KR20100126762A - 세포내 효소 및 수용체 조절 - Google Patents

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KR20100126762A
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알란 호언스비 데이비선
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알리스테어 데이비드 그라함 도날드
스테펜 존 데이비스
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Abstract

α,α-이치환 글리신 에스테르와 표적세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 조절체의 공유결합 접합체, 여기서 접합체의 에스테르기는 하나 또는 그 이상의 세포 내 카르복실에스테라아제 효소에 의하여 해당 산으로 가수분해할 수 있고, α,α-이치환 글리신 에스테르는 억제제와 세포로 통과하는 표적 효소 또는 수용체 사이의 결합 계면에서 떨어져 있는 위치에서 조절체에 접합 되고 활성 산 가수분해 생성물은 세포 내에 축적한다.

Description

효소 및 수용체 조절{ENZYME AND RECEPTOR MODULATION}
본 발명은 α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프를 조절체에 공유결합으로 접합하여 세포내 효소 또는 수용체의 활성을 조절하는 화합물의 활성을 증가 또는 연장시키는 일반 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프가 공유 결합으로 접합되는 조절체와, 비-접합된 모 조절체에 비하여 우수한 성질을 갖는 이와 같은 접합체의 식별방법에 관한 것이다. 더우기, 본 발명은 단핵세포-대식세포 연결 세포 내에서 아미노산 접합체를 선택적으로 축적하게 하는 α,α-이치환 글리신 에스테를 모티프를 함유하는 조절체의 용도에 관한 것이다.
여러 가지 세포 내 효소와 수용체는 그들의 활성 부위에 결합하여 그들의 활성을 조절하는 약학적으로 유용한 약제를 그 표적으로 한다. 그 예들은 하기 표1에 표시했다. 표적효소와 수용체에 도달하기 위하여, 조절체 화합물은 당연히 혈장/세포외 유체에서 세포막을 교차해야한다. 일반적으로, 전하 중성 조절체는 하전된 종보다 더 쉽게 세포막을 교차한다. 동적 평형은 조절체가 혈장과 세포 내부 사이에서 평형을 이루므로서 이루어진다. 평형의 결과에 따라, 세포 내 효소와 수용체의 많은 조절체의 용도와 세포 내 체류시간은 특히 조절체가 혈장에서 빠르게 제거되었을 때, 통상 매우 낮다. 그러므로 조절체의 효능은 표적 효소 또는 수용체에 대한 그들의 높은 결합 친화성에 불구하고 불량하다.
국제특허출원 WO 2006/117567에는 하나 또는 그 이상의 세포 내 카르복실에스테라아제 hCE-1, hCE-2와 hCE-3에 의하여 가수분해되는 α-아미노산 에스테르 모티프를 접합시키므로서 세포 내 효소 또는 수용체의 정해진 조절체의 세포 내 농도를 증가시키는 방법이 기술되어 있다. 이것은 세포 내에서 조절체의 체류를 연장시켜 효능의 증가를 가져오고, 개량된 약 동력학적 및 약 역학적 성질을 유도한다. 더 많은 일정 조사량과 투약 회수 감소를 성취할 수 있다. α-아미노산 에스테를 모티프를 조절체에 접합하여 약제를 이의 치료적 작용, 전신 노출 감소와 이후 부작용에 책임질 수 있는 특이한 표적 세포에 목적으로 사용할 때 그 이상의 이익을 얻는다.
국제특허출원 WO 2006/117567에 기술되어 있는 α-아미노산 에스테르 접합체는 모두 α-탄소 상에서 일치환된다. 이 공보에서는 α,α-이치환 글리신 에스테르 접합체가 세포 내 카르복실에스테라아제에 의하여 가수분해될 수 있는 것을 예상하지 못하였다. 실제 α,α-이치환 글리신 에스테르를 가수분해하는 세포 내 카르복실에스테라아제, 주로 hCE-1, hCE-2와 hCE-3의 능력은 종전에는 연구되지 않았음을 나타낸다.
이 발명은 α,α-이치환 글리신 에스테르의 접합체가 세포 내 카르복실에스테라아제에 의하여 가수분해될 수 있고, 따라서 WO 2006/117567에 기술된 방법과 장점 또한 이러한 접합체로 얻을 수 있음을 새롭게 발견한 것에 기초를 둔다. 이러한 장점에는 산 가수분해 생성물의 세포 내 축적을 포함하고, 몇몇 경우, 특별한 형의 세포에서 선택적 축적을 포함한다. WO 2006/117567의 경우와 같이, 이 발명은 친유성(낮은 극성 또는 전하 중성) 분자가 세포막을 통과하고 비교적 쉽게 세포에 들어가고, 친수성(더 높은 극성, 하전) 분자는 통과하지 못하는 사실의 장점을 갖는다. 그러므로, 친유성 모티프가 정해진 조절체에 결합 되면, 조절체가 세포에 들어가게 하고, 모티프가 하나의 더 높은 극성으로 세포에서 변환되면, 부착된 더 높은 극성 모티프를 갖는 조절체가 세포 내에 축적되는 것으로 예상된다. 이러한 모티프의 제공은 표적 효소 또는 수용체와의 이들의 결합 형태를 변경하지 않는 방법으로 조절체에 부착하고, 그러므로 부착된 더 높은 극성 모티프를 갖는 조절체의 축적이 활성의 연장 및/또는 증가를 가져오는 것으로 예상된다.
WO 2006/117567의 경우에서와 같이, 이 발명은 정해진 조절체에 결합 α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프를 모산으로 가수분해하는데 사용되는 카르복실에스테라아제 효소의 용도를 구성한다. 그러므로, 조절체는 α,α-이치환 글리신 에스테르와의 공유결합 접합체로서 투여될 수 있고, 이러한 형태로 이는 하나 또는 그 이상의 세포 내 카르복실에스테라아제에 의하여 효과적으로 가수분해되는 세포에 쉽게 들어가고, 생성된 α,α-이치환 글리신 조절체 접합체는 세포 내에 축적되고, 전체 효능 및/또는 활성체류시간은 증가한다. 또한, α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프의 수정 또는 접합 되는 방법에 의하여, 조절체는 단핵세포와 대식세포의 표적이 될 수 있다. 여기서, "단핵세포" 또는 "단핵세포들"이 명시되지 않으면, 용어 대식세포 또는 대식세포들을 사용하여 대식세포들(대식세포와 연관되는 종양 포함)와/또는 단핵세포들을 나타낸다.
이에, 광범위한 일 관점에서, 본 발명은 α,α-이치환 글리신 에스테르와 표적세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 조절체의 공유결합 접합체를 제공하고, 여기서 접합체의 에스테르기는 하나 또는 그 이상의 세포 내 카르복실에스테라아제 효소에 의하여 해당 산으로 가수분해할 수 있고; α,α-이치환 글리신 에스테르는 조절체와 표적 효소 또는 수용체 사이의 결합 계면에서 떨어진 위치에서 조절체에 공유결합되고, 와/또는 표적 효소 또는 수용체에 접합된 조절체와 이들 해당 산의 결합 형태는 비 접합 조절체와 동일하다.
다른 관점에서, 본 발명은 조절체와 표적 효소 또는 수용체 사이의 결합 계면에서 떨어진 위치에서 α,α-이치환 글리신 에스테르의 공유결합에 의한 조절체의 구조적 수정, 와/또는 표적 효소 또는 수용체에 접합된 조절체와 상기 해당 산의 결합형태가 비접합된 조절체와 동일하게 되도록 하나 또는 그 이상의 세포 내 카르복실에스테라아제 효소에 의하여 해당 산으로 가수분해할 수 있는 접합체의 에스테르기로 이루어지는 표적 세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 조절체의 세포 내 효능 및/또는 체류 시간을 증가 또는 연장시키는 방법을 제공한다. 표적효소 또는 수용체에 조절체의 결합형태가 유지되도록 조절체에 α,α-이치환 글리신 에스테르 부분을 공유결합으로 부착시켜서, 두 에스테르 접합체와 해당 산의 α,α-이치환 글리신 접합체가 비 접합된 모 조절체의 조절체 활성을 보유한다. 특정 효소 억제 효능 또는 에스테르와 산 접합체의 수용체 작용물질 또는 길항물질 효능은 산 접합체로 에스테르 접합체의 세포 내 가수분해가 세포 내에서 후자의 축적을 가져오기 때문에, 실질적으로 비 접합된 조절체의 해당하는 효능만큼 높을 필요는 없으며, 세포 내에서 생성된 산 접합체의 농도는 비 접합된 조절체로 성취할 수 있는 것보다 더 높아야하므로 후자에 비하여 전자의 어떠한 본질적으로 낮은 효능을 보상한다. 그러므로, 본 발명의 접합전략은 종래 "프로-드러그" 접근 방법과 다름을 알 수 있다. 종래 "프로드러그" 접근 방법에서는 원 조절체를 방출시키기 위하여 생체 내에서 처리되는 유도체로 변환하여 모 조절체를 수정하는 것이고, 이는 최종 활성에 원인이 있는 모 조절체를 방출하는 것이다.
이 전략에서, 원 조절체를 수정하므로서 최종의 활성은 조절체의 α,α-이치환 글리신 접합체로 인한 세포 내 활성의 조합된 결과와, 조절체의 α,α-이치환 글리신 접합체의 축적을 가져온다. 활성 종은 접합체이나, 비 접합된 원 조절체는 아니다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 세포 내 효소 또는 수용체의 조절체 수정에 관한 것이다. 본 발명의 원리가 조절체의 화학적 동일성 또는 표적 효소 또는 수용체의 동일성에 의하여 한정되지 않는 일반적으로 적용이 되더라도, 이는 효과가 표적 효소 또는 수용체에 공유 결합으로 인한 것과 반대되는 표적 효소 또는 수용체에 역결합에 의하여 이의 효과를 나타내는 것이 가장 바람직하다.
실제 사용에 있어, 표적 효소 또는 수용체와 모 조절체의 세포 내 결합 활성을 보유하기 위하여 카르복실에스테라아제-가수분해 접합체가 요구되기 때문에, 에스테르 모티프의 결합에는 이러한 요구를 참작해야하며, 이는 표적에 해당 카르복실에스테라아제 가수분해 생성물(즉, 해당산)의 결합 형태가 본질적으로 비 접합된 조절체와 동일하도록 카르복실에스테라아제-가수분해 α,α-이치환 글리신 모티프가 조절체에 결합 되면 충족될 수 있다. 일반적으로 이것은 조절체와 표적 효소 또는 수용체 사이의 결합 계면에서 떨어진 위치에서 조절체에 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프의 공유결합으로 성취된다. 이 방법에서, 모티프는 결합 형태로 잠재적으로 간섭받는 것보다 오히려 용매로 확장시켜서 조정하는 것이다.
더불어 α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프는 전자가 세포 내에서 후자에 의하여 가수분해되면 분명히 카르복실에스테라아제의 기질이어야 한다. 세포 내 카르복실에스테라아제의 능력은 α,α-이치환 글리신 에스테르 기질의 매우 엄격한 구조적 요구에 따르지 않음을 나타낸다. 그러므로, 조절체에 α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프의 공유결합 접합의 최선의 형태는 가수분해일 것이다. 통상적으로 연성 링커 쇄에 의한 결합이 이를 성취하는 방법일 것이다.
약제의 어떠한 화학적 변이는 이의 결합구조를 예민하게 변경시킬 수 있고, α,α-이치환 글리신 에스테르 카르복실에스테라아제 모티프를 연결하기 위한 화학적 전략은 표적으로 하는 부가적 결합 상호작용을 도입하거나, 또는 하나 또는 그 이상의 이와 같은 상호작용을 위하여 치환할 수 있음을 알 수 있다. 그러므로 표적에 가수분해된 접합체의 결합형태가 비 접합된 조절체와 동일한 요구조건은 결합형태의 현저한 동요가 없는 것, 다시 말해서, 접합 형태가 비 접합된 조절체와 실질적으로 동일한 것이 요구되는 것으로 이해되어야한다. 요구가 있을 때, 모 조절체의 주 결합 특징이 유지되어야하고, 수정 및 비 수정 조절체는 결합 특징의 통상적 전체 구성을 가져야한다. "동일결합형태"와 "원격결합"이란 관점은 상술한 바와 같이 "동일결합형태" 요구 조건을 성취하는 통상적 방법이 억제제와 표적 효소 또는 수용체 사이의 결합 계면에서 떨어져 있는 조절체 분자의 위치에서 카르복실에스테라아제를 결합시키는데 있기 때문에 유사하다. 그러나, 이들 요구조건은 접합체 와/또는 이들의 해당 산이 생체 외 또는 생체 내 조절 효능에 있어 모 조절체와 동일해야하는 것을 의미하지는 않는다. 그러나, 일반적으로, 에스테라아제-가수분해 카르복실산은 그 분석에 있어 10분의 1 이상의 모 조절체의 효능으로 생체 외 효소-또는 수용체-결합 분석에서 효능을 갖고, 에스테르가 동일한 분석으로 최소한 모 조절체 만큼 높은 세포 활성 분석에서 효능을 갖는 것이 바람직하다. 구조-활성 상호관계를 나타내는 종래의 의약 화학방법이 전술한 "동일결합형태"와 "원격결합"요구조건을 이루는 결합 전술을 완전하게 식별할 수 있더라도, NMR와 X-선 결정학과 같은 현대 기술은 알려져 있거나, 측정가능한 효소 또는 수용체의 공지된 조절체의 결합 형태에 있어, 매우 보편적인 것으로 진보되어 있다. 이와 같은 정보는 공공 분야에서 매우 중요한 위치에 있고, 또는 구조적으로 유사한 조절체의 알려진 결합 형태나, 표적 효소 또는 수용체의 활성 부위의 알려진 구조를 기초로 하여 리간드 도킹과 상동 모형화와 같은 모형화 방법을 기초로 하는 컴퓨터를 사용하여 모형화할 수 있다. 이와 같은 기술에 의하여 얻은 조절체의 결합 형태의 지식으로, 억제제와 표적 효소 또는 수용체 사이의 결합 계면에서 떨어진 조절체상의 점에서 통상적으로(상술한 바와 같이) 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프의 결합에 접합한 위치가 식별될 수 있다. 접합된 알파 아미노산의 에스테르기를 해당 산으로 가수분해 할 수 있는 세포 내 카르복실에스테라아제 효소는 인체 카르복실에스테라아지("hCE")효소 동형 hCE-1(CES-1으로도 알려져 있음), hCE-2(CES-2로 알려져 있음)와 hCE-3(Drug Disc. 금일 2005 10, 313-325)로 세 가지가 알려져 있다. 이들이 주 효소로 생각되지만, 비페닐하이드로라아제(BPH)와 같은 다른 카르복실에스테라아제도 접합체를 가수분해하는데 역할을 한다.
하술한 파괴된 세포분석은 정해진 조절체의 접합체와 α,α-이치환 글리신 에스테르를 요구한 바와 같이 가수분해하는 것을 식별하는 간단한 방법이다. 이들 효소는 재조합법을 사용하여 쉽게 발현할 수 있고, 재조합 효소를 사용하여 가수분해가 일어나는 것을 측정 또는 식별할 수 있다.
본 발명의 특징은 세포 내에서 카르복실에스테라아제가 가수분해될 때 원하는 접합체가 공유결합으로 연결된 α,α-이치환 글리신 산 모티드를 보유하는 것으로, 이는 세포에서 가수분해된 접합체의 제거를 방지하고 감소시키는 모티프의 극성 카르복실기가 있으므로서, 세포 내에 이의 축적을 제공하기 때문이다. 실제 수정된 조절체의 세포 효능은 산의 축적과 이의 표적의 활성 조절(또한 비 가수분해된 에스테르가 비 가수분해되어 남는 동안 표적 상에 그의 활성을 미치게 하더라도)로 인하여 우수하게 된다. 일반적으로 세포가 여러 가지 형의 펩티다아제 효소를 함유하기 때문에 접합체, 또는 특히 가수분해된 접합체(해당 산)가 이러한 펩티다아제의 기질이 아닌 것이 바람직하다. 특히 α,α-이치환 글리신 에스테르기가 접합체에서 디펩티드 모티프의 C-말단 원소가 아닌 것이 가장 바람직하다. 그러나, 공유결합 형태로 인한 제한과는 별도로, α,α-이치환 글리신 에스테르기는 이의 아미노기를 통하여 또는 이의 α-치환기 중 하나를 통하여 공유 결합으로 부착된다. 몇몇 경우에서는, 조절체는 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프를 위해 편리한 결합 점을 갖게 되고, 다른 경우에서는 합성 전략이 이의 결합을 위해 연구되어야 한다. 카르복실에스테라아제 hCE-2 와 또는 hCE-3만을 발현하는 세포와 이들 효소의 재조합 형태는 α,α-이치환 글리신 에스테르의 아미노 질소가 비 치환 아니면 카르보닐기에 직접 결합할 때(즉, 아미노기가 아미드 모티프의 부분을 형성할 때)α,α-이치환 글리신 에스테르만을 그들의 생성 산으로 가수 분해하는 반면에, hCE-1(즉 대식세포), 또는 재조합 hCE-1을 함유하는 세포가 질소 상에서 광범위한 기를 갖는 α,α-이치환 글리신 에스테르를 가수분해할 수 있음을 알았다. 이러한 hCE-2와 hCE-3의 선택성 요구는 조절체가 어떠한 세포형에서만 효소 또는 수용체를 표적으로 해야하는 것이 요구되는 이점을 얻을 수 있다. 이들 세 가지 카르복실에스테라아제 효소의 상대량은 세포형에 따라 변한다(참조 WO 2006/117567의 도 1과 http:/symatlas.gnf.org/SymAtlas의 데이터베이스(이 데이터베이스에서 hCE3/CES 3는 기호 FLJ21736에 의한 것임을 주의)). 조절체가 hCE-1인 세포형에서만 작용하려하면, 아미노기가 카르보닐기에 직접 결합 되지 않는 방법으로의 α,α-이치환 글리신 에스테르 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프의 결합은 유효 농도의 hCE-1을 갖는 세포에서 바람직하게 축적하는 가수분해된 조절체 접합체를 가져온다. 다른 방법으로 서술해보면, hCE-1 발현 세포에서 조절체 접합체로부터 유도된 산의 특수한 축적은 아미노산 에스테르의 질소 원자가 카르보닐에 직접 결합 되지 않거나, 또는 비 치환되어 남는 방법으로 아미노산 에스테르 모티프를 조절체에 결합시키므로서 이룰 수 있다. 대식세포는 시토킨 특히 TNFα와 IL-1의 방출을 통하여 염증성 질병에서 주요 역할을 하는 것으로 알려져 있다(van Roon 등 Arthritis와 Rheumatism, 2003, 1229-1238). 류마티스성 관절염에서 이들은 관절 염증과 관절 파손에 주요한 기여자이다(Conell in Eng J. Med. 2004, 350, 2591-2602). 또한 대식세포는 종양 성장과 발육에도 관계된다(Naldini and Carraro in Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2005, 3-8). 그러므로 대식세포를 선택적으로 표적으로 하는 제제는 암, 염증과 자가면역 질병의 치료에 유효하다. 특수한 세포형을 표적으로 하는 것은 부작용 감소를 유도하는 것으로 예상된다. 본 발명은 조절체를 대식 세포에 표적으로 하는 방법을 가능하게 하고, 이는 α,α-이치환 글리신 에스테르 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프가 조절체에 결합 되는 방법이 특수한 카르복실에스테라아제에 의하여 가수분해되는지 여부와, 그러므로 생성된 산이 다른 세포형에 축적되는지 여부를 측정하는 상기 관찰에 기초를 둔다.
특히, WO 2006/117567에 기술되어 있는 바와 같이, 대식세포가 인체 카르복실에스테라아제 hCE-1을 함유하는 반면에 다른 세포형에서는 함유하지 않음을 알 수 있다. 본 발명의 접합체에서, 에스테르 모티프의 질소가 치환되지만 카르보닐기 부분에 직접 결합 되지 않을 때 에스테르는 hCE-1에 의하여만 가수분해되므로, 에스테라아제-가수분해 조절체 접합체는 대식세포에서만 축적될 것이다.
더우기, 본 발명의 α,α-이치환 글리신 접합체는 일반적으로 카르복실 에스테라아제 HCE-2와 HCE-3만을 함유하는 세포에서보다 카르복실에스테라아제 HCE-1(즉 대식세포)을 함유하는 세포에서 더 우수하다.
또한, α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프가 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기 중 하나를 통하여 조절체에 결합 되는 본 발명의 접합체는 카르복실에스테라아제 HCE-2와 HCE-3만을 함유하는 세포에서보다 카르복실에스테라아제 HCE-1(즉 대식세포)를 함유하는 세포에 더 우수함을 알 수 있다. 그러므로 활성 가수분해 산 접합체는 이러한(일반적으로) C-결합 에스테르 접합체의 경우에 비-선택적으로 축적한다. α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프가 α,α-이치환 글리신 에스테르의 질소 원자를 통하여 조절체에 결합 되는 본 발명의 접합체는 일반적으로 HCE-1, 2 또는 -3 중 어느 것을 함유하는 세포에 의하여 가수분해된다. 그러므로 활성가수분해 접합체는 이러한 N-결합 에스테르 접합체의 경우에 비-선택적으로 축적한다.
용 어
여기서 사용된 "α,α-이치환 글리신" 또는 "α,α-이치환 글리신 산"란 용어는 식 H2N-C(R2R3)-COOH를 뜻하고, 이 식에서 R2와 R3는 α-치환기(이는 물론 수소는 아니다)를 뜻하고, "α,α-이치환 글리신 에스테르"는 카르복실산기가 에스테르화되는 화합물이다. "에스테르" 또는 "에스테르화 카르복실기"란 용어는 R9O(C=O)- 기를 뜻하며, 여기서 R9는 알코올 R9OH에서 통상적으로 유도되는 에스테르의 특징을 갖는 기이다.
여기서 사용된 "(Ca-Cb)알킬" (여기서 a와 b는 정수)이란 용어는 a 내지 b개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 뜻한다. 따라서 a가 1이고 b가 6인 경우의 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸과 n-헥실이 있다.
여기서 사용된 "2가(Ca-Cb)알킬" (여기서 a와 b는 정수)이란 용어는 a 내지 b개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 뜻한다. 따라서 a가 1이고 b가 6인 경우의 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸과 n-헥실이 있다.
여기서 사용된 "2가 (Ca-Cb)알킬렌기" (여기서 a와 b는 정수)란 용어는 a 내지 b개의 탄소 원자와 두 개의 불포화 원자가를 갖는 포화탄화수소쇄를 뜻한다.
여기서 사용된 "(Ca-Cb)알킬렌기" (여기서 a와 b는 정수)란 용어는 a 내지 b개의 탄소원자를 갖고 적당한 E 아니면 Z 입체 화학의 하나 이상의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알켄일 부분을 뜻한다. 이들의 예를 들면, 비닐, 알릴, 1-및 2-부텐일과 2-메틸-2-프로펜일이 있다.
여기서 사용된 "2가(Ca-Cb)알켄일렌" 이란 용어는 a 내지 b개의 탄소 원자, 하나 이상의 이중 결합과 두 개의 불포화 원자가를 갖는 탄화수소쇄를 뜻한다.
여기서 사용된 (Ca-Cb)알킨일" (여기서 a와 b는 정수)란 용어는 2~6개의 탄소 원자를 갖고 더불어 하나의 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기이다. 이들의 예를 들면, 에틴일, 1-프로핀일, 1-및 2-부틴일, 2-메틸-2-프로핀일, 2-펜틴일, 3-펜틴일, 4-펜틴일, 2-헥신일, 3-헥신일, 4-헥신일과 5-헥신일이 있다.
여기에 사용된 "2가(Ca-Cb)알킨일렌기" (여기서 a와 b는 정수)란 용어는 2~6개의 탄소 원자와 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 2가 탄화수소쇄를 뜻한다.
여기에 사용된 "탄소환식"이란 용어는 모두가 탄소인 16개 이하의 고리 원자를 갖는 일-, 다리 결합된 일-, 이-또는 삼환식기를 뜻하며, 이들에는 아릴과 시클로알킬이 있다.
여기에 사용된 "시클로알킬"이란 용어는 3~8개의 탄소 원자를 갖는 일환식 탄소환식기를 뜻하며, 예를 들면, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸과 놀보르닐이 있다.
여기서 사용된 "아릴"이란 무제한 용어는 일-, 다리결합된 일-, 이- 또는 삼-환식 탄소환식 방향족기를 뜻하며, 이들에는 공유결합에 의하여 직접 결합 되는 두 개의 일환식 탄소환식 방향족 고리를 갖는 기가 있다. 이와 같은 기의 예를 들면, 페닐, 비페닐과 나프틸이 있다.
여기에 사용된 "헤테로 아릴"이란 무제한 용어는 S,N와 S에서 선택한 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 함유하는 일-, 다리결합된 일-, 이-또는 삼-환식 방향족 기를 뜻하고, 공유결합에 의하여 직접 결합 되는 두 개의 이러한 일환식 고리 또는 하나의 이러한 일환식 고리와 하나의 일환식 아릴 고리를 갖는 기이다. 이와 같은 기의 예를 들면, 티엔일, 벤즈티엔일, 푸릴, 벤즈푸릴, 피롤일, 이미다졸일, 벤즈이미다졸일, 티아졸일, 벤즈티아졸일, 이소티아졸일, 벤즈이소티아졸일, 피라졸일, 옥사졸일, 벤즈옥사졸일, 이소옥사졸일, 벤즈이소옥사졸일, 이소트리아졸일, 트리아졸일, 벤즈트리아졸일, 티아디아졸일, 옥사디아졸일, 피리딘일, 피리다진일, 피리미딘일, 피라진일, 트리아진일, 인돌일과 인다졸일이 있다.
여기에 사용된 "헤테로시클일" 또는 "헤테로환식"이라 무제한 용어는 상기에서 정의한 바와 같이 "헤테로아릴"이 있고, 이의 비-방향족 의미에서는 S,N과 O에서 선택한 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 함유하는 일-, 다리결합된 일-, 이-또는 삼-환식 비-방향족기와 이러한 다른기에 또는 일환식 탄소환식기에 공유 결합된 하나 또는 그 이상의 이러한 헤테로 원자를 함유하는 일환식 비-방향족기로 이루어지는 기를 뜻한다. 이와 같은 기를 예시하면 피롤일, 푸란일, 티엔일, 피페리딘일, 이미다졸일, 옥사졸일, 이소옥사졸일, 티아졸일, 티아시아졸일, 피라졸일, 피리딘일, 피롤리딘일, 피리미딘일, 몰포린일, 피페라진일, 인돌일, 몰포린일, 벤즈푸란일, 피란일, 이소옥사졸일, 벤즈이미다졸일, 메틸렌디옥시페닐, 에틸렌디옥시페닐, 말레이미노와 석신이미도기가 있다.
이 명세서에서 다른 언급이 없는 한, 여기의 어떠한 부분에 사용된 "임의로 치환된"이란 용어는 이러한 부분이 4개 이하의 상화성 치환기로 치환되는 것을 뜻하고, 이들 각기의 예를 들면, 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, 히드록시, 히드록시(C1-C6)알킬, 머캅토, 머캅토(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬티오, 페닐, 할로(플루오로, 브로모와 클로로 포함), 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 니트로, 티르릴(-CN), 옥소, -COOH, -COORA, -CORA, -SO2RA, -CONH2, -SO2NH2, -CONHRA, -SO2NHRA, -CONRARB, -SO2NRARB, -NH2, -NHRA, -NRARB, -OCONH2, -OCONHRA , -OCONRARB, -NHCORA , -NHCOORA, -NRBCOORA, -NHSO2ORA, -NRBSO2OH, -NRBSO2ORA,-NHCONH2,-NRACONH2, -NHCONHRB , -NRACONHRB, -NHCONRARB, 또는 -NRACONRARB가 있고, 여기서 RA와 RB는 각각 5 또는 6개의 환 원자를 갖는 (C1-C6)알킬, (C3-C6)시클로알킬, 페닐 또는 일환식 헤테로아릴을 뜻하고, 또는 RA와 RB가 동일한 질소 원자에 결합 될 때 환식 아미노기(예를 들어 몰포리노, 피페리딘일, 피페라진일 또는 테트라하이드로피롤일)를 형성한다. "임의의 치환기"란 전술한 치환기 중 하나를 의미한다.
"천연 또는 비-천연 알파 아미노산의 측쇄"란 용어는 글리신을 제외하고 R1이 수소인 식 NH2-CH(R1)-COOH의 천연 또는 비-천연 아미노산의 R1기를 뜻한다.
천연 알파 아미노산 측쇄의 예를 들면, 알라닌, 알기닌, 아스파라긴, 아스팔트산, 시스테인, 시스틴, 글루탐산, 히스티딘, 5-히드록시리신, 4-히드록시프롤린, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, α-아미노아디프산, α-아미노-n-부티르산, 3,4-디히드록시페닐알라닌, 호모세린, α-메틸세린, 오르니틴, 피페콜산과 티록신의 측쇄가 있다.
기능성 치환기를 함유하는 천연 알파-아미노산의 예를 들면, 아미노, 카르복실, 히드록시, 머캅토, 구아니딜, 이미다졸일, 또는 일돌일기가 있고, 이들의 특성 측쇄로는 알기닌, 리신, 글루탐산, 아스팔트산, 트립토판, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립신과 시스테인이 있다. 본 발명 화합물의 α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프에서 하나 또는 둘의 α-치환기가 이들 측쇄 중 하나일 때, 기능성 치환기는 임의로 보호될 수 있다. 천연 알파-아미노산의 측쇄에서 기능성 치환기에 관하여 사용될 때 "보호된"이란 용어는 실질적으로 비-기능성인 이러한 치환기의 유도체를 뜻한다. 예를 들면, 카르복실기는 에스테르화되고(예를 들어 C1-C6 알킬 에스테르로 ), 아미노기는 아미드(예를 들어 NHCOC1-C6 알킬아미드로) 또는 카르바메이트(예를 들어 NHC(=O)OC1-C6 alkyl or NHC(=O)OCH2Ph 카르바메이트)로 변환되고, 히드록시기는 에테르(예를 들어 OC1-C6 알킬 O(C1-C6 알킬)페닐에테르로) 또는 에스테르(예를 들어 OC(=O)C1-C6 알킬 에스테르)로 변환되고, 티올기는 티오에테르(예를 들어 tert-부틸 또는 벤질 티오에테르로) 또는 티오에스테르(예를 들어 SC(=O)C1-C6 알킬 티오에스테르로)변환된다. 조절체에 결합하기 위하여 α,α-이치환 글리신 에스테르 카르복실에스테라아제 에스테라아제 모티프에 원칙적으로 존재하는 에스테르기는 여러 가지가 가능하다. 또한 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프에서 에스테르로서 사용되는 α-치환기 R2와 R3에서와 다른, α,α-이치환 글리신은 여러 가지가 있다. 몇몇 α,α-이치환 글리신 에스테르는 하나 또는 그 이상의 동형 hCE-1, -2와 -3 또는 이들 효소를 함유하는 세포에 의하여 빠르게 가수분해되고, 한편 다른 것은 더 느리게 가수분해되거나, 또는 매우 작은 범위로만 가수분해된다. 일반적으로, 카르복실에스테라아제가 모산으로 유리 α,α-이치환 글리신 에스테르를 가수분해하면 이는 상술한 hCE-2와 hCE-3의 N-카르보닐 의존을 받고, 또한 조절체에 공유결합으로 접합 될 때 에스테르 모티프를 가수분해한다. 그러므로, 여기에 서술된 파괴세포분석 및/또는 단리된 카르복실에스테라아제 분석은 요구되는 가수분해 윤곽을 갖는 에스테르의 똑바르고, 신속하고 간단한 제일 스크린을 제공한다. 다음 이 방법에서 선택한 에스테르 모티프를 선택된 접합 화학을 통하여 조절체에 접합시킬 때 동일한 카르복실에스테라아제 분석으로 재분석하여 그 배경에 아직 카르복실에스테라아제 기질이 있음을 식별한다.
에스테르기
언급한 바와 같이, 해당 산으로 본 발명 화합물의 에스테르기를 가수분해할 수 있는 세포 내 카르복실에스테라아제 효소에는 세 가지 공지된 인체 효소 동형 hCE-1, hCE-2와 hCE-3이 있다. 이들이 주효소로 생각되더라도, 비페닐하이드로라아제(BPH)와 같은 다른 효소도 에스테르를 가수분해하는 역할을 갖는다. 일반적으로, 카르복실에스테라아제가 모산으로 유리 아미노산 에스테르를 가수분해하면, 또한 이는 억제제에 공유결합으로 접합 될 때 에스테르 모티프를 가수분해하게 된다. 그러므로, 여기에 서술된 파괴세포분석 및/또는 단리된 카르복실에스테라아제 분석은 요구되는 가수분해 윤곽을 갖는 에스테르의 똑바르고, 신속하고 간단한 제일 스크린을 제공한다. 이 방법에서 선택한 에스테르 모티프를 선택된 접합 화학을 통하여 조절체에 접합시킬 때 동일한 카르복실에스테라아제 분석으로 재분석하여 그 배경에 아직 카르복실에스테라아제 기질이 있음을 확인한다. 세포 내 카르복실에스테라아제 효소에 의하여 이들이 가수분해할 수 있는 요구조건을 받을 때, α,α-이치환 글리신 에스테르 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프에서 특정 에스테르기의 예를 들면 R14가 R8R9R10C 인 식-(C=O)OR14의 기가 있으며, 여기서
(i) R8은 수소 또는 임의로 치환된 (C1-C3)알킬-(Z1)a-[(C1-C3)알킬]b- 또는 (C2-C3)알켄일-(Z1)a-[(C1-C3)알킬]b-이고 여기서 a와 b는 각각 0 또는 1이고, Z1은 -0-, -S- 또는 -NR11(여기서(R11은 수소 또는 (C1-C3)알킬이다)이며; R9와 R10은 각각 수소 또는 (C1-C3)알킬-이며;
(ii) R8은 수소 또는 임의로 치환된 R12R13N-(C1-C3)알킬이고, 여기서 R12는 수소 또는 (C1-C3)알킬이며; 또는 R12와 R13은 이들이 결합 되는 수소와 함께 5- 또는 6-고리원자를 갖는 임의로 치환된 일환식 헤테로환식 고리 또는 8~10개의 고리 원자의 이환식 헤테로환식 고리계를 형성하고 R9와 R10은 각각 수소 또는 (C1-C3)알킬-이며; 또는
(iii) R8과 R9은 이들이 결합 되는 탄소와 함께 3~7개의 고리 원자의 임의로 치환된 일환식 또는 다리 결합 일환식 탄소환식 고리 또는 8~10개의 고리 원자를 갖는 이환식 또는 다리결합 일환식 탄소환식 고리계를 형성하고 R10은 수소이다.
상기 (i), (ii)와 (iii)의 경우, "알킬"은 플루오로알킬이다.
이들 종류 (i), (ii)와 (iii)에서, R10은 보통 수소이다. R14의 특별한 예를 들면 메틸, 트리플루오로메틸, 에틸, n- 또는 이소-프로필, n-, sec- 또는 tert-부틸, 시클로헥실, 놀보르닐, 알킬, 페닐, 벤질, 2-, 3-, 또는 4-피리딜메틸, N-메틸피페리딘-4-일, 테트라하이드로푸란-3-일 또는 메톡시에틸이 있다. 특히 바람직하기로는 R14가 시클로페닐 일 때이다.
α-치환기
조절체에 접합 되는 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α,α-치환기 R2와 R3의 예를 들면 천연 또는 비-천연 알파-아미노산의 측쇄에서 선택될 수 있고 이러한 측쇄에서 어떠한 기능 기가 보호된다. 예를 들면, 조절체에 접합된 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기 R2와 R3는 페닐과 식-CRaRbRc 의 기이며, 이 식에서
각 Ra, Rb와 Rc는 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C2-C6)알켄일, 페닐(C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬이고; 또는
Rc는 수소이고 Ra와 Rb는 각각 페닐 또는 피리딜과 같은 헤테로아릴 이거나; 또는
Rc는 수소, (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C2-C6)알킨일, 페닐(C1-C6)알킬, 또는 (C3-C8)시클로알킬이고, Ra와 Rb는 이들이 결합 되는 탄소 원자와 함께 3~8 원환 시클로알킬 또는 5~6 원환 헤테로환식 고리를 형성하거나; 또는
Ra, Rb와 Rc는 이들이 결합 되는 탄소 원자와 함께 삼환식 고리(예를 들어 아다만틸)를 형성하거나; 또는
Ra와 Rb는 각각 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C2-C6)알킨일, 페닐(C1-C6)알킬, 또는 수소 이외의 하기 Rc에 대하여 정의한 기이고, 또는 Ra와 Rb는 이들이 결합되는 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로환식 고리를 형성하고, Rc는 수소, -OH, , -OH, -SH, 할로겐, -CN, -CO2H, (C1-C4)퍼플루오로알킬, -CH2OH, -O(C1-C6)알킬, -O(C2-C6)알켄일, -S(C1-C6)알킬, -SO(C1-C6)알킬, -SO2(C1-C6)알킬, -S(C2-C6)알켄일, -SO(C2-C6)알켄일, -SO2(C2-C6)알켄일 또는 -Q-W 기이고,
이 기에서 Q는 결합 또는 -O-, -S-, -SO- 나 -SO2- 를 나타내고 W는 페닐, 페닐알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C3-C8)시클로알킬알킬, (C4-C8)시클로알켄일, (C4-C8)시클로알켄일알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬기를 나타내고, 이 W기는 히드록실, 할로겐, -CN, -CONH2, -CONH(C1-C6)알킬, -CONH(C1-C6알킬)2, -CHO, -CH2OH, (C1-C4)퍼플루오로알킬, -O(C1-C6)알킬, -S(C1-C6)알킬, -SO(C1-C6)알킬, -SO2(C1-C6)알킬, -NO2, -NH2, -NH(C1-C6)알킬, -N((C1-C6)알킬)2, -NHCO(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C2-C6)알킨일, (C3-C8)시클로알킬, (C4-C8)시클로알켄일, 페닐 또는 벤질로부터 독립적으로 선택한 하나 또는 그 이상의 치환기에 의하여 임의로 치환될 수 있다.
또한, 조절체에 접합 되는 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기 R2와 R3는 그 자체 α-탄소와 함께 시클로프로필, 시클로펜틸 또는 시클로헥실 고리와 같은 3-6 원환 포화 스피로 시클로알킬고리 또는 피페리딘-4-일 고리와 같은 스피로 사이클일 고리를 형성한다.
몇몇 경우에, 조절체에 접합 되는 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기 R2와 R3중 최소한 하나는 C1-C6 알킬치환기, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 n-또는 이소-프로필이다.
몇몇 구성에서, 조절체에 접합된 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기 R2와 R3중 하나는 C1-C6 알킬치환기, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 n-또는 이소-프로필이고, 다른 하나는 메틸, 에틸, n-및 이소-프로필, n-, sec-와 tert-부틸, 페닐, 벤질, 티엔일, 시클로헥실과 시클로헥실메틸이다.
특히 바람직하기로는 R2와 R3중 하나가 메틸이고, 다른 하나가 메틸, 에틸, 또는 n-또는 이소-프로필인 경우이고; 또는 R2와 R3가 이들이 결합 되는 탄소와 함께 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실 고리를 형성하는 것이다. 특별한 경우에 조절체에 결합 되는 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기 R2와 R3는 각각 메틸이다.
접 합
상술한 바와 같이, α,α-이치환 글리신 에스테르는 그의 아미노기를 통하여, 또는 α-치환기 중 하나를 통하여 조절체에 접합 된다. 링커기는 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프와 조절체 사이에 존재한다. 나머지 조절체에 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프를 연결하는 기의 구조는 분명히 이와 같은 연결에 선택되는 특수한 화학적 전략에 따른다. 그 결합을 위한 화학적 전략은 분명히 광범위하며, 따라서 여러 가지 연결 구조가 가능하다. 아미노산 에스테르 모티프와 나머지 분자 사이의 연결 화학을 이루는 변수의 정확한 조합은 전체적으로 화합물의 최초 결합 형태에 보통 관계가 없다. 또한 몇몇 경우에 연결 화학은 효소와 상호 작용으로 부가적 결합을 이루므로서 결합을 강화한다.
또한, 상술한 α,α-이치환 글리신 에스테르 모티프의 장점(세포로 쉽게 진입, 세포 내에서 카르복실에스테라아제 가수분해와 활성 카르복실산 가수분해 생성물의 세포 내 축적)은 아미노산 에스테르 모티프와 잔존 분자 사이의 연결이 분자로부터 아미노산의 분할을 가져올 수 있는, 세포 내의 펩티다아제 활성을 위한 기질이 아닐 때 가장 잘 이룰 수 있다. 물론 세포 내 펩티다아제에 대한 안정성은 파괴된 세포 내용물을 갖는 화합물을 배양하고, 이와 같은 어떠한 분할을 위해 분석하여 쉽게 시험할 수 있다.
예를 들면, α,α-이치환 글리신 에스테르(식 H2N-C(R2R3)-COOH)는
(a) 식 -(CH2)z-X1-L1-Y-NH-C(R2)(R3)-R1 의 기 또는
(b) 식 -(CH2)z-Y1-L1-R3-C(R2)(NH2)(R1)의 기로서 조절체에 접합되고 이 식에서:
R 1 은 카르복실에스테라아제-가수분해성 에스테르기이고;
R 2 와 R 3 은 α,α-이치환 글리신의 α-치환기이고;
R 2 는 천연 또는 비-천연 알파 아미노산의 측쇄이고;
Y는 결합, -C(=O)-, -S(=O)2-, -C(=O)O-, -C(=O)NR3-, -C(=S)-NR4 , -C(=NH)-NR4, 또는 -S(=O)2NR4-이고, 여기서 R4는 수소 또는 임의로 치환되는 C1-C6 알킬이다.
Y 1 은 결합, -C(=O)-, -S(=O)2-, -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR5-,
-NR5(C=O)-, -S(=O)2NR5-, -NR5S(=O)2-, 또는 -NR6(C=O)NR5이고, 여기서 R5와 R6은 각각 수소 또는 임의로 치환된 (C1-C6)알킬이다.
L 1 은 식 -(Alk1)m(Q)n(Alk2)p-의 2가기이고, 이 식에서
m, n와 p는 각각 0 또는 1이고,
Q는 (i) 5-13 고리 멤버를 갖는 임의로 치환되는 2가 일-또는 이환식, 탄소환식 또는 헤테로환식기, 또는(ii) P가 0인 경우, 식 -Q1-X2- (이 식에서 X2는 -0-, -S- 또는 NRA-이고, 여기서 RA는 수소 또는 임의로 치환되는 C1-C3 알킬이고, Q 1 은 5-13 고리 멤버를 갖는 임의로 치환되는 2가 일- 또는 이환식, 탄소환식 또는 헤테로환식기이다)의 2가기이고;
Alk 1 과 Alk 2 는 각각 임의로 치환되는 2가 C3-C7 시클로알킬기, 또는 에테르(-0-), 티오에테르(-S-) 또는 아미노(-NRA)(여기서 R4는 수소 또는 임의로 치환되는 C1-C3 알킬)결합에 임의로 함유하거나 종결하는 임의로 치환되는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬렌, C2-C6 알켄일렌 또는 C2-C6 알킨일렌이며;
X 1 은 결합, -C(=O)-; 또는 -S(=O)2-; -NR7C(=O)-, -C(=O)NR7-,
-NR7C(=O)-NR8- , -NR7S(=O)2-, 또는 -S(=O)2NR7-(여기서 R7과 R8는 각각 수소 또는 임의로 치환되는 C1-C6 알킬이다)이고;
z 는 0 또는 1이다.
다음 연결 기에 존재하는 변수를 취할 때,
z는 0 또는 1이므로, 조절체에 연결되는 메틸렌기는 임의적이다.
특히 바람직한 Y의 예를 들면 결합, -(C=O)-, -(C=O)NH-,와
-(C=O)O-가 있다. 그러나, hCE-1 특이성에 있어서 알파 아미노산 에스테르가 식(1A)의 기로서 억제제에 접합 될 때 Y는 결합이어야 한다. 기 L에 있어, Alk1 과 Alk2 가 존재할 때, 이들의 예를 들면, -CH2-, -CH2CH2- -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH=CH-,-CH=CHCH2-, -CH2CH=CH-, CH2CH=CHCH2-, -C≡C-, -C≡CCH2, CH2C≡C-,와 CH2C≡CCH2가 있다. 부가적으로 Alk1과 Alk2의 예를 들면 -CH2W-, -CH2CH2W- -CH2CH2WCH2-, -CH2CH2WCH(CH3)-, -CH2WCH2CH2-, -CH2WCH2CH2WCH2-와 -WCH2CH2- 가 있으며 여기서 W는 -O-, -S-, -NH-, -N(CH3)- 또는 -CH2CH2N (CH2CH2OH) CH2-이다. 다른 Alk1과 Alk2의 예를 들면 2가 시클로프로필, 시클로펜틸과 시클로헥실기가 있다.
L1에서, n이 0일 때, 기는 탄화수소쇄(임의로 치환되고 형편에 따라 에테르, 티오에테르와 아미노 연결을 갖는다)이다. 특히 L1에서 임의의 치환기가 없는 것이 바람직하다. 두 m와 P가 0일 때, L1은 5~13개의 고리 원자를 갖는 2가 일-또는 이환식 탄소환식 또는 헤테로환식(임의로 치환)이다. n가 1이고, m와 P중 최소한 하나가 1일 때, L1은 탄화수소쇄 또는 쇄들과 5~13개의 고리 원자를 갖는 일-또는 이환식 탄소환식 또는 헤테로환식기(임의로 치환)를 포함하는 2가기이다. Q가 존재할 때, 이의 예를 들면, 2가 페닐, 나프틸, 시클로프로필, 시클로펜틸, 또는 시클로헥실기, 또는 피페리딘일, 피페라진일, 인돌일, 피리딜, 티엔일, 또는 피롤일기와 같은 5~13개의 고리 멤버를 갖는 일-, 또는 이-환식 헤테로 환식기가 있으며, 그러나, 페닐렌이 특히 바람직하다.
특히, 본 발명의 몇몇 구성에 있어, n가 1일 때, m와 P는 0이다. 다른 구성으로는 m가 1일 때 n와 P는 0이다. 또 다른 구성에 있어 m,n와 P는 모두 0이다. 또한 다른 구성에 있어, Q가 일환식 헤테로환식기일 때 m은 0이고, n은 1이고, P는 0또는 1이다. Alk1과 Alk2가 존재할 때, 이는 -CH2-, -CH2CH2-와 -CH2CH2CH2-에서 선택되고 Q는 1,4-페닐렌이다.
세포 내 효소와 수용체의 조절체
본 발명의 원리는 광범위한 질병에 연관되는 광범위한 세포 내 표적의 조절체에 적용될 수 있다. 서술한 바와 같이, 공지의 조절체를 그들의 표적에 결합하는 형태는 일반적으로 조절체 그들 자신이 공지된 직후 공지되었다. 더불어, X-선 결정학과 NMR과 같은 현대기술은 구조-활성 상호관계를 특징으로 하는 종래 의약 화학 방법에서와 같이, 이러한 결합 위상과 구조를 나타낼 수 있다. 이와 같은 지식으로, 정해진 조절체의 구조에서 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프를 구조 테이타를 사용하여 효소 또는 수용체에 조절체의 결합이 파괴되지 않고 결합시킬 수 있을때를 식별하는 것이 정확하다. 예를 들면, 다음 표1은 결정구조 데이터가 발표되었을 때 몇몇 세포 내 효소 또는 수용체 표적을 열거한 것이다.
표 1
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003

Figure pct00004
예시 목적으로, 참고 문헌에 상기 세포 내 표적 중 5의 공지된 억제제가 표시되어 있고, 이들의 표적에 대한 결합 형태가 공지되어 있다. 이들 실시 예는 이러한 구조적 데이터를 사용하여 α,α-이치환 글리신 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프의 결합에 적합한 위치를 측정할 수 있다. 활성 부위의 개략도를 대표적인 억제제와 함께 다음에 표시했다. 일반적으로 위치는 조절체와 표적 사이의 결합 계면에서 떨어져 있고, 그러므로 용매로 효소 결합 계면에서 떨어져 있는 점이 카르복실에스테라아제 에스테르 모티프의 결합에 적합한 위치이고 이들은 다음 도표에서 도시했다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
또한, 유사한 방법을 표1에서 확인된 다른 실시 예들에도 사용할 수 있다. 표적 세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 조절체의 세포 효능 및/또는 세포 내 체류 시간을 증가시키기 위하여 본 발명의 방법은 다음 몇 가지 단계를 포함한다:
단계 1 : 조절체와 표적 효소 또는 수용체 사이의 결합 계면에서 떨어져 있는, 표적 효소 또는 수용체와 동일한 결합 형태를 공유하는 하나 또는 다수의 조절체 분자에 관한 위치 또는 위치들을 식별한다. 통상 이와 같은 위치들은 구조의 검사에 의하여, 효소 또는 수용체에 결합된 공지의 조절체(또는 이들의 밀폐 구조의 유사체)를 갖는 표적 효소 또는 수용체의 X-선 공동-결정 구조(또는 nmr에 의하여 유도된 구조)로 식별된다. 또한 효소 또는 수용체의 활성 부위에 결합된 조절체를 갖는 표적 효소 또는 수용체의 X-선 결정 구조는 컴퓨터 그래픽 방법에 의하여 모형화하고, 모형을 검사한다. 결합 계면에서 떨어져 있는 위치에서 조절체의 구조적 수정으로 효소 또는 수용체의 활성 부위에 조절체의 결합을 현저하게 방해하지 않는 것으로 추정된다. 적당한 위치들은 통상적으로 용매로 향하는 공동-결정 구조 또는 결합 모형으로 나타나게 된다.
단계 2 : α,α-이치환 글리신 에스테르기, 또는 단계 1에서 식별된 하나 또는 그 이상의 위치에서 일정한 범위의 α,α-이치환 글리신 에스테르기의 결합에 의하여 조절체를 공유 결합으로 수정한다. α,α-이치환 글리신 에스테르기(즉, 잠재적 카르복실에스테라아제 모티프)는 조절체상에 존재하는 공유결합 기능성을 통하여 또는 그 목적을 위하여 특별히 도입된 적당한 기능성을 통하여 결합한다. 카르복실에스테라아제 모티프가 스페이서 또는 링커 요소에 의하여 주 분자 벌크로부터 간격을 가지게 하여 모티프를 용매에 더 깊게 위치시키므로서 조절체의 결합 형태에 관한 모티프의 더욱더 작은 어떠한 효과를 감소시키거나 또는 조절체의 주 분자 벌크에서 나오는 입체적 간섭을 감소시키므로서 모티프가 카르복실에스테라아제 근접할 수 있도록 한다. 단계 2의 실행은 통상적으로 하나 또는 그 이상의 작은 라이브러리의 후보 조절체의 제조를 가져오고, 각각은 단계 1에서 식별된 하나 또는 그 이상의 결합점에서, 여러 가지 α,α-이치환 글리신 에스테르의 주입에 의하여 그의 모 억제제와 연관하여 공유 결합으로 수정된다.
단계 3 : 단계 2에서 제조된 α,α-이치환 글리신 에스테르-접합 조절체를 시험하여 표적 효소 또는 수용체에 대한 그들의 활성을 측정한다. 의약 화학에서 통상 알려져 있는 바와 같이, 단계 1과 2의 실행 결과에 따라 제조된 모 조절체의 카르복실에스테라아제 모티프 변형체를 적당한 분석으로 시험하여 조절체 활성의 예상되는 보유가 실제로 유지되는지 여부와 어느 정도인지와 효능 윤곽이 어떤지를 측정하는것이 바람직하다. 본 발명의 하기 목적에 따라, 이는 조절체 활성의 축적을 일으키는데 있고, 분석으로는 통상 수정된 조절체, 효능 윤곽과, 세포 활성의 정도를 평가하는 세포 계에서의 분석이 적합하다. 단계 3에 사용될 수 있는 다른 분석으로는 수정된 조절체와 이의 추정 카르복실에스테라아제 가수분해 생성물의 내재하는 활성을 측정하기 위한 생체 외 효소 또는 수용체 조절 분석; 카르복실에스테라아제에 의한 해당 카르복실산으로의 수정된 조절체의 변환율을 측정하기 위한 분석과; 세포에서 카르복실에스테라아제 가수분해 생성물(카르복실산)의 축적율 및/또는 수준을 측정하기 위한 분석이 있다. 이와 같은 분석들에서, 두 단핵 세포와 비-단핵 세포와/또는 단리된 카르복실에스테라아제의 패널을 사용하여 세포 선택성을 나타내는 화합물을 식별할 수 있다. 필요 또는 요청에 따라, 단계 3은 다른 모양의 모 조절체의 후보 아미노산 에스테르-접합 변형체로 반복할 수 있다.
단계 4 : 단계 3에서 얻은 데이터에서, 세포 내에서 효소 또는 수용체 활성 조절로 세포 내에서 해당 카르복실산으로 변환되고 축적을 일으키고, 증가 되거나 연장된 세포 효능을 나타내는 하나 또는 그 이상의 시험된 모 조절체의 α,α-이치환 글리신 에스테르-접합 변형체를 선택한다. 상술한 단계 1~4는 본 발명의 원리를 이행하기 위한 일반적 알고리즘을 나타낸다.
합 성
본 발명에 관한 화합물의 합성에는 여러 가지 합성 방법이 있지만, 모두 유기 합성 화학자에게 알려져 있는 공지된 화학에 따른다. 따라서, 식(I)에 의한 화합물은 표준 문헌에 기술되어 있고 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있는 공정에 따라 합성할 수 있다. 대표적인 문헌으로는 "Advanced organic chemistry" 제4판(Wiley), J March, "Comprehensive Organic Transformation", 제2판(Wiley), R.C. Larock , "Handbook of Heterocyclic Chemistry", 제2판(Pergamon), A.R. Katritzky, "Synthesis", Acc . Chem . Res .", "Chem . Rev"에서 볼 수 있는 논문, 또는 표준 문헌 조사 온라인에 의하여 또는 "Chemical Abstracts" 또는 "Beilstein"과 같은 2차 문헌에서 확인되는 일차 문헌이 있다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 하기에서 기술하고 특히 아래 실시 예들에서 기술한 여러 가지 방법에 의하여 제조할 수 있다. 하술한 반응에서, 반응성 기능기, 예를 들어, 히드록실, 아미노와 카르복시기를 보호하는 것이 필요하고, 여기서 이들은 최종 생성물에서 반응물의 원하지 않는 참여를 피하는 것을 필요로 한다. [참조, 예를 들어 Greene, T.W., "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1999].
통상의 보호기는 기본 실시와 함께 사용할 수 있다. 몇 가지 예에서 탈보호는 일반식(I)의 화합물 합성에 있어 최종 단계에서 행하고, 후술한 본 발명에 따른 방법은 이러한 보호기의 제거를 확대하는데 있다.
본 발명의 화합물은 다음 실시 예들에 의하여 제조할 수 있고, 모든 온도는 ℃이다. 사용된 약어는 다음과 같다:
EtOAc = 초산 에틸
MeCN = 아세토니트릴
MeOH = 메탄올
Boc = tert-부톡시카르보닐
CDI = 1,1'-카르보닐 디이미다졸
DCM = 디클로로메탄
DBU = 1,8-디아자비시클로[5.4.0]undec-7-엔
DMAP = 디메틸아미노피리딘
DMF = 디메틸포름아미드
DMSO = 디메틸 술폭시드
THF = 테트라하이드로푸란
HCl = 염산
NaHCO3 = 탄산수소나트륨
TBDMSCl = tert -부틸디메틸글로로실란
NBS = N-브로모석신이미드
NMM = N-메틸 몰포린
NH4Cl = 염화 암모늄
KHMDS = 칼륨 비스(트리메틸실일)아미드
Pd/C = 탄소부착 팔라듐
MgSO4 = 황산 마그네슘
EDC = N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르노디이미드 하이드로클로라이드
Et2O = 디에틸 에테르
NaBH(OAc)3 = 트리아세톡시붕수수화 나트륨
HOBt = 1-히드록시벤조트리아졸
TFA = 트리플루오로초산
TLC = 엷은층 크로마토그래피
mL = 밀리리터
g = 그람
mg = 밀리그람
mol = 몰
mmol = 밀리몰
LCMS = 고성능 액체 크로마토그래피 분광법
NMR = 핵자기공명
RT = 실온
통상적으로 이용할 수 있는 시약과 용매(HPLC 등급)는 더 이상 정제하지 않고 사용한다. 용매는 Bichi 회전 증발기 또는 VirTis Benchtop SLC 동결-건조기를 사용하여 제거한다. 마이크로파 조사는 Biotage Initiator™ 8 마이크로파 합성기를 사용하여 행한다. 플래시 크로마토그래피 컬럼에 의한 화합물의 정제는 Fluorochem에서 얻은 실리카 겔, 입자 크기 40-63㎛(230-400메쉬)를 사용하여 행한다. 제조용 HPLC에 의한 화합물의 정제는 역상 Axia™ prep Luna C18 컬럼(10㎛, 100×21.2 ㎜), 10분 이상의 기울기 0-100% B (A = 물 + 0.05% TFA, B=아세토니트릴), 유속=25㎖/min, 254㎜에서 UV 검출을 사용하여 Gilson systems로 행한다. 1H NMR 스펙트럼은 중수소화 용매에서 Bruker 300 MHz AV 분광계로 기록한다. 화학적 이동 δ는 ppm이다. 엷은층 크로마토그래피(TLC)분석은 Kieselgel 60 F254 (Merck)판으로 행하고 자외선을 사용하여 투시한다.
분석적 HPLC/MS는 역상 Luna C18 컬럼(3㎛, 50 x 4.6 mm), 2.25분 이상의 기울기 5-95 % B (A=물+0.1% 포름산, B=아세토니트릴+0.1% 포름산), 유속=2.25mL/min을 사용하여 an Agilent HP1100 LC system에서 행한다. UV 스펙트럼은 G1315B DAD 검출기를 사용하여 220과 254 nm에서 기록한다. 질량 스펙트럼은 LC/MSD SL G1956B 검출기로 m/z 범위 150-800 이상으로 얻는다. 데이터는 ChemStation and ChemStation Data Browser 소프트웨어를 사용하여 통합하고 기록한다.
실시예 1-6
다음 화합물 6-아미노-5-(2,4-디플루오로-벤조일-1-페닐-1H-피리딘-2-온(화합물 I)과 6-아미노-5-(2,4-디플루오로-벤조일-1-(2,5-디플루오로페닐-1H-피리딘-2-온(화합물 II)은 세포 내 효소 p38 MAP 키나아제의 억제제로 공지되어 있다(WO 03/076405):
Figure pct00008
하기 실시예 1,3과 6은 억제제와 표적 효소 사이의 결합 계면에서 떨어져 있는 위치에서, 이들 화합물에 아미노산 에스테르의 알파 탄소에서 이치환하는 에스테라아제 모티프의 공유 결합에 관한 것이다(참조, 모델 p38 MAP 키나아제 억제제의 결합 형태에 관한 상기 주석). 하기 실시예 2,4와 6은 실시예 1,3과 5 각각의 카르복실산 에스테라아제 가수분해 생성물에 관한 것이다.
실시예 1-6의 합성
중간체 1: 4- 클로로페닐 3-(2,4- 디플루오로페닐 )-3- 옥소프로판이미도티오에이트
Figure pct00009
중간체 1은 WO 2003076405에 기술되어 있는 실험 공정을 사용하여 제조할 수 있다.
중간체 2: {4-[6-아미노-5-(2,4- 디플루오로벤조일 )-2- 옥소피리딘 -1-(2 H )일]-페닐}아세트알데히드
Figure pct00010
{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)일]-페닐}아세트알데히드는 하기 반응식 1에 표시된 방법을 사용하여 합성한다.
Figure pct00011
반응식 1
단계 1- 2-(4-{[3-(2,4-디플루오로페닐)-3-옥소프로판이미도일]아미노}페닐)에틸 아세테이트
4-클로로페닐 3-(2,4-디플루오로페닐)-3-옥소프로판이미도티오에이트(중간체 1)(69.7g, 192mmol)를 빙초산(700mL)에 현탁시키고 2-(4-아미노페닐)에탄올 (27.71g, 202mmol, 1.05 eq)을 가한다. 혼합물을 2.5시간 동안 80℃로 가열한 후 실온으로 냉각시키고 감압하에 농축한다. 잔재를 Et20(2×250mL)로 세척하여 백색 고체를 얻고, 이를 포화 NaHCO3 (700 mL)에 현탁시키고 30분 동안 강하게 교반한다. 여과하고 수세 하면 베이지색 고체를 얻으며 이를 감압하에 여과하여 제목의 화합물 64.12%, 92% 수율)을 얻는다. LC/MS: m/z 361 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 7.79-7.71 (1H, m), 7.45-7.07 (6H, m), 5.26 (1H, s), 4.21 (2H, t, J=6.8 Hz), 2.89 (2H, t, J=6.5 Hz), 2.00 (3H, s).
단계 2- 2-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)-일]페닐}에틸 아세테이트
CDI(43.26 g, 267 mmol, 1.5 eq)를 질소분위기하에 무수 THF(1ℓ)에 용해시키고 0℃로 냉각한다. 프로피올산(16.43 mL, 267 mmol, 1.5 eq)을 적가하고 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반한다. 무수 THF(500mL)에서의 2-(4-{[3- (2,4-디플루오로페닐)-3-옥소프로판이미돌일]-아미노}페닐)에틸아세테이트(64.12g, 178mmol)의 현탁액을 가하고 혼합물을 6시간 동안 80℃로 가열한 후 하룻밤 실온에서 교반한다. 생성한 침전물을 여과하여 수집하고, Et20로 세척하고 감압하에 건조하여 담황색 고체(39.56g)로서 제목의 화합물을 얻는다. 여액을 감압하에 농축하여 갈색 오일을 얻고 이를 EtOAc(500mL)로 분쇄하고, 여과하여 두 번째 배치의 생성물(7.21g)을 얻는다. 두 배치를 조합하면 황색 고체로서 제목의 화합물 (46.77g, 64% 수율)을 얻는다. LC/MS: m/z 413 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 7.55- 7.37 (4H, m), 7.3-7.20 (4H, m), 5.72 (1H, d, J=9.6 Hz), 4.30 (2H, t, J=6.9 Hz), 3.01 (2H, t, J=6.9 Hz), 2.04 (3H, s).
단계 3- 6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-1-[4-(2-히드록시에틸)페닐]피리딘-2(1H)-온
2-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1-(2H)-일]페닐}에틸아세테에트(46.77g, 113mmol)를 6N 수성 HCl(500mL)에 현탁시키고 2시간 동안 환류하에 가열한다. 형성된 침전물을 실온으로 냉각하고 이를 여과하여 수집하고, 포화수성 NaHCO3 (1000mL)에 현탁시키고 30분 동안 강하게 교반한다. 여과하고 물(2×500mL)로 세척하고 감압하에 건조하면 회백색 고체로서 제목의 화합물(40.11g, 96% 수율)을 얻는다. LC/MS: m/z 371 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 7.55-7.37 (4H, m), 7.31-7.20 (4H, m), 5.71 (1H, d, J=9.9 Hz), 4.69 (1H, t, J=5.3 Hz), 3.71 (2H, m), 2.84 (2H, d, J=6.9 Hz).
단계 4- {4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)-일]페닐}-아세트알데히드
0℃에서 무수 DCM(750mL)에 현탁시킨 6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일 )-1-[4-(2-히드록시에틸)페닐]-피리딘-2(1H)-온((15.00 g, 40.5 mmol)의 현탁액에 데스-마틴 페리오디난(20.62 g, 48.6 mmol, 1.2 eq)을 부분씩 가한다. 혼합물을 실온으로 가온하고 3시간 동안 교반한 후, 포화 수성 NaHCO3 (400 mL)와 포화 수성 Na2S2O3 (400 mL)에 부은 후 30분 동안 강하게 교반한다. 수성 층을 분리하고 DCM (2 x 500 mL)으로 추출하고 유기 추출물을 조합하고 MgSO4 상에서 건조한다. 여과하고 감압하에 농축하면 조 담황색 고체로서 제목의 화합물(15.13g)을 얻고 이는 더 이상 정제하지 않고 사용한다.
LC/MS: m/z 369 [M+H]+.
중간체 3: 시클로펜틸 2- 메틸알라니네이트 하이드로클로라이드
Figure pct00012
중간체 3은 다음 반응식 2에 표시된 방법을 사용하여 합성한다.
Figure pct00013
반응식 2
단계 1- 시클로펜틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸알라니네이트
Figure pct00014
0℃에서 DCM(10mL)에 용해한 N-(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸알라닌(1.00g, 4.92mmol)의 용액에 시클로펜탄올(0.83mL, 9.84mmol), EDCl(1.06g, 5.42mmol)과 끝으로 DMAP(60mg, 0.49mmol)를 가한다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 18시간 동안 교반한다. DCM을 진공에서 제거하여 투명한 오일을 얻는다. 조 잔재를 EtOAc (100mL)에 용해시키고 물, 1M NaHCO3와 염수로 세척한다. 유기상을 건조하고 (MgSO4) 진공에서 농축한다. 조 추출물을 컬럼 크로마토그래피(헵탄에서 10% EtOAc)하여 정제하면 투명 오일로서 원하는 생성물(0.254g, 20% 수율)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 5.25-5.17 (1H, m), 5.04 (1H, br s), 1.93-1.54 (8H, m), 1.49 (6H, s), 1.45 (9H, s).
단계 2- 시클로펜틸 2-메틸알라니네이트 하이드로클로라이드(중간체 3)
Figure pct00015
시클로펜틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸알라니네이트(0.254 g, 0.93 mmol)을 THF(5mL)에 용해시키고 4M HCl/디옥산(2 mL)으로 처리하고 반응 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반한다. 조 혼합물을 감압하에 농축하고 Et20로 분쇄하여 백색 침전물을 얻는다. 이를 Et20로 더 세척하여 백색분말로서 원하는 생성물(0.16 g, 82 % 수율)을 얻는다. 1H NMR (300MHz, DMSO-d6) δ: 8.58 (3H, br s), 5.21-5.14 (1H, m), 1.93-1.78 (2H, m), 1.74-1.53 (6H, m), 1.45 (6H, s).
중간체 4: tert -부틸 2- 메틸알라니네이트
Figure pct00016
중간체 4는 하기 반응식 3에 표시된 방법을 사용하여 합성한다.
Figure pct00017
반응식 3
단계 1 - tert-부틸 N-[(벤질옥시)카르보닐]-2-메틸알라니네이트
Figure pct00018
질소하에 0℃에서 DCM(10mL 무수)과 시클로헥산(10mL)에 용해한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-2-메틸알라닌(1g, 4.21 mmol)의 용액에 붕소트리플루오라이드 디에틸 에테레이트(7.7 ul, 촉매)를 가한다. 시클로헥산(10mL)에서 tert-부틸 2,2,2-트리클로로아세트 이미데이트(1.51mL, 8.43 mmol)를 30분 이상 서서히 가한 후 실온으로 가온한다. 반응물을 16시간 동안 실온에서 교반한다. 조 반응 혼합물에 190 mg의 NaHCO3를 가하고 반응물을 여과한다. 모액을 진공에서 농축한다. 조 추출물을 컬럼 크루마토그래피(헵탄에서 10% EtOAc)하여 정제하면 원하는 생성물(0.863 g, 70 % 수율)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7.39-7.31 (5H, m), 5.46 (1H, br s), 5.10 (2H, s), 1.54 (6H, s), 1.45 (9H, s).
단계 2- tert-부틸 2-메틸알라니네이트(중간체 4)
Figure pct00019
EtOAc (20 mL)에 용해한 tert-부틸 N-[(벤질옥시)카르보닐]-2-메틸알라니네이트(0.863 mg, 2.90 mmol)의 용액에 100mg의 Pd/C 촉매를 가한다. 혼합물을 제거하여 18시간 동안 수소 분위기하에 교반하고, 여과하고(셀라이트), EtOAc로 세척하고 진공에서 농축한다. 생성물은 극미량의 EtOAc를 함유하는 황색 오일(0.45 mg, 96 %)로서 단리한다. 생성물이 휘발성을 가지므로 진공에서 증발시킬 동안 주의해야한다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.48 (9H, s), 1.32 (6H ,s).
중간체 5: 시클로펜틸 1- 아미노시클로펜탄카르복실레이트
Figure pct00020
중간체 5는 다음 반응식 4에 표시된 방법을 사용하여 합성한다.
Figure pct00021
반응식 4
단계 1- 시클로펜틸 1-아미노시클로펜탄카르복실레이트
시클로펜탄올(20mL)에 용해한 1-아미노시클로펜탄카르복실산(2.58 g, 19.97 mmol)의 용액에 농황산(2.15g, 21.97 mmol)을 가하고 혼합물을 70℃에서 하룻밤 교반한다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 감압하에 시클로펜탄올을 제거한다. 잔재를 EtOAc(30mL)에 용해시키고 포화 NaHCO3(30 mL)과 물(3×20mL)로 세척한 다음 건조하고(MgSO4), 여과하고 진공에서 농축하면 짙은 황색 오일을 얻는다. 칼럼 크로마토그래피(EtOAc에서 15% 1.2M NH3/MeOH)하여 정제하면 원하는 생성물(1.97 g, 50 % 수율)을 얻는다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 5.21-5.17 (1H, m), 2.15-1.90 (2H, m), 1.85-1.57 (14H, m).
중간체 6: tert -부틸 1- 아미노시클로펜탄카르복실레이트
Figure pct00022
중간체 6은 다음 반응식 5에 표시된 방법을 사용하여 합성한다.
Figure pct00023
반응식 5
단계 1 - 1-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}시클로펜탄카르복실산
1:1 디옥산/물(60mL)에 용해한 1-아미노시클로펜탄카르복실산(3.0 g, 23.2 mmol)의 용액에 Na2CO3 (12.3 g, 116 mmol)을 서서히 가한 다음 클로로포름산 벤질(3.6 mL, 25.5 mmol)을 가하고 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반한다. 반응 혼합물을 주의하여 1M HCl로 pH2로 산성화한 다음 EtOAc (3 x 30 mL)로 추출한다. 조합된 유기 추출물을 염수(30mL)로 세척하고, 건조하고(MgSO4), 여과하고 진공에서 농축하여 담황색 오일을 얻는다. LCMS와 NMR로 원하는 생성물과 해당 벤질 에스테르의 혼합물인 조 생성물이 나타난다. 조 생성물을 1:1 THF/물(60mL)에 용해시키고 수산화리튬(2.67 g, 116 mmol)으로 처리한다. 혼합물을 하룻밤 실온에서 교반한 다음 EtOAc (3 x 30 mL)로 세척하고, pH=2로 산성화하고 EtOAc (3 x 30 mL)로 추출한다. 조합된 유기 추출물을 염수(30mL)로 세척하고, 건조하고(MgSO4), 여과하고 감압하에 농축하여 제목의 화합물(4.76 g, 78 %)을 얻는다. LCMS: m/z 264 [M+H]+.
단계 2 - tert-부틸 1-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}시클로펜탄카르복실레이트
tert-부틸 1-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}시클로펜탄 카르복실레이트는 중간체 4의 단계 1(반응식 3)과 유사한 모양으로 제조한다.
LC/MS: m/z 320 [M+H]+.
단계 3 - tert-부틸 1-아미노시클로펜탄카르복실레이트
tert-부틸 1-아미노시클로펜탄카르복실레이트는 중간체 4의 단계 2(반응식 3)와 유사한 모양으로 제조한다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 2.08-2.02 (2H, m), 1.87-1.72 (4H, m), 1.64-1.58 (2H, m), 1.47 (9H, s).
실시예 1: 시클로펜틸 N -(2-{4-[6-아미노-5-(2,4- 디플루오로벤조일 )-2- 옥소피리딘 -1(2 H )-일] 페닐 }에틸)-2- 메틸알라니네이트
Figure pct00024
본 발명의 이 실시예 화합물에서, 디메틸 글리신 시클로페닐 에스테르 모티프는 디메틸 글리신 시클로펜틸 에스테르를 통하여 -CH2CH2- 링커기로 모 p38 MAP 키나아제 억제제에 공유결합된다. 화합물은 하술한 바와 같이 중간체 2와 중간체 3을 사용하여 합성한다. 무수 THF(4mL)에 용해한 중간체 2(189 mg, 0514 mmol)의 용액에 시클로펜틸 2-메틸알라니네이트 하이드로클로라이드(중간체 3)(160 mg, 0.77 mmol, 1.5 eq)와 NaBH(OAc)3 (326 mg, 1.54 mmol, 3 eq)를 가한다. 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반한 다음 물(20mL)로 급냉시킨다. 수성 층을 EtOAc (3 x 20 mL)로 추출하고, 조합된 유기 추출물을 염수(40mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조하고, 여과하고 감압하에 농축한다. 잔재를 제조용 HPLC하여 정제하면 제목의 화합물(130 mg, 48 % 수율)을 얻는다.
LC/MS: m/z 524 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 10.43 (1H, br s), 7.51-7.34 (4H, m), 7.28-7.26 (2H, m), 7.04-6.90 (2H, m), 5.93 (1H, d, J=9.6 Hz), 5.20-5.10 (1H,m), 2.93-2.75 (4H, m), 1.95-1.55 (8H, m), 1.31 (6H, s).
실시예 2: N -(2-{4-[6-아미노-5-(2,4- 디플루오로벤조일 )-2- 옥소피리딘 -1 (2 H )-일] 페닐 }에틸)-2- 메틸알라닌
Figure pct00025
이 실시예는 실시예 1의 화합물의 카르복실산 가수분해 성성물에 관한 것이다. 화합물은 다음 반응식 6에 기술한 바와 같이 중간체 2와 중간체 4를 사용하여 합성한다.
Figure pct00026
반응식 6
단계 1- tert-부틸 N-(2-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)-일]페닐}에틸)-2-메틸알라니네이트
THF(3mL)에 용해한 중간체 2(180 mg, 0.489 mmol)에 용해한 용액에 tert-부틸 2-메틸알라니네이트(중간체 4)(117 mg, 0.73 mmol)를 가하고, 30분 동안 교반한 다음 NaBH(OAc)3 (310 mg, 1.467 mmol)를 가한다. 반응물을 24시간 동안 교반하고, EtOAc로 희석하고 유기물을 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조하고(MgSO4), 진공에서 농축한다. 잔재를 제조용 HPLC하여 정제하면 제목의 화합물(120mg, 48% 수율)을 얻는다.
LC/MS: m/z 512 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 10.41 (1H, br s), 7.51-7.34 (4H, m), 7.28-7.26 (2H, m), 7.05-6.90 (2H, m), 5.93 (1H, d, J=9.9 Hz), 5.15 (1H, br s), 2.93-2.78 (4H, m), 1.46 (9H, s), 1.29 (6H, s).
단계 2 - N-(2-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)-일]페닐}에틸)-2-메틸알라닌
DCM(3mL)에 용해한 tert-부틸 N-(2-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일) -2-옥소피리딘-1(2H)-일]페닐}에틸)-2-메틸알라니네이트(100mg, 0.19mmol)의 용액에 트리플루오로초산(3mL)을 가한다. 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반하고 감압하에 농축한다. 잔재를 Et20로 분쇄하고, 여과하여 수집하고 감압하에 건조하여 회백색 고체로서 제목의 화합물을(50mg, 56% 수율)을 얻는다.
LC/MS: m/z 456 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.05 (1H, br s), 7.60-7.15 (9H, m), 6.95 (1H, br s), 5.72 (1H, d, J=9.6 Hz), 3.15-2.95 (4H, m), 1.33 (6H, br s).
실시예 3: 시클로펜틸 1-[(2-{4-[6-아미노-5-(2,4- 디플루오로벤조일 )-2- 옥소피리딘 -1(2 H )-일] 페닐 }에틸)아미노] 시클로펜탄카르복실레이트
Figure pct00027
실시예 3은 실시예 1과 유사한 방법으로 중간체 2와 중간체 5를 사용하여 합성한다.
LC/MS: m/z 550 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, DMSO- d6) δ: 7.55-7.34 (6H, m), 7.29-7.21 (2H, m), 5.72 (1H, d, J=9.8 Hz), 5.27-5.21 (1H, m), 3.31-3.20 (2H, m), 3.10-3.00 (2H, m), 2.22-2.12 (2H, m), 2.08-1.98 (2H, m), 1.90-1.58 (12H, m)
실시예 4: 1-[(2-{4-[6-아미노-5-(2,4- 디플루오로벤조일 )-2- 옥소피리딘 -4(2 H )-일] 페닐 }에틸)아미노] 시클로펜탄카르복실산
Figure pct00028
실시예 4는 실시예 2와 유사한 방법으로 중간체 2와 중간체 6을 사용하여 합성한다.
LCMS: m/z 482 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 7.52-7.37 (4H, m), 7.31-7.20 (4H, m), 5.71 (1H, d, J=10.0 Hz), 3.08-2.93 (4H, m), 2.10-1.99 (2H, m), 1.78-1.68 (6H, m).
실시예 5: 시클로펜틸 5-{4-[6-아미노-5-(2,4- 디플루오로벤조일 )-2- 옥소피리딘 -1(2 H )-일]-3,5- 디플루오로펜옥시 }-2- 메틸노르발리네이트
Figure pct00029
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) 10.14 (1H, br s), 8.06 (3H, br s), 7.57 (1H, dd, J=8.5, 15.1 Hz), 7.42 (1H, td, J=2.3, 10.0 Hz), ), 7.34 (1H, dd, J=2.5, 9.8 Hz), 7.24 (1H, td, J=2.3, 8.5 Hz), 7.03 (2H, d, J=10.2 Hz) 5.74 (1H, d, J=9.8 Hz), 5.23-5.19 (1H, m), 4.13-4.07 (2H, m), 1.97-1.83 (5H, m), 1.70-1.57 (7H, m), 1.45 (3H, s). LCMS 순도 95%, m/z 576 [M+H]+.
실시예 5는 다음 반응식 7에 표시된 방법으로 합성한다.
Figure pct00030
반응식 7
단계 1: 5-벤질 1-시클로펜틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-글루타메이트
DCM(100mL)에 용해한 (2S)-5-(벤질옥시)-2-[(tert-부톡시카르보닐) 아미노]-5-옥소펜타노산(10g, 30mmol)의 용액에 시클로펜탄올(30mL, 33mmol)과 EDC(6.25g, 33mmol)를 가한다. 반응물을 20분 동안 교반하여 반응을 완료한다. 반응물을 DCM으로 희석하고, 1M HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조하고(MgSO4) 진공에서 농축한다. 잔재를 컬럼 크로마토그래피(20% EtOAc/헵탄)하여 정제하면 백색 고체로서 제목의 화합물(8.48 g, 71 % 수율)을 얻는다. m/z 406 [M+H]+.
단계 2: 5-벤질 1-시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-L-글루타메이트
아세토니트릴(100mL)에 용해한 5-벤질 1-시클로펜틸 N-(tert-부톡시 카르보닐)-L-글루타메이트(8.48 g, 21 mmol)의 용액에 디-tert-부틸 디카르보네이트 (13.69 g, 63 mmol)와 DMAP(255 mg, 2.1 mmol)를 가한다. 반응물을 50℃로 가열하고 하룻밤 교반한 후 실온으로 냉각시키고 감압하에 농축한다. 조 잔재를 EtOAc에 용해시키고 1M HCl, 포화 NaHCO3와 염수로 세척한다. 유기층을 황상 마그네슘 상에서 건조하고 진공에서 농축하여 갈색오일을 얻는다. 컬럼 크로마토그래피(10-20% EtOAc/헵탄)하여 정제하면 무색 오일로서 제목의 화합물(10.16 g, 96 % 수율)을 얻는다. m/z 506 [M+H]+.
단계 3: (4S)-4-[비스(tert-부톡시카르보닐)아미노]-5-(시클로펜틸옥시)-5-옥소펜타노산
EtOAc(200mL)에 용해한 5-벤질 1-시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시 카르보 닐)-L-글루탐에이트(10.16 g, 20.1 mmol)의 용액에 Pd/C (1 g)을 가한다. 혼합물을 19시간 동안 H2의 분위기하에 교반하고, 셀라이트로 여과하고 진공에서 농축하여 담황색 오일로서 제목의 화합물(8.28 g, 99 % 수율)을 얻는다. m/z 416 [M+H]+.
단계 4: 시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-5-히드록시-L-노르발리네이트
(4S)-4-[비스(tert-부톡시카르보닐)아미노]-5-(시클로펜틸옥시)-5-옥소펜타노산(8.28 g, 20 mmol)을 THF(80mL)에 용해시키고 얼음 욕조에서 냉각시킨다. NMM(3.3 mL, 30 mmol)을 가한 다음 이소부틸클로로포름에이트(3.6 mL, 28 mmol)를 적가한다. 반응물을 1.5시간 동안 0℃에서 교반한 후 반응물을 여과하고 침전물을 THF로 세척한다. 모액을 다시 0℃로 냉각하고 NaBH4 (1.51 g, 40 mmol)를 적가하고, 3시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 물(80mL)로 급냉하고 EtOAc (3 x 100 mL)로 추출한다. 조합된 유기 추출물을 염수로 세척하고, 건조하고(MgSO4) 진공에서 농축하여 황색 오일을 얻는다. 컬럼 크로마토그래피(40% EtOAc/헵탄)하여 정제하면 무색오일로서 제목의 화합물(4.34 g, 54 % 수율)을 얻는다. m/z 402 [M+H]+.
단계 5: 시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-5-{[tert-부틸(디메틸)실일]옥시}-L-노르발리네이트
시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-5-히드록시-L-노르발리네이트 (4.34 g, 10.8 mmol)를 아세토니트릴(45mL)에 용해시키고 얼음 욕조에서 냉각시킨다. DBU (1.7 mL, 11.3 mmol)를 가한 다음 TBDMSCl(1.71 g, 11.3 mmol)를 가한다. 반응물을 실온에서 하룻밤 교반한 다음 진공에서 농축한다. 조 잔재를 EtOAc에서 용해시키고 1M HCl, 포화 NaHCO3와 염수로 세척한다. 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조하고 진공에서 농축하여 황색 오일을 얻는다. 컬럼 크로마토그래피(20% EtOAc/헵탄)하여 정제하면 무색오일로서 제목의 화합물(3.82 g, 69 % 수율)을 얻는다. m/z 516 [M+H]+.
단계 6: 시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-5-{[tert-부틸(디메틸)실일]옥시}-2-메틸노르발리네이트
N2 분위기하에 -78℃에서 THF(50mL)에 용해한 시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-5-{[tert-부틸(디메틸)실일]옥시}-L-노르발리네이트(3.82 g, 7.4 mmol)의 용액에 THF(16.3 mL, 14.8 mmol)에서 0.91M KHMDS를 가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 -78℃에서 교반한 후 요오드화 메틸(0.92 mL, 14.8 mmol)을 가한다. 반응물을 실온으로 가온하고 하룻밤 교반한다. 반응 혼합물을 NH4Cl로 급냉하고 수성 층을 EtOAc(2 x 50 mL)로 추출한다. 조합된 유기 추출물을 염수로 세척하고, 건조하고(MgSO4) 진공에서 농축하여 황색 오일을 얻고 이를 더 이상 정제하지 않고 사용한다(3.50 g, 89% 수율). m/z 530 [M+H]+.
단계 7: 시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-5-히드록시-2-메틸노르발리네이트
시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-5-{[tert-부틸(디메틸)실일] 옥시}-2-메틸노르발리네이트를 초산(45mL), THF(15mL)와 물(15mL)에 용해시킨다. 반응물을 20시간 동안 30℃에서 교반하여 반응을 완료한다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석한 다음 포화 NaHCO3와 염수로 세척한다. 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조하고 진공에서 농축하여 짙은 황색 오일(3.08g)을 얻고 이를 더 이상 정제하지 않고 사용한다. m/z 416 [M+H]+.
단계 8: 시클로펜틸 5-브로모-N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸노르발리네이트
NBS (3.95 g, 22.2 mmol)을 DCM(30mL)에 현탁시키고 트리페닐포스핀(5.44 g, 20.7 mmol)을 가한다. 반응물을 5분 동안 교반한 후 피리딘(0.94 mL, 8.9 mmol)을 가한다. 시클로펜틸 N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-5-히드록시-2-메틸 노르발리네이트(3.08 g, 7.4 mmol)를 DCM(30mL)의 용액으로 가하고 실온에서 하룻밤 교반한다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 갈색 오일을 얻고 이를 컬럼 크로마토 그래피(15% EtOAc/헵탄)하여 정제하면 무색오일로서 제목의 화합물(1.05g, 이 단계 이상에서 30% 수율)을 얻는다. m/z 479 [M+H]+.
단계 9: 시클로펜틸 5-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)-일]-3,5-디플루오로펜옥시}-N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸노르발리네이트
6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-1-(2,6-디플루오로-4-히드록시페닐)피리딘-2(1H)-온[WO 03076405 실시예 51](500 mg, 1.32 mmol)과 시클로펜틸 5-브로모-N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸 노르발리네이트(696 mg, 1.45 mmol)을 DMF(10mL)에서 함께 혼합한다. 탄산 칼륨(365 mg, 2.64 mmol)와 요오드화 나트륨(396 mg, 2.64 mmol)을 하룻밤 40℃에서 교반하면서 가한다. 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL)로 희석한 다음 물과 염수로 세척한다. 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조하고 진공하여 농축하여 황색 고체를 얻고 이를 컬럼 크로마토그래피 (30-40% EtOAc/헵탄)하여 정제하면 백색 고체로서 제목의 화합물(604 mg, 59 % 수율)을 얻는다. m/z 776 [M+H]+.
단계 10: 시클로펜틸 5-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)-일]-3,5-디플루오로펜옥시}-2-메틸노르발리네이트
시클로펜틸 5-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)-일)-3,5-디플루오로펜옥시}-N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸노르발리네이트 (604mg)를 TFA(10mL)와 DCM(10mL)에 용해시키고, 반응물을 하룻밤 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 갈색 오일을 얻는다. 조 잔재를 EtOAc (50 mL)로 희석한 다음 포화 NaHCO3, 물과 염수로 세척한다. 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조하고 진공에서 농축하여 실시예 5의 담황색 고체(387 mg, 46% 수율)를 얻는다.
실시예 6: 5-{4-[6-아미노-5-(2,4- 디플루오로벤조일 )-2- 옥소피리딘 -1(2 H )-일]-3,5- 디플루오로펜옥시 }-2- 메틸노르발린
Figure pct00031
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) 10.16 (1H, br s), 8.17 (3H, br s), 7.63-7.51 (1H, m), 7.47-7.18 (3H, m), 7.14-6.99 (2H, m), 6.23 (1H, d, J=9.6 Hz), 4.10 (2H, br s), 1.96-1.63 (4H, m), 1.41 (3H, s). LCMS 순도 95%, m/z 508 [M+H]+.
실시예 6은 다음 반응식 8에 표시된 방법으로 합성한다.
Figure pct00032
반응식 8
단계 1: 5-벤질 1-tert-부틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-글루탐에이트
DCM(50mL)에 용해한 N-α-tert-부틸옥시카르보닐-L-글루탐산-α-tert-부틸 에스테르(5 g, 16.5 mmol)의 용액에 벤질 알코올(3.4 mL, 33 mmol), EDC (3.48 g, 18 mmol)와 DMAP (201 mg, 1.6 mmol)를 가한다. 반응물을 20시간 동안 교반하여 반응을 완료한다. 반응물을 DCM으로 희석하고, 1M HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조하고(MgSO4) 진공에서 농축한다. 잔재를 컬럼 크로마토그래피(20% EtOAc/헵탄)하여 정제하면 무색오일로서 제목의 화합물(5.98 g, 92 % 수율)을 얻는다. m/z 416 [M+Na]+.
단계 2-9는 실시예 5에 서술된 방법과 동일한 방법(반응식 7)에 따라 제조한다.
단계 10: 5-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)-일]-3,5-디플루오로펜옥시}-2-메틸노르발린
tert-부틸 5-{4-[6-아미노-5-(2,4-디플루오로벤조일)-2-옥소피리딘-1(2H)-일]-3,5-디플루오로펜옥시}-N,N-비스(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸노르발리네이트 (70mg)를 TFA(2mL)와 DCM(2mL)에 용해시키고, 반응물을 하룻밤 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 핑크색 오일을 얻는다. 조 잔재를 디에틸 에테르로 분쇄하여 회백색 고체(23 mg, 40% 수율)를 여별하고 진공하에 건조하면 TFA염으로서 실시예 6의 화합물을 얻는다.
화합물 IV (N-히드록시-3- 페닐 - 프로피온아미드 )
Figure pct00033
화합물 IV
화합물 IV는 다음 반응식 9에 표시된 바와 같이 제조한다.
Figure pct00034
반응식 9
N-(1- 이소부톡시에톡시 )-3- 페닐프로피온아미드
N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) (151 mg)와 4-디메틸아미노피리딘(촉매)을 하이드로신남산(100mg), 보호된 히드록실아민(WO2008/040934) (136 ㎕)과 디클로로메탄(5mL)의 교반된 용액에 질소 분위기하에 실온에서 가한다. 반응물을 2시간 동안 교반한 다음 물(50mL)에 붓는다. 이를 디클로로메탄(2 ×50 mL)으로 추출한다. 조합된 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조하고 용매를 진공에서 제거한다. 잔재를 기울기로 도달되는, 헵탄에서의 0-100% 초산 에틸의 용리액을 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하면 무색오일로서 생성물(58mg)을 얻는다.
화합물 IV : N-히드록시-3- 페닐프로피온아미드
N-(1-이소부톡시에톡시)-3-페닐프로피온아미드(58mg)를 DCM(2mL)과 MeOH (0.5 mL)에 용해시키고 질소 분위기하에 실온에서 교반한다. 디옥산(275㎕)에서의 4M HCl을 용액에 가하고 반응물을 2시간 동안 교반한다. 용매를 진공에서 제거한 다음 잔재를 HPLC하여 정제하면 핑크색 고체로서 생성물(9mg)을 얻는다. m/z 166 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) 10.37 (1H, bs), 7.21 (5H, m), 2.81 (2H, t, J = 7.5Hz), 2.61 (1H, m), 2.58 (2H, t, J = 7.5 Hz).
실시예 7, 8, 9, 10의 합성
상기 화합물들은 하기 중합체와 방법을 사용하여 합성한다.
중간체
중간체 7: (2 E )-3-(5- 포르밀피리딘 -2-일)- N -(1- 이소부톡시에톡시 ) 아크릴아미드
Figure pct00035
중간체 7은 WO2008/040934에 기술된 방법으로 제조한다.
중간체 8: 3-(4- 포르밀페닐 )- N -(1- 이소부톡시에톡시 ) 프로판아미드
Figure pct00036
중간체 8은 WO2008/040934에 기술된 방법으로 제조한다.
중간체 9: 시클로펜틸 1- 아미노시클로헥산카르복실레이트
Figure pct00037
시클로헥산(250mL)에서 1-아미노시클로헥산카르복실산(4.2 g,29 mmol)에 시클로펜탄올(50mL)과 파라-톨루엔술폰산(5.89g)을 가하고 생성된 현탁액을 72시간 동안 딘-스타크 장치에서 환류하에 가열한다. 실온으로 냉각하면 백색 고체가 생성되고 이를 여과하여 수집하고 시클로헥산(2×100mL)으로 세척하고 감압하에 건조하여 무색 고체로서 제목의 화합물(4.1g)을 얻는다. m/z 212.3 [M+H]+.
중간체 10: 시클로펜틸 2- 메틸 -D,L- 류시네이트
Figure pct00038
시클로펜탄올(1mL)과 농 H2SO4 (0.36 mL)에 용해한 (R,S)-α-메틸류신(500 mg,3.44 mmol)의 용액을 28시간 동안 80℃에서 가열한다. 반응물을 감압하에 농축하고 잔재를 포화NaHCO3(aq)(20 mL)과 디클로로메탄(20mL)사이에 분배한다. 유기층을 건조하고(MgSO4) 증발하여 밝은 갈색오일로서 원하는 물질(650mg)을 얻고 이를 더 이상 정제하지 않고 사용한다. m/z 214.3 [M+H]+.
실시예
실시예 7: 시클로펜틸 1-({4-[3-( 히드록시아미노 )-3- 옥소프로필 ]벤질}아미노) 시클로펜탄카르복실레이트
Figure pct00039
디클로로메탄(20mL)에 용해한 중간체 8(208 mg, 0.68 mmol)과 중간체 5(184 mg, 0.68 mmol)의 용액에 트리아세톡시 붕소수화 나트륨(430 mg, 2.04 mmol)와 초산(47㎕)을 가한다. 생성된 용액을 5시간 동안 실온에서 교반한 다음 포화 NH4Cl로 급냉한다. 반응물을 디클로로메탄(2×50mL)으로 추출하고 조합된 유기층을 건조하고(MgSO4) 진공에서 농축한다. 생성된 잔재를 디옥산(1mL)에서 4M HCl에 용해시키고 1시간 동안 실온에서 교반한다. 반응물을 NaHCO3로 급냉하고 초산 에틸(2×150mL )로 추출한다. 조합된 유기층을 건조하고(MgSO4) 증발시킨다. 잔재를 HPLC하여 정제하면 무색 고체로서 제목의 화합물(80mg)을 얻는다. m/z 375 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, MeOD), 7.46 (2H, d J=7.9 Hz), 7.36 (2H, d J=8.1 Hz), 5.40 (1H, m), 4.18 (2H, s), 2.98 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.38 (4H, m), 2.08-1.52 (14H, m).
실시예 8: 1-({4-[3-( 히드록시아미노 )-3- 옥소프로필 ]벤질}아미노) 시클로펜탄카르복실산
Figure pct00040
시클로펜틸 1-({4-[3-(히드록시아미노)-3-옥소프로필]벤질}아미노)시클로펜탄카르복실레이트(실시예 7)(40mg)를 36시간 동안 45℃로 THL(1mL)과 물(1mL)에서 수산화리튬(40 mg, 15mmol)과 교반한다. 반응물을 감압하에 농축하고 생성된 잔재를 길선 제조용 HPLC하여 정제한다. 정제된 카르복실산 유도체를 실온에서 1시간 동안 디클로로메탄:TFA (1 mL, 1:1 v/v)에서 교반하고 반응물을 감압하에 농축한다. 제목의 화합물(3mg)을 무색 고체로서 단리한다. 1H NMR (300 MHz, MeOD), 7.47 (2H, d J=7.9 Hz), 7.36 (2H, d J=8.1 Hz), 4.18 (2H, s), 3.01-2.95 (2H, t J=7.5 Hz), 2.38 (4H, m), 1.97-1.59 (6H, m)
실시예 9: 시클로펜틸 N -{4-[3-( 히드록시아미노 )-3- 옥소프로필 ]벤질}-2-메틸-D,L- 류시네이트
Figure pct00041
이는 중간체 8 (209 mg, 0.68 mmol)과 중간체 10(146 mg, 0.61 mmol)을 사용하여 실시예 7과 유사한 방법으로 제조한다.
1H NMR (300 MHz, MeOD) 7.44 (2H, d J=8.1 Hz), 7.35 (2H, d J=8.1 Hz), 5.38-5.33 (1H, m), 4.21 (1H, d J=12.8 Hz), 4.06 (1H, d, J=12.8 Hz), 2.98 (2H, t J=7.6 Hz), 2.41 (2H, t J=7.6 Hz), 2.04-1.72 (11H, m), 1.68 (3H, s), 0.99 (6H, t J=7.6 Hz).
다음 실시예들은 실시예 9를 사용하여 실시예 8의 제목의 화합물과 유사한 방법으로 제조한다.
실시예 10: N -{4-[3-( 히드록시아미노 )-2- 옥소프로필 ]벤질}-2- 메틸 -D,L-류신
Figure pct00042
m/z 323 [M+H]+. 1H NMR (300 MHz, MeOD), 7.44 (2H, d J=8.1Hz), 7.35(2H, d J=8.1Hz), 4.20 (1H, d J=12.4Hz), 4.09 (1H, dJ=12.6Hz), 2.97 (2H, t J=7.3Hz), 2.41 (2H, t J=7.7Hz), 2.01-1.87 (3H, m), 1.76 (3H, s), 1.01 (6H, t J=6.3Hz).
실시예 11: 시클로펜틸 1-[({6-[(1 E )-3-( 히드록시아미노 )-3- 옥소프로프 -1-엔-1-일]피리딘-3-일} 메틸 )아미노] 시클로헥산카르복실레이트
Figure pct00043
THF(20mL)에 용해한 중간체 7(386 mg, 1.83 mmol)과 중간체9(902 mg, 3.02 mmol)의 용액에 분말 분자체 4Å(100mg)를 가하고 생성된 혼합물을 12시간 동안 환류 온도에서 가열한다. 실온으로 냉각하고 붕수소화 나트륨(317 mg, 85 mmol)을 가하고 20분 동안 교반을 계속한다. 반응물을 포화NH4Cl (50 mL)으로 급냉한 다음, 디클로로메탄(3×100mL)으로 추출한다. 조합된 유기층을 건조하고(MgSO4), 진공에서 농축하고 생성된 잔재를 컬럼 크로마토그래피[실리카 겔, DCM에서 5% 메탄올]한다. 정제된 물질을 디클로로메탄(20mL)에 용해시키고 이에 디옥산에서 4M HCl을 가하고 생성 용액을 1시간 동안 실온에서 교반한다. 용액을 NaHCO3으로 급냉하고, 초산 에틸(2×150mL)로 추출한다. 조합된 유기층을 건조하고(MgSO4) 증발시킨다. 잔재를 HPLC하여 정제하면 무색 고체로서 제목의 화합물(80mg)을 얻는다. m/z 388.25 (M+H)+. 1H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 10.95 (1H, br s), 9.43 (1H, br s), 8.65 (1H, d, J=1.7 Hz), 7.92 (1H, dd, J=2.0, 8.0), 7.67 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.50 (1H, d, J=15.4 Hz), 6.98 (1H, d, J=15.4 Hz), 5.23 (1H, t, J=5.3 Hz), 4.16 (2H, br s), 2.15-2.30 (2H, m), 1.16-1.96 (16H, m).
생물학적 활성
히스톤 탈아세틸라아제 활성
히스톤 탈아세틸라아제 활성을 억제하는 화합물의 능력은 Biomol에서 판매하고 있는 HDAC 형광 활성 분석을 사용하여 측정한다. 주로, Fluor de Lys ™기질, 입실론-아미노 아세틸화를 갖는 리신을 억제제의 존재 또는 부존재하에 히스톤 탈아세틸라아제 활성(헬라핵 추출물)의 공급원에서 배양한다. 기질의 탈아세틸화는 기질을 형광단을 발생하는 Fluor de Lys ™전개제로 민감하게 한다. 따라서, HDAC활성의 공급원에서 기질의 배양은 HDAC억제제의 존재하에서 감소 되는 신호의 증가를 가져온다. 데이터는 억제제 없이 측정되는, 억제 퍼센트로 표시되고, 배경 신호는 다음과 같이 모든 시료에서 감한다:
활성 % = [(Si - B) / (S0 - B)] x 100
여기서 Si 는 기질, 효소와 억제제의 존재하의 신호이고, S0는 기질, 효소와 억제제가 용해되어 있는 매체의 존재하의 신호이고, B는 효소 없이 측정된 배경신호이다.
IC50값은 Graphpad Prism software를 사용하여, 가변성 경사도(화합물의 로그 농도에 대한 활성%)를 갖는 S형 투여량 반응에 대한 방정식으로 8가지 데이터 포인트의 결과를 맞춘 후 비-선형 회귀분석에 의하여 측정한다. 헬라 세포에서 유도된 조 핵 추출물로부터의 히스톤 탈아세틸라아제 활성은 선별용으로 사용된다. 4C(Seneffe, 벨지움)에서 구매한 제품은 지수 증식기에 있는 동안 수확된 헬라 세포를 제조한다. 핵 추출물은 J. D. Dignam, Nucl . Acid . Res ., 1983, 11, 1475-1489에 기술되어 있는 방법에 따라 제조하고 액체 질소에서 급동결하고 -80℃에서 저장한다. 최종 완충제 조성물은 20 mM Hepes, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.2 mM PMSF와 20 % (v/v) 글리세롤이다.
U937 과 HUT 세포 억제 분석
대수기에서 증식하는 암 세포계를 채취하여 1000-2000 세포/웰(100㎕ 최종 체적)로 96-웰 조직 배양 판에 접종한다. 24시간 후 증식세포를 화합물로 처리한다. 판을 72-96시간 더 재배양한 후 WST-1 세포 생존도 분석을 공급자(Roche Applied Science)지침에 따라 행한다.
데이터는 다음과 같이 억제제 없이 측정되는 억제 퍼센트로 표시한다:
억제 % = 100-[(Si / S0) x 100]
여기서 Si는 억제제 존재하의 신호이고 S0는 DSMO 존재하의 신호이다.
투여량 반응곡선은 6 복제물을 사용하여 8 농도(최상의 최종 농도 10㎛, 3-배 희석)를 나타낸다.
IC50값은 Graphpad Prism software를 사용하여 가변성 경사도(화합물의 로그 농도에 대한 활성%)를 갖는 S형 투여량 반응에 대한 방정식으로 결과를 맞춘 후, 비-선형 회귀분석에 의하여 측정한다.
p38 MAP 키나아제 효소 분석
p38 MAPα 키나아제 활성을 억제하는 화합물의 능력은 Upstate (Dundee 영국)에 의하여 실행되는 분석으로 측정한다. 25㎕의 최종 반응 체적으로, p38 MAP 키나아제α(5-10mU)를 25mM Tris pH 7.5, 0.02mM EGTA, 0.33mg/mL 미엘린 염기성 단백질, 10mM 초산 마그네슘과 [Y-33P-ATP] (비활성도, 약 500cpm/pmol, 요구되는 농도)에서 배양한다. 반응은 MgATP 혼합물을 첨가하여 개시한다. 실온에서 40분 동안 배양한 후, 5㎕의 3% 인산용액을 첨가하여 반응을 중지한다. 10㎕의 반응물로 P30 필터매트를 얼룩 지게하고 75mM 인산으로 5분 동안 3회 세척하고 메탄올로 한번 세척한 후 건조하고 섬광 계수한다. 중복 데이터 포인트는 1/3 로그희석시리즈의 DMSO에서의 모액에서 생긴다. 아홉 희석단계는 10㎛의 최상 농도로 이루어지고 '무화합물' 블랭크를 포함한다. 표준 방사측정 필터-결합분석은 km에서, 또는 이에 가까운 ATP 농도에서 실행한다. 섬광 계수에서 나온 데이터를 수집하고 Prism software로 자유-맞춤분석을 한다. 발생된 곡선으로부터 50%억제를 나타내는 농도를 측정하고 기록한다.
p38 MAP 키나아제 세포 분석- MAPKAP2 의 인산화 억제
U937 또는 HUT78 세포를 RPMI 1640에서 접종하고 18시간 동안 37℃로 5% CO2에서 배양한다. 10mM의 화합물 모액을 매체/0.1% DMSO로 희석하여 로그 또는 반-로그 희석 시리즈를 얻는다. '무 처리'와 '아니소마이신'용 웰을 0.1% DMSO으로만 처리한다. 세포를 4시간 동안 더 37℃로 5% CO2에서 배양한다. 아니소마이신을 10㎛의 최종 농도로 '무처리'를 제외한 모든 웰에 가한다. 세포를 30분 동안 37℃로 5% CO2에서 배양한 후 채취한다. 판을 채취하는 동안 얼음에 방치하고, 다음 모든 단계는 4℃에서 행한다. 세포를 4℃에서 10분 동안 1000rpm으로 펠릿화하고, 매체를 흡인하고, 펠릿을 냉PBS로 세척한다. 펠릿을 120㎕의 SDS용해완충제(62.5mM Tris, pH 6.8, 2% SDS, 10% 글리세롤, 50mM DTT, 단백질 분해효소억제제와 인산가수분해효소는 제조자의 권고에 따라 첨가된다.)얼음에서 30분 후, 시료를 5초 동안 음파처리한 후 10분 동안 4℃에서 13,000rpm으로 원심분리하여 세포 부스러기를 제거한다. 10㎕의 생성된 겔 시료를 NOVEX 4-12% Bis-Tris MOPS 겔 상에서 레인으로 적재한다. 겔의 웨스턴 전이에서 나온 막을 제조자의 지침에 따라 안티-포스포 MAPKAP2, 안티-포스포 HSP27과 안티 GAPDH로 얼룩지게 한다. 신호를 HRP-연결 항-토끼 또는 항-생쥐 항체(ECL시약과 ECL필름)를 사용하여 가시화한다. 여러 가지 화합물에 대한 IC50 값은 두 띠-이동과 신호 강도를 사용하여 생성한 사진 영상으로 가시화한다.
THP -1 세포의 LPS -자극
THP-1 세포를 V-바닥 96 웰 조직 배양 처리 판에서 4×104세포/웰의 밀도로 100㎕로 접종하고 16시간 동안 37℃로 5% CO2에서 배양한다. 100㎕의 조직 배지에 억제제 첨가 2시간 후 세포를 1㎍/mL의 최종 농도에서 LPS(E coli 균주 005:B5, 시그마)로 자극하고 6시간 동안 37℃로 5% CO2에서 배양한다. 샌드위치 ELISA (R&D Systems #QTA00B)에 의하여 세포-유리 상청액으로 TNF-α수준을 측정한다.
HCE -1 카르복실에스테라아제 분석
hCE-1에 의한 해당 카르복실산으로의 에스테르 가수분해는 다음 공정을 사용하여 측정할 수 있다. 영 시간에, 인산염 분석 완충제(K2PO4 100mM, KCl 40mM, pH 7.4)에서 6㎍/mL의 농도로 100㎕의 재조합 hCE-1을 5㎛에스테르 기질을 함유하는 동일한 체적의 분석 완충제에 가한다. 완전하게 혼합한 후, 삼중의 시료를 37℃에서 0,20 또는 80분 동안 배양한다. 적당한 시간에 600㎕의 아세토니트릴을 가하여 가수분해를 중지한다. 영 시간 시료에 아세토니트릴을 가한 후 효소를 가한다. LCMS (Sciex API 3000, HP1100 이중 펌프, CTC PAL)에 의하여 실온에서 에스테르와 이의 해당 카르복실산에 대하여 시료를 분석한다. 크로마토그래피는 MeCN (75 x 2.1mm) 컬럼과 물/0.1% 포름산에서 5-95% 아세토니트릴의 이동 상을 기본으로 한다. 80분 후, 산의 수준, 가수분해 생성물을 ng/mL로 표시한다.
파괴 세포 카르복실에스테라아제 분석
에스테르가 본 발명에 따라서 접합하는 본 발명의 어떠한 정해진 화합물을 시험하여 다음 분석에서 시험에 따라, 세포 내 에스테라아제에 의하여 가수분해되는 요구조건을 충족하는지 여부를 측정할 수 있다.
세포 추출물의 제조
U937 또는 HCT 116 종양 세포(~109)를 4체적의 Dulbeccos PBS(~1리터)로 세척하고 4℃에서 10분 동안 525g로 펠릿화한다. 이를 두 번 반복하고 최종 세포 펠릿을 35mL의 냉 균질화 완충제(Trizma 10 mM, NaCl 130 mM, CaCl2 0.5 mM pH 7.0, 25℃)에 재-현탁시킨다. 균질화물은 질소 공동화(4℃에서 50분 동안 700 psi)에 의하여 제조한다. 균질화물은 얼음에서 유지하고 다음 최종 농도로 억제제의 칵테일로 보충한다.
류펩틴 1μM
아프로티닌 0.1μM
E64 8μM
펩스타틴 1.5μM
베스타틴 162μM
키모스타틴 33μM
10분 동안 525g으로 원심분리하여 세포 균질화물을 정화한 후, 생성된 상정액을 에스테라아제 활성의 공급원으로 사용하고 요구될 때까지 80℃에서 저장한다.
에스테르 분할의 측정
해당 카르복실산으로 에스테르의 가수분해는 상기에서 제조한 세포추출물을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 효과를 위하여 세포 추출물(~30㎍/0.5 mL의 전체분석체적)을 Tris- HCl 25 mM, 125 mM NaCl 완충제, pH 7.5, 25℃에서 37℃로 배양한다. 영시간에 에스테르(기질)를 2.5μM의 최종농도로 가한 다음 시료를 적당한 시간(통상 0 또는 80분)동안 37℃에서 배양한다. 3 ×체적의 아세토니트릴을 가하여 반응을 중지한다. 영시간 시료에 에스테르 화합물전에 아세토니트릴을 가한다. 5분 동안 12000g으로 원심분리한 후, LCMS(Sciex API 3000, HP1100 이중 펌프, CTC PAL)에 의하여 실온에서 에스테르와 이의 해당 카르복실산에 대하여 실온에서 시료를 분석한다. 크로마토그래피는 MeCN (75 x 2.1mm)컬럼과 물/0.1% 포름산에서 5-95% 아세토니트릴의 이동 상을 기본으로 한다. 가수분해율은 pg/mL/min으로 표시한다.
세포 축적 분석
세포(8×104/mL)를 5% (v/v) CO2 -가습 분위기하에 6μM 화합물을 함유하는 배지로 37℃에서 배양한다. 4℃에서 5분 동안 300g으로 25mL 분취량의 세포 현탁액을 원리분리한 6시간 후 배양을 종료한다. 배지 상청액의 0.2mL 시료를 4체적의 아세토니트릴(Sigma-Aldrich)에 가한다. 상청액을 제거한 후, 남은 세포 펠릿(2×106세포)을 1mL의 아세토니트릴로 추출한다. LC/MS/MS (Sciex API3000)에 의하여 실온에서 에스테르와 산 대사물질에 대하여 시료를 분석한다. 크로마토그래피는 5-95%
(v/v) 아세토니트릴, 0.1% (v/v) 포름산 이동 상과 MeCN (75 x 21mm) 컬럼을 기본으로 한다. 영시간 시료에 있어서 에스테르를 가한 다음 기술한 아세토니트릴로 추출한 후 즉시 세포 현탁액을 냉각하여 원심분리한다. 세포의 수준은 ng/mL로 표시한다.
Figure pct00044
Figure pct00045
표 1
표 1은 모 화합물(화합물 I)에 대한 효소분석에서 실시예 1의 산이 비슷한 IC50을 가짐을 나타낸다: 효소에 결합을 나타내는(WO 03/076405)는 에스테라아제 모티프의 결합에 의하여 파괴되지 않는다. 예를 들어 실시예 1의 이치환 화합물은 hCE-1에 의하여 가수분해되며 따라서 산은 세포에 축적된다. 이러한 산의 축적은 세포분석에서의 모 화합물보다 훨씬 더 효능이 큰 실시예 1의 결과를 가져온다. 이들 데이터는 에스테라아제 모티프의 결합과 해당 산의 세포 내 축적 결과에 의하여 성취될 수 있는 강력한 장점을 나타낸다.
Figure pct00046
표 2
표 2는 모 화합물(화합물 I)은 단핵세포와 비-단핵세포계에서 동일한 효능을 나타내는 반면에 실시예 1과 3은 단핵 세포계에서 100배 더 큰 효능을 가짐을 나타낸다. 실시예 1만이 단핵 세포계에서만 분열하는 에스테라아제 모티프의 결합에 의하여 세포 선택성이 성취됨을 나타내는 단핵 세포계에서 축적한다.
Figure pct00047
표 3
표3은 C-결합 디알킬 화합물(실시예 5)은 대식세포 선택성을 갖는 반면에 모 화합물(화합물 II;WO 03/076405)과 아미노산 유도체의 알파 탄소에서 알킬기를 갖지 않는 (화합물 III;WO 2007/129036)은 그렇지 않음을 나타낸다. 이것은 대식세포 선택성은 아미노산 에스테르 모티프의 알파 탄소에서 제이치환기를 도입하므로서 성취될 수 있음을 예시한 것이다.
Figure pct00048
표 4
표 4는 실시예 7과 9의 산이 모 화합물(화합물 IV)에 대한 효소 분석에서 유사한 IC50을 가짐을 나타내며; 효소에 결합은 에스테라아제 모티프의 결합에 의하여 파괴되지 않음을 나타낸다. 예를 들어 실시예 7의 이치환 화합물은 hCE-1에 의하여 가수분해되고 따라서 산은 단핵세포에 축적된다. 이러한 산의 축적은 세포분석에서의 모 화합물보다 훨씬 더 효능이 큰 실시예 7과 9의 결과를 가져온다. 이들 데이터는 에스테라아제 모티프의 결합에 의하여 성취될 수 있는 강력한 장점을 나타낸다.
Figure pct00049
표 5
표 5는 모 화합물(화합물 IV)이 단핵세포(U937)와 비-단핵세포(Hut78)세포계에서 유사한 효능을 갖는 반면에 실시예 7과 9는 비-단핵세포계 보다 단핵세포계에서 30배 이상의 효능을 가짐을 나타낸다. 이것은 아미노산 모티프의 알파 위치에서 제이치환기가 화합물에서 대식세포선택성을 제공함을 예시한 것이다.

Claims (13)

  1. α,α-이치환 글리신 에스테르와 표적세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 조절체의 공유결합 접합체: 이때,
    접합체의 에스테르기는 하나 이상의 세포 내 카르복실에스테라아제 효소에 의하여 해당 산으로 가수분해할 수 있고;
    α,α-이치환 글리신 에스테르는 억제제와 표적 효소 또는 수용체 사이의 결합계면에서 떨어진 위치에서 조절체에 접합된다.
  2. α,α-이치환 글리신 에스테르와 표적세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 조절체의 공유결합 접합체: 이때,
    접합체의 에스테르기는 하나 이상의 세포 내 카르복실에스테아제 효소에 의하여 해당 산으로 가수분해할 수 있고;
    α,α-이치환 글리신 에스테르는 접합된 조절체와 해당 산의 표적효소 또는 수용체로의 결합형태가 비접합된 조절체의 것과 동일하도록 조절체에 접합된다.
  3. 억제제와 표적효소 또는 수용체 사이의 결합 계면에서 떨어진 위치에서 α,α-이치환 글리신 에스테르의 공유결합에 의하여 조절체를 구조적으로 수정하고, 접합체의 에스테르기가 하나 이상의 세포 내 카르복실에스테라아제 효소에 의하여 해당 산으로 가수분해할 수 있는 것을 포함하는 표적세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 조절체의 세포 내 효능 및/또는 체류시간을 증가 또는 연장시키는 방법.
  4. 접합된 조절체와 해당 산의 표적 효소 또는 수용체로의 결합 형태가 비접합된 조절체의 것과 동일하도록 α,α-이치환 글리신 에스테르의 공유결합에 의하여 조절체를 구조적으로 수정하고, 접합체의 에스테르기가 하나 이상의 세포 내 카르복실에스테라아제 효소에 의하여 해당 산으로 가수분해할 수 있는 것으로 이루어지는 표적 세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 조절체의 세포 내 효능 및/또는 체류시간을 증가 또는 연장시키는 방법.
  5. 전술한 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 조절체에 접합되는 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기는 페닐 및 식 -CRaRbRc의 기에서 독립적으로 선택되는 접합체 또는 방법:
    상기 식에서,
    각 Ra, Rb와 Rc는 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C2-C6)알킨일, 페닐(C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬이거나; 또는
    Rc는 수소이고 Ra 및 Rb는 각각 페닐, 또는 피리딜과 같은 헤테로아릴이거나; 또는
    Rc는 수소, (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C2-C6)알킨일, 페닐(C1-C6)알킬, 또는 (C3-C8)시클로알킬이고, Ra 및 Rb는 이들이 결합되는 탄소원자와 함께 3~8 원환 시클로알킬 또는 5~6 원환 헤테로환식 고리를 형성하거나; 또는
    Ra, Rb와 Rc는 이들이 결합되는 탄소원자와 함께 삼환식 고리(예를 들어, 아다만틸)를 형성하거나; 또는
    Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C2-C6)알킨일, 페닐(C1-C6)알킬, 또는 수소 이외의 하기 Rc에 대하여 정의한 기이거나, 또는 Ra 및 Rb는 이들이 결합되는 탄소원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로환식 고리를 형성하고, Rc는 수소, -OH, -SH, 할로겐, -CN, -CO2H, (C1-C4)퍼플루오로알킬, -CH2OH, -O(C1-C6)알킬, -O(C2-C6)알켄일, -S(C1-C6)알킬, -SO(C1-C6)알킬, -SO2(C1-C6)알킬, -S(C2-C6)알켄일, -SO(C2-C6)알켄일, -SO2(C2-C6)알켄일 또는 -Q-W 기이고, 이 기에서 Q는 결합 또는 -O-, -S-, -SO- 또는 -SO2-를 나타내고 W는 페닐, 페닐알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C3-C8)시클로알킬알킬, (C4-C8)시클로알켄일, (C4-C8)시클로알켄일알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬기를 나타내고, 상기 W기는 히드록실, 할로겐, -CN, -CONH2, -CONH(C1-C6)알킬, -CONH(C1-C6알킬)2, -CHO, -CH2OH, (C1-C4)퍼플루오로알킬, -O(C1-C6)알킬, -S(C1-C6)알킬, -SO(C1-C6)알킬, -SO2(C1-C6)알킬, -NO2, -NH2, -NH(C1-C6)알킬, -N((C1-C6)알킬)2, -NHCO(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C2-C6)알킨일, (C3-C8)시클로알킬, (C4-C8)시클로알켄일, 페닐 또는 벤질로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의하여 임의로 치환될 수 있다.
  6. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 조절체에 접합되는 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기는 그 자체 α-탄소와 함께 3-6 원환 포화 시클로알킬 또는 헤테로시클일 고리를 형성하거나; 또는 상기 α-치환기 중의 적어도 하나가 C1-C6 알킬 치환기인 접합체 또는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 조절체에 접합된 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기 중 하나가 C1-C6알킬 치환기이고, 다른 하나는 메틸, 에틸, n-및 이소-프로필, n-, sec-와 tert-부틸, 페닐, 벤질, 티엔일, 시클로헥실 및 시클로헥실메틸에서 선택되는 접합체 또는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 조절체에 접합된 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기 중 하나가 메틸이고, 다른 하나가 메틸, 에틸 또는 n-또는 이소-프로필이거나; 또는 이 α-치환기가 이들에 결합되는 탄소와 함께 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실 고리를 형성하는 접합체 또는 방법.
  9. 전술한 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    α,α-이치환 글리신 에스테르가 α,α-이치환 글리신 에스테르의 아미노기를 통하여 상기 조절체에 공유결합으로 접합되는 접합체 또는 방법.
  10. 전술한 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    α,α-이치환 글리신 에스테르가 α,α-이치환 글리신 에스테르의 α-치환기들 중 하나를 통하여 상기 조절체에 공유결합으로 접합 되는 접합체 또는 방법.
  11. 전술한 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 에스테르가 hCE-2 또는 hCE-3를 함유하나 hCE-1은 함유하지 않는 세포에 관계하는 세포 내 카르복실에스테라아제 효소 hCE-1을 함유하는 세포에 의하여 해당 α,α-이치환 글리신 접합체로 선택적으로 가수분해할 수 있는 접합체 또는 방법.
  12. 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 의한 접합체와 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  13. 표적세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 소정 조절체의 α,α-이치환 글리신 에스테르의 공유결합 접합체를 식별하고 이 접합체는 상기 소정의 조절체와 관련하여 증가 또는 연장된 세포 효능을 갖는 방법에 있어서,
    (i) 표적세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 소정의 조절체 상, 또는 표적효소 또는 수용체와 동일한 결합형태를 공유하는 표적세포 내 효소 또는 수용체의 활성을 갖는 복수의 소정 조절체 상의 위치 또는 위치들을 식별하고, 이 위치 또는 위치들은 조절체와 표적효소 또는 수용체 사이의 결합 계면에서 떨어져 있고;
    (ii) α,α-이치환 글리신 에스테르기, 또는 (i)에서 식별된 하나 이상의 위치에서 소정 범위의 다른 α,α-이치환 글리신 에스테르기의 결합에 의하여 조절체를 공유결합으로 수정하고;
    (iii) (ii)에서 제조된 알파 아미노산-접합 조절체를 시험하여 표적효소 또는 수용체에 대한 그의 활성을 측정하고;
    (iv) (iii)에서 얻은 데이터로부터, 세포 내 효소 또는 수용체 활성의 조절을 야기하고 세포 내에서 해당 카르복실산으로 변환되고 축적되며, 증가 또는 연장된 세포 효능을 나타내는 하나 이상의 상기 시험된 소정 조절체의 α,α-이치환 글리신 에스테르-접합 변형체를 선택하는 것을 포함하는 방법.
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