EA021817B1

EA021817B1 - Кристаллический (r)-(e)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)этокси)-1h-индазол-3-ил)винил)-1h-пиразол-1-ил)этанола моногидрат

Info

Publication number: EA021817B1
Application number: EA201390275A
Authority: EA
Inventors: Бенджамин Алан Дисероад
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2010-10-05
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2015-09-30
Also published as: JP2013538875A; HRP20151299T1; SI2625175T1; CA2813329C; US20120083511A1; UA111725C2; KR20130052680A; JP5940547B2; HK1184147A1; TW201249826A; ZA201301560B; CA2813329A1; BR112013006336A2; PL2625175T3; TWI418554B; DOP2013000072A; ECSP13012539A; ES2558777T3; DK2625175T3; ME02307B

Abstract

В изобретении предложен кристаллический (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)этокси)-1H-индазол-3-ил)винил)-1H-пиразол-1-ил)этанола моногидрат, подходящий для применения для лечения рака, а также фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая указанное соединение.

Description

Фактор роста фибробластов (РОР) известен в качестве важного медиатора многих физиологических процессов, таких как морфогенез в ходе развития и ангиогенез. Семейство рецепторов фактора роста фибробластов (РОРК) состоит из четырёх представителей (РОРК1-РОРК4), которые представляют собой гликопротеины, состоящие из внеклеточных иммуноглобулиноподобных (1д-подобных) доменов, гидрофобного трансмембранного участка и цитоплазматического участка, содержащего тирозинкиназный домен. Связывание РОР приводит к димеризации РОРК с последующим аутофосфорилированием рецептора и активацией нисходящих сигнальных путей. Активация рецептора является достаточной для рекрутирования и активации специфических нисходящих сигнальных партнёров, участвующих в регуляции различных процессов, таких как рост клеток, метаболизм клеток и выживаемость клеток. Таким образом, сигнальный путь РОР/РОРК оказывает плейотропное действие на множество биологических процессов, важных для пролиферации, миграции, инвазии опухолевых клеток и ангиогенеза.

Винилиндазолы известны в данной области техники в качестве средств для лечения рака. См., например, №0 2002/10137 и №О 2003/101968. Ингибиторы РОРК также известны в данной области техники. См., например, №0 2002/022598.

В РСТ/и§2010/033487 предложена аморфная форма (К)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпиридин-4ил)этокси)-1Н-индазол-3-ил)винил)-1Н-пиразол-1-ил)этанола, которая является низкокристаллической и подходит для применения в качестве ингибитора РОРК.

В настоящем изобретении предложен кристаллический (К)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпиридин-4ил)этокси)-1Н-индазол-3-ил)винил)-1Н-пиразол-1-ил)этанола моногидрат, характеризующийся рентгеновской порошковой дифрактограммой (Си излучение, λ=1,54059 А), содержащей пик при 14,65 (2θ±0,1°), пик при 3,54 (2θ±0,1°), пик при 12,51 (2θ±0,1°), пик при 19,16 (2θ±0,1°), который является сильным ингибитором РОРК и может обеспечивать преимущества по сравнению с известной ранее формой, а именно: удобство в обращении при использовании в твёрдом состоянии в больших масштабах, простоту очистки путём кристаллизации и превосходную термодинамическую устойчивость в условиях фармацевтической переработки и хранения.

В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции для лечения рака, содержащие соединение согласно настоящему изобретению в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями.

Указанные виды рака выбраны из группы, состоящей из рака молочной железы, рака лёгкого, рака мочевого пузыря, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака простаты, рака толстой кишки, множественной миеломы ОМЛ, рака печени, меланомы, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, почечно-клеточного рака, глиобластомы и рака яичка.

Для специалиста в данной области техники будет понятно, что все соединения согласно настоящему изобретению способны образовывать соли. Указанные соединения согласно настоящему изобретению представляют собой амины и, следовательно, реагируют с любой из неорганических и органических кислот с образованием фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Такие фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и общая методика их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, Р. 5>1аН1 с1 а1., НапбЬоок οί РЬаттасеийса1 5>айх: Ргорсгйсх. §е1ее1юи Апб ихс (УСНА/№йеу-УСН, 2008); δ.Μ. Вегде е1 а1., РйагтасеиБса1 БаНз, 1оитпа1 οί РйагтасеиБса1 Баепсек, νο1. 66, Νο. 1, 1апиагу 1977.

В настоящем описании термин выделенный означает кристаллический (К)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5дихлорпиридин-4-ил)этокси)-1Н-индазол-3-ил)винил)-1Н-пиразол-1-ил)этанол, чистота которого составляет 99%.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены, по существу, как показано в примерах получения и примерах ниже. Названия в следующих примерах получения и примерах получены с применением инструмента получения наименований Б1гис1=№нпе в СйетЭтате® ИНта 10.0.

Пример получения 1.

1-(3,5 -Дихлорпиридин-4-ил)этанол.

В 3-горлую круглодонную колбу вместимостью 12 л добавляют тетрагидрофуран (ТГФ, 3 л) и диизопропиламин (ДИПА, 315 мл, 2,24 моль), после чего смесь охлаждают до -78°С. Медленно добавляют нбутиллитий (1,6 М в гексане, 1400 мл, 2,24 моль). После того как указанное добавление завершено и температура стабилизировалась на отметке -78°С, медленно добавляют раствор 3,5-дихлорпиридина (296,7 г, 2,00 моль), который сразу же образует раствор жёлтого цвета, который, в свою очередь, превращается в суспензию цвета ржавчины. После того как указанное добавление завершено и температура стабилизировалась на отметке -78°С, медленно добавляют ацетальдегид (230 мл, 4,05 моль) в ТГФ (600 мл). Продолжают перемешивание при -78°С. Через 3 ч баню с сухим льдом удаляют и начинают гасить реакцию путём добавления по каплям насыщенного водного раствора хлорида аммония (1 л). Обеспечивают нагревание реакционной смеси до комнатной температуры (КТ) в течение ночи при перемешивании. Полученную смесь разбавляют метил-трет-бутиловым эфиром (МТБЭ, 2 л), насыщенным водным раствором хлорида аммония (1 л) и водой (2 л). Разделяют и промывают органические вещества с применением насыщенного водного раствора хлорида натрия (рассола). Водную фазу подвергают экс- 1 021817 тракции с применением МТБЭ (1,5 л). Органические слои объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют под вакуумом. Остаток подвергают очистке путём хроматографии на силикагеле [25% этилацетат (ЭА) в гексане] с получением указанного в заголовке соединения в виде масла красного цвета.

Выход составляет 352 г (90%).

МС (ЭР) т/ζ 192 [М+1]+.

Пример получения 2.

(8)-1-(3,5-Дихлорпиридин-4-ил)этанол.

Смесь стереоизомеров, полученную на этапе 1, разделяют на колонке СШКАЬРАК® ΑΌ-Н при элюировании смесью 90% гептана/10% этанола. Пик 2 соответствует целевому энантиомеру. Для установления абсолютной конфигурации растворяют образец продукта в СОС1₃ (конечная концентрация 100 мг/мл). Получают спектр колебательного кругового дихроизма (ККД) и инфракрасный (ИК) спектр с разрешением 4 см^-1 с применением ККД спектрометра С1йга11Р РТ (ΒίοΤοοΙδ 1пс®) с детектором ИК-излучения, снабжённым окнами из ВаР₂, при толщине слоя 100 мм. ККД и ИК снимают в течение 6 ч с применением 150 мкл образца. Указанные данные представляют без сглаживания или дополнительной обработки. Получают частоты колебаний и интенсивности поглощений и ККД путём оптимизации низкоэнергетического конформера по методу Гаусса при В3Р\У91/6-31С** уровне на кластере Ыпих и симулируют соответствующие спектры с применением полосы колебательного кругового дихроизма лоренцевой формы шириной 6 см^-1. Приведённый выше анализ показывает, что продукт представляет собой δ-изомер.

Выход составляет 84,37 г (27%).

Μδ (ЭР) т/ζ 192 [М+1]+.

Пример получения 3.

^)-1-(3,5-Дихлорпиридин-4-ил)этилметансульфонат.

Растворяют ^)-1-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)этанол (5,02 г, 26,14 ммоль) в дихлорметане (ДХМ, 100 мл) и охлаждают колбу на ледяной бане. Добавляют триэтиламин (ТЭА, 3,5 мл, 25,11 ммоль) с последующим добавлением по каплям метансульфонилхлорида (2,2 мл, 28,42 ммоль). Ледяную баню удаляют и оставляют реакционную смесь нагреваться до КТ. Через 4 ч гасят указанную реакцию водой (100 мл) и разделяют слои. Водный слой подвергают экстракции ДХМ (50 мл), а затем смесью 20% изопропилового спирта (ИПС)/хлороформа (50 мл). Органические экстракты объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют под вакуумом.

Выход составляет 7,15 г (100%).

МС (ЭР) т/ζ 270 [М+1]+.

Пример получения 4.

4- Йод-1-(2-(тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)этил)-1Н-пиразол.

В 3-горлой колбе вместимостью 1 л, снабжённой магнитной мешалкой, трубкой для ввода азота и датчиком внутренней температуры, растворяют 2-(2-бромэтокси)тетрагидро-2Н-пиран (34 г, 156 ммоль) в ацетонитриле (АЦН, 400 мл). Добавляют 4-йодпиразол (29,34 г, 149,74 ммоль) с последующим добавлением карбоната цезия (73,4 г, 223,02 ммоль). Перемешивают полученную смесь при КТ в течение 18 ч. Фильтруют реакционную смесь через целит (СБЫТЕ®), промывают отфильтрованный осадок АЦН и концентрируют фильтрат до получения масла золотистого цвета. Применяют без дополнительной очистки.

Выход составляет 47,819 г (99%).

МС (ЭР) т/ζ 323 [М+1]+.

Пример получения 5.

5- (трет-Бутилдиметилсилилокси)-1Н-индазол.

В реакционный сосуд вместимостью 10 л загружают Ν,Ν-диметилформамид (ДМФА, 2,50 л), 5-гидроксииндазол (150,20 г, 1,12 моль) и 1Н-имидазол (114,35 г, 1,68 моль). Полученную смесь охлаждают до 0°С и добавляют трет-бутилдиметилхлорсилан (253,16 г, 1,68 моль) в течение 0,5 ч. Полученную смесь перемешивают при 18°С в течение 3 ч. В реакцию медленно добавляют воду (2,5 л) с применением ледяной бани с температурой 5°С для поддержания внутренней температуры на уровне примерно 20°С. Смесь перемещают в делительную воронку и подвергают экстракции ЭА (2x2,5 л). Экстракты объединяют и промывают водой (3x2,5 л) и рассолом. Органические растворы сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают до получения масла красного цвета. Указанное масло пропускают через наполнитель из силикагеля и элюируют с применением элюента (от 0 до 30% ЭА в гексане) с получением указанного в заголовке соединения в виде масла оранжевого цвета, кристаллизуется.

Выход составляет 300 г (100%).

МС (ЭР) т/ζ 249 [М+1]+.

- 2 021817

Пример получения 6.

5-(трет-Бутилдиметилсилилокси)-3-йод-1Н-индазол.

Раствор 5-(трет-бутилдиметилсилилокси)-1Н-индазола (300,00 г, 1,21 моль) в ДХМ (4,00 л) охлаждают до 10°С в реакторе с рубашкой вместимостью 10 л. К полученному раствору добавляют Ν-йодсукцинимид (298,89 г, 1,33 моль) порциями в течение 0,5 ч. Смесь перемешивают при КТ в течение 3 ч, чтобы обеспечить полное превращение по данным жидкостной хроматографии с массспектрометрией (ЖХ-МС) и тонкослойной хроматографии (ТСХ). Далее смесь охлаждают до 10°С и гасят водой (2,5 л). Смесь перемещают в делительную воронку и водный слой подвергают экстракции ДХМ (2,5 л). Объединённые органические экстракты промывают 10% водным раствором тиосульфата натрия (5 л) и рассолом. Органический раствор сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения в виде твёрдого вещества оранжевого цвета.

Выход составляет 388 г (90%).

МС (ЭР) т/ζ 375 [М+1]+.

Пример получения 7.

5-(трет-Бутилдиметилсилилокси)-3-йод-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-индазол.

Раствор 5-(трет-бутилдиметилсилилокси)-3-йод-1Н-индазола (387,00 г, 1,08 моль) в ДХМ (2,50 л) и ТГФ (1,00 л) охлаждают до 10°С в реакционном сосуде вместимостью 10 л, снабженном рубашкой. К полученной смеси добавляют метансульфоновую кислоту (14,0 мл, 216,02 ммоль) с последующим добавлением 3,4-дигидро-2Н-пирана (296 мл, 3,24 моль) в течение 0,5 ч, наблюдая незначительный экзотермический эффект. Смесь перемешивают при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждают до 10°С и реакцию гасят насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2 л). Смесь разбавляют водой (2 л) и водный слой подвергают экстракции ДХМ (2 л). Объединённые органические экстракты промывают водой (2 л) и рассолом. Органическую смесь сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют под вакуумом. Остаток элюируют через слой силикагеля с применением элюента (от 0 до 10% ЭА/гексан) с получением указанного в заголовке соединения.

Выход составляет 150 г (31%).

МС (ЭР) т/ζ 459 [М+1]+.

Пример получения 8.

(Е)-1-(Тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-3-(2-(1-(2-(тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)этил)-1Н-пиразол-4ил)винил)-1Н-индазол-5-ол.

Смесь 5-(трет-бутилдиметилсилилокси)-3-йод-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-индазола (14 г, 30,54 ммоль) в ДМФА (150 мл) барботируют азотом в течение 10 мин в 3-горлой круглодонной колбе вместимостью 500 мл, снабжённой магнитной мешалкой, датчиком температуры и холодильником с перегородками. К полученному раствору добавляют трибутиламин (ТБА, 6,7 г, 36,1 ммоль) и 4,4,5,5-тетраметил-2-винил-1,3,2-диоксаборолан (7,0 г, 43,18 ммоль) и продолжают барботирование в течение 10 мин. К полученной смеси добавляют хлорид бис-(трифенилфосфин)палладия(11) (0,45 г, 0,63 ммоль) и продолжают барботировать в течение дополнительных 0,5 ч. Смесь нагревают до 95-100°С в течение 18 ч. Далее охлаждают реакционную смесь до температуры ниже 40°С и загружают 4-йод-1-(2-(тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)этил)-1Н-пиразол (9,8 г, 30,42 ммоль). К полученной смеси добавляют октагидрат гидроксида бария (19,3 г, 60,3 ммоль) и воду (13 мл) и продолжают барботирование в течение 10 мин. В реакционную смесь добавляют комплекс хлорид [1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроцен]палладия(11) и ДХМ (1,3 г, 1,56 ммоль) и продолжают барботирование в течение 0,5 ч. Смесь нагревают до 95°С в атмосфере азота в течение 3 ч. Смесь разбавляют ЭА и фильтруют через целит (Се1йе®). Целит промывают рассолом (400 мл) и разделяют слои фильтрата. Органический слой промывают рассолом и объединённые водные слои подвергают экстракции ЭА. Органические растворы объединяют и концентрируют до получения масла коричневого цвета. Указанное масло растворяют в ДХМ (100 мл) и добавляют к наполнителю из силикагеля. Наполнитель промывают с применением элюента (50% ЭА в гексане с последующим применением 70% ЭА в гексане) с получением масла светло-коричневого цвета. Растирают в порошок с применением МТБЭ (100 мл) с получением указанного в заголовке соединения в виде твёрдого вещества.

Выход составляет 5 г (37%).

МС (ЭР) т/ζ 439 [М+1]+.

Пример получения 9.

5-((К)-1-(3,5-Дихлорпиридин-4-ил)этокси)-1 -(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-3 -((Е)-2-( 1 -(2-(тетрагидро2Н-пиран-2-илокси)этил)-1Н-пиразол-4-ил)винил)-1Н-индазол.

В 3-горлой круглодонной колбе вместимостью 250 мл, снабжённой датчиком внутренней температуры, обратным холодильником, трубкой для ввода азота и магнитной мешалкой, суспендируют (Е)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-3 -(2-(1-(2-(тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)этил)-1Н-пиразол-4ил)винил)-1Н-индазол-5-ол (10,0 г, 22,83 ммоль) и карбонат цезия (7,88 г, 23,94 ммоль) в АЦН (92 мл), после чего нагревают суспензию до 60°С. К указанной суспензии добавляют (§)-1-(3,5-дихлорпиридин-4ил)этилметансульфонат (7,03 г, 26,02 ммоль) и перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь охла- 3 021817 ждают до КТ, фильтруют и твёрдую фазу промывают АЦН. Фильтрат концентрируют и остаток подвергают очистке путём хроматографии на силикагеле (2-4% (2 М аммиака в метаноле)/ДХМ). Фракции продукта объединяют и концентрируют под вакуумом с получением пены белого цвета.

Выход составляет 12,5 г (86%).

МС (ЭР) т/ζ 612 [М+1]+.

Пример получения 10 (аморфная форма).

(К)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-Дихлорпиридин-4-ил)этокси)-1Н-индазол-3-ил)винил)-1Н-пиразол-1ил)этанол

В 3-горлую круглодонную колбу вместимостью 250 мл, снабжённую капельной воронкой, отверстием для ввода азота, датчиком внутренней температуры и магнитной мешалкой, загружают метанол (57 мл) и охлаждают на ледяной бане. К полученному раствору медленно через капельную воронку добавляют ацетилхлорид (20 мл, 281,03 ммоль). К раствору через капельную воронку добавляют 5-((К)-1(3,5-дихлорпиридин-4-ил)этокси)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-3-((Е)-2-(1-(2-(тетрагидро-2Н-пиран-2илокси)этил)-1Н-пиразол-4-ил)винил)-1Н-индазол (7,1 г, 11,59 ммоль), растворённый в метаноле (40 мл). После завершения добавления удаляют ледяную баню, смесь нагревают до КТ и перемешивают в течение 4 ч. Реакционную смесь концентрируют под вакуумом с получением пены жёлтого цвета. Жёлтую пену растворяют в метаноле (10 мл) и медленно добавляют к насыщенному водному раствору бикарбоната натрия (120 мл). Полученную смесь перемешивают при КТ в течение 30 мин. Смесь фильтруют, твёрдое вещество промывают водой (100 мл) и сушат под вакуумом. Указанное твёрдое вещество перекристаллизовывают из горячего ЭА/метанола/гексана с получением указанного в заголовке соединения в виде твёрдого вещества белого цвета.

Выход составляет 2,1 г (41%).

МС (ЭР) т/ζ 444 [М+1]+.

Пример 1.

Получение формы 1 моногидрата (К)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)этокси)-1Ниндазол-3 -ил)винил)-1Н-пиразол-1 -ил)этанола.

Реакционный сосуд продували азотом и загружали в него (К)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпиридин4-ил)этокси)-1Н-индазол-3-ил)винил)-1Н-пиразол-1-ил)этанол и смесь растворителей, состоящую из 11% воды/ацетонитрила. Полученную суспензию нагревали до внутренней температуры 66-68°С с получением раствора. Указанный раствор медленно охлаждали до 56-58°С, затем вносили затравку с применением суспензии, представляющей собой затравочные кристаллы в смеси 11% воды/ацетонитрила, и медленно перемешивали. Сначала реакционную смесь охлаждали до 48-50°С, а затем до 19-20°С. Продукт выделяли путём фильтрования при наличии потока азота с относительной влажностью по меньшей мере 80%, пропускаемого через твёрдую лепёшку. Затем уровень влажности в потоке азота последовательно снижали до 40% и продолжали сушку, что приводило к получению указанного в заголовке соединения. Следует отметить, что затравочный кристалл получали аналогично, а именно: реакционный сосуд продували азотом и загружали в него (К)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)этокси)-1Н-индазол-3ил)винил)-1Н-пиразол-1-ил)этанол и смесь растворителей, состоящую из 11% воды/ацетонитрила. Полученную суспензию нагревали до внутренней температуры 70°С с получением раствора. Затем указанный раствор медленно охлаждали, обеспечивали кристаллизацию, кристаллы фильтровали и сушили. Полученное соединение представляет собой сильный ингибитор ЕСРК и по сравнению с указанным соединением в предшествующей форме может обладать предпочтительными свойствами, а именно превосходной обрабатываемостью твёрдых веществ в больших масштабах, легкостью очистки путём кристаллизации и термодинамической устойчивостью в условиях фармацевтической обработки и хранения.

Соединение согласно примеру 1, ПРД.

Дифрактограмму ПРД снимали с применением дифрактометра ΡΑΝαΙνΙίοαΙ Х'Рей™ Рго ΜΡΌ Ρ\ν3040 Рго с излучением СиК_а (λ=1,54059 А (напряжение: 45 кВ и сила тока: 40 мА)), полученным с применением источника с длинным острым фокусом Θρΐίχ. Образец помещали между плёнками толщиной 3 мкм, анализировали геометрию пропускания и вращали со скоростью 1 об/с, чтобы оптимизировать статистические данные по ориентации. Перед проведением анализа анализировали образец кремния (стандартный эталонный материал ΝΙδΤ 640с), чтобы установить положение пика кремния 111. Для указанного материала анализировали одну дифрактограмму ΡΑΝαΙνΙίοαΙ и результат предпочтительной ориентации и статистического описания частиц оценивали путем сравнения воспроизведённой дифрактограммы ПРД с анализом монокристалла. Для фокусировки рентгеновского излучения СиК_а источника так, чтобы указанное излучение проходило через образец и попадало на детектор, применяли эллиптиче- 4 021817 ски изогнутое градуированное многослойное зеркало. Дифрактограммы снимали с применением сканирующего позиционно-чувствительного детектора (Х'Се1ета1от), расположенного на расстоянии 240 мм от образца. Данные снимали в интервале от 1,01 до 39,99° 2Θ с шагом 0,017° 2Θ и скоростью сканирования 1,2°/мин и с установкой щели, ограничивающей расходимость на 0,5°, и щели, ограничивающей рассеивание, на 0,25°. Чтобы минимизировать фон, вызванный рассеиванием излучения в воздухе, применяли поглотитель излучения. Щели Соллера применяли для падающего и дифрагированного пучков лучей, чтобы минимизировать вертикальную расходимость. Наблюдаемые пики представлены в таблице. Порог интенсивности составлял 5%.

Наблюдаемые пики для соединения согласно примеру 1, ПРД

2Θ	Расстояние ά (А)	Интенсивность {%)
3,54 ±0,10	24,975 ± 0,726	45
7.08 ±0,10	12,485 ±0,179	10
10,62 ±0,10	8,328 ± 0,079	9
12,51 ±0,10	7,075 ± 0,057	78
13,00 + 0,10	6,812 ±0,053	37
13,60 ±0,10	6,512 ±0,048	16
14,18 ± 0,10	6,245 ± 0,044	13
14,65 ±0,10	6,046 ±0,041	100
14,97 ±0,10	5,919 ±0,040	29
15,49 + 0,10	5,722 + 0,037	16
16,24 ±0,10	5,459 ± 0,034	35
16,59 ±0,10	5,344 ± 0,032	24
17,06 ±0,10	5,198 ±0,030	26
17,76 ±0.10	4,995 ± 0,028	20
18,49 ±0,10	4,798 ± 0,026	9
19,16 ±0,10	4,632 ± 0,024	68
20,37 ±0,10	4,361 ± 0,021	44
21,67 ±0,10	4,101 ±0,019	8
21,89 ±0,10	4,061 ±0,018	8
22,17+0.10	4,010 ±0,018	22
23,02 ±0,10	3,863 ±0,017	54

24,33 + 0,10	3,659 ±0,015	15
25,25 ±0,10	3,528 ± 0,014	27
25,93 ±0,10	3,436 ±0,013	49
26,16 ±0,10	3,406 ±0,013	16
26,77 ±0,10	3,331 ±0,012	10
27,23 + 0,10	3,275 ±0,012	15
28,25 ±0,10	3,159 ±0,011	10
28,59 ±0,10	3,123 ±0,011	11
29,56 ±0,10	3,022 ±0,010	13

Таким образом, образец из примера 1, полученный должным образом, может характеризоваться рентгеновской порошковой дифрактограммой, полученной с применением излучения СиК_а , содержащей пики дифракции (значения 2-тета), указанные в таблице, в частности содержащей пики при 14,65 в комбинации с одним или более пиками при 3,54, 12,51 и 19,16, и более конкретно, содержащей пик при 14,65, с допустимыми углами отклонения при дифракции 0,1°, более предпочтительно 0,01°.

Многие виды злокачественных опухолей человека приводили к нарушению регуляции пути РОР/РОРК. РОРК и РСР часто чрезмерно экспрессируются при многочисленных видах рака, и их экспрессия часто соответствует неблагоприятным прогнозам. Активирующие мутации в киназном домене РОРК были обнаружены при нескольких видах опухолей, включая рак молочной железы, НМРЛ, рак мочевого пузыря, желудка, простаты, толстой кишки и множественную миелому. Г еномную амплификацию локуса РОРК также обнаруживали у многих пациентов с раком молочной железы, желудка и лёгкого. Сверхэкспрессия РОРК или РСР также была обнаружена при многих различных видах опухолей, таких как рак мочевого пузыря, множественная миелома, рак простаты и лёгкого. Другие виды рака, лечение которых ингибитором пути семейства РОРК может иметь положительный результат, включают

- 5 021817

АМЛ, рак печени, меланому, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, рак поджелудочной железы, почечно-клеточный рак, глиобластому и рак яичка. Наряду с ролью в образовании и развитии опухолей РОР и РОРК также являются важнейшими регуляторами ангиогенеза, особенно во время роста опухоли. Ось РОР/РОРК также играет важную роль в увеличении других стромальных клеток опухоли, таких как ассоциированные с раком фибробласты. Повышающая регуляция РОР также приводит к устойчивости к антиангиогенной терапии и другим видам химиотерапии. Наконец, низкомолекулярные ингибиторы РОРК демонстрировали противоопухолевую активность в нескольких доклинических моделях опухолей и в настоящее время изучаются в клинических условиях. В своей совокупности РОР/РОРК путь имеет существенное значение для нескольких важных клеточных процессов в раковых клетках. Согласно указанным причинам способы лечения, основанные на таргетинге сигнальной системы РОРК и/или РОР, могут действовать как непосредственно на клетки опухоли, так и на опухолевый ангиогенез.

Продукт 10 испытывали, по существу, как описано ниже, проводя следующие анализы: ферментный анализ РОРК1 (связывание на фильтрах), ферментный анализ РОРК3 (связывание на фильтрах), клеточный анализ РОР9-индуцированной р-ЕКК в КТ-112 (в присутствии БСА) и клеточные анализы А1рЬа8стееп ЗитеРце обнаружения фосфорилирования ЕКК (ТЬт202/Тут204) в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (ЭКПВЧ). Указанные анализы демонстрируют, что продукт 10 представляет собой ингибитор пути семейства РОРК и обладает противораковой активностью. Таким образом, результаты, полученные для применением аморфной формы (К)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпиридин-4ил)этокси)-1Н-индазол-3-ил)винил)-1Н-пиразол-1-ил)этанола, являются показательными в отношении результатов, полученных для соединения согласно настоящему изобретению. Кристаллические формы указанного соединения тем не менее являются предпочтительными, поскольку по сравнению с известной ранее формой могут обеспечивать удобство в обращении при использовании в твёрдом виде в больших масштабах, простоту очистки путём кристаллизации и превосходную термодинамическую устойчивость в условиях фармацевтической переработки и хранения.

Ферментный анализ РОРК1 и РОРК3 (связывание на фильтрах).

Киназу РОРК1 или РОРК3 (0,15 нг/мкл РОРК1 человека или 0,32 нг/мкл РОРК3 человека) выдерживали в 50 мкл буферного раствора, содержащего 10 ммоль 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (ГЭПЭС) с рН 7,5, 8 ммоль трис-(гидроксиметил)аминометана (трис-НС1) с рН 7,5, 5,0 ммоль дитиотреитола (ДТТ), 10,0 мкмоль аденозинтрифосфата (АТФ), 10 ммоль МпС1₂, 150 ммоль ЫаС1, 0,01% ΤΡΙΤΟΝ® Х-100, 0,5 мкКи ³³Р-АТФ и 0,05 мкг/мкл поли(О1и-Туг). Реакцию проводили в объёме 50 мкл при КТ в течение 30 мин, а затем гасили путём добавления 130 мкл 10% Н₃РО₄. Реакционную смесь (120 мкл) перемещали в 96-луночный планшет с размером пор 1,0 мкм с фильтром из стекловолокна, выдерживали при КТ в течение 20-30 мин, а затем трижды промывали на Т1ТРЕТЕК® Ζοοιη с применением 0,5% Н₃РО₄. Перед добавлением 40 мкл МютоЗсш!™ 20 (Раскагй) лунки подвергали воздушной сушке, а затем подсчитывали на счётчике ТОаНас МюоЪе1а. Для осуществления соединением ингибирования обеспечивали указанное соединение в виде растворов 10 ммоль исходного продукта в диметилсульфоксиде (ДМСО). Указанное соединение последовательно разбавляли 20% ДМСО в соотношении 1:3 для получения 10 точек кривой концентрация-эффект и разбавляли в соотношении 1:5 (от 20 мкмоль до конечной концентрации 0,001 мкмоль в 4% ДМСО) в реакционном планшете перед добавлением реакционной смеси в планшет с фильтром для определения активности соединения. Контрольные лунки содержали только 4% ДМСО, тогда как основные данные устанавливали на основе контрольных лунок, содержащих 0,1 моль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Процент ингибирования для каждой из 10 концентраций вычисляли исходя из контрольных лунок на каждом планшете, и данные зависимости эффекта от 10 значений концентрации впоследствии анализировали с применением программы АсЙУЙуВаке (ГОВ8), используя логистическое уравнение с 4 параметрами, и абсолютные значения 1С₅₀ устанавливали исходя из кривой, полученной в результате подбора. Минимально значимые отношения (МСК) для установленной 1С₅₀ в ферментных анализах РОРК1 и РОРК3 составляли 1,38 и 1,47 соответственно. В ходе указанных анализов было установлено, что 1С₅₀ продукта 10 для РОРК1 и РОРК3 составляла 0,0077 и 0,0064 мкмоль соответственно. Указанные данные демонстрируют, что продукт 10 является сильным ингибитором ферментов РОРК1 и РОРК3.

РОР9-индуцированная р-ЕКК с БСА.

Клетки КТ112 раковой опухоли мочевого пузыря человека высеивали при плотности 5000 клеток/лунку в 100 мкл КРМ1 1640 (ОФсо 11875-085) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС, ОФсо 10082-147) и 1% раствора пенициллина/стрептомицина (Оксо 15140-122) в 96-луночные планшеты СЕБЕВШО®® (Сотшпд 3340) и выдерживали в течение ночи при 37°С. На следующее утро среду для роста удаляли и заменяли на 100 мкл КРМ1 1640 с добавлением 20 мг/мл альбумина бычьей сыворотки (БСА). После 3 ч выдерживания при 37°С в каждую лунку добавляли 20 мкл соединений, разбавленных в три этапа, в КРМ1 1640 с 20 мг/мл БСА в 6% ДМСО. Это давало 10 точек кривой дозаэффект в диапазоне 10-0,005 мкмоль в 1% ДМСО. Выдерживание продолжали в течение 1 ч при 37°С. Клетки стимулировали с применением 50 мкл раствора 50 мкг/мл РОР9 (Р&Э ЗуЧепъ 273-Р9) в бессывороточной КРМ1 с получением конечной концентрации РОР9 500 нг/мл. Клетки фиксировали путём

- 6 021817 добавления 30 мкл 25% раствора формальдегида в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (конечная концентрация формальдегида 3,7%) и выдерживали в течение 30 мин при КТ. Клетки трижды промывали ФСБ с последующим добавлением 100 мкл охлаждённого метанола и выдерживали в течение 30 мин при -20°С. Метанол удаляли и клетки обрабатывали ФСБ, содержащим 0,1% ΤΡΙΤΟΝ® Х-100 (ФСБТ), трижды промывали ФСБ и выдерживали 15 мин при КТ. Затем клетки выдерживали в течение ночи при 4°С при осторожном встряхивании в 50 мкл раствора первичных антител к р-р44/42 МАРК (Се11 8щпа1ш8 91018) в ФСБ в соотношении 1:400 с добавлением 2% БСА, 0,01% коктейля ингибиторов фосфатазы 1 (8щша Р2850), 0,01% коктейля ингибиторов фосфатазы 2 (8щша Р5726) и 0,01% коктейля ингибиторов протеаз (8щша Р8340). На следующее утро планшеты дважды промывали ФСБТ и дважды ФСБ с последующим выдерживанием в течение 1 ч при КТ в темноте в 80 мкл раствора вторичных антител козы против 1§О Н+Ь кролика, конъюгированных с А1еха Р1иот 488, (ВуЬтодеп А11034) в ФСБ в соотношении 1: 1000 с 1% БСА и 0,1% коктейля ингибиторов фосфатазы 1, 0,01% коктейля ингибиторов фосфатазы 2 и 0,01% коктейля ингибиторов протеаз. Клетки трижды промывали ФСБ с последующим добавлением 100 мкл раствора пропидиййодида (ПИ) (молекулярный зонд Р-3566) в ФСБ в соотношении 1:200, а затем выдерживали в темноте в течение 1 ч. Количество р-ЕКК-положительных клеток и общее количество клеток в каждой лунке определяли при помощи ΑΟυΜΕΝ ЕХРЬОКЕК™ (ΤΤΡ ЬаЬТесЬ Ыб) с применением оптического фильтра 500-530 нмоль и 575-640 нмоль для А1еха 488 и ПИ соответственно. Значения общей средней интенсивности рЕКК на лунку при применении А1еха 488 впоследствии преобразовывали в процент ингибирования с применением значений, полученных исходя из минимального (10 мкмоль положительного контрольного соединения в ДМСО) и максимального (только ДМСО) контроля, оборудованного на одном и том же планшете. Проценты ингибирования и данные зависимости эффекта от 10 значений концентрации впоследствии анализировали с применением сигмоидального уравнения доза-эффект с 4 параметрами и относительные значения 1С₅₀ устанавливали исходя из полученной кривой. Минимально значимое отношение (МСК) для 1С₅₀, установленной в ходе анализа РОР9, индуцированного р-ЕКК с БСА, составляло 2,7. В ходе указанного анализа было установлено, что 1С₅₀ продукта 10 составляла 0,0004 мкмоль. Указанные данные демонстрируют, что продукт 10 является сильным ингибитором РОР9-индуцированного фосфорилирования ЕКК в раковых клетках человека.

Определение фосфорилирования ЕКК (Τ1ιγ202/Τυγ204) в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (ЭКПВЧ) с применением А1рЬа8стееи 8итеР1те.

Влияние соединения на ингибирование рецептора РОЕ 1 определяли путём мониторинга фосфорилирования ЕКК (рЕКК) в ответ на стимуляцию основного фактора роста фибробластов (Ь-РОР) в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (ЭКПВЧ). Уровни полученной рЕКК измеряли с применением системы А1рЬа8стееи® 8итеР1те® (ТСК Вюкаепсек, ТСКЕ850К). Данный анализ носит гомогенный характер и проводится с применением сэндвич-иммунного связывания фосфорилированного анализируемого образца с последующим обнаружением с применением гранул А1рЬа8стееп®, покрытых антителами, (Регкт Е1тег) для образования усиленного сигнала.

ЭКПВЧ извлекали и сохраняли в среде для роста, состоящей из основной среды для эндотелиальных клеток (С1опеОск. СС-3132) с добавлением 10% ФБС, 0,4% экстракта бычьего мозга, 0,1% гидрокортизона, 0,1% сульфата гентамицина, амфотерицина-В и 0,1% эпидермального фактора роста, рекомбинация человека до 7 пассажей. Клетки брали для анализа с применением стандартных процедур, а затем пересчитывали. Клетки (20000/лунка) высевали в 100 мкл среды для роста в 96-луночных планшетах с покрытием из поли-Э-лизина (ΒΌ, 354640). Планшеты выдерживали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂.

В день проведения анализа клетки выдерживали в 100 мкл бессывороточной ОЭК (основной для эндотелиальных клеток) среды, содержащей 1,5% ФБС и 20 мг/мл БСА, в течение 3 ч при 37°С, 5% СО₂, затем обрабатывали 20 мкмоль соединения, разбавленного в три этапа, в минимальной среде в течение 1 ч при 37°С. Это давало 10 точек кривой концентрации-эффекта в диапазоне 10-0,005 мкмоль в 1% ДМСО. После 1 ч обработки соединения клетки стимулировали с применением 50 мкл Ь-РОР (81дта, Р0291, конечная концентрация Ь-РОР 50 нг/мл) при 37°С в течение 15 мин. В лунках, содержащих клетки и 50 мкл стимулятора Ь-РОР, вырабатывался максимальный сигнал, а в лунках, содержащих клетки с 10 мкмоль положительного контрольного соединения и 50 мкл стимулятора Ь-РОР, вырабатывался минимальный сигнал. Затем среду удаляли, в каждую лунку добавляли 50 мкл 1х 8итеР1ге® буфера для лизиса (часть комплекта 8итеР1ге® ΤОК Вюкаепсек) и выдерживание продолжали при КТ в течение 10 мин при осторожном встряхивании. Для обнаружения рЕКК 6 мкл лизата и 10 мкл реакционной смеси (60 частей рабочего буферного раствора/10 частей активирующего буферного раствора/по 0,6 частей гранул донора и акцептора, Регкт Е1тег, 6760617К) перемещали в 384-луночный планшет ргох1р1а1е (Регкт Е1тег, 6006280). Указанный планшет герметизировали и выдерживали при КТ в течение 2 ч при осторожном встряхивании, а затем прочитывали на спектрофотометре для прочтения планшетов Регкт Е1тег ЕпУкюп, снабжённом Τи^ЬоΜоάи1е, с применением стандартных параметров настройки А1рЬа8стееп® (Ех_680нм и Ет_520-620нм). Показатели излучения преобразовывали в процент ингибирования, установленный исходя из максимального (только ДМСО) и минимального (10 мкмоль положительного контрольного соединения в ДМСО) контроля на каждом планшете, а затем данные при 10 значениях

- 7 021817 концентрации соединения подставляли в логистическое уравнение с четырьмя параметрами с применением ЛеЦуПуЬахс® 4,0 и устанавливали значение 1С₅₀. Минимально значимое отношение (МСК) для 1С₅₀, установленной в результате анализа, в ходе которого осуществляли А1рйа8сгееи® §игеР1ге® обнаружение фосфорилирования ЕКК (Тйт202/Тут204), составляло 2,1. В ходе указанного анализа было установлено, что 1С₅₀ продукта 10 составляла 0,0006 мкмоль. Указанные данные демонстрируют, что продукт 10 является сильным ингибитором Ь-РСР-индуцированного фосфорилирования ЕКК в эндотелиальных клетках пупочной вены человека.

Соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно готовят в виде фармацевтической композиции, вводимой различными способами. Наиболее предпочтительно такие композиции представляют собой композиции для перорального или внутривенного введения. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области. См., например, Кет1и§1ои: Тйе 8с1еисе Аиб Ргасйсе Οί РЬагтасу (Ό. Тгоу е1 а1., еЙ8., 2Г’¹ ЕЕ., Ырршсой ХУППапъ & ХУПкиъ. 2005).

Соединение согласно настоящему изобретению, как правило, эффективно в широком диапазоне доз. Например, суточные дозы обычно находятся в диапазоне от примерно 0,5 до примерно 100 мг/кг массы тела. В некоторых случаях уровни доз ниже нижнего предела вышеуказанного диапазона могут быть более чем достаточными, тогда как в других случаях могут быть применены ещё большие дозы, не вызывая каких-либо опасных побочных эффектов, и, следовательно, вышеуказанный диапазон доз в любом случае не предназначен для ограничения объёма настоящего изобретения. Следует понимать, что фактически вводимое количество соединения будет определять врач с учётом соответствующих обстоятельств, включая заболевание, подлежащее лечению, выбранный способ введения, вводимое действующее соединение или соединения, возраст, вес и восприимчивость конкретного пациента и тяжесть симптомов у пациента.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение, представляющее собой кристаллический (К)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпиридин-4ил)этокси)-1Н-индазол-3-ил)винил)-1Н-пиразол-1-ил)этанола моногидрат, характеризующееся рентгеновской порошковой дифрактограммой (Си излучение, λ=1,54059 А), содержащей пик при 14,65 (2θ±0,1°), пик при 3,54 (2θ±0,1°), пик при 12,51 (2θ±0,1°), пик при 19,16 (2θ±0,1°).
2. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение по п.1 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.