EA025202B1

EA025202B1 - Молекула для лечения воспалительного нарушения

Info

Publication number: EA025202B1
Application number: EA201391649A
Authority: EA
Inventors: Карлос Алонсо Бедате; Мануэль Сото Альварес; Лаура Рамирес Гарсия; Херонимо Карнес Санчес; Марта Роман Эскутия
Original assignee: Лабораториос Лети, С.Л.
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2016-11-30
Also published as: BR112013028891A2; PT2707022T; AU2012252420B2; CN103796675A; CA2835258C; EP2707022B1; CN103796675B; EA201391649A1; US10000538B2; MX354120B; JP6176795B2; CA2835258A1; ES2670520T3; AU2012252420A1; US20140206598A1; WO2012152792A1; MX2013013071A; EP2707022A1; JP2014515924A; NZ617454A

Abstract

Это изобретение обеспечивает источник L19 в качестве лекарственного средства предпочтительно для предотвращения или лечения воспалительного нарушения в индивидууме.

Description

Это изобретение обеспечивает источник Ь19 в качестве лекарственного средства, предпочтительно для предотвращения воспалительного нарушения в индивидууме.

Уровень техники

Иммунные и родственные воспалительные заболевания являются комплексными, часто взаимосвязанными биологическими путями, которые в нормальной физиологии отвечают на инсульт или повреждение стимулирующей репарацией этого инсульта или повреждения и установлением природной и приобретенной реакции. Заболевание или патология встречаются, когда эти физиологические пути вызывают дополнительные инсульт или повреждение, либо ненормально расширенной реакцией, обусловленной аномальной регуляцией или сверхстимуляцией, либо комбинацией этих двух реакций. Несмотря на развитие новых противовоспалительных лекарственных средств, таких как анти-ТИР-агенты, воспалительные заболевания продолжают представлять важную неудовлетворенную медицинскую потребность, часто вследствие отсутствия отвечаемости и чувствительности к этим лекарственным средствам.

Иммунные и родственные воспалительные заболевания, которые могут быть модулированы применением противовоспалительных агентов, включают в себя аутоиммунный диабет (любые другие, подобные ему), сахарный диабет, увеиты, (1) рассеянный склероз, ревматоидный артрит (КА), синдром раздраженной толстой кишки (ΙΒΌ) (спастический колит), неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, контролируемое отторжение трансплантата после трансплантации органа, реакцию трансплантат против хозяина (СУНЭ). воспалительные заболевания легких и хроническое обструктивное заболевание легких (СОРБ) (2), рак (4), системную красную волчанку, §ЬЕ, саркоидоз, рак и псориаз.

КА считается системным аутоиммунным заболеванием, которое лечится обработкой модифицирующими болезнь противоревматическими лекарственными средствами (БМАКБ8), обычно в комбинации, для минимизации побочных эффектов, ассоциированных с системными лекарственными средствами. Побочные эффекты этих лекарственных средств включают в себя язвенный стоматит, уменьшенное количество эритроцитов.

ΙΒΌ является термином, который описывает хроническое воспалительное нарушение тонкой кишки и/или толстой кишки. В область ΙΒΌ включены также язвенный колит и болезнь Крона. Хотя точные причины не установлены твердо, считается, что ΙΒΌ является аутоиммунным заболеванием. В настоящее время лечение не является доступным, и терапии сосредоточены на супрессии аномальной или ненормально увеличенной воспалительной реакции. Лечения включают в себя кортикостероиды (такие как метотрексат, азотиоприн и меркаптопурин) и аминосалицилаты. Продолжительное использование кортикостероидов ассоциировано с разрежением костей, инфекцией, катарактами и эффектами костного мозга. Аминосалицилаты имеют тенденцию лучшей переносимости, так как они слабо абсорбируются и действуют на пораженную зону локально. Побочные эффекты включают в себя головную боль и редко более серьезные состояния, такие как панкреатит.

Псориаз лечат различными путями. Использование кортикостероидов местно является обычным способом лечения, но недостатки включают в себя неэффективность и развитие резистентности. Применение фототерапии (светолечения) является эффективным в лечении псориаза вследствие увеличения апоптоза, которое участвует, по-видимому, в уменьшенном воспалении. Недостатки кратковременного действия увеличивают дискомфорт и зуд, тогда как продолжительные эффекты создают увеличенный риск кожного рака, плоскоклеточного рака и меланомы. Для лечения псориаза используют системные лекарственные средства, которые имеют множество других, часто нежелательных системных эффектов и должны использоваться при тщательном контроле и мониторинге дерматологом.

Таким образом, все еще существует потребность в развитии новых терапий для воспалительного заболевания, такого как КА, ΙΒΌ и псориаз, которые не имеют всех этих недостатков существующих терапий.

Описание изобретения

Источник Ь19.

В первом аспекте, для применения в качестве лекарственного средства обеспечен источник Ь19.

Ь19 является рибосомным белком. Рибосомные белки являются сильно консервативными цитозольными белками. Таким образом, источник Ь19 может быть получен из любого эукариотического организма, будь то растение или животное, например, из млекопитающих, пресмыкающихся, рыб, насекомых или любого другого несущего хромосомы организма, такого как простейшие. Это изобретение не ограничивается специфическим источником Ь19, пока кодируемый Ь19-белковый продукт способен индуцировать противовоспалительную реакцию, как определено здесь ниже. Предпочтительные простейшие включают в себя плазмодий и, в частности, члены семейства трипаносоматидов, более конкретно, различные виды трипаносоматических простейших ЬеЫипаша. Существуют более 20 известных видов ЬехкЬташа, включающих в себя виды подрода ЬехкЬтата, содержащие комплекс Ь. та_)ог, включающий в себя Ь. та.)ог, комплекс Ь. Боиоуат, включающий в себя Ь. сНадаБ Ь. άοηονηηί и Ь. шТайит, комплекс Ь. Мехюаиа, включающий в себя Ь. ата/оиеи515 и Ь. техюаиа, а также подвиды У1аита, включающие в себя комплекс Ь. ЬгахП1еп815, включающий в себя Ь. ЬгахлПеп818 и Ь. региу1аиа, и комплекс Ь. диуаиеи818, включающий в себя Ь. §иуаиеи818 и Ь. раиатеи818. Видами Р1а8тобшт, представляющими особый инте- 1 025202 рес, являются Р1актойшт ГаЮрагит и Р1актойшт νίναχ. Альтернативно источник Ь19 может быть получен из вида Тгураиокота. Видом Тгураиокота может быть Тгураиокота сги/ί. Тгураиокота ЪгисеЕ В одном предпочтительном варианте осуществления, источник Ь19 получают, производят или создают из видов ЬещЬташа, предпочтительно ЬещЬташа та|ог. ЬещЬтата тГапШт ЬещЬтата йопотапк Ье1кЬтата сйадак1 и/или ЬещЬтата Ъга/Шепму Более предпочтительным является источник Ь19, который получен или произведен или создан из Ье1кЬташа та_)ог. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что источник Ь19 может быть также приготовлен смешиванием двух или нескольких источников Ь19, произведенных из одного и того же организма или из нескольких различающихся организмов, идентифицированных здесь. Здесь было продемонстрировано, что применение источника Ь19 имеет привлекательные свойства, так как было показано, что кодируемый белковый продукт Ь19 способен индуцировать продуцирование противовоспалительной реакции в получающем лечение субъекте.

Одним предпочтительным источником Ь19 является молекула нуклеиновой кислоты, олиго нуклеотид, белок, фрагмент белка и/или пептид, каждый из которых произведен из белка или полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты Ь19, описанной здесь. Источник Ь19 предпочтительно содержит (или состоит из них) белок Ь19, полипептид Ь19, произведенный из Ь19 пептид или фрагмент белка Ь19 и/или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок Ь19 или полипептид Ь-19 или произведенный из Ь19 пептид или фрагмент белка Ь19, каждые из которых определены здесь. Предпочтительный белок Ь19 представлен 5>ЕО ГО N0:1. Этот предпочтительный Ь19, предпочтительно кодируется 5>Е0 ГО N0:2. Другой предпочтительный белок Ь19 представлен 5>Е0 ГО N0:5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29. Каждый из этих белков Ь19 предпочтительно кодируется 5>Е0 ГО N0:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,

26, 28, 30, соответственно.

В первом варианте осуществления, предпочтительным источником Ь19 является молекула нуклеиновой кислоты, представленная нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из

ί) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность или сходство последовательности с аминокислотной последовательностью 5>Е0 ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 ,25, 27 или 29, ίί) нуклеотидных последовательностей, содержащих нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность или сходство с нуклеотидной последовательностью 5>Е0 ГО N0:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30, ίίί) нуклеотидных последовательностей, комплементарная часть которых гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты последовательности (ί) или (ίί) и ίν) нуклеотидных последовательностей, последовательности которых отличаются от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода.

Во втором варианте осуществления, предпочтительный источник Ь19 является полипептидом, кодируемым молекулой нуклеиновой кислоты первого варианта осуществления, как идентифицировано выше. В более предпочтительном варианте осуществления, источник Ь19 является полипептидом, аминокислотная последовательность которого имеет по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность или сходство последовательности с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность 5>Е0 ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 ,25,

27, 29 или 31.

Авторы идентифицировали несколько белков Ь19 и соответствующих молекул нуклеиновых кислот. Каждый из этих белков Ь19 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95% или более с 5>Е0 ГО N0:1. Каждая из молекул нуклеиновых кислот, кодирующих каждый из этих белков Ь19, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95% или более с 5>Е0 ГО N0:2. Каждый из этих белков Ь19 представляет гомолог белка Ь19 ЬещЬташа та)ог представленного 5>Е0 ГО N0:1.

Вкратце, авторы идентифицировали три белка Ь19 из ЬещЬташа Ъгах1Иеп818, представленных 5>Е0 ГО N0:5, 7 или 9. Каждый из этих белков является предпочтительно кодируемым следующими нуклеотидными последовательностями 5>Е0 ГО N0:6, 8 или 10, соответственно.

Авторы также идентифицировали два белка Ь19 из Ье1кЬташа тГаШипт представленных 5>Е0 ГО N0:11 или 13. Каждый из этих белков является предпочтительно кодируемым следующими нуклеотидными последовательностями 5>Е0 ГО N0:12 или 14, соответственно.

Авторы также идентифицировали два белка Ь19 из ЬещЬташа техюаиа, представленных 5>Е0 ГО N0:15 или 17. Каждый из этих белков является предпочтительно кодируемым следующими нуклеотидными последовательностями 5>Е0 ГО N0:16 или 18, соответственно.

Авторы также идентифицировали один белок Ь19 из Ье1кЬташа άоηоνаη^, представленный 5>Е0 ГО N0:19. Этот белок является предпочтительно кодируемым следующей нуклеотидной последовательностью 5>Е0 ГО N0:20.

Кроме того, авторы идентифицировали четыре белка Ь19 из Тгураиокота сги/г представленных 5>Е0 ГО N0:21, 23, 25 или 27. Каждый из этих белков является предпочтительно кодируемым следующи- 2 025202 ми нуклеотидными последовательностями 8Е0 ГО N0:22, 24, 26 или 28, соответственно.

Авторы также идентифицировали один белок Ь19 из Ттурапокота Ьгисск представленный 8Е0 ГО N0:29. Этот белок является предпочтительно кодируемым следующей нуклеотидной последовательностью 8ЕО ГО N0:30.

Предпочтительно, указанная аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность, определенные здесь как имеющие по меньшей мере 50% идентичность или сходство со специфической идентифицированной аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, охватываются данным изобретением, и говорится, что они являются функциональными, когда этот кодируемый белок, полипептид, фрагмент белка или пептид способны индуцировать противовоспалительную реакцию, такую как реакция, получаемая белком Ь19, представленным 8Е0 ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29 по меньшей мере до некоторой степени. По меньшей мере до некоторой степени предпочтительно означает, что по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60, 70, 80, по меньшей мере 90% или 100% этой противовоспалительной реакции индуцировалось 8Е0 ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29.

Индуцирование противовоспалительной реакции является или предпочтительно определяется как способность индуцировать детектируемое продуцирование противовоспалительного соединения и/или способность индуцировать уменьшение продуцирования воспалительного соединения в получающем лечение субъекте или индивидууме. Одним противовоспалительным соединением является предпочтительно цитокин. Более предпочтительным цитокином является цитокин ГЛ-10. Воспалительным соединением является предпочтительно цитокин. Более предпочтительным цитокином является 1РЛу и/или ТИРа. Продуцирование ГО-10 или ГЕЛу или ТИРа предпочтительно оценивают на уровне мРНК с использованием ПЦР или на уровне белка с использованием ЕЫ8А, ЕЫ8Р0Т или РАС8. Все эти способы известны квалифицированному в данной области специалисту. Многие публикации подразумевают повышение ГО-10 с уменьшением воспаления, как результата заболевания. То же самое относится к повышению ГРЦу или ТОТ¹а и присутствию воспаления. Продуцирование противовоспалительного соединения может оцениваться на получающем лечение субъекте или на пробе, полученной из указанного субъекта. В этом контексте, пробой может быть ткань или жидкость, или клетка. Предпочтительные ткани включают в себя селезенку или кожу или кишку или легкое. Предпочтительная жидкость включает в себя кровь.

Предпочтительные клетки включают в себя РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) или клетки кожи, или кишечные клетки и клетки легких. Противовоспалительная реакция может быть индуцирована после по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней лечения источником Ь19. Предпочтительными источниками являются полипептид, белок, фрагмент белка или пептид Ь19. Индукцией противовоспалительной реакции может быть также увеличение индукции противовоспалительной реакции. В этом контексте, увеличение может означать увеличение по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%. Эта индукция противовоспалительной реакции может быть также уменьшением количества или качества ΓΡΉγ и/или ТНРа. В этом контексте, уменьшение может означать уменьшение по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%.

В одном предпочтительном варианте осуществления, противовоспалительное соединение продуцируется и воспалительные соединения (т.е. ГРЦу и/или ТНРа) не детектируются. В этом контексте не детектируются ГР^ и/или ТНРа. Отсутствие ГРЦу и/или ТНРа предпочтительно оценивается с использованием РСК или ЕЫ8А. Отсутствие воспалительного соединения может оцениваться на получающем лечение субъекте или на пробе, полученной из указанного субъекта на противовоспалительное соединение.

В одном предпочтительном анализе, противовоспалительную реакцию, более предпочтительно продуцирование ГЛ-10 или увеличение ГО-10 детектируют спустя по меньшей мере 24 ч или 48 ч или 72 ч инкубирования источника Ь19, предпочтительно полипептида Ь19 или пептида Ь19 с РВМС. В этом предпочтительном анализе, уменьшенное количество ГРЦ-у и/или уменьшенное количество ТЫРа или недетектируемый ГРХ-у И/ИЛИ отсутствие ТНРа детектируют спустя по меньшей мере 24 ч или 48 ч, или 72 ч инкубирования источника Ь19, предпочтительно полипептида Ь19 или пептида Ь19 с РВМС. Более предпочтительно, ГЛ-10, IΡNу и/или ТНРа оцениваются при помощи ЕЫ8А, как описано в экспериментальной части. В следующем предпочтительном варианте осуществления, источник Ь19, который способен индуцировать противовоспалительную реакцию, также способен предотвращать и/или задерживать развитие воспалительного нарушения или состояния или заболевания и/или быть способным ослаблять один или несколько симптомов и/или одну или несколько характеристик или параметров клетки или ткани из получающего лечение субъекта, как определено здесь ниже.

Предпочтительным источником Ь19 является молекула нуклеиновой кислоты первого варианта осуществления, идентифицированная выше. Эта предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты представлена нуклеотидной последовательностью, которая произведена из 8Е0 ГО N0:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30, или последовательностью, имеющей по меньшей мере 50% идентичность

- 3 025202 или сходство с 5>Е0 ГО N0:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30 или ее частью, и которая может содержать замены, инсерции, делеции и дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеотиды или химические части молекулы для увеличения стабильности, растворимости или нацеливания. В предпочтительном варианте осуществления, источником Ь19 является молекула нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность которой имеет по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность или сходство последовательности с 5>Е0 ГО N0:2, 4, 6, 8,

10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30, или с ее частью.

Молекула нуклеиновой кислоты Ь19, определенная здесь, является предпочтительно олигонуклеотидом. Предпочтительный олигонуклеотид имеет длину по меньшей мере 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 нуклеотидов и произведен из 5>ЕО ГО N0:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30. Более предпочтительные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более смежных нуклеотидов соответствующей молекулы нуклеиновой кислоты Ь19, идентифицированной выше, предпочтительно представленной 8ЕО ГО N0:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 30, и продукт которой способен индуцировать противовоспалительную реакцию, определенную здесь ранее. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления, молекула нуклеиновой кислоты Ь19, определенная здесь, является предпочтительно олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более смежных нуклеотидов 8ЕО ГО N0:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,

22, 24, 26, 28 или 30.

В результате, предпочтительным источником Ь19 является олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более смежных нуклеотидов 8ЕО ГО N0:2.

Другим предпочтительным источником Ь19 является полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты первого варианта осуществления, идентифицированный выше, и/или полипептид, аминокислотная последовательность которого имеет по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность или сходство последовательности с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29, или с его частью.

Один предпочтительный полипептид представлен аминокислотной последовательностью, которая произведена из 5>ЕО ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29 или из ее части, или последовательности, имеющей по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность или сходство с 5>ЕО ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29 или с ее частью, и которая может содержать замены, инсерции, делеции и дополнительные N или Сконцевые аминокислоты или химические части молекулы для увеличения стабильности, растворимости.

Фрагмент белка Ь19 или произведенный из Ь19 пептид или полипептид Ь19 или белок Ь19, определенные здесь, являются предпочтительно фрагментом, содержащим меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265 или 267 смежных аминокислот соответствующего белка Ь19, предпочтительно представленного 5>ЕО ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,

23, 25, 27 или 29, который способен индуцировать противовоспалительную реакцию, как определено здесь ранее. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления, фрагмент белка Ь19 или произведенный из Ь19 фрагмент или произведенный из Ь19 пептид, как определено здесь, является предпочтительно фрагментом, содержащим по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265 или 267 смежными аминокислотами 8ЕО ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29. Источник Ь19 может также содержать полноразмерный белок Ь19, такой как белок, представленный 8ЕО ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29, и содержит дополнительные аминокислоты в И-и/или С-конце этого белка Ь19. В другом предпочтительном варианте осуществления, источник Ь19 содержит (или состоит из них) белок или полипептид, содержащий по меньшей мере один фрагмент белка этого белка Ь19. Одним предпочтительным источником Ь19 является фрагмент белка, содержащий по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265 или 267 смежных аминокислот 8ЕО ГО N0:1.

В одном варианте осуществления, источником Ь19 является пептид, произведенный из 8ЕО ГО N0:1, или фрагмент 8ЕО ГО N0:1. Один предпочтительный фрагмент или пептид, содержит по меньшей мере 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 смежных аминокислот 8ЕО ГО N0:1. В примере 3, три района Ь19 и специфических пептидов, произведенных из Ь19, были идентифицированы как являющиеся способными индуцировать продуцирование

- 4 025202

1Ь-10. Эти предпочтительные районы Ь19 являются следующими:

район 1 содержит пептиды, имеющие ЗЕО ГО N0:31, 32 и/или 55, район 2, содержит пептиды, имеющие ЗЕО ГО N0:42, 43, 44 и/или 56, район 3 содержит пептиды, имеющие ЗЕО ГО N0:53, 54 и/или 57.

Ниже авторы определяют более подробно эти пептиды или фрагменты ЗЕО ГО N0:1. Фрагмент белка ЗЕО ГО N0:1, содержащий по меньшей мере 14 смежных аминокислот ЗЕО ГО N0:1, и содержащий ЗЕО ГО N0:31, 32, 55, 42, 43, 44, 56, 53, 54 и/или 57.

Один более предпочтительный фрагмент ЗЕО ГО N0:1 содержит ЗЕО ГО N0:31 или 32 или 42 или 43 или 44 или 53 и содержит до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 или 20 смежных аминокислот из ЗЕО ГО N0:1. Указанный фрагмент может содержать ЗЕО ГО N0:31 или 32, или 42, или 43, или 44, или 53 и может иметь длину до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 или 20 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из ЗЕО ГО N0:31 или 32, или 42, или 43, или 44, или 53.

Другой более предпочтительный фрагмент ЗЕО ГО N0:1 содержит ЗЕО ГО N0:54 и содержит до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 или 14 смежных аминокислот из ЗЕО ГО N0:1. Указанный фрагмент может содержать ЗЕО ГО N0:54 и может иметь длину до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 или 14 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из ЗЕО ГО N0:54.

Один более предпочтительный фрагмент ЗЕО ГО N0:1 содержит ЗЕО ГО N0:57 и содержит до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25 смежных аминокислот из ЗЕО ГО N0:1. Указанный фрагмент может содержать ЗЕО ГО N0:57 и может иметь длину до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из ЗЕО ГО N0:57.

Один более предпочтительный фрагмент ЗЕО ГО N0:1 содержит ЗЕО ГО N0:55 и содержит до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 смежных аминокислот из ЗЕО ГО N0:1. Указанный фрагмент может содержать ЗЕО ГО N0:55 и может иметь длину до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из ЗЕО ГО N0:55.

Один более предпочтительный фрагмент ЗЕО ГО N0:1 содержит ЗЕО ГО N0:56 и содержит до 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42 смежных аминокислот из ЗЕО ГО N0:1. Указанный фрагмент может содержать ЗЕО ГО N0:56 и может иметь длину до 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из ЗЕО ГО N0:56.

Каждый из этих предпочтительных фрагментов ЗЕО ГО N0:1, идентифицированных здесь, предпочтительно способен индуцировать противовоспалительную реакцию, как определено здесь ранее.

Этот источник Ь19 может быть белком, продуктом расщепления этого белка и/или его фрагментом, который может быть в очищенной форме или может находиться в неочищенной композиции, предпочтительно биологического происхождения, такой как бактериальный лизат, дрожжевой лизат, грибковый лизат, бактериальный супернатант, дрожжевой супернатант, грибковый супернатант, гомогенат, полученный обработкой ультразвуком, или фиксат. Альтернативно, источник Ь19 может быть химически синтезирован или ферментативно продуцированным ίη νίίτο в бесклеточной системе или в клеточной системе. Источник белка Ь19 или его фрагмент может быть также нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный белок или фрагмент, из РНК- или ДНК-матрицы. Эти молекулы РНК или ДНК могут быть 'голой' ДНК, предпочтительно содержащейся в пузырьках или липосомах, или они могут содержаться в векторе. Этот вектор может быть любым (рекомбинантным) ДНК- или РНК-вектором, известным в данной области, и предпочтительно является плазмидой; где гены, кодирующие антигены латентности, функционально связаны с регуляторными последовательностями, придающими экспрессию и трансляцию кодируемых мессенджеров. Этот вектор может быть также любым ДНК- или РНК-вирусом, таким как, но не ограничивается ими, Аденовирус, Аденоассоциированный вирус (ААУ), ретровирус, лентивирус, модифицированный Уасаша Апкага вирус (МУА) или Вирус Птичьей Оспы, или любой другой вирусный вектор, способный придавать экспрессию указанного полипептида в выбранного субъекта. ДНКвекторы могут быть неинтегрирующимися, такими как эписомно реплицирующиеся векторы, или могут быть векторами, интегрирующимися в геном хозяина случайной интеграцией или гомологичной рекомбинацией.

Источник Ь19 или его композиция, определенные здесь для применения в соответствии с данным изобретением, могут быть подходящими для ίη νίίτο введения в клетку, ткань и/или орган индивидуума, пораженного воспалительным нарушением или находящемся при риске развития воспалительного нарушения, и/или могут быть подходящими для введения ίη νίνο или ех νίνο в клетку, ткань и/или орган таких индивидуумов и/или могут быть подходящими для введения ίη νίνο таким индивидуумам. В зависимости от типа используемого источника (на основе белка или на основе нуклеиновой кислоты), квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, какой тип препарата является подходящим. Источник Ь19 может вводиться как таковой (голый белок или голая нуклеиновая кислота). Альтернативно, источник на основе нуклеиновой кислоты может вводиться с использованием конструкта нуклеиновой кислоты, описанного здесь. Указанный источник Ь19 или композиция, определенные здесь, могут вводиться прямо или опосредованно ίη νίνο, ίη νίίτο или ех νίνο в клетку, ткань и/или орган индивидуума,

- 5 025202 пораженного воспалительным нарушением или находящегося при риске развития воспалительного нарушения, или ίη νίνο такому индивидууму. Предпочтительно, указанные клетки являются клетками индивидуума, страдающего от воспалительного нарушения. Предпочтительно указанной тканью является ткань индивидуума, страдающего от воспалительного нарушения. В зависимости от этого воспалительного нарушения, конкретные тип клеток или ткани могут быть более подходящими для лечения источником Ь19 или композицией этого изобретения. Например, тканью может быть кожа, кровь, кишечник, легкое, и подходящие клетки могут быть получены из этих тканей.

Источник Ь19 или композиция этого изобретения может быть введена опосредованно с использованием подходящих способов, известных в данной области. Молекула нуклеиновой кислоты, определяемая как первый вариант, может быть, например, обеспечена индивидууму или клетке, ткани или органу указанного индивидуума в форме экспрессирующего вектора, где этот экспрессирующий вектор кодирует транскрипт, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты. Этот экспрессирующий вектор предпочтительно вводят в клетку, ткань, орган или в индивидуума посредством вектора доставки генов. В предпочтительном варианте осуществления, обеспечен экспрессирующий вектор на основе вируса, содержащий экспрессионную кассету или транскрипционную кассету, которая запускает экспрессию или транскрипцию молекулы, идентифицированной здесь. Одним предпочтительным вектором доставки является вирусный вектор, такой как аденоассоциированный вирусный вектор (АЛУ), или ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор и т.п. Плазмиды, искусственные хромосомы, плазмиды, подходящие для нацеленной гомологичной рекомбинации и интеграции в геноме клеток человека, могут быть подходящим образом применены для доставки молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в первом варианте.

Ожидаются улучшения способов для обеспечения индивидуума или клетки, ткани, органа указанного индивидуума источником Ь19 или композицией, определенными здесь, если принять во внимание тот прогресс, который достигнут до сих пор. При введении источника Ь19 или композиции, предпочтительно указанные источник Ь19 и композицию растворяют в растворе, который является совместимым с конкретным способом доставки. При внутривенном, подкожном, внутримышечном, внутрикожном, внутриоболочечном и/или внутрижелудочковом введении предпочтительно, чтобы этот раствор был физиологическим солевым раствором.

В контексте этого изобретения субъект или индивидуум или пациент или животное обозначает человека или животного. Животное, которое включено в объем этого изобретения, включает в себя млекопитающего. Предпочтительные млекопитающие включают в себя собаку и кошку.

В одном предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 1 мкг источника Ь19 используют для индукции противовоспалительной реакции. Диапазоны дозы источника Ь19, определенные выше, являются предпочтительными дозами для применений ίη νίΐτο или ех νίνο. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что в зависимости от используемого источника Ь19, подлежащих лечению клетки, ткани, органа или субъекта, используемой среды и условий трансфекции и инкубирования, используемая доза Ь19 может дополнительно варьироваться и может нуждаться в дальнейшей оптимизации.

Источник Ь19 является предпочтительно лекарственным средством или служит для использования в виде лекарственного средства. Более предпочтительно, указанное лекарственное средство предназначено для предотвращения, задержки и/или лечения воспалительного нарушения в отношении субъекта, нуждающегося в этом. В контексте данного изобретения, воспалительным нарушением является любое воспалительное заболевание или состояние или любое состояние, в котором воспаление будет встречаться на конкретной стадии. Примеры воспалительных заболеваний или состояний включают в себя, но не ограничиваются ими, ревматоидный артрит (КА), ювенильный ревматоидный артрит, псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ) (в том числе болезнь Крона или язвенный колит), синдром раздраженной толстой кишки (спастический колит), гепатит, сепсис, алкогольное поражение печени и неалкогольную себорею, нефрит, такой как гломерулярный нефрит, астму, эндокардит, тяжелую псевдопаралитическую миастению, рассеянный склероз, аутоиммунный склероз, аутоиммунный диабет (любые другие, сходные с ним), сахарный диабет, увеит, (1) контроль отторжения трансплантата после трансплантации органа, реакцию трансплантат против хозяина (ОУНО), воспалительные заболевания легких, включающие в себя астму и хроническое обструктивное заболевание легких (СОРЭ) (2), рак (4) системную красную волчанку, §ЬЕ, индуцируемое УФ воспаление кожи, атопический дерматит и саркоидоз.

В данном контексте, термин гепатит относится к гастроэнтерологическому заболеванию, состоянию или нарушению, которое характеризуется, по меньшей мере частично, воспалением печени. Примеры гепатита включают в себя, но не ограничиваются ими, гепатит, ассоциированный с вирусом гепатита А, вирусом гепатита В, вирусом гепатита С или воспаление печени, ассоциированное с ишемией/реперфузией.

В одном более предпочтительном варианте осуществления, указанное лекарственное средство способно ослаблять один или несколько симптомов из получающего лечение пациента, и/или одна или несколько характеристик или параметров клетки или ткани или органа из получающего лечение пациента

- 6 025202 улучшаются с использованием источника Ь19 или композиции этого изобретения. Для каждого воспалительного заболевания, квалифицированному в данной области специалисту будут известны по меньшей мере один симптом, параметр или характеристика, величины указанных параметра или характеристики, ассоциированные с указанным заболеванием, а также будет известно, как оценивать каждый из них. Если лекарственное средство этого изобретения способно индуцировать противовоспалительную реакцию, как описано здесь ранее, говорят, что указанное лекарственное средство способно предотвращать и/или задерживать развитие воспалительного нарушения или состояния или заболевания, и/или улучшать одну или несколько характеристик или один или несколько параметров клетки или ткани из получающего лечение субъекта, как определено здесь позднее.

Ниже авторы дают параметр, специфический для ревматоидного артрита, псориаза и воспалительного заболевания кишечника, соответственно.

Ревматоидный артрит является системным заболеванием и является одной из наиболее обычных форм артрита. Он характеризуется воспалением мембранной выстилки сустава, вызывающим боль, тугоподвижность, теплоту, покраснение и опухание.

Имеются несколько животных-моделей для КА, известных в данной области. Одним примером является модель индуцированного коллагеном артрита (С1А), в которой мыши развивают хронический воспалительный артрит, который очень похож на ревматоидный артрит человека. Поскольку С1А имеет сходные иммунологические и патологические признаки с КА, это делает его подходящей моделью для скрининга потенциальных терапий для КА. Известно, что в этой модели основные механизмы патогенеза с различными иммунологическими и воспалительными параметрами, относящимися к иммуноопосредованному артриту, были определены. Эти параметры могут быть использованы для оценивания эффективности соединения в модели С1А (5).

КА предпочтительно диагностируется после оценивания показателя Балла Активности Заболевания (Э15са5С ΛοΙίνίΙν §еоте (ЭА§)) или родственного ЭА§28 (6), включающего в себя измерения нескольких параметров и симптомов на субъекте. Оценивание указанных показателей может проводиться практикующим врачом (клиницистом), обследующим субъекта. В более предпочтительном варианте осуществления, указанное лекарственное средство способно ослаблять один или несколько симптомов из получающего лечение пациента, и/или одна или несколько характеристик или параметров клетки или ткани или органа из получающего лечение пациента улучшаются с использованием источника Ь19 или композиции этого изобретения, когда указанное лекарственное средство способно индуцировать значимое изменение в ЭА§ или ЭА§28. Другие пути оценивания ревматоидного артрита также описаны в (6) и в (7). Определенное здесь лекарственное средство способно улучшать один параметр, если спустя по меньшей мере одну неделю, один месяц, шесть месяцев, один год или более лечения с использованием источника Ь19 или композиции этого изобретения, предпочтительно, величина указанного параметра улучшилась по меньшей мере на 1, 2, 5, 10% или более при сравнении величины указанного параметра перед началом этого лечения.

Как определено здесь, лекарственное средство способно ослаблять один симптом или одну характеристику пациента или клетки, ткани или органа или указанного пациента, если после по меньшей мере одной недели, одного месяца, шести месяцев, одного года или более лечения с использованием Ь19 или композиции этого изобретения, указанные симптом или характеристика уже не были детектируемыми.

Воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ) является группой воспалительных состояний ободочной кишки и тонкой кишки, в том числе язвенного колита и болезни Крона. Язвенный колит характеризуется воспалением ободочной кишки, приводящим к частому опустошению ободочной кишки, приводящему к диарее и ассоциированным спазмам, лихорадке и потери массы. Выстилка ободочной кишки становится разрушенной, образующей язвы, которые выделяют слизь, гной и кровь. Повторяющиеся эпизоды могут приводить к образованию рубцовой ткани и гибели ткани ободочной кишки или сепсису с тяжелым заболеванием. Существующие терапии фокусируются на супрессии аномального воспалительного процесса в выстилке ободочной кишки.

Одной хорошо охарактеризованной моделью животных для ΙΒΌ, язвенного колита и особенно болезни Крона человека является модель колита, индуцированного 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой/этанолом (ΤΝΒδ). Колит индуцировали интраректальным введением ΤΝΒδ. Оно индуцирует опосредуемую Т-клетками иммунную реакцию в слизистой оболочке ободочной кишки, приводящую к массивному мукозному воспалению, характеризующемуся инфильтрацией Т-клеток и макрофагов через всю стенку толстой кишки. Этот гистопатологический характер сопровождается прогрессивной потерей массы, кровавым поносом, утолщением стенки толстой кишки (8). Существующие модели животных воспаления ободочной кишки не отражают полностью сложности этого заболевания в людях, однако они являются ценными инструментами для оценивания эффективности терапевтических соединений.

Псориаз является обычным, хроническим заболеванием кожи, в котором новые клетки кожи растут аномально, приводя к воспаленным, опухшим и чешуйчатым бляшкам кожи, где старая кожа не слущивается достаточно быстро. Наиболее обычной формой является чешуйчатый псориаз, характеризуемый повреждениями, покрытыми наверху серебристо-белыми чешуйками. Псориаз может ограничиваться небольшим количеством повреждений или может включать в себя обширные зоны кожи, наиболее часто

- 7 025202 появляющиеся на локтях, коленях, волосистой части кожи головы и на торсе. Мягкие случаи псориаза лечат местными нанесениями. Однако более тяжелые случаи требуют ультрафиолетовой терапии, которая является неудобной, или применения системных иммуносупрессивных терапий, которые, вследствие токсичных побочных эффектов, часто имеют ограниченную ценность при продолжительном применении. Кроме того, псориаз часто рецидивируется, в том числе вскоре после остановки иммуносупрессивной терапии.

Несколько моделей заболевания были развиты для оценивания потенциальных модуляторов заболевания. Одной такой моделью является модель ксенотрансплантата ίη νίνο для псориаза с псориатической кожей человека, имплантированной в мышь с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СГО). Терапии, которые удаляют или уменьшают воспаление, могут быть испытаны введением в §СГОмышей, несущих воспаленную ткань человека. Эффективность лечения может оцениваться диапазоном показателей. Псориаз является заболеванием, которое предпочтительно диагностируется после оценивания индекса Площади Псориаза и Индекса Тяжести (ΡΑδΙ), глобального оценивания врачом (РОА) (9) или балла ΝΡΡ Ρδοιϊαδίδ 8согс (ΝΡΡ-Ρδ), включающего измерения нескольких параметров и симптомов на субъекте. Это оценивание указанных индексов может проводиться практикующим врачом (клиницистом), обследующим субъекта. В более предпочтительном варианте осуществления, указанное лекарственное средство способно ослаблять один иди несколько симптомов из получающего лечение пациента, и/или одна или несколько характеристик или параметров клетки или ткани или органа из получающего лечение человека улучшились с использованием источника Ь19 или композиции этого изобретения, когда указанное лекарственное средство способно индуцировать значимое изменение в ΡΑδΙ, РОА или ΝΡΡ-Ρδ. Другие пути оценивания псориаза включают в себя индекс качества жизни Иегша1о1о§у ЬгГе ОиаШу 1пбех (Ό6·ΟΙ) (10) и δαΙΓοτά Ρδοιϊαδίδ 1пбех (δΡΙ), также описанные в (11). Как определено здесь, лекарственное средство является способным улучшать один параметр, если после по меньшей мере одной недели, одного месяца, шести месяцев, одного года или более лечения с использованием источника Ь19 или композиции этого изобретения, предпочтительно, величина указанного параметра улучшалась по меньшей мере на 1, 2, 5, 10% или более в сравнении с величиной указанного параметра перед началом этого лечения.

Предпочтительный источник Ь19, как определено здесь, способен предотвращать или лечить воспалительное нарушение в индивидууме. Индивидуум, который может лечиться с использованием такого источника, может уже быть диагностированным как имеющий воспалительное нарушение. Альтернативно, индивидуум, который может лечиться с использованием такого источника Ь19, может быть еще недиагностированным как имеющий воспалительное нарушение, но может быть индивидуумом, имеющим высокий риск развития воспалительного нарушения в будущем при его или ее генетическом фоне. Предпочтительным индивидуумом является человек.

Композиция

В следующем аспекте, обеспечена композиция, содержащая источник Ь19, описанная здесь. В одном предпочтительном варианте осуществления, указанная композиция является предпочтительно фармацевтической композицией, причем указанная фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемые носитель, соль, разбавитель и/или эксципиент.

Обеспечена также такая фармацевтическая композиция, которая может содержать любой фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель, соль, консервант, солюбилизатор, разбавитель и/или эксципиент. Такие фармацевтически приемлемые носитель, наполнитель, соль, консервант, солюбилизатор, разбавитель и/или эксципиент могут быть найдены в (12). Каждый признак указанной композиции был определен здесь ранее.

Если используются источники Ь19, определенная здесь доза может относиться к общей дозе всех используемых источников Ь19 или к дозе каждого используемого или добавляемого источника Ь19. Таким образом, в одном варианте осуществления, обеспечена композиция, в которой каждый используемый источник Ь19 или общее количество используемого источника Ь19 вводят в дозах в количестве от 0,1 мг/кг и 100 мг/кг.

Особенно предпочтительным в этом изобретении является применение эксципиента, который будет способствовать доставке каждого из компонентов, определенных здесь, к клетке и/или в клетку. Предпочтительными являются эксципиенты, способные образовывать комплексы, наночастицы, мицеллы, везикулы, липосомы, протеолипосомы и/или вирус-подобные частицы (ΑΕΡ), которые доставляют каждый компонент, определенный здесь, в виде комплекса или в виде компонента, захваченного в везикуле или липосоме, через клеточную мембрану. Многие из этих эксципиентов известны в данной области. Подходящие эксципиенты содержат полиэтиленимин (ΡΕΙ) или подобные катионные полимеры, включающие в себя сополимеры полипропиленимина или полиэтиленимина (ТЕС) и производные, синтетические амфифилы (δΑΙΝΤ-18), липофектин™, ΌΟΤΑΡ и/или вирусные капсидные белки, которые способны

- 8 025202 самособираться в частицы, которые могут доставлять каждый компонент, определенный здесь, в клетку.

В зависимости от их идентичности, квалифицированный в данной области специалист будет знать, какой тип препарата является наиболее подходящим для каждого компонента, определенного здесь. В одном предпочтительном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает композицию или препарат, которые находятся в форме набора частей, содержащих источник Ь19, описанный здесь.

Лекарственное средство или лекарственный препарат или фармацевтическая композиция, описанные здесь, могут вводиться локально или системно. Лекарственный препарат предпочтительно вводят парентерально, например, инъекцией или инфузией внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутрикожным, внутриартериальным способом или локальным способом внутрь повреждения. Предпочтительным способом введения является подкожное или чрескожное введение. Одним примером чрескожного введения является применение крема. Это изобретение не ограничивается одним конкретным способом введения лекарственного средства или источника Ь19 или композиции, определенных здесь. Предпочтительным способом введения является пероральное введение с использованием капсулы или таблетки. Альтернативно, лекарственный препарат или источник Ь19 или композиция, определенные здесь, могут вводиться локально через катетер или насос, или суппозиторий или крем. Альтернативно, лекарственный препарат или источник Ь19 или композиция, определенные здесь, могут вводиться местно. Препарат лекарственного средства или источник Ь19 или композиции, определенные здесь, зависят от предполагаемого способа введения и (терапевтического) применения. Фармацевтический носитель может быть любым совместимым, нетоксичным веществом, подходящим для доставки указанного соединения субъекту. Например, в качестве носителя могут быть использованы стерильная вода или инертные твердые вещества или эксципиенты, обычно дополненные фармацевтически приемлемыми адъювантами, буферными агентами, диспергирующими агентами и т.п. Композиции будут находиться либо в жидкости, например, стабилизированной суспензии указанного соединения, или композиции, содержащей указанное соединение, либо в твердой и/или сухой формах: например, порошке. Для перорального и ректального введения, указанное соединение может быть введено в твердых лекарственных формах, таких как капсулы, таблетки, суппозитории и порошки, или в жидких лекарственных формах, таких как эликсиры, сиропы, крем, мазь и суспензии. Другой формой может быть полутвердая или полужидкая форма, где указанное соединение присутствует в виде жидкой формы в твердом носителе или на твердом носителе, таком как пластырь.

Композиция может находиться в жидкой, твердой или полужидкой или полутвердой формах, как уже определено здесь.

В одном предпочтительном варианте осуществления, другие соединения используются последовательно или одновременно с источником или композицией Ь19 для улучшения специфичности терапевтического или профилактического лечения. Например, выгодно использовать другие соединения, которые будут дополнительно усиливать противовоспалительную реакцию получающего лечение субъекта. Более предпочтительно, такие соединения не присутствуют в единой композиции вместе с источником или композицией Ь19. Таким соединением может быть антитело, ΌΜΑΚΌ (модифицирующие заболевание противоревматические агенты), Ν8ΑΙΌ (Нестероидные Противовоспалительные Агенты) и/или индуктор 1Ь-10, такой как индукторы, описанные в табл. 1 (13). Индуктор 1Ь-10 включает в себя соединение, выбранное из группы, состоящей из: кордицепина, соли золота, кортикостероида, циклоспорина А, 8Т1959 3-(2-этилфенил)-5-(3-метоксифенил)-1Н-1,2,4-триазола, 8К 31747А, 88К 125329А, апротинина, линомида, монометилфумарата, цАМФ-повышающих агентов, таких как ролипрам или цикапрост, катехоламина, витамина Ό3, рыбьего жира, содержащего η-3-полиненасыщенную жирную кислоту, полового гормона эстриола, ΚΜ 2210 или бестрабуцила, и ΙΡΝ типа I, такого как ΙΡΝ-τ, ΙΡΝ-α или ΙΡΝ-β, мимического аутоантигена, такого как ацетат глатирамера (сополимера Ι), пиримидилпиперазин или его производное, дихлорид 1-этил-3-(3-диметил аминопропил) мочевины, 5'-метилтиоаденозин и пирфенидон, такой как 5метил-1-фенил-1Н-пиридинон.

Применение

В дополнительном аспекте обеспечено применение источника Ь19 или композиции, определенных здесь, для изготовления лекарственного средства для предотвращения или лечения воспалительного нарушения в индивидууме. Каждый признак указанного применения был определен здесь ранее.

Лечение в применении или в способе по этому изобретению состоит из по меньшей мере одной недели, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере нескольких месяцев, по меньшей мере одного года, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 лет или более. Каждый источник Ь19, определенный здесь, для применения в соответствии с этим изобретением, может быть подходящим для прямого ίη νίνο, ίη νίΐτο или ех νίνο введения в клетку, ткань и/или орган индивидуумов, пораженных воспалительным нарушением или находящихся при риске развития воспалительного нарушения, и может быть введен непосредственно ίη νίνο указанным индивидуумам. Частота введения источника Ь19 или композиции этого изобретения может зависеть от нескольких параметров, таких как возраст пациента, количество молекул (т.е. доза), приготовления указанной молекулы. Эта частота может быть частотой один раз в день, один раз в неделю или находиться в диапазоне между по меньшей мере один раз в две недели или три недели, или четыре недели, или пять недель, или более продолжительным периодом времени.

- 9 025202

Способ

В одном дополнительном аспекте, обеспечен способ для облегчения одного или нескольких симптомов воспалительного нарушения в индивидууме, в клетке, ткани или органе указанного индивидуума или облегчения одной или нескольких характеристик или симптомов индивидуума или клетки, ткани или органа указанного индивидуума, где этот способ предусматривает введение указанному индивидууму источника Ь19 или композиции, определенных здесь.

В одном варианте осуществления указанный способ выполняют ίη νίίτο, например, с использованием культуры клеток или культуры ткани. Указанный способ может быть также выполнен ех νίνο. Предпочтительно, указанный способ выполняют ίη νίνο. Каждый признак этих способов уже был определен здесь. В одном способе этого изобретения, источник Ь19 может быть объединен с дополнительным соединением, о котором известно, что оно используется для лечения воспалительного нарушения в индивидууме. Таким соединением может быть антитело, ΌΜΆΚΌ (модифицирующие заболевание противоревматические агенты), Ν3ΆΙΌ (Нестероидные Противовоспалительные Агенты) и/или индуктор 1Ь-10, такой как индукторы, описанные в табл. 1 (13).

Предпочтительные индукторы 1Ь-10 уже были идентифицированы ранее.

Определения

Молекула нуклеиновой кислоты.

Молекула нуклеиновой кислоты может быть кДНК или синтетической ДНК. Эта ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной и, если она является одноцепочечной, может быть кодирующей цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. ДНК или РНК со скелетом молекулы, модифицированным для стабильности или по другим причинам, являются дополнительной частью этого изобретения. Молекула нуклеиновой кислоты представлена нуклеотидной последовательностью. Нуклеотидная последовательность может быть аллельным вариантом нуклеотидной последовательности по этому изобретению. Если желательно, эта нуклеотидная последовательность может быть приготовлена или изменена синтетически таким образом, что могут быть выгодно использованы известные преференции (предпочтения) кодонов предполагаемой экспрессии хозяина. В зависимости от размера молекулы нуклеиновой кислоты, она могла бы быть идентифицирована как являющаяся олигонуклеотидом.

Олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 нуклеотидов.

Полипептид.

В данном контексте термин полипептид относится к любому пептиду, олигопептиду, полипептиду, продукту гена, продукту экспрессии или белку. Полипептид представлен аминокислотной последовательностью. Она может содержать от 2 до 267 (т.е. иметь длину ЗЕО ГО N0:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29) или 5-265 или 8-260 или 10-250 аминокислот. Она может содержать более 267 аминокислот. Термин полипептид включает в себя природно-встречающиеся или синтетические молекулы. Олигопептид может содержать 2-20 аминокислот. Пептид может содержать 5-10 или 5-20, или 5-30, или 5-50 аминокислот.

Идентичность/сходство.

Идентичность последовательности определяется здесь как родство между двумя или более аминокислотными (полипептидом или белком или пептидом или фрагментом белка) последовательностями или двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот (полинуклеотидом, нуклеиновой кислотой или нуклеотидом или олигонуклеотидом), как определяется сравнением этих последовательностей. В одном предпочтительном варианте осуществления, идентичность последовательности рассчитывают на основе полной длины двух конкретных ЗЕО ГО N0 или их части. Их часть предпочтительно означает по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 100% обеих ЗЕО ГО N0. В данной области, идентичность также обозначает степень родства последовательности между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот, в зависимости от того, какие последовательности исследуются, определяемую сопоставлением между цепями таких последовательностей.

Сходство между двумя аминокислотными последовательностями определяют сравнением аминокислотной последовательности и ее консервативных аминокислотных замен одного полипептида с последовательностью второго полипептида. Идентичность и сходство могут быть легко рассчитаны известными способами, в том числе, но не только, способами, описанными в (СотрШа1юпа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк, А. М., ей., ОхГогй ишуегЩу Рге88, Νον Уогк, 1988; ВюсотриЛпд: 1пГогтаЛс8 апй Оепоте РгсдеОк, ЗтПк Ό. ей., Асайетк Рге88, №ν Уогк, 1993; Сотрикг Апа1у818 оГ Зедиепсе Όαία, Рай I, ОпГЛщ А. М., апй ОгГГш, Н. О., ей8., Нитапа Рге88, №ν 1ег8еу, 1994; Зедиепсе Апа1у818 ίη Мо1еси1аг Βίο1оду, νοη Неше, О., Асайетк Рге88, 1987; и Зедиепсе Апа1у818 Рптег, Опаком М. апй Оехегеих, ί., ей8., М Зксккп Рге88, №ν Уогк, 1991; и СагШо, Н., апй Ь1ртап, Ό., З1АМ ί. Аррйей МаШ., 48:1073 (1988).

Разработаны предпочтительные способы для определения идентичности для получения наибольшей совместимости между тестируемыми последовательностями. Способы для определения идентичности и сходства запрограммированы в публично доступных компьютерных программах. Предпочтительные способы компьютерных программ для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают в себя, например, пакет программ ОСО (^еνе^еиx, ί., еί а1, ШСею Аай8 Ке8еагск

- 10 025202 (1): 387 (1984)), ΒβκίΡίΐ, ВЬЛ8ТР, ΒΕΆ8ΤΝ, апб РА8ТА (А11ксЬи1, 8. Р. е! а1, 1. Μοί. ΒίοΙ. 215:403-410 (1990). Программа ВЬЛ8Т X публично доступна из ΝΟΒΙ и других источников (ВЬЛ8Т Мапиа1, А11ксЬи1, 8., е! а1, ΝΟΒΙ ΝΕΜ ΝΙΗ Β^κύ^ ΜΌ 20894; А11ксЬи1, 8., е! а1, 1. Μο1. Βίο1. 215:403-410 (1990). Для определения идентичности может быть также использован хорошо известный алгоритм 8тйЬ \Уа1егтап.

Предпочтительные параметры для сравнения полипептидных последовательностей включают в себя следующие: Λ^οπίΐιιη: №еб1етаи апб ХУипкск. 1. Μο1. Βίο1. 48:443-453 (1970); Сотрапюп та!й\: ΒΕΘ88υΜ62 Ггот НепШтоГГ апб НепЫтой; Ргос. №11. Асаб. 8сг И8Л. 89: 10915-10919 (1992); Сар РепаИу: 12; апб Сар Ьепд!Ь Репа11у: 4. Одна программа, применимая с этими параметрами, публично доступна как программа Одар из Сепейск Сοтри1е^ Сгоир, находящейся в Μаб^кοп, VI. Вышеуказанные параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения аминокислот (вместе с ιτο репа11у для конечных гэпов).

Предпочтительные параметры для сравнения нуклеиновых кислот включают в себя следующие: А1дοй1йт: №ей1етап апб ^ипксй, 1. Μο1. Βίο1. 48:443-453 (1970); Сοтра^^кοп тайт\: та!сЬек=+10, т1кта!сЬ=0; Сар Репа11у: 50; Сар Ьепд1й Репа11у: 3. Доступные из программы Сар из Сепейск Сοтри1е^ Сгоир, расположенные в Μаб^кοη, \νίκ. Выше даны параметры по умолчанию для сравнений нуклеиновых кислот.

Необязательно, в определении степени сходства аминокислот квалифицированный в данной области специалист может также учитывать так называемые консервативные аминокислотные замены, как будет ясно квалифицированному в данной области специалисту. Консервативными аминокислотными заменами называют взаимозаменяемость остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группой аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, являются глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группой аминокислот, имеющих алифатические-гидроксильные боковые цепи, являются серин и треонин; группой аминокислот, имеющих амидсодержащие боковые цепи, являются аспарагин и глутамин; группой аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, являются фенилаланин, тирозин и триптофан: и группой аминокислот, имеющих щелочные боковые цепи, являются лизин, аргинин и гистидин; и группой аминокислот, имеющих серу-содержащие боковые цепи, являются цистеин и метионин. Предпочтительными консервативными группами аминокислотных замен являются: валин-лейцинизолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Варианты с заменами аминокислотной последовательности, описанной здесь, являются варианты, в которых по меньшей мере один остаток в описанных последовательностях был удален, а другой остаток был инсертирован на его место. Предпочтительно, аминокислотная замена является консервативной. Предпочтительные консервативные замены для каждой из природно-встречающихся аминокислот являются следующими: А1а для кег; Агд для 1ук; Акп для д1п или йк; Акр для д1и; Сук для кег или а1а; Сш для акп; С1и для акр; С1у для рго; Нй для акп или д1п; 11е для 1еи или уа1; Ьеи для 11е или уа1; Ьук для агд; д1п или д1и; Μе1 для 1еи или йе; РЬе для те!, 1еи или 1уг; 8ег для !Ьг; ТЬг для кег; Тгр для 1уг; Туг для 1гр или рЬе; и Уа1 для йе или 1еи.

Условия гибридизации

Условия гибридизации для молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь низкую или среднюю, или высокую строгость (процедуры блоттинга по Саузерну). Условия низкой или средней или высокой строгости обозначают предгибридизацию и гибридизацию при 42°С в 5х 88РЕ, 0,3% ДСН, 200 пг/мл подвергнутой силе сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося, и либо 25%, или 35%, или 50% формамида для низкой или средней или высокой строгостей, соответственно. Затем, реакционную смесь гибридизации промывают три раза в течение 30 минут каждый раз с использованием 2х 88С, 0,2% ДСН и или 55°С, или 65°С, или 75°С для низкой или средней или высокой строгостей, соответственно.

Конструкт нуклеиновой кислоты/экспрессия/регуляторные последовательности

Конструкт нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок или фрагмент белка, определенные здесь. Конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты для конкретного белка или фрагмента белка, описанных здесь, будет гарантировать экспрессию этой конкретной молекулы нуклеиновой кислоты и соответствующего белка или фрагмента белка в получающем лечение субъекте. В более предпочтительном варианте осуществления, конструкт нуклеиновой кислоты содержит более одной молекулы нуклеиновой кислоты, причем каждая молекула нуклеиновой кислоты кодирует конкретный белок или фрагмент белка. В еще более предпочтительном варианте осуществления, конструкт нуклеиновой кислоты содержит две, три, четыре молекулы нуклеиновой кислоты, причем каждая молекула нуклеиновой кислоты кодирует конкретный белок или фрагмент белка. В одном предпочтительном варианте осуществления, конструкт нуклеиновой кислоты содержит экспрессионную кассету, причем указанная кассета содержит каждую требуемую молекулу нуклеиновой кислоты. Каждая молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с другой присутствующей молекулой нуклеиновой кислоты. Наиболее предпочтительно, подходящий промотор функционально связан с экспрессионной кассетой для гарантии экспрессии этой молекулы нуклеиновой кислоты в субъекте.

Функционально связанная определяется здесь как конфигурация, в которой регуляторная последовательность подходящим образом помещена в положении относительно нуклеотидной последователь- 11 025202 ности, кодирующей полипептид этого изобретения, таким образом, что эта регуляторная последовательность управляет продуцированием/экспрессией полипептида этого изобретения в клетке и/или субъекте.

Будет понятно, что экспрессия будет включать в себя любую стадию, участвующую в продуцировании этого полипептида, в том числе, но не только, транскрипцию, пост-транскрипционную модификацию, трансляцию, пост-трансляционные модификации и секрецию.

Регуляторная последовательность, как определено здесь, включает в себя все компоненты, которые являются необходимыми или выгодными для экспрессии полипептида. При минимуме, эти регуляторные последовательности включают в себя промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Необязательно, промотор, представленный нуклеотидной последовательностью, присутствующей в конструкте нуклеиновой кислоты, функционально связан с другой нуклеотидной последовательностью, кодирующей молекулу нуклеиновой кислоты, идентифицированной здесь.

Экспрессирующим вектором может быть любой вектор, который может быть удобным образом подвергнут процедурам рекомбинантных ДНК и может запускать экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид этого изобретения, в клетке и/или в субъекте. В данном контексте термин промотор относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует для регуляции транскрипции одного или нескольких генов или нуклеиновых кислот, расположенных выше по ходу транскрипции (слева) от сайта инициации транскрипции этого гена, и относится к сайту связывания, идентифицированному присутствием сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов связывания инициации транскрипции и любых других ДНК-последовательностей, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, сайты связывания транскрипционного фактора, сайты связывания белка репрессора и активатора и любых других последовательностей нуклеотидов, известных квалифицированному в данной области специалисту, для действия прямо или опосредованно для регуляции величины транскрипции от промотора. В контексте этого изобретения, промотор предпочтительно заканчивается при нуклеотиде-1 стартового сайта транскрипции (Т88).

Если нет других указаний, каждый вариант осуществления, описанный здесь, может быть объединен с другим вариантом осуществления, описанным здесь.

В этом документе и в его формуле изобретения глагол содержать и его спряжения используются в не ограничивающем его смысле, означая, что предметы после этого слова являются включенными, но не упоминаемые предметы не являются исключенными. Кроме того, глагол состоять может быть заменен состоит по существу, что означает, что источник Ь19 или композиция, определенные здесь, могут содержать дополнительные (другие) компоненты, чем компоненты, идентифицированные специфически, причем указанные дополнительные компоненты не изменяют уникальной характеристики этого изобретения.

Кроме того, ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности, что присутствуют более одного из этих элементов, пока этот контекст не требует ясно, чтобы имелся один и только один из этих элементов. Таким образом, единственное число обычно обозначает по меньшей мере один.

Слово приблизительно или около в применении в ассоциации с численной величиной (приблизительно 10, около 10) предпочтительно означает, что эта величина может быть этой величиной 10 или большей или меньшей на 1% величиной.

Все патентные и литературные ссылки, цитируемые в данном описании, включены здесь тем самым посредством ссылок в их полном виде. Каждый вариант осуществления, идентифицированный здесь, может быть объединен вместе с другими, если нет других указаний.

Это изобретение дополнительно объясняется в следующих примерах. Эти примеры не ограничивают объем этого изобретения, а служат только для разъяснения этого изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Очистка Й18-ЕтЕ19. Гель 8Ό8-ΡΑΟΕ, показывающий различные стадии в очистке белка гЬтЕ19. (1) Стандарт молекулярной массы. Общие бактериальные экстракты после прохождения колонки (2) и перед прохождением колонки (3). (4) Очищенный белок.

Фиг. 2. Продуцирование ΙΡΝ-гамма и 1Ь-10 спленоцитами не подвергнутых воздействию мышей ВЛЬВ/е (п=6), стимулированных ίη νίίτο ЬтЕ19. Показана величина Р, полученная после статистического анализа, выполняемого посредством ί-критерия Стьюдента. Различия в продуцировании цитокинов между стимулированными ЬтЕ19 или Конканавалином А (СопА) клетками считали значимыми, когда Р<0,05*).

Фиг. 3. Продуцирование ΙΡΝ-гамма и 1Ь-10 РВМС здоровых людей-доноров, стимулированных ίη νίίτο ЬтЕ19. Показана величина Р, полученная после статистического анализа выполняемого посредством ί-критерия Стьюдента. Различия в продуцировании цитокинов между стимулированными ЬтЕ19 или СопА клетками считали значимыми, когда Р<0,05*).

Фиг. 4. Схематическое представление рекомбинантного белка МВР-ЕтЕ19.

Фиг. 5. Концентрация ΤΝΡα в различных группах исследования после 24 ч инкубации (пг/мл). Эти величины представлены в виде среднее ± стандартное отклонение. #; р<0,005, тест-группы без облучения в сравнении с группой Контроля*; р<0,005, облученные тест-группы в сравнении с Контролем/УФ- 12 025202 группой.

Фиг. 6. Концентрация ГЙ-10 в различных группах исследования после 24 часов инкубации (пг/мл). Эти величины представлены в виде среднее ± стандартное отклонение. #; р<0,005, тест-группы без облучения в сравнении с группой Контроля*; р<0,005, облученные тест-группы в сравнении с Контролем/УФ-группой.

Фиг. 7. Продуцирование ГЙ-10 с пептидом ЬтЬ19. Клетки получали и культуры обрабатывали, как указано в тексте. Уровень ГЙ-10 в культуральных супернатантах анализировали при помощи ЕЬ1§А. Этот анализ выполняли один раз с использованием объединенных клеток, полученных из трех не подвергнутых воздействию мышей (анализ выполняли в двух повторностях). *р<0,05 при сравнении каждой группы с нестимулированными клетками.

Примеры

Пример 1. Клонирование и экспрессия.

Этот ген характеризовали после поиска ίη ыПсо в базе данных генома Ь. та_)ог. На основе этой последовательности синтезировали два олигонуклеотида (см. ниже) и использовали в качестве праймера для ПЦР с использованием ДНК, экстрагированной из паразитов Ь. та)ог [клон VI (МНОМДЬ/ 80(Ρτίθά1ίη)]. Полученную ДНК расщепляли ВатШ/НшйШ, клонировали в соответствующих сайтах плазмиды рВ1ис5Спр1 и секвенировали. Полученная последовательность ДНК и расшифрованная аминокислотная последовательность показаны ниже, соответственно.

A. Используемые олигонуклеотиды.

ЬшЫЭО: сдССАТССАТСАССССТСТСТСССТСТС (5Е<2 Ιϋ N0:3) (подчеркнутый сайт разрезания ВатН1 был включен для целей клонирования).

ЬтЫЭК: сссААОСТТТТАСТТСТТССАСТТСТТСАС [ЗЕО ΙΌ N0:4) (подчеркнутый сайт разрезания ΗίηάΙΙΙ был включен для целей клонирования).

B. Нуклеотидная последовательность. (Сайты разрезания рестрикционными ферментами включены и помечены курсивом и подчеркнуты: эти сайты не принадлежат к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей Ь19, из Ье18Йатша та|ог или Ьт)

Анализ последовательности ЬтЕ19 (8ЕЦ ГО N0:2 является последовательностью ниже без подчеркнутой последовательности, добавленной для целей клонирования)

ССАТССАТСА ССССТСТСТС ССТСТСТТСС	ТССССССАСА	СТТТТААССА
СААССАААСС	САСААСАТСС	ТСТСТСТСАА	ССТССАСССТ	ССССТТСССТ
ССАССАТССТ	ССССТССССС
сссесссссе тстосстсса ссссаассас	ССССТ6САСА	ТССАСААССС
6ААСТССССС	ААСАСССТСС	ССААССТСАТ	СААССАТССС	ТТСАТСАТСС
ССААСССССТ	6ААССТССАС	ТССССССССС	ССТССССТАА	ААТСААССАС
СССААССАСА	ТССССССССА	СААСССССТТ	СССССССССС	АСССТАСССС
ССАССССССС	АТССССАССА	АССАСТТСТС	САТССССССС	СТССССАТТС
тссессссст	ССТССССААС ТАСССССССС АСААСААСАТ ТСАСССССАС

6ТСТАСС0СС АССТСТАСАТ СССССССААС	6СТААССТСТ	ТССССААСАА
ССССААССТТ	СТССАССАСА	ТССАСААСАТ	СААСААТСАС	ААСААСААСС
АСССССАССТ	СССССАССАС	СТСССССССА	АССАССТССС	ССАССАССАС
ААССССААСА	АСССТС6САА	ССАССАССТС	ААСААССССС	АСААССАССС
ССАССССССС	АССССССАСС	АСССТССТСС	СССТССССАС	ААСААСААСС
СС6АСССССС	СААСАА6ТСС ССССС6ССТС СТСССААСТС СССССССССТ

ССССССААСС СТССТССССС ССССАССААС СССССТССТС СТСССССССС

САССААСССТ ССТССССССС ТСААСААСТС СААСААСТАА ААССТТ

С. Расшифрованная аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:1)

МТРЬЗЪЗЗЗК Η3ΓΚ0ΝΕΤ0Ν МУЗЬКЬОАРЬ	А551Ь6ССКА	Р.УИЬОРМЕА’/
ΕΙ0ΝΑΝ3ΡΚ5	такыкосгс	1РКРУКУНЗЕ	АКИРКМКЕАК	ϋΜΟΕΗΝΰνΟΕ
РЕСЗКЕАРМР	ЗКЕЪИМККЬР	ΙΙΛΚΙ,ΙΛΚΥΚ	АОККЮРНУУ	ΚϋΙ,ΥΜΕΑΚΟΝ
νΡΚΝΚΚΝΡνΕ	ΗΙΗΚΙΚΝΕΚΚ	КЕКОЬАЕОЬА	ΑΚΗΣΕΦΕΏΝΕ	ЫКАРВДЕЪКК
КЕКЕРЕРАРР	ООАААААОКК	КАРААККЗАА	РААКЗААРАА	ΚΑΑΑΡΑΤΚΑΑ
АААРАТКСАА	РУККЗКК*

ДНК, кодирующую ЕтЬ19, субклонировали в сайты Β;·ιιηΗΙ/ΗίηάΙΙΙ прокариотической экспрессионной плазмиды рЦЕ-30, что позволяет получить рекомбинантный белок, слитый с бх-гистидинами.

Культуры ЕксйепсЫа сой (штамм М15), трансформированной этой рекомбинантной плазмидой, ис- 13 025202 пользовали для экспрессии этого рекомбинантного белка. Первые анализы выполняли при 37°С, но авторы наблюдали, что этот белок деградировался внутри этих бактерий. По этой причине, культуры индуцировали при 30°С для уменьшения деградации белка. При этих условиях авторы наблюдали низкое продуцирование интактного рекомбинантного белка. Таким образом, гЬтЬ19 очищали аффинной хроматографией при денатурирующих условиях. Полученный очищенный белок представляет несколько полос деградации с более низкой молекулярной массой (фиг. 1). Эти рекомбинантные белки пропускали через полимиксин-агарозную колонку для удаления эндотоксинов.

Стимуляция клеток селезенки мыши рекомбинантным гЬтЬ19.

Препараты отдельных клеток из ткани селезенки высевали в двух повторностях в 24-луночных планшетах при 5х10⁶ клетках на мл. Клетки инкубировали в полной среде ΡΡΜΙ, дополненной 2 мМ Ьглутамином, пенициллином (100 Е/мл), стрептомицином (100 мкг/мл) и 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой (отдельно) (фоновый контроль; среда), или стимулировали гЬтЕ19 (12 мкг/мл) или СопА (1 мкг/мл) при 37°С в 5% СО₂ в течение 72 ч. Выделение ΙΡΝ-гамма и 1Ь-10 в культуральных супернатантах оценивали с использованием сэндвич-ЕШЗА (фиг. 2). Можно было сделать вывод, что рекомбинантный белок ЬтЕ19 индуцировал специфическое продуцирование 1Ь-10, без продуцирования ΙΡΝ-гамма клетками селезенки, полученными из не подвергнутых какому-либо воздействию мышей.

Стимуляция мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из людей с рекомбинантным гЕтЬ19.

РВМС получали из гепаринизированной венозной крови проведением через градиент Рюо11 Нурасще. РВМС промывали три раза и ресуспендировали при концентрации 5х10⁶ клеток/мл в ΡΡΜΙ, дополненной 2 мМ Ь-глутамином, пенициллином (100 Е/мл), стрептомицином (100 мкг/мл) (ШЬсо, ΝΥ) 10% инактивированной нагреванием сывороткой АВ человека). Клетки высевали в 24-луночных планшетах для культуры ткани при концентрации 5х 10⁶ клеток/мл и инкубировали при 37°С, 5% СО₂. Стимуляцию выполняли добавлением гЬтЕ19 (20 мкг/мл и 5 мкг/мл) и СопА (1 мкг/мл) в течение 72 ч. Как описано выше, выделение ΙΡΝ-гамма и 1Ь-10 в культуральных супернатантах оценивали с использованием сэндвич-ЕЬ1§А (фиг. 3).

Как наблюдали с клетками селезенки мыши, РВМС из здоровых доноров-людей продуцировали ГЬ10 после стимуляции рекомбинантным ЬтЕ19. Продуцирование этого цитокина было зависимым от дозы.

Экспрессия гЬтЕ19 в виде слитого белка со связывающим мальтозу белком.

Эти предварительные результаты показывали, что белок гЬтЕ19 был способен индуцировать высвобождение ΙΠ-10 из лейкоцитов мышей и человека. Уровень продуцирования этого рекомбинантного белка был все еще неоптимальным.

Для улучшения продуцирования белка ДНК, кодирующую белок ЬтЕ9, клонировали в прокариотический экспрессирующий вектор рМа1-с2. Этот вектор делает возможным продуцирование гетерологичных белков в Е. сой, слитых с бактериальным белком МВР. Как указано на фиг. 4, этот слитый белок и гетерологичный белок могут быть разделены с использованием специфической протеазы (Ха-фактора) вследствие присутствия сайта разрезания Ха-фактора между обоими белками.

Культуры Е. сой (штамм ХЬ1-Ь1ие), трансформированные этой рекомбинантной плазмидой, могут быть использованы для экспрессии этого рекомбинантного белка. Белок сверхэкспрессировался в виде растворимого продукта, который очищали аффинной хроматографией при нативных условиях в амилозных колонках. С использованием этой системы был получен более высокий уровень рекомбинантного белка (не показано).

Пример 2. Исследование кожи.

Целью этого изобретения было оценивание противовоспалителной способности белка, названного Ь19, в эксплантатах кожи человека. Это выполняли способом скрининга для исследования защитной эффективности этого белка против ультрафиолетового света (УФ) на коже.

Основой этого исследования является выполнение единственного воспалительного исследования на кожных эксплантатах для оценивания противовоспалительной способности указанного продукта против облучения УФ-светом. Это исследование разделяли на следующие задачи для достижения предполагаемой цели.

Скрининг фоновой цитотоксичности.

Единственный анализ выполняли с использованием способа МТТ для определения максимальной концентрации продукта, подлежащего анализу, в скрининге на эффективность. Этот способ является колориметрическим анализом на основе метаболического уменьшения солей тетразолия (МТТ) вследствие клеточного метаболизма (клеточного дыхания) фибробластов мыши (ВАЕВ/3Т3). Эта метаболическая редукция МТТ обусловлена митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназой, который производит синее соединение (формазан) и определяет митохондриальную функциональность обработанных клеток. Количество живых клеток является пропорциональным полученному синему цвету. Этот продукт инкубировали в 8 различных концентрациях (6 повторностях каждой концентрации) в течение 24 ч.

- 14 025202

Скрининг противовоспалительной эффективности Эффективность оценивали с использованием противовоспалительного исследования в единственном анализе на кожных эксплантатах, который анализировал два интерлейкина, присутствующих в воспалении, вызываемом УФ-облучением, с использованием способа ЕЫ8А.

Группы этого исследования были следующими.

Группа здорового контроля. 3 кожных эксплантата. Они не получали УФ-облучения.

Поврежденная группа. 3 кожных эксплантата, облученные УФ-светом.

Тест-группа. 9 кожных эксплантатов, облученных и затем инкубированных с Ьт Ь19 (ЗЕО ГО N0:1), экспрессированным в Е. сой.

Тест-группа 2. 9 кожных эксплантатов, не облученных и затем инкубированных с Ьт Ь19 (ЗЕО ГО N0:1), экспрессированным в Е. сой.

Три различные концентрации продукта, 3 повторности на концентрацию (наивысшую концентрацию определяли скринингом на токсичность продукта).

После облучения этих эксплантатов ультрафиолетовым светом, Ьт Ь19 (т.е. ЗЕО ГО N0:1), экспрессированный в Е. сой, инкубировали; спустя 24 часа авторы измеряли два интерлейкина, участвующих в воспалительных действиях, вызываемых ультрафиолетовым светом на коже, ГО-10 и ΤΝΡα.

Материалы и способы

Культуры клеток.

В качестве экспериментальной системы для скрининга цитотоксичности, это исследование использовало культуру клеток иммортализованной линии фибробластов мыши из клеточной линии ВАЬВ/ЗТЗ из Европейской Коллекции Культур Клеток (ЕСАСС) Сай Νο. 86110401.

Иммортализованные фибробласты из ЕСАСС росли в среде ΌΜΕΜ с 10% ФТС (Фетальная Телячья Сыворотка). После оттаивания, эти клетки культивировали в монослое в увлажненной атмосфере с 5% СО₂ при температуре 37°С. Во время этого периода эту культуральную среду сменяли каждые 2-3 дня в соответствии с инструкциями поставщика. После этого периода, когда культуральные колбы достигали конфлюэнтности 80%, эти клетки распределяли на 96-луночных планшетах при концентрации 5000 клеток на лунку.

Исследование цитотоксичности с конечной точкой, МТТ.

Во время анализа цитотоксичности, клетки обрабатывали различными концентрациями продукта исследования, известного как Ь19. После 24 часов обработки выполняли окрашивание МТТ. Этот анализ основан на метаболической редукции 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолбромида (МТТ) или солей тетразолия (желтых и растворимых), продуцируемых митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназой, который генерирует соединение синего цвета (формазан), которое делает возможным определение митохондриальной функциональности обработанных клеток. Этот способ широко используется для измерения выживаемости и пролиферации клеток. Количество живых клеток пропорционально количеству продуцированного фармазана. Поскольку мертвые клетки не дышат, они не предоставляют этот фермент и, следовательно, не могут редуцировать его, так как они не предоставляют сукцинатдегидрогеназу. Чем больше редукция в МТТ, тем более синим является цвет и тем большей является жизнеспособность клеток.

Этот эксперимент выполняли на 86-луночных планшетах с клетками 3Т3, растущими на монослое с 80% конфлюэнтностью. Эти исследования цитотоксичности позволили авторам изобретения определить величины ЬС80, ЬС50 и ЬС20 (концентрации продукта, которые уменьшают жизнеспособность клеток на 80%, 50% и 20%, соответственно).

Во время выполнения этой задачи, планшет иммортализованных фибробластов инкубировали с восемью различными концентрациями белка Ь19 в течение 24 ч (анализировали 1 планшет с продуктом с 6 повторностями на каждую анализируемую концентрацию) и второй контрольный планшет МТТ-анализа с додецилсульфатом натрия (ДСН) при восьми различных концентрациях (1 планшет с МТТ, с 6 повторностями на анализируемую концентрацию) в качестве ссылочного продукта токсичности. Эти данные использовали для установления стандартной кривой для гибели клеток. Все планшеты исследования также засевали фибробластами по меньшей мере в 12 лунках, которые использовали в качестве здоровых контролей, и культуры ЗТЗ только с культуральной средой, где Ь19 не добавляли в планшет исследования и ДСН не добавляли к контрольному планшету с гибелью клеток (Данные ДСН: ЬС20: 0,124 мг/мл; ЬС50: 0,142 мг/мл; ЬС80: 0,163 мг/мл).

Согласно концентрации белка Ь19, дополненного ЬЕТ1, наивысшая анализированная концентрация была 200 мкг/мл при разведениях 1:2. Эти используемые конечные концентрации представлены подробнее ниже: С2: С3: С4: С5:С6:С8: 1,56 мкг/мл.

После инкубирования эти планшеты проявляли с использованием МТТ и оптическую плотность измеряли при 540 нм с использованием планшет-ридера ЕП§А. Полученные результаты использовали для расчета величин летальной концентрации ЬС80, ЬС50 и ЬС20, в культурах фибробластов для исследуемых продуктов.

Анализ определения интерлейкина-10 и ΤΝΡα

- 15 025202

Количественный анализ интерлейкина-10 и ΤΝΡα выполняли с супернатантом культуральных сред кожных эксплантатов. Количественное определение как 1Ь-10, так и ΤΝΡα выполняли с наборами ΒΌ Ор1Е1А™ ЕЬГОА, изготовляемыми Вес1оп Опте, Етапкйп Ьаке5, N1. И8А): Нитап ΤΝΡ ЕЬ1§А Κίΐ II.

Эффективность Ь19 анализировали по количеству интерлейкинов, индуцированных УФоблучением на кожных эксплантатах человека.

Подвергание действию имитирующего солнечный свет источника света.

Планшет с пробами кожи подвергали действию УФ/видимого света, испускаемому имитатором солнечного света 8ОЬ 500 (Ότ. Ноп1е). Интенсивность света измеряли на всем процессе экспонирования измерителем УФ-света. Дозы облучения могут быть установлены (урегулированы) этими величинами с учетом того, что во время 5 мин экспонирования, эти клетки получают приблизительно 1 Дж/см² при этой интенсивности. Конечное время экспонирования кожных эксплантатов было 50 минут, при облучении 10 Дж/см².

Группы, включенные в это исследование.

Тест-группа. 9 кожных эксплантатов, облученных и затем инкубированных с Ьт Ь19 (8ЕО ГО N0:1), экспрессированным в Е. сой.

Тест-группа 2. 9 кожных эксплантатов, не облученных и затем инкубированных с Ьт Ь19 (8Е0 ГО N0:1), экспрессированным в Е. сой.

Три различные концентрации продукта, 3 повторности на концентрацию (наивысшую концентрацию определяли скринингом на токсичность продукта). После облучения этих эксплантатов ультрафиолетовым светом (10 Дж/см²) их инкубировали с продуктом Ь19. Спустя 24 ч, авторы измеряли два интерлейкина, участвующих в воспалительных действиях, вызываемых ультрафиолетовым светом на коже, 1Ь10 и ΤΝΡα.

ГО-10 и ΤΝΡα определяли количественно добавлением 100 мкл каждого из стандартов ГО-10 и ΤΝΡα, включенных в наборы, изготовляемые ΒΌ Вю8с1епс1е8 (ΒΌ Ор1Е1А™ ЕЬ1§А Ье15: ГО-10 Са1- №. 555157 апй ΤΝΡ Са1. №. 555212), а также 100 мкл культуральной среды, используемой для инкубирования каждой из этих проб, в каждом случае в виде двух повторностей, и инкубированием на планшетах ЕЬЙЗА при температуре окружающей среды в течение 2 ч. Затем эти лунки промывали ЗФР, 200 мкл конъюгированного раствора добавляли и инкубирование выполняли в течение 1 ч. Затем эти лунки промывали опять, 200 мкл раствора субстрата добавляли и инкубирование выполняли в течение 20 мин при температуре окружающей среды. Наконец, добавляли 50 мкл стоп-раствора и оптическую плотность считывали при 450 нм со ссылкой 540 нм. Эту оптическую плотность экстраполировали до величины ГО10 и ΤΝΡα, с использованием кривой, полученной со стандартами обоих цитокинов в качестве ссылки.

Результаты и обсуждение

Скрининг фоновой цитотоксичности.

Исследование цитотоксичности белка Ь19.

Для определения максимальной концентрации продукта исследования в скрининге эффективности, выполняли единственный анализ с использованием способа МТТ на иммортализованной линии фибробластов, ΒΛ^Β/3Τ3, которые высевали на 96-луночных планшетах с приближенной плотностью 5000 клеток на лунку. Этот продукт инкубировали в 8 различных концентрациях (в 6 повторностях каждой концентрации) в течение 24 ч.

Результаты этого анализа использовали для определения концентраций, необходимых для определения ЬС₈₀, ЬС50, и ЬС₂₀. ЬС является летальной концентрацией этого вещества. ЬС₈₀ является концентрацией этого вещества, при которой умирают 80% этой популяции клеток. ЬС₅₀ является концентрацией этого вещества, при которой умирают 50% этой популяции клеток, и ЬС₂₀ является токсической концентрацией этого вещества, при которой умирают 20% этой популяции культуры клеток.

В этих анализах, каждый планшет фибробластов инкубировали с 6 различными активными концентрациями в течение 24 ч: С2: С3: С4: С5:С6:С8: 1,56 мкг/мл.

После инкубирования эти планшеты проявляли для анализа с использованием МТТ и оптическую плотность измеряли при 540 нм с использованием планшет-ридера ЕЬЙЗА. Следующая таблица показывает ЬС80, ЬС50 и ЬС20, полученные для каждого продукта (табл. 1) без статистической значимости.

Таблица 1. Результаты для ЬС20, ЬС50 и ЬС80 белка Ь19 из ЬЕГО, полученные анализом цитотоксичности, МТТ

(мкг/мл)	ЬС80	ЬС50	ЬС20
1,19	485,83934	228,357	22,03021

Величины выражены в виде средней величины (мкг/мл).

Результаты этого анализа цитотоксичности получали с учетом величин оптической плотности, полученных в культурах здорового контроля, которые не инкубировали с продуктом Ь19 в качестве ссылки

- 16 025202

100% жизнеспособности. Так же как наблюдалось с величинами смерти клеток, жизнеспособность была равна 0% с продуктом ДСН при концентрации >175 мкг/мл (Данные ДСН: ЬС20: 0,124 мг/мл; ЬС50: 0,142 мг/мл; ЬС80: 0,163 мг/мл).

Вследствие результатов, полученных в анализе цитотоксичности, было решено, что для следующей задачи скрининга противовоспалительной эффективности белка Ь19, наивысшей концентрацией для тестирования этого продукта могла бы быть концентрация 25 мкг/мл, а также 12,5 мкг/мл и 6,25 мкг/мл.

Выбор наивысшей концентрации, 25 мкг/мл, относится к ЬС20. Эта величина является достаточной для анализа этого продукта на коже, так как она находится на границе минимальной токсичности для этого продукта. Следует отметить также, что скрининг токсичности выполняли в единственной культуре фибробластов.

Монокультуры являются всегда более чувствительными к токсичности продукта, чем органотипическая культура, такая как кожный эксплантат.

Скрининг противовоспалительной эффективности.

Исследование противовоспалительной способности белка Ь19 после облучения УФ-светом на кожных эксплантатах человека.

Обработку кожных эксплантатов человека белком Ь19 (25 мкг/мл, 12,5 и 6,25 мкг/мл в течение 24 ч) (Ьт Ь19 или §ЕЦ ГО N0:1) выполняли для исследования противовоспалительного эффекта этого белка. Эти группы исследований делили на эксплантаты, которые облучали УФ-светом и затем инкубировали с белком Ь19, и эксплантаты, которые подвергали действию этого продукта, но не облучали УФ-светом.

Это исследование выполняли на органотипических культурах кожных эксплантатов человека из косметической хирургии. Этот анализ использовал две контрольные группы; культуру без белка Ь19 или солнечного облучения и поврежденную контрольную группу без этого белка, но облучаемую солнечным светом. Концентрации и условия могут быть найдены ниже:

Контрольная группа: кожные эксплантаты в условиях нормальной культуры.

Группа Ь19-25 мкг/мл; кожные эксплантаты, инкубированные с 25 мкг/мл белка в течение 24 ч.

Группа Ь19-12,5 мкг/мл; кожные эксплантаты, инкубированные с 12,5 мкг/мл белка в течение 24 ч.

Группа Ь19-6,25 мкг/мл; кожные эксплантаты, инкубированные с 6,25 мкг/мл белка в течение 24 ч.

Контроль/УФ-группа: кожные экплантаты в условиях нормальной культуры и облучаемые УФсветом, 10 Дж/см².

Группа Π9-25 мкг/мл/УФ: кожные эксплантаты, облученные УФ-светом (10 Дж/см²) и затем инкубированные с 25 мкг/мл белка в течение 24 ч.

Группа Ь19-12,5 мкг/мл/УФ: кожные эксплантаты, облученные УФ-светом (10 Дж/см²) и затем инкубированные с 12,5 мкг/мл белка в течение 24 ч.

Группа Ь19-6,25 мкг/мл/УФ: кожные эксплантаты, облученные УФ-светом (10 Дж/см²) и затем инкубированные с 6,25 мкг/мл белка в течение 24 ч.

В конце инкубационного периода (24 ч) выполняли количественное определение на обоих цитокинах, ΙΡ-10 и ΤΝΡα, со способом ЕЫ§А для определения количества этих цитокинов. В этой задаче выполняли единственный анализ, в котором анализировали белок Ь19 из Лабораторий ЬЕТ! Этот анализ использовал 3 повторности каждого условия и каждую повторность анализировали способом ЕЫ§А в двух повторностях.

Концентрация ΤΝΡα (фиг. 5) и концентрация ГО-10 (фиг. 6) для этих групп исследования показаны ниже, как для кожных эксплантатов, облученных УФ-светом, так и для тех, которые не облучались. Фиг. 5 показывает продуцирование ΤΝΡα в кожных эксплантатах в условиях, которым они подвергались.

Воспалительная реакция, продуцируемая УФ-облучением в группе Контроль/УФ (153,9±44 пг/мл), является значимо более высокой, чем в контрольной группе без облучения (22,9±7,3 пг/мл). Это указывает на то, что облучение 10 Дж/см² УФ-света (в монокультуре, используемым облучением является нормально 1 Дж/см²) на кожных эксплантатах запускает воспалительную реакцию в этом случае. Эта реакция является достаточной, чтобы увидеть, имеет ли белок Ь19 противовоспалительные действия после инкубирования в кожных пробах, экспонированных этому уровню облучения.

Как показано на графике, статистическое исследование этого белка показывает, что продуцирование ΤΝΡα после облучения УФ-светом уменьшается значимо в эксплантатах, которые были инкубированы после этого (в течение 24 ч) с белком Ь19 при концентрациях 25 и 12,5 мкг/мл (23,3±2,8 и 25,9±4,8 пг/мл, соответственно). Группа Ь19-6,25 мкг/мл/УФ показала незначимое уменьшение в продуцировании указанного цитокина.

С другой стороны, этот график показывает также значимое увеличение продуцирования ΤΝΡα в группах Ь19-25 мкг/мл, Ь19-12,5 мкг/мл и Ь19-6,25 мкг/мл (которые не облучались) в сравнении с этой Контрольной группой. Все вышесказанное приводит авторов к выводу, что белок Ь19 может влиять на кожу некоторым образом, генерируя воспалительную реакцию. Эта последняя точка должна быть подтверждена дополнительными исследованиями.

Это значимое уменьшение в продуцировании ΤΝΡα в культурах с белком Ь19, обработанных после этого солнечной радиацией, против группы Контроль/УФ приводит авторов к мысли о том, что этот бе- 17 025202 лок может иметь противовоспалительное действие.

Фиг. 6 показывает продуцирование ГО-10 в кожных эксплантатах в условиях, которым они подвергались. Анализ ГЛ-10 как в облученной, так и в необлученной группах, инкубированных с белком Ь19, показывает значимое увеличение в продуцировании ГО-10 при всех концентрациях этого исследуемого белка в сравнении с необлученной Контрольной группой (#; р<0,005).

В статистическом исследовании, это увеличение наблюдали в меньшей степени против Контрольной группы, облученной УФ-светом, где только группа Ь19-12,5 мкг/мл/УФ предоставляет значимое увеличение (*; р<0,005), 363,7±22 пг/мл, против группы Контроль/УФ (203,1±77). Это обусловлено стандартными отклонениями в двух других группах исследования, Ь19-6,25 мкг/мл/УФ и Ь19-25 мкг/мл/УФ (366±94 и 724,8±288 пг/мл), что заставляет это статистическое исследование определять различия, более высокие, чем статистическая значимость 0,005. Увеличение в количестве повторностей могло бы улучшить эту статистическую значимость.

Полученные данные указывают на увеличение в продуцировании ГЛ-10. противовоспалительного цитокина, что подтверждает результаты, полученные для ЮТа, что приводит к возможности того, что белок Ь19 запускает противовоспалительный каскад в кожных эксплантатах, с увеличенным продуцированием ГО-10.

Выводы

В исследовании цитотоксичности, токсичность белка Ь19 была очень низкой при величинах 25 мкг/мл. Выбор 25, 12,5 и 6,25 мкг/мл для выполнения задачи 2 был основан на скрининге цитотоксичности. Облучение УФ-светом при 10 Дж/см³ производит значимый воспалительный эффект в пробах кожного эксплантата, не инкубированных с белком Ь19, и значимо увеличивает как уровни ЮТа, так и уровни ГЛ-10 (внутреннюю противовоспалительную реакцию в коже).

Белок Ь19 вызывает детектируемое уменьшение в продуцировании цитокина ШРа в пробах кожи, облученных УФ-светом.

Белок Ь19 производит общее увеличение в уровнях ГО-10 во всех группах, инкубированных с этим белком, как в отношении проб, которые подвергаются облучению УФ-светом, так и проб, которые не подвергаются этому облучению.

Согласно полученным результатам, способность белка Ь19 активировать противовоспалительное действие является очень высокой.

Пример 3. Обусловленное ГЛ-10 продуцирование ЬтЬ19 и произведенных из ЬтЬ19 пептидов.

Цель этого исследования

Определение, какие районы Ь19 (линейные эпитопы) способны индуцировать продуцирование ГО10 в культурах селезенки.

Материал

Конструировали и химически синтезировали двадцать четыре различных пептидов. Каждый из них соответствует линейному району белка Ь19 ЬсЫипаша та|ог (т.е. 8ЕО ГО N0:1). Каждый пептид содержит 20 аминокислот, произведенных из Ь19 ЬсЫипаша та|ог (т.е. 8Е0 ГО N0:1), за исключением пептида 24, который содержит только 14 аминокислот. Каждый пептид перекрывается с 9 аминокислотами предыдущего пептида.

1:	Пептид	1:	МТРЬЗЬЗЗЗЕНЗРКОИЕТОИ	(ЗЕО	ГО	ИО:	31)
2:	Пептид	2 :	3ΡΚΏΝΕ ТОЫМУЗЬКЬОАКЬА	(ЗЕО	ГО	ИО:	32)
3:	Пептид	3:	ЗЬКЬОАКЬАЗЗ ГЬСССКАКУ-	(ЗЕО	10	ИО:	33)
4:	Пептид	4 :	1ЬСССКАК™иЭРИЕАУЕ Ιβ	(ЗЕО	го	ИО:	34)
5;	Пептид	5:	БРИЕАУЕ10ИАИЗЕКЗУЕКЬ	(ЗЕО	го	НО:	35)
6:	Пептид	6:	ΝβκκενκΕα,ικοσρι ΙΕΚΡν	(ЗЕО	го	N0:	36)
7:	Пептид	7:	ОСП ΙΚΚΡνκνΗ3ΚΑΚΪίΚΚΜ	(ЗЕО	го	ИО:	37)
8:	Пептид	8:	НЗКАКНККМКЕАКОМСКНИС	(ЗЕО	го	ИО:	38)
9:	Пептид	9:	АКОМСКННСТСККЕСЗКЕАК	(ЗЕО	го	НО:	39)

10:	Пептид	10:	ЕгЕЕСЗКЕАЕМРЗКЕПИМЕКЬ	(ЗЕО	ГО	ИО:	40)
11:	Пептид	11:	ЗКЕЬТО4ККЬК1ЬККЪЫЖУК	(ЗЕО	ГО	ИО:	41)
12:	Пептид	12:	ЬККЬЪККУКАОККГОКНУТГК	(ЗЕО	ГО	ИО:	42)
13:	Пептид	13:	ΚΚΙΟΚΗνΥΚΟΙΎΜΚΑΚΟΝνΓ	(ЗЕО	ГО	N0:	43)
14 :	Пептид	14:	УМКАКСИУРКНКЕИЬУЕ НI н	(ЗЕО	ГО	N0:	44)
15:	Пептид	15:	ККИЬУЕН1НК1КИЕКККЕК0	(ЗЕО	го	ИО:	45)
16:	Пептид	16:	КИЕКККЕКОЬАЕОТААКНЬК	(ЗЕО	го	ИО:	46)
17:	Пептид	17:	ЕОЪААКНЪКОЕОИЕИКАККО	(ЗЕО	го	N0:	47)

18:	Пептид	18:	βΝΚΝΚΑΚΚβΕΙ,ΚΚΚΕΚΕΕΕΚ	(ЗЕО ГО ΝΟ: 48)
19:	Пептид	19:	КККЕКЕЕЕКАЕРЮЦАААААС	(ЗЕС ГО ΝΟ: 49)
20:	Пептид	20:	КООАААААОКККАОААККЗА	(ЗЕО 10 N0: 50,
21:	Пептид	21:	КАОААКК5ААРААК8ААРАА	(ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 51)
22 :	Пептид	22:	ААКЗААРААКАААРАТКААА	(ЗЕ52 ГО N0:52)
23:	Пептид	23:	ААРАТКАААААРАТКСААРУ	<ЗЕ2 ГО ΝΟ: 53)
24 :	Пептид	24:	РАТКЗААРУККЗКК (ЗЕО ГО N0: 54)

Целый рекомбинантный белок Ь19 (Ьт Ь19) ЬеЫипаша тафг (т.е. 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1), экспрессируемый в ЕксЬепсЫа οοΐί. использовали в качестве контроля.

Результаты

Клетки селезенки из не обработанных никакими воздействиями мышей ВАЬВ/с (5х10⁶ клеток/мл стимулировали (конечный объем 200 мкл) каждым индивидуальным пептидом (100 мкг/мл), смесью из 24 пептидов (100 мкг/мл), рекомбинантным белком ЬеЫипаша та/г, полученным из бактерии (12 мкг/мл), и не стимулировали. После 48 ч и 72 ч супернатанты собирали и количество ГО-10 измеряли при помощи ЕЫ8А, как описано здесь ранее.

Этот рекомбинантный ЬтЬ19, полученный в бактериях, был способен индуцировать синтез ГО-10 в клетках селезенки из необученных (необработанных) мышей. Ни один из этих пептидов не был способен индуцировать такое же количество ГО-10, какое индуцировалось этим белком. Однако статистически значимые количества ГО-10 индуцировались пептидами 1, 2, 12, 13, 14, 23 и 24.

Уровень индуцированного ГО-10 был более высоким спустя 72 ч после стимуляции во всех случаях. Текущие эксперименты с пептидами

Авторы этого изобретения повторяют эксперименты с новыми синтезированными пептидами для подтверждения полученных результатов. Согласно этим результатам, авторы этого изобретения используют те же самые пептиды, но включили 3 новых пептида, содержащие последовательности пептидов, которые индуцируют наивысшие уровни ГО-10. Композициями этих пептидов являются:

25: Пептид 1-2: МТРЬЗЬЗЗЗКНЗРК0ЫЕТ0ЫМУЗЪК142АК1А (3Εζ2 Ю N0:55)

26: Пептид 12-13-14:

ЬЕ^ЫЖУЕАОКК10ЕНУУЕПЬУМРАКСЫУРКЫКЕЫЬУЕН1Н (ЗЕ<2 ГО N0:56)

27: Пептид; 23-24: ААРАТКАААААРАТКОААРУККЗКК (3Εζϊ ГО

N0:57)

Пример 4: Модель животного для исследования противовоспалительного действия Ъ19

Цель

Целями этого изобретения являются: тестирование противовоспалительного действия активного вещества авторов изобретения, произведенного из Ьт Ь19 (т.е. 8ЕЦ ГО ΝΟ:1), экспрессируемого в Е. гоН и тестированного в ех νίνο культурах кишечной ткани, и исследование этого противовоспалительного действия в модели болезни Крона животного.

Методология

Для достижения этих целей будут предприняты две различные стадии.

1. Ιη νίΐτο анализы с мукозными эксплантатами из пациентов с болезнью Крона, здоровых контролей и здоровых проб, где воспаление было индуцировано ίη νίΐτο с РМА-иономицином. После 6 ч инкубирования проб с активным веществом, супернатанты будут анализированы на присутствие провоспалительных цитокинов, регуляторных цитокинов и хемокинов, таких как ΤΝΕα, ГО-10 и т.д.

РНК будут экстрагированы из различных тканей для анализа экспрессии генов, кодирующих цитокины, хемокины, факторы транскрипции и сигналы воспаления.

Ткани будут расщепляться для получения мукозных мононуклеарных клеток, где экспрессия некоторых клеток-маркеров будет изучаться для исследования различных состояний дендритных клеток после инкубирования. Популяция лимфоцитов будет также исследована для определения специфичности реакции на это активное вещество.

2. Ιη νίνο исследование противовоспалительного действия этого активного вещества с использованием мышиных воспалительных моделей, в которых хронический колит индуцируется в животных принятием внутрь питьевой воды с декстрансульфатом натрия (Ό88) в течение нескольких дней. Активное вещество будет инокулироваться подкожно в животных до и после обработки Ό88. Различные параметры, такие как количественное оценивание кишечного воспаления, будут измеряться для оценивания кишечного повреждения (14)-(25).

- 19 025202

Ссылки

1. ΖΙιοιι, X., еί а1, СиггеШ Эгид Тагде!к - Нптипе, Еп^сте & Μе!аЬο1^с Όικοι^γκ. 5(4), 2005, 465-475.

2. ΤοδΗίγϋΗ Υ., еί а1, Еигореап Киггей οί РЬа^тасο1οду. 533, 2006, 289-301.

3. Се188 Е., еί а1, Ιοιιπκιΐ οί !Ье Атег1сап Асайету οί ОегтаЮКду, 50(5), 2004, 657-675.

4. Сап-Сап Ь., еί а1, ТНе Киггей οί СНтса1 ^ек^а!^ 117(5), 2007, 1175-83.

5. \νοοΕ\\ Сигг.0рш. ВНеит. 3:407-20, 1999.

6. Уаη В1е1 Р.Ь.С.М., (2001), Век! Ргасйсе & КекеагсЬ СНтса1 ΚЬеита!ο1οду, 15: 67-76.

7. Сек!ег А.М., (1999), ВайНеге'к СНтса1 Iттиηο1οду, 13: 629-644.

8. №игаЙ1 е! а1. 1п1егп. Вег. ^титЕ 19:51-62, 2000.

9. Апп ВЬеит Όίκ 2005;64(Зирр1 II): ΪΪ65-ΪΪ68. άοΐ: 10.113 6/агй.2004.031237).

10. Ηοι^όο Υ., е! а1, Кигшй οί ^скИда^е ЭегтаЮКду (2005) 125, 659-664.

11. КгЬу В., е! а1, Вг I ВегтаЮ1 2000;142:728-32.

12. ВетшдЮп: ТНе Заепсе апй Ргасйсе οί РЬагтасу, 201Н Еййюп. Ва1!^тο^е, ΜΌ: υρρίικ:οΗ СйПатк & Сйкшк, 2000).

13. ΖΙιοιι X. Е! а1, (2005), Сигг. Эгид Тагде1к Iттиηе Еп^ст. ΜеίаЬο1. Όίκοιύ., 5(4): 465-475.

14. ЗагЮг КВ., Оавйцейего^ду 2008; 134 (2):577-94.

15. Ι’οιτιΗ К, е! а1, Си! 2002; 51: 659-664.

16. ΕογγικΙ К, е! а1, Ат I Са8!гоеп!его1 2003; 98: 865-870.

17. Саго1 М., е! а1, I Ьеикссуе Вю1 2006; 79: 917-922.

18. Μиηοζ-Р^ονеηс^ο Ό., е! а1, АгсЬ МсгоЬюР 2008 0с! 31.

19. Ε1ορίκ М., е! а1, 1пЙатт Εο\\ό1 Όίκ. 2009; 15: 275-283.

20. Ьидеа А., е! а1, Си! 2000; 46: 515-521.

21. У1Йе1а З., е! а1, Ат I Сак!гоеп!его1 2001; 96: 1486-1493.

22. Мейша С., е! а1, Зсапй I Сак!гоеп!его1 2001; 36: 1314-1319.

23. Мейша С., е! а1, Ат I РЬукю1 2003; 284: С116-С122.

24. У1йе1а З., е! а1, I РНагта^ Ехр ТЬег. 2006; 316: 940-945.

25. Уйе1а З., е! а1, 1йд Όίκ δοΐ 2007; 52: 45-51.

- 20 025202

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ЬаЬогабогЬоз ЬЕТ! 5Ь

<120>	Молекула для	лечения воспалительного	нарушения
<130>	Р6032062РСТ
<150>	ЕР 11165248.	3
<151>	2011-05-09
<150>	из 61/484,67
<151>	2011-05-09
<160>	57
<170>	РабепбТп уегзгоп 3.3
<210>	1
<211>	267
<212>	БЕЛОК
<213>	ЬейзЬтапха та^ог
<400>	1
Меб ТЬг	Рго Ьеи Зег	Ьеи Зег Зег Зег Агд ΗΪ3	Зег РЬе Ьуз О1п Азп
1	5	10	15
С1и ТЬг	С1п Азп Меб	Уа1 Зег Ьеи Ьуз Ьеи С1п	А1а Агд Ьеи А1а Зег
	20	25	30
Зег Не	ι Ьеи С1у Суз	С1у Агд А1а Агд Уа1 Тгр	Ьеи Азр Рго Азп С1и
	35	40	45
А1а Уа1	С1и 11е С1п	Азп А1а Азп Зег Агд Ьуз	Зег \7а1 Агд Ьуз Ьеи
50		55	60

- 21 025202

- 22 025202

А1а Ьуз Ьуз Зег АЬа АЬа Рго АЬа АЬа Ьуз Зег АЬа АЬа Рго АЬа АЬа 225 230 235 240

Ьуз АЬа АЬа АЬа Рго АЬа ТЬг Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа ТЬг 245 250 255

Ьуз СЬу АЬа АЬа Рго УаЬ Ьуз Ьуз Зег Ьуз Ьуз 260 265 <210> 2 <211> 804 <212> ДНК <213> ЬеЬзЬтапЬа тадог <400> 2 аЬдассссбс ЬсЬсссЬсЬс ЬСссЬсссдс сасадЬЬЬЬа адсадаасда аасдсадаас 60 аЬддСдЬсСс ЬдаадсЬдса ддсбсдссбб дсдбсдадса Ьссбсддсбд сддссдсдсс 120 сдсдбдЬддс Ьддассссаа сдаддсддЬд дадабссада асдсдаасбс дсдсаададс 180 дОдсдсаадс Рдабсаадда ЬддсббсаСс абссдсаадс сддбдааддб дсасбсдсдс 240 дсдсддбддс дГаааабдаа ддаддсдаад дасабддддс дссасаасдд сдб^дддсдс 300 сдсдадддЬа дссдсдаддс ссдсабдссд адсааддадЪ ГдЬддабдсд ссдссбдсдс 360 аббсЪдсдсс дссЬдсбдсд саадбассдс дсддасаада адаЬЬдассд ссасдЬдЬас 420 сдсдассСдЬ асаЬдсдсдс даадддСаас дСдССссдса асаадсдсаа ссССдСддад 480 сасаСссаса адаСсаадаа Сдадаадаад ааддадсдсс адсСддсдда дсадсСсдсд 540 дсдаадсасс Сдсдсдасда дсадаассдс аасааддсСс дсаадсадда дсСдаадаад 600 сдсдадаадд адсдсдадсд сдсдаддсдс дасдасдсСд сСдссдсСдс дсадаадаад 660

- 23 025202

ааддсддасд ссдсдаадаа	дЬссдссдсд	ссЬдсЬдсда	адЬссдссдс	дссСдссдсд	720
ааддсЬдсЬд сссссдссас	дааддссдсЬ	дсЬдсЪдссс	ссдссасдаа	дддрдсрдсд	780
ссддрдаада адЬсдаадаа	дЬаа				804
<2Ь0>	3
<211>	28
<212>	ДНК
<213>	искусственная
<220>
<223>	праймер
<400>	3
сдддарссаС дассссРсЬс	ЬсссЬсЬс				28
<210>	4
<211>	30
<2Ь2>	ДНК
<213>	искусственная
<220>
<223>	праймер
<400>	4
сссаадсРРЬ ЬасРЬсЬЬсд	асЬЬсРРсас				30
<210>	5
<211>	250
<212>	БЕЛОК
<213>	ЬеЬзЬтапЬа ЬгагЬЬЬепзЬз
<400>	5
МеЬ УаЬ Зег Ьеи Ьуз Ьеи СЬп АЬа	Агд Ьеи АЬа	Зег Зег ЬЬе	! Ьеи СЬу

- 24 025202

- 25 025202

165

170

175

СЬи Ьеи Ьуз Ьуз Агд СЬи Ьуз С1и Агд СЬи Агд АЬа Агд Агд Азр Азр 180 185 190

АЬа А1а А1а А1а А1а СЬп Ьуз Ьуз Ьуз АЬа Азр УаЬ АЬа Ьуз Ьуз Зег 195 200 205

АЬа АЬа Рго АЬа ТЬг Ьуз АЬа АЬа АЬа УаЬ Зег АЬа АЬа Ьуз АЬа АЬа 210 215 220

АЬа УаЬ Зег УаЬ Зег Агд АЬа АЬа АЬа АЬа УаЬ АЬа Рго АЬа АЬа Ьуз 225 230 235 240

Рго АЬа УаЬ Рго АЬа Ьуз Ьуз Зег Ьуз Ьуз 245 250 <210> 6 <211> 753 <212> ДНК <213> ЬеЬзЬтапЬа ЬгагЫЬепзЬз <400> 6 аЬддЬдЬсЕс ЬдаадсЕдса ддсЕсдссСс дсдЬсдадса РссСсддсЬд сддссдсдсс 60 сдсдЬдЬддс Ьддассссаа сдаддсдаСд дадаСссада асдсааасЬс дсдсаададс 120 дЬдсдсаадс Ьда^саадда ЬддсЬРсаЬс аЬЬсдЬаадс сддЬдааддй дсасйсдсдс 180 дсдсддЬддс дСаадаЬдаа ддаддсдаад дасаЪддддс дссасадсдд сдЬЕддссдд 240 сдсдадддЬа дссдсдаддс ссдсаРдссд адсааддадс ЬдЬддаЪдсд ссдссЬдсдс 300 аЬСсЬдсдЬс дссьдсЕдсд саадСассдс дсддасаада адаксдассд ссасдйдкас 360

- 26 025202 сдсдассРдР асдрдсдсдс даадддРаас дРдРРссдса асаадсдсаа ссРРаРддад 420 сасаРссаса адаРсаадаа сдадаадаад ааддадсддс адсРддсдда дсадсррдсд 480 дсдаадсасс адсдсдасда дсадсассдс аасааддсРс дсаадсадда дсРдаадаад 540 одсдадаадд адсдсдадсд сдсдаддсдс дасдасдсРд сРдсРдсРдс дсадаадаад 600 ааддсддасд РРдсдаадаа дРсРдсРдсс ссРдсРасда аддсРдсРдс РдРсРссдсс 660 дсдааддсРд сРдсРдгсРс сдРсРсдадд дсРдсРдсРд сРдРддсРсс сдсРдсдаад 720 ссРдсРдРдс сддсдаадаа дРсдаадаад Раа

753 <210> 7 <211> 271 <212> БЕЛОК <213> ЬеЬзЬтапЬа ЬгагШепзтз <400> 7

Мер УаЬ Зег Леи Ьуз Ьеи СЬп А1а Агд Ьеи А1а Зег Зег Не Ьеи СЬу 15 10 15

Суз СЬу Агд АЬа Агд УаЬ Тгр Ьеи Азр Рго Азп СЬи АЬа Мер С1и 11е 20 25 30

СЬп Азп А1а Азп Зег Агд Ьуз Зег УаЬ Агд Ьуз Ьеи 11е Ьуз Азр СЬу 35 40 45

РЬе 11е ЬЬе Агд Ьуз Рго УаЬ Ьуз УаЬ НЬз Зег Агд АЬа Агд Тгр Агд 50 55 60

Ьуз МеЬ Ьуз СЬи АЬа Ьуз Азр Мер СЬу Агд НЬз Зег СЬу УаЬ СЬу Агд

- 27 025202

70 75 80

Агд С1и С1у Зег Агд С1и А1а Агд Меб Рго Зег Ьуз С1и Ьеи Тгр Мей 85 90 95

Агд Агд Ьеи Агд Не Ьеи Агд Агд Ьеи Ьеи Агд Ьуз Туг Агд А1а Азр 100 105 110

Ьуз Ьуз 11е Азр Агд Нхз Уа1 Туг Агд Азр Ьеи Туг Уа1 Агд А1а Ьуз 115 120 125

С1у Азп Уа1 РЬе Агд Азп Ьуз Агд Азп Ьеи Меб С1и Нхз 11е Нхз Ьуз 130 135 140

11е Ьуз Азп С1и Ьуз Ьуз Ьуз С1и Агд С1п Ьеи А1а С1и С1п Ьеи А1а 145 150 155 160

А1а Ьуз Нхз С1п Агд Азр С1и С1п Нхз Агд Азп Ьуз А1а Агд Ьуз С1п 165 170 175

СХи Ьеи Ьуз Ьуз Агд С1и Ьуз С1и Агд С1и Агд А1а Агд Агд Азр Азр 180 185 190

А1а А1а А1а А1а А1а 61п Ьуз Ьуз Ьуз А1а Азр Уа1 А1а Ьуз Ьуз Зег 195 200 205

А1а А1а Рго А1а ТЬг Ьуз А1а А1а А1а Уа1 Зег А1а А1а Ьуз А1а А1а 210 215 220

А1а Уа1 Зег А1а А1а Ьуз А1а А1а А1а Уа1 Зег Уа1 Зег Агд А1а А1а

- 28 025202

225

230

235

240

АЬа

УаЬ

А1а

Рго

А1а

АЬа

Ьуз

Рго

АЬа

УаЬ

Рго

АЬа

Ьуз

АЬа

245

250

255

АЬа

Рго

АЬа

Ьуз

СЬу

АЬа

УаЬ

Рго

АЬа

Ьуз

5ег

Ьуз

260 265 270 <210> 8 <2Ы> 816 <212> ДНК <2ЬЗ> ЬеЬзЬтапЬа ЬгагЫЬепзЬз

<400> 8 аЬддЬдЬсЬс	ОдаадсЬдса	ддсЬсдссЬс	дсдЬсдадса	ЬссЬсддсЬд	сддссдсдсс	60
сдсдЬдЬддс	Ьддассссаа	сдаддсдаЬд	дадаСссада	асдсааасЬс	дсдсаададс	120
дйдсдсаадс	СдаЬсаадда	ЬддсЬЬсаЬс	аЬЬсдЬаадс	сддйдааддь	дсасЬсдсдс	180
дсдсддЬддс	дЬаадаЬдаа	ддаддсдаад	дасаЬддддс	дссасадсдд	сдЬЬддссдд	240
сдсдадддСа	дссдсдаддс	ссдсаЬдссд	адсааддадс	ЁдЬддаЬдсд	ссдссьдсдс	300
аЬЬсЬдсдЬс	дссЬдсЬдсд	саадЬассдс	дсддасаада	адаЬсдассд	ссасдЬдЬас	360
сдсдассЬдЬ	асдЬдсдсдс	даадддЬаас	дЬдСЬссдса	асаадсдсаа	ссЬЬаЬддад	420
сасаЬссаса	адаЬсаадаа	сдадаадаад	ааддадсддс	адсЬддсдда	дсадсЬЬдсд	480
дсдаадсасс	адсдсдасда	дсадсассдс	аасааддсСс	дсаадсадда	дсЬдаадаад	540
сдсдадаадд	адсдсдадсд	сдсдаддсдс	дасдасдсйд	сЬдсЬдсСдс	дсадаадаад	600
ааддсддасд	Ойдсдаадаа	дЬсЬдсЬдсс	ссЬдсЬасда	аддсЬдсЬдс	ЬдЬсЬссдсс	660
дсдааддсЬд	сЬдсЬдЬсЬс	сдссдсдаад	дсЬдсйдсЬд	ЬсЬссдЬсЬс	дадддсЬдсЬ	720

- 29 025202 дсЬдсЬдЬдд сЬсссдсЬдс даадссЬдсЬ дЬдссддсда аддсЬдсддс дссЬдсЬдсд 780 аадддЬдсЬд Ьдссддсдаа даадЬсдаад аадЬаа 816

<210>	9
<211>	176
<212>	БЕЛОК
<213>	ЬеЬзЬтапЬа ЬгагЫЬепзЬз
<400>	9

МеЬ 1

Агд Агд

Ьеи

Агд 5

11е

Ьеи

Агд Агд Ьеи Ьеи Агд 10

Ьуз

Туг Агд АЬа 15

Азр

Ьуз

Не

Азр

Агд

НЬз

Уа1

Туг

Агд

Азр

Ьеи

Туг

УаЬ

Агд

АЬа

20

25

30

Ьуз

С1у

Азп

7а1

РЬе

Агд

Азп

Ьуз

Агд

Азп

Ьеи

МеЬ

СЬи

НЬз

Не

НЬз

35

40

45

Ьуз

Не

Ьуз

Азп

С1и

Ьуз

СЬи

Агд

СЬп

Ьеи

АЬа

СЬи

СЬп

Ьеи

50

55

60

А1а

Ьуз

Н13

С1п

Агд

Азр

О1и

СЬп

НЬз

Агд

Азп

Ьуз

АЬа

Агд

Ьуз

65

70

75

80

С1п

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

СЬи

Ьуз

СЬи

Агд

СЬи

Агд

АЬа

Агд

Азр

85

90

95

Азр

АЬа

А1а

АЬа

С1п

Ьуз

АЬа

Азр

УаЬ

АЬа

Ьуз

100

105

НО

- 30 025202

Зег	А1а	А1а 115	Рго А1а	ТЬг Ьуз А1а А1а А1а Уа1 Зег А1а А1а Ьуз	А1а
120	125
А1а	АХа	УаХ	Зег А1а	АХа Ьуз А1а	А1а А1а Уа1 Зег Уа1 Зег Агд	АХа
	130			135	140
А1а	А1а	А1а	Уа1 А1а	Рго А1а АХа	Ьуз Рго А1а Уа1 Рго АХа Ьуз	АХа
145				Х50	155	160
АХа	А1а	Рго	АХа А1а	Ьуз С1у А1а	Йа1 Рго АХа Ьуз Ьуз Зег Ьуз	Ьуз
			165		170 175
<210>	10
<211>	531
<212>	БЕЛОК
<213>	ЬеХзЬтапЬа ЬгагШепвтз
<400>	10
А1а	ТЬг	СХу	Суз С1у	Суз Суз С1у	Суз Суз ТЬг 61у Суз С1у Суз	АХа
1			5		10 15
ТЬг	ТЬг	Суз	ТЬг С1у	Суз С1у ТЬг	Суз С1у Суз Суз ТЬг С1у Суз	ТЬг
			20		25 30
С1у	Суз	СХу	Суз А1а	А1а С1у ТЬг	А1а Суз Суз С1у Суз С1у Суз	СХу
		35		40	45
С1у	А1а	Суз	А1а А1а	С1у А1а А1а	СХу АХа ТЬг Суз С1у АХа Суз	Суз
	50			55	60

- 32 025202

- 33 025202

- 34 025202

<210>	11
<211>	245
<С212>	БЕЛОК
<213>	ЬеЬзСопапЬа Ьп£апСит
<400>	11

МеС УаЬ 1

Зег

Ьеи

Ьуз 5

Ьеи СЬп АЬа

Агд Ьеи 10

АЬа

Зег

11е

Ьеи 15

СЬу

Суз

СЬу

Агд

АЬа

Агд

УаЬ

Тгр

Ьеи

Азр

Рго

Азп

СЬи

АЬа

УаЬ

СЬи

11е

20

25

30

С1п

Азп

АЬа

Азп

Зег

Агд

Ьуз

Зег

УаЬ

Агд

Ьуз

Ьеи

Пе

Ьуз

Азр

СЬу

35

40

45

РЬе

Не

11е

Агд

Ьуз

Рго

УаЬ

Ьуз

УаЬ

НЬз

Зег

Агд

АЬа

Агд

Тгр

Агд

50

55

60

Ьуз

МеС

Ьуз

СЬи

АЬа

Ьуз

Азр

МеС

СЬу

Агд

НЬз

Азп

СЬу

УаЬ

СЬу

Агд

65

70

75

80

Агд

СЬи

61 у

Зег

Агд

СЬи

АЬа

Агд

МеС

Рго

Зег

Ьуз

СЬи

Ьеи

Тгр

МеС

Θ5

90

95

Агд

Ьеи

Агд

11е

Ьеи

Агд

Ьеи

Агд

Ьуз

Туг

Агд

АЬа

Азр

100

105

110

Ьуз

Ые

Азр

Агд

НЬз

УаЬ

Туг

Агд

Азр

Ьеи

Туг

УаЬ

Агд

АЬа

Ьуз

115

120

125

СЬу

Азп

УаЬ

РЬе

Агд

Азп

Ьуз

Агд

Азп

Ьеи

УаЬ

СЬи

НЬз

Т1е

НЬз

Ьуз

- 35 025202

130

135

140

Не Ьуз Азп С1и Ьуз Ьуз Ьуз СЬи Агд СЬп Ьеи АЬа СЬи СЬп Ьеи АЬа 145 150 155 160

АЬа Ьуз НЬз Ьеи Агд Азр СЬи СЬп Азп Агд Азп Ьуз АЬа Агд Ьуз СЬп 165 170 175

СЬи Ьеи Агд Ьуз Агд СЬи Ьуз СЬи Агд СЬи Агд АЬа Агд Агд Азр Азр 1Э0 185 190

АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп Ьуз Ьуз Ьуз АЬа Азр АЬа АЬа Ьуз Ьуз Зе! 195 200 205

АЬа АЬа Рго АЬа АЬа Ьуз Зег АЬа АЬа Рго АЬа АЬа Ьуз Зег АЬа АЬа 210 215 220

Рго А1а А1а Ьуз УаЬ АЬа АЬа Рго АЬа ТЬг Ьуз СЬу АЬа АЬа Рго УаЬ 225 230 235 240

Ьуз Ьуз Зег Ьуз Ьуз 245

<210>	12
<211>	738
<212>	ДНК
<213>	ЬеЬзЬтапЬа Ьп£ап6иш

<400> 12 аГддСдксЬс СдаадсГдса ддсТсдссЬЬ дсдЕсдадса ЬссРсддсРд сддссдсдсс сдсдСдЬддс Еддассссаа сдаддсддСд дадабссада асдсдаасЪс дсдсаададс

120

- 36 025202

дйдсдсаадс	йдайсаадда	йддсййсайс	айссдсаадс	сддйдааддй	дсасйсдсдс	180
дсдсддйддс	дйаааайдаа	ддаддсдаад	дасайддддс	дссасаасдд	сдййддссдс	240
сдсдадддйа	дссдсдаддс	ссдсайдссд	адсааддадй	йдйддайдсд	ссдссйдсдс	300
аййсйдсдсс	дссйдсйдсд	саадйассдс	дсддасаада	адайсдассд	ссасдйдйас	360
сдадассйдй	асдйдсдсдс	даадддйаай	дйдййссдса	асаадсдсаа	ссййдйддад	420
сасайссаса	адайсаадаа	йдадаадаад	ааддадсдсс	адсйддсдда	дсадсййдсд	480
дсдаадсасс	йдсдсдасда	дсадаассдс	аасааддсйс	дсаадсадда	дсйдаддаад	540
сдсдадаадд	адсдсдадсд	сдсдаддсдс	дасдасдсйд	сйдссдсйдс	дсадаадаад	600
ааддсддасд	ссдсдаадаа	дйсйдссдсд	ссйдссдсда	адйсйдссдс	дссйдссдсд	660
аадйсйдссд	сдссйдссдс	дааддййдсй	дсссссдсса	сдаадддйдс	йдсдссддйд	720

аадаадйсда адаадйаа 738

<210>	13
<211>	238
<212>	БЕЛОК
<213>	ЬеЬзЬтапха ЬпЬапйиш
<400>	13

Мей Уа1 Зег Ьеи Ьуз Ьеи С1п А1а Агд Ьеи А1а Зег Зег Не Ьеи С1у 15 10 15

Суз С1у Агд А1а Агд Уа1 Тгр Ьеи Азр Рго Азп С1и А1а Уа1 С1и 11е 20 25 30

С1п Азп А1а Азп Зег Агд Ьуз Зег Уа1 Агд Ьуз Ьеи Не Ьуз Азр С1у

- 37 025202

40 45

РЬе Не Не Агд Ьуз Рго УаЬ Ьуз УаЬ НЬз Зег Агд А1а Агд Тгр Агд 50 55 60

Ьуз Меб Ьуз 61и АЬа Ьуз Азр Меб СЬу Агд НЬз Азп СЬу \/а1 С1у Агд 65 70 75 80

Агд СЬи СЬу Зег Агд СЬи А1а Агд Меб Рго Зег Ьуз СЬи Ьеи Тгр Меб 85 90 95

Агд Агд Ьеи Агд Не Ьеи Агд Агд Ьеи Ьеи Агд Ьуз Туг Агд АЬа Азр 100 105 НО

Ьуз Ьуз Не Азр Агд НЬз УаЬ Туг Агд Азр Ьеи Туг УаЬ Агд А1а Ьуз 115 120 125

СЬу Азп УаЬ РЬе Агд Азп Ьуз Агд Азп Ьеи УаЬ СЬи НЬз Не Низ Ьуз 130 135 140

Не Ьуз Азп СЬи Ьуз Ьуз Ьуз СЬи Агд СЬп Ьеи А1а СЬи СЬп Ьеи АЬа 145 150 155 160

А1а Ьуз НЬз Ьеи Агд Азр СЬи С1п Азп Агд Азп Ьуз АЬа Агд Ьуз СЬп 165 170 175

СЬи Ьеи Агд Ьуз Агд СЬи Ьуз СЬи Агд СЬи Агд АЬа Агд Агд Азр Азр 180 185 190

АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп Ьуз Ьуз Ьуз АЬа Азр АЬа АЬа Ьуз Ьуз 5ег

- 38 025202

195

200

205

А1а А1а Рго А1а А1а Ьуз 5ег А1а А1а Рго А1а А1а Ьуз Уа1 А1а А1а

210

215

220

Рго АЬа ТЬг Ьуз СЬу А1а АЬа Рго УаЬ Ьуз Ьуз 5ег Ьуз Ьуз

225

230

235 <210> 14 <211> 717 <212> ДНК <213> ЬеЬзЬипапЬа Ьп£апЬит <400> 14 аЬддЬдЬсЬс ЬдаадсЬдса ддсСсдссЬС дсдСсдадса 1сс1сддс1д сддссдсдсс 60 сдсдбдбддс Ьддассссаа сдаддсддЬд дадаЬссада асдсдаасЬс дсдсаададс 120 дЬдсдсаадс ЬдаСсаадда ЬддсСЬсаЬс аЬссдсаадс сддЪдааддЪ дсасЬсдсдс 180 дсдсддбддс дЬааааЬдаа ддаддсдаад дасаЬддддс дссасаасдд сдЫддссдс 240 сдсдадддба дссдсдаддс ссдсаЬдссд адсааддад! ЬдЬддаЬдсд ссдссЬдсдс 300 аОбсСдсдсс дссС.дс!дсд саадсаосдс дсддасаада адаСсдассд ссасдСдСас 360 сдадассСдС асдСдсдсдс даадддбаа! дЪдЬСссдса асаадсдсаа ссССдСддад 420 сасаСссаса адассаадаа Сдадаадаад ааддадсдсс адсСддсдда дсадсССдсд 480 дсдаадсасс Сдсдсдасда дсадаассдс аасааддсСс дсаадсадда дсСдаддаад 540 сдсдадаадд адсдсдадсд сдсдаддсдс дасдасдсСд сСдссдсСдс дсадаадаад 600 ааддсддасд ссдсдаадаа дСсСдссдсд ссСдссдсда адСсСдссдс дссСдссдсд 660 ааддЬЬдсСд сссссдссас даадддЬдсС дсдссддСда адаадСсдаа даадСаа 717

- 39 025202

<210>	15
<211>	247
<212>	БЕЛОК
<213>	ЬеЬзЬтапЬа техЬсапа

<400> 15

Мер УаЬ Зег Ьеи Ьуз Ьеи СЬп АЬа Агд Ьеи АЬа Зег Зег 11е Ьеи Зег 15 10 15

Суз СЬу Агд А1а Агд УаЬ Тгр Ьеи Азр Рго Азп С1и АЬа Мер СЬи Ые 20 25 30

СЬп Азп АЬа Азп Зег Агд Ьуз Зег УаЬ Агд Ьуз Ьеи ЬЬе Ьуз Азр СЬу 35 40 45

РЬе ЬЬе ЬЬе Агд Ьуз Рго УаЬ Ьуз УаЬ НЬз Зег Агд АЬа Агд Тгр Агд 50 55 60

Ьуз Мер Ьуз СЬи АЬа Ьуз Азр Мер СЬу Агд НЬз Азп СЬу УаЬ СЬу Агд 65 70 75 80

Агд СЬи СЬу Зег Агд СЬи АЬа Агд Мер Рго Зег Ьуз СЬи Ьеи Тгр Мер 85 90 95

Агд Агд Ьеи Агд ЬЬе Ьеи Агд Агд Ьеи Ьеи Агд Ьуз Туг Агд АЬа Азр 100 105 110

Ьуз Ьуз Ые Азр Агд НЬз УаЬ Туг Агд Азр Ьеи Туг Мер Агд АЬа Ьуз 115 120 125

- 40 025202

СЬу Азп УаЬ РЬе Агд Азп Ьуз Агд Азп Ьеи УаЬ СЬи Туг ЬЬе НЬз Ьуз ЬЗО 135 140

Ые Ьуз Азп СЬи Ьуз Ьуз Ьуг АЬа Агд СЬп Ьеи АЬа СЬи СЬп Ьеи АЬа 145 150 155 160

СЬи Ьеи Агд Ьуз Агд СЬи Ьуз СЬи Агд СЬи Агд АЬа Ьуз Агд Азр Азр 180 185 190

АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп Ьуз Ьуз Ьуз АЬа Азр АЬа АЬа Ьуз Ьуз Зег 195 200 205

АЬа АЬа Рго АЬа АЬа Ьуз Зег АЬа АЬа Рго АЬа АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа 210 215 220

Рго УаЬ АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа АЬа Ьуз СЬу АЬа АЬа 225 230 235 240

Рго УаЬ Ьуз Ьуз Зег Ьуз Ьуз 245

<210>	16
<211>	744
<212>	ДНК
<213>	ЪеЬзЬшапЬа техЬсапа

<400> 16 аСддСдСсСс СдаадсСдса адсСсддсСС дсдбсдадса СссСсадсСд сддссдсдсс 60

- 41 025202

сдсдЕдЕддс	Ьддассссаа	сдаддсдаЬд	дадакссада	асдсдаасЬс	дсдсаададс	120
дЬдсдсаадс	ЕдаЕсаадда	ЬддсССсаЕс	аЬссдсаадс	сддЬдааддЕ	дсасЕсдсдс	180
дсдсддЬддс	дЬаааакдаа	ддаддсдаад	дасаЕддддс	дссасаасдд	сдЪкддссдс	240
сдсдадддЬа	дссдсдаддс	ссдсаЪдссд	адсааддадЬ	ЬдЬддаЕдсд	ссдссЕдсдс	300
аЬЬсЬдсдсс	дссСдсЬдсд	саадЬассдс	дсддасаада	адаЕсдассд	ссасдГдСас	360
сдадассЬдС	асаСдсдсдс	даадддЬаас	дЬдТЬссдса	асаадсдсаа	ссПдЬ ддад	420
ЬасаЪссаса	адаЬсаадаа	Ьдадаадаад	ааддсдсдсс	адсЕддсдда	дсадсЬЬдсд	480
дсдаадсасс	Ьдсдсдасда	дсадаассдс	аасааддсЬс	дсаадсадда	дсЕдсддаад	540
сдсдадаадд	адсдсдадсд	сдсдаадсдс	дасдасдсСд	сЬдссдскдс	дсадаадаад	600
ааддсддасд	ссдсдаадаа	дЬссдссдсд	ссЬдсЬдсда	адкссдссдс	дсскдссдсд	660
ааддсСдсЪд	сссссдЬсдс	дааддссдсЕ	дсЬдскдссс	ссдсддсдаа	дддкдскдсд	720
ссддЕдаада	адСсдаадаа	дСаа				744

<210>	17
<211>	247
<212>	БЕЛОК
<213>	ЬехзЬтапта техЬсапа
<400>	17

МеЬ Уа1 £ег Ьеи Ьуз Ьеи С1п А1а Агд Ьеи А1а Зег Зег Не Ьеи Зег 15 10 15

Суз С1у Агд А1а Агд Уа1 Тгр Ьеи Азр Рго Азп С1и А1а МеЪ С1и 11е 20 25 30

- 42 025202

С1п Азп АЬа Азп 5ег Агд Ьуз Зег УаЬ Агд Ьуз Ьеи ЬЬе Ьуз Азр СЬу 35 40 45

Агд Агд Ьеи Агд Ые Ьеи Агд Агд Ьеи Ьеи Агд Ьуз Туг Агд АЬа Азр 100 105 110

Ьуз Ьуз 11е Азр Агд НЬз УаЬ Туг Агд Азр Ьеи Туг Мер Агд АЬа Ьуз 115 120 125

С1у Азп УаЬ РЬе Агд Азп Ьуз Агд Азп Ьеи УаЬ СЬи Туг ЬЬе НЬз Ьуз 130 135 140

Ые Ьуз Азп СЬи Ьуз Ьуз Ьуз АЬа Агд СЬп Ьеи АЬа СЬи СЬп Ьеи АЬа 145 150 155 160

- 43 025202

Рго УаЬ Ьуз Ьуз Зег Ьуз Ьуз 245

<210>	18
<211>	744
<212>	ДНК
<213>	ЬеЬзЬнпапЬа техЬсапа

<400> 18 аЬддЬдЬсЬс ЬдаадсЬдса адсЬсддсЬС дсдЬсдадса ЬссЬсадсЬд сддссдсдсс 60 сдсдЬдЬддс Ьддассссаа сдаддсдаЬд дадаЬссада асдсдаасЬс дсдсаададс 120 дСдсдсаадс ЬдаЬсаадда ЬддсЫсаЬс аЬссдсаадс сддЬдааддЬ дсасЬсдсдс 180 дсдсддЬддс дЬааааЬдаа ддаддсдаад дасаЬддддс дссасаасдд сдЫддссдс 240 сдсдадддЕа дссдсдаддс ссдсаЬдссд адсааддадЬ ЬдЬддаЬдсд ссдссЬдсдс 300 аЫсЬдсдсс дссСдсСдсд саадЬассдс дсддасаада адайсдассд ссасдйдЬас 360 сдадассСдЬ асаЬдсдсдс даадддЬаас дЬдЬЬссдса асаадсдсаа ссЫдСддад 420

ЬасаЬссаса адаЬсаадаа Ьдадаадаад ааддсдсдсс адсЬддсдда дсадсТЬдсд 480 дсдаадсасс Ьдсдсдасда дсадаассдс аасааддсЬс дсаадсадда дсЬдсддаад 540

- 44 025202

сдсдадаадд	адсдсдадсд сдсдаадсдс дасдасдсбд сбдссдсбдс дсадаадаад	600
ааддсддасд	ссдсдаадаа дбссдссдсд ссбдсбдсда адбссдссдс дссбдссдсд	660
ааддсбдсбд	сссссдбсдс дааддссдсб дсбдсбдссс ссдсддсдаа дддбдсбдсд	720
ссддбдаада	адбсдаадаа дбаа	744

<210>	19
<211>	245
<212>	БЕЛОК
<213>	ЬеЬзЬтапЬа άοηονβηί
<400>	19

Меб 1

УаЬ

Зег

Ьеи

Ьуз 5

Ьеи

СЬп АЬа Агд Ьеи 10

АЬа Зег Зег

Не

Ьеи 15

СЬу

Суз

СЬу

Агд

АЬа

Агд

УаЬ

Тгр

Ьеи

Азр

Рго

Азп

СЬи

АЬа

УаЬ

СЬи

Не

20

25

30

СЬп

Азп

АЬа

Азп

Зег

Агд

Ьуз

Зег

УаЬ

Агд

Ьуз

Ьеи

11е

Ьуз

Азр

СЬу

35

40

45

РЬе

Не

Агд

Ьуз

Рго

УаЬ

Ьуз

УаЬ

НЬз

Зег

Агд

АЬа

Агд

Тгр

Агд

50

55

60

Ьуз

Меб

Ьуз

СЬи

АЬа

Ьуз

Азр

Меб

СЬу

Агд

НЬз

Азп

СЬу

УаЬ

СЬу

Агд

65

70

75

80

Агд

СЬи

СЬу

Зег

Агд

СЬи

АЬа

Агд

Меб

Рго

Зег

Ьуз

СЬи

Ьеи

Тгр

Меб

85

90

95

- 45 025202

Ьуз Ьуз Ые Азр Агд НЬз УаЬ Туг Агд Азр Ьеи Туг УаЬ Агд АЬа Ьуз 115 120 125

СЬу Азп УаЬ РЬе Агд Азп Ьуз Агд Азп Ьеи УаЬ СЬи НЬз Ые НЬз Ьуз 130 135 140

Ые Ьуз Азп СЬи Ьуз Ьуз Ьуз СЬи Агд СЬп Ьеи АЬа СЬи СЬп Ьеи АЬа 145 150 155 160

СЬи Ьеи Агд Ьуз Агд СЬи Ьуз СЬи Агд СЬи Агд АЬа Агд Агд Азр Азр 180 185 180

АЬа АЬа Зег АЬа АЬа Ьуз Зег АЬа АЬа Рго АЬа АЬа Ьуз Зег АЬа АЬа 210 215 220

Рго АЬа АЬа Ьуз УаЬ АЬа АЬа Рго АЬа ТЬг Ьуз СЬу АЬа АЬа Рго УаЬ 225 230 235 240

Ьуз Ьуз Зег Ьуз Ьуз 245

- 46 025202

<210>	20
<211>	738
<212>	ДНК
<213>	Ье1зЬтап1а допоуапх

<400> 20 аЬддСдбсСс ЪдаадсОдса ддсЕсдссЫ дсдРсдадса РссСсддсГд сддссдсдсс 60 сдсдЕдЬддс Ьддассссаа сдаддсддЬд дадаЕссада абдсдаасбс дсдсаададс 120 дЪдсдсаадс РдаРсаадда ЕддсГСсаЪс аРссдсаадс сддЕдааддС дсасИсдсдс 180 дсдсддбддс дСааааЬдаа ддаддсдаад дасаСддддс дссасаасдд сдССддссдс 240 сдсдадддЕа дссдсдаддс ссдсабдссд адсааддадС СдСддаЬдсд ссдссСдсдс 300 аббсбдсдсс дссбдсЬдсд саадбассдс дсддасаада адабсдассд ссасдбдСас 360 сдадассЬдЪ асдЕдсдсдс даадддЬааЪ дРдЬЬссдса асаадсдсаа ссЕЬдРддад 420 сасабссаса адаЬсаадаа Ъдадаадаад ааддадсдсс адсЬддсдда дсадсЫдсд 480 дсдаадсасс Рдсдсдасда дсадаассдс аасааддсРс дсаадсадда дсЕдаддаад 540 сдсдадаадд адсдсдадсд сдсдаддсдс дасдасдсСд сЬдссдсСдс дсадаадаад 600 ааддсддасд ссдсдаадаа дСсбдссдсд ЬсЪдсЬдсда адЬсбдссдс дссЪдсбдсд 660 аадбсЬдссд сдссбдссдс дааддЕСдсб дсссссдсса сдаадддСдс ЪдсдссддЪд 720 аадаадРсда адаадбаа 738

<210>	21
<211>	372
<212>	БЕДОК
<213>	Тгурапозота сгига
<400>	21

- 47 025202

Мей УаЬ Зег Ьеи Ьуз Ьеи С1п АЬа Агд Ьеи АЬа АЬа Азр Не Ьеи Агд 15 10 15

Суз СЬу Агд НЬз Агд УаЬ Тгр Ьеи Азр Рго Азп СЬи АЬа Зег СЬи ЬЬе 20 25 30

Зег Азп АЬа Азп Зег Агд Ьуз Зег УаЬ Агд Ьуз Ьеи ГЬе Ьуз Азр СЬу 35 40 45

Ьеи ЬЬе ЬЬе Агд Ьуз Рго УаЬ Ьуз УаЬ НЬз Зег Агд Зег Агд Тгр Агд 50 55 60

НЬз Мей Ьуз СЬи АЬа Ьуз Зег Мей СЬу Агд НЬз СЬи СЬу АЬа СЬу Агд 65 70 75 80

Агд СЬи СЬу ТЬг Агд СЬи АЬа Агд Мей Рго Зег Ьуз СЬи Ьеи Тгр Мей 85 90 95

Агд Агд Ьеи Агд ЬЬе Ьеи Агд Агд Ьеи Ьеи Агд Ьуз Туг Агд СЬи СЬи 100 105 110

Ьуз Ьуз Не Азр Агд НЬз Не Туг Агд СЬи Ьеи Туг УаЬ Ьуз АЬа Ьуз 115 120 125

СЬу Αδη УаЬ РЬе Агд Азп Ьуз Агд Азп Ьеи Мей СЬи НЬз Не НЬз Ьуз 130 135 140

УаЬ Ьуз Азп СЬи Ьуз Ьуз Ьуз СЬи Агд СЬп Ьеи АЬа СЬи СЬп Ьеи АЬа 145 150 155 160

- 48 025202

АЬа Ьуз Агд Ьеи Ьуз Азр СЬи СЬп НЬз Агд НЬз Ьуз АЬа Агд Ьуз СЬп 165 170 175

СЬи Ьеи Агд Ьуз Агд СЬи Ьуз Азр Агд СЬи Агд АЬа Агд Агд СЬи Азр 180 185 190

АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Ьуз СЬп Ьуз АЬа АЬа АЬа Ьуз Ьуз АЬа 195 200 205

АЬа АЬа Рго Зег СЬу Ьуз Ьуз Зег АЬа Ьуз АЬа АЬа ТЬг АЬа Рго АЬа 210 215 220

Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа 225 230 235 240

АЬа АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа 245 250 255

АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа ТЬг АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа Рго 260 265 270

АЬа Ьуз АЬа АЬа ТЬг АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз 275 280 285

АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа ТЬг АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа 290 295 300

АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа ТЬг АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа 305 310 315 320

- 49 025202

Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа ТЬг АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа

325

330

335

Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа ТЬг АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа

340

345

350

АЬа ТЬг АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа ТЬг АЬа Рго УаЬ СЬу Ьуз Ьуз АЬа

355

360

365

СЬу СЬу Ьуз Ьуз 370 <210> 22 <211> 1119 <212> ДНК <213> Тгурапозоша сгигЬ <400> 22 аСддЬдСсдс ЬдаадсЬдса ддсЬсдЬЬСд дсддсддаса ССсСссдсСд сддСсдссас 60 сдСдСдСддс СддаСссСаа СдаддссСсС дадаЬССсса аСдсааасбс дсдсаададс 120 дСдсдсаадС СдаСсаадда СддСсСдаСС аССсдсаадс сСдСсааддС дсасСсдсдс 180

СсссдсСддс дссасаЬдаа ддаддсдаад адсаЬдддсс дссасдаддд сдсбдддодс 240 сдсдадддСа сссдсдаадс ссдсаСдссд адсааддадс СдСддаЬдсд ссдЬсЬдсдс 300 аЫсСссдсс дссЬдсЬдсд саадСассдс даддадаада адаЫдассд ссасаСсСас 360 сдсдадсСдС асдбдааддс дааддддаас дСдСЬСсдса асаадсдСаа ссСсаСддад 420 сасаСссаса аддСдаадаа сдадаадаад ааддаааддс адсСддсбда дсадсСсдсд 480 дсдаадсдсс Сдааддабда дсадсассдС сасааддссс дсаадсадда дсбдсдСаад 540

- 50 025202 сдсдадаадд ассдсдадсд йдсдсдйсдс даадайдсйд ссдсйдссдс сдссдсдаад 600 садааадсйд сйдсдаадаа ддссдсйдсй сссйсйддса адаадйссдс дааддсйдсй 660 асйдсассйд сдааддссдс йдсйдсассй дсдааддссд сйдсйдсасс йдсдааддсй 720 дсйдсйдсас сйдсдааддс йдсйдсйдса ссйдсдаадд сйдсйдсйдс ассйдсдаад 780 дсйдсйасйд сассйдсдаа ддссдсйдсй дсассйдсда аддсйдсйас йдсассйдсд 840 ааддссдсйд сйдсассйдс дааддсйдсй дсйдсассйд сдааддсйдс йасйдсассй 900 дсдааддссд сйдсйдсасс йдсдааддсй дсйасйдсас сйдсдааддс сдсйдсйдса 960 ссйдсдаадд сйдсйасйдс ассйдсдаад дссдсйдсйд сассйдсдаа ддссдсйдсй 1020 дсассйдсда аддсйдсйас йдсассйдсд ааддссдсйа сйдсассйдс дааддсйдсй 1080 асйдсасссд ййддааадаа ддсйддйддс аадаадйда 1119

<210>	23
<211>	356
<212>	БЕЛОК
<213>	Тгурапозота сгигг

<400> 23

Мей Уа1 Зег Ьеи Ьуз Ьеи 61п А1а Агд Ьеи А1а А1а Азр 11е Ьеи Агд 15 10 15

Суз С1у Агд ΗΪ5 Агд Уа1 Тгр Ьеи Азр Рго Азп 61и А1а Зег С1и 11е 20 25 30

Зег Азп А1а Азп Зег Агд Ьуз Зег Уа1 Агд Ьуз Ьеи 11е Ьуз Азр С1у 35 40 45

- 51 025202

- 52 025202

- 53 025202

<210>	24
<211>	1071
<212>	ДНК
<213>	Тгурапозоша сгига
<400>	24

аСддЬдЬсдс ЬдаадсЬдса ддсЬсдЬЬЬд дсддсддаса

ЬЬсЬссдсЬд сддЬсдссас сдЬдЬдЬддс ЬддасссЬаа ЬдаддссЬсЬ дадаЬЬЬсса аЬдсааасЬс дсдсаададс дЬдсдсаадЬ ЬдаСсаадда ЬддЬсЬдаЬЬ аЬЬсдсаадс сЬдЬсааддЬ дсасьсдсдс

ЪсссдсЬддс дссасаЬдаа ддаддсдаад адсаЬдддсс дссасдаддд сдсСдддсдс сдсдадддЬа сссдсдаадс ссдсаЬдссд адсааддадс

ЬдЬддаЬдсд ссдЬсЬдсдс аЬЬсЬссдсс дссЬдсьдсд саадЬассдс даддадаада адаЬЬдассд ссасаЬЬЬас сдсдадсЬдЬ асдЬдааддс дааддддаас дЬдЬЬЬсдса асаадсдЬаа ссЬсаЬддад сасаЬссаса аддЬдаадаа сдадаадаад ааддаааддс адсЬддсЬда дсадсЬсдсд дсдаадсдсс ЬдааддаЬда дсадсассдЬ сасааддссс дсаадсадда дсЬдсдЬаад сдсдадаадд ассдсдадсд ЬдсдсдЬсдс даадаЬдсЬд ссдсЬдссдс сдссдсдаад садааадсЬд сЬдсдаадаа ддссдсЬдсЬ сссЬсЬддса адаадЬссдс дааддсЬдсЬ дсасссдсда аддсЬдсЬдс Ьдсасссдсд ааддссдсЬд сЬссасссдс даадассдсЬ дсЬдсасссд сдааддсЬдс ЬдсассЬдсо ааддсЬдсЬд сЬссасссдс дааддсЬдсЬ дсЬссасссд сдаадассдс ЬдсЪссассс дсдаадассд сЬдсЬссасс сдсдааддсЬ дсЬдсЬссас ссдсдааддс сдсЬдсЬсса сссдсдаадд ссдсЬдсЬсс асссдсдаад дссдсЬдсЬд сасссдсдаа ддссдсЬдсЬ дсасссдсда аддсЬдсЬдс

Ьссасссдсд ааддссдсЬд сЬссасссдс дааддсЬдсЬ дсЬссасссд сдааддсЬдс

ЬдсЬссассс

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

- 54 025202 дсдааддсРд сРдсРдсРсс сдРРддааад ааддсРддРд дсаадаадрд а 1071

<210>	25
<211>	343
<212>	БЕЛОК
<213>	Тгурапозота сгизЬ
<400>	25

Мер 1

УаЬ

Зег

Ьеи Ьуз Ьеи СЬп АЬа Агд Ьеи АЬа АЬа Азр

Ые Ьеи Агд 15

5

10

Суз

СЬу

Агд

НЬз

Агд

УаЬ

Тгр

Ьеи

Азр

Рго

Азп

СЬи

АЬа

Зег

СЬи

11е

20

25

30

Зег

Азп

АЬа

Азп

Зег

Агд

Ьуз

Зег

УаЬ

Агд

Ьуз

Ьеи

Ые

Ьуз

Азр

СЬу

35

40

45

Ьеи

Ые

Агд

Ьуз

Рго

УаЬ

Ьуз

УаЬ

НЬз

Зег

Агд

Зег

Агд

Тгр

Агд

50

55

60

НЬз

Мер

Ьуз

СЬи

АЬа

Ьуз

Зег

Мер

СЬу

Агд

НЬз

СЬи

СЬу

АЬа

СЬу

Агд

65

70

75

80

Агд

СЬи

СЬу

ТЬг

Агд

СЬи

АЬа

Агд

Мер

Рго

Зег

Ьуз

СЬи

Ьеи

Тгр

Мер

85

90

95

Агд

Ьеи

Агд

1Ье

Ьеи

Агд

Ьеи

Агд

Ьуз

Туг

Агд

СЬи

100

105

по

Ьуз

11е

Азр

Агд

НЬз

Ые

Туг

Агд

СЬи

Ьеи

Туг

УаЬ

Ьуз

АЬа

Ьуз

- 55 025202

115 120 125

СЬу Азп УаЬ РЬе Агд Азп Ьуз Агд Азп Ьеи Мей СЬи НЬз 11е НЬз Ьуз 130 135 140

АЬа Ьуз Агд Ьеи Ьуз Азр СЬи СЬп НЬз Агд НЬз Ьуз АЬа Агд Ьуз 61п 165 170 175

СЬи Ьеи Агд Ьуз Агд СЬи Ьуз Азр Агд СЬи Агд АЬа Агд Агд СЬи Азр 180 135 190

АЬа АЬа Рго 5ег СЬу Ьуз Ьуз Зег АЬа Ьуз АЬа АЬа 11е АЬа Рго АЬа 210 215 220

АЬа Ьуз ТЬг АЬа АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа

- 56 025202

275

280

285

А1а А1а А1а Рго АХа Ьуз А1а А1а ТЬг А1а Рго А1а Ьуз А1а А1а А1а

290

295

300

А1а Рго А1а Ьуз А1а А1а ТЬг А1а Рго А1а Ьуз АХа А1а ТЬг А1а Рго

305

310

315

320

А1а Ьуз А1а А1а А1а А1а Рго АЬа Ьуз А1а А1а ТЬг А1а Рго Уа1 С1у

325

330

335

Ьуз Ьуз А1а С1у С1у Ьуз Ьуз 340 <210> 26 <211> 1032 <212> ДНК <213> Тгурапозоша сгига <400> 26 аЬддбдГсдс бдаадсбдса ддсЬсдЬЬЬд дсддсддаса ЬЬсЬссдсЬд сддгсдссас 60 сдЪдЬдЕддс ЬддасссЬаа ЬдаддссЬсЪ дадаЬЬЬсса аЬдсааасЬс дсдсаададс 120 дедсдсаадь сдассаадда ьддссхдасг аысдсаадс сСдссааддЬ дсасЬсдсдс 180

ЬсссдсГддс дссасаедаа ддаддсдаад адсаЬдддсс дссасдаддд сдсЬдддсдс 240 сдсдадддСа сссдсдаадс ссдсаЬдссд адсааддадс ЬдЬддаЬдсд ссдЬсЬдсдс 300 аббсЬссдсс дссСдсЬдсд саад5ассдс даддадаада адаЕСдассд ссасаСсЬас 360 сдсдадсЬд£ асдЕдааддс дааддддаас дСдСХЬсдса асаадсдЬаа ссЬсаЬддад 420 сасаГссаса аддЬдаадаа сдадаадаад ааддаааддс адсЬддсЕда дсадсСсдсд 480

- 57 025202 дсдаадсдсс сдааддасда дсадсассдс сасааддссс дсаадсадда десдедьаад 540 сдсдадаадд ассдсдадсд СдсдсдСсдс даадаСдсСд ссдсСдссдс сдссдсдаад 600 садааадсСд сЬдсдаадаа ддссдсСдсС сссСсСддса адаадСссдс дааддсСдсС 660 аССдсассСд сдааддссдс СдсСдсассС дсдааддссд сСдсСдсасс СдсдааддсС 720 дсСдсСдсас сСдсдааддс сдсСдсСдса ссСдсдаадд сСдсСдсСдс ассСдсдаад 780 дсСдсСасСд сассСдсдаа ддсСдсСдсС дсассСдсса адассдсСдс Сдсасссдсд 840 ааддсСдссд сассСдсдаа ддссдсСдсС дсассСдсда аддссдсСас СдсассСдсд 900 ааддсСдсСд сСдсассСдс дааддссдсС асСдсассСд сдааддсСдс СасСдсассС 960 дсдааддсСд сСдсСдсасс Сдсдааддсс дсСасСдсас ссдССддааа дааддсСддС 1020 ддсаадаадС да

1032

<210>	27
<211>	357
<212>	БЕЛОК
<213>	Тгурапозотаа сгигЬ

<400> 27

МеС УаЬ Зег Ьеи Ьуз Ьеи СЬп АЬа Агд Ьеи А1а АЬа Азр ЬЬе Ьеи Агд 15 10 15

Суз СЬу Агд НЬз Агд УаЬ Тгр Ьеи Азр Рго Азп СЬи АЬа Зег СЬи Це 20 25 30

Зег Азп АЬа Азп Зег Агд Ьуз Зег УаЬ Агд Ьуз Ьеи Ые Ьуз Азр СЬу 35 40 45

- 58 025202

Ьеи Не 11е Агд Ьуз Рго УаЬ Ьуз УаЬ НЬз Зег Агд Зег Агд Тгр Агд 50 55 60

НЬз МеС Ьуз СЬи АЬа Ьуз Зег МеС СЬу Агд НЬз СЬи СЬу АЬа СЬу Агд 65 70 75 80

Агд СЬи СЬу ТЬг Агд СЬи АЬа Агд Мес Рго Зег Ьуз СЬи Ьеи Тгр МеС 85 90 95

Агд Агд Ьеи Агд 11е Ьеи Аид Агд Ьеи Ьеи Агд Ьуз Туи Агд СЬи СЬи 100 105 110

Ьуз Ьуз Ые Азр Агд НЬз Ые Туг Агд СЬи Ьеи Туи УаЬ Ьуз АЬа Ьуз 115 120 125

СЬу Азп УаЬ РЬе Аид Азп Ьуз Агд Азп Ьеи МеС СЬи НЬз Ые НЬз Ьуз 130 135 140

Уа1 Ьуз Азп СЬи Ьуз Ьуз Ьуз С1и Агд С1п Ьеи АЬа СЬи С1п Ьеи АЬа 145 150 155 160

А1а Ьуз Агд Ьеи Ьуз Азр СЬи СЬп НЬз Аид НЬз Ьуз А1а Аид Ьуз С1п 165 170 175

СЬи Ьеи Агд Ьуз Аид СЬи Ьуз Азр Аид СЬи Аид АЬа Аид Агд СЬи Азр 180 185 190

- 59 025202

- 60 025202

<210>	28
<211>	1074
<212>	ДНК
<213>	Тгурапозота сгигЬ
<400>	28

айддйдйсдс	йдаадсйдса	ддсйсдйййд	дсддсддаса	ййсйссдсйд	сддйсдссас	60
сдйдйдйддс	йддасссйаа	йдаддссйсй	дадайййсса	айдсааасйс	дсдсаададс	120
дйдсдсаадй	йдайсаадда	йддйсйдайй	аййсдсаадс	сйдйсааддй	дсасйсдсдс	180
йсссдсйддс	дссасайдаа	ддаддсдаад	адсайдддсс	дссасдаддд	сдсйдддсдс	240
сдсдадддйа	сссдсдаадс	ссдсайдссд	адсааддадс	йдйддайдсд	ссдйсйдсдс	300
аййсйссдсс	дссйдсйдсд	саадйассдс	даддадаада	адаййдассд	ссасайййас	360
сдсдадсйдй	асдйдааддс	дааддддаас	дйдйййсдса	асаадсдйаа	ссйсайддад	420
сасайссаса	аддйдаадаа	сдадаадаад	ааддаааддс	адсйддсйда	дсадсйсдсд	480
дсдаадсдсс	йдааддайда	дсадсассдй	сасааддссс	дсаадсадда	дсйдсдйаад	540
сдсдадаадд	ассдсдадсд	Ьдсдсдйсдс	даадайдсйд	ссдсйдссдс	сдссдсдаад	600
садааадсйд	сйдсдаадаа	ддссдсйдсй	сссйсйддса	адаадйссдс	дааддсйдсй	660
дсассйдсса	аддсйдсйдс	йдсасссдсд	аадассдсйд	сйссасссдс	дааддссдсй	720
дсйссасссд	сдааддсйдс	йдсйссассс	дсдааддсйд	сйдсйссасс	сдсдааддсй	780
дсйдсйссас	ссдсдааддс	йдсйдсйсса	сссдсдаадд	сйдсйдсйсс	асссдсдаад	840
дсйдсйдсйс	сасссдсдаа	ддсйдсйдсй	ссасссдсда	аддсйдсйдс	йдсасссдсд	900
аадассдсйд	сйссасссдс	дааддсйдсй	дсйдсасссд	сдаадассдс	йдсйссассс	960
дсдаадассд	сйдсйссасс	сдсдааддсс	дсйасйссас	ссдсдааддс	йдсйдсйсса	1020

- 61 025202 сссдсдаадд сСдссдссдс Ссссдссдда аадааддсСд дСддсаадаа деда 1074

<210>	29
<211>	260
<212>	БЕЛОК
<213>	Тгурапозота ЬгисеЬ
<4 00>	29

МеС 1

УаЬ

Зег

Ьеи

Ьуз 5

Ьеи

СЬп АЬа Агд Ьеи АЬа АЬа Азр Ые Ьеи Агд

10

15

Суз

СЬу

Агд

СЬу

Агд

УаЬ

Тгр

Ьеи

Азр

Рго

Азп

СЬи

АЬа

УаЬ

СЬи

Ые

20

25

30

Агд

Азп

АЬа

Азп

Зег

Агд

Ьуз

Зег

УаЬ

Агд

Ьуз

Ьеи

Ые

Ьуз

Азр

СЬу

35

40

45

Ьеи

УаЬ

Мес

Агд

Ьуз

Рго

УаЬ

Ьуз

УаЬ

НЬз

Зег

Агд

Зег

Агд

Тгр

Агд

50

55

60

СЬп

МеС

Ьуз

Ьеи

АЬа

Ьуз

Зег

МеС

СЬу

Агд

НЬз

СЬи

СЬу

ТЬг

СЬу

Агд

65

70

75

80

Агд

СЬи

СЬу

ТЬг

Агд

СЬи

АЬа

Агд

МеС

Рго

Зег

Ьуз

Азр

Ьеи

Тгр

МеС

85

90

95

Агд

Ьеи

Агд

11е

Ьеи

Агд

Ьеи

Агд

Ьуз

Туг

Агд

СЬи

100

105

110

Ьуз

Ые

Азр

Агд

НЬз

11е

Туг

Агд

СЬи

Ьеи

Туг

МеС

Ьуз

АЬа

Ьуз

- 62 025202

115 120 125

СЬу Азп УаЬ РЬе Агд Азп Ьуз Агд Азп Ьеи Ме! СЬи НЬз Ые НЬз Ьуз 130 135 140

УаЬ Ьуз Азп СЬи Ьуз Ьуз Ьуз АЬа Агд СЬп Ьеи АЬа СЬи СЬп Ьеи АЬа 145 150 155 160

АЬа Ьуз Агд Ьеи Ьуз Азр СЬи СЬп Азп Агд Агд Ьуз АЬа Агд Ьуз СЬп 165 170 175

СЬи Ьеи Ьуз Ьуз Агд СЬи Ьуз СЬи Агд СЬи Агд АЬа Агд Агд Азр Азр 180 185 190

АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Ьуз СЬп Агд АЬа АЬа АЬа Ьуз Ьуз АЬа 195 200 205

А1а А1а Рго АЬа АЬа Ьуз Ьуз СЬу СЬу Ьуз АЬа УаЬ АЬа Рго АЬа ТЬг 210 215 220

Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа Ьуз УаЬ АЬа Рго 225 230 235 240

АЬа Ьуз АЬа АЬа Рго АЬа Ьуз АЬа АЬа Зег Рго АЬа СЬу Ьуз Ьуз АЬа 245 250 255

АЬа СЬу Ьуз Ьуз 260 <210> 30

- 63 025202 <211> 783 <212> ДНК <213> Тгурапозота ЬгисеЬ <400> 30

аСддСдСсас	СдаадсСсса	адсСсдссСд	дсадсддаса	СссСдсдсСд	сддссдсддс	60
сдсдсдеддс	сддассссаа	сдаадсадСа	дадаССсдса	аСдссааССс	асдсаададС	120
дСасдсаадС	СдаСсааада	сддСССддСа	аСдсдааадс	сСдССааддС	дсаССсдсдс	180
СсссдсСддс	дссадаСдаа	дССддсдаад	адсаСдддас	дссасдаддд	Сассддссдс	240
сдсдадддСа	сСсдсдаадс	асдсаСдссс	адсааддасс	СССддаСдсд	ссдасССсдс	300
аССсССсдсс	дСССдсССсд	саадСассдс	даадаааада	адаССдаСсд	дсасаСсСас	360
сдсдадсСдС	асаСдааддс	ааадддсаас	дСдЫссдса	асаадсдсаа	сссСаСддад	420
сасаСссаса	аддСдаадаа	сдадаадаад	ааддсСсдСс	адсССдсСда	дсаасСсдсд	480
дсдааасдсс	саааддасда	дсадаассдс	сдсааддсас	дааадсадда	деСдаадаад	540
сдСдадаадд	ааедСдадед	СдсасдссдС	дасдаСдссд	сСдсСдсСдс	сдсСдссааа	600
саасдадсСд	ссдсдаадаа	ддсСдссдсС	сссдсСдсса	адаадддСдд	сааддсСдСС	660
дсссссдсса	сСссСдсдаа	ддссдссссС	дсаааддссд	ссдсСдсдаа	ддССдсссса	720
дедааддедд	сСсссдсааа	ддссдссадс	ссСдссддда	адааддсадс	дддСаадаад	780

Сда 783 <210> 31 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

- 64 025202 <223> пептид 1 <400> 31

Мей ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Зег Зег Зег Агд Нхз Зег РЬе Ьуз С1п Азп 15 10 15

С1и ТЫ 51п Азп <210> 32 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 2 <400> 32

Зег РЬе Ьуз С1п Азп С1и ТЬг С1п Азп Мей 7а1 Зег Ьеи Ьуз Ьеи С1п 15 10 15

А1а Агд Ьеи А1а 20 <210> 33 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 3 <400> 33

- 65 025202

Зег Ьеи Ьуз Ьеи СЬп АЬа Агд Ьеи АЬа Зег Зег Ые Ьеи СЬу Суз СЬу 15 10 15

Агд АЬа Агд УаЬ 20 <2Ь0> 34 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 4 <400> 34

Ые Ьеи СЬу Суз СЬу Агд АЬа Агд УаЬ Тгр Ьеи Азр Рго Азп СЬи АЬа 15 10 15

УаЬ СЬи Ые СЬп <210> 35 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 5 <400> 35

Азр Рго Азп С1и АЬа УаЬ С1и Ые СЬп Азп АЬа Азп Зег Агд Ьуз Зег 15 10 15

- 66 025202

Уа1 Агд Ьуз Ьеи 20 <210> 36 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 6 <400> 36

Азп Зег Агд Ьуз Зег Уа1 Агд Ьуз Ьеи 11е Ьуз Азр С1у РЬе 11е 11е 15 10 15

Агд Ьуз Рго Уа1 20 <210> 37 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 7 <400> 37

Азр С1у РЬе 11е 11е Агд Ьуз Рго Уа1 Ьуз Уа1 ΗΪ3 Зег Агд А1а Агд 15 10 15

Тгр Агд Ьуз Меб 20

- 67 025202 <210> 38 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 8 <400> 38

НЬз 5ег Агд АЬа Агд Тгр Агд Ьуз МеС Ьуз СЬи АЬа Ьуз Азр МеС СЬу 15 10 15

Агд НЬз Азп СЬу 20 <210> 39 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 9 <400> 39

АЬа Ьуз Азр МеС СЬу Агд НЬз Азп СЬу УаЬ СЬу Агд Агд СЬи СЬу Бег 15 10 15

Агд СЬи АЬа Агд

	20
<210>	40
<211>	20
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный

- 68 025202 <220>

<223> пептид 10 <400> 40

Агд Агд С1и С1у Зег Агд С1и А1а Агд Мек Рго Зег Ьуз С1и Ьеи Тгр 15 10 15

МеГ Агд Агд Ьеи 20 <210> 41 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 11 <400> 41

Зег Ьуз О1и Ьеи Тгр МеЕ Агд Агд Ьеи Агд 11е Ьеи Агд Агд Ьеи Ьеи 15 10 15

Агд Ьуз Туг Агд 20 <210> 42 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 12

- 69 025202 <400> 42

Ьей Агд Агд Ъеи Ьей Агд Ьуз Туг Агд А1а Азр Ьуз Ьуз	Не	Азр 15	Агд
1	5	10
НЬз Уа1	Туг Агд
	20
<210>	43
<211>	20
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	пептид 13
<400>	43
Ьуз Ьуз	; 11е Азр Агд Ηί3	Х/а1 Туг Агд Азр Ъеи Туг МеЬ	Агд	А1а	Ьуз
1	5	10		15

С1у Азп Уа1 РЬе

	20
<210>	44
<211>	20
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	пептид 14
<400>	44
Туг МеЬ	: Агд А1а Ьуз Е1у Азп Уа1	РЬе Агд Азп Ьуз Агд Азп	Ьей Уа1
1	5	10	15

- 70 025202

С1и НЬз Ые Ηί5 <210> 45 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 15 <400> 45

Ьуз Агд Азп Ьеи УаЬ СЬи ΗΪ5 11е НЬз Ьуз 11е Ьуз Азп СЬи Ьуз Ьуз 15 10 15

Ьуз СЬи Агд СЬп 20 <210> 46 <21Ь> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 16 <400> 46

Ьуз Азп СЬи Ьуз Ьуз Ьуз СЬи Агд СЬп Ьеи АЬа СЬи СЬп Ьеи АЬа АЬа 15 10 15

Ьуз НЬз Ьеи Агд 20

- 71 025202 <210> 47 <211> 20 <212> БЕЛОК <2ЬЗ> искусственный <220>

<223> пептид 17 <400> 47

СЬи СЬп Ьеи АЬа АЬа Ьуз НЬз Ьеи Агд Азр СЬи СЬп Азп Агд Азп Ьуз 15 10 15

А1а Агд Ьуз С1п 20 <210> 48 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 18 <400> 48

СЬп Азп Агд Азп Ьуз АЬа Агд Ьуз СЬп СЬи Ьеи Ьуз Ьуз Агд СЬи Ьуз 15 10 15

СЬи Агд СЬи Агд 20 <210> 49 <2Ы> 20

- 72 025202 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 19 <400> 49

Ьуз Ьуз Агд С1и Ьуз С1и Агд С1и Агд АЬа Агд Агд Азр Азр А1а А1а 15 10 15

АЬа А1а АЬа С1п <210> 50 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 20 <400> 50

Агд Азр Азр А1а А1а АЬа А1а А1а 01п Ьуз Ьуз Ьуз АЬа Азр А1а А1а 15 10 15

Ьуз Ьуз Зег АЬа 20 <210> 51 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 21 <400> 51

Ьуз АЬа Азр АЬа АЬа Ьуз Ьуз Зег АЬа А1а Рго АЬа А1а Ьуз Зег А1а 15 10 15

А1а Рго А1а А1а <210> 52 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 22 <400> 52

А1а АЬа Ьуз Зег АЬа АЬа Рго АЬа АЬа Ьуз АЬа АЬа АЬа Рго АЬа ТЬг 15 10 15

Ьуз АЬа АЬа АЬа 20 <210> 53 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 23 <400> 53

АЬа АЬа Рго АЬа ТЬг Ьуз АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Рго АЬа ТЬг Ьуз СЬу 15 10 15

АЬа АЬа Рго УаЬ <210> 54 <211> 14 <212> БЕЛОК < 213 > искусственный <220>

<223> пептид 24 <400> 54

Рго АЬа ТЬг Ьуз 61у АЬа АЬа Рго УаЬ Ьуз Ьуз Бег Ьуз Ьуз 15 10 <210> 55 <211> 31 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 1-2 <400> 55

Мер ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Зег Зег Зег Агд НЬз Зег РЬе Ьуз СЬп Азп 15 10 15

СЬи ТЬг СЬп Азп Мер УаЬ Зег Ьеи Ьуз Ьеи СЬп АЬа Агд Ьеи АЬа 20 25 30

- 75 025202 <210> 56 <211> 42 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> пептид 12-13-14 <400> 56

Ьеи Агд

Агд Ьеи

Ьеи Агд

Ьуз

Туг

Агд

АЬа

Азр

Ьуз

Не

Азр

Агд

1

5

10

15

НЬз Уа1

Туг Агд

Азр Ьеи

Туг

Меб

Агд

АЬа

Ьуз

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Агд

20

25

30

Азп Ьуз

Агд Азп

Ьеи Уа1

СЬи

НЬз

Не

НЬз

35

40

<210>

57

<211>

25

<212>

БЕЛОК

<213>

искусственный

<220>

<223>

пептид 23-24

<4 00>

57

А1а АЬа

Рго АЬа

ТЬг Ьуз

АЬа

А1а

АЬа

А1а

Рго

А1а

ТЬг

Ьуз

СЬу

1

5

10

15

А1а А1а Рго Уа1 Ьуз Ьуз Зег Ьуз Ьуз 20 25

- 76 025202

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение молекулы нуклеиновой кислоты в качестве лекарственного средства, где указанная молекула нуклеиновой кислоты представлена нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из:

ί) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО N0:1;

ίί) нуклеотидных последовательностей, содержащих нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ГО N0:2;

ίίί) нуклеотидных последовательностей, комплементарная цепь которых гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты (ί) или (ίί); и ίν) нуклеотидных последовательностей, последовательности которых отличаются от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода.
2. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.1, где эта молекула нуклеиновой кислоты представлена нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из:

ί) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 70% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:1, ίί) нуклеотидных последовательностей, содержащих нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 70% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ГО N0:2;

ίίί) нуклеотидных последовательностей, комплементарная цепь которых гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты (ί) или (ίί); и ίν) нуклеотидных последовательностей, последовательности которых отличаются от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода.
3. Применение полипептида, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты, определенной в п.1 или 2, в качестве лекарственного средства.
4. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты получена из или происходит из БсЫипаша та]ог, ЕсМипаша Ьга/Шстй. ЕсМипаша тГапШт. ЬткНташа Мсх1сапа или БсЫипаша бопоуаш.
5. Применение полипептида по п.3, где указанный полипептид получен из или происходит из ЬшкЬташа та]ог, БсЫипаша Ьга/Шстй, БсЫипаша шГайит, БсЫипаша Мсхюаиа или ЬшкЬташа бопоνаη^.
6. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.1, где лекарственное средство предназначено для профилактики или лечения воспалительного нарушения у индивида.
7. Применение полипептида по п.3, где лекарственное средство предназначено для профилактики или лечения воспалительного нарушения у индивида.
8. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.1, 2, 4 или 6, где эта молекула нуклеиновой кислоты является олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более смежных нуклеотидов 8Е0 ГО N0:2.
9. Применение полипептида по любому из пп.3, 5 или 7, где этот полипептид является фрагментом белка, содержащим по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265 или 267 смежных аминокислот 8ЕО ГО N0:1.
10. Применение полипептида по п.9, где этот полипептид представлен фрагментом белка, содержащим по меньшей мере 14 смежных аминокислот 8ЕО ГО N0:1 и содержащий 8Е0 ГО N0:31, 32, 55, 42, 43, 44, 56, 53, 54 и/или 57.
11. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.6, где воспалительным нарушением является ревматоидный артрит (КА), ювенильный ревматоидный артрит, псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, воспалительное заболевание кишечника, включающее в себя болезнь Крона или язвенный колит, гепатит, сепсис, алкогольное поражение печени и неалкогольная себорея, саркоидоз, аутоиммунный диабет, сахарный диабет, увеит, рассеянный склероз, контролируемое отторжение трансплантата после трансплантации органа, реакция трансплантат против хозяина (ОУНЭ), воспалительные заболевания легких, включающие в себя астму и хроническое обструктивное заболевание легких (С0РИ) (2), рак (4), системная красная волчанка, 8ЬЕ, саркоидоз, атопический дерматит и рак.
12. Применение полипептида по п.7, где воспалительным нарушением является ревматоидный артрит (КА), ювенильный ревматоидный артрит, псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, воспалительное заболевание кишечника, включающее в себя болезнь Крона или язвенный колит, гепатит, сепсис, алкогольное поражение печени и неалкогольная себорея, саркоидоз, аутоиммунный диабет, сахарный диабет, увеит, рассеянный склероз, контролируемое отторжение трансплантата после

- 77 025202 трансплантации органа, реакция трансплантат против хозяина (СУНО), воспалительные заболевания легких, включающие в себя астму и хроническое обструктивное заболевание легких (ΟΟΡΏ) (2), рак (4), системная красная волчанка, 8ЬЕ, саркоидоз, атопический дерматит и рак.
13. Композиция, содержащая по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в любом из пп.1, 2, 4, или 8, где эта композиция является предпочтительно фармацевтической композицией, причем указанная фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, адъювант, соль, разбавитель и/или эксципиент.
14. Композиция, содержащая по меньшей мере один полипептид, определенный в любом из пп.3, 5, 9 или 10, где эта композиция является предпочтительно фармацевтической композицией, причем указанная фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, адъювант, соль, разбавитель и/или эксципиент.
15. Композиция, содержащая по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в любом из пп.1, 2, 4, или 8, и полипептид, определенный в любом из пп.3, 5, 9 или 10, где эта композиция является предпочтительно фармацевтической композицией, причем указанная фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, адъювант, соль, разбавитель и/или эксципиент.
16. Применение композиции, определенной в пп.13-15, для профилактики или лечения воспалительного нарушения у индивида.
17. Применение по п.16, где воспалительным нарушением является ревматоидный артрит (КА), ювенильный ревматоидный артрит, псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, воспалительное заболевание кишечника, включающее в себя болезнь Крона или язвенный колит, гепатит, сепсис, алкогольное поражение печени и неалкогольная себорея, саркоидоз, аутоиммунный диабет, сахарный диабет, увеит, рассеянный склероз, контролируемое отторжение трансплантата после трансплантации органа, реакция трансплантат против хозяина (СУНО), воспалительные заболевания легких, включающие в себя астму и хроническое обструктивное заболевание легких (ΟΟΡΏ) (2), рак (4), системная красная волчанка, 8ЬЕ, саркоидоз, атопический дерматит и рак.
18. Способ облегчения одного или нескольких симптомов и/или характеристик, и/или для улучшения параметра воспалительного нарушения у индивида, причем этот способ предусматривает введение указанному индивидууму молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида, определенных в любом из пп.1-12, или композиции, определенной в любом из пп.13-15.
19. Способ по п.18, где воспалительным нарушением является ревматоидный артрит (КА), ювенильный ревматоидный артрит, псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, воспалительное заболевание кишечника, включающее в себя болезнь Крона или язвенный колит, гепатит, сепсис, алкогольное поражение печени и неалкогольная себорея, саркоидоз, аутоиммунный диабет, сахарный диабет, увеит, рассеянный склероз, контролируемое отторжение трансплантата после трансплантации органа, реакция трансплантат против хозяина (СУНО), воспалительные заболевания легких, включающие в себя астму и хроническое обструктивное заболевание легких (ΟΟΡΏ) (2), рак (4), системная красная волчанка, 8ЬЕ, саркоидоз, атопический дерматит и рак.