EA019838B1 - КОВАЛЕНТНЫЕ КОНЪЮГАТЫ α,α-ДВУЗАМЕЩЕННОГО ГЛИЦИНОВОГО ЭФИРА И МОДУЛЯТОРА АКТИВНОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ФЕРМЕНТА ИЛИ РЕЦЕПТОРА - Google Patents

Abstract

В изобретении представлены ковалентные конъюгаты α,α-дизамещенного глицинового эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, в которых эфирная группа конъюгата способна к гидролизу под действием одного или более внутриклеточных ферментов карбоксилэстераз с образованием соответствующей кислоты и α,α-дизамещенный глициновый эфир сопряжен с модулятором в положении, удаленном от поверхности связывания между ингибитором и целевым ферментом или рецептором, и попадает в клетки, где накапливается активный кислотный продукт гидролиза.

Description

Данное изобретение относится к способу повышения или пролонгирования активности соединения, которое модулирует активность внутри клеточного фермента или рецептора путем ковалентного конъюгирования α,α-фрагмента дизамещенного глицинового эфира с модулятором. Это изобретение относится также к модуляторам, с которыми фрагмент α,α-дизамещенного глицинового эфира ковалентно конъюгирован, и к способу идентификации таких конъюгатов, имеющих превосходные свойства относительно родительского неконъюгированного модулятора. Далее настоящее изобретение относится к применению модуляторов, содержащих фрагменты α,α-дизамещенного глицинового эфира, которые обеспечивают селективное накопление конъюгатов аминокислот в клетках линий моноцитов-макрофагов.

Предпосылки создания изобретения

Многие внутриклеточные ферменты и рецепторы являются мишенями для фармацевтически полезных лекарств, которые модулируют их активность при связывании с их активными сайтами. Примеры приведены в табл. 1 ниже. Для того чтобы достичь целевых ферментов и рецепторов, модуляторы должны, конечно, пересечь клеточную мембрану из плазмы/внеклеточной жидкости. В общем, нейтральные модуляторы пересекают клеточную мембрану легче, чем заряженные молекулы. Затем устанавливается динамическое равновесие, когда модулятор находится в состоянии равновесия между плазмой и внутренней частью клетки. Как результат равновесия, время пребывания внутри клетки и концентрации многих модуляторов внутриклеточных ферментов и рецепторов часто очень невелико, особенно в случаях, когда модулятор быстро удаляется из плазмы. Активности модуляторов поэтому невелики, несмотря на их высокое сродство к связыванию с целевым ферментом или рецептором.

Международная заявка \¥О 2006/117567 раскрывает способ повышения внутриклеточной концентрации данного модулятора внутри клеточного фермента или рецептора путем конъюгирования с фрагментом эфира α-аминокислоты, который гидролизуется одной или несколькими внутриклеточными карбоксилэстеразами 11СЕ-Е ПСЕ-2 и БСЕ-3. Это приводит к повышенной активности за счет пролонгирования пребывания модулятора внутри клетки и приводит к улучшенным фармакокинетическим и фармакодинамическим свойствам. Могут быть достигнуты более стойкое воздействие и применение меньших доз. Достигается и другое преимущество, когда фрагмент эфира α-аминокислоты сопрягается с модулятором таким образом, что лекарство попадает в конкретные целевые клетки, отвечающие за их терапевтическое действие, уменьшая системное воздействие и проявление побочных эффектов.

Конъюгаты эфира α-аминокислоты, описанные в международной заявке \¥О 2006/117567, все являются монозамещенными у α-углерода. Эта публикация не предполагает, что конъюгаты α,αдизамещенного глицинового эфира могут гидролизоваться внутриклеточными карбоксилэстеразами. В действительности, оказывается, что способность внутриклеточных карбоксилэстераз, в основном БСЕ-1, ПСЕ-2 и БСЕ-3, гидролизоавать α,α-дизамещенный глициновый эфир не была ранее исследована.

Сущность изобретения

Данное изобретение основано на обнаружении нового явления, что конъюгаты α,α-дизамещенных глициновых эфиров могут гидролизоваться внутриклеточными карбоксилэстеразами и, таким образом, способы и преимущества, описанные в заявке \¥О 2006/117567, также могут быть достигнуты с такими конъюгатами. Такие преимущества включают внутриклеточное накопление продуктов кислотного гидролиза и в некоторых случаях селективное накопление в клетках конкретного типа. Как и в заявке \¥О 2006/117567, данное изобретение имеет преимущество в том, что липофильные (низкая полярность нейтральных молекул) молекулы проходят через клеточную мембрану и попадают в клетки довольно легко, а гидрофильные (с большей полярностью, заряженные) молекулы - нет. Следовательно, если липофильный фрагмент присоединен к данному модулятору, позволяя модулятору попасть в клетку, и если этот фрагмент превращается в клетке во фрагмент с большей полярностью, ожидается, что модулятор с присоединенным фрагментом с большей полярностью будет накапливаться внутри клетки. При условии, что такой фрагмент присоединен к модулятору таким образом, при котором не изменяется его связывание с целевым ферментом или рецептором, ожидается, что накопление модулятора с присоединенным фрагментом с большей полярностью приведет к пролонгированной и/или повышенной активности.

Как и в случае заявки \УО 2006/117567, данное изобретение использует тот факт, что имеются ферменты карбоксилэстеразы в клетках, которые могут применяться для гидролиза фрагмента α,αдизамещенного глицинового эфира, присоединенного к данному модулятору родительской кислоты. Следовательно, модулятор может быть введен как ковалентный конъюгат с α,α-дизамещенным глициновым эфиром, в виде которого он легко попадает в клетку, где он эффективно гидролизуется одной или несколькими внутриклеточными карбоксилэстеразами и полученный конъюгат α,α-дизамещенный глицин-модулятор накапливается в клетке, повышая общую активность и/или время активного пребывания. Было также обнаружено, что путем модификации фрагмента α,α-дизамещенного глицинового эфира или способа, которым было достигнуто конъюгирование, модуляторы могут быть нацелены на моноциты и макрофаги. В данной заявке, если только моноцит или моноциты не конкретизированы, термины макрофаг или макрофаги применяются для обозначения макрофагов (включая макрофаги, ассоциируемые с опухолями) и/или моноцитов.

Настоящее изобретение относится к ковалентному конъюгату α,α-дизамещенного глицинового

- 1 019838 эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, где эфирная группа конъюгата селективно гидролизуется клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу йСЕ-1 по отношению к клеткам, содержащим йСЕ-2 или йСЕ-3, но не йСЕ-1;

α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевым ферментом или рецептором;

указанный α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его αаминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом, где положение конъюгирования является удаленным, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках И937; (Ь) анализа ингибирования фосфорилирования МАРКАР2, проводимого на раковых клетках И937; и (с) анализа стимулирования ЬР8, проводимого на клетках ТНР-1.

В другом варианте осуществления изобретение относится к ковалентному конъюгату α,αдизамещенного глицинового эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, где эфирная группа селективно гидролизуется клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу йСЕ-1 по отношению к клеткам, содержащим йСЕ-2 или йСЕ-3, но не йСЕ-1;

α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором таким образом, что характер связывания конъюгированного модулятора и указанной соответствующей кислоты с целевым ферментом или рецептором является таким же, как и в случае неконъюгированного модулятора;

указанный α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его αаминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом, где характер связывания является тем же самым, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках И937; (Ь) анализа ингибирования фосфорилирования МАРКАР2, проводимого на раковых клетках И937; и (с) анализа стимулирования ЬР8, проводимого на клетках ТНР-1.

В предпочтительном варианте осуществления α-заместители в α,α-дизамещенном глициновом эфире, конъюгированном с модулятором, независимо выбраны из фенила и групп формулы -СВ_аВ_Ьй_с, в которых каждый из й_а, К._Ь и Р_с независимо обозначает водород, (С₁-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂С₆)алкинил, фенил(С1-С₆)алкил, (С₃-С₈)циклоалкил; или Р_с обозначает водород, й_а и К._Ь независимо обозначают фенил или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, такой как пиридил; или Р_с обозначает водород, (С1-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂-С₆)алкинил, фенил(С1-С₆)алкил или (С₃-С₈)циклоалкил, й_а и Й_Ь вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8членный циклоалкил или 5-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О; или й_а, К._Ь и Р_с вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют адамантил; или й_а и Й_Ь, каждый независимо, обозначают (С1-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂-С₆)алкинил, фенил(С₁С₆)алкил или группу, определение которой дано ниже для Р_с, отличающуюся от водорода, или й_а и Й_Ь вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8-членный циклоалкил или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический или неароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, и Р_с обозначает водород, -ОН, -8Н, галоген, -ΟΝ, -СО₂Н, (С1-С₄)перфторалкил, -СН₂ОН, -О(С1-С₆)алкил, -О(С₂С₆)алкенил, -8(С₁-С₆)алкил, -8О(С₁-С₆)алкил, -8О₂(С₁-С₆)алкил, -8(С₂-С₆)алкенил, -8О(С₂-С₆)алкенил, -8О₂(С₂-С₆)алкенил или группу Ю-Ψ, где О обозначает связь или -О-, -8-, -8О- или -8О₂- и обозначает фенил, фенил(С₁-С₆)алкил, (С₃-С₈)циклоалкил, (С₃-С₈)циклоалкилалкил, (С₄-С₈)циклоалкенил, (С₄С₈)циклоалкенилалкил, моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, или гетероарил(С₁-С₆)алкил, в котором гетероарильная группа представляет собой моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, причем группа может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из гидроксила, галогена, -СИ -СО№Н₂, -СОХН^-С^алкила, -СОННЦС^С^алкилк, -СНО, -СН₂ОН, (С₁-С₄)перфторалкила, -О(С₁-С₆)алкила, -8(С₁-С₆)алкила, -8О(С₁-С₆)алкила, -8О₂(С₁-С₆)алкила, -ЫО₂, -ХН₂, -ЯН^-С^алкила, -ЫЦС^С^алкилк, -ЯНСО^-С^алкила, (С₁-С₆)алкила, (С₂-С₆)алкенила, (С₂-С₆)алкинила, (С₃-С₈)циклоалкила, (С₄С8)циклоалкенила, фенила или бензила.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения α-заместители α,αдизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, вместе с самим α-атомом углерода образуют 3-6-членное насьщенное циклоалкильное или гетероциклическое кольцо или по меньшей

- 2 019838 мере один из указанных α-заместителей является С1 -С₆-алкильным заместителем.

В другом предпочтительном варианте осуществлении изобретения один из α-заместителей α,αдизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является С₁ -С₆-алкильным заместителем, а другой выбран из группы, состоящей из метила, этила, н- и изопропила, н-, втор- и третбутила, фенила, бензила, тиенила, циклогексила и циклогексилметила.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения один из α-заместителей α,αдизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является метилом, а другой является метилом, этилом или н- или изопропилом или указанные α-заместители вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклопропильное, циклобутильное, циклопентильное или циклогексильное кольцо.

Настоящее изобретение также относится к способу повышения или пролонгирования внутриклеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, включающему структурную модификацию модулятора путем ковалентного присоединения к нему α,α-дизамещенного глицинового эфира в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевым ферментом или рецептором, при этом эфирная группа конъюгата способна к селективному гидролизу клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу ЕСЕ-1 по отношению к клеткам, содержащим ЕСЕ-2 или 11СЕ-3. но не ЕСЕ-1: и указанный α,αдизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его α-аминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом; где положение конъюгирования является удаленным, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках И937; (Ь) анализа ингибирования фосфорилирования МАРКАР2, проводимого на раковых клетках И937; и (с) анализа стимулирования ЬР8, проводимого на клетках ТНР-1.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повышения или пролонгирования внутриклеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, включающему структурную модификацию модулятора путем ковалентного присоединения к нему α,α-дизамещенного глицинового эфира таким образом, что характер связывания конъюгированного модулятора и соответствующей кислоты с целевым ферментом или рецептором является таким же, как и в случае неконъюгированного модулятора, при этом эфирная группа конъюгата способна к селективному гидролизу клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу ЕСЕ-1 по отношению к клеткам, содержащим ЕСЕ-2 или ЕСЕ-3, но не ЕСЕ-1; и указанный α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его α-аминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом; где характер связывания является тем же самым, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках И937; (Ь) анализа ингибирования фосфорилирования МАРКАР2, проводимого на раковых клетках И937; и (с) анализа стимулирования ЬР8, проводимого на клетках ТНР-1.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат по изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов.

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации ковалентного конъюгата α,αдизамещенного глицинового эфира данного модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, причем конъюгат обладает повышенной или пролонгированной клеточной активностью по сравнению с данным модулятором, включающему:

(ί) идентификацию положения или положений в молекуле данного модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора или множества данных модуляторов активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора с тем же самым характером связывания с целевым ферментом или рецептором, при этом положение или положения являются удаленными от поверхности связывания между модуляторами и целевым ферментом или рецептором;

(ίί) ковалентную модификацию модулятора (модуляторов) путем присоединения радикала α,αдизамещенного глицинового эфира или ряда различных радикалов α,α-дизамещенного глицинового эфира в одном или более положениях, идентифицированных на стадии (1);

(ίίί) испытание модулятора (модуляторов), конъюгированного с α-аминокислотой, полученного на стадии (ίί), с целью определения его активности в отношении целевого фермента или рецептора, и на основании данных, полученных на стадии (ίίί), выбор одного или нескольких испытанных α,αдизамещенных глициновых эфиров, конъюгированных с данным модулятором (модуляторами), которые вызывают модуляцию активности фермента или рецептора в клетках, превращаются в клетках в соответствующие карбоновые кислоты, которые накапливаются в клетках, содержащих внутриклеточную карбоксилэстеразу ЕСЕ-1, и которые обладают повышенной или пролонгированной клеточной активностью.

- 3 019838

Подробное описание изобретения

Таким образом, согласно одному широкому аспекту данное изобретение предусматривает ковалентный конъюгат α,α-дизамещенного глицинового эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, при этом эфирная группа конъюгата селективно гидролизуется клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу йСЕ-1 по отношению к клеткам, содержащим йСЕ-2 или йСЕ-3, но не йСЕ-1; а α,α-дизамещенный глициновый эфир ковалентно присоединен к модулятору в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевым ферментом или рецептором и/или конъюгирован с модулятором таким образом, что связывание конъюгированного модулятора и указанной соответствующей кислоты с целевым ферментом или регулятором является таким же, как связывание неконъюгированного модулятора.

Кроме того, данное изобретение предусматривает способ повышения или пролонгирования внутриклеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, включающий структурную модификацию модулятора путем ковалентного присоединения к нему α,α-дизамещенного глицинового эфира в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевыми ферментом или рецептором и/или осуществляемом таким образом, что связывание конъюгированного модулятора и указанной соответствующей кислоты с целевыми ферментом или рецептором является таким же, как связывание неконъюгированного модулятора, при этом сложноэфирная группа конъюгата способна к селективному гидролизу клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу йСЕ-1 по отношению к клеткам, содержащим 11СЕ-2 или 11СЕ-3. но не ЕСЕ-1.

При ковалентном присоединении эфирной части α,α-дизамещенного глицина к модулятору таким образом, что характер связывания модулятора с целевым ферментом или рецептором сохраняется, и эфирный конъюгат, и соответствующий конъюгат кислого α,α-дизамещенного глицина сохраняют активность родительского неконъюгированного модулятора. Абсолютные ингибирующие активности фермента или агониста рецептора либо антагонизирующие активности конъюгатов эфира и кислоты не должны быть такими высокими, как соответствующие активности неконъюгированного модулятора, так как внутриклеточный гидролиз эфирного конъюгата с кислым конъюгатом приводит к накоплению последнего внутри клетки, и получающаяся концентрация кислого конъюгата в клетке выше, чем концентрация, достигаемая с неконъюгированным модулятором, что компенсирует при этом любую присущую более низкую активность первого по сравнению с последним. Поэтому является очевидным, что стратегия присоединения согласно данному изобретению отличается от традиционного подхода с применением пролекарств. Согласно этому традиционному подходу модулятор-родитель модифицируют путем конверсии производного, которое получается ίη νίνο с высвобождением исходного модулятора, и именно это высвобождение исходного модулятора ответственно за конечную активность. Согласно стратегии по изобретению исходный модулятор модифицируют таким образом, что возможная активность является комбинированным результатом внутриклеточной активности благодаря конъюгату α,α-дизамещенного глицина и модулятора и накоплению этого конъюгата α,α-дизамещенного глицина и модулятора. Активным агентом является конъюгат, а не исходный неконъюгированный модулятор.

Как указывалось выше, данное изобретение касается модификации модуляторов внутриклеточных ферментов или рецепторов. Хотя принцип данного изобретения является общим, не ограниченным химической природой модулятора или природой целевого фермента или рецептора, является предпочтительным, чтобы модулятор был таким, который проявляет свое действие путем обратимого связывания с целевыми ферментом или рецептором в противоположность тем, чье действие обусловлено ковалентным связыванием с целевым ферментом или рецептором.

Так как для практического применения требуется, чтобы гидролизуемый карбоксилэстеразой конъюгат сохранял внутриклеточную связывающую активность родительского модулятора с целевыми ферментом или рецептором, присоединение эфирного фрагмента должно учитывать это требование, которое будет выполнено, если гидролизуемый карбоксилэстеразой эфирный фрагмент α,α-дизамещенного глицина присоединен к модулятору таким образом, что характер связывания соответствующего продукта гидролиза при помощи карбоксилэстеразы (то есть соответствующей кислоты) с целью практики является таким же, как у неконъюгированного модулятора. В общем, это достигается путем ковалентного присоединения эфирного фрагмента карбоксилэстеразы к модулятору в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевыми фрагментом или рецептором. Таким образом, фермент располагается, простираясь в растворитель, не вмешиваясь в характер связывания.

Кроме того, эфирный фрагмент α,α-дизамещенного глицина, очевидно, должен быть субстратом для карбоксилэстеразы, если первый должен подвергаться гидролизу последней в клетке. Оказывается, что способность внутриклеточных карбоксилэстераз не зависит от очень строгих структурных требований к субстрату, α,α-дизамещенному глициновому эфиру. Отсюда большинство способов ковалентного конъюгирования эфирного фрагмента α,α-дизамещенного глицина с модулятором позволяют осуществить гидролиз. Присоединение гибкой цепи линкера обычно является таким способом.

Известно, что любая химическая модификация лекарства может неуловимо менять геометрию его

- 4 019838 связывания и химический подход для связывания эфирного фрагмента α,α-дизамещенного глицина может вовлекать дополнительное взаимодействие при связывании с мишенью или может заменять одну или несколько таких реакций. Отсюда требование, что характер связывания гидролизованного конъюгата с мишенью должен быть таким же, как у неконъюгированного модулятора, следует понимать как требование, заключающееся в том, что не должно быть значительного изменения характера связывания, другими словами, в том, что характер связывания практически должен быть таким же, как у неконъюгированного модулятора. Когда это требование выполняется, основные характеристики связывания родительского модулятора сохраняются, и модифицированные, и немодифицированные модуляторы имеют полный общий набор характеристик связывания. Термины одинаковый характер связывания и удаленное присоединение являются подобными, так как, как указано выше, обычный способ достижения одинакового характера связывания должен обеспечивать присоединение фрагмента карбоксилэстеразы в таком месте молекулы модулятора, которое удалено от поверхности связывания ингибитора и целевыми фрагментом или рецептором. Однако следует отметить, что эти требования не означают, что конъюгат и/или его соответствующая кислота должны обладать одной и той же ίη νίίτο и ίη νίνο модулирующей активностью, как родительский модулятор. Однако, в общем, является предпочтительным, чтобы гидролизованная эстеразой карбоновая кислота имела активность, определенную методом анализа ίη νίίτο связывания фермента или рецептора, не менее одной десятой активности родительского модулятора, определенной этим же методом, и чтобы эфир имел активность, определенную методом анализа клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, как активность родительского модулятора, определенную указанным методом.

Хотя традиционные методы картирования отношения структура-активность в медицинской химии вполне способны идентифицировать стратегию присоединения для того, чтобы отвечать требованиям такого же характера связывания и удаленного присоединения, современные методы, такие как ЯМР и рентгеновская кристаллография, способствовали прогрессу, когда стал обычно известным характер связывания известного модулятора фермента или рецептора или этот характер стал определяемым. Такая информация в большинстве случаев является общедоступной или может быть смоделирована с применением компьютерных методов моделирования, таких как докинг (стыкование) лиганда и моделирование гомологии, основанных на известных способах связывания структурно подобных модуляторов или на известной структуре активного сайта целевых фермента или рецептора. Зная характер связывания модулятора, достигнутого такими методами, можно определить подходящее место присоединения эфирного фрагмента карбоксилэстеразы, обычно (как указывалось выше) в таком месте модулятора, которое удалено от поверхности связывания ингибитора и целевых фермента или рецептора.

Внутриклеточные ферменты карбоксилэстеразы, способные гидролизовать сложноэфирную группу конъюгированной α-аминокислоты с получением соответствующей кислоты, включают три известные человеческие карбоксилэстеразы (ВСЕ): изотипы фермента ВСЕ-1 (известен как СЕ8-1), ВСЕ-2 (известен как СЕ8-2) и ИСЕ-3 (Эгид Э18с. Тобау, 2005, 10, 313-325). Хотя они рассматриваются как основные ферменты, но другие карбоксилэстеразы, такие как бифенилгидролаза (ВРН), также могут играть роль в гидролизе конъюгатов.

Анализ расщепленной клетки, описанный ниже, представляет собой простой метод подтверждения того, что данный конъюгат модулятора и α,α-дизамещенного глицинового эфира или данный α,αдизамещенный глициновый эфир, которые подвергаются анализу на предмет их использования, гидролизуются, как это требуется. Эти ферменты могут также легко подвергаться экспрессии с применением рекомбинантных методов, а рекомбинантные ферменты могут быть использованы для определения или подтверждения факта гидролиза.

Признаком данного изобретения является то, что желаемый конъюгат сохраняет ковалентно связанный кислотный фрагмент α,α-дизамещенного глицина, когда он гидролизуется карбоксилэстеразой(ами) в клетке, так как именно полярная карбоксильная группа этого фрагмента предотвращает или уменьшает клиринс гидролизованного конъюгата из клетки и тем самым вносит вклад в его накопление в клетке. В действительности, клеточная активность модифицированного модулятора в основном обусловлена накоплением кислоты и ее модуляцией активности мишени (хотя негидролизованный сложный эфир также проявляет свою активность по отношению к мишени до тех пор, пока он остается негидролизованным).

Поскольку клетки, в общем, содержат несколько типов пептидазных ферментов, предпочтительно, чтобы конъюгат или в особенности гидролизованный конъюгат (соответствующая кислота) не являлся субстратом для таких пептидаз. В частности, особенно предпочтительно, чтобы эфирная группа α,αдизамещенного глицина не была С-концевой группой дипептидного фрагмента в конъюгате. Однако несмотря на это ограничение метода ковалентного присоединения, эфирная группа α,α-дизамещенного глицина может быть ковалентно присоединена к модулятору через аминогруппу или через один из αзаместителей. В некоторых случаях модулятор будет содержать место присоединения, удобное для эфирного фрагмента карбоксилэстеразы, а в других случаях для его присоединения должна быть разработана стратегия синтеза.

- 5 019838

Было обнаружено, что клетки, которые только экспрессируют карбоксилэстеразы 11СЕ-2 и/или 11СЕ3, и рекомбинантные формы этих ферментов будут только гидролизовать эфиры α,α-дизамещенного глицина с получением их кислот, если атом азота аминогруппы α,α-дизамещенного глицинового эфира является или незамещенным, или непосредственно связанным с карбонильной группой (то есть аминогруппа образует часть амидного фрагмента), в то время как клетки, содержащие 11СЕ-1 (то есть макрофаги) или рекомбинантный 11СЕ-1. могут гидролизовать α,α-дизамещенные глициновые эфиры с широким набором групп у атома азота. Это требование селективности НСЕ-2 и НСЕ-3 может стать преимуществом, когда требуется, чтобы модулятор был нацелен на ферменты или рецепторы только в некоторых типах клеток. Относительные количества этих трех карбоксилэстеразных ферментов меняются у различных типов клеток (см. фиг. 1 заявки \УО 2006/117567 и базу данных 1Шр:/5ута11а5.дпГ.огд/8утА11а5 (в этой базе данных 11СЕ3/СЕ83 обозначена символом БЫ21736)). Если модулятор предназначен для действия только в тех типах клеток, где обнаружен НСЕ-1, присоединение эфирного фрагмента α,αдизамещенного глицина в карбоксилэстеразе таким образом, что аминогруппа не присоединена непосредственно к карбонилу, приводит к образованию гидролизованного конъюгата модулятора, накапливающегося предпочтительно в клетках с эффективными концентрациями НСЕ-1. Иными словами, специфическое накопление кислоты, полученной из конъюгата модулятора в клетках, экспрессирующих 11СЕ1, может быть достигнуто при связывании эфирной группы аминокислоты с модулятором таким образом, что атом азота в эфире аминокислоты не связан непосредственно с карбонилом или остается незамещенным.

Известно, что макрофаги играют ключевую роль в развитии воспалительных расстройств путем высвобождения цитокинов, в частности ΤΝΕ-α и 1Ь-1 (Уап Кооп с! а1., Агйгйщ апб КЕеитаШт, 2003, 12291238). В случае ревматоидного артрита они играют основную роль при воспалении суставов и при разрушении суставов (Сопе11, Ν. Епд. 1. Меб., 2004, 350, 2591-2602). Макрофаги принимают также участие в процессе роста и развития опухолей (№11бйн апб Саггаго, Сигг. Эгад Тагдей 1пГ1атт. А11егду, 2005, 3-8). Следовательно, агенты, которые селективно нацелены на клетки макрофагов, могут иметь значение при лечении рака, воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Таргетирование специфических типов клеток, как ожидается, приведет к уменьшению проявления побочных эффектов. Данное изобретение предусматривает способ таргетирования (нацеливания) модуляторов на макрофаги, который основан на указанном выше наблюдении, что путь, которым эфирный фрагмент α,α-дизамещенного глицина карбоксилэстеразы связан с модулятором, определяет, осуществился ли его гидролиз специфическими карбоксилэстеразами и отсюда, накапливается ли полученная кислота в различных типах клеток или нет.

Конкретно, как описано в заявке \¥О 2006/117567, было установлено, что макрофаги содержат человеческую карбоксилэстеразу йСЕ-1, в то время как другие типы клеток ее не содержат. В других конъюгатах по изобретению, когда атом азота сложноэфирного фрагмента замещен, но не связан непосредственно с карбонильной группой, эфир будет только подвергаться гидролизу под действием НСЕ-1 и, следовательно, только гидролизованные эстеразой конъюгаты модулятора будут накапливаться в макрофагах.

Кроме того, конъюгаты α,α-дизамещенного глицина по изобретению вообще более активны в клетках, содержащих карбоксилэстеразу НСЕ-1 (то есть в макрофагах), чем в клетках, которые содержат только карбоксилэстеразы НСЕ-2 и НСЕ-3.

Кроме того, было установлено, что конъюгаты по изобретению, в которых эфирный фрагмент α,αдизамещенного глицина связан с модулятором через один из α-заместителей α,α-дизамещенного глицинового эфира, являются в общем более активными в клетках, содержащих карбоксилэстеразу НСЕ-1 (то есть в макрофагах), чем в клетках, которые содержат только карбоксилэстеразы НСЕ-2 и НСЕ-3. Активный гидролизованный кислотный конъюгат поэтому накапливается не селективно в случае таких (в общем) С-связанных конъюгатов.

Конъюгаты по изобретению, в которых эфирный фрагмент α,α-дизамещенного глицина связан с модулятором через атом азота α,α-дизамещенного глицинового эфира, в общем, гидролизуются клетками, содержащими любую из НСЕ-1, НСЕ-2 или НСЕ-3. Активный гидролизованный кислотный конъюгат поэтому накапливается не селективно в случае таких Ν-связанных конъюгатов.

Терминология.

Применяемый в данной заявке термин α,α-дизамещенный глицин или α,α-дизамещенная глициновая кислота означает соединение формулы Н₂№С(К.₂К.₃)-СООН, где К₂ и К₃ являются αзаместителями (которые, конечно, не являются атомами водорода) и α,α-дизамещенный глициновый эфир представляет собой такое соединение, в котором карбоксильная группа этерифицирована. Термин эфир или этерифицированная карбоксильная группа означает группу К₉О(С=О)-, в которой К₉ является группой, характеризующей эфир, на основе спирта К₉ОН.

Применяемый в данной заявке термин (С_а-С_Ь)алкил, где а и Ь целые числа, относится к линейному или разветвленному алкильному радикалу, содержащему от а до Ь атомов углерода. Так, например, когда а равен 1 и Ь равен 6, термин включает метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил и н-гексил.

- 6 019838

Термин двухвалентный (С_а-С_Ь)алкиленовый радикал, где а и Ь целые числа, относится к насыщенной углеводородной цепи, содержащей от а до Ь атомов углерода и две ненасыщенные валентности.

Применяемый термин (С_а-С_Ь)алкенил, где а и Ь целые числа, относится к линейному или разветвленному алкенилу, содержащему от а до Ь атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь в Еили Ζ-стереохимии, если это возможно. Например, этот термин включает винил, аллил, 1- и 2-бутенил и 2 -метил-2 -пропенил.

Термин двухвалентный (С_а-С_Ь)алкениленовый радикал означает углеводородную цепь, содержащую от а до Ь атомов углерода, по меньшей мере одну двойную связь и две ненасыщенные валентности.

Используемый в данной заявке термин (С_а-С_Ь)алкинил, где а и Ь целые числа, относится к линейным или разветвленным углеводородным группам, содержащим от двух до шести атомов углерода и, кроме этого, одну тройную связь. Этот термин включает, например, этинил, 1-пропинил, 1- и 2-бутинил, 2-метил-2-пропинил, 2-пентинил, 3-пентинил, 4-пентинил, 2-гексинил, 3-гексинил, 4-гексинил и 5гексинил.

Термин двухвалентный (Са-СЬ)алкиниленовый радикал, где а и Ь целые числа, относится к двухвалентной углеводородной цепи, содержащей от двух до шести атомов углерода и по меньшей мере одну тройную связь.

Термин карбоциклический относится к моно-, мостиковому моно-, ди- или трициклическому радикалу, содержащему до 16 атомов в кольце, все из которых представляют собой атомы углерода, и включает арил или циклоалкил.

Термин циклоалкил относится к моноциклическому насыщенному карбоциклическому радикалу, содержащему от 3 до 8 атомов углерода, он включает, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооклил и норборнил.

Не имеющий точного определения термин арил относится к моно-, мостиковому моно-, ди- или трициклическому карбоциклическому ароматическому радикалу и включает радикалы, содержащие два моноциклических карбоциклический ароматических кольца, которые связаны ковалентной связью. Примеры таких радикалов включают фенил, бифенил и нафтил.

Не имеющий четкого определения термин гетероарил относится к моно-, мостиковому моно-, би-, или трициклическому ароматическому радикалу, содержащему один или несколько гетероатомов, выбранных из 8, N и О, и включает радикалы, содержащие два таких моноциклических кольца или одно такое моноциклическое кольцо и одно моноциклическое арильное кольцо, которые соединены ковалентной связью. Примеры таких радикалов включают тиенил, бензтиенил, фурил, бензофурил, пирролил, имидазолил, бензимидазолил, тиазолил, бензтиазолил, изотиазолил, бензизотиазолил, пиразолил, оксазолил, бензоксазолил, изоксазолил, бензизоксазолил, изотиазолил, триазолил, бензтриазолил, тиадиазолил, оксадиазолил, пиридинил, пиридазиниил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, индолил и индазолил.

Не имеющий также четкого определения термин гетероциклил или гетероциклический включает гетероарил, определение которого дано выше, и в его неароматическом значении относится к моно-, мостиковому моно-, би- или трициклическому неароматическому радикалу, содержащему один или несколько гетероатомов, выбранных из 8, N и О, и к группам, состоящим из моноциклического ароматического радикала, содержащего один или несколько таких гетероатомов, который ковалентно соединен с другим таким радикалом или с моноциклическим карбоциклическим радикалом. Примеры таких радикалов включают пирролил, фуранил, тиенил, пиперидинил, имидазолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, тиадиазолил, пиразолил, пиридинил, пирролидинил, пиримидинил, морфолинил, пиперазинил, индолил, морфолинил, бензофуранил, пиранил, изоксазолил, бензимидазолил, метилендиоксифенил, этилендиоксифенил, малеимидные и сукцинимидные группы.

Если иное не указано в контексте описания, термин возможно замещенная, применяемый в данной заявке в отношении любой группы, означает замещение совместимыми заместителями в количестве до четырех, каждый из которых может представлять собой, например, (С1-С₆)алкил, (С1-С₆)алкокси, гидрокси, гидрокси(С1-С₆)алкил, меркапто, меркапто(С1-С₆)алкил, (С1-С₆)алкилтио, фенил, галоид (включая фтор, бром и хлор), трифторметил, трифторметокси, нитро, нитрил (-ΟΝ), оксо, -СООН, -СООК^А, -СОК^А, -8Ο2Κ^Α, -ί.ΌΝΗ;, -8Ο₂ΝΗ₂, -ίΌΝΗΚ^Α, -8Ο2ΝΗΚ^α, -ίΌΝΌΚ, -8Ο2ΝΚ^αΚ^β, -ΝΗ2, -ΝΗΚ^Α, -ΝΚ^ΑΚ^Β, -Οί.ΌΝΗ;, -ΟίΌΝΗΚ^Α, -Οί.ΌΝΗΒ^ΑΒ^Β, АНСО)1А, -ΝΗί.ΌΟΒ^Α, -ΝΒΌΟΟΒ^α, -ΝΗ8Ο2ΟΚ^α, -ΝΚ^Β8Ο2ΟΗ, -ΝΚ^Β8Ο2ΟΚ^Α, -ΝΗϋΟΝΗ2, ΑΗΤΌΝ Ι₂, АНСОАНН, ΑΗΤΌΝ ΙΚ, -Ν ΚΌΝΌΚ или ΑΚΤΌΝΌΚ, где Κ^Α и Κ^Β независимо обозначают (С1-С₆)алкил, (С₃-С₆)циклоалкил, фенил или моноциклический гетероарил, содержащий 5 или 6 атомов в кольце, или К^А и Κ^Β, присоединенные к одному и тому же атому азота, образуют циклическую аминогруппу (например, морфолино, пиперидинил, пиперазинил или тетрагидропирролил). Возможный заместитель может быть одной из указанных замещающих групп.

Термин боковая цепь природной или неприродной α-аминокислоты относится к группе Κ¹ природной или неприродной аминокислоты формулы NΗ₂-СΗ(Κ¹)-СΟΟΗ, отличающейся от глицина, где Κ¹ означает водород.

Примеры боковых цепей природных α-аминокислот включают боковые цепи аланина, аргинина, аспарагина, аспартовой кислоты, цистеина, цистина, глутаминовой кислоты, гистидина, 5

- 7 019838 гидроксилизина, 4-гидроксипролина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина, валина, α-аминоадипиновой кислоты, α-амино-н-масляной кислоты, 3,4-дигидроксифенилаланина, гомосерина α-метилсерина, орнитина, пипеколовой кислоты и тироксина.

Природные α-аминокислоты, которые содержат функциональные заместители, например аминогруппу, карбоксил, гидрокси, меркапто, гуанидин, имидазолил или индолил, в их боковых цепях включают аргинин, лизин, глутаминовую кислоту, аспартовую кислоту, триптофан, гистидин, серин, треонин, тирозин и цистеин. Когда один или оба из α-заместителей в α,α-дизамещенном глициновом эфире в соединениях по изобретению является одной из этих боковых цепей, функциональный заместитель может быть защищенной группой.

Термин защищенный, используемый в отношении функционального заместителя в боковой цепи природной α-аминокислоты, означает производное такого заместителя, которое не является функциональным. Например, карбоксильные группы могут быть этерифицированы (например, в виде (С1С₆)алкилового эфира), аминогруппы могут быть превращены в амидные (например, в виде ННСОС₁-С₆алкиламида) или карбаматные (например, в виде ННС(=О)ОС₁-С₆-алкил- или ННС(=С))ОСН₂Рйкарбамата), гидроксильные группы могут быть превращены в группы простого эфира (например, в виде ОС1-С6-алкилового или О(С1-С6-алкил)фенилового эфира) или в сложноэфирные группы (например, в виде ОС(=О)С1-С6-алкилового эфира) и тиольные группы могут быть превращены в тиоэфирные (например, в виде трет-бутилового или бензилового тиоэфира) или в группы сложного тиоэфира (например, в виде 8С(=О)С₁-С₆-алкилового тиоэфира).

Имеется много возможных сложноэфирных групп, которые, в принципе, могут находиться в эфирном фрагменте α,α-дизамещенного глицина карбоксилэстеразы для присоединения к модулятору. Точно также имеется много α,α-дизамещенных глицинов, различающихся α-заместителями К₂ и К₃, которые могут применяться в качестве сложных эфиров в эфирном фрагменте карбоксилэстеразы. Некоторые α,α-дизамещенные глициновые эфиры быстро гидролизуются одной или несколькими из изотипов клеток 11СЕ-1. ЕСЕ-2 и ЕСЕ-3 или клетками, содержащими эти ферменты, в то время как другие гидролизуются медленнее или гидролизуются только в очень небольшой степени. В общем, если карбоксилэстераза гидролизует свободный α,α-дизамещенный глициновый эфир с получением родительской кислоты, она будет, с учетом Ν-карбонильной зависимости ЕСЕ-2 и ЕСЕ-3, описанной выше, гидролизовать также сложноэфирный мотив, будучи ковалентно конъюгированной с модулятором. Следовательно, анализ расщепленных клеток и/или анализ изолированной карбоксилэстеразы, описанные в данной заявке, обеспечивают прямой, быстрый и простой первый скрининг сложных эфиров, которые имеют требуемый профиль гидролиза. Сложноэфирные фрагменты, выбранные таким образом, затем снова могут быть подвергнуты анализу методом анализа карбоксилэстеразы, будучи конъюгированными с модулятором, выбранным методом конъюгирования, для подтверждения того, что они все еще являются субстратом для карбоксилэстеразы.

Сложноэфирная группа.

Как указано выше, внутриклеточные ферменты карбоксилэстеразы, способные гидролизовать сложноэфирную группу соединения по изобретению в соответствующую кислоту, включают три известные изотипа человеческого фермента ЕСЕ-1, ЕСЕ-2 и ЕСЕ-3. Хотя они считаются основными ферментами, другие ферменты, такие как бифенилгидролаза (ВРН), также могут играть роль в гидролизе сложного эфира. В общем, если карбоксилэстераза гидролизует свободный эфир аминокислоты с получением родительской кислоты, она будет также гидролизовать сложноэфирный фрагмент, будучи ковалентно конъюгированной с ингибитором. Поэтому методы анализа расщепленной клетки и/или изолированной карбоксилэстеразы, описанные в данной заявке, обеспечивают прямой, быстрый и простой первый скрининг сложных эфиров, которые имеют требуемый профиль гидролиза. Эфирные фрагменты, выбранные этим методом, затем снова могут подвергаться анализу тем же методом анализа карбоксилэстераз, будучи конъюгированными с ингибитором выбранным методом для подтверждения того, что они все еще являются субстратом для карбоксилэстеразы.

С условием требования, что эфирные группы должны гидролизоваться внутриклеточными карбоксилэстеразами, можно привести примеры конкретных сложноэфирных групп в эфирном фрагменте α,αдизамещенного глицина карбоксилэстеразы, которые включают группы формулы -(С=О)ОК₁₄, где К₁₄ обозначает КЩЩ^С-, где:

(ί) К₈ обозначает водород или возможно замещенный (С₁-С₃)алкил-(2¹)а-[(С1-Сз)алкил]ь- или (С2С3)алкенил-(2¹)а-[(С₁-С₃)алкил]_ь-, где а и Е независимо обозначают 0 или 1 и Ζ¹ обозначает -О-, -8- или -ΝΚ₁₁-, где К₁₁ обозначает водород или (С₁-С₃)алкил; и К₉ и К₁₀ независимо обозначают водород или (С₁С₃)алкил;

(ίί) К₈ обозначает водород или возможно замещенный К₁₂К.1₃№(С1-С₃)-алкил, где К₁₂ обозначает водород или (С₁-С₃)алкил и К₁₃ обозначает водород или (С₁-С₃)алкил; или К₁₂ и К₁₃ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют возможно замещенное моноциклическое гетероциклическое кольцо с 5 или 6 атомами в кольце или бициклическую гетероциклическую кольцевую систему с 8-10

- 8 019838 атомами в кольце; и К₉ и К₁₀ обозначают независимо водород или (С1-Сз)алкил; или (ш) и К₉ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют возможно замещенное моноциклическое или мостиковое моноциклическое карбоциклическое кольцо с 3-7 атомами в кольце или мостиковую моноциклическую карбоциклическую кольцевую систему из 8-10 атомов в кольце и К₁₀ обозначает водород.

В случаях (ί)-(ίίί), описанных выше, алкил включает фторалкил. В случаях (ί)-(ίίί) К₁₀ часто обозначает водород. Конкретные примеры К₁₄ включают метил, трифторметил, этил, н- или изопропил, н-, вторили трет-бутил, циклогексил, норборнил, аллил, фенил, бензил, 2-, 3- или 4-пиридилметил, Νметилпиперидин-4-ил, тетрагидрофуран-3-ил или метоксиэтил. Предпочтительно, когда К₁₄ обозначает циклопентил.

α-Заместители.

Примеры α-заместителей К₂ и К₃ в α,α-дизамещенном глициновом эфире, конъюгированном с модулятором, могут быть выбраны из боковых цепей природных или неприродных α-аминокислот, в таких боковых цепях любая функциональная группа может быть защищена.

Например, α-заместители К₂ и К₃ в α,α-дизамещенном глициновом эфире, конъюгированном с модулятором, включают фенил и группы формулы -СК,К|_:Кс· в которых каждый из ΚΚΚ независимо обозначает водород, (С₁-С₆)алкил, (С₁-С₆)алкенил, (С₂-С₆)алкинил, фенил(С₁-С₆)алкил, (С₃-С₈)циклоалкил; или

К_с обозначает водород и К_а и Кь независимо обозначают фенил или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N или О, такой как пиридил; или

К_с обозначает водород, (С₁-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂-С₆)алкинил, фенил(С₁-С₆)алкил или (С₃С₈)циклоалкил и и К_ь вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8членный циклоалкил или 5-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее один или более гетероатомов, выбранных из 8, N или О; или

Ка и К_с вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют адамантил или

К_а и К_ь, каждый независимо, обозначают (С₁-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂-С₆)алкинил, фенил(С₁С₆)алкил или группу, определение которой дано ниже для К_с, отличающуюся от водорода, или К_а и вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкильное кольцо или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический или неароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N или О, и К_с обозначает водород, -ОН, -8Н, галоген, -ΟΝ, -СО₂Н, (С₁-С₄)перфторалкил, -СН₂ОН, -О(С₁-С₆)алкил, -О(С₂С₆)алкенил, -8(С₁-С₆)алкил, -8О(С₁-С₆)алкил, -8О₂(С₁-С₆)алкил, -8(С₂-С₆)алкенил, -8О(С₂-С₆)алкенил, -8О₂(С₂-С₆)алкенил или группу Ю-ν, где О обозначает связь или -О-, -8-, -8О- или -8О₂- и V обозначает фенил, фенил(С₁-С₆)алкил, (С₃-С₈)циклоалкил, (С₃-С₈)циклоалкилалкил, (С₄-С₈)циклоалкенил, (С₄С₈)циклоалкенилалкил, моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N или О, или гетероарил(С₁-С₆)алкил, причем группа V может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из гидроксила, галогена, -С№, -СОNН₂, -СОNН(С₁-С₆)алкила, -СОNН(С₁-С₆-алкила)₂, -СНО, -СН₂ОН, (С₁-С₄)перфторалкила, -О(С₁-С₆)алкила, -8(С₁-С₆)алкила, -8О(С₁С₆)алкила, -8О₂(С₁-С₆)алкила, ^О₂, -NН₂, -NН(С₁-С₆)алкила, ^((С1-С₆)алкила)₂, -NНСО(С₁-С₆)алкила, (С1-С6)алкила, (С2-С6)алкенила, (С2-С6)алкинила, (С3-С8)циклоалкила, (С4-С8)циклоалкенила, фенила или бензила.

Или же α-заместители К₂ и К₃ α,α-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, взятые вместе с самим α-углеродом, могут образовать 3-6-членное насыщенное циклоалкильное кольцо, такое как циклопропил, циклопентил или циклогексил, или гетероциклическое кольцо, такое как пиперидин-4-ильное кольцо.

В некоторых случаях по меньшей мере один из α-заместителей К₂ и К₃ α,α-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является С₁-С₆-алкильным заместителем, например метилом, этилом или н- или изопропилом.

Согласно некоторым вариантам один из α-заместителей К₂ и К₃ α,α-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является С₁-С₆-алкилом, например метилом, этилом или н- или изопропилом, а другой выбирается из группы, состоящей из метила, этила, н- и изопропила, н-, втор- или трет-бутила, фенила, бензила, тиенила, циклогексила и циклогексилметила.

Предпочтительными являются случаи, когда один из К₂ и К₃ является метилом и другой представляет собой метил, этил или н- или изопропил; или когда К2 и К3 вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклопропил, циклобутил, циклопентил или циклогексил. В конкретном случае α-заместители К₂ и К₃ α,α-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, каждый, представляет собой метил.

- 9 019838

Конъюгирование.

Как указано выше, α,α-дизамещенный глициновый эфир может быть конъюгирован с модулятором через свою аминогруппу или через один из α-заместителей. Между эфирным фрагментом карбоксилэстеразы и модулятором может находиться радикал линкера. Структура радикала, соединяющего эфирный фрагмент карбоксилэстеразы с остальной частью модулятора, очевидно, зависит от стратегии, выбранной для получения такой связи. Ясно, что стратегия химического подхода к такому сочетанию может меняться в широких пределах, и поэтому возможны многие структуры этого соединения. Точная комбинация переменных такого соединения между эфирной группой аминокислоты и остальной частью молекулы часто не будет иметь отношения к основному методу связывания соединения в целом. С другой стороны, химический метод образования связи в некоторых случаях может привести к дополнительным реакциям связывания с ферментом, тем самым способствуя связыванию.

Следует отметить, что преимущества эфирного фрагмента α,α-дизамещенного глицина, описанные выше (легкое попадание в клетку, гидролиз карбоксилэстераз в клетке и накопление в клетке активного продукта гидролиза, карбоновой кислоты), получаются легче, когда соединение между эфирной группой аминокислоты и остальной частью молекулы не является субстратом для активности пептидазы в клетке, которая может привести к отщеплению аминокислоты от молекулы. Конечно, стабильность к действию внутриклеточных пептидаз легко определяется путем инкубирования соединения с разрушенным содержимым клетки и анализа каждого такого расщепления.

Например, α,α-дизамещенный глициновый эфир (формулы Н^Н-НК^КД-СООН) может быть конъюгирован с модулятором как:

(а) радикал формулы -(СН₂)2-Х¹-Ь¹-¥-КН-С(К₂)(Яз)-К₁ или (б) радикал формулы -(СН₂)_г-¥¹-Ь¹-К₃-С(К₂)(ХН₂)(К₁), где

К₁ обозначает гидролизуемую карбоксилэстеразой сложноэфирную группу;

К₂ и К₃ обозначают α-заместители α,α-дизамещенного глицина;

К₂ - боковая цепь природной или неприродной α-аминокислоты;

Υ обозначает связь, -С(=О)-, -8(=О)₂-, -С(=О)О-, -С(=О)1МК₃- -С(=8)-Кк₄, -С( \Н)\1С- или -8(=Θ)₂ΝΚ₄-, где К₄ обозначает водород или возможно замещенный С₁-С₆-алкил;

Ь₁ обозначает двухвалентный радикал формулы -(А1к¹)т(Р)п(А1к²)р-, где т, η и р независимо равны 0 или 1;

О обозначает (1) возможно замещенный двухвалентный моно- или бициклический карбоциклический или гетероциклический радикал с 5-13 атомами в кольце или (и) в случае, когда р равен 0, двухвалентный радикал формулы -θ'-Х²-, где X² обозначает -О-, -8- или ΝΚ^Α-, где К^А обозначает водород или возможно замещенный двухвалентный моно- или бициклический карбоциклический или гетероциклический радикал, содержащий 5-13 членов в кольце;

А1к¹ и А1к² независимо обозначают возможно замещенные двухвалентные С3-С7-циклоалкильные радикалы или возможно замещенные линейные или разветвленные С1-С6-алкилен, С2-С6-алкенилен или С2-С6-алкинилен, которые могут содержать или заканчиваться или (-О-), тиоэфирную группу (-8-) или аминогруппу (-ΝΚ.^Λ)-, где К^А обозначает водород или возможно замещенный С1-С₃-алкил;

X¹ обозначает связь, -С(=О)-, -8(=О)₂-, -№₇С(=О)-, -€(=Θ)ΝΚ₇-, -ΝΚ₇Η=Θ)-ΝΚ₈, -ΝΚ₇8(=Θ)₂- или -8(=Θ)₂ΝΚ₇-, где К₇ и К₈ независимо обозначают водород или возможно замещенный С₁-С₆-алкил;

ζ равен 0 или 1.

Ниже будут рассмотрены переменные в связующем радикале по очереди:

ζ может равняться 0 или 1, поэтому метиленовый радикал, соединенный с модулятором, является необязательным.

Предпочтительные примеры Υ включают связь, -(С=О)ХН- и -(С=О)О-.

Однако в случае специфичности йСЕ-1, когда эфир α-аминокислоты конъюгирован с ингибитором в виде радикала формулы (1А), Υ должен быть связью.

В радикале Ь примеры А1к¹ и А1к², когда они имеются, включают -СН2-, -СН2СН2-, -СН2СН2СН2-, СН2СН2СН2СН2-, -СН=СН-, -СН=СНСН2-, -СН2СН=СН-, -СН2СН=СНСН2-, -С С-, -С^ССН2-, СН2С С- и СН2С=ССН2. Другие примеры А1к¹ и А1к² включают -СН2А-, -СН₂СН₂^-, -СН₂СН₂^СН₂-, -СН₂СН₂№СН(СН₃)-, -СН₂№СН₂СН₂-, -СН₂^СН₂СН₂^СН₂- и -№СН₂СН₂-, где № обозначает -О-, -8-, -ΝΉ-, Ν(ί.Ή₃)- или -СН₂СН^(СН₂СН₂ОН)СН₂-. Другие примеры А1к¹ и А1к² включают двухвалентные циклопропильный, циклопентильный и циклогексильный радикалы.

В Ь¹, когда η равен 0, радикал представляет собой углеводородную цепь (возможно замещенную и содержащую простую эфирную, тиоэфирную или аминогруппу). Предпочтительно, чтобы в Ь¹ не было необязательных заместителей. Когда и т, и р равны О, Ь¹ представляет собой двухвалентный моно- или бициклический карбоциклический или гетероциклический радикал с 5-13 атомами в кольце (возможно замещенными). Когда η равен 1 и по меньшей мере один из т и р равен 1, Ь¹ обозначает двухвалентный радикал, включающий углеводородную цепь или цепи и моно- или бициклический карбоциклический или гетероциклический радикал с 5-13 атомами в кольце (возможно замещенными). Когда содержится О, этот радикал может быть, например, двухвалентным фенильным, нафтильным, циклопропильным, цик

- 10 019838 лопентильным или циклогексильным радикалом или моно- или бициклическим гетероциклическим радикалом, содержащим 5-13 атомов в кольце, таким как пиперидинил, пиперазинил, индолил, пиридил, тиенил или пирролил, но предпочтительным является 1,4-фенилен.

Согласно некоторым вариантам изобретения т и р могут равняться 0, когда η равен 1. Согласно другим вариантам т, η и р могут все быть равны 0. По другим вариантам т может быть равен 0, η может быть равен 1, когда О обозначает моноциклический гетероциклический радикал, и р может равняться 0 или 1. А1к' и А1к², когда они имеются, могут быть выбраны из -СН₂-, -СН₂СН₂-, а также -СН₂СН₂СН₂- и О может быть 1,4-фениленом.

Модуляторы внутриклеточных ферментов и рецепторов.

Принципы данного изобретения могут быть применены к модуляторам широкого круга внутриклеточных мишеней, которые участвуют в развитии широкого круга заболеваний. Как было обсуждено выше, способы связывания известных модуляторов с их мишенями стали широко известными сразу же после того, как стали известными сами модуляторы. Кроме того, современные методы, такие как рентгеновская кристаллография и ЯМР, способны обнаружить такие топологии и геометрии связывания, как традиционные методы медицинской химии, характеризующие отношения структура-активность. Обладая таким знанием, можно идентифицировать, когда в структуре данного модулятора эфирный фрагмент карбоксилэстеразы может быть присоединен без разрушения связывания модулятора с ферментом или рецептором с применением структурных данных. Например, в табл. 1 перечислены некоторые внутриклеточные ферменты и рецепторы, для которых опубликованы данные о структуре кристаллов.

Таблица 1

Мишень	Ссылка на данные о структуре кристаллов	Целевая болезнь
СО 45	Кат е1 а!.. I Ехр. Мед. 201,441 (2005)	Аутоиммунное заболевание
Ьск	Ζίιιι е: а1., 81гис1иге 7,651, (1999)	Воспаление
ΖΑΡ-70	Ли й а1., 5. ΒίοΙ СЕет. 279, 42818 (2004)	Аутоиммунное заболевание
РОЕ4	Ηιιβΐ е1 а!., ВюсЬепнзТгу 42, 13220 (2003)	Воспаление
РОЕЗ	8сарт й а1., ВюсЬепйзтгу 43, 6091 (2004)	Астма
ΙΜΡΟΗ	ЬйсЬак е1 а1., Се11 85,921 (1996)	Псориаз
р38 МАРК.	У/апр й а!., ЗТисшге 6,1117 (1998)	Воспаление
С0Х2	КеГег й а!„ 1. ΒίοΙ СЬет 278, 45763, (2003)	Воспаление
Аденозинкиназа	8с11шпасЬег е! а!., ί ΜοΙ ΒίοΙ 298, 875 (2000)	Воспаление
РЬА2	Сйапска е1 а1.» ВюсЬет&йу В 10914 (2002) ‘	Псориаз
РЬС	Еззеп й а!., ВюсЬеппзну 36, 1704 (1997)	Ревматоидный артрит
ил	Ьейоз й а1, ί Мо! ΒίοΙ, 339, 805 (2004)	Воспаление
1ΝΟ8	КозенГеИ й а1., ВюсЬегтзРу 41, 13915 (2002)	Воспаление
ЬТА4 гидролаза	Ки4Ъег£ е1 а!., λ ΒίοΙ СЬет., 279» 27376 (2004)	Воспаление
1СЕ	Окатаю εΐ а1., СЬет РЬапп Ви11 47, 11 (1999)	Ревматоидный артрит
Ο8Κ3β	ВеПгапй. и а!., Л Μοί ΒίοΙ 333, 393 (2003)	Ревматоидный артрит
РКС	Хи й а!., 1ВС 279 50401 (2004)	Воспаление
РАКР	КиГ е( а!.. ΡΝΑ8 (Ц8А) 93, 7481 (1996)	Пролиферативные болезни
Ме1АР2	ЗЬеррагД е1 ак, λ Вюог£ Мес! СЬет. 14,885 (2004)	Ревматоидный артрит

- 11 019838

Кортикостероидной рецептор	ВЫаое е1 а1., Се11110,93 (2002)	Воспаление
ΡΙ3Κ.	\Уа1ксг е! а1„ Мо1 Се11 ΒίοΙ 6, 909 (2000)	Пролиферативные болезни
КаГ	ν/ап й а1., Се11116,855 (2004)	Пролиферативные болезни
АКТ/РКВ	Уап8 й а1., На18Ш1С1 Βίο! 9, 940 (2002)	Пролиферативные болезни
ноле	Ρΐηηίη а1., МаШге 401,188 (1999)	Пролиферативные болезни
с-АЫ	Ыа^аг е1 а1^ Сапсег Ке8 62,4236 (2002)	Пролиферативные болезни
ΙΟΡ-1Κ	МипзЬ ©1 а!., Ас1а СгуаХаНо^г 5е& П 59, 1725 (2003)	Пролиферативные болезни
Тимидилатсинтетаза	ЗсЬои! е! а1., 81гис1иге 6,839 (1998)	Пролиферативные болезни
Глидинамидрибонуклеатидформилтрансферраза	К1ен1е1а1., ΙΜοΙΒίοΙ 249,153 (1995)	Пролиферативные болезни
Пуриннуклеатидформилаза	Кое1пег е1 а1.9 3 Мо1 ΒίοΙ 280, 153 (1998)	Пролиферативные болезни
Эстронсульфатаза	НетаЫег-Оигтал е1 а!., 3 ΒίοΙ СЬет 278, 22989(2003)	Пролиферативные болезни
ЕСЕ-ВТК	31ато8 е! а1., I ΒίοΙ СЬет 277, 46265 (2002)	Пролиферативные болезни
Киназа 8гс	Ьатегз е! а1„ 1 МЫ ΒίοΙ 285,713 (1999)	Пролиферативные болезни
УЕОРК2	МсТцгие е! а1., ЗЬпЫиге 7,319 (1999)	Пролиферативные болезни
Супероксиддисмутаза	Нои§Ье1а1., ΙΜοΙ ΒίοΙ 287, 579 (1999)	Пролиферативные болезни
Орнитиндекарбоксилаза	ΑΙΐΗπιά « 81., 1 Μοί ΒίοΙ 295,7 (2000)	Пролиферативные болезни
Топоизомераза II	С1аззеп е! а1.. ΡΝΑ8 (Л8А) 100, 10629 (2003)	Пролиферативные болезни
Топоизомераза1	81акег е1 а!„ ΡΝΑ8 (Ц8А) 99, 15387 (2002)	Пролиферативные болезни
Рецептор андрогеновый	МаЬаа е! а1., 3 ΒίοΙ СЬет 275, 26164 (2000)	Пролиферативные болезни
тк	Нео е1 а1„ ЕМВО123,2185 (2004)	Пролиферативные болезни
Форяизилтрансфераза	Сипт еХ а!., Вюог§ Меб СЬет. Ьеи 13, 1367 (2003)	Пролиферативные болезни
сок	Ваутз е( а!., 5с1епсе 291,134 (2001)	Пролиферативные болезни
Дигидрофолатредуктаза	баг^аго е1 а!., 1 ΜοΙ ΒίοΙ 277, 119 (1998)	Пролиферативные болезни
шз	СЙЙЙЬЫ а!., Мо1 СеИ 13, 169 (2004)	Пролиферативные болезни

- 12 019838

Карбонатдегидрогеназа	81атз с1 а1., Рго1ет 8с1 7,556 (1998)	Пролиферативные болезни
Тимидинфссфорилаза	Когтап е1 а1., 8(тисШге 12, 75 (2004)	Пролиферативные болезни
Дигидропиримидиндегидрогеназа	ОоЬпйзсЬ й а!., 1ВС 277,13155 (2002)	Пролиферативные болезни
Маинозидаза а	Уап беп Е18еп е1 а1., ΕΜΒΟ 120, 3008 (2001)	Пролиферативные болезни
Пептидил-пролил изомераза (Ρίη 1)	КапеапаЛап е1 а1., Се1189, 875 (1997)	Пролиферативные болезни
Рецептор ретиноида X	Е§еа й а1„ ΕΜΒΟ 1 19,2592 (2000)	Пролиферативные болезни
β-глюкуронидазы	1ат е1 а!., Ναι 81гис1 ВЫ 3,375 (1996)	Пролиферативные болезни
Глютатионтрансфераза	ОаНеу е1 а1., I Μοί ΒίοΙ 291, 913 (1999)	Пролиферативные болезни
Ьрз 90	Лег й а!.. СЬет. ΒίοΙ 10,361 (2003)	Пролиферативные болезни
ΙΜΡΌΗ	ЫсЬак й а!., Се1185,921 (1996)	Пролиферативные болезни
Фосфолипаза А2	СЬалЬга й а!., ВюсЬепйзПу 41, 10914 (2002)	Пролиферативные болезни
Фосфолипаза С	Еззеп е! а1., ВюсйеппЫгу 36, 1704 (1997)	Пролиферативные болезни
Фосфолипаза I>	Теиоз е( а!., 1 Μοί ΒίοΙ 339,805 (2004)	Пролиферативные болезни
Ме1Ар2	ВЬеррагй й а!., Вюог§ Ме4 СЬет Ьей 14, 865 (2004)	Пролиферативные болезни
РТР-1 В	АпОегзеп й а!.. 1 ΒίοΙ СЬет 275, 7101 (2000)	Пролиферативные болезни
Аурора-кйназа	ГапсеШ е1 а1., ίη ргезз (в печати)	Пролиферативные болезни
ΡϋΚ-1	КотадОег е! а1., ВюсЬет 1 375, 255 (2003)	Пролиферативные болезни
НМО СоАредуктаза	1зГ/ап апс1 ОегзепЪоГег 8с1епсе 292, 1160 (2001)	Атеросклероз
Оксидоскваленциклаза	ТепЬап с1 а]., СЬет, ΒίοΙ 9,639 (2002)	Гиперхолестеринемия
Стимулятор пируватдегидрогеназз	МаПезН е1 а1., Заепсе 255. 1544 (1992)	Сердечно-сосудистое заболевание
Аденилат-циклаза	7Ьапе с( а!., КаШге 386,247 (1997)	Сердечно-сосудистое заболевание
Агонист ΡΡΚ,γ	ЕЬОигр й а1., 1 Мс4 СЬет 46, 1306 (2003)	Диабет
Алкогольдегидрогеназа	ВаЫзоп еТ а1.. ΡΝΑ8 1.'8А 94 12797 (1997) '	Отравление алкоголем
Гормончувствит. липаза	Ψ/εί е! а1., На! 3(гис1 ΒίοΙ 6,340 (1999)	Инсулинрезистентный диабет
Аденозинкиназа	МаЙС'л'.ч е! а1., ВюсЬстЩгу 37, 15607	Эпилепсия
	(1998)
Альденозияредуктаза	иггЬтзсе е1 а1., 8Иис1иге 5,601 (1997)	Диабет
Рецептор витамин О	а ТоссЫш-Уа1еп11П1 е! а1., ΡΝΑ8 и8А 98, 5491 (2001)	Остеопороз
Протеинтиразинфосфотаза	Апйегаеп е( а!., 1 ВЫ СЬет 275, 7101 (2000)	Диабет
ВИЧ протеаза	ЬоиЬ е1 а!., ВюсЬеппайу 37, 2105 (1998)	ВИЧ
НСУ-полимераза	ВгезеаиеШ й а1„ ΡΝΑ8 Ε5Λ 96, 13034 (1999)	Гепатит С
Нейраминидаза	Тау1ог й а1„ 1 Мей СЬет 41,798 (1998)	Грипп
Обратная транскриптаза	Цаа й а1., 3 Μοί ΒίοΙ 264, 1085 (1996)	ВИЧ
СМУ-протеаза	КЬауа! е! а1., ВюсЬепнйгу 42, 885 (2003)	СМУ-инфекция
Тимидинкиназа	СЬатрпезз а1., Ρτοΐεΐη 32,350 (1998)	Герпесная инфекция
ВИЧ-пнтеграза	Μοίΐβηί е< а!., Ас1а Сгуз1а11о£г 8ес1 ϋ 57. 536 (2001)	ВИЧ

Для целей иллюстрации делается ссылка на известные ингибиторы пяти вышеуказанных внутриклеточных мишеней, метод связывания которых с мишенью известен. Эти примеры показывают, как такие структурные данные могут применяться для определения соответствующих положений для присоединения эфирного фрагмента α,α-дизамещенного глицина. Показана схема активных сайтов вместе с примерами ингибиторов. В общем, положения, удаленные от поверхности связывания между модулятором и мишенью, и, следовательно, удаление от поверхности связывания фермента в растворитель являются подходящими местами для прикрепления сложноэфирного фрагмента, они показаны на диаграмме.

- 13 019838

ΗΌΛΟ

- 14 019838

Похожий подход может также быть применен для других примеров, показанных в табл. 1. Способ увеличения клеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора в клетке может включать несколько стадий.

Стадия 1. Идентификация положения или положений в одной или многих молекулах модулятора, которые делят один и тот же метод связывания целевого фермента или рецептора, удаленных от поверхности связывания между модуляторами и целевым ферментом или рецептором.

Обычно такие положения идентифицируют по структуре со-кристаллов, определенной рентгеновским методом (или методом ЯМР) для целевого фермента или рецептора с известным модулятором (и его близким структурным аналогом), связанным с ферментом или рецептором, путем выявления структуры. Или же структура кристаллов целевого фермента или рецептора с модулятором, помещенным в активный сайт фермента или рецептора, модулируется компьютерными графическими методами, и затем рассматривают эту модель. Предположение, что структурная модификация модулятора в положениях, удаленных от поверхности связывания, вряд ли значительно влияет на связывание модулятора с активным сайтом фермента или рецептора. Подходящие положения обычно определяются из структуры сокристалла или модели, которая должна ориентироваться по направлению к растворителю.

Стадия 2. Ковалентная модификация модулятора(ов) путем присоединения эфирного радикала α,αдизамещенного глицина или ряда различных эфирных радикалов α,α-дизамещенного глицина в одном или нескольких положениях, идентифицированных на стадии 1.

Присоединение сложноэфирных радикалов α,α-дизамещенного глицина (то есть возможных фрагментов карбоксилэстеразы) может происходить через имеющуюся группу ковалентного сочетания в модуляторе(ах) или через подходящую группу, специально введенную для этой цели. Фрагменты карбоксилэстеразы могут быть отделены от основанного объема молекулы спейсерным или линкерным элементом, чтобы поместить этот фрагмент глубже в растворитель и тем самым уменьшить любое небольшое влияние фрагмента на метод связывания модулятора, и/или обеспечить доступность фрагмента на метод связывания модулятора, и/или обеспечить доступность фрагмента для карбоксилэстеразы путем уменьшения стерического вмешательства, которое может появиться от основной массы молекулы модулятора.

Осуществление стадии 2 приводит к получению одного или обычно небольшой библиотеки потенциальных модуляторов, каждый из которых ковалентно модифицирован относительно его родительского ингибитора путем введения различных сложноэфирных радикалов α,α-дизамещенного глицина в одной или нескольких точках присоединения, идентифицированных на стадии 1.

- 15 019838

Стадии 3. Испытание конъюгата модулятора(ов) с α,α-дизамещенным глициновым эфиром, полученного на стадии 2, для определения его активности в отношении целевого фермента или рецептора.

Как обычно принято в медицинской химии, варианты фрагментов карбоксилэстеразы в родительском(их) модуляторе(ах), полученных в результате осуществления стадий 1 и 2, предпочтительно испытывают с применением методов анализа, пригодных для определения ожидаемого сохранения активности модулятора и степени сохранения этой активности и профиля активности. В соответствии с целями изобретения, которые состоят в создании накопления активности модулятора в клетках, подходящие методы анализа обычно включают анализ клеточных линий для оценки степени клеточной активности и профиля активности модифицированных модуляторов. Другие методы анализа, которые могут быть применены на стадии 3, включают ίη νίίΓΟ определение модулирования фермента или рецептора с целью оценки активности, присущей модифицированному модулятору и его продукту гидролиза карбоксилэстеразы; метод анализа для определения скорости конверсии модифицированных модуляторов в соответствующую карбоновую кислоту или действие карбоксилэстераз и методы определения скорости и/или степени накопления продукта гидролиза карбоксилэстеразы (карбоновой кислоты) в клетках. В таких методах анализа можно использовать клетки моноцитов и не-моноцитов и/или панель изолированных карбоксилэстераз с целью идентификации соединений, которые проявляют селективность в отношении клеток.

Если это необходимо или желательно, стадия 3 может быть повторена с другим набором потенциальных версий родительского модулятора, конъюгированного с эфиром α-аминокислоты.

Стадия 4. Выбор одного или нескольких вариантов испытанных родительских модуляторов, конъюгированных с α,α-дизамещенным глициновым эфиром, которые вызывают модуляцию активности фермента или рецептора внутри клеток и превращаются и аккумулируются как соответствующие карбоновые кислоты внутри клеток и которые обладают пролонгированной клеточной активностью.

Описанные выше стадии 1 -4 представляют общий алгоритм для осуществления принципов данного изобретения.

Синтез.

Существуют многие способы синтеза соединений, которых касается данное изобретение, все они основаны на известных химических реакциях, очевидных для химика-органика. Так, соединения формулы (I) могут быть синтезированы способами, описанными в обычной литературе и хорошо известными из уровня техники. Типичными литературными источниками являются АЩапсей отдалю сИет151гу, 4⁴¹¹ Εάίίίοη (^11еу), I МагсБ, СотргеБепзКе Огдашс ТгапзГогтаНоп, 2^4Ь Εάίίίοη (\У11еу), КС. Ьагоск НапйЬоок о£ Не1егосус11с СИетШту, 2^4Ь ЕйШоп (Регдатоп), Л.К КЩгЦхку), обзорные статьи в 8уп1йез1з, Асс. СИет. Кез, СИет. Вет. или первичные источники, которые можно найти в процессе поиска оп 11пе или во вторичных источниках, таких как СИет1са1 АЬз1гас1з или ВеП81ет.

Соединения по изобретению могут быть получены различными способами, описанными ниже и более конкретно в примерах, приведенных далее. При осуществлении реакций, показанных ниже, может быть необходимым защитить реакционноспособные функциональные группы, например гидроксильную, аминогруппу и карбоксильную группу, когда их наличие желательно в конечном продукте, чтобы избежать их нежелательного участия в реакциях (см., например, Сгееп Т.^. РгоЮсИпд Сгоирз ш Огдашс 8уп1Без1з КИп \УПеу апй 8опз, 1999). Могут быть применены обычные защитные группы в соответствии с обычной практикой. В некоторых случаях снятие защиты может быть конечной стадией синтеза соединений формулы (I) и способы согласно изобретению, описанные ниже, следует понимать как охватывающие такое удаление защитных групп.

Соединения по изобретению могут быть получены в соответствии со следующими примерами. Все температуры указаны в °С. Используются следующие сокращения:

ЕЮАс=этилацетат,

МеСМ=ацетонитрил,

МеОН=метанол,

Вос=трет-бутоксикарбонил,

СЭ1= 1,1 '-карбонилдиимидазол,

Ό СМ=дихлорметан,

ΌΒυ= 1,8-диазабицикло [5.4.0] индец-7 -ен,

ИМАР=диметиламинопиридин,

ИМЕ=диметилформамид, ИМ8О=диметилсульфоксид, ТНЕ=тетрагидрофуран, НС1=соляная кислота, ИаНСО₃=кислый карбонат натрия, ТВПМ8С1=трет-бутилдиметилхлорсилан,

ΝΒ 8=№бромсукцинимид,

ИММ=Ы-метилморфолин,

- 16 019838

МН₄С1=хлорид аммония,

КНМЭ8=бис-(триметилсилил)амид калия,

Рб/С=палладий-на-угле,

Мд8О₄=сульфат магния,

ЕЭС=гидрохлорид N-(3 -диметиламинопропил)-Ы'-этилкарбодиимид,

ЕЮ₂=диэтиловый эфир,

NаΒН(ОАс)з=триацетоксиборгидрид натрия,

НОВ1= 1 -гидроксибензотриазол, ТРА=трифторуксусная кислота, ТЬС=тонкослойная хроматография, тЬ=мл, г=грамм(ы), мг=миллиграмм(ы), то1=моль, тто1=миллимоль(и),

ЬСМ8=жидкостная хроматография высокого разрешения/масс-спектроскопия,

NМΚ=ядерный магнитный резонанс,

КТ=комнатная температура.

Коммерчески доступные реагенты и растворители (НРЬС сорт) применяли без дальнейшей очистки. Растворители удаляли в роторном выпаривателе Бучи или в сушилке У1гТ1к ВспсЕкр 8ЬС Бгссхс-бгусг. Микроволновое излучение получали, используя синтезатор Вю1адс ΙηίΙίαΙοΓ™ Ещ111 пйсгслуаус 8уп1Нс81/сг. Очистку соединений методом флэш-хроматографии на колонке проводили, используя силикагель, размер частиц 40-63 мкм (230-400 меш), полученный в ИиогосЕст. Очистку соединений методом препаративной хроматографии осуществляли в системах Сйкоп, используя колонки Ах1а™ ргср. Ьипа С18 (10 мкм, 100x21,2 мм), градиент 0-100% В (А=вода+0,05% ТРА, В=ацетонитрил ) в течение 10 мин, скорость потока=25 мл/мин, УФ с длиной волны, равной 254 нм.

Спектры ¹Н NМΚ. снимали на спектрометре Вгиксг 300 МН/ АУ в дейтерированных растворителях. Химические сдвиги указаны в м.д. Тонкослойную хроматографию (ТЬС) проводили на пластинах К1скс1дс1 60 Р₂₅₄ (Мсгск) с использованием УФ-света.

Аналитическую НРЬС/М8 осуществляли на системе Ад11сп1 НР 1100 ЬС с применением колонки с обращенной фазой Ьипа С18 (3 мкм, 50x4,6 мм), градиент 5-95% В (А=вода+0,1% муравьиной кислоты, В=ацетонитрил+0,1% муравьиной кислоты) в течение 2,25 мин, скорость потока=2,25 мл/мин, УФспектры записывали при длине волны 220 и 254 нм, используя детектор С1315В ЭЛЭ. Масс-спектры получали в интервале т/ζ от 150 до 800 на детекторе БС/М8Э 8Ь С1956В. Данные интегрировали и обрабатывали с использованием СЕст81айоп и программ С11ст81а1юп Эа1а Вго^ксг.

Примеры 1-6. Соединения 6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-1-фенил-1Н-пиридин-2-он.

(Соединение I) и 6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиридин-2-он (соединение ΙΙ)

Соединенне 1

Соединение II являются известными ингибиторами внутриклеточного фермента киназы р38 МАР (\УО 03/076405). Примеры 1, 3 и 5 ниже относятся к ковалентному конъюгированию фрагментов эстеразы с дизамещени ем у α-углерода эфира аминокислоты с этими соединениями в положении, удаленном от поверхности связывания между ингибитором и целевым ферментом (см. комментарии выше, касающиеся метода связывания ингибитора в модели киназы р38 МАР). Примеры 2, 4 и 6 ниже относятся к продукту гидролиза эстеразы, карбоновой кислоте, полученной в примерах 1, 3 и 5 соответственно.

Синтез в примерах 1-6.

Промежуточное соединение 1. 4-Хлорфенил-3-(2,4-дифторфенил)-3-оксопропанимидотиоат

Промежуточное соединение 1 может быть получено по методу, описанному в \УО 200376405.

Промежуточное соединение 2. {4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)ил] фенил}ацетальдегид

- 17 019838 {4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]фенил}ацетальдегид получали способами, показанными на схеме 1 ниже.

Стадия 1. 2-(4-{[3-(2,4-Дифторфенил)-3-оксопропанимидоил]амино}фенил)этилацетат.

4-Хлорфенил-3-(2,4-дифторфенил)-3-оксопропанимидотиоат (промежуточное соединение 1) (69,7 г, 192 ммоль) суспендировали в ледяной уксусной кислоте (700 мл) и добавляли 2-(4-аминофенил)этанол (27,71 г, 202 ммоль, 1,05 экв.). Смесь нагревали при 80°С в течение 2,5 ч до последующего охлаждения при комнатной температуре и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали с ЕьО (500 мл) и промывали ЕьО (2x250 мл) с получением белого твердого продукта, который суспендировали в насыщенном №1НС'О₃ (700 мл) и энергично перемешивали в течение 30 мин. После фильтрации и промывки водой получали бежевый твердый продукт, который сушили при пониженном давлении с получением целевого соединения (64,12 г, выход 92%).

БС/М8: т/ζ 361 [М+Н]⁺. '11 ММК (300 МГц, ΌΜ8Ο-ά₆) δ 7,79-7,71 (1Н, т), 7,45-7,07 (6Н, т), 5,26 (1Н, 8), 4,21 (2Н, ΐ, 1=6,8 Гц), 2,89 (2Н, ΐ, 1=6,5 Гц), 2,00 (3Н, 8).

Стадия 2. 2-{4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]фенил}этилацетат.

ΓΌΙ (43,26 г, 267 ммоль, 1,5 экв.) растворяли в безводном ТНГ (1 л) в атмосфере азота и охлаждали до 0°С. По каплям добавляли пропионовую кислоту (16,43 мл, 257 ммоль, 1,5 экв.), давали смеси нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч. Добавляли суспензию 2-{4-{(2,4дифторфенил)-3-оксопропанимидоил]амино}фенил)этилацетата (64,12 г, 178 ммоль) в безводном ТНГ (500 мл) и смесь нагревали при 80°С в течение 6 ч, затем перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Полученный остаток отделяли путем фильтрации, промывали ЕьО и сушили при пониженном давлении, получая целевое соединение в виде бледно-желтого продукта (39,56 г). Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением коричневого масла, которое растирали с ЕЮАс (500 мл), затем путем фильтрации получали вторую порцию продукта (7,21 г). Обе партии соединяли с получением целевого соединения в виде твердого продукта желтого цвета (46,77 г, выход 64%).

БС/М8: т/ζ 413 [М+Н]⁺. Ή ΝΜΚ (300 МГц, ПМ8О-й₆) δ 7,55-7,37 (4Н, т), 7,3-7,20 (4Н, т), 5,72 (1Н, ά, 1=9,6 Гц), 4,30 (2Н, ΐ, 1=6,9 Гц), 3,01 (2Н, ΐ, 1=6,9 Гц), 2,04 (3Н, 8).

Стадия 3. 6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-1-[4-(2-гидроксиэтил)фенил]пиридин-2(1Н)-он.

2-{4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]фенил}этилацетат (46,77 г, 113 ммоль) суспендировали в 6 N водной НС1 (500 мл) и нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч. Осадок, образовавшийся при охлаждении при комнатной температуре, который выделяли путем фильтрации, суспендировали в насыщенном водном NаНСΟз (1000 мл) и энергично перемешивали в течение 30 мин. После фильтрации, промывки водой (2x500 мл) и сушки при пониженном давлении получали целевое соединение в виде твердого продукта неправильного белого цвета (40,11 г, выход 96%).

БС/М8: т/ζ 371 [М+Н]⁺. '11 МИК (300 МГц, ПМ8О-0₆) δ 7,55-7,37 (4Н, т), 7,31-7,20 (4Н, т), 5,71 (1Н, ά, 1=9,9 Гц), 4,69 (1Н, ΐ, 1=5,3 Гц), 3,71 (2Н, т), 2,84 (2Н, ά, 1=6,9 Гц).

Стадия 4. {4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]фенил}ацетальдегид.

К суспензии 6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-1-[4-(2-гидроксиэтил)фенил]пиридин-2(1Н)-она (15,00 г, 40,5 ммоль) в безводном ЭСМ (750 мл) при температуре 0°С добавляли частями периодинан ДессаМартина (20,62 г, 48,6 ммоль, 1,32 экв.). Смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 ч, затем выливали в насыщенный водный раствор №1НС'О₃ (400 мл) и насыщенный водный раствор №ь8₃О₃ (400 мл) и энергично перемешивали в течение 30 мин. Водный слой отделяли и экстрагировали ЭСМ (2x500 мл), органические экстракты соединяли и сушили над Мд§О₄. После фильтрации и концентрации при пониженном давлении получали целевое соединение в виде сырого твердого продукта бледно-желтого цвета, который применяли без дальнейшей очистки (15,13 г).

БС/М8: т/ζ 369 [М+Н]⁺.

- 18 019838

Промежуточное соединение 3. Циклопентил-2-метилаланината гидрохлорид

НС1 Н_гМ

О ¹—'

Промежуточное соединение 3 синтезировали, применяя способ, показанный на схеме 2 ниже. Схема 2

Стадия 1. .

I Циклопентанол * I Стадия цыХ/⁰^ >*₀ ОН ЕОС1, ОМАР. ОСИ НСУдноксан ⁴⁰ 1Г Т /

ТНЕ °

Стадия 1. Циклопентил-Ы-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилаланинат

К раствору Ы-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилаланина (1,00 г, 4,92 ммоль) в ЭСМ (10 мл) при температуре 0°С добавляли циклопентанол (0,83 мл, 9,84 ммоль), ЕЭС1 (1,06 г, 5,42 ммоль) и наконец ΌΜΛΡ (60 мг, 0,49 ммоль), реакционную смесь нагревали до КТ и перемешивали в течение 18 ч. ЭСМ удаляли под вакуумом с получением прозрачного масла. Сырой остаток растворяли в ЕЮАс (100 мл) и промывали водой, 1 М ЫаНСОз и рассолом. Органическую фазу высушивали (Мд§О₄) и концентрировали под вакуумом. Сырой экстракт очищали методом хроматографии на колонке (10% ЕЮАс в гептане) с получением желаемого продукта в виде прозрачного масла (0,254 г, выход 20%).

'Н ΝΜΚ (300 МГц, С1)С1_;) δ 5,25-5,17 (1Н, т), 5,04 (1Н, Ьг 8), 1,93-1,54 (8Н, т), 1,49 (6Н, 8), 1,45 (9Н, ₈).

Стадия 2. Циклопентил-2-метилаланината гидрохлорид (промежуточное соединение 3).

Циклопентил-№(трет-бутоксикарбонил)-2-метилаланинат (0,254 г, 0,93 ммоль) растворяли в ТНГ (5 мл) и обрабатывали 4 М НС1/диоксан (2 мл) и перемешивали реакционную смесь при КТ в течение 24 ч. Сырую смесь концентрировали при пониженном давлении и растирали с ЕГО с получением белого осадка. Этот осадок промывали ЕГО с получением желаемого продукта в виде белого порошка (0,16 г, выход 82%).

'|| ΝΜΚ (300 МГц, 1)\15О-сЕ) δ 8,58 (3Н, Ьг ₈), 5,21-5,14 (1Н, т), 1,93-1,78 (2Н, т), 1,74-1,53 (6Н, т), 1,45 (6Н, 8).

Промежуточное соединение 4. трет-Бутил-2-метилаланинат

Промежуточное соединение 4 синтезировали методом, показанным на схеме 3 ниже. Схема 3

Стадия 1. трет-Бутил-№[(бензилокси)карбонил]-2-метилаланинат.

К раствору №[(бензилокси)карбонил]-2-метилаланина (1 г, 4,21 ммоль) в ЭСМ (безводный, 10 мл) и циклогексана (10 мл) при температуре 0°С в атмосфере азота добавляли диэтилэфират трифторида бора (7,7 мкл, катализатор). Затем медленно добавляли в течение 30 мин трет-бутил-2,2,2-трихлорацетимидат (1,51 мл, 8,43 ммоль) в циклогексане (10 мл), затем давали нагреться до КТ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. К сырой реакционной смеси добавляли 190 мг NаНСО₃ и отфильтровывали. Маточник концентрировали под вакуумом. Сырой экстракт очищали методом хроматографии на колонке (10% ЕЮАс в гептане) с получением желаемого продукта (0,863 г, выход 70%).

'|| ММК (300 МГц, С1)С1_;) δ 7,39-7,31 (5Н, т), 5,46 (1Н, Ьг 8), 5,10 (2Н, 8), 1,54 (6Н, 8), 1,45 (9Н, 8). Стадия 2. трет-Бутил-2-метилаланинат (промежуточное соединение 4).

К раствору трет-бутил-№[(бензилокси)карбонил]-2-метилаланината (0,863 мг, 2,90 ммоль) в ЕЮАс (20 мл) добавляли 100 мл катализатора Ρά/С. Подсоединяли вакуум и перемешивали смесь в атмосфере водорода в течение 18 ч, отфильтровывали (через целит), промывали ЕЮАс и концентрировали под вакуумом. Полученный продукт выделяли в виде желтого масла (0,45 мг, 96%), содержащего следы ЕЮАс. Полагали, что продукт является летучим, поэтому нужна была предосторожность во время выпаривания под вакуумом.

- 19 019838 ¹Н ПМК (300 МГц, СОС1_;) δ 1,48 (9Н, в), 1,32 (6Н, в).

Промежуточное соединение 5. Циклопентил-1-аминоциклопентанкарбоксилат

Промежуточное соединение 5 получали по методу, показанному на схеме 4 ниже. Схема 4

Стадия 1. Циклопентил-1-аминоциклопентанкарбоксилат.

К раствору 1-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (2,58 г, 19,97 ммоль) в циклопентаноле (20 мл) добавляли концентрированную серную кислоту (2,15 г, 21,97 ммоль) и перемешивали смесь в течение ночи при 70°С. Реакционную смесь охлаждали до КТ и удаляли циклопентанол при пониженном давлении. Остаток растворяли в ЕЮАс (30 мл) и промывали насыщенным раствором NаНСО₃ (30 мл) и водой (3x20 мл). Затем высушивали (Мд8О₄), отфильтровывали и концентрировали под вакуумом, получая масло темно-желтого цвета. После очистки методом колоночной хроматографии (15% 1,2 М ПН₃/МеОН в ЕЮАс) получали желаемый продукт (1,97 г, выход 50%).

'|| \\1К (300 МГц, СОС1_;) δ 5,21-5,17 (1Н, т), 2,51-1,90 (2Н, т), 1,85-1,57 (14Н, т).

Промежуточное соединение 6. трет-Бутил-1-аминоциклопентанкарбоксилат

Промежуточное соединение 6 синтезировали методом, показанным на схеме 5 ниже.

Стадия 1. 1-[{(Бензилокси)карбонил]амино}циклопентанкарбоновая кислота.

К раствору 1-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (3,0 г, 23,2 ммоль) в смеси 1:1 диоксан/вода (60 мл) медленно добавляли №ьСО₃ (12,3 г, 116 ммоль), затем бензилхлорформиат (3,6 мл, 25,5 ммоль) и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь осторожно подкисляли до рН, равного 2, при помощи 1 М НС1, затем экстрагировали ЕЮАс (3x30 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом (30 мл), сушили (Мд8О₄), фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением бледно-желтого масла. ЬСМ8 и ПМК показали, что сырой продукт представляет собой смесь желаемого продукта и соответствующего бензилового эфира. Сырой продукт растворяли в смеси 1:1 ТНР/вода (60 мл) и обрабатывали гидроокисью лития (2,67 г, 116 ммоль). Смесь перемешивали при КТ в течение ночи, затем промывали ЕьО (3x30 мл), подкисляли до рН, равного 2, и экстрагировали ЕЮАс (3x30 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом (30 мл), сушили (Мд8О₄), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая целевое соединение (4,76 г, 78%).

ЬСМ8: т/ζ 264 (М+Н)⁺.

Стадия 2. трет-Бутил-1 -[{(бензилокси)карбонил] амино}циклопентанкарбоксилат. трет-Бутил-1-[{(бензилокси)карбонил]амино}циклопентанкарбоксилат получали способом, похожим на способ на стадии 1 (схема 3) получения промежуточного соединения 4.

БС/М8: т/ζ 320 (М+Н)⁺.

Стадия 3. трет-Бутил-1-аминоциклопентанкарбоксилат.

трет-Бутил-1-аминоциклопентанкарбоксилат получали по способу стадии 2 (схема 3) получения промежуточного соединения 4.

'|| \\1К (300 МГц, СОС1_;) δ 2,08-2,02 (2Н, т), 1,87-1,72 (4Н, т), 1,64-1,58 (2Н, т), 1,47 (9Н, в).

- 20 019838

Пример 1. Циклопентил-Н-(2-{4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)ил] фенил}этил)-2-метилаланинат

В этом примере соединения по изобретению циклопентилэфирную группу диметилглицина ковалентно конъюгировали с родительским ингибитором киназы р38МАР через аминогруппу циклопентилового эфира диметилглицина и через линкерный радикал -СН₂-СН₂-.

Соединение получали, используя промежуточные соединения 2 и 3, как описано ниже.

К раствору промежуточного соединения 2 (189 мг, 0,514 ммоль) в безводном ТНЕ (4 мл) добавляли гидрохлорид циклопентил-2-метилаланината (промежуточное соединение 3) (160 мг, 077 ммоль, 1,5 экв.) и №1ВН(ОЛе)₃ (326 мг, 1,54 ммоль, 3 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и затем резко охлаждали водой (20 мл). Водный слой обрабатывали ЕЮАс (3x20 мл) и объединенные органические экстракты промывали рассолом (40 мл), сушили над Мд§О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали методом препаративной НРЬС с получением целевого соединения (130 мг, выход 48%).

ЬС/М8: т/ζ 524 (М+Н)⁺. Ή ΝΜΒ (300 МГц, СОСЪ) δ 10,43 (1Н, Ьг 8), 7,51-7,34 (4Н, т), 7,28-7,26 (2Н, т), 7,04-6,90 (2Н, т), 5,93 (1Н, й, 1=9,6 Гц), 5,20-5,10 (1Н, т), 2,93-2,75 (4Н, т), 1,95-1,55 (8Н, т), 1,31 (6Н, 8).

Пример 2. №(2-{4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]фенил}этил)-2метилаланин

Этот пример относится к продукту гидролиза соединения, полученного в примере 1. Соединение получали с применением промежуточных соединений 2 и 4, как показано на схеме 6.

Стадия 1. трет-Бутил-№(2-{4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]фенил}этил)-2-метилаланинат.

К раствору промежуточного соединения 2 (180 мг, 0,489 ммоль) в ТНЕ (3 мл) добавляли трет-бутил2-метилаланинат (промежуточное соединение 4) (117 мг, 0,73 ммоль), перемешивали в течение 30 мин и затем добавляли ΝαΒ^ΟΑ^ (310 мг, 1,467 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч, разбавляли ЕЮАс и органический слой промывали насыщенным NаΗСΟ₃, рассолом, сушили (Мд§О₄), фильтровали и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали методом препаративной НРЬС с получением целевого соединения (120 мг, выход 48%).

ЬС/М8: т/ζ 512 (М+Н)⁺. Ή ΝΜΒ (300 МГц, С1)С1_;) δ 10,41 (1Н, Ьг 8), 7,51-7,34 (4Н, т), 7,28-7,26 (2Н, т), 7,05-6,90 (2Н, т), 5,93 (1Н, й, 1=9,9 Гц), 5,15 (1Н, Ьг 8), 2,93-2,78 (4Н, т), 1,46 (9Н, 8), 1,29 (6Н, 8).

Стадия 2. №(2-{4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]фенил}этил)-2метилаланин.

К раствору трет-бутил-№(2-{4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)ил]фенил}этил)-2-метилаланината (100 мг, 0,19 ммоль) в ЭСМ (3 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (3 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали с ЕьО. фильтровали и сушили при пониженном давлении с получением целевого соединения в виде твердого продукта неправильного белого цвета (50 мг, выход 56%).

БС/М8: т/ζ 456 (М+Н)⁺. Ή \МН (300 МГц, 1)\18О-й.) δ 10,05 (1Н, Ьг 8), 7,60-7,15 (9Н, т), 6,95 (1Н, Ьг 8), 5,72 (1Н, й, 1=9,6 Гц), 3,15-2,95 (4Н, т), 1,33 (6Н, Ьг 8).

- 21 019838

Пример 3. Циклопентил-1-[(2-{4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)ил]фенил}этил)амино]циклопентанкарбоксилат

Соединение по примеру 3 синтезировали с применением промежуточных соединений 2 и 5, как описано в примере 1.

ЬС/М8: т/ζ 550 (М+Н)⁺. ¹Н ΝΜΚ (300 МГц, 1)\18О-б₆) δ 7,55-7,34 (6Н, т), 7,29-7,21 (2Н, т), 5,72 (1Н, б, 1=9,8 Гц), 5,27-5,21 (1Н, т), 3,31-3,20 (2Н, т), 3,10-3,00 (2Н, т), 2,22-2,12 (2Н, т), 2,08-1,98 (2Н, т), 1,90-1,58 (12Н, т).

Пример 4. 1-[(2-{4-[6-Амино-5-{2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]фенил}этил)ами-

Соединение по примеру 4 получали, применяя промежуточные соединения 2 и 6, как описано в примере 2.

ЬС/М8: т/ζ 482 (М+Н)⁺. ^!Н ΝΜΚ (300 МГц, 1)\18О-б₆) δ 7,52-7,37 (4Н, т), 7,31-7,20 (4Н, т), 5,71 (1Н, б, 1=10,0 Гц), 3,08-2,93 (4Н, т), 2,10-1,99 (2Н, т), 1,78-1,68 (6Н, т).

Пример 5. Циклопентил-5-{4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3,5-

^!Н ХМК (300 МГц, ИМ8О-б₆) δ 10,14 (1Н, Ег 8), 8,06 (3Н, Ег 8), 7,57 (1Н, бб, 1=8,5 и 15,1 Гц), 7,42 (1Н, 1б, 1=2,3, 10,0 Гц), 7,34 (1Н, бб, 1=2,5 и 9,8 Гц), 7,24 (1Н, 1б, 1=2,3, 8,5 Гц), 7,03 (2Н, б, 1=10,2 Гц), 5,74 (1Н, б, 1=9,8 Гц), 5,23-5,19 (1Н, т), 4,13-4,07 (2Н, т), 1,97-1,83 (5Н, т), 1,70-1,57 (7Н, т), 1,45 (3Н, 8). Чистота ЬСМ8=95%; т/ζ 576 (М+Н)⁺.

Соединение по примеру 5 получали методом, показанным на схеме 7.

Схема 7

Соединение по Примеру 1

Стадия 1. 5-Бензил-1-циклопентил-№(трет-бутоксикарбонил)-Ь-глутамат.

К раствору (28)-5-(бензилокси)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановой кислоты (10 г,

- 22 019838 ммоль) в ИСМ (100 мл) добавляли циклопентанол (30 мл, 33 ммоль), БИС (6,25 г, 33 ммоль) и ΌΜΆΡ (362 мг, 3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 ч для завершения реакции. Полученную реакционную смесь разбавляли ИСМ, промывали 1 М НС1, насыщенным NаНСО₃, рассолом, сушили (Мд8О₄) и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали методом колоночной хроматографии (20% Б1ОЛс/гептан) с получением целевого соединения в виде твердого продукта белого цвета (8,48 г, выход 71%).

т/ζ 406 (М+Н)⁺.

Стадия 2. 5-Бензил-1-циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-Б-глутамат.

К раствору 5-бензил-1-циклопентил-№(трет-бутоксикарбонил)-Б-глутамата (8,48 г, 21 ммоль) в ацетонитриле (100 мл) добавляли ди-трет-бутилкарбонат (13,69 г, 63 ммоль) и ΌΛΜΡ (255 мг, 2,1 ммоль). Смесь нагревали до 50°С и перемешивали в течение ночи перед охлаждением до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Сырой остаток растворяли в ЕЮАс и промывали 1 М НС1, насыщенным NаНСО₃ и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением коричневого масла. Очистка методом колоночной хроматографии (10-20% ЕЮАс/гептан) привела к получению целевого соединения в виде бесцветного масла (10,16 г, выход 96%).

т/ζ 506 (М+Н)⁺.

Стадия 3. (48)-4-[бис-(трет-Бутоксикарбонил)амино]-5-(циклопентилокси)-5-оксопентановая кислота.

К раствору 5-бензил-1-циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-Б-глутамата (10,16 г, 20,1 ммоль) в ЕЮАс (200 мл) добавляли Ρά/С (1 г). Смесь перемешивали в атмосфере Н₂ в течение 19 ч, фильтровали через слой целита и концентрировали под вакуумом с получением целевого соединения в виде бледно-желтого масла (8,28 г, выход 99%).

т/ζ 416 (М+Н)⁺.

Стадия 4. Циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-гидрокси-Б-норвалинат.

(48)-4-[бис-(трет-Бутоксикарбонил)амино]-5-(циклопентилокси)-5-оксопентановую кислоту (8,28 мг, 20 ммоль) растворяли в ТНБ (80 мл) и охлаждали на ледяной бане. Добавляли NΜΜ (3,3 мл, 30 ммоль) с последующим введением по каплям изобутилхлорформиата (3,6 мл, 28 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 1,5 ч перед фильтрацией и осадок промывали ТНБ. Маточник охлаждали снова до 0°С и частями добавляли NаΒН₄ (1,51 г, 40 ммоль), перемешивали в течение 3 ч. Реакционную смесь обрабатывали водой (80 мл) и экстрагировали ЕЮАс (3x100 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом, сушили (Мд8О₄) и концентрировали под вакуумом с получением желтого масла. После очистки на хроматографической колонке (40% ЕЮАс/гептан) получали целевое соединение в виде бесцветного масла (4,34 г, выход 54%).

т/ζ 402 (М+Н)⁺.

Стадия 5. Циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-Бнорвалинат.

Циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-гидрокси-Б-норвалинат (4,34 г, 10,8 ммоль) растворяли в ацетонитриле (45 мл) и охлаждали на ледяной бане. Добавляли ИБИ (1,7 мл, 11,3 ммоль) с последующим введением ТВИМ8С1 (1,71 г, 11,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и затем концентрировали под вакуумом. Сырой остаток растворяли в ЕЮАс и промывали 1 М НС1, насыщенным NаНСО₃ и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением желтого масла. После очистки методом колоночной хроматографии (20% ЕЮАс/гептан) получали целевое соединение в виде бесцветного масла (3,82 г, выход 69%).

т/ζ 516 (М+Н)⁺.

Стадия 6. Циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-{ [трет-бутил(диметил)силил]окси}-2метилнорвалинат.

К раствору циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-Бнорвалината (3,82 г, 7,4 ммоль) в ТНБ (50 мл) при температуре -78°С в атмосфере азота добавляли 0,91 М КНМИ8 в ТНБ (16,3 мл, 14,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 1 ч перед добавлением метилиодида (0,92 мл, 14,8 ммоль). Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь обрабатывали насыщенным N4^1 и экстрагировали водный слой ЕЮАс (2x50 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом, сушили (Мд8О₄) и концентрировали под вакуумом с получением желтого масла, которое применяли без дальнейшей очистки (3,50 г, выход 89%).

т/ζ 530 (М+Н)⁺.

Стадия 7. Циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-гидрокси-2-метилнорвалинат.

Циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-метилнорвалинат растворяли в уксусной кислоте (45 мл), ТНБ (15 мл) и воде (15 мл). Реакционную смесь перемешивали при 30°С в течение 20 ч для завершения реакции. Реакционную смесь затем разбавляли ЕЮАс и

- 23 019838 промывали насыщенным №НСО₃ и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом, получая густое желтое масло, которое применяли без дальнейшей очистки (3,08 г).

т/ζ 416 (М+Н)⁺.

Стадия 8. Циклопентил-5-бромЖ,Жбис-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилнорвалинат.

ΝΒ8 (3,95 г, 22,2 ммоль) суспендировали в ЭСМ (30 мл) и добавляли трифенилфосфин (5,44 г, 20,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 5 мин перед добавлением пиридина (0,94 мл, 8,9 ммоль). Затем добавляли циклопентил-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-гидрокси-2-метилнорвалинат (3,08 г, 7,4 ммоль) в виде раствора в ЭСМ (30 мл) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом с получением коричневого масла, которое очищали методом хроматографии на колонке (15% ЕЮАс/гептан) с получением целевого соединения в виде бесцветного масла (1,05 г, выход 30% на двух стадиях).

т/ζ 479 (М+Н)⁺.

Стадия 9. Циклопентил-5-{4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3,5дифторфенокси}-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилнорвалинат.

6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-1-(2,6-дифтор-4-гидроксифенил)пиридин-2(1Н)-он (пример 51 ^О 03/076405) (500 мл, 1,32 ммоль) и циклопентил-5-бром-^№бис-(трет-бутоксикарбонил)-2метилнорвалинат (696 мг, 1,45 ммоль) смешивали вместе в ЭМГ (10 мл). Затем добавляли карбонат калия (365 мг, 2,64 ммоль) и иодид натрия (396 мг, 2,64 ммоль), перемешивая смесь при 40°С в течение ночи. Затем реакционную смесь разбавляли ЕЮАс (50 мл) и промывали водой и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением твердого продукта желтого цвета, который очищали методом хроматографии на колонке (30-40% ЕЮАс/гептан) с получением целевого соединения в виде твердого продукта белого цвета (604 мг, 59%).

т/ζ 776 (М+Н)⁺.

Стадия 10. Циклопентил-5-{4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3,5дифторфенокси}-2-метилнорвалинат.

Циклопентил-5-{4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3,5-дифторфенокси}Н№бис-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилнорвалинат (604 мг) растворяли в ТГА (10 мл) и ЭСМ (10 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом с получением коричневого масла. Сырой продукт разбавляли ЕЮАс (50 мл) и промывали насыщенным NаНСОз, водой и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением твердого продукта бледно-желтого цвета, полученного в примере 5 (387 мг, выход 46%).

Пример 6. 5-{4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3,5-дифторфенокси}-2метилнорвалин

¹Н \МК (300 МГц, ЭМ8О-б₆) δ 10,16 (1Н, Ьг 8), 8,17 (3Н, Ьг 8), 7,63-7,51 (1Н, т), 7,47-7,18 (3Н, т), 7,14-6,99 (2Н, т), 6,23 (1Н, б, 1=9,6 Гц), 4,10 (2Н, Ьг ₈), 1,96-1,63 (4Н, т), 1,41 (3Н, ₈). Чистота ЬСМ8=95%; т/ζ 508 (М+Н)⁺.

Соединение по примеру 6 получали способом, показанным на схеме 8.

Схема 8

Стадия 9

Пример 2

- 24 019838

Стадия 1. 5-Бензил-1-трет-бутил-М-(трет-бутоксикарбонил)-Ь-глютамат.

К раствору Ν-α-трет-бутоксикарбонил-Ь-глутамовой кислоты α-трет-бутилового эфира (5 г, 16,5 ммоль) в ЭСМ (50 мл) добавляли бензиловый спирт (3,4 мл, 33 ммоль), ЕЭС (3,48 г, 18 ммоль) и ΌΜΑΡ (201 мг, 1,16 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 ч до завершения реакции. Смесь разбавляли ЭСМ. промывали 1 М НС1, насыщенным №1НСО₃, рассолом, сушили (Мд§О₄) и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали методом хроматографии на колонке (20% ЕЮАс/гептан) с получением целевого соединения в виде бесцветного масла (5,98 г, выход 92%).

т/ζ 416 (\1-М1)'.

Стадии 2-9 повторяют тот же метод, который описан в примере 5 (схема 7).

Стадия 10. 5-{4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3,5-дифторфенокси}-2метилнорвалин.

трет-Бутил-{4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3,5-дифторфенокси}-^№ бис-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилнорвалинат (70 мг) растворяли в ТБА (2 мл) и ЭСМ (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом с получением масла розового цвета. Сырой остаток затем растирали с диэтиловым эфиром с получением твердого вещества неправильного белого цвета (23 мг, выход 40%), которое отфильтровывали и сушили под вакуумом с получением соединения по примеру 6 в виде соли ТБА.

Соединение IV. (№Гидрокси-3-фенилпропионамид) о соединение IV Соединение IV получали, как показано на схеме 9 ниже.

Схема 9

N-(1 -Изобутоксиэтокси)-3 -фенилпропионамид.

Гидрохлорид №(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимид (ЕЭС) (151 мг) и 4-диметиламинопиридин (катализатор) добавляли к перемешиваемому раствору гидрокоричной кислоты (100 мг), защищенного гидроксиламина (\УО 2008/040934) (136 мкл) и дихлорметана (5 мл) при КТ в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч и затем выливали в воду (50 мл). Затем смесь обрабатывали дихлорметаном (2x50 мл). Объединенные органические слои сушили над сульфатом натрия и удаляли под вакуумом растворитель. Остаток очищали методом хроматографии на колонке, применяя в качестве элюента от 0 до 100% этилацетата в гептанах с получением продукта в виде бесцветного масла (58 мг).

Соединение IV. 14-Гидрокси-3-фенилпропионамид.

№(1-Изобутоксиэтокси)-3-фенилпропионамид (58 мг) растворяли в ЭСМ (2 мл) и МеОН (0,5 мл) и перемешивали при КТ в атмосфере азота. К раствору добавляли 4 М НС1 в диоксане (275 мкл) и перемешивали смесь в течение 2 ч. Затем удаляли растворитель под вакуумом, очищали остаток методом НРЬС с получением твердого продукта розового цвета (9 мг).

т/ζ 166 (М+Н)⁺. '11 NΜК (300 МГц, ОМЧО-сЕ) δ 10,37 (1Н, Ьг 8), 7,21 (5Н, т), 2,81 (2Н, I, 1=7,5 Гц), 2,61 (1Н, т), 2,58 (2Н, I, 1=7,5 Гц).

Синтез соединений по примерам 7-10.

Эти соединения получали с применением промежуточных соединений и способов, описанных ни же.

Промежуточные соединения.

Промежуточное соединение 7. (2Е)-3-(5-Формилпиридин-2-ил)-№(1-изобутоксиэтокси)акриламид

Промежуточное соединение 7 получали по способу, описанному в \УО 2008/040934. Промежуточное соединение 8. 3-(4-Формилфенил)-№(1-изобутоксиэтокси)пропанамид о

Промежуточное соединение 8 получали способом, описанным в \УО 2008/040934.

- 25 019838

Промежуточное соединение 9. Циклопентил-1-аминоциклогексанкарбоксилат

К 1-аминоциклогексанкарбоновой кислоте (4,2 г, 29 ммоль) в циклогексане (250 мл) добавляли циклопентанол (50 мл) и п-толуолсульфокислоту (5,89 г) и полученную суспензию нагревали с обратным холодильником в приборе Дина-Старка в течение 72 ч. При охлаждении до комнатной температуры полученный продукт белого цвета собирали фильтрацией, промывали циклогексаном (2x100 мл) и сушили при пониженном давлении с получением целевого соединения (4,1 г) в виде бесцветного твердого продукта.

т/ζ 213,2 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение 10. Циклопентил-2-метил-Э,Ь-лейцинат

Раствор (К,8)-α-метиллейцина (500 мг, 3,44 ммоль) в циклопентаноле (1 мл) и конц. Н₂8О₄ (0,36 мл) нагревали при 80°С в течение 28 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток распределяли между насыщенным NаНСОз (водн.) (20 мл) и дихлорметаном (20 мл). Органический слой сушили (Мд8О₄) и выпаривали с получением желаемого продукта (650 мг) в виде масла светло-коричневого цвета, который применяли без дальнейшей очистки.

т/ζ 214,3 (М+Н)⁺.

Примеры.

Пример 7. Циклопентил-1-({4-[(3-гидроксиамино)-3-оксопропил]бензил}амино)циклопентанкарбоксилат

К раствору промежуточного соединения 8 (208 мг, 0,68 ммоль) и промежуточного соединения 5 (184 мг, 0,68 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (430 мг, 2,04 ммоль) и уксусную кислоту (47 мкл). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч и затем обрывали реакцию путем добавления насыщенного ХН₄С1. Реакционную смесь обрабатывали дихлорметаном (2x50 мл) и объединенные органические слои высушивали (Мд8О₄) и концентрировали под вакуумом. Полученный остаток растворяли в 4 М НС1 в диоксане (1 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию обрывали NаНСОз и экстрагировали этилацетатом (2x150 мл). Объединенные органические слои сушили (Мд8О₄) и выпаривали. Остаток очищали методом НРЬС, получая целевое соединение (80 мг) в виде бесцветного продукта.

т/ζ 375 (М+Н)⁺. '11 \\1К (300 МГц, МеОЭ) δ 7,46 (2Н, б, 1=7,9 Гц), 7,36 (2Н, б, 1=8,1 Гц), 5,40 (1Н, т), 4,18 (2Н, в), 2,98 (2Н, 1, 1=7,2 Гц), 2,38 (4Н, т), 2,08-1,52 (14Н, т).

Пример 8. 1-({4-[(3-Гидроксиамино)-3-оксопропил]бензил}амино)циклопентанкарбоновая кислота

НО' .он

Циклопентил-1-({4-[3-гидроксиамино)-3-оксопропил]бензил}амино)циклопентанкарбоксилат (при-

пературе 45°С в течение 36 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали методом НРЬС С1Ьвои. Очищенное производное карбоновой кислоты перемешивали в смеси дихлорметан:ТРА (1 мл, 1:1 об./об.) в течение 1 ч при комнатной температуре и концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Целевое соединение выделяли в виде бесцветного твердого продукта.

Ί1 ХМК (300 МГц, МеОЭ) δ 7,47 (2Н, б, 1=7,9 Гц), 7,36 (2Н, б, 1=8,1 Гц), 4,18 (2Н, в), 3,01-2,95 (2Н, 1, 1=7,5 Гц), 2,38 (4Н, т), 1,97-1,59 (6Н, т).

Пример 9. Циклопентил-Ы-{4-[3-(гидроксиамино)-3-оксопропил]бензил}-2-метил-О,Ь-лейцинат о

- 26 019838

Это соединение получали способом, аналогичным способу по примеру 7, с применением промежуточного соединения 8 (209 мг, 0,68 ммоль) и промежуточного соединения 10 (146 мг, 0,61 ммоль), получали целевое соединение в виде бесцветного твердого вещества.

т/ζ 391,51 (М+Н)⁺. ¹Н ΝΜΚ (300 МГц, МеОЭ) δ 7,44 (2Н, б, 1=8,1 Гц), 7,35 (2Н, б, 1=8,1 Гц), 5,385,33 (1Н, т), 4,21 (1Н, б, 1=12,8 Гц), 4,06 (1Н, б, 1=12,8 Гц), 2,98 (2Н, 1, 1=7,6 Гц), 2,41 (2Н, 1, 1=7,6 Гц), 2,04-1,72 (11Н, т), 1,68 (3Н, 8), 0,99 (6Н, 1, 1=7,6 Гц).

Следующий пример проводили, как получение соединения примера 8, используя пример 9.

Пример 10. Ы-{4-[3-(Гидроксиамино)-3-оксопропил]бензил}-2-метил-О,Е-лейцин

т/ζ 323 (М+Н)⁺. ^!Н ΝΜΚ (300 МГц, МеОЭ) δ 7,44 (2Н, б, 1=8,1 Гц), 7,35 (2Н, б, 1=8,1 Гц), 4,20 (1Н, б, 1=12,4 Гц), 4,09 (1Н, б, 1=12,6 Гц), 2,97 (2Н, 1, 1=7,3 Гц), 2,41 (2Н, 1, 1=7,7 Гц), 2,01-1,87 (3Н, т), 1,76 (3Н, 8), 1,01 (6Н, 1, 1=6,3 Гц).

Пример 11. Циклопентил-1-[({6-[(1Е)-3-(гидроксиамино)-3-оксопроп-1-ен-1-ил]пиридин-3ил}метил)амино]циклогексанкарбоксилат

К раствору промежуточного соединения 7 (386 мг, 1,83 ммоль) и промежуточного соединения 9 (902 мг, 3,02 ммоль) в ТНЕ (20 мл) добавляли порошкообразные молекулярные сита 4А (100 мг) и полученную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 12 ч. После охлаждения до комнатной температуры добавляли боргидрид натрия (317 мг, 85 ммоль) и продолжали перемешивание еще 20 мин. Реакцию обрывали насыщенным ИН₄С1 (50 мл) и затем экстрагировали дихлорметаном (3x100 мл). Объединенные органические слои высушивали (Мд8О₄) и концентрировали под вакуумом и полученный остаток очищали методом колоночной хроматографии (силикагель, 5% метанола в ЭСМ). Очищенный продукт растворяли в дихлорметане (20 мл), добавляли 4 М НС1 в диоксане и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию обрывали №1НСО₃ и экстрагировали этилацетатом (2x150 мл). Объединенные органические слои сушили (Мд8О₄) и выпаривали. Остаток очищали НРЬС, получая целевое соединение (80 мг) в виде бесцветного твердого продукта.

т/ζ 388,25 (М+Н)⁺. ^!Н ХМН (300 МГц, б₆-ЭМ8О) δ 10,95 (1Н, Ьг 8), 9,43 (1Н, Ьг 8), 8,65 (1Н, б, 1=1,7 Гц), 7,92 (1Н, бб, 1=2,0 и 8,0 Гц), 7,67 (1Н, б, 1=8,0 Гц), 7,50 (1Н, б, 1=15,4 Гц), 6,98 (1Н, б, 1=15,4 Гц), 5,23 (1Н, 1 1=5,3 Гц), 4,16 (2Н, Ьг 8), 2,15-2,30 (2Н, т), 1,16-1,96 (16Н, т).

Биологическая активность.

Активность в отношении гистон-деацетилазы.

Способность соединений ингибировать активность гистон-деацетилазы определяли с применением метода флуоресцентного анализа активности коммерчески доступной НЭАС, В1ото1. Вкратце, субстрат Е1иог бе Ьу8™, лизин с эпсилон-аминоацетилированием, инкубируют с источником активности гистондеацетилазы (ядерный экстракт НеЬа) в присутствии или в отсутствие ингибитора. Деацетилирование субстрата сенсибилизирует субстрат к проявителю Е1иог бе Ьу8™, который продуцирует флуорофор. Таким образом, инкубирование субстрата с источником активности НЭЛС приводит к увеличению сигнала, который уменьшается в присутствии ингибитора НЭАС.

Результаты выражали в % от контрольной величины, измеренной в отсутствие ингибитора, с фоновым сигналом, полученным от всех образцов, следующим образом:

% активности=[(8‘-В)/(8^о-В)]х 100, где 8¹ обозначает сигнал в присутствии субстрата, фермента и ингибитора;

8^о обозначает сигнал в присутствии субстрата, фермента и наполнителя, в котором растворяется ингибитор;

В обозначает фоновый сигнал, измеренный в отсутствие фермента.

Величины 1С₅₀ определяли методом нелинейного регрессионного анализа после подставления результатов восьми величин в уравнение сигмоидального ответа на дозу с различным наклоном (% активности в зависимости от 1од концентрации соединения), применяя программу СгарБраб Рп8т.

Для скрининга использовали величины активности гистон-деацетилазы из сырого ядерного экстракта из клеток НеЬа. Препарат, приобретенный в 4С (8епейе, Ве1дшт), готовили из клеток НеЬа, собранных на фазе экспоненциального роста. Ядерный экстракт готовили по методу, описанному Ю. Όί§пат, Νι.ιο1. Ас1б. Ре8., 1983, 11, 1475-1489, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°С. Конечная концентрация буфера представляла собой 20 мМ Нере8, 100 мМ КС1, 0,2 мМ ЕЭТА, 0,5

- 27 019838 мМ ΌΤΤ, 0,2 мМ РМ8Е и 20% (об./об.) глицерина.

Определение ингибирования клеток И937 и ИИТ.

Клеточные линии раковых клеток (И937 и ИИТ), растущие в 1од-фазе, собирали и высевали с концентрацией 1000-2000 кл/лунку (конечный объем 100 мкл) в 96-луночные планшеты. Через 24 ч клетки обрабатывали испытуемым соединением. Затем планшеты снова выдерживали еще 72-96 ч перед проведением анализа жизнеспособности клеток ^М8Т-1 в соответствии с инструкциями поставщиков (Коске Аррйеб 8с1епсе).

Полученные данные выражали в % от ингибирования контрольного образца в отсутствие ингибитора % ингибирования=100-[(878°)х 100], где 8¹ обозначает сигнал в присутствии ингибитора и

8^о обозначает сигнал в присутствии ΌΜ8Ο.

Кривые зависимости ответа от дозы получали для 8 величин концентраций (конечная концентрация 10 мкМ с 3-х кратным разбавлением), используя шесть реплик.

Величины 1С₅₀ определяли методом нелинейного регрессионного анализа после подставления результатов восьми величин в уравнение сигмоидального ответа на дозу с различным наклоном (% активности в зависимости от 1од концентрации соединения), применяя программу Сгарйраб Рпкт.

Определение активности в отношении фермента киназы р38МАР.

Способность соединений ингибировать активность киназы р38МАР определяли методом анализа Ир81а1е (Эннбее иК). С конечным объемом, равным 25 мкл, киназа-α р38МАР (5-10 меж. ед.) инкубируют с 25 мМ Тик, рЫ 7,5, 0,02 мМ ЕСТА, 0,33 мг/мл миелинового основного белка, 10 мМ Мд-ацетата и [γ-³³Ρ-ΑΤΡ] (специфическая активность примерно 500 спм/пмол, концентрация требующаяся). Реакцию инициируют путем добавления смеси Мд АТР. После выдержки в течение 40 мин при комнатной температуре реакцию останавливают путем добавления 5 мкл 3%-ного раствора фосфорной кислоты. Затем 10 мкл реакционной смеси помещают на фильтр Р30 и три раза промывают в течение 5 мин в 75 мМ фосфорной кислоты и один раз в метаноле до сушки и измерения сцинтилляционных параметров.

Повторные данные получали при ряде 1/3 1од разбавлений исходного раствора в ΌΜ8Ο. Проводили девять стадий разбавления от наибольшей концентрации 10 мкМ, включали также контрольную пробу без соединения. Осуществляли стандартный радиометрический метод связывания на фильтрах с концентрацией АТР, равной К_т или близкой к ней. Измеряли величины импульсов сцинтилляции и подвергали их непараметрическому анализу с помощью программы Рпкт. На основании построенной кривой определяли концентрацию, приводящую к 50%-ному ингибированию.

Клеточная активность киназы р38МАР: ингибирование фосфорилирования МАРКАР2.

Клетки И937 или ЕиТ78 помещали в среду КРМ1 1640 и инкубировали при температуре 37°С, 5% СО₂ в течение 18 ч. 10-мМ исходные растворы соединений разбавляли средой/0,1% ЭМ8О с получением серии логарифмических и полулогарифмических разбавлений. Лунки без обработки и с анизомицином обрабатывали только 0,1% ЭМ8О. Клетки инкубировали при температуре 37°С, 5% СО₂ в течение 30 мин. Планшеты выдержали во время сбора клеток на льду и все последующие стадии проводили при температуре 4°С. Клетки гранулировали при скорости 1000 об/мин в течение 10 мин при температуре 4°С, среда отсасывалась и гранулы промывали холодным РВ8. Гранулы подвергали лизису в 120 мкл лизисного 8Ό8 буфера (62,5 мМ Тпк. рН 6,8, 2% 8Ό8, 10% глицерина, 50 мМ ОТТ с ингибиторами протеазы и ингибиторами фосфатазы, добавленными в соответствии с рекомендациями производителей). После выдержки в течение 30 мин на льду образцы обрабатывали ультразвуком в течение 5 с перед центрифугированием со скоростью, равной 13000 об/мин, при температуре 4°С в течение 10 мин для удаления остатков клеток. 10 мкл полученного геля выгружали на линию с гелями ΝΟνΕΧ 4-12% бис-Тпк МОР8. Мембраны после вестерн-передачи гелей блотировали антифосфо-МАРКАР2, антифосфо-Η8Р27 и анти-СΑРΟΗ согласно инструкциям производителей. Сигнал проявляли с применением ЯКРсвязанных антител антикролика или антимыши, ЕСЬ реагента и ЕСЬ пленки. Величины 1С₅₀ для различных соединений определяли по полученным фотографическим изображениям, используя и сдвиги полос, и интенсивность сигналов.

ЬР8-стимулирование клеток ТНР-1.

ТНР-1 клетки помещали в лунки планшета с объемом 100 мкл с плотностью 4х10⁴ клеток/лунку 96ти луночного планшета с ν-образным дном, обработанным тканевой культурой, и инкубировали при 37°С 5% СО2 в течение 16 ч. Через 2 ч после добавления ингибитора в 100 мкл культуральной тканевой среды клетки стимулировали ЬР8 (штамм Е. со11 005:В5, 81дта) с конечной концентрацией 1 мкг/мл и инкубировали при 37°С в 5% СО₂ в течение 6 ч. Уровень Т№-а определяли в надосадочных жидкостях, не содержащих клеток, методом сэндвич-ЕЬ18А (К апб Ό 8ук1етк # СТА00В).

Анализ карбоксилэстеразы НСЕ-1.

Гидролиз сложных эфиров с получением карбоновых кислот под действием кСЕ-1 может быть определен с применением следующей процедуры. В момент времени 0 100 мкл рекомбинантной 11СЕ-1 с концентрацией 6 мкг/мл в фосфатном буфере для анализа (К₂РО₄ 100 мМ, КС1 40 мМ, рН 7,4) добавляли

- 28 019838 к равному объему буфера для анализа, содержащего 5 мкМ эфирного субстрата. После тщательного перемешивания трипликаты образцов инкубировали в течение 0, 20 или 80 мин при температуре 37°С. В нужное время гидролиз останавливали путем добавления 600 мкл ацетонитрила. Для образцов, отобранных в момент времени 0, ацетонитрил добавляли до фермента. Образцы анализировали на наличие сложного эфира и его соответствующей карбоновой кислоты при комнатной температуре, используя ЬСМ8 (8с1ех ΑΡΙ 3000, насос двойного действия НР 1100, СТС РАЬ). Хроматографию проводили с применением колонки МеСЫ (75x2,1 мм) и мобильной фазы, состоящей из 5-95% ацетонитирила в воде/0,1% муравьиной кислоты. Содержание продукта гидролиза, кислоты через 80 мин выражали в нг/мл.

Определение карбоксиэстеразы в распавшихся клетках.

Любое соединение по изобретению, содержащее сложноэфирный конъюгат, может быть испытано для определения соответствия этого соединения требованию гидролиза под действием внутриклеточных эстераз следующим методом.

Приготовление клеточного экстракта.

Опухолевые клетки И937 или НСТ 116 (~10⁹) промывали 4 объемами среды Би1Ьессо8 РВ8 (~1 л) и гранулировали (525 г) в течение 10 мин при температуре 40°С. Эту процедуру повторяли дважды и полученную клеточную гранулу вновь суспендировали в 35 мл холодного гомогенизирующего буфера (Тп5та 10 мМ, ЫаС1 130 мМ, СаС1₂ 0,5 мМ, рН 7,0 при 25°С). Гомогенаты получали путем кавитации азотола (700 фунт/дюйм² в течение 50 мин при температуре 4°С). Гомогенат выдерживали на льду и дополняли коктейлем ингибиторов при конечных концентрациях

лейпептнц	1 мкМ
апротинин	0,1 мкМ
Е64	8 мкМ
пепстатин	1,5 мкМ
бестатин	162 мкМ
химостатин	33 мкМ

После осветления клеточного гомогената путем центрифугирования (525 г) в течение 10 мин полученную надосадочную жидкость использовали в качестве источника активности эстеразы и хранили до применения при температуре -80°С.

Определение расщепления эфира.

Гидролиз эфиров с получением соответствующих карбоновых кислот может быть проанализирован с применением клеточного экстракта, полученного, как описано выше. Для этой цели клеточный экстракт (~30 мкг/общий объем 0,5 мл) инкубировали при температуре 37°С в буфере, содержащем Тп5-НС1 25 мМ, 125 мМ ЫаС1, рН 7,5 при температуре 25°С. В момент времени 0 добавляли сложный эфир (субстрат) с конечной концентрацией 2,5 мМ и выдерживали образцы при температуре 37°С в течение нужного времени (обычно 0 или 80 мин). Реакцию останавливали путем добавления 3 объемов ацетонитрила. В момент времени 0 ацетонитрил добавляли до введения эфира. После центрифугирования (12000 г) в течение 5 мин образцы анализировали на содержание эфира и соответствующей карбоновой кислоты при комнатной температуре методом ЬСМ8 (8с1ех ΑΡΙ 3000, бинарный насос НР 1100, СТС РАЬ). Хроматографию проводили на колонке с МеСЫ (75x2,1 мм) с мобильной фазой 5-95% ацетонитрила в воде/0,1% муравьиной кислоты. Скорость гидролиза выражалась в пг/мл/мин.

Определение накопления в клетках.

Клетки (8х10⁴/мл) инкубировали при температуре 37°С в культуральной среде, содержащей 6 мкМ соединения, в атмосфере с 5% (об./об.) СО₂.

Реакцию обрывали через 6 ч путем центрифугирования аликвот клеточной суспензии объемом 25 мл при 300 г в течение 5 мин при температуре 4°С. Образцы надосадочных жидкостей культуральной среды объемом 0,2 мл добавляли к 4 объемам ацетонитрила (8щта-А1бпс11). После декантирования надосадочной жидкости оставшиеся гранулы клеток (2х10⁶ клеток) экстрагировали 1 мл ацетонитрила. Затем образцы анализировали на наличие эфира и его метаболита при комнатной температуре методом ЬС/М8/М§ (8с1ех АР1 3000). Хроматографию проводили на колонке с МеСЫ (75x2,1 мм) с мобильной фазой 5-95% ацетонитрила в воде/0,1% муравьиной кислоты. В момент времени 0 клеточную суспензию охлаждали и центрифугировали сразу же после добавления эфира и затем экстрагировали ацетонитрилом, как описано выше. Содержание веществ в клетках выражалось в нг/мл.

- 29 019838

Таблица 1

Соединение	Ингибирование Р38 (1С50 нм )	Ингибиров. фосфорилирования МАРКАР-2 в клетках. 1Г937 (1С5о нм)	Отношен 1Сзо в клетках к ферменту	Расщепление НСЕ-1	Расщепление клеточным лизатом из ϋ937 клеток пг/мл/мин	Накопление в клетках 13937 через 6 ч (нг/мл)
χύδ? СоединениеI (родительское)	50	300	6	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ
Пример 1	Эфир 50	Кислота 50	10	0,2	198	165	987

Табл. 1 показывает, что кислота по примеру 1 характеризуется 1С₅₀, подобной 1С₅₀ родительского соединения (соединения I): (\УО 03/076405), что свидетельствует о том, что связывание с ферментом не нарушилось при присоединении эфирного фрагмента. Дизамещенные соединения, например, описанные в примере 1, гидролизуются под действием 11СЕ-1 и, как следствие, в клетках накапливается кислота. Это накопление кислоты (пример 1) происходит значительно более активно, чем родительское соединение. Эти данные показывают преимущество в активности, которое может быть достигнуто при присоединении фрагмента эстеразы и накоплении соответствующей кислоты в клетках.

Таблица 2

Соединение	Ингибирование фосфорилирования ΜΑΙ’ΚΑΡ-2 в клетках 11937	Ингибирование фосфорилирования МАРКАР-2 в клетках НиТ 78	Отнош. 1С50в клетках нит 78	Накопление в клетках 11937 (нг/мл)	Накопление в клетках нит 78 (нг/мл)
	(1С«0 нм) (клеточная линия моноцитов)	(Ю50 нм) (клеточная линия не-моноцитов)	к 1С30 в клетках Н937
Родительское Соединение 1	300	450	1,5	ΝΑ	ΝΑ
Пример 1	10	1000	100	987	3
Пример 3	100	10 000	100	Νϋ	Νϋ

Табл. 2 показывает, что активность родительского соединения (соединение I) одинакова в клеточных линиях моноцитов и не-моноцитов, в то время как соединения по примерам 1 и 3 в 100 раз более активны в клеточной линии моноцитов. Соединение по примеру 1 только накапливается в клеточной линии моноцитов, что свидетельствует о том, что клеточная селективность достигается за счет присоединения фрагмента эстеразы, который отщепляется только в клеточной линии моноцитов.

Таблица 3

Соединение	Ингибирование фосфорилирования МАРКАР-2 в клетках и937(1С5о, нм) (клеточная линия моноцитов)	Ингибирование фосфорилирования МАРКАР-2 в клетках НиТ 78 (ГС», нм) (клеточная линия немоноцитов)	Отношение 1С50, в клетках НиТ 78 к ΙΟ» в клетках 1)937
.Ж? Родительское СоединениеП	10	10	1
Соединение Ш	1	1	1
Пример 5	5	100	20

Табл. 3 показывает, что С-связанные диалкильные соединения (пример 5) являются селективными по отношению к макрофагам, в то время как родительское соединение (соединение II, \¥О 03/076405 и соединение III, \¥О 2007/129036), не содержащие алкильной группы у α-углерода производного аминокислоты, не являются селективными. Это показывает, что селективность по отношению к макрофагам

- 30 019838 может быть достигнута путем введения второго заместителя у α-углерода эфирного фрагмента аминокислоты.

Таблица 4

Соединение	Ингибирование ноле (1Сяь нм)	Ингибирование пролиферации в клетках 17937	Отношение 1С$о в клетках к 1С50 фермента	Расщепление под действием НСЕ-1
Си-уСн Родительское Соединение IV	2600	13% при ЮмкМ	>3,85	ΝΑ
Пример 7	Эфир 4200	Кислота 6120	180	0,043	>12600 пг/мл/мин
Пример 9	4900	6242	190	0,04	Νϋ 1

Табл. 4 показывает, что кислоты по примерам 7 и 9 характеризуются похожими величинами 1С₅₀ при проведении анализа ферментов для родительского соединения (соединение IV), что свидетельствует, что связывание с ферментом не было нарушено при присоединении фрагмента эстеразы. Дизамещенные соединения, например соединение по примеру 7, гидролизуются под действием ЕСЕ-1 и, как следствие этого, в клетках моноцитов накапливается кислота. Это накопление кислоты приводит к тому, что соединения по примерам 7 и 9 значительно более активны, чем родительское соединение по данным клеточного анализа. Эти данные показывают, что повышение активности может быть достигнуто при присоединении фрагмента эстеразы.

Таблица 5

Соединение	Ингибирование НРАС (1С50> нм)	Ингибирование пролиферации в клетках 0937 (1С?0, нм)	Ингибирование пролиферации в клетках нит 78 (1С50, нм)	Отношение 1С«> в клетках нит 78 и клетках 11937
Родительское Соединение IV	2600	13% при 10 мкМ	10% при 10 мкМ	~ 1
Пример 7	Эфир 4200	Кислота 6120	180	6200	34
Пример 9	4900	6242	190	5500	30

Табл. 5 показывает, что родительское соединение (соединение ГУ) имеет похожие величины активности в клеточных линиях моноцитов (И937) и не-моноцитов (НИТ 78), в то время как соединения по примерам 7 и 9 проявляют активность в клеточной линии моноцитов, в 30 раз превышающую активность в клеточной линии не-моноцитов. Это свидетельствует о том, что второй заместитель в α-положении фрагмента аминокислоты обеспечивает селективность соединений в отношении макрофагов.

Claims (14)

1. Ковалентный конъюгат α,α-дизамещенного глицинового эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, где эфирная группа конъюгата селективно гидролизуется клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу ЕСЕ-1 по отношению к клеткам, содержащим ЕСЕ-2 или ЕСЕ-3, но не ЕСЕ-1;

α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевым ферментом или рецептором;

указанный α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его αаминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом, где положение конъюгирования является удаленным, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках И937; (Ь) анализа ингибирования фосфорилирования МАРКАР2, проводимого на раковых клетках И937; и (с) анализа стимулирования ЬР8, проводимого на клетках ТНР-1.

- 31 019838

2. Ковалентный конъюгат α,α-дизамещенного глицинового эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, где эфирная группа селективно гидролизуется клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу ИСЕ-1 по отношению к клеткам, содержащим ИСЕ-2 или ИСЕ-3, но не ИСЕ-1;

α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором таким образом, что характер связывания конъюгированного модулятора и указанной соответствующей кислоты с целевым ферментом или рецептором является таким же, как и в случае неконъюгированного модулятора;

указанный α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его αаминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом, где характер связывания является тем же самым, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках υ937; (Ь) анализа ингибирования фосфорилирования МАРКАР2, проводимого на раковых клетках υ937; и (с) анализа стимулирования ЬР8, проводимого на клетках ТНР-1.

3. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что α-заместители в α,αдизамещенном глициновом эфире, конъюгированном с модулятором, независимо выбраны из фенила и групп формулы -СК_аК_ЬКс, в которых каждый из К_а, К_Ь и К_с независимо обозначает водород, (С1-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂С₆)алкинил, фенил(С1-С₆)алкил, (С₃-С₈)циклоалкил; или

Кс обозначает водород и К_а и К_Ь независимо обозначают фенил или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, такой как пиридил; или

Кс обозначает водород, (С1-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂-С₆)алкинил, фенил(С1-С₆)алкил или (С₃С₈)циклоалкил и К_а и К_Ь вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8членный циклоалкил или 5-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О; или

Ка, КЬ и Кс вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют адамантил; или

К_а и К_Ь, каждый независимо, обозначают (С1-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂-С₆)алкинил, фенил(С1С6)алкил или группу, определение которой дано ниже для Кс, отличающуюся от водорода, или Ка и КЬ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8-членный циклоалкил или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический или неароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, и К_с обозначает водород, -ОН, -8Н, галоген, -ΟΝ, -СО₂Н, (С1-С₄)перфторалкил, -СН₂ОН, -О(С1-С₆)алкил, -О(С₂С₆)алкенил, -8(С1-С₆)алкил, -8О(С1-С₆)алкил, -8О₂(С1-С₆)алкил, -8(С₂-С₆)алкенил, -8О(С₂-С₆)алкенил, -8О₂(С₂-С₆)алкенил или группу -φ-Ψ, где 9 обозначает связь или -О-, -8-, -8О- или -8О₂- и Ψ обозначает фенил, фенил(С1-С₆)алкил, (С₃-С₈)циклоалкил, (С₃-С₈)циклоалкилалкил, (С₄-С₈)циклоалкенил, (С₄С₈)циклоалкенилалкил, моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, или гетероарил(С1-С6)алкил, в котором гетероарильная группа представляет собой моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, причем группа Ψ может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из гидроксила, галогена, -СЦ -СОNН₂, -СОNН(С1-С₆)алкила, -СОNН((С1-С₆)алкил)₂, -СНО, -СН₂ОН, (С1-С₄)перфторалкила, -О(С1-С₆)алкила, -8(С1-С₆)алкила, -8О(С1-С₆)алкила, -8О₂(С1-С₆)алкила, -N92, -N4^ -NН(С1-С₆)алкила, -^(С1-С₆)алкил)₂, -NНСО(С1-С₆)алкила, (С1-С₆)алкила, (С₂-С₆)алкенила, (С₂-С₆)алкинила, (С₃-С₈)циклоалкила, (С₄С8)циклоалкенила, фенила или бензила.

4. Конъюгат по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что α-заместители α,α-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, вместе с самим α-атомом углерода образуют 3-6членное насыщенное циклоалкильное или гетероциклическое кольцо или по меньшей мере один из указанных α-заместителей является С1-С₆-алкильным заместителем.

5. Конъюгат по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что один из α-заместителей α,αдизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является С₁-С₆-алкильным заместителем, а другой выбран из группы, состоящей из метила, этила, н- и изопропила, н-, втор- и третбутила, фенила, бензила, тиенила, циклогексила и циклогексилметила.

6. Конъюгат по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что один из α-заместителей α,αдизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является метилом, а другой является метилом, этилом или н- или изопропилом или указанные α-заместители вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклопропильное, циклобутильное, циклопентильное или циклогексильное кольцо.

7. Способ повышения или пролонгирования внутриклеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, включающий струк

- 32 019838 турную модификацию модулятора путем ковалентного присоединения к нему α,α-дизамещенного глицинового эфира в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевым ферментом или рецептором, при этом эфирная группа конъюгата способна к селективному гидролизу клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу 110Έ-1 по отношению к клеткам, содержащим 110Έ-2 или йСЕ-3, но не Ιιί.Έ-1; и указанный α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его α-аминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом; где положение конъюгирования является удаленным, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках И937; (Ь) анализа ингибирования фосфорилирования МАРКАР2, проводимого на раковых клетках И937; и (с) анализа стимулирования ЬР8, проводимого на клетках ТНР-1.

8. Способ повышения или пролонгирования внутриклеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, включающий структурную модификацию модулятора путем ковалентного присоединения к нему α,α-дизамещенного глицинового эфира таким образом, что характер связывания конъюгированного модулятора и соответствующей кислоты с целевым ферментом или рецептором является таким же, как и в случае неконъюгированного модулятора, при этом эфирная группа конъюгата способна к селективному гидролизу клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу Ιιί.Έ-1 по отношению к клеткам, содержащим 110Έ-2 или йСЕ-3, но не йСЕ-1; и указанный α,α-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его α-аминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом; где характер связывания является тем же самым, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках И937; (Ь) анализа ингибирования фосфорилирования МАРКАР2, проводимого на раковых клетках И937; и (с) анализа стимулирования ЬР8, проводимого на клетках ТНР-1.

9. Способ по любому из пп.7, 8, отличающийся тем, что α-заместители в α,α-дизамещенном глициновом эфире, конъюгированном с модулятором, независимо выбраны из фенила и групп формулы -СК_аК_ЬК_с, в которых каждый из К_а, К_Ь или К_с независимо обозначает водород, (С1-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂С₆)алкинил, фенил(С1-С₆)алкил, (С₃-С₈)циклоалкил; или

Кс обозначает водород и Ка и КЬ независимо обозначают фенил или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, такой как пиридил; или

К_с обозначает водород, (С1-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂-С₆)алкинил, фенил(С1-С₆)алкил или (С₃С₈)циклоалкил и К_а и К_Ь вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8членный циклоалкил или 5-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О; или

К_а, К_Ь и К_с вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют адамантил; или

К_а и К_Ь, каждый независимо, обозначают (С1-С₆)алкил, (С₂-С₆)алкенил, (С₂-С₆)алкинил, фенил(С1С6)алкил или группу, определение которой дано ниже для Кс, отличающуюся от водорода, или Ка и КЬ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8-членное циклоалкильное кольцо или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический или неароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, и К, обозначает водород, -ОН, -8Н, галоген, -СИ -СО₂Н, (С1-С₄)перфторалкил, -СН₂ОН, -О(С1-С₆)алкил, -О(С₂-С₆)алкенил, -8(С1-С₆)алкил, -8О(С1-С₆)алкил, -8О₂(С1-С₆)алкил, -8(С₂-С₆)алкенил, -8О(С₂С₆)алкенил, -8О₂(С₂-С₆)алкенил или группу -ά-^, где 9 обозначает связь или -О-, -8-, -8О- или -8О₂- и обозначает фенил, фенил(С1-С₆)алкил, (С₃-С₈)циклоалкил, (С₃-С₈)циклоалкилалкил, (С₄С₈)циклоалкенил, (С₄-С₈)циклоалкенилалкил, моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, или гетероарил(С1-С₆)алкильную группу, в которой гетероарильная группа представляет собой моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из 8, N и О, причем группа может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из гидроксила, галогена, -СК, -СОКН₂, -СОКН(С1-С₆)алкила, -СОКН((С1-С₆)алкил)₂, -СнО, -СН₂ОН, (С1С₄)перфторалкила, -О(С1-С₆)алкила, -8(С1-С₆)алкила, -8О(С1-С₆)алкила, -8О₂(С1-С₆)алкила, -N92, -ЯН^ -NН(С1-С₆)алкила, -Ы((С1-С₆)алкил)₂, -ЫНСО(С1-С₆)алкила, (С1-С₆)алкила, (С₂-С₆)алкенила, (С₂С6)алкинила, (С3-С8)циклоалкила, (С4-С8)циклоалкенила, фенила или бензила.

10. Способ по любому из пп.7, 8, отличающийся тем, что α-заместители α,α-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, вместе с самим α-атомом углерода образуют 3-6

- 33 019838 членное насыщенное циклоалкильное или гетероциклическое кольцо или по меньшей мере один из указанных α-заместителей является С1-С₆-алкильным заместителем.

11. Способ по любому из пп.7, 8, отличающийся тем, что один из α-заместителей α,αдизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является С1-С6-алкильным заместителем, а другой выбран из группы, состоящей из метила, этила, н- и изопропила, н-, втор- и третбутила, фенила, бензила, тиенила, циклогексила и циклогексилметила.

12. Способ по любому из пп.7, 8, отличающийся тем, что один из α-заместителей α,αдизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является метилом, а другой является метилом, этилом или н- или изопропилом или указанные α-заместители вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклопропильное, циклобутильное, циклопентильное или циклогексильное кольцо.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из пп.1-6 и один или более фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов.

14. Способ идентификации ковалентного конъюгата α,α-дизамещенного глицинового эфира данного модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, причем конъюгат обладает повышенной или пролонгированной клеточной активностью по сравнению с данным модулятором, включающий:

(ί) идентификацию положения или положений в молекуле данного модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора или множества данных модуляторов активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора с тем же самым характером связывания с целевым ферментом или рецептором, при этом положение или положения являются удаленными от поверхности связывания между модуляторами и целевым ферментом или рецептором;

(ίί) ковалентную модификацию модулятора (модуляторов) путем присоединения радикала α,αдизамещенного глицинового эфира или ряда различных радикалов α,α-дизамещенного глицинового эфира в одном или более положениях, идентифицированных на стадии (1);

(ίίί) испытание модулятора (модуляторов), конъюгированного с α-аминокислотой, полученного на стадии (ίί), с целью определения его активности в отношении целевого фермента или рецептора;

(ίν) на основании данных, полученных на стадии (ίίί), выбор одного или нескольких испытанных α,α-дизамещенных глициновых эфиров, конъюгированных с данным модулятором (модуляторами), которые вызывают модуляцию активности фермента или рецептора в клетках, превращаются в клетках в соответствующие карбоновые кислоты, которые накапливаются в клетках, содержащих внутриклеточную карбоксилэстеразу ЕСЕ-1, и которые обладают повышенной или пролонгированной клеточной активностью.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2