образце.
Подробное описание
Изобретение относится к соединениям формулы (1а1)
или их свободной кислоте, свободному основанию или фармацевтически приемлемой соли, в которой
Κ1 обозначает гетероциклил, выбранный из азетидинила, пирролинила, пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазолинила, изотиазолидинила, оксазолинила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила, триазолидинила, оксадиазолинила, оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразолинила, тетразолидинила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6-тетрагидропиридинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила, гексагидропирроло [3,4-Ь]пиррол(1Н)ила, (3а5,6а5)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол(1Н)ила, гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ила, (3а5,6а5)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ила, гексагидропирроло [3,4-с] пиррол-(1Н)ила, (3аК,6а5)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1Н)ила, октагидро-5Н-пирроло [3,2-с] пиридинила, октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинила, (4аК,7аК)октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинила, (4а5,7а5)-октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинила, гексагидропирроло [1,2-а] пиразин-(1 Н)ила, (7Κ, 8 а5)гексагидропирроло [1,2-а] пиразин-(1 Н)ила, (8а5)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аК)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8а8)октагидропирроло [1,2-а] пиразин-(1Н)ила, (8аК)-октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, гексагидропирроло [1,2-а] пиразин-(2Н)-она, октагидро-2Н-пиридо [1,2-а] пиразинила, 3-азабицикло [3.1.0] гексила, (1К,55)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло [3.2.1] октила, (1К,55)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8азабицикло [3.2.1] окт-2-енила, (1 Κ,5 δ)- 8-азабицикло [3.2.1] окт-2-енила, 9-азабицикло [3.3.1] нонила, (1К,58)-9-азабицикло [3.3.1] нонила, 2,5-диазабицикло [2.2.1] гептила, (1 δ ,4 δ)-2,5диазабицикло [2.2.1] гептила, 2,5-диазабицикло [2.2.2] октила, 3,8-диазабицикло [3.2.1] октила, (1Κ, 5δ)-3,8диазабицикло [3.2.1] октила, 1,4-диазабицикло [3.2.2] нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6диазаспиро [3.3] гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7диазаспиро[4.4]нонила или 6,9-диазаспиро[4.5]децила;
причем гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями Κ3 и одним дополнительным возможным заместителем Κ4; и причем, альтернативно, каждый гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя тремя или четырьмя заместителями Κ3;
Κ2 фенил или гетероарил;
причем каждый фенил и гетероарил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями Κ6 и одним возможным дополнительным заместителем Κ7;
Ка обозначает водород;
КЬ обозначает водород;
- 7 028344
К3, в каждом случае, независимо выбран из циано, галогена, гидрокси, оксо, С^алкила, галоген-С^ 8алкила, С1-8алкилкарбонила, С3-8алкокси, галоген-С1-8алкокси, С1-8алкокси-С1-8алкила, С3-8алкоксикарбонила, амино, С1-8алкиламино, (С1-8алкил)2-амино, амино-С1-8алкила, С1-8алкиламино-С1-8алкила, (С18алкил)2-амино-С1-8алкила, амино-С1-8алкиламино, С1-8алкиламино-С1-8алкиламино, (С1-8алкиламино-С18алкил)2-амино, (С1-8алкил)2-амино-С1-8алкиламино, [(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил]2-амино, (С18алкиламино-С1-8алкил) (С1-8алкил)амино, [(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил](С1-8алкил)амино, С1-8алкоксиС1-8алкиламино, (С1-8алкокси-С1-8алкил)2-амино, (С1-8алкокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино, С1-8алкилкарбонил-амино, С1-8алкоксикарбониламино, гидрокси-С1-8алкила, гидрокси-С1-8алкокси-С1-8алкила, гидрокси-С1-8алкиламино, (гидрокси-С1-8алкил)2-амино или (гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино;
К4 обозначает С3-14циклоалкил, С3-14циклоалкил-С1-8алкил, С3-14циклоалкиламино, фенил-С1-8алкил, фенил-С1-8алкоксикарбонил, фенилсульфонилокси-С1-8алкил, гетероциклил или гетероциклил-С1-8алкил; причем каждый случай С3-14циклоалкила, фенила и гетероциклила в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями К5;
К5, в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, С1-8алкила, галогенС1-8алкила, С1-8алкокси, галоген-С1-8алкокси, амино, С1-8алкиламино, (С1-8алкил)2-амино или С1-8алкилтио;
К6, в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, С1-8алкила, С18алкенила, галоген-С1-8алкила, гидрокси-С1-8алкила, С1-8алкокси, галоген-С1-8алкокси, С1-8алкокси-С18алкила, амино, С1-8алкиламино, (С1-8алкил)2-амино или С1-8алкил-тио; и
К7 обозначает С3-14циклоалкил, С3-14циклоалкилокси, фенил, гетероциклил или гетероарил, причем гетероциклил, отличный от К1, в каждом случае выбран из оксиранила, оксетанила, азетидинила, тетрагидрофуранила, пирролинила, пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазолинила, изотиазолидинила, оксазолинила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила, триазолидинила, оксадиазолинила, оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразолинила, тетразолидинила, пиранила, дигидро-2Н-пиранила, тиопиранила, 1,3-диоксанила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6тетрагидропиридинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила,
1.3- бензодиоксолила бензо [й][1,3]диоксолила, 1,4-бензодиоксанила, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксинила
2.3- дигидробензо [Ь][ 1,4] диоксинила, гексагидропирроло [3,4-Ь]пиррол-( 1Н)ила, (3а8,6а8)гексагидропирроло [3,4-Ь]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло [3,4-Ь]пиррол-( 1Н)ила, гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ила, (3а8,6а8)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ила, гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6а8)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6аК)-гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1Н)ила, октагидро-5Н-пирроло[3,2-с]пиридинила, октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинила, (4аК,7аК)октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинила, (4а8,7а8)октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинила, гексагидропирроло [1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (7К,8а8)гексагидропирроло [1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8а8)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аК)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8а8)октагидропирроло [1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аК)октагидропирроло [1,2-а]пиразин-(1Н)ила, гексагидропирроло [1,2-а]пиразин-(2Н)-она, октагидро-2Н-пиридо [1,2-а]пиразинила, 3 -азабицикло [3.1.0]гексила, (1К,58)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло[3.2.1]октила, (1К,58)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, (1К,58)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, 9-азабицикло[3.3.1]нонила, (1К,58)-9-азабицикло[3.3.1]нонила, 2,5-диазабицикло [2.2.1] гептила, (18,48)-2,5диазабицикло [2.2.1] гептила, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октила, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, (1К,58)-3,8диазабицикло [3.2.1] октила, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6диазаспиро [3.3] гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7диазаспиро[4.4]нонила, 6,9-диазаспиро[4.5]децила;
причем гетероарил в каждом случае выбран из фуранила, тиенила, пирролила, 2Н-пирролила, 3Нпирролила, пиразолила, 1Н-пиразолила, имидазолила, 1Н-имидазолила, изоксазолила, изотиазолила, оксазолила, 1,3-тиазолила, оксадиазолила, 1,2,4-оксадиазолила, 1,3,4-оксадиазолила, тиадиазолила, 1Нтетразолила, 2Н-тетразолила, пиридинила, пиримидинила, пиразинила, пиридазинила, триазинила, индолила, 1Н-индолила, индазолила, 1Н-индазолила, 2Н-индазолила, индолизинила, изоиндолила, бензофуранила, бензотиенила, бензотиофенила, бензоимидазолила, 1Н-бензоимидазолила, 1,3-бензоксазолила,
1.3- бензооксазолила, 9Н-пуринила, хинолинила, изохинолинила, хиназолинила, хиноксалинила, 1,3диазинила, 1,2-диазинила, 1,2-диазолила, 1,4-диазанафталинила, акридинила, фуро[3,2-Ь]пиридинила, фуро[3,2-с]пиридинила, фуро[2,3-с]пиридинила,6Н-тиено[2,3-Ь]пирролила, тиено[3,2-с]пиридинила, тиено[2,3-й]пиримидинила, 1Н-пирроло[2,3-Ь]пиридинила, 1Н-пирроло[2,3-с]пиридинила, 1Н-пирроло[3,2b] пиридинила, пирроло[1,2-а]пиразинила, пирроло[1,2-Ь]пиридазинила, пиразоло[1,5-а]пиридинила, пиразоло[1,5-а]пиразинила, 3Н-имидазо[4,5-Ь]пиридинила, имидазо[1,2-а]пиримидинила, имидазо[1,2c] пиримидинила, имидазо[1,2-Ь]пиридазинила, имидазо[1,2-а]пиразинила, имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазолила, имидазо[2,1-Ь][1,3,4]тиадиазолила, [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридинила или[1,2,4]триазоло[4,3а]пиридинила.
- 8 028344
Варианты осуществления
В одном варианте соединения формулы (1а1) соединение выбрано из группы, состоящей из
- 9 028344
- 12 028344
- 13 028344
- 14 028344
- 15 028344
или ее формы.
Терминология
Химические термины, используемые выше и по всему описанию, если специально не указано иное, должны пониматься специалистом как имеющие следующие указанные значения.
В рамках изобретения термин С1-8алкил вообще относится к насыщенным углеводородным радикалам, имеющим от одного до восьми атомов углерода в конфигурации прямой или разветвленной цепи, включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, н-пропил (также называемый пропилом или пропанилом), изопропил, н-бутил (также называемый бутилом или бутанилом), изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил (также называемый пентилом или пентанилом), н-гексил (также называемый гексилом или гек- 16 028344 санилом), н-гептил (также называемый гептилом или гептанилом), н-октил и т.п. В некоторых вариантах осуществления С1-8алкил включает, но не ограничен ими, С1-6алкил, С1-4алкил и т.п. С1-8алкил может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин С2-8алкенил вообще относится к частично ненасыщенным углеводородным радикалам, имеющим от двух до восьми атомов углерода в конфигурации прямой или разветвленной цепи и одну или более углерод-углеродных двойных связей, включая, но не ограничиваясь ими, этенил (также называемый винилом), аллил, пропенил и т.п. В некоторых вариантах осуществления С2-8алкенил включает, но не ограничен ими, С2-6алкенил, С2-4алкенил и т.п. С2-8алкенил может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин С2-8алкинил вообще относится к частично ненасыщенным углеводородным радикалам, имеющим от двух до восьми атомов углерода в конфигурации прямой или разветвленной цепи и одну или более углерод-углеродных тройных связей, включая, но не ограничиваясь ими, этинил, пропинил, бутинил и т. п. В некоторых вариантах осуществления С2-8алкинил включает, но не ограничен ими, С2-6алкинил, С2-4алкинил и т.п. С2-8алкинил может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин С1-8алкокси вообще относится к насыщенным углеводородным радикалам, имеющим от одного до восьми атомов углерода в конфигурации прямой или разветвленной цепи формулы: -О-С1-8алкил, включая, но не ограничиваясь ими, метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси, н-гексокси и т. п. В некоторых вариантах осуществления С1-8алкокси включает, но не ограничен ими, С1-6алкокси, С1-4алкокси и т.п. С18алкокси может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин С3-14циклоалкил вообще относится к насыщенному или частично ненасыщенному моноциклическому, бициклическому или полицикллческому углеводородному радикалу, включая, но не ограничиваясь ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил, 1Н-инданил, инденил, тетрагидро-нафталинил и т.п. В некоторых вариантах осуществления С3-14циклоалкил включает, но не ограничен ими, С3-8циклоалкил, С5-8циклоалкил, С3-110циклоалкил и т.п. С3-14циклоалкил может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин арил вообще относится к моноциклическому, бициклическому или полициклическому радикалу с кольцевой структурой атома углерода ароматического соединения, включая, но не ограничиваясь ими, фенил, нафтил, антраценил, флуоренил, азуленил, фенантренил и т. п. Арильный радикал может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин гетероарил вообще относится к моноциклическому, бициклическому или полициклическому радикалу с кольцевой структурой атома углерода ароматического соединения, в котором один или более членов атомов углерода, являющихся членами кольца, были заменены, где это позволяет стабильность структуры, одним или более гетероатомами, такими как атом О, 8 или Ν, включая, но не ограничиваясь ими, фуранил (также называемый фурилом), тиенил (также называемый тиофенилом), пирролил, 2Н-пирролил, 3Н-пирролил, пиразолил, 1Н-пиразолил, имидазолил, 1Н-имидазолил, изоксазолил, изотиазолил, оксазолил, 1,3-тиазолил, триазолил (такой как 1Н-1,2,3-триазолил и т.п.), оксадиазолил (такой как 1,2,4-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил и т.п.), тиадиазолил, тетразолил (такой как 1Н-тетразолил, 2Н-тетразолил и т.п.), пиридинил (также называемый пиридилом), пиримидинил, пиразинил, пиридазинил, триазинил, индолил, 1Н-индолил, индазолил, 1Н-индазолил, 2Н-индазолил, индолизинил, изоиндолил, бензофуранил, бензотиенил (также называемый бензотиофенилом), бензоимидазолил, 1Н-бензоимидазолил, 1,3-бензотиазолил, 1,3-бензоксазолил (также называемый 1,3бензооксазолилом), пуринил, 9Н-пуринил, хинолинил, изохинолинил, хиназолинил, хиноксалинил, 1,3диазинил, 1,2-диазинил, 1,2-диазолил, 1,4-диазанафталинил, акридинил, фуро[3,2-Ь]пиридинил, фуро[3,2с]пиридинил, фуро[2,3-с]пиридинил, 6Н-тиено[2,3-Ь]пирролил, тиено[3,2-с]пиридинил, тиено[2,3й] пиримидинил, 1Н-пирроло[2,3-Ь]пиридинил, 1Н-пирроло[2,3-с]пиридинил, 1Н-пирроло[3,2Ь]пиридинил, пирроло[1,2-а]пиразинил, пирроло[1,2-Ь]пиридазинил, пиразоло[1,5-а]пиридинил, пиразоло[1,5-а]пиразинил, имидазо[1,2-а]пиридинил, 3Н-имидазо[4,5-Ь]пиридинил, имидазо[1,2а]пиримидинил, имидазо[1,2-с]пиримидинил, имидазо[1,2-Ь]пиридазинил, имидазо[1,2-а]пиразинил, имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазолил, имидазо[2,1-Ь] [1,3,4]тиадиазолил, [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридинил, [1,2,4]триазоло[4,3-а]пиридинил и т.п. Гетероарильный радикал может быть в случае необходимости замещен на кольцевом атоме углерода или азота различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин гетероциклил вообще относится к насыщенному или частично ненасыщенному моноциклическому, бициклическому или полициклическому углеродному радикалу с кольцевой структурой, в котором один или более членов атомов углерода, являющихся членами кольца,
- 17 028344 были заменены, где это позволяет стабильность структуры, одним или более гетероатомами, такими как атом О, δ или Ν, включая, но не ограничиваясь ими, оксиранил, оксетанил, азетидинил, тетрагидрофуранил, пирролинил, пирролидинил, пиразолинил, пиразолидинил, имидазолинил, имидазолидинил, изоксазолинил, изоксазолидинил, изотиазолинил, изотиазолидинил, оксазолинил, оксазолидинил, тиазолинил, тиазолидинил, триазолинил, триазолидинил, оксадиазолинил, оксадиазолидинил, тиадиазолинил, тиадиазолидинил, тетразолинил, тетразолидинил, пиранил, дигидро-2Н-пиранил, тиопиранил, 1,3-диоксанил, 1,2,5,6-тетрагидропиридинил, 1,2,3,6-тетрагидропиридинил, пиперидинил, пиперазинил, морфолинил, тиоморфолинил, 1,4-диазепанил, 1,3-бензодиоксолил (также называемый бензо[й][1,3]диоксолил), 1,4бензодиоксанил, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксинил (также называемый 2,3дигидробензо [Ь][1,4] диоксинил), гексагидропирроло [3,4-Ь]пиррол-(1Н)ил, (3аδ,6аδ)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(1Н)ил, (3аК,6аК)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(1Н)ил, гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)-ил, (3аδ,6аδ)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ил, (3аК,6аР)гексагидропирроло [3,4-Ь] пиррол-(2Н)ил, гексагидропирроло [3,4-с] пиррол-(1Н)ил, (3аΚ,6аδ)гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-(1Н)ил, (3аК,6аК)гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-( 1Н)ил, октагидро-5Н-пирроло[3,2-с]пиридинил, октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинил, (4аК,7аК)октагидро6Н-пирроло [3,4-Ь]пиридинил, (4аδ,7аδ)октагидро-6Н-пирроло [3,4-Ь]пиридинил, гексагидропирроло [1,2а] пиразин-(1Н)ил, (7К, 8аδ)гексагидропирроло [1,2-а] пиразин-(1Н)ил, (8а δ) гексагидропирроло [1,2а] пиразин-(1Н)ил, (8аК)гексагидропирроло [1,2-а] пиразин-(1Н)ил, (8а δ )октагидропирроло [1,2-а] пиразин(1Н)ил, (8аК)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ил, гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(2Н)он, октагидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинил, 3-азабицикло[3.1.0]гексил, (1К^)-3-азабицикло[3.1.0]гексил, 8азабицикло[3.2.1]октил, (1К^)-8-азабицикло[3.2.1]октил, 8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енил, (1Κ,5δ)-8азабицикло[3.2.1]окт-2-енил, 9-азабицикло[3.3.1]нонил, (1К^)-9-азабицикло[3.3.1]нонил, 2,5диазабицикло [2.2.1] гептил, (>^)-2,5-диазабицикло[2.2.1]гептил, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октил, 3,8диазабицикло [3.2.1] октил, (1К^)-3,8-диазабицикло[3.2.1]октил, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонил, азаспиро[3.3]гептил, 2,6-диазаспиро[3.3]гептил, 2,7-диазаспиро[3.5]нонил, 5,8-диазаспиро[3.5]нонил, 2,7диазаспиро[4.4]нонил, 6,9-диазаспиро[4.5]децил и т.п. Гетероциклил может быть в случае необходимости замещен на кольцевом атоме углерода или азота различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин С1-8алкокси-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-ОС1-8алкил.
В рамках изобретения термин С1-8алкокси-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ΝΉ8алкил-О-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин (С1-8алкокси-С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -»8алкил-О-С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин С1-8алкокси-С1-8алкиламино-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С1-8алкил-NН-С1-8алкил-О-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин (С1-8алкокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С1-8алкил->С1-8алкил-О-С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин (С1-8алкокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С1-8алкил-»8алкил)(С1-8алкил-О-С1-8алкил).
В рамках изобретения термин С1-8алкокси-С1-8алкиламино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-NН-С1-8алкил-О-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин (С1-8алкокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-»8алкил-О-С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин (С1-8алкокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С^алкил-Ν (С1-8алкил) (С1-8алкил-О-С1-8алкил).
В рамках изобретения термин С1-8алкоксикарбонил относится к радикалу формулы -С(О)-О-С18алкил.
В рамках изобретения термин С1-8алкоксикарбонил-С2-8алкенил относится к радикалу формулы -С1-8алкенил-С(О)-О-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин С1-8алкоксикарбониламино относится к радикалу формулы -Ν4С(О)-О-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -NН-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин (С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -»8алкил)2.
В рамках изобретения термин С1-8алкиламино-С1-8алкенил относится к радикалу формулы -С2- 8алкенил-Ж-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин (С1-8алкил)2-амино-С2-8алкенил относится к радикалу формулы -С28алкенил-»8алкил)2.
В рамках изобретения термин С1-8алкиламино-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С18алкил-Ж-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин (С1-8алкил)2-амино-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -ОС1-8алкил-»8алкил)2.
- 18 028344
В рамках изобретения термин ''С1-8алкиламино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -0. 8алкил-ИН-С1_8алкил.
В рамках изобретения термин (С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С18алкил-Ы(С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин С1-8алкиламино-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -№Н-С1-8алкил-ИН-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин (С1-8алкил)2-амино-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ИН-С1-8алкил-М(С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин (С1-8алкиламино-С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил-ИН-С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин [(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил]2-амино относится к радикалу формулы -Ы[С1-8алкил-М(С1-8алкил)2]2.
В рамках изобретения термин (С1-8алкиламино-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -Ы(С1-8алкил)(С1-8алкил-№Н-С1-8алкил).
В рамках изобретения термин [(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил](С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -Ы(С1-8алкил)[С1-8алкил-М(С1-8алкил)2].
В рамках изобретения термин С1-8алкиламино-С2-8алкинил относится к радикалу формулы -С28алкинил-ИН-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин (С1-8алкил)2-амино-С2-8алкинил относится к радикалу формулы -С28алкинил-Ы(С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин С1-8алкилкарбонил относится к радикалу формулы -С(О)-С1-8алкил. В рамках изобретения термин С1-8алкилкарбониламино относится к радикалу формулы -ХН-С(О)С1-8алкил.
В рамках изобретения термин С1-8алкилтио относится к радикалу формулы -8-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин амино-С2-8алкенил относится к радикалу формулы -С2-8алкенилΝΉ2.
В рамках изобретения термин амино-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С1-8алкилЫН2.
В рамках изобретения термин амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-МН2.
В рамках изобретения термин амино-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ИН-С1- 8алкил-МН2.
В рамках изобретения термин (амино-С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -М(С18алкил-ИН2)2.
В рамках изобретения термин (амино-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -Н(С1-8алкил)(С1-8алкил-ИН2).
В рамках изобретения термин амино-С2-8алкинил относится к радикалу формулы -С2-8алкинилЫН2.
В рамках изобретения термин арил-С1-8алкоксикарбонил относится к радикалу формулы -С(О)-ОС1-8алкил-арил.
В рамках изобретения термин арил-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкиларил.
В рамках изобретения термин арил-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ИН-С1-
8алкиларил.
В рамках изобретения термин (арил-С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -Ν(Ομ 8алкил-арил)2.
В рамках изобретения термин (арил-С1-8алкил) (С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -^С1-8алкил)(С1-8алкиларил).
В рамках изобретения термин арил-С1-8алкиламино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С18алкил-NН-С1-8алкиларил.
В рамках изобретения термин (арил-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-^С1-8алкиларил)2.
В рамках изобретения термин (арил-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-^С1-8алкил)(С1-8алкиларил).
В рамках изобретения термин ариламино относится к радикалу формулы -ХН-арил.
В рамках изобретения термин ариламинокарбонил относится к радикалу формулы -С(О)-NНарил.
В рамках изобретения термин арилсульфонилокси-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С18алкил-О-8О2-арил.
В рамках изобретения термин бензоксикарбонил относится к радикалу формулы -С(О)О-СН2фенил.
В рамках изобретения термин С3-14циклоалкил-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С18алкил-С3-14циклоалкил.
В рамках изобретения термин С3-14циклоалкиламино относится к радикалу формулы -ΝΉ-0-
- 19 028344 14циклоалкил.
В рамках изобретения термин С3_14циклоалкилокси относится к радикалу формулы -О-С314циклоалкил.
В рамках изобретения термин галоген вообще относится к атому галогена, включая фтор, хлор, бром и йод.
В рамках изобретения термин галоген-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С18алкилгалоген, в котором С1-8алкил частично или полностью замещен одним или более атомами галогена, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин галоген-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С18алкилгалоген, в котором С1-8алкил частично или полностью замещен одним или более атомами галогена, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин галоген-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ΝΗ-ί'Υ 8алкилгалоген.
В рамках изобретения термин (галоген-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы Х(С1-8алкил)(С1-8алкилгалоген).
В рамках изобретения термин (галоген-С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -Ν(Οι_ 8алкилгалоген)2.
В рамках изобретения термин гетероарил-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С18алкилгетероарил.
В рамках изобретения термин гетероарил-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С18алкилгетероарил.
В рамках изобретения термин гетероарил-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ΝΗ-С'У 8алкилгетероарил.
В рамках изобретения термин (гетероарил-С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -Ы(С1-8алкилгетероарил)2.
В рамках изобретения термин (гетероарил-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -Ы(С1-8алкил)(С1-8алкилгетероарил).
В рамках изобретения термин гетероарил-С1-8алкиламино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-МН-С1-8алкилгетероарил.
В рамках изобретения термин (гетероарил-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкилгетероарил)2.
В рамках изобретения термин (гетероарил-С1-8алкил(С1-8алкил)амино-С1-8алкил ,,,, относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкил)(С1-8алкилгетероарил).
В рамках изобретения термин гетероариламино относится к радикалу формулы -ΝΗ-гетероарил.
В рамках изобретения термин гетероциклил-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С18алкилгетероциклил.
В рамках изобретения термин гетероциклил-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С18алкилгетероциклил.
В рамках изобретения термин гетероциклил-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ΝΗС1-8алкилгетероциклил.
В рамках изобретения термин (гетероциклил-С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -М(С1-8алкилгетероциклил)2.
В рамках изобретения термин (гетероциклил-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -Ν (С1-8алкил)(С1-8алкилгетероциклил).
В рамках изобретения термин гетероциклил-С1-8алкиламино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-МН-С1-8алкилгетероциклил.
В рамках изобретения термин (гетероциклил-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкилгетероциклил)2.
В рамках изобретения термин (гетероциклил-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкил)(С1-8алкилгетероциклил).
В рамках изобретения гетероциклиламино термин относится к радикалу формулы -ΝΗгетероциклил.
В рамках изобретения термин (гетероциклил)(С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил)(гетероциклил).
В рамках изобретения термин гетероциклиламино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С18алкил-МН-гетероциклил.
В рамках изобретения термин гетероциклилкарбонил относится к радикалу формулы -С(О)гетероциклил.
В рамках изобретения термин гетероциклилкарбонилокси относится к радикалу формулы -ОС(О)гетероциклил.
В рамках изобретения термин гетероциклилокси относится к радикалу формулы -О-гетероциклил.
В рамках изобретения термин гидрокси относится к радикалу формулы -ОН.
- 20 028344
В рамках изобретения термин гидрокси-С1-8алкокси-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С18алкил-О-С1-8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин гидрокси-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-ОН, в котором С1-8алкил частично или полностью замещен одним или более радикалами гидрокси, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин гидрокси-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ЫН-С'У 8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -Ы(С18алкил-ОН)2.
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -Ы(С1-8алкил)(С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-ЫН-С1-8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-Ы(С1-8алкил-ОН)2.
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил относится к радикалу формулы -С1-8алкил-Ы(С1-8алкил)(С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С1-8алкил-ЫН-С1-8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С1-8алкил-Ы(С1-8алкил-ОН)2.
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкокси относится к радикалу формулы -О-С1-8алкил-Ы(С1-8алкил)(С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ЫН-С1-8алкил-ЫН-С1-8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкил)2-амино относится к радикалу формулы -Ν (С1-8алкил-ЫН-С1-8алкил-ОН)2.
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ЫН-С1-8алкил-Ы(С1-8алкил-ОН)2.
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -Ы(С1-8алкил)(С1-8алкил-ЫН-С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин [(гидрокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил](С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -Ы(С1-8алкил)[С1-8алкил-Ы(С1-8алкил-ОН)2].
В рамках изобретения термин (гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкиламино относится к радикалу формулы -ЫН-С1-8алкил-Ы(С1-8алкил, С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин [(гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил](С1-8алкил)амино относится к радикалу формулы -Ы(С1-8алкил)[С1-8алкил-Ы(С1-8алкил)(С1-8алкил-ОН)].
В рамках изобретения термин заместитель означает позиционные переменные на атомах основной молекулы, которые присоединены в определяемом положении атома, заменяя один или более атомов водорода на определяемом атоме, при условии, что присоединяемый атом не превышает доступную валентность или общие валентности, так, что замещение приводит к стабильному соединению. Соответственно, комбинации заместителей и/или переменных допустимы, только если такие комбинации приводят к стабильным соединениям. Следует также отметить, что любой углерод, а также гетероатом с уровнем валентности, который представляется ненасыщенным, как описано или показано здесь, как предполагается, имеет достаточное число атома(ов) водорода, чтобы насытить описанные или показанные валентности.
В целях этого описания, где один или более заместителей для соединения формулы (1а1) охватывают функциональные группы, включенные в соединение формулы (1а1), каждая функциональная группа, находящаяся в любом местоположении в пределах раскрытого соединения, может быть независимо выбрана и быть независимо и/или в случае необходимости замещена.
В рамках изобретения термины независимо выбранный или каждый выбранный относятся к функциональным переменным в списке заместителей, которые могут быть присоединены более одного раза к структуре основной молекулы, причем структура замещения в каждом случае независима от структуры в любом другом случае. Далее, использование родового заместителя на основной структуре для приведенного здесь соединения, как следует понимать, включает замену родового заместителя специфическими заместителями, которые включены в рамки специфического рода, например, арил может быть независимо заменен фенилом или нафталинилом (также называемым нафтилом) и т.п., так, чтобы конечное соединение было включено в рамки соединений, описанных здесь.
В рамках изобретения термин каждый случай, когда он используется во фразе, такой как ...арил, арил-С1-8алкил, гетероциклил и гетероциклил-С1-8алкил, причем каждый случай арила и гетероциклила может быть в случае необходимости замещен одним или двумя заместителями... включает дополнительное независимое замещение на каждом арильном и гетероциклильном кольцах и на арильной и гете- 21 028344 роциклильной частях арил-С1-8алкила и гетероциклил-С1-8алкила.
В рамках изобретения термин в случае необходимости замещенные означает, что указанные заместители, группы, радикалы или части представляют диапазон рода и могут быть независимо выбраны, чтобы заменить один или более атомов водорода на определяемом атоме, присоединенном к основной молекуле.
В рамках изобретения термины стабильное соединение или стабильная структура означают соединение, которое является достаточно крепким для выделения с полезной степенью чистоты из реакционной смеси и его составления в эффективное терапевтическое средство.
Приведенные здесь названия соединений получали, используя программное обеспечение АСО ЬаЬк 1пбе\ Кате, поставляемое АСО ЬаЬк, и/или программное обеспечение СНстЭгал ИИга, поставляемое С.'атЬпбде8оП®. Когда название соединения, раскрытого здесь, находится в противоречии с изображенной структурой, показанная структура имеет преимущество перед названием для определения этого соединения. Номенклатура для радикалов-заместителей, определенных здесь, может немного отличаться от химического названия, из которого они получены; специалисту понятно, что определение радикала заместителя включает радикал, как обнаруживается на химическом названии.
Термин 8ΜΝ, если иначе не определено, относится к человеческому гену 8ΜΝ2, ДНК или РНК. В частном варианте осуществления термин 8ΜΝ1 относится к человеческому гену 8ΜΝ1, термин 8ΜΝ2 относится к человеческому гену 8ΜΝ2, ДНК или РНК.
Последовательности нуклеиновой кислоты для человеческих генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2 известны в данной области техники. В отношении последовательностей нуклеиновой кислоты человеческого 8ΜΝ1, см., например, ОепБапк Ассеккюп Νοδ. ΌΡ894095, ΝΜ-000344, ΝΜ-022874, и ВС062723. В отношении последовательностей нуклеиновой кислоты человеческого 8ΜΝ2, см., например, ΝΜ-022875, ΝΜ022876, ΝΜ-022877, ΝΜ-017411, ΌΡ894734 (Ы1с ТесЬпо1од1е8, 1пс. (ранее 1пуЦгодеп), Карлсбад, Калифорния), ВС000908, ВС070242, СК595484, СК598529, СК609539, И21914 и ВС015308.
Ген 8ΜΝ1 может быть найден последовательно по цепи человеческой хромосомы 5 от приблизительно нуклеотида 70220768 до приблизительно нуклеотида 70249769. Приблизительные местоположения экзонов 6, 7 и 8 и интронов 6 и 7 8ΜΝ1 на человеческой хромосоме 5 являются следующими:
70241893-70242003 экзон 6;
70242004-70247767 интрон 6;
70247768-70247821 экзон 7;
70247822-70248265 интрон 7 и
70248266-70248839 экзонов 8.
Ген 8ΜΝ2 может быть найден последовательно по цепи человеческой хромосомы 5 от приблизительно нуклеотида 69345350 до приблизительно нуклеотида 69374349.
Приблизительные местоположения экзонов 6, 7 и 8 и интронов 6 и 7 8ΜΝ2 на человеческой хромосоме 5 являются следующими:
69366468-69366578 экзон 6;
69366579-69372347 интрон 6;
69372348-69372401 экзон 7;
69372402-69372845 интрон 7 и
69372846-69373419 экзон 8.
В частных вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, показанные выше для экзонов 6, 7 и 8 и интронов 6 и 7 8ΜΝ1, используются в минигенных конструкциях нуклеиновой кислоты 8ΜΝ1, описанных здесь. В других частных вариантах осуществления нуклеотидные последовательности экзонов 6, 7 и 8 и интронов 6 и 7 8ΜΝ2 в приведенных здесь примерах используются в минигенных конструкциях нуклеиновой кислоты 8ΜΝ2, описанных здесь.
Термин 8тп или белок 8тп, если иначе не определено, относится к человеческому белку человека 8тп, который содержит аминокислотные остатки, кодируемые экзонами 1-7 гена 8ΜΝ2. В частном варианте осуществления белок 8тп стабилен и функционален ш уйго и/или ш У1уо, что может быть оценено способами, известными специалисту. В другом частном варианте осуществления белок 8тп представляет собой полноразмерный белок, кодируемый человеческим геном 8ΜΝ1 и/или геном 8ΜΝ2. В другом частном варианте осуществления белок 8тп имеет аминокислотную последовательность, которую можно найти в ОепБапк под номером доступа ΝΡ_000335, ААС50473.1, ААА66242.1 или ΝΡ_059107.
В рамках изобретения термин усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и аналогичные термины, если иначе не определено, относится к включению полной, интактной, необрезанной последовательности экзона 7 8ΜΝ2 в зрелую мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 (т.е. приводя к продукции полноразмерной мРНК 8ΜΝ2) ш уйго и/или ш У1уо, что может быть оценено способами, известными специалисту, так чтобы повышенные уровни белка 8тп продуцировались от гена 8ΜΝ2 ш уйго и/или ш У1уо, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы усиленная экспрессия стабильного и функционального белка 8тп продуцировалась от гена 8ΜΝ2 ш уйго и/или ш угуо, что может быть оценено способами, известными специали- 22 028344 сту; или так, чтобы экспрессия слитого белка, кодируемого минигеном, усиливалась ίη νίίτο и/или ίη νίνο, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы экспрессия белка 8шп, продуцированного от гена 8М^2, у пациента (например, животная модель для §МА или человек-субъект с 8МА), усиливалась.
В рамках изобретения термин усиливает включение экзона 7 5МШ в мРНК, которая транскрибируется от гена 5МШ и аналогичные термины, если иначе не определено, относится к включению полной, интактной, необрезанной последовательности экзона 7 5МШ в зрелую мРНК, которая транскрибируется от гена §МШ (т.е. приводя к продукции полноразмерной мРНК §МШ) ίη νίίτο и/или ίη νίνο, что может быть оценено способами, известными специалисту, так, чтобы повышенные уровни белка 8шп продуцировались от гена 5МШ ίη νίίτο и/или ίη νίνο, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы усиленная экспрессия стабильного и функционального белка 8шп продуцировалась от гена 5МШ ίη νίίτο и/или ίη νίνο, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы экспрессия слитого белка, кодируемого минигеном, усиливалась ίη νίίτο и/или ίη νίνο, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы экспрессия белка 8ти, продуцированного от гена 5МШ у пациента (например, животная модель для §МА или пациентчеловек), усиливалась.
В рамках изобретения термин существенное изменение в контексте количества мРНК означает, что количество мРНК не изменяется статистически значительным количеством, например, значение р меньше чем значение, выбранное из 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 или 0,00001.
В рамках изобретения термины субъект и пациент используются взаимозаменяемо и относятся к животному или любому живому организму, имеющему чувствительность и способность к самостоятельному движению и который требует для своего существования кислорода и органической пищи. Неограничивающие примеры включают виды: человека, лошадей, свиней, крупного рогатого скота, крыс, мышей, собак и кошек. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой млекопитающее или теплокровное позвоночное животное. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой животное, не являющееся человеком. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой человека. В одном частном варианте осуществления пациентом является пациент с §МА, являющийся человеком.
В рамках изобретения термин пожилой человек относится к человеку возрастом 65 лет или старше.
В рамках изобретения термин взрослый человек относится к человеку, имеющему возраст 18 лет или старше.
В рамках изобретения термин ребенок относится к человеку, имеющему возраст от 1 года до 18 лет.
В рамках изобретения термин младенец относится к новорожденному до 1 года.
В рамках изобретения термин малыш относится к человеку, имеющему возраст от 1 года до 3 лет.
Формы соединения
В некоторых вариантах осуществления, описанных здесь, соединение формулы (1а1) или ее формы выделяют для использования, причем форма выбрана из ее свободной кислоты, свободного основания или фармацевтически приемлемой соли.
В рамках изобретения термин выделенный означает физическое состояние соединения формулы (1а1) или ее формы после выделения и/или очистки в способе синтеза (например, из реакционной смеси) или из естественного источника или их комбинации согласно способу выделения или очистки, или способам, описанным здесь, или которые являются известными специалисту (например, хроматография, перекристаллизация и т. п.) с чистотой, достаточной для охарактеризовывания стандартными аналитическими методиками, описанными здесь или известными специалисту.
В рамках изобретения термин защищенный означает, что функциональная группа на соединении формулы (1а1) находится в форме, модифицированной таким образом, чтобы предотвратить нежелательные побочные реакции на защищенном участке, когда соединение подвергают реакции. Подходящие защитные группы известны специалисту, а также описаны в стандартных руководствах, таких как, например, Έν. Стеепе еί а1., Р^οίесί^νе Сгоирк ίη Отдашс ЗутНехЬ (1991), \УПеу. Νονν ΥοτΚ.
Соединения формулы (1а1) могут образовывать соли, которые включены в рамки этого описания. Ссылка на соединение формулы (1а1) включает ссылку на его соли, если не указано иное. Термин соль(и) в рамках изобретения обозначает соли с кислотой, образованные с неорганическими и/или органическими кислотами, а также соли с основанием, образованные с неорганическими и/или органическими основаниями. Кроме того, когда соединение формулы (1а1) содержит как основную группу, такую как, но не ограничиваясь ими, пиридин или имидазол, и кислотную группу, такую как, но не ограничиваясь ей, карбоновая кислота, можно сформировать цвиттерионы (внутренние соли), которые включены в рамки термина соль(и), как он используется здесь.
Термин фармацевтически приемлемая соль(и) в рамках изобретения обозначает такие соли соединений, описанных здесь, которые являются безопасными и эффективными (т.е. нетоксичными, физиологически приемлемыми) для использования на млекопитающих, и которые обладают биологической ак- 23 028344 тивностью, хотя другие соли также могут быть использованы. Соли соединений формулы (1а1) можно образовать, например, вводя соединение формулы (1а1) в реакцию с количеством кислоты или основания, таким как эквивалентное или стехиометрическое количество, в такой среде, как среда, в которой соль осаждается, или в водной среде, с последующей лиофилизацией.
Фармацевтически приемлемые соли включают одну или более солей кислых или основных групп, присутствующих в соединениях, описанных здесь. Варианты солей присоединения с кислотой включают, но не ограничены ими, ацетат, кислый фосфат, аскорбат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, битартрат, борат, бутират, хлорид, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, этансульфонат, формиат, фумарат, гентизинат, глюконат, глюкуронат, глутамат, гидробромид, гидрохлорид, дигидрохлорид, гидройодид, изоникотинат, лактат, малеат, метансульфонат, нафталинсульфонат, нитрат, оксалат, памоат, пантотенат, фосфат, пропионат, сахарат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, толуолсульфонат (также известный как тозилат), трифторацетат и т.п. Один или более вариантов солей присоединения с кислотой включают хлорид, гидрохлорид, дигидрохлорид, тригидрохлорид, гидробромид, ацетат, диацетат или трифторацетат. Более конкретные варианты осуществления включают хлорид, гидрохлорид, дигидрохлорид, гидробромид или трифторацетат.
Дополнительно, кислоты, которые вообще считают подходящими для образования фармацевтически пригодных солей из основных фармацевтических соединений, обсуждаются, например, Р. 8!аЬ1 с1 а1., СатП1е О. (екк.) НапкЪоок о£ Ркагтасеикса1 8акк. Ргорегкек, 8е1ес1юп апк Ике. (2002) Ζιιπαΐι: \νίΝ\·-νί.’Η; δ. Вегде е1 а1., 1оита1 о£ Ркагтасеикса1 8с1епсек (1977) 66(1) 1-19; Р. Оои1к, 1п1егпакопа1 1. о£ Ркагтасеикск (1986) 33, 201-217; Апкегкоп е! а1., Тке Ргасксе о£ Μек^с^па1 Скет1к!гу (1996), Асакетк Ргекк, №те Уогк; и в Тке Огапде Воок (кее, тееЪкке £ог Роок & Эгид АктиикЦаПоп. VакЬ^пдΐоп, Э.С.). Эти раскрытия включены в настоящее описание путем ссылки.
Подходящие основные соли включают, но не ограничены ими, соли алюминия, аммония, кальция, лития, магния, калия, натрия, цинка и диэтаноламина. Некоторые соединения, описанные здесь, могут также образовывать фармацевтически приемлемые соли с органическими основаниями (например, органическими аминами), такими как, но не ограничиваясь ими, дициклогексиламины, трет-бутиламины и т.п., и с различными аминокислотами, такими как, но не ограничиваясь ими, аргинин, лизин и т. п. Основные азотсодержащие группы могут быть кватернизованы такими агентами как низшие галогеналкилы (например, метил-, этил- и бутил-хлориды, бромиды и йодиды), диалкилсульфаты (например, диметил-, диэтил- и дибутил-сульфаты), длинноцепочечные галогениды (например, децил-, лаурил- и стеарилхлориды, бромиды и йодиды), аралкил галогениды (например, бензил- и фенетил-бромиды) и другие.
Все такие соли с кислотой и соли с основанием могут быть фармацевтически приемлемыми солями в рамках описания, приведенного здесь, и все такие соли с кислотой и основанием считаются эквивалентными свободным формам соответствующих соединений в целях, описанных здесь.
В рамках изобретения термин в основном чистый относится к соединениям, состоящим в основном из единственного изомера в количестве, больше или равном 90%, в количестве, больше или равном 92%, в количестве, больше или равном 95%, в количестве, больше или равном 98%, в количестве, больше или равном 99%, или в количестве, равном 100% единственного изомера.
Полиморфные кристаллические и аморфные формы соединений формулы (1а1) и соли, сольваты, сложные эфиры и пролекарства соединений формулы (1а1) также включены в понятие соединений, описанных здесь.
Применения соединений
Здесь описаны соединения формулы (1а1) или ее формы, которые усиливают включение экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2. Было показано с использованием тестов, описанных здесь (см. раздел биологических примеров, ниже), что такие соединения формулы (1а1) или ее формы усиливают включение экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2. Соответственно, соединения формулы (1а1) или ее формы могут быть использованы в качестве усилителей включения экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2.
В одном аспекте изобретение относится к способам модуляции включения экзона 7 δΜΝ2 в РНК, транскрибируемую от гена δΜΝ2, включающему контактирование человеческой клетки с соединением формулы (1а1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способам модуляции включения экзона 7 δΜΝ2 в РНК, транскрибируемую от гена δΜΝ2, включающим контактирование человеческой клетки с соединением формулы (1а1) или ее формы, которая модулирует экспрессию минигена δΜΝ2, описанного здесь или в международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В одном варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в примерах международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. Человеческую клетку можно ввести в контакт с соединением формулы (1а1) или ее формы ш νίΙΐΌ и/или ш У1уо, например, в организме животного или человека. В частном варианте осуществления человеческая клетка получена от человека или находится в организме человека. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с δΜΑ или находит- 24 028344 ся в организме человека-пациента с δΜΑ.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2, включающему контактирование человеческой клетки с соединением формулы 0а1) или ее формы. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2, включающему контактирование человеческой клетки с соединением формулы 0а1) или ее формы, которая усиливает экспрессию минигена δΜΝ2, описанного здесь или в Международной Публикации \νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В одном варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в примерах международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. Человеческую клетку можно ввести в контакт с соединением формулы 0а1) или ее формы ίη νίίΓο и/или ίη νίνο, например, в организме животного или человека. В частном варианте осуществления человеческая клетка получена от человека или находится в организме человека. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с δΜΑ или находится в организме человека-пациента с δΜΑ. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с δΜΑ или находится в организме человекапациента с δΜΑ, причем δΜΑ вызвана инактивирующей мутацией или делецией в гене δΜΝ1 на обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена δΜΝ1. В другом варианте осуществления человеческая клетка представляет собой человеческую клетку от пациента с δΜΑ. В некоторых вариантах осуществления человеческая клетка происходит от линии клеток, такой как ΟΜ03813, 0Μ00232, ΟΜ09677 и/или ΟΜ23240 (доступна от ΟογιοΙΙ ΙηκΙίΙυίο). В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы 0а1) или ее формы.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам усиления включения экзона 7 δΜΝ1 и δΜΝ2 в РНК, транскрибируемую от генов δΜΝ1 и δΜΝ2, включающим контактирование человеческой клетки с соединением формулы 0а1) или ее формы. Человеческую клетку можно ввести в контакт с соединением формулы 0а1) или ее формы ίη νίίτο и/или ίη νίνο, например, в организме животного или человека. В частном варианте осуществления человеческая клетка получена от человека или находится в организме человека. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с δΜΑ или находится в организме человека-пациента с δΜΑ. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы 0а1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способу модуляции включения экзона 7 δΜΝ2 в РНК, транскрибируемую от гена δΜΝ2, включающему введение животной модели для δΜΑ соединения формулы 0а1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу модуляции включения экзона 7 δΜΝ2 в РНК, транскрибируемую от гена δΜΝ2, включающему введение животной модели для δΜΑ соединения формулы 0а1) или ее формы, которое модулирует экспрессию минигена δΜΝ2, описанного здесь или в международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В одном варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в примерах международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом зарианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы 0а1) или ее формы.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2, включающему введение животной модели для δΜΑ соединения формулы 0а1) или ее формы. Б другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2, включающему введение животной модели для δΜΑ соединения формулы 0а1) или ее формы, которое усиливает экспрессию минигена δΜΝ2, описанного здесь или в международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В одном варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в примерах международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ш1) или ее формы.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 δΜΝ2 в РНК, транскрибируемую от гена δΜΝ2, включающему введение животной модели для δΜΑ соединения формулы 0а1) или ее формы. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы 0а1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способу увеличения количества белка διηη. включающему контактирование человеческой клетки с соединением формулы 0а1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу увеличения количества белка διηη„ включающе- 25 028344 му контактирование человеческой клетки с соединением формулы (1а1), которое усиливает включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ. Человеческую клетку можно ввести в контакт с соединением формулы (1а1) или ее формы ίη νίΐΓΟ и/или ίη νίνο, например, в организме животного или человека. В частном варианте осуществления человеческая клетка получена от человека или находится в организме человека. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с ЗМА или находится в организме человека-пациента с ЗМА. В другом варианте осуществления человеческая клетка представляет собой человеческую клетку от пациента с ЗМА. В некоторых вариантах осуществления человеческая клетка происходит от линии клеток, такой как СМ03813, СМ00232, СМ09677 и/или СМ23240 (доступна от Сопс11 ΙηκΙίΙυίο). В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (1а1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способу увеличения количества белка Зтп, включающему введение животной модели для ЗМА соединения формулы (1а1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу увеличения количества белка Зтп, включающему введение животной модели для ЗМА соединения формулы (1а1), которое усиливает включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ в, например, клеточном или бесклеточном тесте, таком как описанный в биологических примерах, ниже.
В одном варианте осуществления соединение формулы (1а1) усиливает экспрессию минигена, описанного здесь или в международной публикации XV0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В частном варианте осуществления соединение формулы (1а1) усиливает экспрессию минигена, описанного в Примерах международной публикации ν0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом частном варианте осуществления соединение формулы (1а1) усиливает экспрессию минигена, описанного в биологическом примере 1, ниже. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (1а1) или ее формы.
В одном варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (1а1) или ее формы для получения лекарственного средства, которое усиливает включение экзона 7 ЗМ№ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМ№. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (1а1) или ее формы для получения лекарственного средства, которое усиливает включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМ№, таким образом увеличивая экспрессию белка Зтп у пациента-человека. В частном варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы усиливает включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (1а1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способам усиления включения экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМ№, у пациента-человека, включающим введение человеку эффективного количества соединения формулы (1а1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМ№, у пациента-человека, включающим введение человеку эффективного количества соединения формулы (1а1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В некоторых вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы вводят пациенту-человеку в фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В частном варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы усиливает включение экзона 7 ЗМ№ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМ№, в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с ЗМА. В другом частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с ЗМА, причем ЗМА вызвана инактивирующей мутацией или делецией в гене 3МШ на обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена ЗМШ. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (1а1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способам усиления экспрессии белка Зтп у пациентачеловека, включающим введение человеку эффективного количества соединения формулы (1а1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления экспрессии белка Зтп у пациента-человека, включающим введение человеку эффективного количества соединения формулы (1а1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМ№. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы вводят пациенту-человеку в фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В частном варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы усиливает включение экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже), или в международной публикации ν0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (см., например, Примеры в этих публикациях), каждая из которых полностью включена в настоящее описание
- 26 028344 путем ссылки.
В частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8ΜΑ. В другом частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8ΜΑ, причем 8ΜΑ вызвана инактивирующей мутацией или делецией в теломерной копии гена 8ΜΝ1 в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8ΜΝ1. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (1а1) или ее формы.
В другом варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (1а1) или ее формы для получения лекарственного средства, которое усиливает экспрессию белка 8тп у пациента-человека. В частном варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2, как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В другом варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2, как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже), или в международной публикации XVΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (см., например, примеры в этих публикациях), каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (1а1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способам лечения спинальной мышечной атрофии (8ΜΑ), включающему введение пациенту эффективного количества соединения формулы (1а1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8ΜΑ у пациентачеловека, включающему введение пациенту эффективного количества соединения формулы (1а1) или ее формы. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8ΜΑ у пациента-человека, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, включающей эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (1а1) или ее формы.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8ΜΑ у пациентачеловека, включающему зведение пациенту эффективного количества соединения формулы (1а1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8ΜΑ у пациента-человека, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, включающей эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8ΜΑ у пациентачеловека, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, включающая эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В частном варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В другом варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже) или в международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (см., например, Примеры в этих публикациях), каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (1а1) или ее формы.
В другом варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (1а1) или ее формы в получении лекарственного средства для лечения 8ΜΑ у пациента-человека. В частном варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2, как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В другом варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2, как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже), или в международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (см., например, Примеры в этих публикациях), каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (1а1) или ее формы.
В варианте способа по изобретению соединения формулы (1а1) или ее формы используются в комбинации с одним или более дополнительными средствами. Соединение(я) формулы (1а1) или ее формы может вводиться пациенту или контактировать с клеткой до, одновременно с или после введения пациенту или контактирования клетки с дополнительным средством(ами). Соединение(я) формулы (1а1) или ее формы и дополнительное средство(а) может вводиться пациенту или контактировать с клеткой в
- 27 028344 единственной композиции или разных композициях. В некоторых вариантах осуществления соединение(я) формулы (1а1) или ее формы используется в комбинации с заменой гена 8ΜΝ1 (с использованием. например. вирусных векторов доставки). В других частных вариантах осуществления соединение(я) формулы (1а1) или ее формы используется в комбинации с заменой клетки с использованием дифференцированных стволовых клеток 8ΜΝ1+/+ и/или 8ΜΝ2+/+. В других частных вариантах осуществления соединение^) формулы (1а1) или ее формы используются в комбинации с заменой клетки с использованием дифференцированных стволовых клеток 8ΜΝ1+/+. В других частных вариантах осуществления соединение^) формулы (1а1) или ее формы используются в комбинации с заменой клетки с использованием дифференцированных стволовых клеток 8ΜΝ2+/+. В другом частном варианте осуществления соединение^) формулы (1а1) или ее формы используется в комбинации с акларубицином. В другом частном варианте осуществления соединение(я) формулы (1а1) или ее формы используется в комбинации с активатором транскрипции. таким как ингибитор гистон деацетилазы (НО АС) (например. бутираты. вальпроевая кислота и гидроксимочевина) и стабилизаторами мРНК (например. мРНК декэпирующий ингибитор КС3039 от КерНдеп).
В некоторых вариантах осуществления лечение 8ΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) имеет терапевтический эффект и/или благоприятный эффект. В частном варианте осуществления лечение 8ΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) производит один. два или более из следующих эффектов: (ί) уменьшает или облегчает серьезность 8ΜΑ; (ίί) задерживает начало 8ΜΑ; (ίίί) ингибирует прогрессию 8ΜΑ; (ιν) уменьшает частоту госпитализации пациента; (ν) уменьшает продолжительность госпитализации для пациента; (νί) увеличивает выживаемость пациента; (νίί) улучшает качество жизни пациента; (νίίί) уменьшает количество симптомов. связанных с 8ΜΑ; (ΐχ) уменьшает или облегчает серьезность симптома(ов). связанного с 8ΜΑ; (х) уменьшает продолжительность симптома. связанного с 8ΜΑ; (χί) предотвращает рецидив симптома. связанного с 8ΜΑ; (χίί) ингибирует развитие или начало симптома 8ΜΑ; и/или (χίίί) ингибирует прогрессию симптома. связанного с 8ΜΑ.
Симптомы 8ΜΑ включают слабость мышц. недостаточный мышечный тонус. слабый крик. слабый кашель. вялость или тенденцию к падению. затруднение всасывания или глотания. затруднение дыхания. накопление секреций в легких или верхних дыхательных путях. сжимание кулака потной рукой. дрожь/вибрацию языка. голову. часто наклоняемую к одной стороне даже в положении лежа. ноги. которые имеют тенденцию быть более слабыми. чем руки. ноги. часто принимающие положение лягушачьих лапок. трудности с кормлением. повышенную восприимчивость к инфекциям дыхательных путей. слабость кишечника/мочевого пузыря. массу тела ниже нормы. неспособность сидеть без поддержки. невозможность ходить. невозможность ползать и гипотонию. арефлексию и множественные врожденные контрактуры (артрогрипоз). связанные с потерей клеток переднего рога.
В частном варианте осуществления лечение 8ΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) производит один. два или более следующих эффектов: (ί) сокращение потери силы мышц; (ίί) увеличение силы мышцы; (ίίί) сокращение атрофии мышцы; (ιν) сокращение потери моторной функции; (ν) увеличение количества мотонейронов; (νίί) сокращение потери мотонейронов; (νίίί) защита 8ΜΝ дефицитных мотонейронов от дегенерации; (ΐχ) увеличение моторной функции; (х) увеличение легочной функции; и/или (χί) сокращение потери легочной функции.
В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность ребенка или младенца к сидению. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца. ребенка младшего возраста. ребенка или взрослого вставать без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца. ребенка младшего возраста. ребенка или взрослого ходить без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца. ребенка младшего возраста. ребенка или взрослого бегать без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца. ребенка младшего возраста. ребенка или взрослого дышать без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца. ребенка младшего возраста. ребенка или взрослого поворачиваться во сне без посторонней
- 28 028344 помощи. В другом варианте осуществления лечение δΜΑ соединением формулы (1а1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца, ребенка младшего возраста, ребенка или взрослого глотать без посторонней помощи.
В некоторых вариантах осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры δΜN, такие как δΕφ ΙΌ ΝΟ. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или δΕφ ΙΌ ΝΟ. 2, 9 или 12, и зонды δΜN, такие как δΕφ ΙΌ ΝΟ. 3 или 10), используется в тесте, таком как ΚΤ-ΡΟΚ, ΚΤ-ςΡΕ’Κ. ΚΤ по окончании ΡΟΚ, ΡΟΚ, ςΡΕΡ, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузерн-блот, для определения того, усиливает ли соединение формулы (1а1) или ее формы включение экзона 7 δΜN1 и/или δΜN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN1 и/или δΜN2. В некоторых вариантах осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры δΜN, такие как δΕφ ΙΌ ΝΟ. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или δΕφ ΙΌ ΝΟ. 2, 9 или 12, и зонды δΜN, такие как δΕφ ΙΌ ΝΟ. 3 или 10), используется в тесте, таком как ΚΤ-ΡΟΚ, ΡΤ-ςΡΕΡ, ΚΤ по окончании ΡΟΚ, ΡΟΚ, ςΡΕΡ, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузерн-блот, или фармацевтическом продукте или наборе для теста, таких как описанные ниже, для контроля ответов пациента на соединение формулы (Ш1) или ее формы.
Популяция пациентов
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (^1) или ее формы, или его фармацевтическую композицию вводят пациенту, страдающему δΜΑ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Щ1) или ее формы вводят пациенту, предрасположенному или склонному к δΜΑ. В частном варианте осуществления соединение формулы (Щ1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту-человеку, причем пациент-человек представляет собой пациента с δΜΑ, причем δΜΑ вызвана инактивирующей мутацией или делецией в гене δΜN1 в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена δΜN1. В некоторых вариантах осуществления пациента-человека генотипируют до введения соединения формулы (^1) или ее формы или его фармацевтической композиции, чтобы определить, имеет ли пациент инактивирующую мутацию или делецию в теломерной копии гена δΜN1 в обеих хромосомах, которая приводит к потере функции гена δΜN1. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Щ1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 0 δΜΑ. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (^1) или ее формы, или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 1 δΜΑ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Щ1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 2 δΜΑ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Щ1) или ее формы, или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 3 δΜΑ. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Щ1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 4 δΜΑ.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ш1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту, который получит или может получить пользу от увеличенного включения экзона 7 δΜN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Да1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту, который получит или может получить пользу от увеличенной экспрессии белка δтη.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ш1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят человеку, который имеет возраст в диапазоне от приблизительно О месяцев до приблизительно 6 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 12 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 18 месяцев, от приблизительно 18 до приблизительно 36 месяцев, от приблизительно 1 до приблизительно 5 лет, от приблизительно 5 до приблизительно 10 лет, от приблизительно 10 до приблизительно 15 лет, от приблизительно 15 до приблизительно 20 лет, от приблизительно 20 до приблизительно 25 лет, от приблизительно 25 до приблизительно 30 лет, от приблизительно 30 до приблизительно 35 лет, от приблизительно 35 до приблизительно 40 лет, от приблизительно 40 до приблизительно 45 лет, от приблизительно 45 до приблизительно 50 лет, от приблизительно 50 до приблизительно 55 лет, от приблизительно 55 до приблизительно 60 лет, от приблизительно 60 до приблизительно 65 лет, от приблизительно 65 до приблизительно 70 лет, от приблизительно 70 до приблизительно 75 лет, от приблизительно 75 до приблизительно 80 лет, от приблизительно 80 до приблизительно 85 лет, от приблизительно 85 до приблизительно 90 лет, от приблизительно 90 до приблизительно 95 лет или от приблизительно 95 до приблизительно 100 лет.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ш1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят младенцу. В других вариантах осуществления соединение формулы (Щ1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят ребенку младшего возраста. В других вариантах осуществления соединение формулы (^1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят ребенку. В других вариантах осуществления соединение формулы (Щ1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят взрослому человеку. В других вариантах осуществления соединение формулы (Щ1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пожилому человеку.
- 29 028344
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МА у пациента, для которого существует риск проявления 8МА. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы, или его фармацевтической композиции вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МА у пациента, для которого существует риск проявления 8МА. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы, или его фармацевтической композиции вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МА у пациента, для которого существует риск проявления 8МА. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его фармацевтической композиции вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МА у пациента, для которого существует риск проявления 8МА.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту 8МА для лечения или облегчения 8МА. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его фармацевтической композиции вводят пациенту 8МА для лечения или облегчения 8МА. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его фармацевтической композиции вводят пациенту 8МА, чтобы предотвратить прогрессию 8МА. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его фармацевтической композиции вводят пациенту 8МА для лечения или облегчения 8МА.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы, или его лекарственного средства вводят пациенту, страдающему 8МА. В других вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы вводят пациенту, предрасположенному или склонному к 8МА. В частном варианте осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту-человеку, причем пациент-человек представляет собой пациента с 8МА, причем 8МА вызвана инактивирующей мутацией или делецией в гене 8МШ на обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8МШ. В некоторых вариантах осуществления пациента-человека генотипируют до введения соединения формулы (1а1) или ее формы или его лекарственного средства, чтобы определить, имеет ли пациент инактивирующую мутацию или делецию в теломерной копии гена 8МШ в обеих хромосомах, которая приводит к потере функции гена 8МШ. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 0 8МА. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 1 8МА. В других вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 2 8МА. В других вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 3 8МА. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 4 8МА.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту, который получит или может получить пользу от увеличенного включения экзона 7 8МШ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту, который получит или может получить пользу от увеличенной экспрессии белка 8тп.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят человеку, который имеет возраст в диапазоне от приблизительно 0 месяцев до приблизительно 6 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 12 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 18 месяцев, от приблизительно 18 до приблизительно 36 месяцев, от приблизительно 1 до приблизительно 5 лет, от приблизительно 5 до приблизительно 10 лет, от приблизительно 10 до приблизительно 15 лет, от приблизительно 15 до приблизительно 20 лет, от приблизительно 20 до приблизительно 25 лет, от приблизительно 25 до приблизительно 30 лет, от приблизительно 30 до приблизительно 35 лет, от приблизительно 35 до приблизительно 40 лет, от приблизительно 40 до приблизительно 45 лет, от приблизительно 45 до приблизительно 50 лет, от приблизительно 50 до приблизительно 55 лет, от приблизительно 55 до приблизительно 60 лет, от приблизительно 60 до приблизительно 65 лет, от приблизительно 65 до приблизительно 70 лет, от приблизительно 70 до приблизительно 75 лет, от приблизительно 75 до приблизительно 80 лет, от приблизительно 80 до приблизительно 85 лет, от приблизительно 85 до приблизительно 90 лет, от приблизительно 90 до приблизительно 95 лет или от приблизительно 95 до приблизительно 100 лет.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят младенцу. В других вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят ребенку младшего возраста. В других вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят ребенку. В других вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят взрослому человеку. В других вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пожилому человеку.
- 30 028344
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту, чтобы предотвратить начало §МЛ у пациента, для которого существует риск проявления §МЛ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту, чтобы предотвратить начало §МЛ у пациента, для которого существует риск проявления §МЛ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту, чтобы предотвратить начало §МЛ у пациента, для которого существует риск проявления §МЛ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту, чтобы предотвратить начало §МЛ у пациента, для которого существует риск проявления §МЛ.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (1а1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту §МЛ для лечения или облегчения §МЛ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту §МЛ для лечения или облегчения §МЛ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту §МЛ, чтобы предотвратить прогрессию 8МЛ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту §МЛ для лечения или облегчения §МЛ.
Способ введения
При введении пациенту соединение формулы (1а1) или ее формы предпочтительно вводят как компонент композиции, которая в случае необходимости включает фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. Композиция может вводиться перорально или любым другим удобным путем, например, инфузией или болюсным вливанием, абсорбцией через эпителиальные или кожнослизистые покровы (например, слизистую оболочку полости рта, прямой кишки и кишечника) и может вводиться вместе с другим биологически активным средством. Введение может быть системным или местным. Известны различные системы доставки, например, инкапсуляция в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, капсулах, и они могут использоваться для введения соединения.
Способы введения включают, но не ограничены ими, парентеральный, кожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, внутриносовой, эпидуральный, пероральный, подъязычный, внутриносовой, внутрицеребральный, внутривлагалищный, чрескожный, ректальный, ингаляцией или топический, особенно в уши, нос, глаза или кожу. Способ введения оставлен на усмотрение практикующего врача. В большинстве случаев введение приводит к высвобождению соединения в кровоток. В частном варианте осуществления соединение вводят перорально.
Дозировка и лекарственные формы
Количество соединения формулы (1а1) или ее формы, которое будет эффективно в лечении §МЛ, зависит, например, от пути введения, типа 8МЛ, общего состояния здоровья пациента, этнической принадлежности, возраста, массы тела и пола пациента, диеты, времени и серьезности §МЛ, и должно быть определено согласно суждению практикующего врача и обстоятельств каждого пациента или лица.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество, профилактически эффективное количество или терапевтически эффективное количество в контексте введения соединения формулы (1а1) или ее формы, или его композиции или лекарственного средства, относится к количеству соединения формулы (1а1), которое оказывает терапевтический эффект и/или благоприятное воздействие. В некоторых частных вариантах осуществления эффективное количество, профилактически эффективное количество или терапевтически эффективное количество в контексте введения соединения формулы (1а1) или ее формы, или его композиции или лекарственного средства, приводит к одному, двум или более из следующих эффектов: (ί) уменьшает или облегчает серьезность §МЛ; (ίί) задерживает начало §МЛ; (ίίί) ингибирует прогрессию 8МЛ; (ίν) уменьшает частоту госпитализации пациента; (ν) уменьшает продолжительность госпитализации для пациента; (νί) увеличивает выживаемость пациентов; (νίί) улучшает качество жизни пациента; (νίίί) уменьшает количество симптомов, связанных с 8МЛ; (ΐχ) уменьшает или облегчает серьезность симптома(ов), связанного с 8МЛ; (х) уменьшает продолжительность симптома, связанного с 8МЛ; (χί) предотвращает рецидив симптома, связанного с 8МЛ; (χίί) ингибирует развитие или начало симптома 8МЛ; и/или (χίίί) ингибирует прогрессию симптома, связанного с 8МЛ. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы представляет собой количество, эффективное для усиления включения экзона 7 §МЫ2 в мРНК §МЫ2, которая транскрибируется от гена 8МЫ2, и увеличения уровней белка §ти, продуцируемого от гена §МЫ2, и, таким образом, создания желательного благоприятного воздействия у пациента. В некоторых случаях желаемый эффект может быть определен путем анализа или количественного определения: (1) включения экзона 7 §МЫ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2; или (2) уровней белка 8ти, продуцируемого от гена §МЫ2. Неограничивающие примеры эффективных количеств соединения формулы (1а1) или ее формы описаны здесь.
Например, эффективное количество может быть количеством, требуемым для лечения §МЛ у пациента-человека, или количеством, требуемым для усиления включения экзона 7 §МЫ2 в мРНК, которая
- 31 028344 транскрибируется от гена 8ΜΝ2, у пациента-человека, или количеством, требуемым для увеличения уровней белка 8тп, продуцируемого от гена 8ΜΝ2 у пациента-человека. В частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8ΜА.
В общем, эффективное количество будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,001 мг/кг/сутки до приблизительно 500 мг/кг/сутки для пациента или субъекта, имеющего массу тела в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 200 кг. Типичный взрослый пациент, как ожидают, будет иметь в среднем массу тела в диапазоне от приблизительно 70 до приблизительно 100 кг.
В рамках настоящего описания эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы для применения в получении лекарственного средства, получении фармацевтического набора или в способе лечения 8ΜА у пациента-человека включает количество в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 35000 мг. В частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8ΜА.
Композиции, описанные здесь, составляют для введения пациенту через любой путь доставки лекарственного средства, известный в данной области техники. Неограничивающие примеры включают пероральный, глазной, ректальный, щечный, топический, носовой, офтальмический, подкожный, внутримышечный, внутривенный (болюс и инфузия), внутрицеребральный, чрескожный и легочный пути введения.
Фармацевтические композиции
Варианты осуществления, описанные здесь, включают использование соединения формулы (1а1) или ее формы в фармацевтической композиции. В частном варианте осуществления описано применение соединения формулы (1а1) или ее формы в фармацевтической композиции для лечения 8ΜА у пациентачеловека, включающее введение эффективного количества соединения формулы (1а1) или ее формы в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом. В частном варианте осуществления пациентчеловек представляет собой пациента с 8ΜΛ.
Соединение формулы (1а1) или ее формы может в случае необходимости быть в форме композиции, включающей соединение или его форму и дополнительный носитель, эксципиент или разбавитель. Другие варианты осуществления включают фармацевтические композиции, включающие эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В частном варианте осуществления фармацевтические композиции являются подходящими для введения животному и/или человеку. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть в любой форме, которая позволяет вводить композицию пациенту.
В частном варианте осуществления и в этом контексте термин фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель означает носитель, эксципиент или разбавитель, апробированный регулирующим агентством федеральной власти или власти штата или указанный в Фармакопее США или другой в целом признанной фармакопее для использования на животных, и более конкретно, у человека. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному)), эксципиенту или носителю, с которым вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая таковые нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода представляет собой специфический носитель для внутривенно вводимых фармацевтических композиций. Физиологические растворы и водный раствор декстрозы и растворы глицерина могут также использоваться как жидкие носители, особенно для инъецируемых растворов.
Типичные композиции и лекарственные формы включают один или более эксципиентов. Подходящие эксципиенты известны специалисту в области фармации, и неограничивающие примеры подходящих эксципиентов включает крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Является ли специфический эксципиент подходящим для включения в фармацевтическую композицию или лекарственную форму, зависит от различных факторов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, путь, которым лекарственную форму вводят пациенту, и конкретные активные ингредиенты в лекарственной форме. Изобретение также относится к безводным фармацевтическим композициям и лекарственным формам, включающим одно или более соединений формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. Композиции и лекарственные формы могут принимать форму растворов или сиропов (в случае необходимости с ароматизатором), суспензий (в случае необходимости с ароматизатором), эмульсий, таблеток (например, жевательных таблеток), пилюль, капсул, гранул, порошка (в случае необходимости для восстановления), составов с замаскированным вкусом или замедленного высвобождения и т.п.
Фармацевтические композиции по изобретению, которые являются подходящими для перорального введения, могут быть представлены как отдельные лекарственные формы, такие как, но не ограничиваясь ими, таблетки, каплеты, капсулы, гранулы, порошок и жидкости. Такие лекарственные формы содержат предопределенные количества активных ингредиентов, и могут быть получены способами, известными специалисту в области фармации.
- 32 028344
Примеры эксципиентов, которые могут использоваться в пероральной лекарственной форме по изобретению, включают, но не ограничены ими, связующие, наполнители, разрыхлители и лубриканты.
Биомаркеры
В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, используется как биомаркер для 8ΜΆ. В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, используется как биомаркер для 8ΜΆ. В других вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, используется как биомаркер для пациента с 8ΜΆ, получающего лечение соединением, таким как раскрытое здесь. В других вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, используется как биомаркер для пациента с 8ΜΆ, получающего лечение соединением, таким как раскрытое здесь. В некоторых вариантах осуществления изменение в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2 и соответствующее изменение в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, представляет собой биомаркер для пациента, получающего лечение соединением, таким как раскрытое здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8ΜΆ.
В частном варианте осуществления увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, и соответствующее уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2 после введения соединения (например, соединения формулы (1а1), раскрытого здесь) указывает, что соединение может быть эффективным для лечения 8ΜΆ. В другом частном варианте осуществления уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, и соответствующее увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2 после введения соединения (например, соединения формулы (1а1), раскрытого здесь) указывает, что соединение не будет эффективно лечить 8ΜΆ. В соответствии с этими вариантами осуществления, праймер(ы) 8ΜΝ и/или зонд 8ΜΝ, описанные ниже, могут использоваться в тестах, таких как РСК (например, цРСК) и КТ-РСК (например, КТ-цРСК или КТ по окончании РСК), для оценки и/или количественного определения количества мРНК, которая транскрибируется от гена гена 8ΜΝ2 и включает или не включает экзон 7 из 8ΜΝ2.
В одном варианте осуществления изобретение относится к праймерам 8ΜΝ и/или зондам 8ΜΝ (например, прямой лраймер, имеющий нуклеотидную последовательность 5>ЕС ГО ΝΟ. 1, 7, 8, 11 или 13; и/или обратный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность 5>ЕС ГО ΝΟ. 9 или 12; и/или зонд 8ΜΝ, такой как 5>ЕС ГО ΝΟ. 3 или 10) для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых человеческим 8ΜΝ2. Эти праймеры могут использоваться как праймеры в, например, КТ-РСК (такой как КТ-РСК, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК, как описано здесь или как известно специалисту), РСК (такой как цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, и как зонды в тестах гибридизации, таких как Нозерн-блот и/или Саузерн-блот. В биологических примерах, описанных здесь, КТ по окончании РСК представляет собой полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией, которую осуществляют для определенного числа циклов амплификации (или до исчерпания исходных материалов) с последующим количественным анализом каждого продукта ДНК, с использованием, например, гель-электрофоретического разделения, окрашивания флуоресцентным красителем, количественного анализа флюоресценции и т.п.
5>ЕС ГО ΝΟ. 1 гибридизуется с ДНК или РНК, включающей нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 22-40 из экзона 7 8ΜΝ2, 5>ЕС ГО ΝΟ. 2 гибридизуется с ДНК или РНК, включающей нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 4-26 из последовательности, кодирующей люциферазу светлячка; 5>ЕС ГО ΝΟ. 7 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 32-54 из экзона 7 8ΜΝ2 и нуклеотидам 1-4 из экзона 8 из 8ΜΝ2, 5>ЕС ГО ΝΟ. 8 гибридизуется с последовательностям нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 87-111 из экзона 7 8ΜΝ2 и нуклеотидам 1-3 из экзона 8 из 8ΜΝ2, 5>ЕС ГО ΝΟ. 9 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, антисмысловая цепь ДНК или РНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 39-62 из экзона 8 из 8ΜΝ2, 5>ЕС ГО ΝΟ. 11 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 43-63 из экзона 6 из 8ΜΝ2, 5>ЕС ГО ΝΟ. 12 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, антисмысловая цепь ДНК или РНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 51-73 из экзона 8 из 8ΜΝ2, и 5>ЕС ГО ΝΟ. 13 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 22-46 из экзона 6 из 8ΜΝ2.
Соответственно, олигонуклеотид, соответствующий 5>ЕС ГО ΝΟ. 9, 11, 12 и/или 13, может использоваться в реакции амплификации для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых человеческим 8ΜΝ2, не содержащим экзон 7 из человеческих 8ΜΝ2, и нуклеиновой кислоты, кодирующей или кодируемой человеческим 8ΜΝ2 и включающей экзон 7 из человеческих 8ΜΝ2. Напротив, олигонуклеотид, соответствующий 5>ЕС ГО ΝΟ. 8, в сочетании с обратным даунстрим-праймером (на- 33 028344 пример, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ. 9 или 12) может использоваться для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых человеческим 8ΜΝ2, не содержащим экзон 7 из человеческих 8ΜΝ2, и олигонуклеотида, соответствующего 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ. 1 и 7, в сочетании с обратным даунстрим-праймером (например, §ЕЦ ГО ΝΟ. 9 или 12) может использоваться для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых человеческим 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включающих экзон 7 из 8ΜΝ2.
§ЕЦ ГО ΝΟ. 3 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 50-54 из экзона 7 из человеческих 8ΜΝ2 и нуклеотидам 1-21 из экзона 8 из человеческих 8ΜΝ2, и §ЕЦ ГО ΝΟ. 10 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 7-36 из экзона 8 из человеческих 8ΜΝ2. §ЕЦ ГО ΝΟ. 3 может быть использована как зонд для детекции мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, описанного здесь или описанного в международной публикации XVΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки), и детекции мРНК, которая транскрибируется от человеческого 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. Кроме того, 8ЕЦ ГО ΝΟ. 10 может быть использована как зонд для детекции мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает или не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, и детекции мРНК, которая транскрибируется от человеческого 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, описанного здесь, или как описано в международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки.
В частном варианте осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры 8ΜΝ, такие как §ЕЦ ГО ΝΟ. 1, 7, 11 или 13 и/или §ЕЦ ГО ΝΟ. 2, 9 или 12, и/или зонды 8ΜΝ, такие как §ЕЦ ГО ΝΟ. 3 или 10), используется в тесте, таком как КТ-РСК, КТ-цРСК, КТ по окончании РСК, РСК, цРСК, амплификация по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, тест, такой как описанный ниже в биологических примерах), для определения того, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы) включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры 8ΜΝ, такие как §ЕЦ ГО ΝΟ. 1, 7, 11 или 13 и/или §ЕЦ ГО ΝΟ. 9 или 12, и/или зонды 8ΜΝ, такие как §ЕЦ ГО ΝΟ. 3 или 10), используется в тесте, таком как КТ-РСК, КТ-цРСК, КТ по окончании РСК, РСК, цРСК, амплификация по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, тест, такой как описанный ниже в биологических примерах), для контроля количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8ΜΑ.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры 8ΜΝ, такие как §ЕЦ ГО ΝΟ. 1, 7, 11 или 13 и/или §ЕЦ ГО ΝΟ. 9 или 12, и/или зонды 8ΜΝ, такие как §ЕЦ ГО ΝΟ. 3 или 10), используется в тесте, таком как КТ-РСК, КТ-цРСК, КТ по окончании РСК, РСК, цРСК, амплификация по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, тест, такой как описанный ниже в биологических примерах), для контроля ответа пациента на соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы). В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8ΜΑ.
Образец (например, проба крови, образец РВМС или образец ткани, такой как образец ткани кожи или мышцы) от пациента может быть получен с использованием методик, известных специалисту, и праймеры и/или зонды, описанные ниже в биологических примерах, могут использоваться в тестах (например, РСК, КТ-РСК, КТ-цРСК, цРСК, КТ по окончании РСК, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот и Саузерн-блот) для определения количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 (например, количества мРНК, которая включает экзон 7 из 8ΜΝ2, транскрибированных от гена 8ΜΝ2). Образец, полученный от пациента, относится к образцу, который обрабатывают и/или манипулируют после получения от пациента, используя методики, известные специалисту. Например, образец от пациента может быть обработан, например, для экстракции РНК, с использованием методик, известных специалисту. Образец от пациента может быть обработан, например, для экстракции РНК, и РНК обратно транскрибируют, чтобы получить кДНК. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8ΜΑ.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, 8ЕЦ ГО ΝΟ. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, 8ЕЦ ГО ΝΟ. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соедине- 34 028344 ние формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с δΜΑ.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером δΜΝ, описанным ниже (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером δΜΝ, описанным здесь (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с δΜΑ.
Количество мРНК, которая транскрибируется от человеческого гена δΜΝ2, которая включает экзон 7 из δΜΝ2, и количество мРНК, которая транскрибируется от человеческого гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, может быть дифференцировано друг от друга, например, размером фрагмента РНК или ДНК, генерируемого от мРНК δΜΝ2, которая включает экзон 7 из δΜΝ2, и от мРНК δΜΝ2, которая не включает экзон 7 из δΜΝ2.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером δΜΝ, описанным ниже (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером δΜΝ, описанным здесь (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с δΜΑ.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с зондом δΜΝ, описанным ниже (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами, например, для КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК), амплификации по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с δΜΑ.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с зондом δΜΝ, описанным ниже (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК), амплификации по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (Ь) детекцию количество мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2.
Количество мРНК, которая транскрибируется от человеческого гена δΜΝ2, которая включает экзон 7 из δΜΝ2, и количество мРНК, которая транскрибируется от человеческого гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, может быть дифференцировано друг от друга, например, размером фрагмента РНК или ДНК, генерируемого от мРНК δΜΝ2, которая включает экзон 7 из δΜΝ2, и от мРНК δΜΝ2, которая не включает экзон 7 из δΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с δΜΑ.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с зондом δΜΝ, описанным ниже (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 10), наряду с применимыми
- 35 028344 компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-дРСК), РСК (например, дРСК), амплификации по типу катящегося кольца, или Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и не включает экзон 7 из 8М№. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МА.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и включает экзон 7 из 8М№, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8МН описанным ниже (например, 8ЕЦ ГО N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8М^ описанным здесь (например, 8ЕЦ ГО N0. 9 или 12), и/или зондом 8М^ описанным здесь (например, 8ЕЦ ГО N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-дРСК), РСК (например, дРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и включает экзон 7 из 8М№. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МА.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от генов 8М№, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8М^ описанным ниже (например, 8ЕЦ ГО N0. 1, 7, 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8М^ описанным здесь (например, 8ЕЦ ГО N0. 9 или 12), и/или зондом 8М^ описанным здесь (например, 8ЕЦ ГО N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-дРСК), РСК (например, дРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, если применимо; и (Ь) детекции количества мРНК, которая транскрибируется от генов 8М№. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МА.
Количество мРНК, которая транскрибируется от человеческих генов 8М№, которая включает экзон 7 из 8М№, и количество мРНК, которая транскрибируется от человеческих генов 8М№ и не включает экзон 7 из 8МШ, может быть дифференцировано друг от друга, например, размером фрагмента РНК или ДНК, генерируемого от мРНК 8МШ, которая включает экзон 7 из 8МШ, и от мРНК 8МШ, которая не включает экзон 7 из 8М№. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МА.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и не включает экзон 7 из 8М№, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8М^ описанным ниже (например, 8ЕЦ ГО N0. 8), и/или обратным праймером 8М^ описанным здесь (например, 8ЕЦ ГО N0. 9 или 12), и/или зондом 8МЩ описанным здесь (например, 8ЕЦ ГО N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-дРСК), РСК (например, дРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и не включает экзон 7 из 8М№. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МА.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МА на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МА (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МА (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8М^, описанным ниже (например, 8ЕЦ ГО N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8МЩ описанным здесь (например, 8ЕЦ ГО N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-дРСК), РСК (например, дРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МА, которому ввели соединение (например, соединение, описанное здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и включает экзон 7 из 8М№, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и включает экзон 7 из 8М№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и включает экзон 7 из 8М№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть полезным или является полезным
- 36 028344 и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8ΜΑ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8ΜΑ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8ΜΑ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8ΜΑ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 9 или 12), и/или зондом 8ΜΝ (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8ΜΑ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8ΜΑ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным: здесь (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 9 или 12), и/или зондом 8ΜΝ (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и
- 37 028344 включает экзон 7 из ЗМ№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и включает экзон 7 из ЗМ№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и включает экзон 7 из ЗМ№, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с ЗМА на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с ЗМА (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с ЗМА (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером ЗМ^, описанным ниже (например, ЗЕф ГО N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером ЗМ^ описанным здесь (например, ЗЕф ГО N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с ЗМА, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с ЗМА на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту ЗМА; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером ЗМ^, описанным ниже (например, ЗЕф ГО N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером ЗМ^, описанным здесь (например, ЗЕф ГО N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена ЗМШ и не включает экзон 7 из ЗМ№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с ЗМА на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с ЗМА (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с ЗМА (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером ЗМ^, описанным ниже (например, ЗЕф ГО N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером ЗМ^ описанным здесь (например, ЗЕф ГО N0. 9 или 12), и/или зондом ЗΜN (например, ЗЕф ГО N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК)
- 38 028344 или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с δΜΑ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы как описано здесь); и (Ъ) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с δΜΑ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту δΜΑ; (Ъ) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером δΜΝ, описанным ниже (например, δΕΟ ГО ΝΟ. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером δΜΝ, описанным здесь (например, δΕΟ ГО ΝΟ. 9 или 12), и/или зондом δΜΝ (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с δΜΑ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с δΜΑ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с δΜΑ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером δΜΝ, описанным ниже (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 11 или 13), и/или обратным праймером δΜΝ, описанным: здесь (например, δΕΟ ГО ΝΟ. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с δΜΑ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы как описано здесь); и (Ъ) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, причем (1)(ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ίί) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и
- 39 028344 не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в аналогичном образце (например. тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает. что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1. 2. 4. 8. 12. 16. 20 ч. 1. 2. 3. 5. 7. 14. 28 дней. 1. 2. 3. 6. 9. 12 месяцев или больше после введения соединения. такого как соединение формулы (1а1) или ее формы. как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8ΜΑ на соединение. включающему: (а) введение соединения пациенту 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например. пробы крови или образца ткани). полученного или происходящего от пациента. с прямым праймером 8ΜΝ. описанным ниже (например. 8ЕО ГО ΝΟ. 11 или 13). и/или обратным праймером 8ΜΝ. описанным здесь (например. 8ЕО ГО ΝΟ. 9 или 12). наряду с применимыми компонентами для. например. КТ-РСК (например. КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК). РСК (например. цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количествы мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. и количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. причем (1) (ί) увеличение количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в пробе пациента относительно количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в аналогичном образце (например. от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения. и (ίί) уменьшение количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в пробе пациента относительно количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в аналогичном образце (например. от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает. что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в пробе пациента относительно количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в аналогичном образце (например. тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения. и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в пробе пациента относительно количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в аналогичном образце (например. тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает. что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1. 2. 4. 8. 12. 16. 20 ч. 1. 2. 3. 5. 7. 14. 28 дней. 1. 2. 3. 6. 9. 12 месяцев или больше после введения соединения. такого как соединение формулы (1а1) или ее формы. как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8ΜΑ на соединение. включающему: (а) контактирование образца пациента с 8ΜΑ (например. пробы крови или образца ткани) или образца. полученного от пациента с 8ΜΑ (например. пробы крови или образца ткани. который был обработан для экстракции РНК). с зондом 8ΜΝ (например. 8ЕО ГО ΝΟ. 10). наряду с применимыми компонентами для. например. КТ-РСК (например. КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК). РСК (например. цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца. причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8ΜΑ. которому ввели соединение (например. соединение формулы (1а1) или ее формы. как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2 и количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. причем (1)(ί) увеличение количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в пробе пациента относительно количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в аналогичном образце (например. от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения. и (ίί) уменьшение количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в пробе пациента относительно количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в аналогичном образце (например. от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает. что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в пробе пациента относительно количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в аналогичном образце (например. тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения. и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в пробе пациента относительно количества мРНК. которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2. в аналогичном образце (например. тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает. что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1. 2. 4. 8. 12. 16. 20 ч. 1. 2. 3. 5. 7. 14. 28 дней. 1. 2. 3. 6. 9. 12 месяцев
- 40 028344 или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8ΜА на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8ΜА; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с зондом 8ΜΝ (например, 8Е0 ГО ΝΟ. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1)(ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ίί) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8ΜА на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8ΜА (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8ΜА (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 9 или 12), и/или зондом 8ΜΝ (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК) или РСК (например, цРСК), причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8ΜА, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1)(ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ίί) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8ΜА на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8ΜА; (Ь) контактирование
- 41 028344 образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, §Еф ГО ΝΟ. 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, 8Еф ГО ΝΟ. 9 или 12), и/или зондом 8ΜΝ (например, 8Еф ГО ΝΟ. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1) (ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (н) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца, ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8ΜΑ к соединению, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8ΜΑ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8ΜΑ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, 8Еф ГО ΝΟ. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, 8Еф ГО ΝΟ. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8ΜΑ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а 1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8ΜΑ к соединению, включающему: (а) введение соединения пациенту 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего
- 42 028344 от пациента, с прямым праймером δΜN, описанным ниже (например, δΕφ ΙΌ ΝΟ. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером δΜN, описанным здесь (например, δΕφ ΙΌ ΝΟ. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, ΚΤ-ΡΟΚ (например, ΚΤ по окончании ΡΟΚ и/или ΚΤ^ΡΟΚ), ΡΟΚ (например, ςΡΕΚ) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Щ1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ш1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50, или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Щ1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Щ1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с δΜΑ к соединению, включающему: (а) контактирование образца пациента с δΜΑ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с δΜΑ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером δΜN, описанным ниже (например, δΕφ ΙΌ ΝΟ. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером δΜN, описанным здесь (например, δΕφ ΙΌ ΝΟ. 9 или 12), и/или зондом δΜN (например, δΕφ ΙΌ ΝΟ. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, ΚΤ-ΡΟΚ (например, ΚΤ по окончании ΡΟΚ и/или ΚΤ^ΡΟΚ), ΡΟΚ (например, ςΡΕΚ) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с δΜΑ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Щ1) или ее формы как описано здесь); и (Ь) детекцию количествы мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜN2 и включает экзон 7 из δΜN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12,
16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как из формулы (Щ1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Щ1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ш1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ш1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с δΜΑ к соединению, включающему: (а) введение соединения пациенту δΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером δΜN, описанным ниже (например, δΕφ ΙΌ ΝΟ. 1, 7, 11 или 13), и/или
- 43 028344 обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, 8ЕО ГО N0. 9 или 12), и/или зондом 8ΜΝ (например, 8Е0 ГО N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8ΜΑ к соединению, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8ΜΑ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8ΜΑ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, 8Е0 ГО Ν0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, 8Е0 ГО Ν0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8ΜΑ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8ΜΑ к соединению, включающему: (а) введение соединения пациенту 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, 8ЕО ГО Ν0. 8, 11 или 13), и/или
- 44 028344 обратным праймером 8М^ описанным здесь (например, 8Еф ГО N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-дРСК), РСК (например, дРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ и не включает экзон 7 из 8М№, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ и не включает экзон 7 из 8М№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ и не включает экзон 7 из 8М№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ и не включает экзон 7 из 8М№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и не включает экзон 7 из 8М№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МА к соединению, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МА (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МА (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8М^ описанным ниже (например, 8Еф ГО N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8М^ описанным здесь (например, 8Еф ГО N0. 9 или 12), и/или зондом 8МN (например, 8Еф ГО N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-дРСК), РСК (например, дРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ и не включает экзон 7 из 8М№, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ и не включает экзон 7 из 8М№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ и не включает экзон 7 из 8М№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ и не включает экзон 7 из 8М№, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ и не включает экзон 7 из 8М№, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МА к соединению, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МА; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8М^ описанным ниже (например, 8Еф ГО N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8М^ описанным здесь (например, 8Еф ГО N0. 9 или 12), и/или зондом 8МN (на- 45 028344 пример, δΕΟ ΙΌ NО. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-дРСК), РСК (например, с|РСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после зведения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с δΜΑ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с δΜΑ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с δΜΑ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером δΜΝ, описанным ниже (например, δΕΟ ΙΌ NО. 11 или 13), и/или обратным праймером δΜΝ, описанным здесь (например, δΕΟ ΙΌ NО. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или РТ-дРСР). РСК (например, дРСР) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с δΜΑ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, причем (1)(ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12,
16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после вве- 46 028344 дения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с §МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту §МЛ; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером §МЫ, описанным ниже (например, 8Еф ГО ЫО. 11 или 13), и/или обратным праймером §МЫ, описанным здесь (например, 8Еф ГО ЫО. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и включает экзон 7 из §МЫ2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и не включает экзон 7 из §МЫ2, причем (1) (ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и включает экзон 7 из §МЫ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и включает экзон 7 из §МЫ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и не включает экзон 7 из §МЫ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и не включает экзон 7 из §МЫ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и включает экзон 7 из §МЫ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и включает экзон 7 из §МЫ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и не включает экзон 7 из §МЫ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и не включает экзон 7 из §МЫ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с §МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с §МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с §МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с зондом §МЫ (например, 8Еф ГО ЫО. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и включает экзон 7 из §МЫ2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и не включает экзон 7 из 8МЫ2, причем (1)(ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и включает экзон 7 из 8МЫ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и включает экзон 7 из 8МЫ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и не включает экзон 7 из 8МЫ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена §МЫ2 и не включает экзон 7 из 8МЫ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным
- 47 028344 и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ш1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 510, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с δΜΑ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту δΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с зондом δΜΝ (например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, причем (1)(ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена δΜΝ2 и не включает экзон 7 из δΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы 0а1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с δΜΑ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с δΜΑ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с δΜΑ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером δΜΝ, описанным ниже
- 48 028344 (например, δΕΟ 1Е ΝΟ. 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, δΕΟ ГО ΝΟ. 9 или 12), и/или зондом 8ΜΝ (8Е0 ГО ΝΟ. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8ΜΆ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь); и (Ь) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1) (ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с 8ΜΆ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8ΜΆ; (Ь) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8ΜΝ, описанным ниже (например, δΕΟ ГО ΝΟ. 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным здесь (например, δΕΟ ГО ΝΟ. 9 или 12), и/или зондом 8ΜΝ (δΕΟ ГО ΝΟ. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТцРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, причем (1) (ί) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(ί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ίί) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в пробе пациента относительно количества
- 49 028344 мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 510, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь.
В частных вариантах осуществления 8ΜΑ у пациента вызвана инактивирующей мутацией или делецией в гене 8ΜΝ1 на обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8ΜΝ1.
Наборы
В одном аспекте изобретение относится к фармацевтическим или тестовым наборам, включающим праймер 8ΜΝ или зонд, описанный здесь, в одном или более контейнерах, и инструкции по использованию. В одном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает, в контейнере, один или более обратных праймеров 8ΜΝ (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 2, 9 и/или 12) и/или один или более прямых праймеров 8ΜΝ (8ЕО ГО ΝΟ. 1, 7, 8, 11 и/или 13), и инструкции по использованию. В другом варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает, в одном контейнере, обратный праймер 8ΜΝ (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 2, 9 или 12), прямой праймер 8ΜΝ (8ЕО ГО ΝΟ. 1, 7, 8, 11 или 13) и инструкции по использованию.
В одном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает, в отдельных контейнерах, один обратный праймер 8ΜΝ (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 2, 9 или 12) в одном контейнере, другой прямой праймер 8ΜΝ (например, 8ЕО ГО ΝΟ. 1, 7, 8, 11 или 13) в другом контейнере, и инструкции по использованию.
В некоторых вариантах осуществления применимые компоненты, необходимые для РСК (например, цРСК), КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, такие как полимераза, дезоксинуклеозид трифосфаты, и т.д., включены в такие наборы. В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходимые для гибридизации, включены в такие наборы. Фармацевтический или тестовый набор, содержащий такие праймеры, может использоваться в РСК и КТ-РСК для, например: (ί) оценки того, усиливает ли терапевтическое средство (например, соединение формулы (1а1) или ее формы) включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2, (ίί) контроля количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 из 8ΜΝ2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 из 8ΜΝ2, и/или (ίίί) контроля ответа пациента на терапевтическое средство (например, соединение формулы (1а1) или ее формы). В других вариантах осуществления субъект представляет собой человека. В других вариантах осуществления человек является пациентом-человеком. В некоторых других вариантах осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8ΜΑ.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с последовательностью, найденной в 8ЕО ГО ΝΟ. 1, в одном контейнере, и обратный праймер с последовательностью, найденной в 8ЕО ГО ΝΟ. 2, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых человеческим минигеном 8ΜΝ1 или человеческим минигеном 8ΜΝ2, такими как описанные здесь, или в международной публикации νΟ 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8ЕО ГО ΝΟ. 7, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8ЕО ГО ΝΟ. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8ΜΝ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В другом частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8ЕО ГО ΝΟ. 8, в одном контейнере, и
- 50 028344 обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенным человеческим геном ЗМ№. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 7, в одном контейнере, прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 8, в другом контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами ЗМ№. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 11, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 12, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами ЗМ№. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 11, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти лраймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами ЗМ№. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 13, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 12, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами ЗМ№. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 13, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами ЗМ№. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 1, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами ЗМ№. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 1, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклзотидной последовательностью, найденной в ЗЕф ГО N0. 12, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК), РСК (например, цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами ЗМ№. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридиза- 51 028344 ции, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В другом варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает зонд 8М^ описанный здесь (например, 8Н) ГО N0. 3 или 10), в одном контейнере. В других вариантах осуществления зонд используется в, например, тесте гибридизации, таком как Саузерн-блот или Нозерн-блот. В частном варианте осуществления зонд используется в КТ-цРСК или цРСК. В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходимые для РСК (например, цРСК), КТ-РСК (например, КТ по окончании РСК и/или КТ-цРСК) или амплификации по типу катящегося кольца, такие как полимераза, дезоксинуклеозид трифосфаты, праймеры, и т.д., включены в такие наборы. В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходимые для гибридизации, включены в такие наборы.
В одном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает обратный праймер 8М^’ (например, 8ЕО ГО N0. 2, 9 или 12) в одном контейнере, прямой праймер 8М^’ (например, 8ЕО ГО N0. 1, 7, 8, 11 или 13) в другом контейнере, и зонд 8М^’ (например, 8ЕО ГО N0. 3 или 10) в другом контейнере, и инструкции по использованию. В другом варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает один или более обратных праймеров 8М^’ (например, 8ЕО ГО N0. 2, 9 и/или
12) в одном контейнере, один или более прямых праймеров 8М^’ (например, 8ЕО ГО N0. 1, 7, 8, 11 и/или
13) в другом контейнере, и один или более зондов 8М^’ (например, 8ΙΧ) ГО N0. 3 и/или 10) в другом контейнере, и инструкции по использованию.
В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходимые для проведения РСК, КТ-РСК или амплификации по типу катящегося кольца, такие как полимераза, дезоксинуклеозид трифосфаты и т.д., включены в такие наборы. Фармацевтический или тестовый набор, содержащий такие зонды и/или праймеры, может использоваться в РСК и КТ-РСК для, например: (ΐ) оценки того, усиливает ли терапевтическое средство (например, соединение формулы (1а1) или ее формы) включение экзона 7 8М№ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№, (ϊϊ) контроля количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и включает экзон 7, и количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№ и не включает экзон 7 из 8М№, и/или (ϊϊϊ) контроля ответа пациента на терапевтическое средство (например, соединение формулы (1а1) или ее формы). В других вариантах осуществления субъект представляет собой человека. В других вариантах осуществления человек является пациентом-человеком. В некоторых других вариантах осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МА.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтическому набору, включающему соединение формулы (1а1) или ее формы, в контейнере, и инструкции по использованию соединения или его формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтическому набору, включающему фармацевтическую композицию, включающую соединение формулы (1а1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель и инструкции по использованию. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтическому набору, включающему фармацевтическую композицию, включающую эффективное количество соединения формулы (1а1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель и инструкции по использованию. В одном варианте осуществления инструкции по использованию объясняют одно, два или более из следующего: доза, путь введения, частота введения и побочные эффекты введения соединения формулы (1а1) или ее формы пациенту. В других вариантах осуществления субъект представляет собой человека. В других вариантах осуществления человек является пациентом-человеком. В некоторых других вариантах осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МА.
Общие способы синтеза
Как раскрыто здесь, общие способы получения соединений формулы (1а1) или ее формы, как описано здесь, доступны через стандартную, известную методологию синтеза. Многие из исходных материалов коммерчески доступны или, если не доступны, могут быть получены с использованием путей, описанных ниже, с использованием методик, известных специалисту. Приведенные здесь схемы синтеза включают множественные стадии реакции, каждая из которых является самостоятельной и может быть осуществлена с или без любой предшествующей или последующей стадии(й). Другими словами, каждая из индивидуальных стадий реакций схем синтеза, приведенных здесь, рассматривается изолированно.
Схема А.
Соединения формулы (1а1), в которой К2 обозначает моноциклический или бициклический арил, гетероциклил или гетероарильную кольцевую систему, могут быть получены как описано ниже на схеме А
Соединение А1 (где X обозначает различные реактивные группы, которые могут использоваться для получения множества заместителей функциональной группы К1, вводя в реакцию подходящие исходные материалы с соединением А1, соединением А3 или соединением А4, используя методики, известные специалисту, и где Ь обозначает уходящую группу, такую как галоген или трифторметилсуль- 52 028344 фонилокси и т.п.) вводят в реакцию с соединением А2 в присутствии подходящего металлического катализатора или комбинации двух разных подходящих металлических катализаторов (таких как бис(трифенилфосфин)палладий (II) хлорид и йодид меди (I) и т.п.), по меньшей мере с одним эквивалентом основания, неорганического или органического (такого как триэтиламин и т.п.), в органическом растворителе (таком как ацетонитрил и т.п.), подвергают сочетанию ЗоподазЫга, получая соединение Α3. Реакция может быть осуществлена при комнатной или повышенной температуре. В случае необходимости, реакция может также быть осуществлена с использованием микроволнового облучения при повышенной температуре. Соединение Α3 вводят в реакцию с кислотой Льюиса (такой как трифторуксусная кислота или п-толуолсульфоновая кислота и т.п.) с или без органического растворителя (такого как толуол или этанол и т.п.) при комнатной или повышенной температуре с осуществлением циклизации с получением соединения А4.
Схема В.
Соединения формулы (1а1), в которой К2 обозначает моноциклический или бициклический арил, гетероциклил или гетероарильную кольцевую систему, могут также быть получены как описано ниже на схеме В
Соединение А1 вводят в реакцию с триметилсилилацетиленом в присутствии подходящего металлического катализатора или комбинации двух разных подходящих металлических катализаторов (таких как бис(трифенилфосфин)палладий (II) хлорид и йодид меди (I) и т.п.), по меньшей мере с одним эквивалентом основания, неорганического или органического (такого как триэтиламин и т.п.), в органическом растворителе (таком как ацетонитрил и т.п.), подвергая сочетанию ЗоподазЫга. Реакция может быть осуществлена при комнатной или повышенной температуре. В случае необходимости реакция может также быть осуществлена с использованием микроволнового облучения при повышенной температуре. Полученное промежуточное соединение триметилсилилацетилен обрабатывают неорганическим основанием (таким как карбонат калия и т.п.) в метаноле, получая соединение В1. Соединение В1 вводят в реакцию с соединением В2, используя условия, описанные на схеме А, осуществляя сочетание ЗоподазЫга, получая соединение Α3, которое может затем быть превращено в соединение А4 путем обработки кислотой, как описано на схеме А.
Схема С.
Соединения формулы Да1), в которой К2 обозначает моноциклический или бициклический гетероциклил или гетероарильную кольцевую систему, могут быть получены как описано ниже на схеме С
Соединение С1 (где X обозначает различные реактивные группы, которые могут использоваться для получения множества заместителей функциональной группы К1 путем введения в реакцию подходящих исходных материалов с соединением С1, соединением С2, соединением С3, соединением С4 или соединением С6 с использованием методик, известных специалисту, и где Ь обозначает уходящую группу, такую как галоген или трифторметилсульфонилокси и т.п.) вводят в реакцию с бут-3-ин-2-олом и в присутствии подходящего катализатора на основе палладия (такого как тетракис(трифенилфосфин)палладий (0) и т.п.), подходящего металлического сокатализатора (такого как хло- 53 028344 рид цинка и т.п.) и органического основания (такого как триэтиламин и т.п.) в органическом растворителе (таком как Ν,Ν-диметилформамид и т.п.), при повышенной температуре в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 150°С, осуществляя сочетание δоηодакЬ^^а с последующей циклизацией, получая соединение С2. Соединение С2 вводят в реакцию с подходящим окислителем (таким как диоксид марганца и т.п.) в подходящем растворителе (таком как дихлорметан и т.п.) при комнатной или повышенной температуре, получая соединение С3. α-метильную группу соединения С3 вводят в реакцию с подходящим селективным бромирующим реагентом (таким как Вг2 или ΝΒδ и т.п.), получая соединение С4. Соединение С4 вводят в реакцию с соединением С5 (причем термин Не! относится к в случае необходимости замещенному гетероциклилу или гетероарильной кольцевой системе, содержащей подобную амидину группу, такую как, но не ограничиваясь ими, 2-аминопиридин, 2-аминопиримидин, 2аминопиразин, 3-аминопиридазин, 2-аминотиазол, 4-аминотиазол, 4-аминопиримидин и т.п.), получая соединение С6.
Схема О.
Соединения формулы (1а1), в которой К2 обозначает моноциклический или бициклический гетероциклил или гетероарильную кольцевую систему, могут быть получены как описано ниже на схеме О
Соединение С4 (где X обозначает различные реактивные группы, которые могут использоваться для получения множества заместителей функциональной группы К1 путем введения в реакцию подходящих исходных материалов с соединением С4 или соединением 02 с использованием методик, известных специалисту), полученное как описано на схеме С, вводят в реакцию с соединением 01 (причем термин Не! относится к в случае необходимости замещенному гетероциклилу или гетероарильной кольцевой системе, содержащей подобную кетимину группу, такую как, но не ограничиваясь ими, 2-метилпиридин, 2-метилпиримидин, 2-метилпиразин, 3-метилпиридазин, 2-метилтиазол, 4-метилтиазол, 4метилпиримидин и т.п.) в присутствии органического основания (такого как триэтиламин и т.п.) в подходящем растворителе (таком как ацетонитрил и т.п.), осуществляя тандемную алкилирующую дегидративную циклизацию, получая соединение 02.
Частные синтетические примеры
Для более подробного описания и помощи в понимании предлагаются следующие неограничивающие примеры, полно иллюстрирующие спектр соединений, описанных здесь, и которые не должны рассматриваться как специфически ограничивающие объем изобретения. Такие вариации соединений, описанных здесь, которые могут уже быть известны или разработаны позже и которые находятся в рамках компетенции специалиста, считаются входящими в рамки соединений, как описано здесь и заявлено далее. Эти примеры иллюстрируют получение некоторых соединений. Специалисту понятно, что методики, описанные в этих примерах, представляют собой методики, описанные в данной области техники, которые хорошо функционируют в практике синтеза и также составляют предпочтительные способы для практики этого изобретения. Однако следует понимать, что специалисту в свете настоящего раскрытия будет понятно, что множество изменений могут быть сделаны в частных способах, которые раскрыты, с получением подобного или похожего результата без отступления от духа и объема настоящего описания.
Кроме приведенных в следующих примерах вариантов соединений, если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции, экспериментальные данные и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, должны быть поняты как модифицируемые термином приблизительно. Соответственно, все такие числа представляют собой приближения, которые могут варьировать в зависимости от желательных свойств, которые требуется получить в результате реакции или в результате варьирующих экспериментальных условий. Поэтому в рамках ожидаемого диапазона экспериментальной воспроизводимости термин приблизительно в контексте полученных данных относится к диапазону для данных при условии, что может варьировать согласно стандартному отклонению от среднего значения. Также для приводимых экспериментальных результатов, полученные данные могут быть округлены до большего или меньшего значения для представления данных без потери значимых чисел. По меньшей мере, и не как попытка ограничить заявку доктриной эквивалентов до объема формулы изобретения, каждый числовой параметр должен рассматриваться в свете числа значащих цифр и методик округления, используемых специалистом.
Хотя числовые диапазоны и параметры, формулирующие широкий объем настоящего описания, представляют собой приближения, числовые обозначения, представленные в примерах, приведенных ниже, даны настолько точно, насколько возможно. Любое числовое обозначение, однако, неотъемлемо содержит определенные ошибки, являющиеся обязательным следствием стандартного отклонения, обнаруживаемого в их соответствующих измерениях в тесте.
- 54 028344
Примеры соединений
Как используется выше и во всем настоящем описании. следующие сокращения. если не указано иное. имеют следующие значения:__
Аббревиатура Значение
Δ нагревание (химия) или деления (биология)
АсОН или НОАс Уксусная кислота
АсгО Уксусный ангидрид
Аг аргон
Α0Ν ацетонитрил
ΒΙΝΑΡ 2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафталин
В(0ФРг)3 триизопропил борат
Вое трет-бутокси-карбонил
В0С2О ди-трет-бутил дикарбонат
ВиОН н-бутанол
°С градусы Цельсия
СМ 1,1-карбонилдиимидазол или Ν,Ν'- карбонилдиимидазол
(СНО)η или (НСНО)„ параформальдегид
Соед соединение
д/ч/час/мин/с день(д)/час(ч или час)/минута(мин)/секунда(с)
Ό3νθΡΗθ3 2-дициклогексилфосфино-2'-(Ν, Ν- диметиламино)бифенил
ОСЕ 1,2-дихлорэтан
БСМ дихлорметан (СНгСЪ)
ΜΑϋ диизопропил азодикарбоксилат
МЕА или МРЕА Ν, Ν- диизопропилэтиламин
ϋΜΑ диметилацетамид
ϋΜΑΡ 4-(диметиламино)пиридин
- 55 028344
ΌΜΕ 1,2-диметоксиэтан
ΌΜΡ диметилформамид
ΌΜ3Ο диметилсульфоксид
ЕЬС или ΕϋΟΙ Ν- (3-диметиламинопропил)-Ν' -этилкарбодиимид гидрохлорид
ЕРОАс этил ацетат
ΕΡΟΗ этанол
ΕΡ2Ο простой диэтиловый эфир
НСОН формальдегид
ίΡΓί йодпропан
ϋοΗηΡΗοθ (2-бифенил)-ди-трет-бутилфосфин
КОАс ацетат калия
ЬАН литий алюминий гидрид
ЬС/МЗ, ЬСМЗ или ЬС-МЗ жидкостная хроматография с масс-спектроскопией
ΣΌΑ литий диизопропиламин
ЫНМЬЗ или ЬНМОЗ литий бис(триметилсилил)амид
МеОН метанол
Ме1 подметан
Ме-ТНР 2-метилтетрагидрофуран
Μθ2Ζη диметилцинк
МпО2 диоксид марганца
МЗ масс-спектроскопия
ЫаН гидрид натрия
ЫаНЗ гидросульфид натрия
ΝβΗΜΌΒ натрий бис(триметилсилил)амид или натрий гексаметилдисалазид
Ыа1 йодид натрия
МаОАс ацетат натрия
МаОМе метоксид натрия
ΝΒ3 Ν- бромсукцинимид
ΝΜΡ Ν-метилпирролидон
ΝΜΗ ядерный магнитный резонанс
- 56 028344
- 57 028344
Пример 1.
Получение соединения 1
Стадия А. К раствору коммерчески доступного 4-(3-(этоксикарбонил)-фенил)пиперазин-1-третбутилкарбоксилата (13,4 г, 40,0 ммоль) в дихлорметане (200 мл) при комнатной температуре при мягком перемешивании частями добавляли Ν-бромсукцинимид (8,5 г, 48 ммоль). После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Анализ ЬС/Ы8 аликвоты показал полное исчезновение исходного материала. Смесь обрабатывали насыщенным раствором Nа2СΟз (100 мл) и перемешивали в течение 15 мин. Органический слой отделяли и высушивали над Nа28Ο4. После удаления растворителя остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, используя градиент 0-50% этилацетата в гексанах. Промежуточный бромид получали в форме бесцветного масла (14,2 г, 86%). Μ8 т/ζ 412,4[М+Н]+, 414,4 [М+2Н]+.
Стадия В. В круглодонную колбу на 250 мл загружали РбС^РЬС^г (0,51 г, 1,33 ммоль), РВи3НВР4 (0,77 г, 2,66 ммоль) и Си1 (0,20 г, 1,06 ммоль) и продували три раза аргоном с последующим добавлением диоксана (30 мл) и диизопропиламина (5,6 мл, 4,03 г, 40,0 ммоль). Смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим добавлением промежуточного бромида (11,0 г, 26,6 ммоль), полученного на стадии А, и ТΜ8-ацетилена (4,51 мл, 3,13 г, 32,0 ммоль). Реакционную смесь затем перемешивали при комнатной температуре в течение 6 дней. Анализ ЬС/Ы8 аликвоты показал >95% превращения. Осадок удаляли фильтрацией и промывали этилацетатом. Фильтраты объединяли и летучие компоненты удаляли на роторном испарителе. Остаток хроматографировали (силикагель, 0-70% этилацетата в гексанах), получая промежуточный алкин Т1Ч8 в форме коричневого масла (8,73 г, 76%). Μ8 т/ζ 431,4 [М+Н]+.
Стадия С. Смесь промежуточного алкина ТЫ8, полученного на стадии В (3,10 г, 7,21 ммоль), Κ2СΟ3 (1,49 г, 10,8 ммоль) и МеОН (40 мл) перемешивали в ванне с водой со льдом. ЬС/Ы8 показала, что полное превращение было достигнуто в течение 2 ч. Затем добавляли насыщенный раствор ΝΗ^Ι (20 мл) и этилацетат (200 мл), и органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали этилацетатом (3x30 мл) и объединенные органические фракции упаривали досуха на роторном испарителе. Остаток хроматографировали (силикагель, 0-10% этилацетата в гексанах), получая промежуточный алкин в форме коричневого масла (1,65 г, 64%). Μ8 т/ζ 359,3[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, СЭС13-б) δ м.д. 7,51 (1Н, д, 1=8,51 Гц), 7,44 (1Н, д, 1=2,84 Гц), 6,97-7,03 (1Н, м), 4,41 (2Н, кв., 1=7,15 Гц), 3,57-3,64 (4Н, м), 3,21-3,27 (5Н, м), 1,49 (9Н, с), 1,41 (3Н, т, 1=7,09 Гц).
Стадия Ό. К смеси промежуточного алкина, полученного на стадии С (1,10 г, 3,1 ммоль), 2йодпиридина (0,69 г, 3,38 ммоль), РбС12(РЬ3Р)2 (0,11 г, 0,15 ммоль) и Си1 (0,03 г, 0,15 ммоль), под аргоном, добавляли ацетонитрил (6,0 мл) и триэтиламин (0,62 г, 6,14 ммоль). Смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Летучие компоненты удаляли на роторном испарителе и остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах 0-70%), получая продукт сочетания, 4-(3-(этоксикарбонил)-4-(пиридин2-илэтинил)фенил)пиперазин-1-трет-бутилкарбоксилат в форме коричневого масла (1,2 г, 87%). Μ8 т/ζ 4 3 6,4 [М+Н]+.
Стадия Е. Смесь соединения, полученного на стадии Ό (0,59 г, 1,4 ммоль), и п-толуолсульфоновой кислоты (0,05 г, 0,27 ммоль) в этаноле (6,0 мл) облучали в микроволновом реакторе при 180°С в течение 3 ч. Смесь затем разбавляли водой (20 мл) и подщелачивали до рН 8 с использованием Nа2СΟ3. Осадок собирали, промывали водой и высушивали. Твердое вещество растворяли в дихлорметане (10 мл), обрабатывали ТРА (2 мл) в течение 0,5 ч при комнатной температуре, затем подщелачивали с использованием Nа2СΟ3 до рН 8-9. Слой дихлорметана отделяли и водный слой экстрагировали дополнительным количеством дихлорметана (3x5 мл). Объединенный раствор дихлорметана высушивали над Nа28Ο4 и хроматографировали (силикагель, МеОН в дихлорметане, 0-30%), получая целевое соединение в форме
- 58 028344 твердого вещества желтого цвета (0,071 г, 17%). Температура плавления 179-181°С; Μ8 т/ζ 308,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, ΌΜ80-ά6) δ м.д. 8,64-8,69 (1Н, м), 7,95 (1Н, тд, >7,80, 1,73 Гц), 7,85 (1Н, дт, >7,96, 1,06 Гц), 7,68-7,74 (2Н, м), 7,57 (1Н, дд, >8,83, 2,84 Гц), 7,51 (1Н, д, >2,52 Гц), 7,42 (1Н, ддд, 1=7,57, 4,73, 1,26 Гц), 3,21-3,26 (4Н, м), 2,84-2,89 (4Н, м).
Пример 2.
Получение соединения 2
Стадия А. Смесь 4-(4-бром-3-(этоксикарбонил)фенил)пиперазин-1-трет-бутилкарбоксилата, полученного как показано в примере 1, стадия А (22,63 г, 54,8 ммоль), Си1 (0,52 г, 2,75 ммоль), \а1 (16,44 г, 109,6 ммоль) и Ν1, ^-диметилциклогексан-1,2-диамина (0,87 мл, 5,5 ммоль) в диоксане (100 мл) перемешивали при 110°С под аргоном в течение 18 ч. Твердое вещество удаляли фильтрацией и фильтрат концентрировали досуха на роторном испарителе. Остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-30%), получая промежуточный йодид в форме коричневого масла (26,2 г, 102%). Μ8 т/ζ 461,2 [М+Н]+.
Стадия В. 4-(3-(Этоксикарбонил)-4-(тиофен-3-илэтинил)фенил)-пиперазин-1-трет-бутилкарбоксилат получали, используя процедуру сочетания 8опа§азЫга, показанную в примере 1, стадия Ό, из йодида, полученного на стадии А, описанной выше и 3-этинил-тиофена (87%). Μ8 т/ζ 441,2 [М+Н]+.
Стадия С. Соединение, полученное на стадии В (192 мг, 0,44 ммоль), перемешивали с ТΡΑ (1,0 мл) при 100°С в течение 6 ч. После охлаждения смесь разбавляли водой (5 мл) и нейтрализовали Νπ^03. Осадок собирали и промывали водой, дихлорметаном и ацетоном, получая целевое соединение в форме коричневого порошка (47 мг, 34%). Температура плавления 240°С (разложение); Μ8 т/ζ 313,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, 1)\18О16) δ м.д. 7,95 (1Н, дд, >2,99, 1,42 Гц), 7,71 (1Н, дд, >5,04, 2,84 Гц), 7,54-7,65 (4Н, м), 7,27 (1Н, с), 3,45-3,53 (4Н, м), 3,20-3,28 (4Н, м).
Пример 3.
Получение соединения 3
Стадия А. Смесь 4-(3-(этоксикарбонил)-4-этинилфенил)-пиперазин-1-трет-бутилкарбоксилата, полученного с использованием химии, показанной в примере 1, стадия С (3,58 г, 10,0 ммоль), 3,4диметоксибромбензола (2,60 г, 12,0 ммоль), Си1 (0,095 г, 0,5 ммоль), РйС12(РН3Р)2 (0,35 г, 0,5 ммоль), Εΐ3Ν (2,8 мл, 2,02 г, 20,0 ммоль) и ацетонитрила (10,0 мл) облучали в микроволновом реакторе под аргоном при 120°С в течение 0,5 ч. Смесь затем охлаждали и хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-70%), получая промежуточный алкин в форме коричневого масла, который затем хроматографировали снова (силикагель, этилацетат в дихлорметане, 0-10%), получая бесцветное масло, гомогенное в анализе ТС/Ы8. Μ8 т/ζ 495,2 [М+Н]+.
Стадия В. Промежуточный алкин, полученный на стадии А, обрабатывали трифторуксусной кислотой (10,0 мл) при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор разбавляли водой (50 мл) и нейтрализовали с использованием NаНС03 до рН 8-9. Желтый осадок собирали и промывали водой и высушивали, получая целевое соединение (1,26 г, 34% в целом, 2 стадии). Температура плавления: 142-143°С; Μ8 т/ζ 367,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, ΌΜ80-ά6) δ м.д. 7,52-7,59 (2Н, м), 7,46 (1Н, д, 1=1,58 Гц), 7,42 (1Н, дд, 1=8,51, 2,21 Гц), 7,38 (1Н, д, 1=2,21 Гц), 7,32 (1Н, с), 7,08 (1Н, д, 1=8,83 Гц), 3,86 (3Н, с), 3,81 (3Н, с), 3,153,22 (4Н, м), 2,82-2,89 (4Н, м).
- 59 028344
Пример 4.
Получение соединения 31
Стадия А. Смесь 2-бром-5-фторметилбензоата (699 мг, 3,0 ммоль), 1-этинил-4-метоксибензола (475 мг, 3,6 ммоль), Си1 (28,5 мг, 0,15 ммоль), Р4С12(РН3Р)2 (105 мг, 0,15 ммоль), Εΐ3Ν (0,83 мл, 606 мг, 6,0 ммоль) и ацетонитрила (3,0 мл) облучали в микроволновом реакторе под аргоном при 120°С в течение 0,5 ч. Смесь затем охлаждали и хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-10%), получая промежуточный алкин в форме коричневого масла, используемый непосредственно на следующей стадии. Μδ т/ζ 285,1 [М+Н]+.
Стадия В. Промежуточный алкин, полученный на стадии А, обрабатывали трифторуксусной кислотой (6,0 мл) при 100°С в течение 1 ч. Летучие компоненты удаляли под вакуумом и остаток обрабатывали водой и нейтрализовали №2СО3. Осадок собирали и хроматографировали (силикагель, дихлорметан), получая промежуточный изокумарин (581 мг, 72%, 2 стадии). Μδ т/ζ 271,1 [М+Н]+.
Стадия С. Смесь соединения, полученного на стадии В (108 мг, 0,4 ммоль), и (δ)-2метилпиперазина (12 0 мг, 1,2 ммоль) в NΜΡ (1,0 мл) перемешивали при 180°С в течение 24 ч. После охлаждения смесь загружали на колонку с силикагелем и хроматографировали (МеОН в дихлорметане, 0-20%), получая целевое соединение в форме желтого порошка (24 мг, 17%). Температура плавления: 129-131°С; Μδ т/ζ 351,3[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, ^ΜδО-ά6) δ м.д. 7,80 (2Н, д, 1=9,14 Гц), 7,51-7,59 (2Н, м), 7,46 (1Н, д, 1=2,21 Гц), 7,26 (1Н, с), 7,06 (2Н, д, 1=8,83 Гц), 3,82 (3Н, с), 3,64-3,73 (2Н, м), 2,973,03 (1Н, м), 2,76-2,85 (2Н, м), 2,61-2,70 (1Н, м), 2,31 (1Н, т, 1=11,03 Гц), 1,06 (3Н, д, 1=6,31 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 4 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 5.
Получение соединения 30
Стадия А. Смесь 5-бром-2-йодметилбензоата (18,4 г, 54,0 ммоль), ацетилена ТΜδ (8,5 мл, 5,88 г, 60,0 ммоль), Си1 (0,51 г, 2,7 ммоль), Р4С12(РН3Р)2 (1,9 г, 2,7 ммоль), Εΐ3Ν (15,0 мл, 10,9 г, 108,0 ммоль) и ацетонитрила (100 мл) перемешивали под аргоном при комнатной температуре в течение 4 ч. После удаления летучих компонентов в вакууме, остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах,
- 60 028344
0-20%), получая промежуточный алкин ТМ8 в форме бесцветного масла (15,7 г, 94%).
Стадия В. Промежуточный алкин, полученный на стадии А (9,33 г, 30,0 ммоль), смешивали с (8)-2метилпиперазином (3,60 г, 36,0 ммоль), Рй2йЬа3 (0,27 г, 0,6 ммоль), .1оНпРНоз (0,18 г, 0,6 ммоль) и Сз2С03 (13,7 г, 42,0 ммоль). Реакционную систему продували три раза аргоном и добавляли растворитель, ЭМЕ (60 мл). Суспензию затем перемешивали при 80°С в течение 4 ч. Анализ ЬС/М8 аликвоты реакционной смеси показал полный расход исходного бромида. Растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлорметане 0-50%), получая (8)-5-(3метилпиперазин-1-ил)-2-((триметилсилил)этинил)метилбензоат в форме коричневого масла (7,56 г, 79%). М8 т/ζ 331,1 [М+Н]+.
Стадия С. Соединение, полученное на стадии В (7,56 г, 22,9 ммоль), обрабатывали ди-трет-бутил бикарбонатом (7,5 г, 34,4 ммоль) и несколькими кристаллами ОМАР в дихлорметане (100 мл). После перемешивания в течение 2 ч при комнатной температуре, анализ ЬС/М8 аликвоты реакционной смеси показал полное исчезновение исходного материала. Растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлорметане, 0-10%), получая (8)-4-(3(метоксикарбонил)-4-((триметилсилил)этинил)фенил)-2-метилпиперазин-1-трет-бутилкарбоксилат в форме бесцветного масла (6,49 г, 66%). М8 т/ζ 431,1 [М+Н]+.
Стадия Ό. Соединение, полученное на стадии С (6,49 г, 15,1 ммоль), обрабатывали К2С03 (карбонат калия)(3,12 г, 22,6 ммоль) в МеОН (40 мл) на ванне с водой со льдом в течение 2 ч. Летучие компоненты удаляли на роторном испарителе и остаток обрабатывали насыщенным раствором N^0 (100 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x150 мл). Объединенные экстракты затем концентрировали досуха и хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах 0-80%), получая (8)-4-(4-этинил-3(метоксикарбонил)фенил)-2-метилпиперазин-1-трет-бутилкарбоксилат в форме светло-коричневого масла (5,39 г, 100%). М8 т/ζ 359,3 [М+Н]+.
Стадия Е. Смесь промежуточного соединения, полученного на стадии Ό, (8)-4-(4-этинил-3(метоксикарбонил)фенил)-2-метилпиперазйн-1-трет-бутилкарбоксилата (716 мг, 2,0 ммоль), 4-йод-1,2диметоксибензола (634 мг, 2,4 ммоль), Си1 (19,0 мг, 0,1 ммоль), РйС12(РН3Р)2 (70 мг, 0,1 ммоль), Е1^ (0,56 мл, 202 мг, 4,0 ммоль) и ацетонитрила (2,0 мл) облучали в микроволновом реакторе под аргоном при 120°С в течение 20 мин. Смесь затем охлаждали и хроматографировали дважды (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-50%, затем этилацетат в дихлорметане, 7,5%), получая промежуточный алкин в форме желтого масла (3 67 мг, 37%). М8 т/ζ 495,3 [М+Н]+.
Стадия Е. Соединение, полученное на стадии Е (367 мг, 0,74 ммоль), обрабатывали ТЕА (5,0 мл) при комнатной температуре в течение 2 ч. Анализ ЕС/М8 аликвоты реакционной смеси показал полное превращение. Смесь разбавляли водой (40 мл), нейтрализовали №2С03 и экстрагировали дихлорметаном (3x20 мл). Объединенные экстракты высушивали и упаривали досуха. Желтый остаток растирали с простым диэтиловым эфиром и высушивали. Целевое соединение получали в форме желтого порошка (228 мг, 81%). Температура плавления: 155-157°С; М8 т/ζ 381,5 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, ЭМ80-й6): δ м.д. 7,51-7,58 (2Н, м), 7,46 (1Н, д, 1=2,52 Гц), 7,42 (1Н, дд, 1=8,51, 1,89 Гц), 7,38 (1Н, д, 1=1,89 Гц), 7,32 (1Н, с), 7,07 (1Н, д, 1=8,83 Гц), 3,86 (3Н, с), 3,81 (3Н, с), 3,64-3,71 (2Н, м), 2,96-3,02 (1Н, м), 2,75-2,84 (2Н, м), 2,65 (1Н, м, 1=3,15 Гц), 2,30 (1Н, дд, 1=11,35, 10,40 Гц), 1,05 (3Н, д, 1=6,31 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 5 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 6.
Получение соединения 65
Стадия А. Смесь 5-фтор-2-йодбензойной кислоты (9,04 г, 34,0 ммоль), бут-3-ин-2-ола (5,7 мл, 5,46 г, 78,0 ммоль), ΖηΟ2 (4,62 г, 34,0 ммоль), Рй(Рй3Р)4 (1,96 г, 1,7 ммоль), Е1^ (14,2 мл, 10,3 г, 102,0 ммоль) и ЭМЕ (50 мл) перемешивали под аргоном при 100°С в течение 2 ч. После удаления летучих компонентов
- 61 028344 под вакуумом остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-50%), получая промежуточное соединение 7-фтор-3-(1-гидроксиэтил)-1Н-изохромен-1-он в форме коричневого масла (5,93 г, 84%). Μδ т/ζ 209,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, СОС13-0): δ м.д. 7,91-7,96 (1Н, м), 7,43-7,47 (2Н, м), 6,556,59 (1Н, м), 4,67 (1Н, кв., 1=6,52 Гц), 1,57 (3Н, д, 1=6,62 Гц).
Стадия В. Промежуточное соединение, полученное на стадии А (5,93 г, 28,5 ммоль), растворяли в дихлорметане (50 мл) и обрабатывали ΜπΟ2 (24,8 г, 285 ммоль) в течение 48 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток суспендировали в дихлорметане (500 мл) и перемешивали в течение 0,5 ч. Смесь фильтровали и твердое вещество промывали дихлорметаном (4x100 мл). Объединенные фильтраты упаривали досуха на роторном испарителе и хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлорметане 0-20%), получая промежуточный кетон в форме белых игольчатых кристаллов (3,88 г, 66%). Μδ т/ζ 207,1 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, СОС13-0): δ м.д. 8,01-8,06 (1Н, м), 7,68 (1Н, дд, 1=8,51, 5,04 Гц), 7,51-7,57 (1Н, м), 7,40 (1Н, д, 1=0,63 Гц), 2,59 (3Н, с).
Стадия С. Промежуточный кетон, полученный на стадии В (2,63 г, 12,8 ммоль), растворяли в хлороформе (30 мл) и обрабатывали бромом (0,72 мл, 2,25 г, 14,0 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч с последующим добавлением гексанов (150 мл) и смесь перемешивали в течение 15 мин. Осадок собирали фильтрацией и промывали гексанами, водой и высушивали. Фильтрат промывали Νβ^Ο3 и концентрировали. Остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлорметане, 0-5%), получая дополнительное промежуточное соединение бромкетон (полные 3,48 г, 96%). Μδ т/ζ 283,0 [М-Н]-, 285,0 [М-Н]-; 1Н-ЯМР (500 МГц, СОС13-0): δ м.д. 8,05 (1Н, дд, 1=8,20, 2,84 Гц), 7,72 (1Н, дд, 1=8,51, 5,04 Гц), 7,54-7,60 (1Н, м), 7,52 (1Н, с), 4,47 (2Н, с).
Стадия Ώ. Промежуточное соединение бромкетон, полученное на стадии С (1,43 г, 5,0 ммоль), смешивали с 3,5-диметилпиразин-2-амином (0,67 г, 5,5 ммоль) и ацетонитрилом (10,0 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 100°С в течение ночи и охлаждали до комнатной температуры. Добавляли этилацетат (20 мл) и осадок собирали, промывали этилацетатом и затем высушивали, получая 3(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-фтор-1Н-изохромен-1-он гидробромид (1,81 г, 93%). Μδ т/ζ 310,3 [М+Н]+.
Стадия Е. Смесь соединения, полученного на стадии Ώ (390 мг, 1,0 ммоль), Ν-метилпиперазина (300 мг, 3,0 ммоль) в ΝΜΓ (2,0 мл) перемешивали при 180°С в течение 24 ч под аргоном. После охлаждения до комнатной температуры смесь загружали на колонку с силикагелем. Флэш-хроматографию (силикагель) осуществляли, используя МеОН в дихлорметане (0-30%), получая целевое соединение в форме желтого порошка (223 мг, 57%). Температура плавления: 240-241°С; Μδ т/ζ 390,1 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, ΏΜδΟ-ά6) δ м.д. 8,34 (1Н, с), 8,24-8,27 (1Н, м), 7,70 (1Н, д, 1=8,83 Гц), 7,57 (1Н, дд, 1=8,83, 2,52 Гц), 7,50 (1Н, д, 1=2,52 Гц), 7,42 (1Н, с), 3,26-3,31 (4Н, м), 2,74 (3Н, с), 2,45-2,49 (4Н, м), 2,38 (3Н, д, 1=0,95 Гц), 2,24 (3Н, с).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 6 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 7.
Получение соединения 33
Стадия А. Промежуточное соединение бромкетон, полученное на стадии С, пример 6 (285 мг, 1,0 ммоль), смешивали с 2-аминотиазолом (110 мг, 1,1 ммоль) и ацетонитрилом (4,0 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 100°С в течение 0,5 ч и охлаждали до комнатной температуры. Добавляли этилацетат (10 мл) и осадок собирали фильтрацией. Осадок промывали этилацетатом и высушивали, получая промежуточное соединение, 2-амино-3-(2-(7-фтор-1-оксо-1Н-изохромен-3-ил)-2-оксоэтил)тиазол3-ий бромид (355 мг, 92%), гомогенный в анализе ЬС/Μδ. Μδ т/ζ 305,0 М+.
Стадия В. Смесь соединения, полученного на стадии А (193 мг, 0,5 ммоль), в ΝΜΕ (1,0 мл) перемешивали при 180°С в течение 1 ч, пока анализ ЬС/Μδ аликвоты реакционной смеси не показал, что весь исходный материал был превращен в промежуточное соединение циклизации. Μδ т/ζ 287,0[М+Н]+. Смесь охлаждали до комнатной температуры и Ν-метилпиперазин (150 мг, 1,5 ммоль) добавляли под аргоном. Полученную смесь затем перемешивали при 180°С в течение 24 ч. После охлаждения смесь загружали на колонку с силикагелем и целевое соединение элюировали МеОН в дихлорметане (0-30%) в форме желтого порошка (32 мг, 17%). Температура плавления: 236-238°С; Μδ т/ζ 367,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР
- 62 028344 (500 МГц, ΌΜδΟ-ά6) δ м.д. 8,12 (1Н, с), 7,93 (1Н, д, 1=4,41 Гц), 7,52-7,63 (2Н, м), 7,48 (1Н, с), 7,32 (1Н, д, 1=4,41 Гц), 7,17 (1Н, с), 3,23-3,30 (4Н, м), 2,43-2,49 (4Н, м), 2,23 (3Н, с).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 7 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 8.
Получение соединения 61
Стадия А. Следуя процедуре, описанной в примере 6, стадия Ό, промежуточное соединение, 3-(8хлоримидазо^Д-а^иридин^-ил^-фтор-Ш-изохромен-Еон гидробромид (244 мг, 62%), получали из коммерчески доступного 3-хлор-2-аминопиридина. Μδ т/ζ 315, 1 [М+Н]+.
Стадия В. Следуя процедуре, описанной в примере 6, стадия Ε, из 3-(8-хлоримидазо[1.2-а]пиридин2-ил)-7-фтор-1Н-изохромен-1-он гидробромида (99 мг, 0,25 ммоль) и Ν-метилпиперазина (86 мг, 0,75 ммоль) целевое соединение получали в форме желтого порошка (19 мг, 19%). Температура плавления: 240°С (разложение); Μδ т/ζ 395,0 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, ΌΜδΟ-ά6) δ м.д. 8,57 (1Н, дд, 1=6,94, 0,95 Гц), 8,46 (1Н, с), 7,72 (1Н, д, 1=8,83 Гц), 7,58 (1Н, с), 7,52 (1Н, дд, 1=7,25, 0,95 Гц), 7,51 (1Н, д, 1=2,52 Гц), 7,44 (1Н, с), 6,95 (1Н, дд, 1=7,41, 6,78 Гц), 3,28-3,31 (4Н, м), 2,47 (4Н, м), 2,24 (3Н, с).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 8 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 9.
Получение соединения 66
(δ)-3-(6,8-Диметилимидазо [1.2-а]пиразин-2-ил)-7-(3-метилпиперазин-1-ил)-1 Н-изохромен-1-он (78 мг, 0,2 ммоль), полученный согласно процедуре из примера 6, суспендировали в дихлорэтане (1,0 мл) с последующим добавлением формальдегида (0,4 мл, 37%, 4,9 ммоль) и №ВН(ОАс)3 (85 мг, 0,4 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем разбавляли дихлорметаном (5,0 мл) и нейтрализовали Ν^Ο3. Слой дихлорметана отделяли и водный слой экстрагировали дихлорметаном (3x2,0 мл). Экстракты объединяли и высушивали над Ν2δΟ4 и хроматографировали (силикагель, МеОН в дихлорметане 0-20%), получая целевое соединение в форме светло-желтого порошка (55 мг, 68%). Температура плавления: 255-256°С; Μδ т/ζ 404,1 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, ΌΜδΟ-ά6) δ м.д. 8,33 (1Н, с), 8,23-8,26 (1Н, м), 7,68 (1Н, д, 1=8,83 Гц), 7,56 (1Н, дд, 1=8,83, 2,52 Гц), 7,48 (1Н, д, 1=2,52 Гц), 7,40 (1Н, с), 3,65-3,76 (2Н, м), 2,82-2,91 (2Н, м), 2,73 (3Н, с), 2,37 (3Н, д, 1=0,95 Гц), 2,21-2,28 (4Н, м), 2,09-2,19 (1Н, м), 1,08 (3Н, д, 1=6,31 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 9 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 10.
Получение соединения 76
- 63 028344
Промежуточное соединение бромкетон, полученное на стадии С, пример 6 (855 мг, 3,0 ммоль), смешивали с 2,3,5-триметилпиразином (402 мг, 3,3 ммоль) и ацетонитрилом (10,0 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 80°С в течение 4 ч и охлаждали до комнатной температуры с последующим добавлением триэтиламина (1,3 мл, 9,0 ммоль). После перемешивания в течение 0,5 ч при комнатной температуре смесь перемешивали при 60°С в течение ночи. Растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлорметане 30%), получая промежуточное соединение, 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-фтор-1Н-изохромен-1-он (782 мг, 85%). Μδ т/ζ 309,3 [М+Н]+.
Стадия В. Следуя процедуре, описанной в примере 6, стадия Е, из 3-(1,3-диметилпирроло[1,2а]пиразин-7-ил)-7-фтор-1Н-изохромен-1-она (77 мг, 0,25 ммоль) и Ν-метилпиперазина (75 мг, 0,75 ммоль) целевое соединение получали в форме желтого порошка (44 мг, 45%). Температура плавления: 219-221°С; Μδ т/ζ 389,5 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, ΌΜδΟ-ά6) δ м.д. 8,03 (1Н, д, 1=1,58 Гц), 7,97 (1Н, д, 1=0,63 Гц), 7,56 (1Н, д, 1=2,84 Гц), 7,47-7,53 (2Н, м), 7,22 (1Н, с), 7,16-7,19 (1Н, м), 3,24-3,30 (4Н, м), 2,57 (3Н, с), 2,45-2,49 (4Н, м), 2,28 (3Н, д, 1=0,95 Гц), 2,24 (3Н, с).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 10 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 11.
Получение соединения 85
Соединение 65, полученное в примере 6 (188 мг, 0,5 ммоль), смешивали с 1-бром-2-этоксиэтаном (104 мг, 0,75 ммоль), Κ^Ο3 (172 мг, 1,25 ммоль) и ΌΜΤ (1,0 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 60°С в течение ночи, охлаждали до комнатной температуры и хроматографировали на силикагеле (метанол в дихлорметане, 0-20%), получая целевое соединение в форме желтого порошка (100 мг, 46%). Температура плавления: 192-194°С; Μδ т/ζ 434,3[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, ΌΜδΟ-ά6) δ м.д. 8,36 (1Н, с), 8,25-8,29 (1Н, м), 7,71 (1Н, д, 1=8,83 Гц), 7,57 (1Н, дд, 1=8,83, 2,52 Гц), 7,50 (1Н, д, 1=2,52 Гц), 7,43 (1Н, с), 3,48 (2Н, т, 1=5,83 Гц), 3,27-3,31 (4Н, м), 3,26 (3Н, с), 2,74 (3Н, с), 2,56-2,62 (4Н, м), 2,54 (2Н, т, 1=5,83 Гц), 2,38 (3Н, д, 1=0,95 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 11 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 12.
Получение соединения 88
Часть 1, стадия А. К охлажденному раствору 2,6-диметилпиразина (108 г, 1,0 моль) в ΌΜΤ (260 мл) на ванне ле,д IΙ2Ο при энергичном перемешивании добавляли сульфурилхлорид (270 мл, 3,3 моль). Скорость добавления устанавливали такой, чтобы поддерживать температуру реакции 40-60°С в течение приблизительно 2 ч. После добавления охлаждающую ванну удаляли и смесь перемешивали в течение дополнительных 0,5 ч. Анализ ГС/Μδ аликвоты показал, что осталось <5% исходного материала. Реакционную смесь затем охлаждали на ванне лед/вода и, поддерживая температуру ниже 35°С, тщательно гасили с помощью 10М ΝαΟΗ (1 л) с последующим добавлением Να^Ο3 (твердого) до рН 6. После добавления воды (800 мл) смесь перегоняли. Дистиллят собирали и органические фракции отделяли. Водный слой экстрагировали простым диэтиловым эфиром (100 мл х3) и эфирные экстракты объединяли с органическими фракциями, отделенными предварительно. Объединенные экстракты промывали водой
- 64 028344 (30 мл х3), затем солевым раствором и высушивали над Ыа23О4. После того как экстракты были сконцентрированы, остаток перегоняли и продукт собирали в форме бесцветной жидкости, приблизительная точка кипения: 127°С при 154 мм рт.ст. (99,1 г, 69%). 1Н-ЯМР (500 МГц, хлороформ-ά) δ м.д. 8,05 (1Н, с), 2,61 (3Н, д, 1=0,63 Гц), 2,50 (3Н, с).
Часть 1, стадия В. Смесь 2-хлор-3,5-диметилпиразин (28,5 г, 0,2 моль), полученного выше, СиО (0,8 г, 0,01 моль) и концентрированного водного раствора ЫН3 (28~30%, 150 мл) перемешивали в закрытом сосуде под давлением при 150°С в течение 3 дней. После охлаждения смесь концентрировали досуха и остаток обрабатывали этилацетатом (500 мл), затем перемешивали в течение 15 мин и фильтровали. Осадок промывали дополнительным количеством этилацетата (приблизительно 1,5 л) до тех пор, пока исходный материал более не обнаруживался в фильтрате. Фильтраты объединяли и концентрировали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем (МеОН/СН2С12, 0-10%), получая твердое вещество желтого/коричневатого цвета (20,7 г, 84%). 1Н-ЯМР (500 МГц, хлороформ-ά) δ м.д. 7,68 (1Н, с), 2,46 (3Н, с), 2,42 (3Н, д, 1=0,63 Гц)
Часть 2, стадия А. Смесь 5-бром-2-йодбензойной кислоты (12,6 г, 38,5 ммоль), бут-3-ин-2-ола (3,1 мл, 2,96 г, 42,4 ммоль), ΖηΓΓ (5,2 г, 38,5 ммоль), Рб(РЬ3Р)4 (2,23 г, 1,9 ммоль), Е!3Ы (16,0 мл, 11,7 г, 115,5 ммоль) и [)\1Г (80 мл) перемешивали под аргоном при 80°С в течение 2 ч. После удаления летучих компонентов под вакуумом, остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-100%), получая промежуточное соединение 7-бром-3-(1-гидроксиэтил)-1Н-изохромен-1-он в форме коричневого масла (7,5 г, 72%). 1Н-ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-ά) δ м.д. 8,38-8,45 (1Н, м), 7,81 (1Н, дд, 1=8,35, 2,05 Гц), 7,32 (1Н, д, 1=8,51 Гц), 6,52-6,59 (1Н, м), 4,66 (1Н, кв. д, 1=6,52, 0,95 Гц), 1,54-1,60 (3Н, м).
Часть 2, стадия В. Промежуточное соединение, полученное в части 2, стадия А (7,5 г, 27,7 ммоль), растворяли в дихлорметане (100 мл) и обрабатывали МпО2 (48,0 г, 554 ммоль) в течение 20 ч при комнатной температуре. Твердое вещество отфильтровывали и промывали дихлорметаном (4х203 мл). Объединенные фильтраты упаривали досуха на роторном испарителе и хроматографировали (силикагель, этилацетат/СН2С12, 0-20%), получая продукт в форме белых игольчатых кристаллов (4,5 г, 61%). 1Н-ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-ά) δ м.д. 8,51 (1Н, дд, 1=2,84, 0,63 Гц), 7,92 (1Н, дд, 1=8,35, 2,05 Гц), 7,53 (1Н, д, 1=8,51 Гц), 7,36 (1Н, с), 2,59 (3Н, с).
Часть 2, стадия С. Промежуточное соединение, полученное в части 2, стадия В (23,0 г, 86,0 ммоль), растворяли в хлороформе (400 мл) и обрабатывали бромом (4,64 мл, 14,5 г, 90,3 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч с последующим добавлением гексанов (1000 мл) и полученную смесь перемешивали в течение 15 мин. Осадок собирали фильтрацией и промывали гексанами, затем водой и высушивали. Фильтрат промывали Ыа2СО3 и концентрировали. Остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат/СН2С12, 0-5%), получая дополнительное промежуточное соединение (общее количество 27,0 г, 91%). 1Н-ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-ά) δ м.д. 8,48-8,56 (1Н, м), 7,94 (1Н, дд, 1=8,35, 2,05 Гц), 7,56 (1Н, д, 1=8,20 Гц), 7,48 (1Н, с), 4,46 (2Н, с).
Часть 2, стадия О. Промежуточное соединение, полученное в части 2, стадия С (4,84 г, 14,0 ммоль), смешивали с 3,5-диметилпиразин-2-амином (1,81 г, 14,7 ммоль), полученным в части 1 и ацетонитрилом (30 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 100°С в течение ночи и охлаждали до комнатной температуры. Добавляли этилацетат (60 мл) и осадок собирали, затем промывали этилацетатом и высушивали, получая 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-бром-1Н-изохромен-1-он гидробромид (5,04 г, 80%). М3 т/ζ 370,2, 372,2[М+Н]+. 1Н-ЯМР (500 МГц, ПМЗОЧ) δ м.д. 8,50-8,54 (1Н, м), 8,34 (1Н,
- 65 028344
с), 8,21 (1Н, д, 1=1,89 Гц), 8,02 (1Н, дд, 1=8,35, 2,05 Гц), 7,80 (1Н, д, 1=8,51 Гц), 7,51-7,57 (1Н, м), 2,79 (3Н, с), 2,41 (3Н, д, 1=0,95 Гц).
Часть 2, стадия Е. 3-(6,8-Диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-бром-1Н-изохромен-1-он гидробромид, полученный в части 2, стадия Ώ (1,13 г, 2,5 ммоль), смешивали с 4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2диоксаборолан-2-ил)-5,6-дигидропиридин-1(2Н) -трет-бутилкарбоксилатом (1,55 г, 5,0 ммоль), Рб2бЬа3 (0,12 г, 0,013 ммоль), КЕ (0,87 г, 15,0 ммоль), 1-Би3РНБЕ4 (0,087 г, 0,3 ммоль) и ТНЕ (10,0 мл). Под покрытием аргона реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение ночи. После охлаждения смесь разбавляли СН2С12 (10 мл) и фильтровали. Осадок промывали СН2С12 и фильтраты объединяли и упаривали. Остаток обрабатывали 10%-ным ТЕА в СН2С12 (55 мл) в течение 2 ч при комнатной температуре. Летучие компоненты удаляли и остаток нейтрализовали №2С03. После упаривания досуха остаток суспендировали в 10% МеОН в СН2С12 и фильтровали. Фильтрат хроматографировали (силикагель, МеОН/СН2С12, 0-20%), получая целевое соединение в форме белого порошка (0,92 г, 99%). Температура плавления: 266°С (разложение); МЗ т/ζ 373,2[М+Н]+. 1Н-ЯМР (500 МГц, ОМЗ0-б6) δ м.д. 8,45 (1Н, с), 8,27-8,30 (1Н, м), 8,18 (1Н, д, 1=1,00 Гц), 8,04 (1Н, дд, 1=1,00 Гц), 7,88 (1Н, д, 1=8,51 Гц), 7,56 (1Н, с), 6,41-6,49 (1Н, м), 3,80-3,87 (2Н, м), 3,38 (2Н, т, 1=6,15 Гц), 2,76-2,81 (2Н, м), 2,75 (3Н, с), 2,39 (3Н, д, 1=0,95 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 12 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 13.
Получение соединения 96
Соединение 88, полученное в примере 12 (37,2 мг, 0,1 ммоль), смешивали с 10%-ным Рб/С (8,0 мг) и ЕЮН (1,0 мл) и гидрировали при комнатной температуре в течение ночи, используя баллон с водородом. Смесь разбавляли СН2С12 (2,0 мл) и фильтровали через Целит. Фильтрат собирали и хроматографировали (силикагель, 0-20% МеОН в СН2С12), получая целевое соединение в форме белого порошка (21,0 мг, 56%). Температура плавления: 218-220°С; МЗ т/ζ 375,2[М+Н]+. 1Н-ЯМР (500 МГц, ЭМЗ0-б6) δ м.д. 8,43 (1Н, с), 8,29 (1Н, д, 1=0,63 Гц), 8,02 (1Н, д, 1=1,58 Гц), 7,85 (1Н, д, 1=8,20 Гц), 7,76 (1Н, дд, 1=8,20, 1,89 Гц), 7,54 (1Н, с), 3,38-3,47 (2Н, м), 2,96-3,10 (3Н, м), 2,76 (3Н, с), 2,40 (3Н, д, 1=0,95 Гц), 1,97-2,08 (2Н, м), 1,76-1,92 (2Н, м).
В табл. 1 приведены выделенные соединения в форме свободного основания соединения формулы (1а1), которые могут быть получены согласно процедурам приведенных примеров с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции. Получение любой соли, изотополога, стереоизомера, рацемата, энантиомера, диастереомера или таутомера из формы свободного основания соединения формулы (1а1) также рассматривается и включено в рамки описания. Если форма свободного основания соединения не была отделена от формы соли, специалист может осуществить необходимые реакции для получения и выделения формы свободного основания соединения.
Термин Соед. обозначает номер соединения, термин Прим. обозначает Номер примера(причем * указывает, что соответствующий пример для соединения приведен выше), термин Т.пл. обозначает Температуру плавления (°С), термин МЗ обозначает Пик(и) Масс-спектроскопии т/ζ М+, [М+Н]+, [М+2Н]+, [М-Н]- или [М-2Н]-, термин Ώ обозначает Разложение/Расщепление, термин ОК обозначает Скорость разложения, термин З обозначает Размягчение, термин N0 указывает, что значение не было определено и термин N1 указывает, что соединение не было выделено.
- 66 028344
Таблица 1
Прим. Соед. Название Т. пл. мг
1* 1 7-(пиперазин-1-ил)-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 179-181 308,2
2* 2 7-(пиперазин-1-ил)-3-(тиофен-3-ил)-1Н-изохромен-1-он 240 (ϋ) 313,2
3* 3 3-(3,4-диметоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 142-143 367,2
4 4 7-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 174-176 322,3
4 5 7-[(ЗК,55)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(пиридин-2-ил)-1Н- изохромен-1-он 168-170 336,3
4 6 3 -(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н- изохромен-1-он 220-222 387,2
4 7 3-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)-7- (4-метил-1,4-диазепан-1- ил)-1Н-изохромен-1-он 175-177 415,3
4 8 3 -(1,3-бензотиазол-2-ил)- 7 -(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 324-326 364,2
4 9 3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[(ЗК,55)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]- 1Н-изохромен-1-он 310-312 392,3
4 10 3-(1,З-бензотиазол-2-ил)-7-(1,4-диазепан-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 277-279 378,3
4 11 3 -(1,3 -бензотиазол-2-ил)- 7 -(4-метил-1,4 -диазепан-1-ил)-1Н- изохромен-1-он 270-272 392,3
3 12 3 -(1,3-бензодиоксол-5-ил)- 7 -(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 267-269 351,2
3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 8 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7 - (пиперазин-1-ил)-1Н- изохромен-1-он 3-(3,5-дифторфенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 3-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-7- (4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен- 1 -он 3-(3,4-диметоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1- он 3 -(3,4-диметоксифенил)-7 -[(ЗК,55)-3,5-диметилпиперазин-1-ил] -1Н- изохромен-1-он 3-(3-метоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 3-(3-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 7-[(ЗК,55)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(3-метоксифенил)-1Н- изохромен-1-он 7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(3-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он 3-(2-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 7-[(ЗК,55)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(2-метоксифенил)-1Н- изохромен-1-он 3-(4-метоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 3-(4-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1~он 3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1- он 253-255 200-202 297-299 ΝΌ 309-311 140-142 140-142 195-197 148-150 118-120 154-157 235-238 166-168 248 (ϋ) 3 65,2 343.1 365.2 381.3 395.3 337.2 351.2 365.3 351.2 351.3 365.3 337.2 351.3 347,2
8 27 3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н- изохромен-1-он 252-254 361,3
- 67 028344
7 28 3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н- изохромен-1-он 224-226 353,3
4 29 7-[(ЗЕ,55)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(4-метоксифенил)-1Н- изохромен-1-он 109-110 365,3
5* 30 3-(3,4-диметоксифенил)-7-[(33)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н- изохромен-1-он 155-157 381,3
4* 31 3-(4-метоксифенил)-7-[(35)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1- он 129-131 351,3
5 32 3-(2-метоксифенил)-7-[(35)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1- он 143-146 351,3
7* 33 3-(имидазо[2,1-Ь] [1,3]тиазол-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил) -1Н- изохромен-1-он 236-238 367,2
4 34 7-[(35)-З-метилпиперазин-1-ил]-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 343-345 322,1
4 35 3 -(2,3 -дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(35)-3-метилпиперазин-1- ил]-1Н-изохромен-1-он 175-177 379,2
4 36 3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7- [ (35)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н- изохромен-1-он 236-238 378,2
4 37 3-(2,З-дигидро-1,4-бензодиоксин-б-ил)-7-[(ЗЕ)-3-метилпиперазин-1- ил]-1Н-изохромен-1-он 175-177 379,2
4 38 3-(2 , З-дигидро-1,4-бензодиоксин-б-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)- 1Н-изохромен-1-он 163-165 379,2
4 5 5 5 5 5 5 δ 5 5 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 3 - (2,З-дигидро-1,4-бензодиоксин-б-ил)-7-[(ЗЕ,55)-3,5- диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 3 -(1,3-бензодиоксол-5-ил)- 7 -[(35)-3-метилпиперазин-1-ил]- 1Н- изохромен-1-он 3-(3,4-дигидроксифенил)-7- [ (35)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н- изохромен-1-он 3-(4-этоксифенил)-7-[(35)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1- он 3-(3-фтор-4-метоксифенил)-7-[(35)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н- изохромен-1-он 3-(3-гидроксифенил)-7- [ (35)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он 3-(2-фтор-4-метоксифенил)-7-[(35)-3-метилпиперазин-1-ил]-ΙΗ- из охромей- 1- он 3-(3-хлор-4-метоксифенил)-7-[(35)-3-метилпиперазин-1-ил]-ΙΗ- из охромен- 1 -он 3-(4-фтор-3-метоксифенил)-7-[(35)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н- изохромен-1-он 3-(5-фтор-2-метоксифенил)-7- [ (35)-З-метилпиперазин-1-ил]-ΙΗ- из охромен-1-он 218-220 248-250 220-222 239-240 209-211 256-258 167-168 187-189 118-120 115-117 393.3 365.3 353.2 365.3 369.1 337.2 369.2 385.2 369.2 369,2
5 49 3-(3,5-дифтор-4-метоксифенил)-7-[(35)-З-метилпиперазин-1-ил]-ΙΗ- из охромен- 1 -он 170-173 387,2
- 68 028344
5 50 3-(2,4-диметоксифенил)-7 - [ (35)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н- изохромен-1-он 231 (Ό) 381,6
3 51 3-(4-этоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 245 (Ό) 351,8
3 52 3-(2-метил-1-бензофуран-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1- он 206-208 361,7
4 53 3 -[3 -(дифторметокси)фенил]-7- [ (35)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н- изохромен-1-он 132-134 387,0
4 54 3-[4-(дифторметокси)фенил]-7-[(35)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н- изохромен-1-он 121-123 387,0
7 55 3-(имидазо[2,1-Ь] [1,3]тиазол-6-ил)-7 - [ (35)-3-метилпиперазин-1- ил]-1Н-изохромен-1-он 340-342 367,0
6 56 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н- изохромен-1-он 225-227 362,0
6 57 3 -(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(35)-3-метилпиперазин-1- ил]-1Н-изохромен-1-он 242-244 376,1
6 58 7-[(ЗК,55)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 279-281 390,1
8 59 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-ΙΗ- из охромей- 1 -он 343-345 381,0
8 60 3 -(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(35)-3-метилпиперазин-1- ил]-1Н-изохромен-1-он 314-316 395,0
8* 61 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил) - 1Н-изохромен-1-он 240 (Ώ) 395,0
6 62 3- (6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил) -ΙΗ- из охромей-1 -он >330 376,2
6 63 3 - (6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(38)-3- метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 325-327 390,2
6 64 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 -[(ЗК,53)-3,5- диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 244-246 404,3
6* 65 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1- ил)-1Н-изохромен-1-он 240-241 390,1
9* 66 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(35)-3,4- диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 255-256 404,1
9 67 3-(3,4-диметоксифенил)-7- [ (35)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-ΙΗ- из охромей-1-он 138-140 395,1
6 68 7-[(8аК)-гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-3-(6- метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 255-257 402,5
6 69 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(8а5)- гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-1Н-изохромен-1-он 282-285 416,5
6 70 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)- 7 -[(8аК)- гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-1Н-изохромен-1-он 282-285 416,5
6 71 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗК)-3- метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 331-333 390,5
- 69 028344
9 72 3-(6,8-диметилимидазо [ 1,2- а] пиразин-2- ил) - 7- [ (ЗК.) -3,4- диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 252-254 404,1
6 73 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1- ил)-1Н-изохромен-1-он 238-240 404,6
6 74 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4 -(пропан-2 - ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 260-262 418,5
6 75 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2- гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 248-250 420,5
10* 76 3 -(1,3 -диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-(4-метилпиперазин-1- ил)-1Н-изохромен-1-он 219-221 389,5
10 77 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-(4-этилпиперазин-1- ил)-1Н-изохромен-1-он 202-204 403,5
10 78 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(пропан-2- ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 213-215 417,5
10 79 3 -(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(2- гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 240-242 419,6
10 80 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8а8)- гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-1Н-изохромен-1-он 220-222 415,1
10 81 3 -(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8аК)- гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-1Н-изохромен-1-он 218-220 415,1
6 82 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 -(4-пропилпиперазин-1- ил)-1Н-изохромен-1-он, и 244-246 418,2
6 83 7 -(4-трет-бутилпиперазин-1-ил)-3 -(6,8-диметилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 300-302 432,3
9 84 7 -(4-циклопропилпиперазин-1-ил)-3 -(6,8-диметилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 260 (ϋ) 416,3
11* 85 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2 - метоксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 192-194 434,3
9 86 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2- метилпропил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 243-245 432,3
9 87 7-(4-циклобутилпиперазин-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 279-281 430,3
12* 88 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6- тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он 266 (ϋ) 373,2
9 89 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-метил-1,2,3,6- тетрагидропиридин-4 -ил) -1Н-изохромен-1-он 240-242 387,3
9 90 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-этил-1,2,3,6- тетрагидропиридин-4 -ил) -1Н-изохромен-1-он 227-229 401,3
9 91 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(пропан-2-ил) - 1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он 259-261 415,3
11 92 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(2-метоксиэтил)- 1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он 174-176 431,2
9 93 7-(1-циклопропил-1,2,3,6 -тетрагидропиридин-4-ил)-3 -(6,8- диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 230-232 413,3
- 70 028344
7-(1-циклобутил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-3-(6,8 диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
252-254
427,3
-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-пропил-1,2,3,6тетрагидропиридин-4 -ил) -1Н-изохромен-1-он
226-228
415,3
13*
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперидин-4-ил)-1Низохромен-1-он
218-220
375,2
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(оксетан-3· ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7- [1-(оксетан-3-ил 1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил) 1Н-изохромен-1-он
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин1-ил)-1Н-изохромен-1-он
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2 ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин1-ил)-1Н-изохромен-1-он
-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)- 7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен1-он
-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)- 7 -(4-метилпиперазин-1-ил)-1Низохромен-1-он
-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7 -[4 -(пропан-2-ил)пиперазин-1 ил]-1Н-изохромен-1-он
3-(2-метил-1,З-бензотиазол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен1-он
3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-[4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1ил]-1Н-изохромен-1-он
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(38)-3метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен
-1-ΟΙ
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗЕ)-3метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗЕ,53) - 3,5диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
3-(б-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 - [ (ЗЕ)-3,4диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 - [ (33)-3,4диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6 тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-метилпиперидин-4ил)-1Н-изохромен-1-он
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-этилпиперидин-4ил)-1Н-изохромен-1-он
294-296
253-255
221-226
291-296
286-291
271-276
229-235
251-258
251-258
261-266
271-276
270-275
248-250
215-217
432,3
429,3
396,3
410,3
438,3
424,3
378,3
392,3
420,3
378,2
410,2
424,2
424,2
424,2
393,2
389,4
403,4
- 71 028344
9 116 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-пропилпиперидин-4- ил)-1Н-изохромен-1-он 204-206 417,5
9 117 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(пропан-2- ил)пиперидин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он 227-229 417,5
9 118 7-(1-циклобутилпиперидин-4-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он ΝΌ 429,5
9 119 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(оксетан-3- ил)пиперидин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он 225-227 431,5
9 120 7-[(33)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 255-260 404,2
9 121 7-[(33)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 250-255 390,2
6 122 3-(б-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил) - 1Н-изохромен-1-он 279-285 376,2
6 123 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-гидроксипиперидин- 1-ил)-1Н-изохромен-1-он 290-292 391,3
6 124 7-[4 -(диметиламино)пиперидин-1-ил]-3-(6,8-диметилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 274-276 418,3
6 125 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗЕ)-3-метилпиперазин-1- ил]-1Н-изохромен-1-он 219-225 376,2
9 126 7-[(ЗЕ)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 238-241 404,2
9 127 7-[(ЗЕ)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 243-248 390,3
6 128 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2- ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 231-236 404,3
9 129 7-[(ЗЕ,53)-4-этил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6- метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 233-238 418,2
9 130 7-[(ЗЕ,53)-4-(2-гидроксиэтил)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6- метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 241-245 434,2
9 131 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗЕ,53)-3,4,5- триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 279-284 404,3
9 132 7-[(ЗЕ,53)-4-циклобутил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6- метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он ΝΌ 444,3
9 133 7-[(ЗЕ)-4-(2-гидроксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6- метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он Νϋ 420,2
9 134 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 - [ (33)-4-(2- гидроксиэтил)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он ΝΌ 434,2
9 135 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(33)-4-этил-З- метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 238-243 418,2
9 136 7-[(33)-4-циклобутил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6,8- диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 277-282 444,2
9 137 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 - [ (33)-3-метил-4 - пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 249-254 432,3
- 72 028344
9 138 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 - [ (35)-3-метил-4 - (пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 266-271 432,2
9 139 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 -[(35)-3-метил-4 - (оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 251-256 446,3
9 140 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[ (ЗН)-4-этил-З- метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 243-246 418,2
9 141 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗН)-3-метил-4 - пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 251-256 432,3
9 142 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗН)-4-(2- гидроксиэтил)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 256-261 434,2
9 143 7-[(ЗН)-4-циклобутил-3-метилпиперазин-1-ил]-3 -(6,8- диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 281-285 444,3
9 144 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[ (ЗН)-З-метил-4- (пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 262-267 432,2
11 145 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 - [ (ЗН)-4-(2 - метоксиэтил)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 205-210 448,2
11 146 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(35)-4-(2 - метоксиэтил)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 221-226 448,2
9 147 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗЕ,55)-4-этил-3,5- диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 253-258 432,2
9 148 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 - [ (ЗЕ,55)-3,5 -диметил- 4-пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 259-263 446,3
9 149 3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗН,55)-3,4,5- триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 261-266 418,2
6 150 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)- 1Н-изохромен-1-он Νϋ 390,2
6 151 3 -(8-этил-б-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин- 1-ил)-1Н-изохромен-1-он 229-234 404,3
6 152 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(35)-3- метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 206-211 404,3
6 153 3-(8-этил-б-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗН)-3- метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 208-213 404,3
6 154 7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(8-этил-б- метилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 239-244 418,2
9 155 7-[(35)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3 -(8-этил-6-метилимидазо[1,2- а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он 233-238 418,2
4 156 3-(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он 268-270 361,3
4 157 3-(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н- изохромен-1-он 239-240 375,3
9 158 3 -(8-этил-б-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗН,55)-3,4,5- триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он 235-238 432,2
12 159 3 -(8-этил-б-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6- тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он 239-241 387,3
или их соль, изотополог, стереоизомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или таутомер.
Биологические примеры
Чтобы описать более подробно и помочь в понимании настоящего описания, предлагаются следующие неограничивающие биологические примеры, более полно иллюстрирующие объем описания и которые не должны рассматриваться как специфически ограничивающие его объем. Такие вариации настоящего описания, которые могут уже быть известны или разработаны позже и которые находятся в рамках компетенции специалиста, считаются входящими в рамки соединений, как описано здесь и заявлено далее. Эти примеры иллюстрируют тестирование некоторых соединений, описанных здесь, ш уйго и/или ш У1Уо и демонстрируют пригодность этих соединений для лечения 8ΜΛ, усиления включения экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую от гена 8ΜΝ2. Соединения формулы (1а1) усиливают включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую от гена 8ΜΝ2 и увеличивают уровни белка 8тп, продуцируемого от гена 8ΜΝ2, и, таким образом, могут использоваться для лечения 8ΜΛ у пациентачеловека.
Пример 1.
- 73 028344
Конструкция минигена 8ΜΝ2.
Получение конструкций минигена.
ДНК, соответствующую области гена 8ΜΝ2, начинающейся с 5' конца экзона 6 (ЛТЛЛТТСССССХ8ЕО ГО Ν0. 14) и заканчивающейся на остатке нуклеиновой кислоты 23 экзона 8 (СЛССЛС)(8ЕО ГО Ν0. 15), амплифицировали с помощью РСК с использованием следующих праймеров:
Прямой праймер: 5'-СССССΑТССΑТΑΑТТСССССΑССΑССТС-3' (8ЕО ГО Ν0. 16).
Обратный праймер: 5'-СССССΑТСССТССТССТСТΑТСССΑССΑ-3' (8ЕО ГО Ν0. 17).
5' конец каждого праймера был сконструирован с добавлением сайта распознавания эндонуклеазы рестрикции ВатН1 на 5' конце экзона 6 (ССЛТСС)(8ЕО ГО Ν0. 18) и 3' конце после 23-го нуклеотида экзона 8. Используя сайты распознавания эндонуклеазы рестрикции ВатН1, фрагмент РСК клонировали в производное оригинального вектора рсДНК 3.1/Нудго, который был модифицирован как раскрыто в публикации заявки на патент И8 2005/0048549.
Новые ИТК добавляли к модифицированному вектору, используя сайт НшйШ и сайты рестрикции ВатН1, включающие 5'ΌΕΟ ИТК: 5'ТΑССТТСТТΑССССТΑСТССΑСССТТСССΑССΑССΑТСССΑССТСССΑССТСΑΑССΑТТССТΑ ЛЛСССТС-3' (8ЕО ГО Ν0. 19), клонированный в модифицированный вектор ρс^NΑ3.1/Ну§^о вместе со стартовым кодоном выше сайта рестрикции ВатН! и;
3'ΌΕΟ ИТК: 5'ΑТССΑΑΑСТΑСΑССΑСТΑСССТТССТΑССΑΑССССССССТСССΑСТСТСΑСΑСΑТСΑСТСΑΑС ΑТΑТΑТССТСССТΑΑССТΑТССТСТΑСССΑТСТΑΑСТΑТТСССТΑТСТСТТΑТΑССС-3' (8ЕО ГО Ν0. 20), клонированный в модифицированный вектор ρс^NΑ3.1/Ну§^о с использованием сайта распознавания рестрикционной эндонуклеазы ΝοΐΙ и сайта распознавания рестрикционной эндонуклеазы Хйо1 с терминирующим кодоном непосредственно после сайта рестрикции ΝοίΙ. Кроме того, ген люциферазы светлячка с отсутствующим стартовым кодоном клонировали в вектор, используя ВатН1 и сайты рестрикции ΝοΐΙ.
Полученный миниген включает, в порядке от 5' к 3' : 5'ГОЕС ИТК, стартовый кодон, шесть дополнительных нуклеотидов, формирующих сайт рестрикции ВатН1, остатки нуклеиновой кислоты экзона 6, остатки нуклеиновой кислоты интрона 6 8ΜΝ2, остатки нуклеиновой кислоты экзона 7 8ΜΝ2, остатки нуклеиновой кислоты интрона 7 8ΜΝ2 и первые 23 остатка нуклеиновой кислоты экзона 8 8ΜΝ2, дополнительные шесть нуклеотидов, формирующих сайт рестрикции ВатН1 и ген люциферазы светлячка с отсутствующим стартовым кодоном.
Единственный остаток аденина был вставлен после нуклеотида 48 экзона 7 8ΜΝ2 сайтнаправленным мутагенезом. Эта конструкция минигена упоминается как 8ΜΝ2-Α.
Транскрипты 8ΜΝ2, полученные из минигенов, содержащих экзон 6-8 и промежуточные интроны, демонстрируют сплайсинг их эндогенной пре-мРНК (Ьогеоп с1 а1., Ргос. Νηΐΐ. Лсай. 8с1. υ.8.Α., 1999, 96 (11), 6307). Получали 8ΜN2-альтернативную конструкцию репортера сплайсинга, которая содержит экзоны 6-8 и промежуточные интроны, сопровождаемые репортерным геном люциферазы. Существенными признаками этой конструкции является отсутствие стартового кодона в гене люциферазы, инактивация стоп-кодона (в открытой рамке считывания, которая кодирует белок 8ΜΝ) экзона 7 вставкой нуклеотида после нуклеиновой кислоты 48 экзона 7 и добавление стартового кодона (ЛТС) непосредственно выше экзона 6. Единственный аденин (8ΜΝ2-Α) был вставлен после нуклеинового остатка 48 экзона 7.
Миниген 8ΜΝ2 был сконструирован так, чтобы репортерный ген люциферазы находился в рамке со стартовым кодоком ЛТС непосредственно выше экзона 6, когда экзон 7 присутствует в мРНК и репортерный ген люциферазы находился вне рамки со стартовым кодоном ЛТС непосредственно выше экзона 6, если экзон 7 8ΜΝ2 удален в ходе сплайсинга пре-мРНК. Кроме того, в отсутствие экзона 7, открытая рамка считывания, которая начинается со стартового кодона ЛТС непосредственно выше экзона 6, содержит стоп-кодон во фрагменте экзона 8 8ΜΝ. Таким образом, в присутствии соединений, которые увеличивают включение экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую от гена 8ΜΝ2, продуцируется больше транскриптов, содержащих экзон 7 и более функциональный репортер. Схематическая иллюстрация этого описания может быть найдена на фиг. 1.
Последовательность ДНК минигена из конструкции 8ΜΝ2-Α 8ЕС ГО Ν0. 21 приведена на фиг. 2а. Изображение минигена субпоследовательности 8ΜΝ2-Α представлено на фиг. 2Ь.
Пример 2.
Тест КТ-цРСК сплайсинга мРНК минигена 8ΜΝ2 в культивируемых клетках.
Основанный на количественной РСК с обратной транскрипцией (КТ-цРСК) тест используют, чтобы определить количественно уровень полноразмерной мРНК минигена 8ΜΝ2, содержащей экзон 7 8ΜΝ2, на линии клеток НЕК293Н, стабильно трансфицированной указанным минигеном и обработанной тестируемым соединением.
- 74 028344
Материалы
Материал Источник
Клетки НЕК293Н АТСС СабаФод Νο.: СКЬ-1573
Се11з-То-Сб лизирующий буфер Бф£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее Αρρίίβά. ВФозузбетз) СабаФод Νο.: 4399002
ϋΜΕΜ Ы£е ТесНпоФодФез, 1пс. (ранее ФпчФбгодеп) СабаФод Νο.: 11960-044
96-луночные плоскодонные планшеты Весбоп ВФскФпзоп СабаФод Νο.: 353072
Смесь ферментов КТ-РСК ЬФ£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее Αρρίίβά ВФозузбетз) Рагб Νο. : 4388520 (также включенный в АдРабН-ΙΌ кФб СабаФод Νο.: 4387391)
Буфер КТ-РСК Ы£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее Αρρίίβά ВФозузбетз) Рагб Νο.: 4388519 (также включенный в АдРабЬ-Ιϋ кФб СабаФод Νο.: 4387391)
Набор АдРабП-Ю Опе-Збер КТ-РСК Ы£е ТесНпоФодФез, 1пс. (ранее Αρρίίβά ВФозузбетз) СабаФод Νο.: 4387391
Термоциклер Ы£е ТескпоФодФез, 1пс. (ранее Αρρίίβά ВФозузбетз) 7900НТ
Протокол. Клетки НЕК2 93Н, стабильно трансфицированные минигенной конструкцией 8МШ-А, описанной выше (10000 клеток/лунка), высевали в 200 мкл среды для культуры клеток (ЭМЕМ плюс 10%-ный ЕВ8, с 200 мкг/мл гигромицина) в плоскодонные планшеты с 96 лунками и планшет немедленно взбалтывали, чтобы гарантировать правильное диспергирование клеток, образующее монослой клеток. Клеткам дают прикрепиться в течение по меньшей мере 4-6 ч. Тестируемые соединения последовательно разбавляют 3,16-кратно в 100%-ном ДМСО, чтобы произвести кривую изменения концентрации с 7 точками. Раствор тестируемого соединения (1 мкл, 200х в ДМСО) добавляют в каждую содержащую клетки лунку и планшет инкубируют в течение 24 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% СО2, 100%-ная относительная влажность). 2 экземпляра получают для каждой тестируемой концентрации соединения. Клетки затем лизируют в лизирующем буфере Сейз-То-С! и лизат сохраняют при -80°С.
Полноразмерную мРНК минигена 8МШ-А и ОАРЭН определяют количественно, используя следующие праймеры и зонды, приведенные в табл. 3. Праймер 8МN Прямой А (8Ер ГО N0. 1) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 7 (от нуклеотида 22 к нуклеотиду 40), праймер 8МN Обратный А (8Ер ГО N0. 2) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в последовательности, кодирующей люциферазу светлячка, зонд А 8МN (8Ер ГО N0. 3) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 7 (от нуклеотида 50 к нуклеотиду 54) и экзоне 8 (от нуклеотида 1 к нуклеотиду 21). Комбинация этих трех олигонуклеотидов обнаруживает только минигены 8МШ или 8МШ (КТ-цРСК) и не будет обнаруживать эндогенные гены 8МШ или 8МШ.
Таблица 3
Праймеры/Зонды Последовательность Источник
3ΜΝ Прямой праймер А ЗЕО Ю ΝΟ.1: СААССААССТССТСАСАТТ РТС1
3ΜΝ Обратный праймер А ЗЕО Ю ΝΟ.2: ТСТТТАТСТТТТТССССТСТТС РТС1
3ΜΝ Прямой зонд А ЗЕО Ю ΝΟ.3: 6ЕАМ- ААССАОАААТССТООСАТАОАССАСС-ТАМКА РТС1
НСАРБН Прямой зонд ЗЕО Ю ΝΟ.4: У1С- СОССТССТСАССАОСССТССТ-ТАМКА ЬТ12
НСАРЦН Прямой праймер ЗЕО ΙΟ ΝΟ.5: СААСССАТТТССТСОТАТТСС БТФ2
НСАРОН Обратный праймер ЗЕО Ю N0.6: ТСАТСССААСААТАТССАСТТТАСС БТ12
- 75 028344 1 Праймеры и зонды, разработанные РТС Ткегареибсз, 1пс.
2 Коммерчески доступные от ЕН'е Тескпо1о§1ез, 1пс. (ранее 1пубго§еп).
Прямой и обратный праймеры 5ΜΝ используются в конечных концентрациях 0,4 мкМ. Зонд 5ΜΝ используется в конечной концентрации 0,15 мкМ. Праймеры ОЛРПН используются в конечных концентрациях 0,2 мкМ и зонды - в концентрации 0,15 мкМ.
Смесь δΜN2-миниген ОЛРПН (15 мкл полный объем) получают, объединяя 7,5 мл 2х буфера КТРСК, 0,4 мл 25х смеси ферментов КТ-РСК, 0,75 мл 20х смеси праймер-зонд ОЛРПН, 4,0075 мл воды, 2 мл 10-кратно разбавленного лизата клеток, 0,06 мл 100 мМ прямого праймера 5ΜΝ, 0,06 мл 100 мМ обратного праймера 5ΜΝ и 0,225 мл 100 мМ зонда 5ΜΝ.
РСК осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 с); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяют стадии 3 и 4 для в общей сложности 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит как миниген 5ΜΝ2-Ά, так и наборы праймеров/зондов ОЛРПН (мультиплексный проект), обеспечивая одновременное измерение уровней двух транскриптов.
Два продукта сплайсинга 5ΜΝ получают от минигека 5ΜΝ2. Первый продукт сплайсинга, содержащий экзон 7, соответствующий полноразмерной мРНК 5ΜΝ2, упомянут здесь с использованием термина РЬ миниген 5ΜΝ2. Второй продукт сплайсинга с отсутствующим экзоном 7 упомянут здесь с использованием термина Δ7 миниген 5ΜΝ2.
Увеличение РЬ минигена 5ΜΝ2 мРНК относительно его содержания в клетках, обработанных контрольным носителем, определяют на основании данных РСК в реальном времени, используя модифицированный способ ΔΔΟ (как описано в Ь1уак апб ЗскшШдеп, Μеΐкобδ, 2001, 25:402-8). Эффективность амплификации (Е) вычисляют по наклону кривой амплификации для РЕ минигена 5ΜΝ2 и ОЛРПН индивидуально. Изобилие РЕ минигена 5ΜΝ2 и ОЛРПН затем вычисляют как (1+Е)-С\ где С! представляет собой пороговое значение для каждого ампликона. Изобилие РЕ минигена 5ΜΝ2 подвергают нормализации к изобилию ОЛРПН. Изобилие подвергнутого нормализации РЕ минигена 5ΜΝ2 от обработанных тестируемым соединением образцов затем делят на изобилие подвергнутого нормализации РЕ минигена 5ΜΝ2 от обработанных носителем клеток, чтобы определить уровень 5ΜΝ2 РЕ мРНК относительно контроля, обработанного носителем.
Результаты. Как видно на фиг. 3, клетки, обработанные соединением 65 (фиг. 3а) и соединением 69 (фиг. 3Ь), увеличили мРНК РЕ минигена 5ΜΝ2 в низких концентрациях. Оба тестируемых соединения полностью восстановили включение экзона 7 относительно необработанных клеток.
Для соединений формулы (1а1) или ее формы, раскрытой здесь, табл. 4 представляет ЕСц5х для продукции полноразмерной мРНК 5ΜΝ2, которая была получена от данных концентрации с 7 точками, произведенных для каждого тестируемого соединения согласно процедуре биологического примера 2. Термин ЕС1,5х для продукции полноразмерной мРНК 5ΜΝ2 определяют как концентрацию тестируемого соединения, которая является эффективной для увеличения количества полноразмерной мРНК 5ΜΝ2 до уровня в 1,5 раза больше относительно уровня в обработанных носителем клетках. ЕС1?5х для продукции полноразмерной мРНК 5ΜΝ2 от >3 мкМ до <30 мкМ обозначены одной звездой (*), ЕСЪ5х от >1 мкМ до <3 мкМ обозначены двумя звездами (**), ЕС1?5х от >0,3 мкМ до <1 мкМ обозначены тремя звездами (***), ЕСц5х от >0,1 мкМ до <0,3 мкМ обозначены четырьмя звездами (****) и ЕС1г5х <0,1 мкМ обозначены пятью звездами (*****).
Таблица 4
- 76 028344
10 * *
11 * * *
12 * * *
13 * *
14 * *
15 *
16 * * *
17 * * *
18 * * *
19 *
20 *
21 *
22 * *
23 * *
24 * * * *
25 * *
26 * *
27 *
28 * * *
29 * * *
30 *****
31 *****
32 * * *
33 * *
34 * * *
35 * * *
36 *
37 * *
38 *
39 * *
40 * * *
41 * * *
42 * * * *
43 *****
44 *
45 * * * *
46 * * * *
47 *
48 * * *
49 *
50 *****
51 * *
52 * * * *
53 * * *
63 *****
64 *****
65 *****
66 *****
67 * * *
68 *****
69 *****
70 * * * *
71 *****
72 *****
73 *****
74 *****
75 *****
76 *****
77 *****
78 *****
79 *****
80 *****
81 *****
82 *****
83 * * * *
84 * * * *
85 * * * *
86 *****
87 *****
88 *****
89 *****
90 *****
91 *****
92 *****
93 *****
94 *****
95 *****
96 *****
97 * *
98 *****
99 *****
100 *****
101 * * * *
102 * * * *
103 *****
104 * * * *
105 ****
106 * *
116 *****
117 *****
118 *****
119 * * * *
120 *****
121 *****
122 *****
123 * *
124 *****
125 *****
126 *****
127 *****
128 *****
129 *****
130 *****
131 *****
132 *****
133 *****
134 *****
135 *****
136 *****
137 *****
138 * * * *
139 * * *
140 *****
141 *****
142 *****
143 *****
144 *****
145 *****
146 * * * *
147 *****
148 *****
149 *****
150 *****
151 *****
152 *****
153 *****
154 *****
155 *****
156 *****
157 *****
158 *****
159 *****
Пример 3.
Тест КТ-цРСК сплайсинга эндогенной мРНК δΜΝ2 в культивируемых клетках.
Основанный на количественной РСК с обратной транскрипцией (КТ-цРСК) тест используют, чтобы определить количественно уровни полноразмерной и Δ7 мРНК δΜΝ2 в первичных клетках и линиях клеток, содержащих ген δΜΝ2, обработанных тестируемым соединением.
- 77 028344
Материалы
Материал Источник
Клетки ЗМА Типа 1 человека СМ03813 (СогтеИ Тпзбтбибе)
Лизирующий буфер Ы£е ТесЪпо1од1ез, 1пс . (ранее Αρρίϊβά
Се11з-То-Сб Втозузбетз) Саба1од Νο.: 4399002
ϋΜΕΜ Ы£е ТесНпо1од1ез, 1пс . Са£а1од Νο.: 11960-044 (ранее Тт/Эбгодеп)
96-луночные
плоскодонные ВесЕоп ΌίοΚίηΒοη Са£а1од Νο.: 353072
планшеты Ы£е ТесНпо1од1ез, 1пс . (ранее Αρρίϊβά
Смесь ферментов Вгозузбетз) Рагб Νο.: 4388520 (также
КТ-РСК включенный в АдРабЬ-Ιϋ ктб Саба1сд Νο.:
4387391)
Ы£е ТесЪпо1од1ез, 1пс . (ранее Αρρίϊβά
Буфер КТ-РСК Втозузбетз) Раг£ Νο.: включенный в АдРабЬ-Ю 4388519 (также ктб Саба1сд Νο.:
4387391)
Набор АдРабЬ-Ιϋ Ы£е ТесЪпо1од1ез, 1пс . (ранее Αρρίϊβά
Опе-Збер КТ-РСК Втозузбетз) Саба1од Νο.: 4387391
Термоциклер Ы£е ТесЪпо1од1ез, 1пс Втозузбешз) 7900НТ . (ранее Αρρίϊβά
Протокол. Клетки ΘΜ03813 пациента с δΜΑ (5000 клеток/лунка) высевали в 200 мкл среды для культуры клеток (Ι)ΜΗΜ плюс 10%-ный ΓΒδ) в плоскодонные планшеты с 96 лунками и планшет немедленно взбалтывали, чтобы гарантировать правильное диспергирование клеток, образующее монослой клеток. Клеткам дают прикрепиться в течение по меньшей мере 4-6 ч. Тестируемые соединения последовательно разбавляют 3,16-кратно в 100%-ном ДМСО, чтобы произвести кривую изменения концентрации с 7 точками. Раствор тестируемого соединения (1 мкл, 200х в ДМСО) добавляют в каждую тестовую лунку и 1 мкл ДМСО добавляют в каждую контрольную лунку. Планшет инкубируют в течение 24 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% СО2, 100%-ная относительная влажность). Клетки затем лизируют в лизирующем буфере Се11§-То-С1 и лизат сохраняют при -80°С.
ЗЫ^-специфичные продукты сплайсинга и мРНК СЛРОН идентифицируют, используя следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 5. Праймер δΜΝ РЬ Гогмагб В (δЕ^ ГО ΝΟ. 7) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 7 (от нуклеотида 32 к нуклеотиду 54) и экзоне 8 (от нуклеотида 1 к нуклеотиду 4), праймер δΜΝ Δ7 Гогмагб В (δЕ^ ГО ΝΟ. 8) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 6 (от нуклеотида 87 к нуклеотиду 111) и экзоне 8 (от нуклеотида 1 к нуклеотиду 3), праймер δΜΝ Кеуегзе В (δЕ^ ГО ΝΟ. 9) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 8 (от нуклеотида 39 к нуклеотиду 62), зонд δΜΝ РгоЬе В (δЕ^ ГО ΝΟ. 10) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 8 (от нуклеотида 7 к нуклеотиду 36). Эти праймеры и зонд гибридизуются с нуклеотидными последовательностями, общими для мРНК δΜΝ2 человека. Так как клетки пациента с δΜΑ, используемые в примере 3, содержат только ген δΜΝ2, КТдРСК может определить количественно только полноразмерную δΜΝ2 и Δ7 мРНК.
- 78 028344
Таблица 5
Праймер/Зонд Последовательность Источник
3ΜΝ РЬ Прямой праймер В ЗЕО Ю ΝΟ.7: ОСТСАСАТТССТТАААТТААООАСААА РТС1
5ΜΝ Δ7 Прямой праймер В ЗЕ<2 Ю ΝΟ.8: ТСССТАТСАТАСТОССТАТТАТАТООАА РТС1
5ΜΝ Обратный праймер В ЗЕО Ю ΝΟ.9: ТССАОАТСТОТСТСАТССТТТСТТ РТС1
5ΜΝ Прямой зонд В ЗЕО ΙΌ N0.10: 6РАМ- СТООСАТАСАОСАОСАСТАААТСАСАССАС-ТАМЕА РТС1
ΠΟΑΡϋΗ Прямой зонд ЗЕО Ю ΝΟ.4: У1С-СОССТСОТСАССАОООСТОСТ- ТАМЕА ЬТ12
ΗΟΑΡΌΗ Прямой праймер ЗЕО Ιϋ ΝΟ.5: СААСССАТТТООТСОТАТТСО ЬТ12
ΗΟΑΡΌΗ Обратный праймер ЗЕ<2 Ιϋ ΝΟ.6: ТОАТООСААСААТАТССАСТТТАСС ЬТ12
1 Праймеры и зонды, разработанные РТС Тйегареийсз, Ес.
2 Коммерчески доступные от ЕЕ ТесЬηο1οд^еδ, Ес (ранее ΕνΕΌ^'Ε).
Прямой и обратный праймеры δΜΝ используются в конечных концентрациях 0,4 мкМ. Зонд δΜΝ используется в конечной концентрации 0,15 мкМ. Праймеры СЛР1)11 используются в конечных концентрациях 0,1 мкМ и зонд - в концентрации 0,075 мкМ. Набор одностадийной КТ-РСК использовался как смесь РСК в реальном времени.
Смесь δΜN-СΑР^Н (10 мкл полный объем) получают, объединяя 5 мкл 2х буфера КТ-РСК, 0,4 мкл 25х смеси ферментов КТ-РСК, 0,25 мкл 20х смеси праймер-зонд СЛРОИ, 1,755 мкл воды, 2,5 мкл лизата клеток, 0,04 мкл 100 мМ прямых праймеров δΜΝ РЬ или δΜΝ Δ7, 0,04 мкл 100 мкМ обратного праймера δΜΝ и 0,015 мкл 100 мкМ зонда.
РСК осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 с); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяют стадии 3 и 4 для в общей сложности 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит либо δΜΝ2 РЬ и СЛРОИ, либо δΜΝ2 Δ7 и наборы праймеры/зонд СЛР1)11 (мультиплексный проект), обеспечивая одновременное измерение уровней двух транскриптов.
Эндогенный ген δΜΝ2 дает начало двум прошедшим альтернативный сплайсинг мРНК. Полноразмерная мРНК δΜΝ2, которая содержит экзон 7, упомянута здесь с использованием термина δΜΝ2 РЬ . Усеченная мРНК, которая не содержит экзон 7, упомянута здесь с использованием термина δΜΝ2 Δ7.
Увеличение δΜΝ2 РЬ и уменьшения δΜΝ2 Δ7 мРНК относительно их уровней в клетках, обработанных контрольным носителем, определяют на основании данных РСК в реальном времени, используя модифицированный способ ΔΔΡ'Ι (как описано в Еоак апс! δсЬт^ίίдеη, ΜеίЬοάδ, 2001, 25:402-8). Эффективность амплификации (Е) вычисляют по наклону кривой амплификации для δΜΝ2 РЬ, δΜΝ2 Δ7 и (Е\Р[)11 индивидуально. Изобилие δΜΝ2 РЬ, δΜΝ2 Δ7 и СЛРОИ затем вычисляют как (1+Б)-С1:, где С1 представляет собой пороговое значение для каждого ампликона. Изобилие δΜΝ2 РЬ и δΜΝ2 Δ7 подвергают нормализации к изобилию СЛР1)11. Подвергнутые нормализации изобилия δΜΝ2 РЬ и δΜΝ2 Δ7 от обработанных тестируемым соединением образцов затем делят на изобилие подвергнутых нормализации δΜΝ2 РЬ и δΜΝ2 Δ7, соответственно, от обработанных носителем клеток, чтобы определить уровни δΜΝ2 РЬ и δΜΝ2 Δ7 мРНК относительно контроля, обработанного носителем.
Результаты. Как видно на фиг. 4, клетки, обработанные возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 4а) и соединения 69 (фиг. 4Ь), содержат прогрессивно больше δΜΝ2 РЬ мРНК и меньше δΜΝ2 Δ7 мРНК, чем те, которые обработаны носителем, показывая коррекцию альтернативного сплайсинга δΜΝ2.
Пример 4.
Полуколичественный тест КТ по окончании РСК сплайсинга эндогенной мРНК δΜΝ2 в культивируемых клетках.
Тест сплайсинга с обратной транскрипцией по окончании РСК используется для визуализации и количественного определения уровней полноразмерной и Δ7 мРНК δΜΝ2 в первичных клетках и линии клеток, содержащих ген δΜΝ2, обработанных тестируемым соединением.
- 79 028344
Материалы
Материал Источник
Клетки ЗМА Типа 1 человека СМ03813 (СогФеФФ 1пзбФбибе)
Се11з-То-Сб лизирующий буфер ЬФ£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее АррФФеЬ ВФозузбетз) СабаФод Νο.: 4399002
ΏΜΕΜ ЬФ£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее 1тлФбгодеп) СабаФод Νο. : 11960-044
96-луночные плоскодонные планшеты Весбоп ОФскФпзоп СабаФод Νο.: 353072
РФабФпит Тад ΗίΕί ΟΝΑ РоФутегазе Зирег Μίχ ЬФ£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее 1т/Фбгодеп) СабаФод Νο.: 11304-016
ФЗсгФрб ВТ ферментный набор ВФоЕас!: СабаФод Νο.: 170-8890
Этидий бромид 2% гели агарозы Е 48- лунок ОоиЫе СотЬ ЬФ£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее 1ггуфбгодеп) СабаФод Νο.: С8008-02
СеФ ОоситепбабФоп Зузбет υνρ СеФ Όοο 16 310 ТтадФпд зузбет
Протокол. Клетки СМ03813 пациента с 3МА (5000 клеток/лунка) высевали в 200 мкл среды для культуры клеток (ЭМЕМ плюс 10%-ный ГВ3) в плоскодонные планшеты с 96 лунками и планшет немедленно взбалтывали, чтобы гарантировать правильное диспергирование клеток, образующее монослой клеток. Клеткам дают прикрепиться в течение по меньшей мере 4-6 ч.
Тестируемые соединения последовательно разбавляют 3,16-кратно в 100%-ном ДМСО, чтобы произвести кривую изменения концентрации с 7 точками. Раствор тестируемого соединения (1 мкл, 200х в ДМСО) добавляют в каждую тестовую лунку и 1 мкл ДМСО добавляют в каждую контрольную лунку. Планшет инкубируют в течение 24 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% СО2, 100%-ная относительная влажность). Клетки затем лизируют в лизирующем буфере СеПз-То-С! и лизат сохраняют при -80°С.
3МЫ ГЬ и Δ7 мРНК идентифицируют, используя следующие праймеры в табл. 6. Эти праймеры гибридизуются с нуклеотидными последовательностями в экзоне 6 (3МЫ Прямой С, 3Ер ГО ЫО. 11)(от нуклеотида 43 к нуклеотиду 63) и экзоне 8 (ЗМЫ Обратный С, ЗЕр ГО ЫО. 12)(от нуклеотида 51 к нуклеотиду 73), общими для человеческой мРНК 3МЫ2. Так как клетки пациента с 3МА, используемые в примере 4, содержат только ген 3МЫ2, КТ-РСК может визуализировать и определить количественно только полноразмерную мРНК 3МЫ2 и Δ7 мРНК 3МЫ2.
Таблица 6
Праймер Последовательность Источник
3ΜΝ Прямой С ЗЕО Ю ΝΟ.11: САТССТСАТССТТТСССААСТ РТС1
3ΜΝ Обратный С ЗЕО Ю ΝΟ.12: СССТТСАСАТТССАСАТСТСТС РТС1
1 Праймер, разработанный РТС Тйегареибсз, 1пс.
Чтобы синтезировать кДНК, 5 мкл лизата, 4 мкл 5х реакционной смеси 13сг1р1, 1 мкл обратной транскриптазы и 10 мкл воды объединяли и инкубировали 5 мин при 25°С, затем 30 мин при 42°С, затем 5 мин при 85°С. Раствор кДНК сохраняли при -20°С.
Чтобы осуществить РСК, 5 мкл кДНК, 0,2 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,2 мкл 100 мкМ обратного праймера и 22,5 мкл полимеразной суперсмеси объединяли в 96-луночных полуокаймленных планшетах для РСК. РСК осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 94°С (2 мин), стадия 2: 94°С (30 с), стадия 3: 55°С (30 с), стадия 4: 68°С (1 мин), затем повторяют стадии 2-4 для в общей сложности 33 циклов, затем поддерживают при 4°С.
мкл каждого образца РСК разделяли электрофорезом на 2%-ном агарозном Е-геле в течение 14 минут, окрашивали окрашивающим реагентом для двухцепочечной ДНК (б5ДНК)(например, этидий бромидом) и визуализировали с использованием геля для формирования изображений.
Результаты. Как видно на фиг. 5, клетки, обработанные возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 5а) и соединения 69 (фиг. 5Ь) содержат прогрессивно больше ГБ мРНК 3МЫ2 и меньше Δ7 мРНК 3МЫ2, что показывает коррекцию альтернативного сплайсинга 3МЫ2.
- 80 028344
Пример 5.
Тест КТ-цРСК сплайсинга мРНК ЗМ№ в тканях животных.
Основанный на количественной РСК с обратной транскрипцией (КТ-цРСК) тест используется для количественного определения уровней полноразмерной и Δ7 мРНК ЗМ№ в тканях мышей, обработанных тестируемым соединением.
Материалы_____
Материал Источник
Ткани от мышей С/С-аллеля ЗМА ТЬе Ласкзоп ЬаЬогабогу, штамм Νο.: 008714 (В б .12 9- ЗтП 1ίη>5 (Зтп1/5МЫ2)МгрЬ / д)
Ткани от мышей Δ7 ЗМА ТЬе Ласкзоп ЬаЬогабогу, штамм Νο.: 005025 (РУВ.Сд-Тд (5МЬ2*бе1ба7)4299АЬтЬ Тд (3ΜΝ2) 8 9АЬтЬ 5тη 1 ьтмза/δ)
Смесь ферментов КТ-РСК Ы£е ТесЬпо1од1ез, 1пс. (ранее АррИеЬ В1озузбетз) Рагб Νο.: 4388520 (также включен в набор АдРабЬ-ΙΌ кхб Саба1од Νο.: 4387391)
Буфер КТ-РСК Ы£е ТесЬпо1од1ез, 1пс. (ранее Αρρίίθά Втозузбетз) Рагб Νο.: 4388519 (также включен в набор АдРабЬ-Ю кхб Саба1од Νο.: 4387391)
Набор АдРабЬ-Ιϋ Опе-Збер КТ-РСК Ы£е ТесЬпо1од1ез, 1пс. (ранее Αρρίίεά В1озузбетз) Саба1од Νο.: 4387391
Мышиные САРБН праймеры и зонды Ы£е ТесЬпо1од1ез, 1пс. (ранее АррИеЬ Втозузбетз) Саба1од Νο.: 4352339Е
Лизирующий реагент φΙΑζοΙ ф1адеп Саба1од Νο.: 79306
КЫеазу Σϊρίά Тгззие Μίηί Κί6 фгадеп Саба1од Νο.: 74804
5 мм шарики из нержавеющей стали фтадеп Саба1од Νο.: 69989
Т1ззиеЬугег II ф1адеп Саба1од Νο.: 85300
Термоциклер Ы£е ТесЬпо1одгез, 1пс. (ранее АррИеЬ В1озу8бетз) 7900НТ
Протокол. Мышей С/С-аллель ЗМА обрабатывали пероральным скармливанием два раза в сутки (ΒΙΟ) в течение 10 дней тестируемых соединений, повторно суспендированных в 0,5% НРМС и 0,1% Т^ееп-80. Образцы тканей собирали и быстро замораживали для очистки РНК.
Образцы тканей (20-40 мг) гомогенизировали в лизирующем реагенте ^IАζο1 в течение 2 мин при 20 Гц в Т188иеЬу8ег II, используя один шарик из нержавеющей стали. После добавления хлороформа гомогенат разделяли на водную и органическую фазы центрифугированием. РНК отделялась наверх, водную фазу экстрагировали и добавляли этанол, чтобы обеспечить подходящие условия связывания. Образец затем наносили на колонку К№азу из К№азу М1ш Κίΐ, где полное количество РНК связывается с мембраной. РНК элюировали в воде без РНК-азы, затем сохраняли при -20°С и впоследствии анализировали с использованием ТацМап КТ-цРСК на 7900НТ термоциклере. Полную РНК разбавляли в десять раз и 2,5 мкл разбавленного образца добавляли к смеси ТацМап КТ-цРСК.
Продукты сплайсинга ЗМ№ идентифицировали, используя следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 7. Праймер ЗΜN ЕЬ Прямой В (ЗЕ^ ΙΏ N0. 7) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзонах 7 и 8, праймер ЗΜN Δ7 Прямой В (ЗЕ^ ΙΓ) N0. 8) гибридизуются с нуклеотидными последовательностями в экзонах 6 и 8, праймер ЗΜN Обратный В (ЗЕ^ ΙΓ) N0. 9) гибридиэуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 8, зонд ЗΜN Зонд В (ЗЕ^ ΙΓ) N0. 10) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 8. Эти праймеры и зонд гибридизуются с последовательностями нуклеотида, общими для человеческой мРНК ЗМ№. Так как клетки пациента с ЗМА, используемые в примере 5, содержат только ген ЗМ№, КТ-цРСК может определить количественно только полноразмерную мРНК и Δ7 мРНК ЗМШ.
- 81 028344
Таблица 7
Праймер/Зонд Последовательность Источник
3ΜΝ ГЬ Прямой праймер В ЗЕ<2 Ιϋ ΝΟ.7: ОСТСАСАТТССТТАААТТААСОАОААА РТС1
3ΜΝ Δ7 Прямой праймер В ЗЕО ГО ΝΟ.8: ТСССТАТСАТАСТСССТАТТАТАТСОАА РТС1
3ΜΝ Обратный праймер В ЗЕО ГО ΝΟ.9: ТССАСАТСТОТСТОАТССТТТСТТ РТС1
3ΜΝ Прямой зонд В ЗЕО ГО N0.10: 6РАМ- СТСССАТАСАОСАССАСТАААТОАСАССАС-ТАМПА РТС1
1 Праймеры и зонды, разработанные РТС ТРегареийсз, 1пс.
Прямые и обратные праймеры δΜΝ используются в конечных концентрациях 0,4 мкМ. Зонд δΜΝ используется в конечной концентрации 0,15 мкМ. Смесь δΜN-ΘΑР^Н (полный объем 10 мкл) получают, объединяя 5 мкл 2х буфера КТ-РСК, 0,4 мкл 25х смеси ферментов КТ-РСК, 0,5 мкл 20х смеси праймер-зонд СЛРЭН, 1,505 мкл воды, 2,5 мкл раствора РНК, 0,04 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,04 мкл 100 мкМ обратного праймера и 0,015 мкл 100 мкМ зонда δΜΝ.
Каждый цикл РСК осуществляли при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 с); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяют стадии 3 и 4 для в общей сложности 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит наборы праймеры/зонд (мультиплексный проект) либо δΜΝ2 РЬ и тΘΑР^Н, либо δΜΝ2 Δ7 и тСЛРЭН, обеспечивая одновременное измерение уровней двух транскриптов.
Увеличение δΜΝ2 РЬ и уменьшение δΜΝ2 Δ7 мРНК относительно их уровней в тканях животных, обработанных контрольным носителем, определяют на основании данных РСК в реальном времени, используя модифицированный способ ΔΔΟ (как описано в Ыуак апб δсΗт^ΐΐдеη, ΜеΐΗοάδ, 2001, 25:402-8). Эффективность амплификации (Е) вычисляют по наклону кривой амплификации для δΜΝ2 РЬ, δΜΝ2 Δ7 и СЛРЭН индивидуально. Изобилие δΜΝ2 РЬ, δΜΝ2 Δ7 и СЛРЭН затем вычисляют как (1+Е)-С\ где С1 представляет собой пороговое значение для каждого ампликона. Изобилие δΜΝ2 РЬ и δΜΝ2 Δ7 подвергают нормализации к изобилию ΘΑР^Н. Изобилие подвергнутых нормализации δΜΝ2 РЬ и δΜΝ2 Δ7 от обработанных тестируемым соединением образцов затем делят на изобилие подвергнутых нормализации δΜΝ2 РЬ и δΜΝ2 Δ7, соответственно, от обработанных носителем клеток, чтобы определить уровни δΜΝ2 РЬ и δΜΝ2 Δ7 мРНК относительно контроля, обработанного носителем.
Результаты. Как видно на фиг. 6, ткани животных, обработанных соединением 65 (фиг. 6а) и соединением 69 (фиг. 6Ь), содержат существенно больше РЬ мРНК δΜΝ2 и меньше Δ7 мРНК δΜΝ2, чем обработанные носителем, что показывает коррекцию альтернативного сплайсинга δΜΝ2.
Пример 6.
Тест сплайсинга эндогенной мРНК δΜΝ2 с помощью полуколичественной КТ по окончании РСК в тканях животных.
Тест сплайсинга с помощью обратной транскрипции по окончании РСК (КТ-РСК) использовали, чтобы определить количественно уровни полноразмерной и Δ7 мРНК δΜΝ2 в тканях мышей, обработанных тестируемым соединением.
- 82 028344
Материалы
Материал Источник
Ткани от мышей С/С- аллель ЗМА ТНе Ласкзоп ЬаЬогабогу, партия Νο.: 0 08714 (Вб . 12 9 - 5тп1^т5 <3тп1/змк2>мгрь/ц)
Ткани от мышей ΔΕχοη7 ЗМА ТНе Ласкзоп ЬаЬогабогу, партия Νο.: 005025 (РУВ.Сд-Тд(5МЫ2*0е1ба7)4299АНтЪ Тд (3ΜΝ2 ) 89АНтЬ 5τηη1ί[η1Μ3ά/2')
Липидный набор <21адеп КИеазу Огадеп Са6а1од Νο.: 74804
Набор ферментов Р1аб1пит Тад ΗίΡί ΌΝΑ Ро1утегазе Зирег Μίχ Ы£е ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее 1т/1бгодеп) Са6а1од Νο. : 11304-016
гЗсгирб КТ В1оКа0 Са6а1од Νο.: 170-8890
Τνζίη.Ρεο 96-луночные полуокаймленные планшеты для РСК ЕррепНогТ Са6а1од Νο.: 951020389
Этидий бромид 2% агарозные Е гели 48- Ме11 ВоиЫе СошЬ Ы£е ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее 1ггуз.Ъгодеп) Са6а1од Νο. : 08008-02
Се1 ЭоситепбаЫоп Зузбет Система построения изображений ЦУР Ое1 Оос 16 310 1тад1пд зузбет
Протокол. Мышей С/С-аллель 8ΜΆ обрабатывали пероральным скармливанием два раза в сутки в течение 10 дней тестируемых соединений в 0,5% НРМС и 0,1% Тмееп-80. Образцы ткани собирали и быстро замораживали для очистки РНК.
Образцы ткани (20-40 мг) гомогенизировали в лизирующем реагенте ^IАзол в течение 2 мин при 20 Гц в ТхззиеЬузег II, используя один шарик из нержавеющей стали. После добавления хлороформа гомогенат разделяли на водную и органическую фазы центрифугированием. РНК отделялась наверх, водную фазу экстрагировали и добавляли этанол, чтобы обеспечить подходящие условия связывания. Образец затем наносили на колонку КЫеазу из КЫеазу Μίπί Κίΐ, где полное количество РНК связывается с мембраной. РНК элюировали в воде без РНК-азы, затем сохраняли при -20°С.
Продукты сплайсинга 8ΜΝ2 идентифицировали, используя следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 8. Эти праймеры гибридизуются с нуклеотидными последовательностями в экзоне 6 (8ΜΝ Прямой Г), 8ЕО ГО ΝΟ. 13)(от нуклеотица 22 к нуклеотиду 46) и экзоне 8 (8ΜΝ Обратный С, 8ЕО ГО ΝΟ. 12), общими для человеческой мРНК 8ΜΝ2.
Таблица 8
Праймер Последовательность Источник
3ΜΝ Прямой Ό ЗЕО Ιϋ ΝΟ.13: РТС1
АТАТОТССАОАТТСТСТТСАТСАТС
3ΜΝ Обратный С ЗЕО Ιϋ ΝΟ.12: СССТТСАСАТТССАОАТСТОТС РТС1
1 Праймер, разработанный РТС ТкегареиРсз, 1пс.
Чтобы синтезировать кДНК, комбинируют 1 мкл раствора РНК (25-50 нг), 4 мкл 5х реакционной смеси 18спрр 1 мкл обратной транскриптазы и 10 мкл воды и инкубируют при 25°С в течение 5 мин, затем при 42°С в течение 30 мин, затем 85°С в течение 5 мин. Раствор кДНК сохраняют при -20°С.
Для осуществления РСК 5 мкл кДНК, 0,2 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,2 мкл 100 мкМ обратного праймера и 22,5 мкл полимеразной суперсмеси объединяют в 96-луночных полуокаймленных планшетах для РСК. РСК осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 94°С (2 мин), стадия 2: 94°С (30 с), стадия 3: 55°С (30 с), стадия 4: 68°С (1 мин), затем повторяют стадии 2-4 для в общей сложности 33 циклов, затем поддерживают при 4°С.
мкл каждого образца РСК разделяли электрофорезом на 2%-ном агарозном Е-геле в течение 14 мин, окрашивали окрашивающим реагентом для бзДНК (например, этидий бромидом) и визуализировали с использованием геля для формирования изображений.
Результаты. Как видно на фиг. 7, ткани от мышей, обработанных возрастающими концентрациями соединения 65, содержат прогрессивно больше РЬ мРНК 8ΜΝ2 и меньше Δ7 мРНК 8ΜΝ2, что показывает коррекцию альтернативного сплайсинга 8ΜΝ2.
Пример 7.
Тест белка 8шп в культивируемых клетках.
- 83 028344
Тест НТКР (гомогенная флюоресценция с временным разрешением) 8ΜΝ используют, чтобы определить количественно уровень белка 8тп в фибробластах пациента с 8ΜΑ, обработанных тестируемыми соединениями. Результаты теста показаны в табл. 9.
Материалы_____
Материал Источник
Клетки человека ЗМА Тип 1 ОМ03813 (СогхеИ 1пзр1бибе)
Коктейль ингибитора протеазы Воске АррИей Зсгепсе Са£а1од Νο.: 11836145001
Анти-ЗМЫ Й2 В1ие сар СгзЫо Саба1од Νο. : 63ЮС002-3ΜΝ
Αητμ-5ΜΝ криптат Рей сар СФзЫо Са£а1од Νο. : 63ΙΌ0002-3ΜΝ
Буфер восстановления 8ΜΝ СгзЫо Саба1од Νο . : 63ЮС002-ЗМИ-Ви££ег
ϋΜΕΜ Ы£е Тескпо1од1ез, 1пс. (ранее 1пч1бгодеп) Са£а1од№о.: 11960-044
Лизирующий буфер ΚΙΡΑ 20 мМ ТГ13-НС1 рН 7,5, 150 мМ ЫаС1, 1 мМ ΕΌΤΑ, 1% ΝΡ-40, 1% натрий деоксихолат
Буфер для разбавления 20 мМ ТГ13-НС1 рН 7,5, 150 мМ ИаС1
Считыватель планшетов Εηνίθίοη Р1а£е Реайег Регкгп Е1шег Μοάθΐ Νο.: 2103
Протокол. Клетки оттаивают и культивируют в ΏΜΕΜ-10% РВ8 в течение 72 ч. Клетки обрабатывают трипсином, подсчитывают и повторно суспендируют в концентрации 25000 клеток/мл в ΏΜΕΜ10% РВ8. Суспензии клетки высевают в плотности 5000 клеток на лунку в 96-луночный планшет для микротитрования и инкубируют в течение 3-5 ч. Для получения контрольного сигнала три (3) лунки в 96луночном планшете не получают клетки и, таким образом, служат чистыми контрольными лунками. Тестируемые соединения последовательно разбавляют в 3,16 раз в 100% ДМСО, чтобы получить кривую изменения концентрации с 7 точками. 1 мкл раствора тестируемого соединения переносят в содержащие клетки лунки и клетки инкубируют в течение 48 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% С02, 100%-ная относительная влажность). Получают тройные образцы для каждой тестируемой концентрации соединения. Через 48 ч супернатант удаляют из лунки и 25 мкл лизирующего буфера К1РЛ, содержащего ингибиторы протеазы, добавляют к лунке и инкубируют при взбалтывании при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляют 25 мкл разбавителя и затем 35 мкл полученного лизата перекосят на планшет с 384 лунками, где каждая лунка содержит 5 мкл раствора антитела (разбавление 1:100 анти-8ΜN 62 и ан™-8ΜΝ криптат в буфере восстановления 8ΜΝ). Планшет центрифугируют в течение 1 мин, чтобы вызвать растворение основания лунки, затем инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Флюоресценцию для каждой лунки планшета при 665 и 620 нм измеряют на спектрофотометре для считывания Епу18юп ти1ШаЬе1 (Регкт-Е1тег).
Нормализованный сигнал флюоресценции вычисляют для каждого образца, чистого контроля и контрольной лунки с носителем, деля сигнал при 665 нм на сигнал при 620 нм. Нормализация сигнала объясняет возможное затухание флюоресценции вследствие матричного эффекта лизата. Значение ΔΡ (измерение изобилия белка 8тп как значение в процентах) для каждой лунки с образцами вычисляют, вычитая подвергнутую нормализации среднюю флюоресценцию для чистых контрольных лунок из подвергнутой нормализации флюоресценции для каждой лунки с образцами, затем деля эту разницу на подвергнутую нормализации среднюю флюоресценцию для чистых контрольных лунок и умножая полученное значение на 100. Значение ΔΡ для каждой лунки с образцами представляет изобилие белка 8тп в тестируемых образцах, обработанных соединением. Значение ΔΡ для каждой лунки с образцами делят на значение ΔΡ для контрольных лунок с носителем, чтобы вычислить кратность увеличения изобилия белка 8тп относительно контроля с носителем.
Результаты. Как видно на фиг. 8, фибробластная клетка пациента с 8ΜΑ тип 1, обработанная соединением 65 (фиг. 8а) и соединением 69 (фиг. 8Ь), демонстрирует дозозависимое увеличение экспрессии белка 8тп при измерении в тесте НТКР 8ΜΝ.
Для соединений формулы (1а1) или ее формы, раскрытой здесь, в табл. 9 показана ЕСц5х для экс- 84 028344 прессии белка δтη, которая была получена от данных концентрации с 7 пунктами, произведенных для каждого тестируемого соединения согласно процедуре биологического примера 7. Термин ЕС1?5х для экспрессии белка δтη определяют как концентрацию тестируемого соединения, которая является эффективной для продуцирования в 1,5 раза большего количества белка δтη в фибробласте пациента с δΜΑ по сравнению с количеством, продуцированным в контроле с носителем, ДМСО. ЕС1?5Х для экспрессии белка δтη от >3 мкМ до <10 мкМ обозначена одной звездой (*), ЕС1?5х от >1 мкМ до <3 мкМ обозначена двумя звездами (**), ЕС1?5х от >0,3 мкМ до <1 мкМ обозначена тремя звездами (***) и ЕС1?5х <0,3 мкМ обозначена четырьмя звездами (****).
Таблица 9
Для соединений формулы (1а1) или ее формы, раскрытой здесь, в табл. 10 приведена максимальная кратность (Кратность) увеличения белка δтη, которая была получена от данных концентрации с 7 пунктами, произведенных для каждого тестируемого соединения согласно процедуре биологического примера 7. Максимальная кратность увеличения <1,2 обозначена одной звездой (*), кратность увеличения от >1,2 до <1,35 обозначена двумя звездами (**), кратность увеличения от >1,35 до <1,5 обозначена тремя звездами (***), кратность увеличения от >1,5 до <1,65 обозначена четырьмя звездами (****) и кратность увеличения >1,65 обозначена пятью звездами (*****).
- 85 028344
Соед. Кратность
1 * *
2 * *
3 * * * *
4 *
5 *
6 *
7 *
8 *
9 *
10 *
11 *
12 * *
13 *
14 * *
15 *
16 * * *
17 * * *
18 *
19 *
20 *
21 *
22 *
23 *
24 * * *
25 *
26 *
27 *
28 * * *
29 *
30 * * * *
31 * * * *
32 * *
33 *
34 * * *
35 *
36 *
37 *
38 *
39 *
40 *
41 * * *
42 * *
43 * * *
44 * *
45 * * *
46 * * * *
47 *
48 *
49 *
50 * * *
51 *
52 * * ★
53 * *
Таблица 10
Соед. Кратность
54 *
55 * *
56 *****
57 *****
58 *****
59 * *
60 * * *
61 *
62 *****
63 *****
64 *****
65 *****
66 *****
67 * * *
68 * * * *
69 *****
70 * * * *
71 *****
72 *****
73 *****
74 *****
75 *****
76 * * *
77 * * *
78 * * *
79 * * * *
80 * * * *
81 *****
82 *****
83 * * * *
84 *****
85 *****
86 * * *
87 * * * *
88 * * * *
89 * * * *
90 *****
91 * * *
92 *****
93 *****
94 *****
95 *****
96 *****
97 * * *
98 *****
99 *****
100 *****
101 *****
102 * * *
103 * * * *
104 * * *
105 * *
106 *
Соед. Кратность
107 * * *
108 *****
109 * * * * *
110 * * * *
111 * * * * *
112 * * * * *
113 * * * *
114 * * * * *
115 * * * * *
116 * * * *
117 * * * * *
118 * * * *
119 *****
120 * * * * *
121 *****
122 *****
123 *
124 * * * *
125 * * * * *
126 * * * *
127 *****
128 *****
129 * * * * *
130 * * * *
131 *****
132 *****
133 * * * * *
134 * * * * *
135 * * * * *
136 *****
137 * * * * *
138 * * * *
139 X * * * *
140 * * * * *
141 *****
142 * * * * *
143 * * * * *
144 * * * * *
145 * * * * *
146 *****
147 *****
148 * * * *
149 *****
150 * * * * *
151 * * * * *
152 * * * * *
153 *****
154 *****
155 * * * * *
156 *****
157 * * * *
158 *****
159 *****
Пример 8.
Тест подсчета гемов (3тп-зависимый подсчет ядерного спекла).
Уровень белка 3тп непосредственно коррелирует с количеством ядерных фокусов, также известных как гемы, полученных после окрашивания клетки флуоресцентно меченным анти-3тп антителом (Ьш апб ЭгсуГизз, ЕМВО I., 1996, 15:3555). Гемы представляют собой мультибелковые комплексы, формирование которых обусловлено белком 3тп и тест подсчета гемов используется для оценки уровня белка 3тп в клетке. Как описано здесь, тест подсчета гемов используется для количественного определения уровня белка 3тп в фибробластных клетках пациента с 3МА, обработанных тестируемым соединением.
Материалы_______
Материал Источник
Клетки человека ЗМА тип 1 СМ03813 (СогФеФФ 1пзбФбибе)
Первичное антитело мыши анти-ΒΜΝ клон 2В1 ЗФдта СабаФод Νο.: 32944
Вторичное антитело- анти-мышь АФеха РФиог 555 ЬФ£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее 1т/Фбгодеп) СабаФод Νο.: А21422
Бычий сывороточный альбумин (ВЗА) ЗФдта СабаФод Νο.: А3294
4% параформальдегид ЕФесбгоп МФсгозсору ЗсФепсез СабаФод Νο.: 15710
Бортезомиб ЬС ЬаЬз, СабаФод Νο.: В-1408
0,05% ТгФбоп Х-100 ЗФдта СабаФод Νο.: 93443-100 мл
Гистологическая среда- РгоЬопд СоФд АпбФ£айе Ееадепб с ΌΑΡΙ ЬФ£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее 1тлФбгодеп) СабаФод Νοβ.: Р7481 и Р36935
22x22 Νο.: 1 стерильные покровные стекла РФзЬег СабаФод Νο.: 12-548-В
ϋΜΕΜ ЬФ£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее 1т/-Фбгодеп) СабаФод Νο. : 11960-044
РВЗ ЬФ£е ТесЬпоФодФез, 1пс. (ранее Тт/Фбгодеп) СабаФод Νο.: 10010-031
Прозрачный лак для ногтей Εενίοη ЬгапсФ СабаФод Νο. : 1271-76
Флуоресцентный микроскоп геФзз ΑχονβΓ6 135 геФзз
Протокол. Клетки оттаивают и культивируют в ЭМЕМ-10% ГВ3 в течение 72 ч, затем обрабатывают трипсином, подсчитывают и повторно суспендируют в концентрации 100000 клеток/мл в ЭМЕМ-10% ГВ3, 2 мл суспензии клеток высевают в 6-луночный планшет для клеточной культуры со стерильным покровным стеклом и инкубируют в течение 3-5 ч. Тестируемые соединения последовательно разбавляют в 3,16 раз в 100% ДМСО, чтобы получить кривую изменения концентрации с 7 точками. 10 мкл раствора тестируемого соединения переносят в каждую содержащую клетки лунку и инкубируют в течение 48 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% СО2, 100%-ная относительная влажность). Для каждой тестируемой концентрации соединения получают два образца. Клетки, содержащие ДМСО в конечной концентрации 0,5%, используют в качестве контроля.
Среду для культуры клеток отсасывают из лунок, содержащих покровные стекла и мягко промывают три раза холодным РВ3. Клетки фиксируют инкубацией в течение 20 мин при комнатной температуре в параформальдегиде. Клетки затем промывают два раза холодным РВ3, затем осуществляют инкубацию в течение 5 мин при комнатной температуре с 0,05% Тгйоп Х-100 в РВ3 для пермеабилизации клеток. После того как фиксированные клетки были промыты три раза холодным РВ3, их блокируют 10%-ным ГВ3 в течение 1 ч. Добавляют 60 мкл первичного антитела, разбавленного 1:1000 в блокирующем буфере и смесь инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Клетки промывают три раза РВ3 и добавляют 60 мкл вторичного антитела, разбавленного 1:5000 в блокирующем буфере, затем смесь ин- 87 028344 кубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Покровные стекла монтируют на предметные стекла при помощи заливочной среды и дают высохнуть в течение ночи. Лак для ногтей наносят на края покровного стекла и стекла хранят в темноте. Ζе^δδ Ахоуег! 135 с объективом 63х Р1ап-Аросйгота!, NА=1,4 используют для детекции и подсчета иммунофлюоресценции. Подсчитывают число гемов на >150 ядер и % активации вычисляют, используя ДМСО и 10 нМ бортезомиба в качестве контролей. Для каждого тестируемого соединения клетки исследуют при всех длинах волны, чтобы идентифицировать тестируемые соединения с присущей флюоресценцией.
Результаты. Как видно на фиг. 9, клетки пациента с 8МА типа 1, обработанные соединением 65 (фиг. 9а) и соединением 69 (фиг. 9Ь), содержат прогрессивно больше гемов относительно клеток, обработанных ДМСО.
Пример 9 Тестирование белка 8тп в человеческих мотонейронах.
Иммунофлуоресцентную софокусную микроскопию 8тп используют, чтобы количественно определить уровень белка 8тп в человеческих мотонейронах, обработанных тестируемыми соединениями.
Протокол. Человеческие мотонейроны, полученные из клеток 8МА 1Р8 (ЕЬег! е! а1., Манге, 2009, 457:2770; и КиЬт е! а1., ВМС Вю1о§у, 2011, 9:42), обрабаывают тестируемым соединением в различных концентрациях в течение 72 ч. Уровень белка 8тп в ядре клетки определяют количественно, используя иммунное окрашивание 8тп и софокусную флюоресцентную микроскопию, по существу, как описано в МакИоЛоеа е! а1., Манге Сйет1са1 Вю1о§у, 2011, 7:544. Уровень белка 8тп в обработанных соединением образцах подвергают нормализации к уровню в обработанных носителем образцах и выстраивают как функцию концентрации соединения.
Результаты. Как видно на фиг. 10, человеческие мотонейроны, обработанные в течение 72 ч увеличивающимися концентрациями соединения 65 (фиг. 10а) и соединения 69 (фиг. 10Ь), содержат прогрессивно больше белка 8тп в ядре.
Пример 10.
Тестирование белка 8тп в тканях животных.
В этом тесте белка 8тп сравнивают ткани от обработанных тестируемым соединением мышей с тканями от мышей, обработанных носителем, ДМСО, чтобы определить увеличение уровней белка 8тп, продуцируемого от человеческого гена 8М№.
Материалы____
Материал Источник
Ткани мышей С/С-аллель ЗМА Тке Ласкзоп ЬаЬогабогу, партия Νο.: 0 08714 (В6 . ±2 9- 5шп1^т5 (5п,п1/змм2)МгРь/8)
Ткани мышей Δ7 ЗМА Тке Ласкзоп ЬаЬогабогу, партия Νο.: 005025 (РУВ.Сд- Тд(5ΜΝ2*ке1ба7)4299Актк Тд (3ΜΝ2 ) 8 9АктЬ 5тп 1 отмза/δ)
- 88 028344
Коктейль ингибиторов протеазы ЕосНе Αρρίίθά 8с1епсе Са£а1од Νο. : 11836145001
Анти-δΜΝ ά2 В1ие сар СгзЫо СаРа1од Νο. : 63Ιϋΰ002-8ΜΝ
Анти-δΜΝ криптат Ней сар СгзЫо Са£а1од Νο. : 63ЮС002-8МКГ
Буфер восстановления 5ΜΝ С1зЫо Са£а1од Νο. : 63ЮС002-5ΜΝ- Ви££ег
Лизирующий буфер ΕΙΡΑ 20 мМ ТГ13-НС1 рН 7,5, 150 мМ ^С1, 1 мМ ЕБТА, 1% ΝΡ-40, 1% натрий деоксихолат
Буфер для разбавления 20 мМ ТГ13-НС1 рН 7,5, 150 мМ Νβΰΐ
Набор для тести белка ВСА Ргегсе Са£а1од Νο.: 23225
Белый планшет с 384 лунками Ыипс Са£а1од Νο.: 351190
Планшет из полипропилена с V-образным дном Ра1соп Са£а1од Νο.: 165195
Прозрачный планшет из полистирола с 96 лунками Иипс Са£а1од Νο.: 442404
5 мм шарики из нержавеющей стали Очадеп Са£а1од Νο.: 69989
Закупоривающиеся пробирки 2,0 мл Ерреп0ог£ Са£а1од Νο.: 022363352
Полуокаймленный 96- луночный планшет для РСЕ Τνίη.Рее Еррепс1ог£ Са£а1од Νο. : 951020389
Т1ззиеБугег II Огадеп Са£а1од Νο.: 85300
Считыватель планшетов Εηνίβίοη Р1а£е Ееайег Регкгп Е1тег Мойе! Νο.: 2103
Протокол. Образцы ткани в закупоривающихся пробирках взвешивали и добавляли объем буфера КIРΑ, содержащего коктейль ингибиторов протеазы, на основании отношения масса-объем для каждого типа ткани: мозг (50 мг/мл), мышца (50 мг/мл) и спинной мозг (25 мг/мл).
Ткани гомогенизировали, используя ПззиеЬу/ег с размалыванием с помощью шариков. Шарики из нержавеющей стали диаметром 5 мм добавляли к образцу и энергично встряхивали в течение 5 мин при 30 Гц в ПззиеЬу/ег. Образцы затем центрифугировали в течение 20 мин при 14000хд в микроцентрифуге и гомогенаты переносили на планшет для РСК. Г омогенаты разбавляли в буфере КIРΑ приблизительно до 1 мг/мл для НТКГ и приблизительно 0,5 мг/мл для полного измерения белка, используя тест белка ВСА. Для теста НТКГ 8ΜΝ 35 мкл гомогената ткани переносили на планшет с 384 лунками, содержащий 5 мкл раствора антитела (1:100 разведение каждого из анти-8ΜNά2 и анти-8ΜN криптата в буфере для восстановления). Чтобы получить контрольный сигнал, три (3) лунки в планшете содержат только лизирующий буфер К1РЛ и, таким образом, служат чистыми контрольными лунками. Планшет центрифугируют в течение 1 мин, чтобы вызвать растворение основания лунки, затем инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Флюоресценцию для каждой лунки планшета при 665 и 620 нм измеряют на спектрофотометре для считывания Επνίδίοπ ши1И1аЬе1 (Регкт-Е1тег). Полный белок в гомогенате ткани измеряют, используя тест ВСА согласно протоколу изготовителя.
Нормализованный сигнал флюоресценции вычисляют для каждого образца, чистого контроля и контрольной лунки с носителем, деля сигнал при 665 нм на сигнал при 620 нм. Нормализация сигнала объясняет возможное затухание флюоресценции вследствие матричного эффекта гомогената ткани. Значение ΔΓ (измерение изобилия белка 8тп как значение в процентах) для каждой лунки с образцами вычисляют, вычитая подвергнутую нормализации среднюю флюоресценцию для чистых контрольных лунок из подвергнутой нормализации флюоресценции для каждой лунки с образцами, затем деля эту разницу на подвергнутую нормализации среднюю флюоресценцию для чистых контрольных лунок и умножая полученное значение на 100. Значение ΔΓ для каждой лунки с образцами делят на полное количество белка (определенное с использованием теста ВСА) для этого образца ткани. Изменение изобилия белка 8тп для каждого образца ткани относительно контроля с носителем вычисляют как процентное различие в значении ΔΓ образца ткани в присутствии тестируемого соединения и усредненного значения ΔΓ контрольного сигнала с носителем, разделенное на усредненное значение ΔΓ контрольного сигнала с носи- 89 028344 телем.
Пример 11.
Тестирование белка δтη в тканях взрослых мышей С/С-аллеля с δΜΑ.
Ткани для использования в тесте белка δтη на взрослых мышах С/С-аллеля с δΜΑ получали как описано в примере 10. В этом тесте оценивали, увеличивает ли лечение мышей С/С-аллеля с δΜΑ тестируемым соединением в течение 10 дней уровни белка δтη, продуцируемого от гена δΜΝ2.
Материалы___
Материал Источник
Ткани от мышей С/С- ТЬе Ласкзоп ЬаЬогаСогу, партия Νο.:
аллеля с ЗМА 008714 (Вб . 129-5тп11:т5<5тп1''5™2>МгРЬ/А)
Протокол. Мышам С/С-аллеля с δΜΑ вводили два раза в сутки перорально (в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Тхуеео 80) тестируемое соединение или носитель в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней. Подобранным по возрасту гетерозиготным мышам вводили носитель для использования в качестве контроля. Ткани собирали для анализа содержания белка согласно примеру 10.
Результаты. Как видно на фиг. 11, подвергнутый нормализации уровень полного белка δтη был увеличен в тканях головного мозга, спинного мозга, мышц и печени взрослых мышей С/С-аллеля с δΜΑ, обработанных два раза в сутки в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней соединением 65 (фиг. 11 а) и соединением 69 (фиг. 11Ь), относительно группы носителя.
Пример 12.
Белок δтη в тканях новорожденных Δ7 мышей с δΜΑ.
Тест белка δтη в тканях новорожденных мышей с δΜΑ используют, чтобы определить, увеличивает ли лечение тестируемым соединением содержания белка δтη, продуцированного от гена δΜΝ2.
Материалы____
Материал Источник
Ткани от Δ7 мышей с ЗМА ТЬе Ласкзоп ЬаЬогаСогу, партия Νο.: 005025 (Ρλ/Β . Сд-Тд (3ΜΝ2*с1е1Са7) 42 99АЬтЬ> Тд (3ΜΝ2 ) 8 ЭАЬтЬ 5тп1ММза/3)
Протокол. δΜΑ Δ7 гомозиготным мышам с нокаутом вводили один раз в сутки внутрибрюшинно (ΙΓ) тестируемое соединение или носитель (100% ДМСО) с послеродового дня (ΓΝΏ) 3 до ΓΝΌ 9. Ткани собирали для анализа содержания белка согласно примеру 10.
Результаты. Как видно на фиг. 12, подвергнутый нормализации уровень полного белка δтη был дозозависимо увеличен в тканях головного мозга (фиг. 12а), спинного мозга (фиг. 12Ь) и мышц (фиг. 12с) новорожденных δΜΑ Δ7 гомозиготных мышей с нокаутом, которых лечат в течение 7 дней один раз в сутки указанными дозами соединения 65.
Пример 13.
Масса тела новорожденных Δ7 мышей с δΜΑ.
Изменение в массе тела новорожденных мышей с δΜΑ используют, чтобы определить, улучшает ли лечение тестируемым соединением показатели массы тела.
Материалы____
Материал Источник
Ткани от АЭкзон7 мышей с ЗМА ТЬе Ласкзоп ЬаЬогаСогу, партия Νο. : 005025 (Ρλ/Β . Сд-Тд (3ΜΝ2 *<5е17а7) 4299АЬтЬ Тд(3ΜΝ2)89АЬтЬ ЗтпГ1^/3)
Протокол. δΜΑ Δ7 гомозиготным мышам с нокаутом вводили один раз в сутки внутрибрюшинно (ΙΓ) тестируемое соединение или носитель (100% ДМСО) от ΓΝΏ 3 до момента, когда режим зведения переключали на пероральное введение два раза в сутки в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Тхуеео 80 в дозе, в 3,16 раз превышающей дозу, используемую для ΙΓ. Массу тела δΜΑ Δ7 мышей, обрабатываемых тестируемым соединением или носителем и подобранных по соответствующему возрасту гетерозиготных мышей регистрировали каждый день.
Результаты. Как видно на фиг. 13, масса тела новорожденных δΜΑ Δ7 гомозиготных мышей с нокаутом, обработанных соединением 65 (фиг. 13а) и соединением 69 (фиг. 13Ь) ΙΓ один раз в сутки от ΓΝΌ 3 до ΓΝΌ 23, затем перорально два раза в сутки от ΓΝΌ 24 до конца исследования, улучшалась по сравнению с мышами, обработанными носителем.
Пример 14.
Рефлекс выпрямления у новорожденных Δ7 мышей с δΜΑ.
Функциональное изменение в рефлексе выпрямления новорожденных мышей с δΜΑ используют, чтобы определить, улучшает ли лечение тестируемым соединением рефлекс выпрямления.
- 90 028344
Материалы
Материал Источник
Ткани от АЭкзон7 мышей с ЗМА ТНе Ласкзоп ЬаЬогайогу, партия Νο.: 005025 (РУВ.Сд-Тд(3ΜΝ2*0е1йа7)42ЭЭАЬшЬ Тд(3ΜΝ2)8ЭАЬтЬ 5тп1^1М5с1/д)
Протокол. δΜΑ Δ7 гомозиготным мышам с нокаутом вводили один раз в сутки внутрибрюшинно (1Р) тестируемое соединение или носитель (100% ДМСО) от Ι’ΝΙ) 3 до момента, когда режим введения переключали на пероральное введение два раза в сутки в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Т\уееп 80 в дозе, в 3,16 раз превышающей дозу, используемую для 1Р. Время рефлекса выпрямления измеряют как время, затраченное мышью, чтобы перевернуться на ноги из положения лежа на спине. Рефлекс выпрямления измеряли пять раз для каждой мыши (давая максимальное время 30 с для каждой попытки) с перерывом в 5 мин между каждым измерением. Время рефлекса выпрямления для δΜΑ Δ7 гомозиготных мышей с нокаутом, обрабатываемых тестируемым соединением или носителем и подобранных по соответствующему возрасту гетерозиготных мышей измеряли в Ι’ΝΙ) 10, 14 и 18 и выстраивали на графике.
Результаты. Как видно на фиг 14, рефлекс выпрямления новорожденных δΜΑ Δ7 гомозиготных мышей с нокаутом, обработанных соединением 65 (фиг. 15а) и соединением 69 (фиг. 15Ь) 1Р один раз в сутки от РНО 3, улучшался по сравнению с мышами, обработанными носителем. Время, затраченное на переворачивание, новорожденных δΜΑ Δ7 гомозиготных мышей с нокаутом было подобно таковому для подобранных по возрасту гетерозиготных мышей в Ι’ΝΙ) 18.
Пример 15.
Выживание новорожденных Δ7 мышей с δΜΑ.
Изменение в числе выживших мышей в течение времени используют, чтобы определить, улучшает ли лечение тестируемым соединением выживание.
Материалы___
Материал Источник
Ткани от Δ7 мышей с ЗМА ТНе Ласкзоп ЬаЬогаРогу, партия Νο.: 005025 (РУВ . Сд-Тд (3ΜΝ2 *с1е1йа7) 42 99АНтЪ Тд (3ΜΝ2) 8 9АНтЬ Зтп1ШМза/Л)
Протокол. δΜΑ Δ7 гомозиготным мышам с нокаутом вводили один раз в сутки внутрибрюшинно (1Р) тестируемое соединение или носитель (100% ДМСО) от Ι’ΝΙ) 3 до момента, когда режим введения переключали на пероральное введение два раза в сутки в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Т\уееп 80 в дозе, в 3,16 раз превышающей дозу, используемую для 1Р и затем переключали на пероральное введение один раз в сутки в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Т\сееп 80 в дозе, в 6,32 раз превышающей дозу, используемую для 1Р. Число выживших мышей в каждой группе регистрировали каждый день и выстраивали как процент от общего числа мышей. Ткани δΜΑ Δ7 и подобранных по возрасту гетерозиготных мышей собирали для измерения содержания белка δтп и обрабатывали, как детально описано в примере 10. Подвергнутые нормализации содержания полного белка δтп, измеренные в тканях, выстраивали как процент содержания в тканях у подобранных по возрасту гетерозиготных мышей, причем уровень δтп у гетерозиготных мышей принимали равным 100%. Уровень белка δтп в ткани мышей, обработанных тестируемым соединением, относительно уровня в ткани гетерозиготных мышей обозначен как значение в процентах над каждой риской на графике.
Результаты. Как видно на фиг. 15, выживание новорожденных δΜΑ Δ7 гомозиготных мышей с нокаутом, обработанных соединением 65 (фиг. 15а) и соединением 69 (фиг. 15Ь) 1Р один раз в сутки от РНО 3 до Ι’ΝΙ) 23, затем перорально два раза в сутки от РНО 24 до конца исследования, улучшалось по сравнению с мышами, обработанными носителем. Как видно на фиг. 16, содержание белка δтп в тканях головного мозга и мышц δΜΑ Δ7 гомозиготных мышей с нокаутом после лечения соединением 65 (фиг. 16а) до РНЭ 144 и соединением 69 (фиг. 16Ь) от ΗΝΟ 3 до РНЭ 80 и 83, было измерено и выстроено относительно обработанных носителем и подобранных по возрасту гетерозиготных мышей.
Пример 16.
Тест сплайсинга человеческой мРНК минигена δΜΝ1 с помощью полуколичественной КТ по окончании РСК в культивируемых клетках.
Тест КТ-РСК используют, чтобы визуализировать и количественно определить уровни человеческой полноразмерной и Δ7 мРНК минигена δΜΝ1 в первичных клетках и линиях клеток, экспрессирующих конструкцию минигена δΜΝ1 человека, обработанных тестируемым соединением.
- 91 028344
Материалы
Материал Источник
Клетки НЕК293Н АТСС Са£а1од Νο.: СКЬ-1573
Се11з-То-С£ Ы£е ТесЬпоТодгез, 1пс. (ранее Αρρίίβά
лизирующий буфер Вгозузбетз) Са£а1од Νο.: 4399002
Ρν«3ΕΝΕ-6 липидный трансфицирующий реагент КосЬе Αρρίίεά Зсгепсе, Са£а1од Νο. : 11 814 443 001
БМЕМ Ы£е ТесЬпо1од1ез, 1пс. 1ггУ1бгодеп) Са£а1од Νο. : 11960-044 (ранее
96-луночные
плоскодонные ВесСоп Бгскгпзоп Са£а1од Νο.: 353072
планшеты
Р1аб1пит Тад ΗίΡί Супермикс ДНК- полимеразы Ы£е ТесЬпободгез, 1пс. 1ггУ1бгодеп) Са£а1од Νο. : 11304-016 (ранее
Набор ферментов бЗсггрб КТ ВгоКаЬ Са£а1од Νο.: 170-8890
Этидий бромид 2% агарозные Е гели 48-Ие11 БоиЫе СотЬ Ы£е ТесЬпо1од1ез, 1пс. 1т/-1бгодеп) Саба1од Νο.: <38008-02 (ранее
Се1 БоситепбаЫоп Зузбет υνρ Ое1 Бос 1£ 310 1тадэ.пд зузбет
Конструкция минигена ЗММ.
Получение конструкций минигена.
Используя процедуру для получения конструкции минигена ЗМ№, описанную в биологическом примере 1, версию ЗМ№ минигена получали, заменяя шестой нуклеотид экзона 7 (остаток тимина) конструкции минигена ЗМШ-А на цитозин с использованием сайт-направленного мутагенеза. Таким образом, подобно конструкции минигена ЗМ№-А, конструкция минигена ЗМШ имеет единственный остаток аденина, вставленный после нуклеинового остатка 48 экзона 7. Конструкция минигена ЗМШ упоминается как ЗМШ-А.
Протокол. Клетки НЕК293Н (10000 клеток/лунка/199 мкл) трансфицировали, используя реактив ЕиОЕ№>6, в планшете с 96 лунками с 15 нг минигенной плазмиды репортера ЗММ-А на лунку. Клетки инкубировали в течение 24 ч после трансфекции. Тестируемые соединения последовательно разбавляли в 3,16 раз в 100% ДМСО, чтобы получить кривую изменения концентрации с 7 точками. Раствор тестируемого соединения (1 мкл, 200х в ДМСО) добавляли к каждой тестовой лунке. 1 мкл ДМСО добавляли к каждой контрольной лунке. Планшет инкубировали в течение 7 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% С02, 100%-ная относительная влажность). Клетки затем лизировали в лизирующем буфере Се11з-То-С1 и лизаты сохраняли при -80°С.
Два продукта сплайсинга мРНК ЗΜN получают от минигена ЗМШ. Термин миниген ЗМ№ ЕЬ относится к первому продукту сплайсинга, содержащему экзон 7, соответствующему полноразмерной мРНК ЗМ№. Термин миниген ЗМШ Δ7 относится ко второму продукту без экзона 7.
ЕЬ и Δ7 мРНК минигена ЗΜN амплифицировали, используя праймеры, представленные в табл. 11. Праймер ЗΜN Прямой С (ЗЕ^ ΙΌ N0. 11) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 6 (от нуклеотида 43 к нуклеотиду 63), праймер ЗΜN Обратный А (ЗЕ^ ΙΌ N0. 2) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в последовательности, кодирующей люциферазу светлячка. Комбинация этих двух олигонуклеотидов обнаруживает только минигены ЗМ№ или ЗМШ (КТ-РСК) и не будет обнаруживать эндогенные гены ЗМШ или 8МШ. Так как клетки пациента с ЗМА, используемые в примере 16, были трансфицированы только человеческим минигеном ЗМШ, КТ-РСК может визуализировать и количественно определять только полноразмерную мРНК минигена ЗМ№ и Δ7 мРНК минигена 8МШ.
Таблица 11
Праймер Последовательность Источник
3ΜΝ Прямой С ЗЕф Ιϋ ΝΟ.11: <ЗАТ<ЗСТ<ЗАТ<ЗСТТТ<3<ЗСААСТ РТС1
3ΜΝ Обратный А ЗЕф Ιϋ ΝΟ.2: СОСТТСАСАТТССАСАТСТСТС РТС1
- 92 028344 1 Праймер, разработанный РТС Тйегареийсз, 1пс.
Чтобы синтезировать кДНК, 5 мкл лизата, 4 мкл 5х реакционной смеси ΐδ^ΐρΐ, 1 мкл обратной транскриптазы и 10 мкл воды объединяли и инкубировали 5 мин при 25°С, затем 30 мин при 42°С, затем 5 мин при 85°С. Раствор кДНК сохраняли при -20°С.
Чтобы осуществить РСК, 5 мкл кДНК, 0,2 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,2 мкл 100 мкМ обратного праймера и 22,5 мкл полимеразного супермикса объединяют в 96-луночном полуокаймленном планшете для РСК. РСК осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 94°С (2 мин), стадия 2: 94°С (30 с), стадия 3: 55°С (30 с), стадия 4: 68°С (1 мин), затем повторяют стадии 2-4 для в общей сложности 33 циклов, затем поддерживают при 4°С.
мкл каждого образца РСК разделяют электрофорезом на 2%-ном агарозном Е-геле в течение 14 мин, окрашивали окрашивающим реагентом для бзДНК (например, этидий бромидом) и визуализировали с использованием геля для формирования изображений.
Результаты. Как видно на фиг. 17, клетки, обработанные возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 17 а) и соединения 69 (фиг. 17Ь), содержат прогрессивно больше мРНК РЬ минигена δΜΝ1 и меньше Δ7 мРНК минигена δΜΝ1, указывая на коррекцию альтернативного сплайсинга δΜΝ1.
Безотносительно того, был ли документ, процитированный здесь, специфично и индивидуально указан как включенный путем ссылки, все документы, упомянутые здесь, включены путем ссылки в настоящую заявку для любой и всех целей в той же степени, как если бы каждая индивидуальная ссылка была полностью сформулирована здесь.
Хотя некоторые варианты осуществления были описаны подробно выше, специалисту будет понятно, что многие модификации возможны в вариантах осуществления без отхода от раскрытия изобретения. Все такие модификации входят в рамки представленной формулы изобретения.

Claims (9)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение формулы (1а1) или его свободная кислота, свободное основание или фармацевтически приемлемая соль, в которой
    К1 обозначает гетероциклил, выбранный из азетидинила, пирролинила, пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазолинила, изотиазолидинила, оксазолинила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила, триазолидинила, оксадиазолинила, оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразолинила, тетразолидинила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6-тетрагидропиридинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила, гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол(1Н)ила, (3аδ,6аδ)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол(1Н)ила, гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ила, (3аδ,6аδ)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ила, гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6аδ)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1Н)ила, октагидро-5Н-пирроло[3,2-с]пиридинила, октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинила, (4аК,7аК)октагидро6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинила, (4аδ,7аδ)октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинила, гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (7К,8аδ)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аδ)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аК)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аδ)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аК)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(2Н)-она, октагидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинила, 3-азабицикло[3.1.0]гексила, (1К^)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло[3.2.1]октила, (1К^)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, (1К^)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, 9-азабицикло [3.3.1]нонила, (1К^)-9-азабицикло[3.3.1]нонила, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептила, (1 δ,4δ)-2,5диазабицикло[2.2.1]гептила, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октила, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, (1 К, 5δ)-3,8диазабицикло [3.2.1] октила, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6диазаспиро[3.3]гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7диазаспиро[4.4]нонила или 6,9-диазаспиро[4.5]децила;
    причем гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями К3 и одним дополнительным возможным заместителем К4; и причем, альтернативно, каждый гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя тремя или четырьмя заместителями К3;
    К2 фенил или гетероарил;
    - 93 028344 причем каждый фенил и гетероарил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями К6 и одним возможным дополнительным заместителем К7;
    Ка обозначает водород;
    КЪ обозначает водород;
    К3, в каждом случае, независимо выбран из циано, галогена, гидрокси, оксо, С1-8алкила, галоген-С18алкила, С1-8алкилкарбонила, С1-8алкокси, галоген-С1-8алкокси, С1-8алкокси-С1-8алкила, С18алкоксикарбонила, амино, С1-8алкиламино, (С1-8алкил)2-амино, амино-С1-8алкила, С1-8алкиламино-С18алкила, (С1-8алкил)2-амино-С1-8алкила, амино-С1-8алкиламино, С1-8алкиламино-С1-8алкиламино, (С18алкиламино-С1-8алкил)2-амино, (С1-8алкил)2-амино-С1-8алкиламино, [(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил]2амино, (С1-8алкиламино-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино, [(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил](С1-8алкил)амино, СУ 8алкокси-С1-8алкиламино, (С1-8алкокси-С1-8алкил)2-амино, (С1-8алкокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино, СЦ 8алкилкарбониламино, С1-8алкоксикарбониламино, гидрокси-С1-8алкила, гидрокси-С1-8алкокси-С18алкила, гидрокси-С1-8алкиламино, (гидрокси-С1-8алкил)2-амино или (гидрокси-С1-8алкил)(С1-
    8алкил)амино;
    К4 обозначает С3-14циклоалкил, С3-14циклоалкил-С1-8алкил, С3-14циклоалкиламино, фенил-С1-8алкил, фенил-С1-8алкоксикарбонил, фенилсульфонилокси-С1-8алкил, гетероциклил или гетероциклил-С1-8алкил; причем каждый случай С3-14циклоалкила, фенила и гетероциклила в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями К5;
    К5, в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, С1-8алкила, галогенС1-8алкила, С1-8алкокси, галоген-С1-8алкокси, амино, С1-8алкиламино, (С1-8алкил)2-амино или С1-8алкилтио;
    К6, в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, С1-8алкила, С28алкенила, галоген-С1-8алкила, гидрокси-С1-8алкила, С1-8алкокси, галоген-С1-8алкокси, С1-8алкокси-С18алкила, амино, С1-8алкиламино, (С1-8алкил)2-амино или С1-8алкил-тио; и
    К7 обозначает С3-14циклоалкил, С3-14циклоалкилокси, фенил, гетероциклил или гетероарил, причем гетероциклил, отличный от К1, в каждом случае выбран из оксиранила, оксетанила, азетидинила, тетрагидрофуранила, пирролинила, пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазолинила, изотиазолидинила, оксазолинила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила, триазолидинила, оксадиазолинила, оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразолинила, тетразолидинила, пиранила, дигидро-2Н-пиранила, тиопиранила, 1,3-диоксанила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6тетрагидропиридинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила,
    1.3- бензодиоксолила бензо [к][1,3]диоксолила, 1,4-бензодиоксанила, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксинила
  2. 2.3- дигидробензо [Ъ][ 1,4] диоксинила, гексагидропирроло [3,4-Ъ]пиррол-( 1Н)ила, (3аδ,6аδ)гексагидропирроло [3,4-Ъ]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло [3,4-Ъ]пиррол-( 1Н)ила, гексагидропирроло[3,4-Ъ]пиррол-(2Н)ила, (3аδ,6аδ)гексагидропирроло[3,4-Ъ]пиррол-(2Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло[3,4-Ъ]пиррол-(2Н)ила, гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1Н)ила, (3аΚ,6аδ)гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-(1Н)ила, (3аК,6аК)гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-(1Н)ила, октагидро-5Н-пирроло[3,2-с]пиридинила, октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ъ]пиридинила, (4аК,7аК)октагидро6Н-пирроло[3,4-Ъ]пиридинила, (4аδ,7аδ)октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ъ]пиридинила, гексагидропирроло [1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (7Κ,8аδ)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аδ)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аК)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аδ)октагидропирроло [1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8аК)октагидропирроло [1,2-а]пиразин-(1Н)ила, гексагидропирроло [1,2-а]пиразин-(2Н)-она, октагидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинила, 3-азабицикло[3.1.0]гексила, (1К^)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло[3.2.1]октила, [1К^)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, (1К^)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, 9-азабицикло[3.3.1]нонила, (1К^)-9-азабицикло[3.3.1]нонила, 2,5-диазабицикло [2.2.1] гептила, (1δ,4δ)-2,5диазабицикло [2.2.1] гептила, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октила, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, [1К^)-3,8диазабицикло [3.2.1] октила, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6диазаспиро[3.3]гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7диазаспиро[4.4]нонила, 6,9-диазаспиро[4.5]децила;
    причем гетероарил в каждом случае выбран из фуранила, тиенила, пирролила, 2Н-пирролила, 3Нпирролила, пиразолила, 1Н-пиразолила, имидазолила, 1Н-имидазолила, изоксазолила, изотиазолила, оксазолила, 1,3-тиазолила, оксадиазолила, 1,2,4-оксадиазолила, 1,3,4-оксадиазолила, тиадиазолила, 1Нтетразолила, 2Н-тетразолила, пиридинила, пиримидинила, пиразинила, пиридазинила, триазинила, индолила, 1Н-индолила, индазолила, 1Н-индазолила, 2Н-индазолила, индолизинила, изоиндолила, бензофуранила, бензотиенила, бензотиофенила, бензоимидазолила, 1Н-бензоимидазолила, 1,3-бензоксазолила,
    1.3- бензооксазолила, 9Н-пуринила, хинолинила, изохинолинила, хиназолинила, хиноксалинила, 1,3диазинила, 1,2-диазинила, 1,2-диазолила, 1,4-диазанафталинила, акридинила, фуро[3,2-Ъ]пиридинила, фуро[3,2-с]пиридинила, фуро[2,3-с]пиридинила, 6Н-тиено[2,3-Ъ]пирролила, тиено[3,2-с]пиридинила, тиено[2,3-к]пиримидинила, 1Н-пирроло[2,3-Ъ]пиридинила, 1Н-пирроло[2,3-с]пиридинила, 1Нпирроло[3,2-Ъ]пиридинила, пирроло[1,2-а]пиразинила, пирроло[1,2-Ъ]пиридазинила, пиразоло[1,5- 94 028344
    a] пиридинила. пиразоло[1.5-а]пиразинила. 3Н-имидазо[4.5-Ь]пиридинила. имидазо[1.2-а]пиримидинила. имидазо[1.2-с]пиримидинила. имидазо[1.2-Ь]пиридазинила. имидазо[1.2-а]пиразинила. имидазо[2.1b] [1.3]тиазолила. имидазо[2.1-Ь][1.3.4]тиадиазолила.[1.2.4]триазоло[1.5-а]пиридинила или[1.2.4]триазоло[4.3-а]пиридинила.
    2. Соединение по п.1. причем фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид. гидрохлорид. дигидрохлорид. гидробромид. ацетат или трифторацетат.
  3. 3. Соединение. выбранное из следующих соединений:
    7-(пиперазин-1 -ил)-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    7-(пиперазин-1-ил)-3-(тиофен-3 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(3.4-диметоксифенил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-[(3К.58)-3.5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2.2-дифтор-1.3-бензодиоксол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(2.2-дифтор-1.3-бензодиоксол-5-ил)-7-(4-метил-1.4-диазепан-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(1.3 -бензотиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1.3-бензотиазол-2-ил)-7-[(3К.58)-3.5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
    3-(1.3 -бензотиазол-2-ил)-7-(1.4-диазепан-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(1.3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-метил-1.4-диазепан-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1.3-бензодиоксол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(2.3-дигидро-1.4-бензодиоксин-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(3.5 -дифторфенил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1.3-бензодиоксол-5-ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(3.4-диметоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(3.4-диметоксифенил)-7-[(3К.58)-3.5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
    3-(3 -метоксифенил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(3 -метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3К.58)-3.5-диметилпиперазин-1 -ил]-3-(3-метоксифенил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-(1.4-диазепан-1-ил)-3-(3-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(2-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3К.58)-3.5-диметилпиперазин-1 -ил]-3-(2-метоксифенил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(4-метоксифенил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(4-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(имидазо [1.2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(имидазо [1.2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(имидазо [2.1 -Ь][1.3]тиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-[(3К.58)-3.5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(4-метоксифенил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(3.4-диметоксифенил)-7-[(38)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1 -он; 3-(4-метоксифенил)-7-[(3 8)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(2-метоксифенил)-7-[(3 8)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(имидазо [2.1 -Ь][1.3]тиазол-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-3 -(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(2.3-дигидро-1.4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(3 8)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(1.3 -бензотиазол-2-ил)-7-[(38)-3 -метилпиперазин-1 -ил] -1 Н-изохромен-1-он; 3-(2.3-дигидро-1.4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(3К)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2.3-дигидро-1.4-бензодиоксин-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2.3-дигидро-1.4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(3К.58)-3.5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1.3 -бензодиоксол-5-ил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(3.4-дигидроксифенил)-7-[(38)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он; 3-(4-этоксифенил)-7-[(3 8)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(3 -фтор-4-метоксифенил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
    3-(3 -гидроксифенил)-7 -[(38)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-фтор-4-метоксифенил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(3-хлор-4-метоксифенил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(4-фтор-3 -метоксифенил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(5-фтор-2-метоксифенил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(3.5 -дифтор-4-метоксифенил)-7 -[(38)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2.4-диметоксифенил)-7-[(38)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(4-этоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(2-метил-1-бензофуран-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-[3 -(дифторметокси)фенил] -7-[(38)-3-метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он;
    3- [4-(дифторметокси)фенил] -7-[(38)-3-метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он;
    3-(имидазо [2.1 -Ь][1.3]тиазол-6-ил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
    - 95 028344
    3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3 δ)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он; 7-[(3Κ,5δ)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3 δ)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3δ)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3Κ,5δ)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3δ)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 он;
    3-(3,4-диметоксифенил)-7-[(3δ)-3,4-диметилпиперазин-1 -ил] - 1Н-изохромен-1-он; 7-[(8аЕ)гексагидропирроло [1,2-а]пиразин-2(1Н)ил]-3 -(6-метилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(8аδ)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(8аΚ)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2^^^0^^2-^)-7-^3^-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3Κ)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1он;
    3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(1,3 -диметилпирроло [1,2-а] пиразин-7-ил)-7-(4-этилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-диметилпирроло [1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1он;
    3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8аδ)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8аΡ)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-пропилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-(4-трет-бутилпиперазин-1-ил)-3 -(6,8-диметилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-(4-циклопропилпиперазин-1 -ил)-3 -(6,8-диметилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-метоксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-метилпропил)пиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1 он;
    7-(4-циклобутилпиперазин-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1 -метил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-этил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1 -(пропан-2-ил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]1Н-изохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(2-метоксиэтил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]1 Н-изохромен-1-он;
    7-(1-циклопропил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Низохромен-1-он;
    7-(1-циклобутил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-пропил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(оксетан-3 -ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1 -(оксетан-3 -ил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]- 96 028344
    1 Н-изохромен-1-он;
    3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1он;
    3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-[4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3δ)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К)-3 -метилпиперазин-1 -ил] - 1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К,5δ)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К)-3,4-диметилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен1-он;
    3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3δ)-3,4-диметилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен1-он;
    3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1 -метилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1 -этилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1 -пропилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1 -(пропан-2-ил)пиперидин-4-ил]-1Н-изохромен-1 -он; 7-(1 -циклобутилпиперидин-4-ил)-3-(6,8-диметилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1 -(оксетан-3 -ил)пиперидин-4-ил]-1Н-изохромен-1 он;
    7-[(33)-4-этил-3 -метилпиперазин-1 -ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-[(3δ)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-[4-(диметиламино)пиперидин-1-ил]-3 -(6,8-диметилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 он;
    3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К)-3-метилпиперазин-1-ил]- 1Н-изохромен-1-он; 7-[(3К)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3К)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3 -(6-метилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6-метилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3К,5δ)-4-этил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Низохромен-1-он;
    7-[(3К,5δ)-4-(2-гидроксиэтил)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)1Н-изохромен-1 -он;
    3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К,5δ)-3,4,5-триметилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1он;
    7-[(3К,5δ)-4-циклобутил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Низохромен-1-он;
    7-[(3К)-4-(2-гидроксиэтил)-3 -метилпиперазин-1-ил]-3 -(6-метилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3 δ)-4-(2-гидроксиэтил)-3-метилпиперазин-1 -ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3δ)-4-этил-3-метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен1-он;
    7-[(3δ)-4-циклобутил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3δ)-3 -метил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3δ)-3 -метил-4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3δ)-3 -метил-4-(оксетан-3 -ил)пиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К)-4-этил-3-метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен1-он;
    - 97 028344
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К)-3 -метил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К)-4-(2-гидроксиэтил)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    7-[(3К)-4-циклобутил-3 -метилпиперазин-1 -ил]-3 -(6,8-диметилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К)-3 -метил-4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К)-4-(2-метоксиэтил)-3-метилпиперазин-1 -ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3 8)-4-(2-метоксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К,58)-4-этил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К,58)-3,5-диметил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К,58)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он;
    3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
    3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К)-3 -метилпиперазин-1 -ил] - 1Н-изохромен-1-он;
    7-[(3К,58)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Низохромен-1-он;
    7-[(38)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3 -(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен1-он;
    3-(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он;
    3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К,58)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Низохромен-1-он или
    3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1 он;
    или его фармацевтически приемлемая соль.
  4. 4. Фармацевтическая композиция для применения в лечении спинальной мышечной атрофии, включающая эффективное количество соединения по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
  5. 5. Способ усиления включения экзона 7 8М№ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8М№, включающий контактирование клетки человека с соединением по п.1.
  6. 6. Способ увеличения количества белка 8ши, включающий контактирование клетки человека с соединением по п.1.
  7. 7. Способ по п.5 или 6, в котором клетка человека представляет собой клетку человека от пациента, страдающего спинальной мышечной атрофией.
  8. 8. Способ лечения спинальной мышечной атрофии у пациента-человека, включающий введение пациенту эффективного количества соединения по п.1.
  9. 9. Способ лечения спинальной мышечной атрофии у пациента-человека, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по п.4.
EA201491412A 2012-01-26 2013-01-25 Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии EA028344B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261591102P 2012-01-26 2012-01-26
PCT/US2013/023067 WO2013112788A1 (en) 2012-01-26 2013-01-25 Compounds for treating spinal muscular atrophy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491412A1 EA201491412A1 (ru) 2014-12-30
EA028344B1 true EA028344B1 (ru) 2017-11-30

Family

ID=48873933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491412A EA028344B1 (ru) 2012-01-26 2013-01-25 Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9399649B2 (ru)
EP (1) EP2809322B9 (ru)
JP (2) JP6193888B2 (ru)
KR (1) KR102064624B1 (ru)
CN (1) CN104203239B (ru)
BR (1) BR112014018027B1 (ru)
CA (1) CA2862084C (ru)
EA (1) EA028344B1 (ru)
ES (1) ES2733644T3 (ru)
HK (1) HK1202069A1 (ru)
MX (1) MX357834B (ru)
PL (1) PL2809322T3 (ru)
WO (1) WO2013112788A1 (ru)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013101974A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating spinal muscular atrophy
PL2809322T3 (pl) * 2012-01-26 2019-11-29 Ptc Therapeutics Inc Związki do leczenia zaniku mięśni pochodzenia rdzeniowego
WO2013119916A2 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating spinal muscular atrophy
MX352962B (es) 2012-03-01 2017-12-15 Ptc Therapeutics Inc Compuestos para tratar atrofia muscular espinal.
EP2828247B1 (en) 2012-03-23 2019-01-16 PTC Therapeutics, Inc. 4h-chromen-4-one derivatives for treating spinal muscular atrophy
BR112015015075A2 (pt) * 2012-12-24 2019-01-15 Univ Ramot agentes para tratar doenças genéticas resultantes de mutações sem sentido e métodos para identificar as mesmas.
CN105392790B (zh) 2013-08-19 2019-04-19 豪夫迈·罗氏有限公司 4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮化合物制备用于预防或治疗癌症的药物的用途
WO2015095446A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for modulating the amount of rna transcripts
WO2015105657A1 (en) 2013-12-19 2015-07-16 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for modulating the amount of rna transcripts
US10882868B2 (en) 2014-05-15 2021-01-05 Hoffmann-La Roche Inc. Compounds for treating spinal muscular atrophy
EP4249472A3 (en) 2015-05-30 2023-12-13 PTC Therapeutics, Inc. Methods for modulating rna splicing
WO2017080967A1 (en) * 2015-11-12 2017-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions for treating spinal muscular atrophy
WO2017087486A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions for treating disorders and diseases using survival motor neuron (smn) protein
ES2879995T3 (es) 2015-12-10 2021-11-23 Ptc Therapeutics Inc Métodos para el tratamiento de la enfermedad de Huntington
CN108137579B (zh) 2015-12-10 2022-01-07 豪夫迈·罗氏有限公司 桥连哌啶衍生物
JP6738044B2 (ja) * 2016-07-22 2020-08-12 Jnc株式会社 ベンゾピラン骨格を有する液晶性化合物、液晶組成物、および液晶表示素子
CN110352007A (zh) 2016-11-28 2019-10-18 Ptc医疗公司 用于调节rna剪接的方法
WO2018226622A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating huntington's disease
BR112019026508A2 (pt) 2017-06-14 2020-07-14 Ptc Therapeutics, Inc. métodos para modificar o splicing do rna
EP3644996B1 (en) 2017-06-28 2023-07-26 PTC Therapeutics, Inc. Methods for treating huntington's disease
CA3067592A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating huntington's disease
WO2019028440A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Skyhawk Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING SPLICING
JP7399870B2 (ja) 2018-03-27 2023-12-18 ピーティーシー セラピューティクス， インコーポレイテッド ハンチントン病を処置するための化合物
WO2020005873A1 (en) 2018-06-27 2020-01-02 Ptc Therapeutics, Inc. Heterocyclic and heteroaryl compounds for treating huntington's disease
CR20210050A (es) * 2018-06-27 2021-06-10 Reborna Biosciences Inc Agente profiláctico o terapéutico para atrofia muscular espinal
US11685746B2 (en) 2018-06-27 2023-06-27 Ptc Therapeutics, Inc. Heteroaryl compounds for treating Huntington's disease
JP2022521467A (ja) 2019-02-05 2022-04-08 スカイホーク・セラピューティクス・インコーポレーテッド スプライシングを調節するための方法および組成物
JP2022519323A (ja) 2019-02-06 2022-03-22 スカイホーク・セラピューティクス・インコーポレーテッド スプライシングを調節するための方法および組成物
US11129829B2 (en) 2019-06-17 2021-09-28 Skyhawk Therapeutics, Inc. Methods for modulating splicing

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5089633A (en) * 1987-04-28 1992-02-18 Georgia Tech Research Corporation Substituted isocoumarins
WO2003104216A1 (en) * 2002-06-10 2003-12-18 Acadia Pharmaceuticals Inc. Urotensin ii receptor modulators

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5854142B2 (ja) * 1975-04-16 1983-12-02 株式会社興人 イソカルボスチリル誘導体の製造方法
US6180625B1 (en) 1998-03-24 2001-01-30 Novo Nordisk A/S Heterocyclic compounds regulating clotting
WO2003005025A1 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 Biovitrum Ab Methods for identifying compounds modulating the activity of ppar-gamma
GB0205281D0 (en) 2002-03-06 2002-04-17 Novartis Ag Organic compounds
AR040350A1 (es) 2002-06-28 2005-03-30 Vertex Pharma Inhibidores de caspasa y usos de los mismos
JP2004168707A (ja) * 2002-11-20 2004-06-17 Bayer Cropscience Ag イソチアゾリルベンゾオキサジン誘導体および病害防除剤
US9068234B2 (en) 2003-01-21 2015-06-30 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression
DE602004022819D1 (de) * 2003-06-06 2009-10-08 Vertex Pharma Von atp-bindende kassette transportern
US7399767B2 (en) 2005-01-21 2008-07-15 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Heterocyclic benzo[c]chromene derivatives useful as modulators of the estrogen receptors
KR100781704B1 (ko) * 2005-04-20 2007-12-03 에스케이케미칼주식회사 피리딘 유도체와 이의 제조방법, 및 이를 포함하는약제조성물
AR059339A1 (es) 2006-02-09 2008-03-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Derivados de la cumarina para trastornos proliferativos de celulas, composicion farmaceutica y agente terapeutico que los contiene
US8337941B2 (en) 2006-07-27 2012-12-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fluorescent substrates for monoamine transporters as optical false neurotransmitters
KR20080091949A (ko) 2007-04-10 2008-10-15 에스케이케미칼주식회사 락톤형 피리딘 화합물을 포함하는 허혈성 질환의 예방 및치료용 약학조성물
JP5276878B2 (ja) * 2007-09-27 2013-08-28 富士フイルム株式会社 ベンゾオキサジノン系化合物の製造方法
US8633019B2 (en) 2008-05-27 2014-01-21 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating spinal muscular atrophy
WO2010019236A1 (en) 2008-08-13 2010-02-18 Ptc Therapeutics, Inc Methods for treating spinal muscular atrophy
WO2013101974A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating spinal muscular atrophy
PL2809322T3 (pl) * 2012-01-26 2019-11-29 Ptc Therapeutics Inc Związki do leczenia zaniku mięśni pochodzenia rdzeniowego
WO2013119916A2 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating spinal muscular atrophy
MX352962B (es) 2012-03-01 2017-12-15 Ptc Therapeutics Inc Compuestos para tratar atrofia muscular espinal.
EP2828247B1 (en) 2012-03-23 2019-01-16 PTC Therapeutics, Inc. 4h-chromen-4-one derivatives for treating spinal muscular atrophy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5089633A (en) * 1987-04-28 1992-02-18 Georgia Tech Research Corporation Substituted isocoumarins
WO2003104216A1 (en) * 2002-06-10 2003-12-18 Acadia Pharmaceuticals Inc. Urotensin ii receptor modulators

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAULTON A. et al. ChEMBL: A Large-Scale Bioactivity Database For Drug Discovery. Nucleic Acids Research, 23 September 2011, Vol. 40, DOI: 10.1093/nar/gkr777 *
HEYNEKAMP J.J. et al. Uncharged Isocoumarin-Based Inhibitors Of Urokinase-Type Plasminogen Activator. BMC Chemical Biology, 2006, Vol. 6, No. 1, p. 1-11, DOI: 10.1186/1472-6769-6-1 *
MAIYALAGAN T. et al. 3-(4-Methoxyphenyl)-1H-isochromen-1-one. Acta Cryst, 2009, Vol. E65, o128, DOI: 10.1107/S1600536808042074 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104203239A (zh) 2014-12-10
BR112014018027A2 (ru) 2017-06-20
BR112014018027A8 (pt) 2017-07-11
MX2014008875A (es) 2014-10-14
KR102064624B1 (ko) 2020-01-09
EA201491412A1 (ru) 2014-12-30
WO2013112788A1 (en) 2013-08-01
ES2733644T3 (es) 2019-12-02
BR112014018027B1 (pt) 2020-10-27
JP2017171667A (ja) 2017-09-28
US9399649B2 (en) 2016-07-26
EP2809322B9 (en) 2019-10-30
EP2809322A4 (en) 2015-12-23
US20150126515A1 (en) 2015-05-07
JP6193888B2 (ja) 2017-09-06
CA2862084C (en) 2021-05-11
JP2015511224A (ja) 2015-04-16
CA2862084A1 (en) 2013-08-01
MX357834B (es) 2018-07-26
EP2809322A1 (en) 2014-12-10
EP2809322B1 (en) 2019-05-15
CN104203239B (zh) 2017-09-08
KR20140127271A (ko) 2014-11-03
PL2809322T3 (pl) 2019-11-29
HK1202069A1 (en) 2015-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA028344B1 (ru) Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии
US9879007B2 (en) Compounds for treating spinal muscular atrophy
CN104470909B (zh) 用于治疗脊髓性肌萎缩的化合物
CN104302181B (zh) 用于治疗脊髓性肌萎缩的化合物
EP2797592B1 (en) Compounds for treating spinal muscular atrophy

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM