EA019673B1 - Радиоактивно меченные pde10 лиганды - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к новым селективным радиоактивно меченным PDE10 лигандам, которые являются полезными для визуализации и количественного определения PDE10A фермента в тканях с использованием позитрон-эмиссионной томографии (PET). Изобретение также направлено на композиции, содержащие такие соединения, на способы получения таких соединений и композиций и на применение таких соединений и композиций для получения изображения ткани, клеток или организма in vitro или in vivo.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым селективным радиоактивно меченным ΡΌΕ10 лигандам, которые являются полезными для визуализации и количественного определения ΡΌΕ10Ά фермента в тканях с использованием позитрон-эмиссионной томографии (ΡΕΤ). Настоящее изобретение также направлено на композиции, содержащие такие соединения, на способы получения таких соединений и композиций, и на применение таких соединений и композиций для получения изображения ткани, клеток или организма ίη νίίτο или ίη νίνο.

Предпосылки создания изобретения

Фосфодиэстеразы (ΡΌΕ) представляют собой семейство ферментов, кодируемых 21 геном и подразделяющееся на 11 отдельных семейств в соответствии со структурными и функциональными свойствами. Эти ферменты метаболически инактивируют широко распространенные внутриклеточные вторичные мессенджеры, 3',5'-циклический аденозинмонофосфат (сАМР) и 3',5'-циклический гуанозинмонофосфат (εΟΜΡ). Эти два мессенджера регулируют множество различных биологических процессов, включая продукцию и действие провоспалительного медиатора, функцию ионных каналов, мышечное сокращение, способность к обучению, дифференциацию, апоптоз, липогенез, гликогенолиз и глюконеогенез. Они делают это путем активации протеинкиназы А (ΡΚΑ) и протеинкиназы С (ΡΚΟ), которые, в свою очередь, фосфорилируют различные субстраты, включая факторы транскрипции и ионные каналы, которые регулируют бесчисленное количество физиологических ответов. В нейронах это включает активацию сАМР и с^МБ-зависимых киназ и последующее фосфорилирование белков, вовлеченных в острую регуляцию синаптической трансмиссии, а также в дифференциацию и выживание нейронов. Внутриклеточные концентрации сАМР и сСМГ строго регулируются скоростью биосинтеза посредством циклаз и скоростью расщепления посредством ΡΌΕ. ΡΌΕ представляют собой гидролазы, которые инактивируют сАМР и сСМГ путем каталитического гидролиза З'-сложноэфирной связи, образуя неактивный 5'-монофосфат (схема 1).

Схема 1

сАМР Х=ЫН_г, Υ=Η 5'АМР/СМР сОМР х= =о, υ=νη₂

На основании специфичности в отношении субстрата ΡΌΕ семейства можно разделить на три группы: ί) сАМР-специфические ΡΌΕ, которые включают ΡΌΕ4, -7 и -8; ίί) сСΜΡ-селективные ферменты ΡΌΕ5 и -9 и ш) имеющие два субстрата ΡΌΕ, ΡΌΕ1, -2 и -3, а также ΡΌΕ10 и -11. Об открытии фосфодиэстеразы 10А (ΡΌΕ10Α) сообщалось в 1999 году. Из всех 11 известных ΡΌΕ семейств ΡΌΕ10Α имеет наиболее ограниченное распределение с высокой экспрессией только в головном мозге и мужской половой железе. В головном мозге мРНК и белок ΡΌΕ10Α высокоэкспрессируются в полосатом теле. Такое уникальное распределение ΡΌΕ10Α в головном мозге, вместе с его возросшими фармакологическими характеристиками, указывает на потенциальное использование ингибиторов ΡΌΕ10Α для лечения неврологических и психиатрических расстройств, таких как шизофрения.

Позитрон-эмиссионная томография (ΡΕΤ) представляет собой неинвазивный метод визуализации, который предлагает наибольшее пространственное и временное разрешение из всех методов ядерной визуализации, и обладает дополнительным преимуществом, поскольку делает возможным действительное количественное определение концентрации радиоактивного индикатора в тканях. В этом методе ис15 13 11 18 пользуют позитрон-испускающие радионуклиды, такие как, например, О, Ν, С и Р, для детекции.

В \νϋ 2006/072828 (ΡΠ/ег) раскрыты гетероароматические хинолиновые соединения в качестве селективных ингибиторов ΡΌΕ10. В νθ-2007/129183 (ΡΓί/сг) раскрыты бициклические гетероарильные соединения в качестве ингибиторов ΡΌΕ10.

Ζΐιιιάο Ти с1 а1. описали |С|-папаверин в качестве радиоактивного индикатора для ΡΕΤ для визуализации ΡΌΕ10Α (М.1с1еаг МсФс1пс апб Βίοίοβν. 37, 509-516, 2010) и сделали заключение, что он не является идеальным радиолигандом для клинической визуализации ΡΌΕ10Α в центральной нервной системе. Существует мнение, что необходимы аналоги, обладающие более высокой селективностью в отношении ΡΌΕ10Α по сравнению с ΡΌΕ3 и улучшенными фармакокинетическими свойствами.

В νθ 2010/097367 раскрыты радиоактивно меченные хинолиновые соединения, например 2-{4-[1(2-[¹⁸Р]фторэтил)-4-пиридин-4-ил-1Н-пиразол-3-ил]феноксиметил}хинолин, полезные в качестве ΡΌΕ10Α лигандов.

- 1 019673

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к соединению, имеющему формулу (I)

или его стереоизомерной форме, где

Кд представляет собой 2-фторэтил, 2,2,2-трифторэтил или 3-фторпропил; правей 1, 2 или 3;

каждый В₂ независимо представляет собой С1_₃алкил, цикло пропил, галогенС] .залкилокси, галоген, трифторметил, трифторметокси, дифторметокси или циано, где по меньшей мере один Е представляет собой [¹⁸Е], или к его сольвату или его солевой форме.

Настоящее изобретение также относится к соединениям-предшественникам для синтеза соединений форммулы (I), как определено выше, где указанные соединения имеют формулу (VI)

или к их стереоизомерной форме, где ш равен 1 или 2;

правей 1, 2 или 3;

каждый Р₂ независимо представляет собой С1.₃алкил, цикло пропил, галогенС1.₃алкилокси, галоген, трифторметил, трифторметокси, дифторметокси или циано, или к их сольвату или солевой форме.

Настоящее изобретение также относится к ссылочным соединениям, соответствующим [¹⁹Р]соединениям формулы (I).

Иллюстративной для настоящего изобретения является стерильная композиция, содержащая соединение формулы (I), как описано в настоящем описании, растворенное в подходящем составе.

Иллюстративным для настоящего изобретения является применение соединения формулы (I), как описано в настоящем описании, для получения или способ получения изображения ткани, клеток или организма ίη νίίτο или ίη νίνο.

Также иллюстративным для настоящего изобретения является способ получения изображения ткани, клеток или организма, включающий контактирование с тканью, клетками или организмом, или введение в ткань, клетки или в организм соединения формулы (I), как описано в настоящем описании, и получение изображения ткани, клеток или организма с использованием системы визуализации методом позитрон-эмиссионной томографии.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы (I), как описано в настоящем описании, включающему стадию взаимодействия соединения формулы (V), как описано в настоящем описании, с ^ПСН31 или ^ПСН3ОТ1 в присутствии основания в инертном растворителе.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение направлено на соединения формулы (I), как определено выше, и их фармацевтически приемлемые сольваты и солевые формы. Настоящее изобретение, кроме того, направлено на соединения-предшественники формулы (VI).

В одном варианте осуществления (2, представляет собой 2-фторэтил.

В другом варианте осуществления Р₂ представляет собой 6-метил, 3,5-диметил или 5-метокси.

В предпочтительном варианте осуществления соединение формулы (I) представляет собой 2-[[4-[1(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-7Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-3,5-диметилпиридин-сукцинат (В-3).

Соединения формулы (I) и композиции, содержащие соединения формулы (I), можно использовать для получения изображения ткани, клеток или организма ίη νίίτο или ίη νίνο. В частности, настоящее изобретение относится к способу визуализации или количественного определения ΡϋΕΙΟΑ в ткани, клетках или в организме ίη νίίτο или ίη νίνο.

Клетки и ткани предпочтительно представляют собой клетки и ткани центральной нервной системы, в которых ΡϋΕΙΟΑ присутствует в большом количестве. Как уже было сказано, ΡϋΕΙΟΑ присутству ет в большом количестве в тканях центральной нервной системы, более конкретно, в ткани центральной нервной системы, образующей головной мозг; еще более конкретно, образующей полосатое тело.

Когда способ осуществляют ίη νίνο, организмом является млекопитающее. В таких конкретных случаях соединение формулы (I) вводят внутривенно, например путем инъекции через шприц или с использованием периферийной внутривенной линии, такой как короткий катетер.

Когда организмом является человек, соединение формулы (I) или стерильную композицию, содержащую стерильный солевой раствор соединения формулы (I), можно, в частности, вводить путем внутривенного введения в руку, в любую определяемую вену, в частности в тыльную сторону ладони или в среднюю локтевую вену около локтя.

Таким образом, в конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения изображения ткани или клетки у млекопитающего, включающему внутривенное введение млекопитающему соединения формулы (I), как определено в настоящем описании, или композиции, содержащей соединение формулы (I), и получение изображения ткани или клетки с использованием системы визуализации методом позитрон-эмиссионной томографии.

Таким образом, в следующем конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения изображения ткани или клетки человека, включающему внутривенное введение человеку соединения формулы (I), как определено в настоящем описании, или композиции, представляющей собой стерильный солевой раствор, содержащий соединение формулы (I), и получение изображения ткани или клетки с использованием системы визуализации методом позитрон-эмиссионной томографии.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу визуализации или количественного определения ΡΌΕ10Ά у млекопитающего, включающему внутривенное введение млекопитающему соединения формулы (I) или композиции, содержащей соединение формулы (I), и получение изображения с использованием системы визуализации методом позитрон-эмиссионной томографии.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) для получения изображения ткани, клеток или организма ίη νίίτο или ίη νίνο, или настоящее изобретение относится к соединению формулы (I), применяемому для получения изображения ткани, клеток или организма ίη νίίτο или ίη νίνο с использованием позитрон-эмиссионной томографии.

Определения

С_1-3алкил, отдельно или в сочетании с другими терминами, означает линейную или разветвленную насыщенную алкильную группу, содержащую 1, 2 или 3 атомов углерода, например метил, этил, 1пропил и 2-пропил.

Как он используется в настоящем описании, термин композиция охватывает продукт, содержащий указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любой продукт, который является результатом, прямым или косвенным, комбинации указанных ингредиентов в указанных количествах.

Термин стереоизомерные формы, как он используется в настоящем описании выше или далее, означает все возможные стереоизомерные формы, которые могут иметь аддитивные соли соединений формулы (I) и их аддитивные соли. Если не оговорено или не указано иное, химическое название соединений означает смесь всех возможных стереохимически изомерных форм.

Приемлемые соли соединений формулы (I) представляют собой такие, в которых противоион является фармацевтически приемлемым. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, также могут найти применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения. Все соли, являются они фармацевтически приемлемыми или нет, включены в объем настоящего изобретения. Фармацевтически приемлемые соли определены как включающие терапевтически активные нетоксичные кислотно-аддитивные солевые формы, которые могут образовывать соединения формулы (I). Указанные соли можно получить путем обработки основной формы соединений формулы (I) подходящими кислотами, например неорганическими кислотами, такими как галогеноводородные кислоты, в частности хлористо-водородной кислотой, бромисто-водородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой и фосфорной кислотой; органическими кислотами, например уксусной кислотой, оксиуксусной кислотой, пропановой кислотой, молочной кислотой, пировиноградной кислотой, щавелевой кислотой, малоновой кислотой, янтарной кислотой, малеиновой кислотой, фумаровой кислотой, яблочной кислотой, винной кислотой, лимонной кислотой, метансульфоновой кислотой, этансульфоновой кислотой, бензолсульфоновой кислотой, п-толуолсульфоновой кислотой, цикламиновой кислотой, салициловой кислотой, п-аминосалициловой кислотой и памовой кислотой.

И наоборот, указанные солевые формы можно преобразовать в форму свободного основания путем обработки подходящим основанием.

Термин организм относится к млекопитающему, в частности к человеку, крысам, мышам, собакам.

Термин клетка относится к клетке, экспрессирующей или содержащей ΡΌΕ10Ά фермент.

Пиридиновые соединения по настоящему изобретению структурно отличаются от соединений предшествующего уровня техники, которые неизменно включают гетероароматическую бициклическую

- 3 019673 группу. Функционально они отличаются тем, что они имеют уменьшенную липофильность, и поэтому они демонстрируют меньшее неспецифическое связывание с белками и жирами головного мозга, что делает их более привлекательными в качестве потенциальных РЕТ радиолигандов. При сравнении с 2-{4[1-(2-[¹⁸Е]фторэтил)-4-пиридин-4-ил-1Н-пиразол-3-ил]феноксиметил}хинолином соединения по настоящему изобретению имеют более быструю кинетику, что обеспечивает меньшее время обнаружения в клиническом применении для получения показателей устойчивого объема распределения и достижение более высоких отношений полосатое тело-к-мозжечку, давая более высокое качество ίη νίνο визуализации и более точное количественное определение потенциала связывания ΡΌΕ10Α.

Получение

Соединения согласно настоящему изобретению, как правило, могут быть получены путем осуществления последовательных стадий, каждая из которых известна специалистам в данной области. В частности, соединения можно получить согласно следующим способам синтеза.

А. Получение конечных соединений.

Соединения формулы (I) в их не меченной радиоактивным изотопом форме можно получить способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области. Соединения по настоящему изобретению могут быть получены, например, тремя разными общими способами.

Способ А.

Следующая последовательность реакций показана на схеме 2.

Таким образом, соединение формулы (II) может быть подвергнуто взаимодействию с коммерчески доступным агентом алкилирования формулы (III), где Ζ представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как галоген, например бром или йод, в присутствии подходящего основания, такого как карбонат цезия или карбонат калия, в инертном растворителе, таком как, например, диметилформамид, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при 100-150°С, с использованием обычного нагревания или в условиях микроволнового облучения, в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно 10-20 мин в микроволновой печи. Реакция алкилирования обычно дает смесь двух возможных региоизомеров, образованных в результате алкилирования по обоим атомам азота пиразольного кольца, которые можно разделить хроматографическими методами, либо при помощи колоночной хроматографии, либо ВЭЖХ.

Альтернативно, Ζ может представлять собой гидроксильную группу, в этом случае, взаимодействие с соединением (II) можно осуществить с использованием традиционных условий Мицунобу, которые хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, соединение (II) может быть подвергнуто взаимодействию с соединением (III), где Ζ представляет собой гидроксил-, в присутствии диэтил-, ди-трет-бутил- или диизопропилазодикарбоксилата и трифенилфосфина, в инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при 120°С, в условиях микроволнового облучения, в течение подходящего периода времени, позволяющего полностью завершить реакцию, обычно 20 мин. Реакция Мицунобу обычно дает смесь двух возможных региоизомеров, образованных в результате алкилирования по обоим атомам азота пиразольного кольца, которые можно разделить хроматографическими методами, либо при помощи колоночной хроматографии, либо ВЭЖХ.

Способ В.

Альтернативно, соединения формулы (I) также можно получить через последовательность реакций, показанную на схеме 3.

Следовательно, соединение формулы (IV) может быть подвергнуто взаимодействию с соединением формулы (V) с использованием традиционных условий Мицунобу, которые хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, соединение (IV) может быть подвергнуто взаимодействию с соединением (V) в присутствии диэтил-, ди-трет-бутил- или диизопропилазодикарбоксилата и трифенилфосфина, в инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, при перемешивании реакци

- 4 019673 онной смеси при подходящей температуре, обычно при 120°С, в условиях микроволнового облучения, в течение подходящего периода времени, позволяющего полностью завершить реакцию, обычно 15-20 мин. Соединения формулы (V) либо являются коммерчески доступными, либо они описаны в химической литературе, и они могут быть получены по стандартным методам синтеза, хорошо известным специалистам в данной области.

Способ С.

Альтернативно, соединения формулы (I), где Я₁ представляет собой 2-фторэтил или 3-фторпропил, также можно получить через последовательность реакций, как показано на схеме 4.

Схема 4

т = 1,г

Следовательно, в соединении формулы (VI) гидроксильная группа может быть преобразована в подходящую удаляемую группу ЬО, такую как метансульфонат или тозилат, способами, хорошо известными специалистам в данной области, с получением промежуточного соединения формулы (VII). Затем удаляемая группа может быть замещена фтором с использованием стандартных способов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как, например, взаимодействие с тетрабутиламмонийфторидом в инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при 70°С, в условиях микроволнового облучения, в течение подходящего периода времени, позволяющего полностью завершить реакцию, обычно 10 мин. Альтернативно, соединения формулы (I) также можно получить путем непосредственного взаимодействия промежуточного соединения формулы (VI) с агентом фторирования, таким как, например, трифторид (Ы,Х-диэтиламино)серы (ΌΑ8Τ), с использованием известных в данной области методик.

Включение радиоактивных атомов фтора в боковую цепь В₁ соединений формулы (I), где Я₁ представляет собой 2-фторэтил или 3-фторпропил, можно осуществить с использованием методик, известных в данной области, например, путем взаимодействия подходящего предшественника формулы (VII) с нуклеофильным радиоактивным фторирующим реагентом, таким как К[¹⁸Р]/Кгур1ойх® 222 или соли тетраалкиламмония, включающие радиоактивный фторид, в инертном растворителе, таком как, например, диметилформамид, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, с использованием обычного нагревания или в условиях микроволнового облучения, в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции.

Альтернативно, включение радиоактивного фтора также можно осуществить путем реакции алкилирования промежуточного соединения формулы (II) с использованием либо 1-бром-2-[¹⁸Р]фторэтана, либо 1-бром-3-[¹⁸Р]фторпропана, в присутствии основания, такого как, например, карбонат цезия, в инертном растворителе, таком как, например, диметилформамид, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, с использованием обычного нагревания или в условиях микроволнового облучения, в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно 15 мин при 90°С с использованием обычного нагревания. В этом случае, желаемое радиоактивно меченное соединение (I) можно отделить от другого радиоактивно меченного региоизомера и от непрореагировавшего предшественника при помощи ВЭЖХ.

Включение либо радиоактивных атомов углерода, либо радиоактивных атомов фтора в группы заместителей К.₂ соединений формулы (I) также можно осуществить с использованием радиохимических методов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, [^пС]метоксигруппа может быть включена путем взаимодействия подходящего предшественника формулы (I), где один К2 представляет собой ОН, с [¹¹С]СΗзI или |С|СН3ОТГ в присутствии основания, такого как, например, карбонат цезия, в инертном растворителе, таком как, например, диметилформамид, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре с использованием обычного нагревания, в течение подходящего периода времени, позволяющего полностью завершить реакцию. Включение радиоактивного атома фтора в К.₂ можно осуществить, например, путем взаимодействия подходящего предшественника формулы (I), где один К.₂ представляет собой нитрогруппу, хлор или бром в положении либо 4, либо 6 пиридинильного кольца, с нуклеофильным радиоактивным фторирующим реагентом, таким как К[¹⁸Р]/Кгур1ойх® 222, в инертном растворителе, таком как, например, диметилформамид, диметилсульфоксид или ацетонитрил, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре с использованием обычного нагревания или в условиях микроволнового облучения, в течение времени, необходимого для достиже ния полного завершения реакции.

Преобразования различных функциональных групп, присутствующих в конечных соединениях, в другие функциональные группы формулы (I), можно осуществить способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области. Таким образом, например, соединение формулы (I), где К.₂ представ

- 5 019673 ляет собой атом брома, может быть подвергнуто взаимодействию с метиловым эфиром (фторсульфонил)дифторуксусной кислоты в присутствии иодида меди в инертном растворителе, таком как, например, диметилформамид, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при 120°С, с использованием обычного нагревания или в условиях микроволнового облучения, в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно 2 ч при обычном нагревании, с получением соединения формулы (I), где В₂ представляет собой трифторметил. В другом примере, соединение формулы (I), где В₂ представляет собой атом брома, может быть подвергнуто взаимодействию с алкил- или циклоалкилбороновой кислотой, в присутствии подходящего основания, такого как, например, водный раствор карбонат натрия, и катализатора на основе комплекса палладия, такого как, например, тетракис(трифенилфосфин)палладий(0), в инертном растворителе, таком как, например, диоксан, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре с использованием обычного нагревания или в условиях микроволнового облучения, в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно 15 мин при 130°С в микроволновой печи, с получением соединения формулы (I), где В₂ представляет собой С_1-3алкил или циклопропил.

В. Получение промежуточных соединений.

Промежуточные соединения формулы (II) могут быть получены способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области, например путем осуществления последовательности реакций, как показано на схеме 5, которая основана на способе, описанном в 1. Меб. Сйет., 2009, 52 (16), 51885196.

Схема 5

Следовательно, соединение формулы (VIII) может быть подвергнуто взаимодействию с избыточным количеством коммерчески доступного диметоксиметилдиметиламина при перемешивании реакционной смеси при температуре кипения с обратным холодильником в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно в течение 1 ч. После упаривания досуха полученный остаток можно обработать гидразингидратом в метаноле при перемешивании реакционной смеси при температуре кипения с обратным холодильником в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно в течение 1 ч.

Промежуточные соединения формулы (VIII) можно получить путем последовательного осуществления трехстадийной реакции, по существу, следуя способу синтеза, аналогично описанному в I. Меб. Сйет., 2009, 52 (16), 5188-5196, как показано на схеме 6.

Схема 6

Следовательно, соединение формулы (IX) может быть подвергнуто взаимодействию сначала с тионилхлоридом для образования соответствующего ацилхлорида, а затем ίη δίΐιι с Ο,Νдиметилгидроксиламином в присутствии подходящего основания, такого как, например, триэтиламин, в инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, при перемешивании реакционной смеси при комнатной температуре в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно от 6 до 18 ч. Полученный, таким образом, №метокси-№метилбензамид затем может быть подвергнут взаимодействию с 4-пиколином в присутствии литийорганического реагента, обычно диизопропиламида лития, в инертном и безводном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, при перемешивании реакционной смеси при -78°С в течение времени, достаточного, чтобы обеспечить полное завершение реакции.

Промежуточные соединения формулы (IX) могут быть получены способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области, например, с использованием последовательности реакций, показанной на схеме 7.

- 6 019673

Схема 7

(Η₂)η

Следовательно, соединение формулы (V) может быть подвергнуто взаимодействию сначала с коммерчески доступным метиловым эфиром 4-оксибензойной кислоты с использованием традиционных условий Мицунобу, которые хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, соединение (V) может быть подвергнуто взаимодействию с метиловым эфиром 4-оксибензойной кислоты в присутствии диэтил-, ди-трет-бутил- или диизопропилазодикарбоксилата и трифенилфосфина, в инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при 120°С, в условиях микроволнового облучения, в течение подходящего периода времени, позволяющего полностью завершить реакцию, обычно 20 мин. Затем соответствующее метилэфирное производное соединения (IX), полученное таким образом, может быть гидролизовано в щелочных условиях, с использованием разбавленного основания, такого как, например, водный раствор гидроксида натрия или гидроксида калия в инертном растворителе, таком как, например, метанол, тетрагидрофуран или смесь метанол/тетрагидрофуран, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре либо при комнатной температуре в течение подходящего периода времени, позволяющего полностью завершить реакцию, обычно 18 ч, или при 150°С в условиях микроволнового облучения в течение 10 мин. Соединения формулы (V) либо являются коммерчески доступными, либо они описаны в химической литературе, и они могут быть получены с использованием простых стандартных методик синтеза, хорошо известных специалистам в данной области.

Промежуточные соединения формулы (IV) могут быть получены способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области, такими как, например, последовательность реакций, показанная на схеме 8.

Схема 8

Следовательно, соединение формулы (X), где Υ представляет собой фенил или 2-хинолинил, может быть подвергнуто реакции гидролиза в подходящем инертном растворителе, таком как, например, этанол, в присутствии катализатора, такого как, например, 5 или 10% палладий на активированном угле, в течение подходящего периода времени, позволяющего полностью завершить реакцию, обычно при 5080°С и давлении 1 атм. водорода в Н-сиЬе аппарате.

Промежуточные соединения формулы (X) могут быть получены способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области, например, как описано выше в способе синтеза соединений формулы (I), с использованием последовательности реакций, показанной на схеме 9.

Таким образом, соединение формулы (XI), где Υ представляет собой фенил или 2-хинолинил, может быть подвергнуто взаимодействию с коммерчески доступным агентом алкилирования формулы (III), где Ζ представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как галоген, например бром или йод, в присутствии подходящего основания, такого как карбонат цезия или карбонат калия, в инертном растворителе, таком как, например, диметилформамид, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при 100-150°С, с использованием обычного нагревания или в условиях микроволнового облучения, в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно 5-20 мин в микроволновой печи. В конкретном случае, когда В| представляет собой -СН₂-СООА1к, конкретная температура реакции является комнатной температурой и необходимое время составляет 3 ч. Реакция алкилирования обычно дает смесь двух возможных региоизомеров, образованных в результате алкилирования по обоим атомам азота пиразольного кольца, которые можно разделить хроматографическими методами, либо при помощи колоночной хроматографии, либо ВЭЖХ.

Альтернативно, Ζ может представлять собой гидроксильную группу, в этом случае взаимодействие

- 7 019673 с соединением (XI) можно осуществить с использованием традиционных условий Мицунобу, которые хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, соединение (XI) может быть подвергнуто взаимодействию с соединением (III), где Ζ представляет собой гидроксил, в присутствии диэтил-, ди-трет-бутил- или диизопропилазодикарбоксилата и трифенилфосфина, в инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при 120°С, в условиях микроволнового облучения, в течение подходящего периода времени, позволяющего полностью завершить реакцию, обычно 20 мин. Реакция Мицунобу обычно дает смесь двух возможных региоизомеров, образованных в результате алкилирования по обоим атомам азота пиразольного кольца, которые можно разделить хроматографическими методами, либо при помощи колоночной хроматографии, либо ВЭЖХ.

Синтез соединения формулы (XI), где Υ представляет собой фенил, описан в патентной заявке 00 2006/072828. Синтез соединения формулы (XI), где Υ представляет собой 2-хинолинил, описан в I. Меб. Сйет. 2009, 52 (16), 5188-5196.

Промежуточные соединения формулы (VI) могут быть получены способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области, например, с использованием последовательности реакций, показанной на схеме 10.

Следовательно, соединение формулы (II) может быть подвергнуто взаимодействию с коммерчески доступным агентом алкилирования формулы (XII), где Ζ представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как галоген, при этом наиболее предпочтительным является бром, в присутствии подходящего основания, такого как карбонат цезия или карбонат калия, в инертном растворителе, таком как, например, диметилформамид, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при 100°С, с использованием обычного нагревания или в условиях микроволнового облучения, в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно 10 мин в микроволновой печи. Реакция алкилирования обычно дает смесь двух возможных региоизомеров, образованных в результате алкилирования по обоим атомам азота пиразольного кольца, которые можно разделить хроматографическими методами, либо при помощи колоночной хроматографии, либо ВЭЖХ.

Альтернативно, соединения формулы (νΐ-а), где η равен 1, также можно получить с использованием последовательности реакций, показанной на схеме 11.

Таким образом, сложноэфирная группа соединения формулы (XIII) может быть восстановлена до спирта способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области, такими как, например, взаимодействие с боргидридом натрия или цианоборгидридом натрия, в подходящем инертном растворителе или смеси растворителей, такой как, например, дихлорметан и метанол, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при комнатной температуре, в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно 2 ч, с получением соединения формулы (νΐ-а), где η равен 1.

Промежуточные соединения формулы (XIII) могут быть получены способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области, например, с использованием последовательности реакций, показанной на схеме 12.

Таким образом, соединение формулы (II) может быть подвергнуто взаимодействию с коммерчески доступным метил- или этилбромацетатом в присутствии подходящего основания, такого как карбонат

- 8 019673 цезия или карбонат калия, в инертном растворителе, таком как, например, диметилформамид, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при комнатной температуре, в течение времени, необходимого для достижения полного завершения реакции, обычно 3-6 ч, с получением соединения формулы (XIII). Реакция алкилирования обычно дает смесь двух возможных регио изомеров, образованных в результате алкилирования по обоим атомам азота пиразольного кольца, которые можно разделить хроматографическими методами, либо при помощи колоночной хроматографии, либо ВЭЖХ.

Альтернативно, промежуточное соединение формулы (XIII) также можно получить через последовательность реакций, как показано на схеме 13.

Следовательно, соединение формулы (Ш-а) может быть подвергнуто взаимодействию с соединением формулы (V) с использованием традиционных условий Мицунобу, которые хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, соединение (Ш-а) может быть подвергнуто взаимодействию с соединением (V) в присутствии диэтил-, ди-трет-бутил- или диизопропилазодикарбоксилата и трифенилфосфина, в инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, при перемешивании реакционной смеси при подходящей температуре, обычно при 120°С, в условиях микроволнового облучения, в течение подходящего периода времени, позволяющего полностью завершить реакцию, обычно 1520 мин. Соединение формулы (IV-;·!) можно синтезировать, следуя последовательности реакций гидрогенолиза, которая показана выше на схеме 8, исходя из соединения формулы (Х-а), где Я₁ представляет собой -СН₂-СО-ОА1к, которое можно синтезировать согласно последовательности реакций, показанной выше на схеме 9.

Активность соединений формулы (I) определяли путем измерения ингибирования крысиного РЭЕ10А2-САМР. и значение ρΚ’50 находилось в пределах от 6,60 до 8,79. Селективность по сравнению с другими ΡΌΕ также измеряли, и во всех случаях она была выше в >50 раз, и для многих соединений в >100 раз.

Применения

Соединения согласно настоящему изобретению находят различное применение для получения изображения тканей, клеток или организма как ίη νίΐΓΟ, так и ίη νίνο. Таким образом, например, их можно использовать для получения карты дифференциального распределения ΡΌΕ10 у субъектов разного возраста и пола. Кроме того, они обеспечивают возможность исследования дифференциального распределения ΡΌΕ10 у субъектов, страдающих различными заболеваниями или расстройствами. Таким образом, аномальное распределение может способствовать постановке диагноза, выявлению случаев заболевания, стратификации популяций субъектов и контролю прогрессирования заболевания у отдельных субъектов. Радиолиганды также могут найти применение в определении занятия сайта ΡΌΕ10Α другими лигандами. Поскольку радиолиганды вводят в следовых количествах, это не дает какого-либо терапевтического эффекта.

Экспериментальная часть.

I. Химия.

Здесь и далее термин ЖХМС означает жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию, ГХМС означает газовую хроматографию/масс-спектрометрию, ВЭЖХ означает высокоэффективную жидкостную хроматографию, ЭСМ означает дихлорметан, ДМФА означает диметилформамид, ΕΐΟΑε означает этилацетат, ТГФ означает тетрагидрофуран, мин означает минуты, ч означает часы, Ш означает время удерживания (в минутах), [М+Н]⁺ означает протонированную массу свободного основания соединения, [М-Н]^- означает депротонированную массу свободного основания соединения, т.пл. означает температуру плавления.

Реакции в условиях микроволнового облучения осуществляли в одномодовом реакторе: микроволновой реактор Вю1аде ШйаШг™ δίχΐν (Вю1аде) или в мультимодовом реакторе: ΜίοΓοδΥΝΤΗ ЬаЬ51а1юп (М11ез!опе, Ше.).

Реакции гидрогенизации осуществляли в проточном гидрогенизаторе Η-ΟϋΒΕ® от Тйа1ез№по №1по1ес11по1оду Ше.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляли на пластинах с силикагелем 60 Е254 (Мегск) с использованием растворителей, имеющих чистоту реактивов. Колоночную флэш-хроматографию осуществляли на силикагеле, размер частиц 230-400 меш и размер пор 60 (Мегск) с использованием стандартных методик. Автоматизированную колоночную флэш-хроматографию осуществляли с использованием готовых для подсоединения картриджей от компании Мегск, на нестандартном силикагеле, размер частиц 15-40 мкм (доступные флэш-колонки с нормальной фазой) на 8ΡΟΤ или ЕЬА8Н системе от компании Агтеп Шкгитепк

- 9 019673

Некоторые способы получения соединений по настоящему изобретению проиллюстрированы в следующих ниже примерах, которые предназначены для иллюстрации, а не для ограничения объема настоящего изобретения. Если не указано иное, все исходные вещества получали от коммерческих поставщиков и использовали без дополнительной очистки.

А. Синтез промежуточных соединений и предшественников.

Промежуточное соединение 1. Метиловый эфир 4-(6-метилпиридин-2-илметокси)бензойной кислоты (1-1)

Смесь 6-метил-2-пиридинметанола (7,0 г, 56,84 ммоль), метил-4-гидроксибензоата (8,65 г, 56,84 ммоль), диизопропилазодикарбоксилата (14,65 мл, 73,9 ммоль) и трифенилфосфина (19,38 г, 73,9 ммоль) в ТГФ (42 мл) нагревали в микроволновой печи при 120°С в течение 20 мин (реакционную смесь разделяли на 7 партий). Затем смесь гасили водой, экстрагировали ЭСМ. растворитель выпаривали досуха в вакууме и неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; гептан/ЕЮАс от 80/20 до 50/50). Желаемые фракции собирали и упаривали в вакууме с получением желаемого промежуточного соединения 1-1 в виде оранжевого масла, имеющего около 50% чистоты, при этом основная примесь представляла собой трифенилфосфиноксид. Смесь использовали в реакции на следующей стадии без дополнительной очистки (25 г, 85,5%). ^₅Η₁₅ΝΟ₃.

Промежуточное соединение 2. 4-(6-Метилпиридин-2-илметокси)бензойная кислота (1-2)

К раствору промежуточного соединения 1-1 в 150 мл смеси метанол/ТГФ (2:1) добавляли 2 М водный раствор гидроксида натрия (49 мл, 97,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем при 60°С в течение 2 ч. После выпаривания органического растворителя водную фазу промывали ЕЮАс и затем подкисляли разбавленной НС1 до рН 5-6. Промежуточное соединение 1-2, которое осаждалось, отфильтровывали, сушили и использовали для следующей реакционной стадии без дополнительной очистки (9,0 г, 76,2%). ^₄Η₁₃ΝΘ₃.

Промежуточное соединение 3. №Метокси-№метил-4-(6-метилпиридин-2-илметокси)бензамид (1-3)

Смесь промежуточного соединения 1-2 (9,0 г, 37,0 ммоль) и тионилхлорида (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь затем концентрировали досуха и неочищенный хлорангидрид кислоты растворяли в ТГФ (100 мл). Затем медленно добавляли триэтиламин (20,5 мл, 148 ммоль) и гидрохлорид Ο,Ν-диметилгидроксиламина (10,8 г, 111 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После гашения водой смесь экстрагировали ЕЮАс, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали в вакууме.

Остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; гептан/ЕЮАс от 40/60 до 0/100) с получением промежуточного соединения 1-3 в виде оранжевого масла, которое использовали для следующей реакции без дополнительной очистки (6,2 г, 46,8%). ^6Ηι₈Ν₂Θ₃.

Промежуточное соединение 4. 2-Пиридин-4-ил-1-[4-(6-метилпиридин-2-илметокси)фенил]этанон (1-4)

К раствору диизопропиламида лития (2 М раствор в ТГФ, 43,3 мл, 86,6 ммоль) в ТГФ (35 мл) добавляли по каплям 4-метилпиридин (8,43 мл, 86,6 ммоль) при 0°С в атмосфере азота. Через 30 мин смесь охлаждали до -78°С и 35 мл полученного раствора добавляли по каплям к другому раствору промежуточного соединения 1-3 (6,2 г, 17,32 ммоль) в ТГФ (65 мл), также охлажденному до -78°С. Смесь перемешивали при этой температуре в течение 2 ч и затем добавляли по каплям еще 20 мл изначально полученного раствора. Полученный раствор перемешивали при -78°С еще в течение 1 ч. Затем реакционную смесь гасили водой и экстрагировали ЭСМ. Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали в вакууме. Полученный неочищенный остаток промывали и растирали с диэтиловым эфиром с получением промежуточного соединения 1-4 (4,7 г, 85,2%) в виде бледно-желтого твердого вещества. С₂₀Н1^₂О₂.

- 10 019673

Промежуточное соединение 5. 2-Метил-6-[4-(4-пиридин-4-ил-2Н-пиразол-3-ил)феноксиметил]пиридинД-5)

Раствор промежуточного соединения Б4 (4,7 г, 14,76 ммоль) в диметоксиметилдиметиламине (15 мл) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 1 ч. После выпаривания растворителя неочищенный остаток растворяли в метаноле (50 мл) и добавляли гидразингидрат (1,08 мл, 22,24 ммоль). Реакционную смесь нагревали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 1 ч, затем растворитель выпаривали с получением твердого остатка, который промывали и растирали со смесью диэтиловый эфир/ЕЮАс с получением промежуточного соединения Б5 (3,4 г, 67,3%) в виде бледно-желтого твердого вещества. Ο₂ιΗ₁₈Ν₄Θ. ЖХМС: К1 2,48, т/ζ 343 [М+Н]⁺ (способ 7).

Промежуточное соединение 6. 4-[3-(4-Бензилоксифенил)-1-(2-фторэтил)-1Н-пиразол-4-ил]пиридин

Д-6)

Смесь 4-[3-(4-бензилоксифенил)-1Н-пиразол-4-ил]пиридина (6,7 г, 20,47 ммоль), который синтезировали, следуя способу, описанному в патентной заявке \¥О 2006/072828, 1-бром-2-фторэтана (3,22 г, 24,56 ммоль) и карбоната цезия (20 г, 61,4 ммоль) в ДМФА (42 мл) нагревали в микроволновой печи при 150°С в течение 5 мин (реакционную смесь разделяли на 6 партий). После охлаждения до комнатной температуры твердое вещество отделяли путем фильтрования, раствор гасили водой и затем экстрагировали ЕЮАс. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ацетонитрил/диизопропиловый эфир от 30/70 до 80/20 и затем снова ЕЮАс/гептан 70/30). Желаемые фракции собирали и упаривали досуха, с получением желаемого промежуточного соединения Б6 (4 г, 52,3%) в виде масла. С₂₃Н₂₀Р№О. ЖХМС: 1/1 4,22, т/ζ 374 [М+Н]⁺ (способ 1).

Соответствующий региоизомер 1-6'. 4-[5-(4-Бензилоксифенил)-1-(2-фторэтил)-1Н-пиразол-4ил]пиридин также выделяли в результате хроматографической очистки (2 г, 26,2%). С₂₃Н₂₀Р^О.

Промежуточное соединение 7. 4-[1-(2-Фторэтил)-4-пиридин-4-ил-1Н-пиразол-3-ил]фенол (Т-7)

Промежуточное соединение 1-6 (4 г, 10,71 ммоль) растворяли в этаноле (200 мл) и подвергали гидрогенизации в системе Н-СИВЕ® с использованием Ρά/С 5% в качестве катализатора (полное заполнение водородом, 2,5 мл/мин) при 80°С и атмосферном давлении. Растворитель выпаривали досуха в вакууме с получением промежуточного соединения Σ-7 (2,5 г, 82,4%), которое использовали для следующей реакции без дополнительной очистки. С₁₆Н₁₄Р^О. ЖХМС: К1 1,57, т/ζ 284 [М+Н]⁺ (способ 8).

Промежуточное соединение 8. 4-[1-(3-Фторпропил)-4-пиридин-4-ил-1Н-пиразол-3-ил]фенол Д-8)

Следовали методике получения промежуточного соединения Σ-7, но заменяя 4-[3-(4бензилоксифенил)-1-(2-фторэтил)-1Н-пиразол-4-ил]пиридин 4-[3-(4-бензилоксифенил)-1-(2-фторпропил)-1Н-пиразол-4-ил]пиридином с получением промежуточного соединения Б8 (90%). С^Н^Р^О. ЖХМС: К1 1,81, т/ζ 298 [М+Н]⁺ (способ 7).

Промежуточное соединение 9. 4-[3-(4-Бензилоксифенил)-1-(2,2,2-трифторэтил)-1Н-пиразол-4ил]пиридин Д-9)

Смесь 4-[3-(4-бензилоксифенил)-1Н-пиразол-4-ил]пиридина (2,0 г, 6,21 ммоль), который синтезировали, следуя способу, описанному в патентной заявке \¥О 2006/072828, 1,1,1-трифтор-2-иодэтана

- 11 019673 (0,733 мл, 7,33 ммоль) и карбоната цезия (5,97 г, 18,3 ммоль) в ДМФА (12 мл) нагревали в микроволновой печи при 120°С в течение 20 мин. После охлаждения до комнатной температуры смесь гасили водой и затем экстрагировали ЕЮАс. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ацетонитрил/диизопропиловый эфир от 50/50 до 80/20). Желаемые фракции собирали и упаривали досуха с получением желаемого промежуточного соединения 1-9, имеющего около 80% чистоты (1,2 г, 38,4%) в виде масла. 0₂3Η₁₈Ε₃Ν₃0. ЖХМС: 1/1 4,86, т/ζ 410 [М+Н]⁺ (способ 2).

Соответствующий региоизомер 1-9'. 4-[5-(4-Бензилоксифенил)-1-(2,2,2-трифторэтил)-1Н-пиразол-4ил]пиридин также выделяли в результате хроматографической очистки (0,4 г, 14,6%). 0₂₃Η₁₈Ε₃Ν₃0.

Промежуточное соединение 10. 4-[4-Пиридин-4-ил-1-(2,2,2-трифторэтил)-1Н-пиразол-3-ил]фенол (1-10)

Промежуточное соединение 1-9 растворяли в этаноле (50 мл) и подвергали гидрогенизации в сис теме Ή-СИВЕ® с использованием Рб/С 5% в качестве катализатора (полное заполнение водородом, 1,5 мл/мин) при 80°С и атмосферном давлении. Растворитель выпаривали досуха в вакууме с получением промежуточного соединения 1-10 (0,55 г, 75,4%) в виде белого твердого вещества, которое использовали для следующей реакции без дополнительной очистки. С_иН|₂Б₃№,0. ЖХМС: М 1,82, т/ζ 320 [М+Н]⁺ (способ 7).

Промежуточное соединение 11. Метиловый эфир {3-[4-(6-метилпиридин-2-илметокси)фенил]-4пиридин-4-илпиразол-1-ил}уксусной кислоты (1-11) и метиловый эфир {5-[4-(6-метилпиридин-2илметокси)фенил]-4-пиридин-4-илпиразол-1-ил}уксусной кислоты (1-11')

О \

К перемешиваемому раствору промежуточного соединения 1-5 (0,30 г, 0,876 ммоль) в ДМФА (6 мл) добавляли метилбромацетат (0,20 мл, 1,051 ммоль) и карбонат цезия (0,86 г, 2,63 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 ч. Затем смесь гасили водой и экстрагировали ЕЮАс. Органические растворители отделяли, сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ЕЮАс/метанол от 100/0 до 90/10). Желаемые фракции собирали и упаривали в вакууме с получением смеси двух региоизомеров 111 и 1-11', которую использовали как таковую для следующей реакции без дополнительной очистки (0,21 г, 49,2%). С₂₄Н₂^₄0₃.

Промежуточное соединение 12. 2-{3-[4-(6-Метилпиридин-2-илметокси)фенил]-4-пиридин-4илпиразол-1-ил}этанол (1-12)

К перемешиваемому раствору смеси промежуточных соединений 1-11 и 1-11' (0,21 г, 0,507 ммоль) в смеси ЭСМ (4 мл) и метанола (1 мл) добавляли боргидрид натрия (0,096 г, 2,536 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь затем гасили водой, экстрагировали дополнительным количеством ЭСМ. органический растворитель сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ЕЮАс/метанол от 100/0 до 90/10). Желаемые фракции собирали и упаривали в вакууме с получением промежуточного соединения 1-12 (0,22 г, 61,2%). С₂₃Н₂^₄0₂. ЖХМС: М 3,48, т/ζ 387 [М+Н]⁺ (способ 3).

Соответствующий региоизомер 1-12'. 2-{5-[4-(6-Метилпиридин-2-илметокси)фенил]-4-пиридин-4илпиразол-1-ил}этанол также выделяли в результате хроматографического разделения (0,045 г, 23%). 03^Η22^Ν4⁰2.

- 12 019673 эфир {4-пиридин-4 -ил-3-[4- (хинолин-2 и метиловый эфир {4-пиридин-4-ил-5-[4Промежуточное соединение 13. Метиловый илметокси)фенил]пиразол-1-ил}уксусной кислоты (^13) (хинолин-2-илметокси)фенил]пиразол-1 -ил}уксусной кислоты (I-13')

К перемешиваемому раствору 2-[4-(4-пиридин-4-ил-2Н-пиразол-3-ил)феноксиметил]хинолина (0,5 г, 1,33 ммоль), который синтезировали, следуя способу, описанному в I. Меб. СЕет. 2009, 52 (16), 51885196, в ДМФА (10 мл) добавляли метилбромацетат (0,25 мл, 1,60 ммоль) и карбонат цезия (1,30 г, 3,99 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем смесь гасили водой и экстрагировали ЕЮАс. Органические растворители отделяли, сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ЕЮАс/метанол от 100/0 до 95/5). Желаемые фракции собирали и упаривали в вакууме с получением смеси двух региоизомеров ^13 и ^13', которую использовали для следующей реакции без дополнительной очистки (0,47 г, 47%). С₂₇Н₂^₄О₃.

Промежуточное соединение 14. Метиловый эфир [3-(4-гидроксифенил)-4-пиридин-4-илпиразол-1ил]уксусной кислоты (1-14) и метиловый эфир [5-(4-гидроксифенил)-4-пиридин-4-илпиразол-1ил]уксусной кислоты ^-14')

Смесь промежуточного соединения ^13 и Е13' (0,47 г, 1,043 ммоль) растворяли в этаноле (20 мл) и подвергали гидрогенизации в системе Н-СИВЕ® с использованием Рб/С 5% в качестве катализатора (полное заполнение водородом, 1,5 мл/мин) при 70°С и атмосферном давлении. Растворитель выпаривали досуха в вакууме с получением желтого масла, которое отверждали путем обработки ОСМ. Твердое вещество промывали дополнительным количеством ОСМ с получением смеси двух промежуточных соединений ^14 и ^14', которую использовали для следующей реакции без дополнительной очистки (0,235 г, 73%). С₁₇Н₁₅^О₃. ЖХМС: К1 0,95 (основной региоизомер), К1 1,00 (второстепенный региоизомер), т/ζ 310 [М+Н]⁺ (способ 8).

Промежуточное соединение 15. Метиловый эфир {3-[4-(3,5-диметилпиридин-2-илметокси)фенил]4-пиридин-4-илпиразол-1-ил}уксусной кислоты (^15) и метиловый эфир {5-[4-(3,5-диметилпиридин-2илметокси)фенил]-4-пиридин-4-илпиразол-1 -ил}уксусной кислоты (I-15')

Смесь двух региоизомеров ^14 и ^14' (0,235 г, 0,760 ммоль), 3,5-диметил-2гидроксиметилпиридина (0,256 г, 1,24 ммоль), диизопропилазодикарбоксилата (0,2 62 г, 1,24 ммоль) и трифенилфосфина (0,299 г, 1,24 ммоль) в ТГФ (6 мл) нагревали в микроволновой печи при 120°С в течение 20 мин. Затем смесь гасили насыщенным водным раствором карбоната натрия, экстрагировали ЕЮАс, сушили над сульфатом натрия и растворитель выпаривали досуха в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ЕЮАс/метанол от 100/0 до 95/5). Желаемые фракции собирали и растворитель выпаривали в вакууме с получением смеси двух промежуточных соединений ^15 и ^15', которую использовали для следующей реакции без дополнительной очистки (0,28 г, 55%). С25Н24^О3.

- 13 019673

Промежуточное соединение 16. 2-{3-[4-(3,5-Диметилпиридин-2-илметокси)фенил]-4-пиридин-4илпиразол-1-ил}этанол (Σ-16)

К перемешиваемому раствору смеси промежуточных соединений Σ-15 и Σ-15' (0,28 г, 0,420 ммоль) в смеси ЭСМ (4 мл) и метанола (1 мл) добавляли боргидрид натрия (0,079 г, 2,20 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь затем гасили водой, экстрагировали дополнительным количеством ЭСМ. органический растворитель сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; Е1ОАс/метанол от 100/0 до 90/10). Желаемые фракции собирали и упаривали в вакууме с получением промежуточного соединения Σ-16 (0,22 г, 61,2%). Другой региоизомер не выделяли при хроматографическом разделении. С₂₄Н₂₄Ы₄О₂. ЖХМС: К! 2,53, т/ζ 401 [М+Н]⁺ (способ 6).

Промежуточное соединение 17. Метиловый эфир {3-[4-(5-метоксипиридин-2-илметокси)фенил]-4пиридин-4-илпиразол-1-ил}уксусной кислоты (Σ-17) и метиловый эфир {5-[4-(5-метоксипиридин-2илметокси)фенил] -4 -пиридин-4 -илпиразол-1 -ил}уксусной кислоты (Σ-17')

Смесь двух региоизомеров Σ-14 и Σ-14' (0,27 г, 0,550 ммоль), (5-метоксипиридин-2-ил)метанола (0,215 г, 0,825 ммоль), описанного в Вюогд. Меб. Скет. 2005, 13, 6763-6770, диизопропилазодикарбоксилата (0,290 г, 0,825 ммоль) и трифенилфосфина (0,216 г, 0,825 ммоль) в ТГФ (4 мл) нагревали в микроволновой печи при 120°С в течение 20 мин. Затем растворитель выпаривали досуха в вакууме и неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; Е1ОАс/метанол от 100/0 до 95/5). Желаемые фракции собирали и растворитель выпаривали в вакууме с получением смеси двух промежуточных соединений Σ-17 и Σ-17', которую использовали для следующей реакции без дополнительной очистки (0,28 г, 76%). С₂₄Н₂₂Ы₄О₄.

Промежуточное соединение 18. 2-{3-[4-(5-Метоксипиридин-2-илметокси)фенил]-4-пиридин-4илпиразол-1-ил}этанол (Σ-18)

К перемешиваемому раствору смеси промежуточных соединений Σ-17 и Σ-17' (0,28 г, 0,418 ммоль) в смеси ЭСМ (4 мл) и метанола (1 мл) добавляли боргидрид натрия (0,079 г, 2,09 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь затем гасили водой, экстрагировали дополнительным количеством ЭСМ, органический растворитель сушили над сульфатом натрия и выпаривали досуха в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; Е1ОАс/метанол от 100/0 до 90/10). Желаемые фракции собирали и упаривали в вакууме с получением промежуточного соединения Σ-18 (0,09 г, 53,5%). Другой региоизомер не выделяли при хроматографическом разделении. С₂₃Н₂₂Ы₄О₃. ЖХМС: К1 2,87, т/ζ 403 [М+Н]⁺ (способ 2).

Промежуточное соединение 19. 2-{3-[4-(3,5-Диметилпиридин-2-илметокси)фенил]-4-пиридин-4илпиразол-1-ил}этиловый эфир метансульфоновой кислоты (Σ-19)

К раствору промежуточного соединения Σ-16 (5 мг, 0,012 ммоль) в ЭСМ (1 мл) добавляли пиридин (11 мкл) и полученный раствор перемешивали при 0°С. Затем добавляли метансульфоновый ангидрид (16,5 мг, 0,095 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 4 ч при 0°С, затем растворитель выпаривали путем продувки азотом. Неочищенную смесь снова растворяли в метаноле (0,5 мл), разбавляли водой (4,5 мл) и пропускали через С₁₈ 8ерРак® картридж (^а1ег§, МИГогб, МА, И8А), предварительно обработанный метанолом (3 мл) и ιηίΐΐίρ® водой (6 мл). Картридж затем промывали три раза дополнительным объемом воды (2 мл) для удаления непрореагировавшего метансульфонового ангидрида насколько

- 14 019673 это возможно. Продукт элюировали из картриджа с использованием ацетонитрила (3 мл) и растворители выпаривали при пониженном давлении. Перед выпариванием растворителей проводили ВЭЖХ анализ для определения конверсии гидроксильного предшественника ^16 в его О-мезильное производное ^19. Этот ВЭЖХ анализ осуществляли на аналитической колонке XΤе^^а™ КР С₁₈ (\Уа1ег5), которую элюировали с использованием градиентных смесей воды и ацетонитрила (0 мин: 95:5 об./об., 25 мин: 10:90 об./об., 30 мин: 10:90 об./об., линейный градиент) при скорости потока 1 мл/мин. Анализ показал, что средняя степень конверсии составляла 98% (п=9). Остаточную воду удаляли азеотропной перегонкой с ацетонитрилом и смесь сушили в течение ночи в вакуумной печи. В день экспериментов с введением радиоактивной метки, обычно осуществляемых на следующий день, полученный продукт реакции растворяли в безводном растворе ДМФА (1,5 мл) и использовали (0,3 мл) для прямого нуклеофильного радиофторирования. С₂₅Н₂₆Ы₄О₄8.

Промежуточное соединение ^20. 2-{3-[4-(5-Метоксипиридин-2-илметокси)фенил]-4-пиридин-4илпиразол-1-ил}этиловый эфир метансульфоновой кислоты ^-20)

К раствору промежуточного соединения ^18 (5 мг, 0,012 ммоль) в ЭСМ (1 мл) добавляли пиридин (11 мкл) и полученный раствор перемешивали при 0°С. Затем добавляли метансульфоновый ангидрид (16,5 мг, 0,095 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 4 ч при 0°С, затем растворитель выпаривали путем продувки азотом. Неочищенную смесь снова растворяли в метаноле (0,5 мл), разбавляли водой (4,5 мл) и пропускали через С₁₈ БерРак® картридж (\Уа1ег5, МйГотб, МА, И8А), предварительно обработанный метанолом (3 мл) и ιηίΐΐίρ® водой (6 мл). Картридж затем промывали три раза дополнительным объемом воды (2 мл) для удаления непрореагировавшего метансульфонового ангидрида насколько это возможно. Продукт элюировали из картриджа с использованием ацетонитрила (3 мл) и растворители выпаривали при пониженном давлении. Перед выпариванием растворителей проводили ВЭЖХ анализ для определения конверсии гидроксильного предшественника ^18 в его О-мезильное производное ^20. Анализ ВЭЖХ осуществляли на аналитической колонке XΤе^^а™ КР С₁₈ (\Уа1ег5), элюирование осуществляли с использованием градиентных смесей воды и ацетонитрила (0 мин: 95:5 об./об., 25 мин: 10:90 об./об., 30 мин: 10:90 об./об., линейный градиент) при скорости потока 1 мл/мин. Анализ показал, что средняя степень конверсии составляла 98% (п=9). Остаточную воду удаляли азеотропной перегонкой с ацетонитрилом и смесь сушили в течение ночи в вакуумной печи. В день экспериментов с введением радиоактивной метки, обычно осуществляемых на следующий день, полученный продукт реакции растворяли в безводном ДМФА (1,5 мл) и использовали (0,3 мл) для прямого нуклеофильного радиофторирования. С₂₄Н₂₄Ы₄О₅8.

В. Получение конечных соединений.

Пример В1. 2-[[4-[1 -(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3 -ил] фенокси]метил] -6метилпиридин· дигидрохлорид (В-1).

Смесь промежуточного соединения 1-5 (0,30 г, 0,876 ммоль), 1-бром-2-фторэтана (0,083 мл, 1,051 ммоль) и карбоната цезия (0,86 г, 2,63 ммоль) в ДМФА (5 мл) нагревали в микроволновой печи при 150°С в течение 10 мин. Затем реакционную смесь гасили водой и экстрагировали ЕЮАс. Органический слой сушили над сульфатом натрия и растворитель выпаривали досуха в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ЕЮАс/метанол от 100/0 до 90/10) с получением смеси двух изомеров. Полученную смесь снова подвергали очистке методом колоночной хроматографии (силикагель; ацетонитрил/метанол от 100/0 до 95/5). Желаемые фракции собирали и упаривали в вакууме с получением желаемого соединения В-1 в виде масла (0,25 г, 44,2%). Обработка полученного маслянистого соединения раствором хлористого водорода в изопропиловом спирте с последующей кристаллизацией из смеси диэтиловый эфир/ОСМ давали соединение В-1 в форме соли хлористо-водородной кислоты в виде желтого твердого вещества. С₂₃Н₂₁ЕЫ₄О^2НС1. ЖХМС: Κΐ 3,82, т/ζ 389 [М+Н]⁺ (способ 3).

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆) δ м.д. 2,66 (с, 3Н), 4,56 (дт, 1=28,0, 4,6 Гц, 2Н), 4,88 (дт, 1=47,2, 4,6 Гц, 2Н), 5,37 (с, 2Н), 7,15 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,44 (д, 1=8,6 Гц, 2Н), 7,57 (д, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,67 (д, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,80 (д, 1=6,9 Гц, 2Н), 8,13 (т, 1=7,1 Гц, 1Н), 8,71 (с, 1Н), 8,74 (д, 1=6,9 Гц, 2Н).

Соответствующий региоизомер 2-{4-[2-(2-фторэтил)-4-пиридин-4-ил-2Н-пиразол-3 ил]феноксиметил}-6-метилпиридин (В-1') также выделяли в результате хроматографического разделения с 70% чистотой (0,25 г, 30,8%) в виде масла. С₂₃Н₂₁ЕЫ₄О.

Радиосинтез. Получение [¹⁸Е]фторэтилбромида и [¹⁸Е]В-1.

[ Е] фторид ([ Е]Е) получали взаимодействием [ О(п, н) Е] путем облучения 1,95 мл 97% обогащенного [¹⁸О]Н2О (Ко1ет НΥОX18, Ко1ет Ми^пек, Веег Бйеуа, !8гае1) в ниобиевой мишени с использованием 18 МеV протонов из циклотрона Сус1опе 18/9 Доп Веат Аррйсайопз, Ьоиуат-1а-Ыеиуе, Ве1дшт). После облучения в течение около 60 мин полученный [¹⁸Е]Е^- отделяли от [¹⁸О]Н2О с использованием

- 15 019673 анионообменного картриджа БерРак™ ЫдЫ Ассе11 р1и§ ОМА (0а1ег5). который был предварительно обработан последовательно 0,5 М раствором К₂С0₃ (10 мл) и водой (2x10 мл). [¹⁸Р]Р^- затем элюировали из картриджа в конический реакционный сосуд (1 мл) с использованием раствора, содержащего карбонат калия (2,47 мг) и Кгур1ойх® 222 (27,92 мг), растворенные в Н₂0/СН₃СЫ (0,75 мл; 5:95 об./об.). Растворители выпаривали при 110°С с использованием обычного нагревания в течение 2 мин. После выпаривания растворителя [¹⁸Р]Р^- дополнительно сушили азеотропной перегонкой следовых количеств воды с использованием ацетонитрила (1 мл) при температуре 110°С до полного удаления влаги.

Раствор 2-бромэтилтрифлата (5 мкл, ПоБшепсек, РеппкуВаша, И8А) в о-дихлорбензоле (0,7 мл) добавляли в сосуд, содержащий [¹⁸Р]Р^-. Полученный [¹⁸Р]РЕ1Бг затем подвергали дистилляции при 120°С с использованием потока гелия (3-4 мл/мин) и барботировали во второй реакционный сосуд, содержащий предшественник 1-5 (0,2 мг) и небольшое количество (1-3 мг) С§2С03 в безводном ДМФА (0,2 мл). После перегонки достаточного количества радиоактивности в раствор предшественника реакционный сосуд закрывали и нагревали при 90°С в течение 15 мин. После взаимодействия неочищенную смесь разбавляли 1,6 мл воды и вводили в систему ВЭЖХ, состоящую из полупрепаративной колонки ВВий^е™ (С18, 5 мкм, 4,6x150 мм; 0а1ег5), и для элюирования использовали смесь 0,05 М натрийацетатого буфера рН 5,5 и ЕЮН (70:30 об./об.) при скорости потока 1 мл/мин. УФ-детекцию ВЭЖХ элюата осуществляли при 254 нм. Радиоактивно меченный продукт [Ε]Β-1 собирали примерно через 37 мин (нежелательный изомер элюировался примерно через 45 мин). В среднем 50 мКи (п=2) очищенного [¹⁸Ε]Β-1 собирали в объеме 1,5-2 мл (подвижная фаза). Собранный пик, соответствующий [¹⁸Ε]Β-1, затем разбавляли изотоническим раствором (Μίηί Р1а§со®, Вгаип, Мекипдеп, Оегтапу) для снижения концентрации этанола до <5% и подвергали стерильному фильтрованию через 0,22-мкм мембранный фильтр (Μί1Βχ®-0ν, М1Шроге, !ге1апй). Чистоту радиоактивного индикатора анализировали с использованием системы аналитической ВЭЖХ, состоящей из колонки УВий^е™ (С18, 3,5 мкм, 3x100 мм; 0а1ег5) при элюировании смесью 0,05 М натрийацетатного буфера рН 5,5 и ацетонитрила (70:30 об./об.) при скорости потока 0,8 мл/минут (Βί=7,5 мин). [¹⁸Е]В-1 синтезировали с радиохимическим выходом 57% (относительно [¹⁸Е]ЕЕ!Вг^- исходной радиоактивности, п=2). Радиохимическая чистота, которую проверяли с использованием описанной выше системы аналитической ВЭЖХ, составляла >99%.

Пример В2. Гидрохлорид 2-[[4-[1-(3-фторпропил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3ил]фенокси]метил]-6-метилпиридина (В-2).

Смесь промежуточного соединения Е5 (0,30 г, 0,876 ммоль), 3-фторпропан-1-ола (0,203 г, 1,314 ммоль), диизопропилазодикарбоксилата (0,261 мл, 1,314 ммоль) и трифенилфосфина (0,345 г, 1,314 ммоль) в ТГФ (3 мл) нагревали в микроволновой печи при 120°С в течение 20 мин. Затем растворитель выпаривали досуха в вакууме и неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ацетонитрил/метанол от 100/0 до 95/5). Желаемые фракции собирали и упаривали в вакууме с получением желаемого соединения В-2 в виде бесцветного масла, которое преобразовывали в соответствующую соль хлористо-водородной кислоты (0,075 г, 19,5%) (точная стехиометрия неизвестна) в виде белого твердого вещества. С₂₄Н₂₃ЕЫ₄0-НС1. ЖХМС: Βί 4,09, т/ζ 403 [М+Н]⁺ (способ 3).

Ή ЯМР (500 МГц, ДМСО-й₆) δ м.д. 2,20-2,34 (м, 2Н), 2,62 (с, 3Н), 4,33 (т, 1=6,9 Гц, 2Н), 4,54 (ддд, 1=47,3, 5,6, 5,5 Гц, 2Н), 5,32 (с, 2Н), 7,14 (д, 1=8,7 Гц, 2Н), 7,43 (д, 1=8,7 Гц, 2Н), 7,50 (д, 1=6,6 Гц, 1Н), 7,60 (д, 1=6,4 Гц, 1Н), 7,78 (д, 1=6,6 Гц, 2Н), 8,05 (ушир.с, 1Н), 8,69 (с, 1Н), 8,73 (д, 1=6А Гц, 2Н).

Соответствующий региоизомер 2-{4-[2-(3-фторпропил)-4-пиридин-4-ил-2Н-пиразол-3ил]феноксиметил}-6-метилпиридина (В-2') также выделяли в результате хроматографического разделения и преобразовывали в его соответствующую соль хлористо-водородной кислоты (0,07 г, 18,2%) в виде белого порошка. С₂₄Н₂₃ЕЫ₄0.

Пример В3. 2-[[4-[1-(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-3,5диметилпиридин-сукцинат (В-3).

Смесь промежуточного соединения Σ-7 (0,20 г, 0,706 ммоль), 3,5-диметил-2гидроксиметилпиридина (0,226 г, 0,918 ммоль), диизопропилазодикарбоксилата (0,211 г, 0,918 ммоль) и трифенилфосфина (0,241 г, 0,918 ммоль) в ТГФ (4 мл) нагревали в микроволновой печи при 120°С в течение 15 мин. Затем смесь гасили насыщенным водным раствором карбоната натрия и экстрагировали ЭСМ. Органический растворитель сушили над сульфатом натрия и выпаривали досуха в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ЕЮАс/метанол от 100/0 до 95/5). Желаемые фракции собирали и растворитель выпаривали в вакууме с получением соединения В-3 в виде бесцветного масла. Остаток растворяли в метаноле (2 мл) и медленно добавляли раствор янтарной кислоты (0,073 г, 0,619 ммоль) в метаноле (2 мл). Растворитель выпаривали досуха и твердый остаток промывали несколько раз диэтиловым эфиром с получением конечного соединения В-3 в форме соли янтарной кислоты (0,295 г, 80,3%) в виде белого твердого вещества. С₂₄Н₂₃ЕЫ₄0-С₄Н₆0₄. ЖХМС: Βί 3,08, т/ζ 403 [М+Н]⁺ (способ 7).

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆) δ м.д. 2,28 (с, 3Н), 2,35 (с, 3Н), 2,42 (с, 4Н), 4,49 (дт, 1=27,7, 4,7 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 1=47,2, 4,6 Гц, 2Н), 5,16 (с, 2Н), 7,05 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,23 (д, 1=6,0 Гц, 2Н), 7,32 (д, 1=8,8

- 16 019673

Гц, 2Н), 7,48 (с, 1Н), 8,23 (с, 2Н), 8,46 (д, 1=5,8 Гц, 2Н), 12,15 (ушир.с, 2Н).

Радиосинтез. Получение [¹⁸Г]фторида и [¹⁸Г]В-3.

[¹⁸Р]фторид ([¹⁸Р]Р^-) получали таким же способом, как описано выше для радиосинтеза [¹⁸Ρ]ΡΕ®γ, с некоторой модификацией, которая состояла в том, что элюирование [¹⁸Р]Р осуществляли из картриджа с использованием раствора 0,45 мл КтурЩйх® 222/раствор К₂СО₃ и 0,3 мл ацетонитрила.

Используемый для радиоактивного мечения предшественник ^19 (~0, 6 мг в 0,3 мл ДМФА) добавляли к высушенному [¹⁸Р] Р/К2СО3/Кгур1цйх® 222 комплексу и осуществляли реакцию нуклеофильного замещения путем обычного нагревания при 90°С в течение 15 мин. После завершения реакции неочищенную смесь разбавляли 1,4 мл воды и вводили в систему ВЭЖХ, состоящую из полупрепаративной колонки ХВййде™ (08, 5 мкм, 4,6x150 мм; Аа1сг5). с использованием для элюирования смеси 0,05 М натрийацетатного буфера рН 5,5 и ΕΐΟΗ (65:35 об./об.) при скорости потока 1 мл/мин. УФ-детекцию ВЭЖХ элюата осуществляли при 254 нм. Радиомеченный продукт [¹⁸Р]В-3 собирали примерно через 26 мин. В среднем 100 мКи (η=7, минимум 60 мКи, максимум 180 мКи) очищенного [¹⁸Р]В-3 собирали в объеме 1,5-2 мл (подвижная фаза). Собранный пик, соответствующий [Р]В-3, затем разбавляли изотоническим раствором (Μίηί Ρ1;·ΐ5οο®, Вгаин, МеНи^е^ бетиту) для снижения концентрации этанола до <5% и подвергали стерильному фильтрованию через 0,22-мкм мембранный фильтр (М111ех®-бУ, М1Шροϊΐ, йектй). Чистоту радиорадиоактивного индикатора анализировали с использованием системы аналитической ВЭЖХ, состоящей из колонки ХВййде™ (С!8, 3,5 мкм, 3x100 мм; Аа1ег5) при элюировании смесью 0,05 М натрийацетатного буфера рН 5,5 и ацетонитрила (65:35 об./об.) при скорости потока 0,8 мл/мин (Κΐ=5,6 мин). УФ-детекцию ВЭЖХ элюата осуществляли при 254 нм. [¹⁸Р]В-3 синтезировали с радиохимическим выходом 16% (относительно исходной радиоактивности [¹⁸Р]Р^-, η=7). Радиохимическая чистота, которую проверяли с использованием описанной выше системы аналитической ВЭЖХ, составляла >98%. Средняя удельная радиоактивность радиоактивного индикатора, которую проверяли с использованием описанной выше системы аналитической ВЭЖХ, была определена как 176 ОВц/мкмоль (4764 Ки/ммоль, η=7) в конце синтеза (ΕΟ8).

Пример В4. 2-[[4-[1-(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-5метоксипиридин (В-4).

Смесь промежуточного соединения Σ-7 (0,23 г, 0,344 ммоль), (5-метоксипиридин-2-ил)метанола (0,072 г, 0,516 ммоль), полученного, как описано в Вюсгд. Мей. СНет. 2005, 13, 6763-6770, диизопропилазодикарбоксилата (0,20 мл, 0,516 ммоль) и трифенилфосфина (0,235 г, 0,516 ммоль) в ТГФ (4 мл) нагревали в микроволновой печи при 120°С в течение 20 мин. Затем смесь гасили насыщенным водным раствором карбоната натрия, экстрагировали ΕίΟΛο, сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ΕΐΟΑс/метанол от 100/0 до 95/5). Желаемые фракции собирали и растворитель выпаривали в вакууме с получением соединения В-4 (0,22 г, 86,2%) в виде белого твердого вещества. С₂₃Н₂1РЫ₄О₂. ЖХМС: Κΐ 2,7, т/ζ 405 [М+Н]⁺ (способ 7).

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ м.д. 3,87 (с, 3Н), 4,47 (дт, 1=27,0, 4,7 Гц, 2Н), 4,84 (дт, 1=46,9, 4,6 Гц, 2Н), 5,17 (с, 2Н), 6,97 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,18 (д, 1=6,0 Гц, 2Н), 7,22 (дд, 1=8,6, 3,0 Гц, 1Н), 7,39 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,44 (д, 1=8,6 Гц, 1Н), 7,70 (с, 1Н), 8,30 (д, 1=3,0 Гц, 1Н), 8,48 (д, 1=6,2 Гц, 2Н).

Радиосинтез. Получение [¹⁸Р] фторида и [¹⁸Р]В-4.

[¹⁸Р] фторид ([¹⁸Р]Р^-) получали точно таким способом, как описано выше для радиосинтеза соединения [¹⁸Р]В-3.

Используемый для радиоактивного мечения предшественник ^20 (~0,6 мг в 0,3 мл ДМФА) добавляли к высушенному СР^/КзС'Оз/КгурЮйх® 222 комплексу и осуществляли реакцию нуклеофильного замещения путем обычного нагревания при 90°С в течение 10 мин. После завершения реакции неочищенную смесь разбавляли 1,4 мл воды и вводили в систему ВЭЖХ, состоящую из полупрепаративной колонки ХВййде™ (С_£8, 5 мкм, 4,6x150 мм; Аа1ег5) с использованием для элюирования смеси 0,05 М натрийацетатного буфера рН 5,5 и ΕΐΟΗ (70:30 об./об.) при скорости потока 1 мл/мин. УФ-детекцию ВЭЖХ элюата осуществляли при 254 нм. Радиомеченный продукт [¹⁸Р]В-4 собирали примерно через 35 мин. Как правило, собирали около 90 мКи очищенного [¹⁸Р]В-4 в объеме 1,5-2 мл (подвижная фаза). Собранный пик, соответствующий [¹⁸Р]В-4, затем разбавляли изотоническим раствором (Μίηί ΡΙαδοο®, Вгаии, МеНи^еи, бетиту) для снижения концентрации этанола до <5% и подвергали стерильному фильтрованию через 0,22-мкм мембранный фильтр (М111ех®-бУ, Μ^11^рο^е, йек-тй). Чистоту радиорадиоактивного индикатора анализировали с использованием системы аналитической ВЭЖХ, состоящей из колонки ХВййде™ (С_!8, 3,5 мкм, 3x100 мм; Аа1ег5) при элюировании смесью 0,05 М натрийацетатного буфера рН 5,5 и ацетонитрила (70:30 об./об.) при скорости потока 0,8 мл/мин (Κΐ=7,2 мин). УФдетекцию ВЭЖХ элюата осуществляли при 254 нм. [¹⁸Р]В-4 синтезировали с радиохимическим выходом 15% (относительно исходной радиоактивности [¹⁸Р]Р^-, η=2). Радиохимическая чистота, которую проверяли с использованием описанной выше системы аналитической ВЭЖХ, составляла >99%. Средняя удельная радиоактивность радиоактивного индикатора, которую проверяли с использованием описанной выше системы аналитической ВЭЖХ, была определена как 141 СВд/мкмоль (3800 Ки/ммоль, η=2) на ΕΟ8.

- 17 019673

Пример В5. 5-Метокси-2-[[4-[4-(4-пиридинил)-1-(2,2,2-трифторэтил)-7Н-пиразол-3ил]фенокси]метил]пиридин (В-5).

Смесь промежуточного соединения 1-10 (0,25 г, 0,47 ммоль), (5-метоксипиридин-2-ил)метанола (0,098 г, 0,70 ммоль), диизопропилазодикарбоксилата (0,24 мл, 0,70 ммоль) и трифенилфосфина (0,285 г, 0,70 ммоль) в ТГФ (3 мл) нагревали в микроволновой печи при 120°С в течение 20 мин. Затем смесь гасили насыщенным водным раствором карбоната натрия и экстрагировали ЕЮАс. Органический растворитель сушили над сульфатом натрия и выпаривали досуха в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ЕЮАс/метанол от 100/0 до 95/5). Желаемые фракции собирали и растворитель выпаривали в вакууме с получением соединения В-5 (0,21 г, 53,2%) в виде бесцветного масла, которое отверждалось при стоянии, с получением белого твердого вещества. С₂зН₁₉Е₃М₄О₂. ЖХМС: 111 4,27, т/ζ 441 [М+Н]⁺ (способ 2).

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1_;) δ м.д. 3,87 (с, 3Н), 4,77 (кв, 1=8,3 Гц, 2Н), 5,17 (с, 2Н), 6,97 (д, 1=9,0 Гц, 2Н), 7,19 (д, 1=6,2 Гц, 2Н), 7,23 (дд, 1=8,6, 3,0 Гц, 1Н), 7,38 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,44 (д, 1=8,6 Гц, 1Н), 7,71 (с, 1Н), 8,30 (д, 1=2,8 Гц, 1Н), 8,51 (д, 1=6,0 Гц, 2Н).

Пример В6. 2-Бром-6-[[4-[1-(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-7Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин-0,75 сукцинат (В-6).

Смесь промежуточного соединения 1-7 (0,30 г, 1,06 ммоль), (6-бромпиридин-2-ил)метанола (0,30 г, 1,59 ммоль), диизопропилазодикарбоксилата (0,315 мл, 1,59 ммоль) и трифенилфосфина (0,417 г, 1,59 ммоль) в ТГФ (5 мл) нагревали в микроволновой печи при 100°С в течение 30 мин. Затем смесь гасили насыщенным водным раствором карбоната натрия и экстрагировали ЭСМ. Органический растворитель сушили над сульфатом натрия и выпаривали досуха в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; сначала ЕЮАс/гептан 70/30, затем диэтиловый эфир/ОСМ 70/30). Желаемые фракции собирали и растворитель выпаривали в вакууме с получением соединения В-6 (0,30 г, 53,2%) в виде бесцветного масла. Некоторое количество соединения В-6 (0,08 г) преобразовывали в соответствующую соль янтарной кислоты, аналогично описанному выше для конечного соединения В-3, с получением конечного соединения В-6 в виде белого твердого вещества. С₂₂Н1₈ВгЕЛ₄О-0,75С₄Н₆О₄. ЖХМС: 111 3,22, т/ζ 453 [М+Н]⁺ (способ 7).

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆) δ м.д. 2,42 (с, 3Н), 4,50 (дт, 1=27,7, 4,6 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 1=47,2, 4,7 Гц, 2Н), 5,20 (с, 2Н), 7,06 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,22 (д, 1=6,0 Гц, 2Н), 7,35 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,59 (д, 1=7,4 Гц, 1Н), 7,63 (д, 1=7,9 Гц, 1Н), 7,82 (т, 1=7,7 Гц, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 8,46 (д, 1=6,0 Гц, 2Н), 12,16 (ушир.с, 1,5Н).

Пример В7. 2-[[4-[1-(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-6(трифторметил)пиридин (В-7).

Соединение В-6 (0,45 г, 0,725 ммоль) растворяли в ДМФА (3 мл) и затем к раствору добавляли метиловый эфир (фторсульфонил)дифторуксусной кислоты (0,464 мл, 3,62 ммоль) и иодид меди (0,69 г, 3,62 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 120°С в герметично закрытой пробирке в течение 2 ч. Реакционную смесь гасили водным раствором 1 М гидроксида натрия и экстрагировали ЭСМ. Органический растворитель сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ЕЮАс/гептан от 70/30 до 100/0). Желаемые фракции собирали и растворитель выпаривали в вакууме с получением желаемого соединения в виде желтого масла, которое содержало трифенилфосфиноксид в виде основной примеси. Неочищенное соединение подвергали дополнительной очистке препаративной ВЭЖХ (С18 ХВпбде 30x100; водный раствор карбоната аммония рН 9/ацетонитрил, градиент от 80/20 до 0/100) с получением В-7 в виде бесцветного масла. Полученное соединение отверждали путем добавления смеси диэтиловый эфир/гептан и, наконец, перекристаллизовывали из диизопропилового эфира с получением конечного соединения В-7 (0,023 г, 7,2%) в виде белого твердого вещества. СУН^Г-Д-О. ЖХМС: К! 3,73, т/ζ 443 [М+Н]⁺ (способ 4).

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆) δ м.д. 4,50 (дт, 1=27,8, 4,7 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 1=47,2, 4,6 Гц, 2Н), 5,31 (с, 2Н), 7,09 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,22 (д, 1=6,0 Гц, 2Н), 7,35 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,89 (д, 1=7,9 Гц, 1Н), 7,89 (д, 1=7,6 Гц, 1Н), 8,18 (т, 1=7,9 Гц, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 8,46 (д, 1=6,0 Гц, 2Н).

Пример В8. 2-Циклопропил-6-[[4-[1-(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3ил] фенокси]метил] пиридин-сукцинат (В-8).

Смесь соединения В-6 (0,24 г, 0,263 ммоль), циклопропилбороновой кислоты (0,029 г, 0,341 ммоль) и тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) (0,015 г, 0,013 ммоль) в смеси водный раствор карбоната натрия/диоксан 1:1 (5 мл) нагревали в микроволновой печи при 130°С в течение 15 мин. После охлаждения до комнатной температуры неочищенную смесь разбавляли водой и экстрагировали ЭСМ. Органический растворитель сушили над сульфатом натрия и выпаривали досуха в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель; ЕЮАс), желаемые фракции собирали и растворитель выпаривали в вакууме с получением желаемого соединения в виде бесцветного масла, которое содержало трифенилфосфиноксид в виде основной примеси. Полученное соединение подвергали дополнительной очистке препаративной ВЭЖХ (С18 ХВпбде 19x100; водный раствор карбоната аммония рН 9/ацетонитрил, градиент от 80/20 до 0/100), с получением В-8 в виде бесцветного масла. Остаток растворяли в метаноле (2 мл) и медленно добавляли раствор янтарной кислоты (0,017 г, 0,244 ммоль) в метаноле (1 мл). Раствори

- 18 019673 тель выпаривали досуха и остаток обрабатывали смесью ОСМ/диизопропиловый эфир, с получением соли янтарной кислоты конечного соединения В-8 (0,076 г, 54,4%) в виде белого твердого вещества. С₂₅Н₂₃РХ₄О-С₄Н₆О₄. ЖХМС: М 4,29, т/ζ 415 [М+Н]⁺ (способ 2).

'|| ЯМР (400 МГц, ДМСО-0) δ м.д. 0,87-0,99 (м, 4Н), 2,05-2,16 (м, 1Н), 2,42 (с, 4Н), 4,49 (дт, 1=27,7, 4,6 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 1=47,2, 4,7 Гц, 2Н), 5,10 (с, 2Н), 7,04 (д, 1=9,0 Гц, 2Н), 7,20-7,24 (м, 3Н), 7,26 (д, 1=7,4 Гц, 1Н), 7,33 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,68 (т, 1=7,7 Гц, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 8,45 (д, 1=6,2 Гц, 2Н), 12,17 (ушир.с, 1Н).

Следующие соединения получали, следуя одному из способов синтеза, описанных выше.

3-Метокси-2-[[4-[4-(4-пиридинил)-1-(2,2,2-трифторэтил)-7Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин (В-9).

Следовали методике получения соединения В-5, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол (3метоксипиридин-2-ил)метанолом, с получением конечного соединения В-9 (58%) в виде белого твердого вещества, которое затем кристаллизовали из диизопропилового эфира. С₂₃Н1₉Р₃Ы₄О₂. ЖХМС: К! 3,01, т/ζ 441 [М+Н]⁺ (способ 7).

'|| ЯМР (400 МГц, СССР) δ м.д. 3,89 (с, 3Н), 4,77 (кв, 1=8,3 Гц, 2Н), 5,26 (с, 2Н), 7,02-7,07 (м, 2Н), 7,17-7,21 (м, 2Н), 7,23 (дд, 1=8,3, 1,6 Гц, 1Н), 7,27 (дд, 1=8,3, 4,6 Гц, 1Н), 7,34-7,41 (м, 2Н), 7,70 (с, 1Н), 8,25 (дд, 1=4А, 1,6 Гц, 1Н), 8,49-8,53 (м, 2Н).

3-(2-Фторэтокси)-2-[[4-[4-(4-пиридинил)-1-(2,2,2-трифторэтил)-7Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин-сукцинат (В-10).

Следовали методике получения соединения В-5, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол [3(2-фторэтокси)пиридин-2-ил]метанолом, с получением конечного соединения В-10, которое преобразовывали в соответствующую соль янтарной кислоты, аналогично тому, как описано выше для конечного соединения В-3, которое кристаллизовали из диэтилового эфира, с получением соли янтарной кислоты конечного соединения В-10 (33,8%) в виде белого твердого вещества. С₂₄Н₂₀Р₄Х₄О₂-С₄Н₆О₄. ЖХМС: К! 2,96, т/ζ 473 [М+Н]⁺ (способ 7).

'|| ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆) δ м.д. 2,40 (с, 4Н), 4,31-4,42 (м, 2Н), 4,67-4,82 (м, 2Н), 5,21 (кв, 1=9,0 Гц, 2Н), 5,18 (с, 2Н), 7,05 (ушир.д, 1=8,7 Гц, 2Н), 7,22-7,26 (м, 2Н), 7,31 (ушир.д, 1=8,7 Гц, 2Н), 7,40 (дд, 1=8,4, 4,9 Гц, 1Н), 7,56 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 8,19 (дд, 1=4,5, 1,0 Гц, 1Н), 8,28 (с, 1Н), 8,45-8,52 (м, 2Н), 12,19 (ушир.с, 2Н).

5-(2-Фторэтокси)-2-[[4-[4-(4-пиридинил)-1-(2,2,2-трифторэтил)-7Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин (В-11).

Следовали методике получения соединения В-5, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол [5(2-фторэтокси)пиридин-2-ил]метанолом, с получением конечного соединения В-11 (20,3%) в виде белого твердого вещества после кристаллизации из смеси диизопропиловый эфир/гептан. С₂₄Н₂₀Р₄Х₄О₂. ЖХМС: 3,9, т/ζ 473 [М+Н]⁺ (способ 5).

'|| ЯМР (400 МГц, СССР) δ м.д. 4,22-4,34 (м, 2Н), 4,70-4,87 (м, 2Н), 4,77 (кв, 1=8,3 Гц, 2Н), 5,18 (с, 2Н), 6,94-7,00 (м, 2Н), 7,17-7,21 (м, 2Н), 7,27 (дд, 1=8,6, 2,8 Гц, 1Н), 7,35-7,41 (м, 2Н), 7,46 (д, 1=8,6 Гц, 1Н), 7,71 (с, 1Н), 8,33 (д, 1=2,8 Гц, 1Н), 8,49-8,54 (м, 2Н).

2- [[4-[1-(3-Фторпропил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-3-метоксипиридин (В12).

Следовали методике получения соединения В-5, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол (3метоксипиридин-2-ил)метанолом и промежуточное соединение 1-10 - промежуточным соединением 1-8, с получением конечного соединения В-12 (40%) в виде белого твердого вещества. С₂₄Н₂₃РЫ₄О₂. ЖХМС: М 3,78, т/ζ 419 [М+Н]⁺ (способ 2).

'|| ЯМР (500 МГц, С1)СР) δ м.д. 2,34 (квин., 1=26,9, 6,0, 6,0, 6,0, 6,0 Гц, 2Н), 3,89 (с, 3Н), 4,33 (т, 1=6,8 Гц, 2Н), 4,51 (дт, 1=47,1, 5,5 Гц, 2Н), 5,25 (с, 2Н), 7,01-7,06 (м, 2Н), 7,16-7,20 (м, 2Н), 7,23 (дд, 1=8,4, 1,2 Гц, 1Н), 7,27 (дд, 1=8,4, 4,7 Гц, 1Н), 7,34-7,41 (м, 2Н), 7,63 (с, 1Н), 8,25 (дд, 1=4,5, 1,6 Гц, 1Н), 8,458,50 (м, 2Н).

3- (2-Фторэтокси)-2-[[4-[1-(3-фторпропил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин-сукцинат (В-13).

Следовали методике получения соединения В-5, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол [3(2-фторэтокси)пиридин-2-ил]метанолом и промежуточное соединение 1-10 - промежуточным соединением 1-8, с получением конечного соединения В-13, которое преобразовывали в соответствующую соль янтарной кислоты, аналогично тому, как описано выше для конечного соединения В-3, которую кристаллизовали из смеси диэтиловый эфир/диизопропиловый эфир, с получением соли янтарной кислоты конечного соединения В-13 (39,2%) в виде белого твердого вещества. С₂₅Н₂₄Р₂Х₄О₂-С₄Н₆О₂. ЖХМС: К! 2,75, т/ζ 451 [М+Н]⁺ (способ 7).

'|| ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆) δ м.д. 2,25 (квин., 1=26,3, 6,4, 6,4, 6,4, 6,4 Гц, 2Н), 2,42 (с, 4Н), 4,27 (т, 1=6,9 Гц, 2Н), 4,37 (дт, 1=29,8, 3,8 Гц, 2Н), 4,53 (дт, 1=47,4, 5,7 Гц, 2Н), 4,75 (дт, 1=47,7, 3,5 Гц, 2Н), 5,18 (с, 2Н), 7,04 (ушир.д, 1=8,7 Гц, 2Н), 7,19-7,25 (м, 2Н), 7,31 (ушир.д, 1=8,7 Гц, 2Н), 7,40 (дд, 1=8,4, 4,6 Гц, 1Н), 7,56 (д, 1=8,1 Гц, 1Н), 8,19 (д, 1=4,6 Гц, 1Н), 8,23 (с, 1Н), 8,45 (ушир.д, 1=6,1 Гц, 2Н), 12,17 (ушир.с,

- 19 019673

2Н).

2-[[4-[1-(3-Фторпропил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-5-метоксипиридин-0,5 сукцинат (В-14).

Следовали методике получения соединения В-5, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол для (5-метоксипиридин-2-ил)метанолом и промежуточное соединение 1-10 - промежуточным соединением I8, с получением конечного соединения В-14 в виде бесцветного масла, которое преобразовывали в соответствующую соль янтарной кислоты, аналогично тому, как описано выше для конечного соединения В3, которую кристаллизовали из диэтилового эфира, с получением соли янтарной кислоты конечного соединения В-14 (25,6%) в виде белого твердого вещества. С₂₄Н₂₃Р^О₂-0,5С₄Н₆О₄. ЖХМС: 3,97, т/ζ 419 [М+Н]⁺ (способ 2).

'|| ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆) δ м.д. 2,24 (квин., 6=26,4, 6,2 Гц, 2Н), 2,41 (с, 2Н), 3,84 (с, 3Н), 4,27 (т, 6=6,9 Гц, 2Н), 4,52 (дт, 6=47,2, 5,7 Гц, 2Н), 5,11 (с, 2Н), 7,03 (ушир.д, 6=8,8 Гц, 2Н), 7,17-7,25 (м, 2Н), 7,31 (ушир.д, 6=8,8 Гц, 2Н), 7,43 (дд, 6=8,3, 3,0 Гц, 1Н), 7,50 (д, 6=8,6 Гц, 1Н), 8,23 (с, 1Н), 8,29 (д, 6=2,8 Гц, 1Н), 8,40-8,48 (м, 2Н), 12,18 (ушир.с, 1Н).

5-(2-Фторэтокси)-2-[[4-[1-(3-фторпропил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин (В-15).

Следовали методике получения соединения В-5, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол [5(2-фторэтокси)пиридин-2-ил]метанолом и промежуточное соединение 1-10 промежуточным соединением 1-8, с получением соединения В-15 в виде бесцветного масла, которое отверждалось при стоянии. В завершение обработки соединение промывали диизопропиловым эфиром, с получением конечного соединения В-15 (35,8%) в виде белого твердого вещества. С₂₅Н₂₄Р₂^О₂-С₄Н₆О₄. ЖХМС: 3,69, т/ζ 451 [М+Н]⁺ (способ 5).

'|| ЯМР (500 МГц, СОС1₃) δ м.д. 2,34 (квин., 6=26,9, 6,2, 6,2, 6,2, 6,2 Гц, 2Н), 4,23-4,33 (м, 2Н), 4,33 (т, 6=6,7 Гц, 2Н), 4,51 (дт, 6=47,4, 5,7 Гц, 2Н), 4,71-4,86 (м, 2Н), 5,17 (с, 2Н), 6,94-6,99 (м, 2Н), 7,18 (ушир.д, 6=6,1 Гц, 2Н), 7,27 (дд, 6=8,7, 2,9 Гц, 1Н), 7,35-7,41 (м, 2Н), 7,46 (д, 6=8,7 Гц, 1Н), 7,64 (с, 1Н), 8,33 (ушир.д, 6=2,9 Гц, 1Н), 8,48 (ушир.д, 6=6,1 Гц, 2Н).

2- [[4-[1 -(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3 -ил] фенокси]метил] -3 -метоксипиридин-сукцинат (В-16).

Следовали методике получения соединения В-4, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол (3метоксипиридин-2-ил)метанолом, с получением соединения В-16, которое преобразовывали в соответствующую соль янтарной кислоты, аналогично тому, как описано выше для конечного соединения В-3, которую кристаллизовали из диэтилового эфира, с получением соли янтарной кислоты конечного соединения В-16 (32,5%) в виде белого твердого вещества. С₂₃Н₂₁Р^О₂-С₄Н₆О₄. ЖХМС: 3,52, т/ζ 405 [М+Н]⁺ (способ 2).

'|| ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆) δ м.д. 2,41 (с, 4Н), 3,86 (с, 3Н), 4,49 (дт, 6=27,7, 4,8 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 6=47,2, 4,8 Гц, 2Н), 5,13 (с, 2Н), 7,03 (ушир.д, 6=8,8 Гц, 2Н), 7,18-7,26 (м, 2Н), 7,31 (ушир.д, 6=8,8 Гц, 2Н), 7,41 (дд, 6=8,3, 4,6 Гц, 1Н), 7,52 (дд, 6=8,4, 1,0 Гц, 1Н), 8,16 (дд, 6=4,6, 1,4 Гц, 1Н), 8,23 (с, 1Н), 8,43-8,48 (м, 2Н), 12,16 (ушир.с, 2Н).

3- (2-Фторэтокси)-2-[[4-[1-(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин-сукцинат (В-17).

Следовали методике получения соединения В-4, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол [3(2-фторэтокси)пиридин-2-ил]метанолом, с получением соединения В-17, которое преобразовывали в соответствующую соль янтарной кислоты, аналогично тому, как описано выше для конечного соединения В-3, которую кристаллизовали из диэтилового эфира, с получением соли янтарной кислоты конечного соединения В-17 (78,3%) в виде белого твердого вещества. СгЩггРгЩОг-СЩбОд. ЖХМС: 2,52, т/ζ 437 [М+Н]⁺ (способ 7).

'|| ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆) δ м.д. 2,42 (с, 4Н), 4,32-4,41 (м, 2Н), 4,49 (дт, 6=27,7, 4,6 Гц, 2Н), 4,684,81 (м, 2Н), 4,85 (дт, 6=47,1, 4,9 Гц, 2Н), 5,18 (с, 2Н), 7,04 (ушир.д, 6=8,7 Гц, 2Н), 7,21-7,25 (м, 2Н), 7,32 (ушир.д, 6=9,0 Гц, 2Н), 7,40 (дд, 6=8,4, 4,6 Гц, 1Н), 7,56 (д, 6=8,1 Гц, 1Н), 8,19 (д, 6=4,6 Гц, 1Н), 8,23 (с, 1Н), 8,44-8,48(м, 2Н), 12,16 (ушир.с, 2Н).

-Фтор-2-[[4-[1 -(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3 -ил] фенокси]метил]пиридин-1,2 сукцинат (В-18).

Следовали методике получения соединения В-6, но заменяли (6-бромпиридин-2-ил)метанол (3фторпиридин-2-ил)метанолом, с получением соединения В-18, которое преобразовывали в соответствующую соль янтарной кислоты, аналогично тому, как описано выше для конечного соединения В-3, которую кристаллизовали из диэтилового эфира, с получением соли янтарной кислоты конечного соединения В-18 (23,9%) в виде белого твердого вещества. С₂₂Н1₈Р^₄О-1,2С₄Н₆О₄. ЖХМС: 2,63, т/ζ 393 [М+Н]⁺ (способ 7).

'|| ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆) δ м.д. 2,41 (с, 4,8Н), 4,50 (дт, 6=27,7, 4,6 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 6=46,9, 4,9 Гц, 2Н), 5,25 (д, 6=2,1 Гц, 2Н), 7,04-7,10 (м, 2Н), 7,19-7,25 (м, 2Н), 7,30-7,37 (м, 2Н), 7,54 (дт, 6=8,5, 4,4 Гц, 1Н), 7,78-7,84 (м, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 8,42-8,51 (м, 3Н), 12,26 (ушир.с, 2,4Н).

- 20 019673

5-(2-Фторэтокси)-2-[[4-[1-(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-7Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин (В-19).

Следовали методике получения соединения В-4, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол [5(2-фторэтокси)пиридин-2-ил]метанолом, с получением соединения В-19 (56,3%) в виде белого твердого вещества после обработки диизопропиловым эфиром. С₂₄Н₂₂Е₂Ы₄О₂. ЖХМС: Βΐ 3,48, т/ζ 437 [М+Н]⁺ (способ 5).

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭС1₃,) δ м.д. 4,22-4,34 (м, 2Н), 4,47 (дт, 1=27,1, 4,9 Гц, 2Н), 4,70-4,87 (м, 2Н), 4,84 (дт, 1=46,9, 4,6 Гц, 2Н), 5,18 (с, 2Н), 6,97 (ушир.д, 1=8,8 Гц, 2Н), 7,16-7,21 (м, 2Н), 7,27 (дд, 1=8,6, 2,8 Гц, 1Н), 7,36-7,42 (м, 2Н), 7,46 (д, 1=8,6 Гц, 1Н), 7,70 (с, 1Н), 8,33 (д, 1=2,8 Гц, 1Н), 8,45-8,52 (м, 2Н).

5- Бром-2-[[4-[1-(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин (В-20).

Следовали методике получения соединения В-6, но заменяли (6-бромпиридин-2-ил)метанол (5бромпиридин-2-ил)метанолом, с получением соединения В-20 (15,6%) в виде белого твердого вещества после обработки диэтиловым эфиром. С₂₂Н1₈ВгГЫ₄О. ЖХМС: Βΐ 3,29, т/ζ 453 [М+Н]⁺ (способ 7).

Ή ЯМР (400 МГц, СССР) δ м.д. 4,47 (дт, 1=27,0, 4,6 Гц, 2Н), 4,84 (дт, 1=46,9, 4,9 Гц, 2Н), 5,18 (с, 2Н), 6,93-6,98 (м, 2Н), 7,17-7,20 (м, 2Н), 7,38-7,42 (м, 2Н), 7,45 (дд, 1=8,3, 0,7 Гц, 1Н), 7,70 (д, 1=0,5 Гц, 1Н), 7,85 (дд, 1=8,3, 2,3 Гц, 1Н), 8,47-8,51 (м, 2Н), 8,66 (дд, 1=2,3, 0,5 Гц, 1Н).

6- [[4-[1-(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-3-пиридинкарбонитрил (В21).

Следовали методике получения соединения В-6, но заменяли (6-бромпиридин-2-ил)метанол 6(гидроксиметил)никотинонитрилом, с получением соединения В-21 (39,4%) в виде белого твердого вещества. СЯ 1-₈1^;\,О. ЖХМС: Βΐ 3,2 1, т/ζ 400 [М+Н]⁺ (способ 4).

Ή ЯМР (500 МГц, СССР) δ м.д. 4,48 (дт, 1=27,2, 4,6 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 1=46,8, 4,6 Гц, 2Н), 5,28 (с, 2Н), 6,96 (ушир.д, 1=9,0 Гц, 2Н), 7,16-7,21 (м, 2Н), 7,39-7,45 (м, 2Н), 7,72 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,71 (с, 1Н), 8,00 (дд, 1=8,1, 2,0 Гц, 1Н), 8,49 (ушир.д, 1=6,1 Гц, 2Н), 8,87 (д, 1=1,4 Гц, 1Н).

2-[[4-[1-(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-5-(трифторметил)пиридин (В-22).

Следовали методике получения соединения В-6, но заменяли (6-бромпиридин-2-ил)метанол (5трифторметилпиридин-2-ил)метанолом, с получением соединения В-22 (29,4%) в виде белого твердого вещества. С₂₃Н₁₈Г₄Х₄О. ЖХМС: Βΐ 3,37, т/ζ 443 [М+Н]⁺ (способ 7).

Ή ЯМР (400 МГц, СССР) δ м.д. 4,48 (дт, 1=27,0, 4,6 Гц, 2Н), 4,84 (дт, 1=46,9, 4,6 Гц, 2Н), 5,29 (с, 2Н), 6,95-7,00 (м, 2Н), 7,16-7,21 (м, 2Н), 7,39-7,45 (м, 2Н), 7,70 (д, 1=6,5 Гц, 1Н), 7,70 (с, 1Н), 7,97 (дд, 1=8,2, 2,0 Гц, 1Н), 8,46-8,53 (м, 2Н), 8,86 (ушир.с, 1Н).

5-Циклопропил-2-[[4-[1-(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин (В-23).

Следовали методике получения соединения В-4, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол (5циклопропилпиридин-2-ил)метанолом, с получением соединения В-23 в виде бесцветного масла, которое отверждалось при стоянии. В завершение обработки соединение промывали диизопропиловым эфиром с получением конечного соединения В-23 (45,6%) в виде белого твердого вещества. Ср₅Н₂₃,ЕМ|О. ЖХМС: Βΐ 3,24, т/ζ 415 [М+Н]⁺ (способ 7).

Ή ЯМР (500 МГц, СССР) δ м.д. 0,67-0,78 (м, 2Н), 0,96-1,10 (м, 2Н), 1,87-1,95 (м, 1Н), 4,47 (дт, 1=26,9, 4,8 Гц, 2Н), 4,84 (дт, 1=47,1, 4,7 Гц, 2Н), 5,19 (с, 2Н), 6,94-6,99 (м, 2Н), 7,16-7,21 (м, 2Н), 7,32 (дд, 1=8,1, 2,3 Гц, 1Н), 7,36-7,41 (м, 3Н), 7,70 (с, 1Н), 8,40 (д, 1=2,0 Гц, 1Н), 8,48 (ушир.д, 1=6,1 Гц, 2Н).

2-[[4-[1-(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-6-метоксипиридин-сукцинат (В-24).

Следовали методике получения соединения В-4, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол (6метоксипиридин-2-ил)метанолом, с получением соединения В-24, которое преобразовывали в соответствующую соль янтарной кислоты аналогично тому, как описано выше для конечного соединения В-3, которую кристаллизовали из диэтилового эфира, с получением соли янтарной кислоты конечного соединения В-24 (25,8%) в виде белого твердого вещества. С₂₃Н₂1ГХ₄О₂-С₄Н₆О₄. ЖХМС: Βΐ 4,26, т/ζ 405 [М+Н]⁺ (способ 2).

Ή ЯМР (500 МГц, ДМСО-й₆) δ м.д. 2,42 (с, 4Н), 3,86 (с, 3Н), 4,49 (дт, 1=27,7, 4,9 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 1=47,4, 4,9 Гц, 2Н), 5,11 (с, 2Н), 6,77 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,03-7,09 (м, 2Н), 7,12 (д, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,20-7,25 (м, 2Н), 7,31-7,36 (м, 2Н), 7,74 (дд, 1=8,2, 7,4 Гц, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 8,42-8,49 (м, 2Н), 12,17 (ушир.с, 2Н).

2-Этокси-6-[[4-[1-(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]пиридин-сукцинат (В-25).

Следовали методике получения соединения В-4, но заменяли (5-метоксипиридин-2-ил)метанол (6этоксипиридин-2-ил)метанолом, с получением соединения В-25, которое преобразовывали в соответствующую соль янтарной кислоты, аналогично тому, как описано выше для конечного соединения В-3, которую кристаллизовали из диэтилового эфира, с получением соли янтарной кислоты конечного соединения В-25 (39,6%>) в виде белого твердого вещества. С₂₄Н₂₃ГХ₄О₂-С₄Н₆О₄. ЖХМС: Βΐ 3,56, т/ζ 419 [М+Н]⁺ (способ 7).

- 21 019673

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆) δ м.д. 1,31 (т, 1=6,9 Гц, 3Н), 2,41 (с, 4Н), 4,30 (кв, 1=7,2 Гц, 2Н), 4,49 (дт, 1=27,7, 4,6 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 1=47,4, 4,9 Гц, 2Н), 5,10 (с, 2Н), 6,74 (д, 1=8,3 Гц, 1Н), 7,03-7,08 (м, 2Н), 7,10 (д, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,20-7,25 (м, 2Н), 7,29-7,37 (м, 2Н), 7,73 (дд, 1=8,2, 7,3 Гц, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 8,438,48 (м, 2Н), 12,19 (ушир.с, 2Н).

6-[[4-[1-(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-2-пиридинкарбонитрил (В26).

Следовали методике получения соединения В-6, но заменяли (6-бромпиридин-2-ил)метанол 6гидроксиметил-2-цианопиридином, с получением соединения В-26 (40,8%) в виде белого твердого вещества после обработки диэтиловым эфиром. С₂зН₁₈ГЫ₅О. ЖХМС: К1 2,68, т/ζ 400 [М+Н]⁺ (способ 7).

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆) δ м.д. 4,50 (дт, 1=27,5, 4,4 Гц, 2Н), 4,85 (дт, 1=47,4, 4,9 Гц, 2Н), 5,28 (с, 2Н), 7,05-7,10 (м, 2Н), 7,23 (ушир.д, 1=4,4 Гц, 2Н), 7,33-7,38 (м, 2Н), 7,89 (дд, 1=7,9, 0,9 Гц, 1Н), 8,03 (дд, 1=7,6, 0,9 Гц, 1Н), 8,13 (т, 1=7,7 Гц, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 8,47 (ушир.с, 2Н).

-Бром-2-[[4-[1 -(2-Фторэтил)-4-(4-пиридинил)-1Н-пиразол-3 -ил] фенокси]метил] -6-метоксипиридин (В-27).

Следовали методике получения соединения В-6, но заменяли (6-бромпиридин-2-ил)метанол 3-6ром2-(гидроксиметил)-6-метоксипиридином, с получением конечного соединения В-27 (54,2%) в виде белого твердого вещества. С₂₃Н₂₀ВгГЫ₄О₂. ЖХМС: К1 4,58, т/ζ 483 [М+Н]⁺ (способ 2).

Ή ЯМР (400 МГц, С1)С1_;) δ м.д. 3,85 (с, 3Н), 4,47 (дт, 1=26,8, 4,6 Гц, 2Н), 4,84 (дт, 1=46,9, 4,6 Гц, 2Н), 5,22 (с, 2Н), 6,61 (д, 1=8,6 Гц, 1Н), 6,98-7,03 (м, 2Н), 7,17-7,21 (м, 2Н), 7,36-7,41 (м, 2Н), 7,68-7,72 (м, 2Н), 8,46-8,51 (м, 2Н).

2-[[4-[1-(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)-7Н-пиразол-3-ил]фенокси]метил]-3,4,5триметилпиридин-сукцинат (В-28).

Следовали методике получения соединения В-3, но заменяли 3,5-диметил-2-гидроксиметилпиридин (3,4,5-триметилпиридин-2-ил)метанолом, с получением конечного соединения В-28 (56,8%) в форме соли янтарной кислоты в виде белого твердого вещества. С₂5Н₂₅РМ₄О-С₄Н₆О₄. ЖХМС: К1 3,53, т/ζ 417 [М+Н]⁺ (способ 6).

Ή ЯМР (500 МГц, ДМСО-6₆) δ м.д. 2,26 (с, 3Н), 2,30 (с, 3Н), 2,35 (с, 3Н), 2,48 (с, 4Н), 4,55 (дт, 1=27,7, 4,6 Гц, 2Н), 4,91 (дт, 1=47,1, 4,6 Гц, 2Н), 5,23 (с, 2Н), 7,09-7,14 (м, 2Н), 7,27-7,31 (м, 2Н), 7,35-7,41 (м, 2Н), 8,21 (с, 1Н), 8,28 (с, 1Н), 8,50-8,54 (м, 2Н), 12,22 (ушир.с, 2Н).

Ш уйго анализ.

Рекомбинантный ΡΌΕ10Α крысы (γΡΌΕ10Α) экспрессировали в 8Г9 клетках с использованием рекомбинантной ΓΡΌΕ10Α бакуловирусной конструкции. Клетки собирали через 48 ч после инфицирования и ΓΡΌΕ10Α белок очищали хроматографией с использованием метало-хелатного соединения на N1сефарозе 6ГГ. Тестируемые соединения растворяли и разбавляли в 100% ДМСО до 100-кратной концентрации относительно конечной концентрации в анализе. Разведения соединений (0,4 мкл) добавляли в 384-луночные планшеты к 20 мкл инкубационного буфера (50 мМ Тп8 рН 7,8, 8,3 мМ МдС1₂, 1,7 мМ ΕΟΤΑ). Добавляли 10 мкл ΓΡΌΕ10Α фермента в инкубационном буфере и реакцию начинали путем добавления 10 мкл субстрата до конечной концентрации 60 нМ сАМР и 0,008 мкКи 3Н-сАМР. Реакционную смесь инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. После инкубации реакцию останавливали с использованием 20 мкл 17,8 мг/мл ΡΌΕ 8ΡΑ шариков. После осаждения шариков в течение 30 мин измеряли радиоактивность в сцинтилляционном счетчике ΡογΚιπ Итог Торсоии! и результаты выражали как число импульсов в 1 мин. Для получения значений слепого эксперимента фермент не использовали в реакции и заменяли инкубационным буфером. Контрольные значения получали путем добавления конечной концентрации 1% ДМСО вместо соединения. Наиболее соответствующую кривую подгоняли с использованием метода суммы минимальных квадратов к графику, представляющему процент контрольного значения минус слепой контроль против концентрации соединения, и р[С'?5₀ значение получали из этой кривой.

- 22 019673 ^Ν=ϊ\

Конечные соединения

№ соед.	К1	К2	Физические данные	Темпера тура плавления °С	РЮ50
В1	сн2сн2е	6-метил	. 2НС1	227,22 (ϋ3Ο	8, 6
В2	СН2СН2СН2Е	6-метил	.ХНС1	106,51 Ф5С)	7, 7
вз	сн2сн2е	3, 5-диметил	.сукцинат	138,81 (ϋΕΟ	8,79
В4	сн2сн2е	5-метокси	Свободное основание	117,52 (ПЗС >	8, 48
В5	СН2СГз	5-метокси	Свободное основание	136,3	8,29
Вб	СН2СН2Г	б-бром	.0,75 сукцинат	108,78 (ϋΞΟ	8, 01
В7	СН2СН2Г	б-трифторметил	Свободное основание		6, 96
В8	сн2сн2е	6-циклспропил	Свободное основание	91,25 (ПЗС)	7, 48
В9	СН2СГ3	3-метокси	Свободное основание	147, 0	8, 29
вю	СН2СР3	3- ¢2фторэтокси)	.сукцинат	140,72 ФЗС)	8, 2
В11	СН2СГз	5-(2- фторэтокси)	Свободное основание	разлож.	6, 97
В12	СН2СН2СН2Г	3-метокси	Свободное основание	165, 9	7, 88
В13	СН2СН2СН2К	3- ¢2- фторэтокси)	.сукцинат	118,38 (ВЗС)	7, 86
В14	сн2сн2сн2е	5-метокси	.0, 5 сукцинат	126, 64 ФЗС)	7, 84
В15	СН2СН2СН2К	5- ¢2- фторэтокси)	Свободное основание	206, 8	6, 6
В16	СН2СН2Г	3-метокси	.сукцинат	178,95 фЗС)	8, 43

В17	СН2СН2Г	3— (2 — фторэтокси)	.сукцинат	114,18 (ПЗС)	8, 42
В18	СН2СН2Г	3-фтор	.1,2 сукцинат		7,79
В19	СН2СН2Г	5-(2- фторэтокси)	Свободное основание	212,7	7
В20	СН2СН2Р	5-бром	Свободное основание	125, 8	8, 02
В21	СН2СН2Г	5-циано	Свободное основание	разлож.	7,1
В22	СН2СН2К	5-трифторме тил	Свободное основание	133,23 ФЗС)	7, 04
В23	сн2сн2г	5-циклопропил	Свободное основание	разлож.	7, 46
В24	СН2СН2Г	6-метокси	.сукцинат	113,25 Ф5С)	8, 53
В25	СН2СН2Г	б-этокси	.сукцинат	119,65 ФЗС)	7, 68
В2 6	СН2СН2Г	6-циано	Свободное основание	148,7	7,48
В27	СН2СН2Г	3-бром-6метокси	Свободное основание	119,2	7,55
В2 8	сн2сн2г	3,4,5-триметил	.сукцинат	197,08 (050	8,36

С. Аналитическая часть.

Температуры плавления.

Значения представляют собой максимальные значения, и их получали с экспериментальными неточностями, которые обычно связывают с этим аналитическим методом.

Для ряда соединений, где указано О8С в представленной выше таблице, температуры плавления определяли при помощи Э8С823е (Мей1ег-То1е4о). Температуры плавления измеряли с температурным градиентом 30°С/1 мин. Максимальная температура составляла 400°С.

Для ряда соединений температуру плавления определяли в открытых капиллярных пробирках на устройстве МеШег РР62. Температуру плавления измеряли с температурным градиентом 10°С/мин. Максимальная температура составляла 300°С. Температуры плавления считывали с цифрового дисплея.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

'Н ЯМР спектры регистрировали либо на спектрометре Вгикег ΌΡΧ-400, либо Вгикег АУ-500 со стандартными последовательностями импульсов, работающих при 400 и 500 МГц соответственно. Хи

- 23 019673 мические сдвиги (δ) указывали в миллионных долях (м.д.) ниже от тетраметилсилана (ТМЗ), который использовали в качестве внутреннего стандарта.

ЖХМС-методы.

Для ЖХМС-характеризации соединений по настоящему изобретению использовали следующие способы.

Общая методика для НР 1100-МЗ оборудования (ТОР или ЗОЭ).

ВЭЖХ измерение осуществляли с использованием НР 1100 (АдПеп! ТесЬпо1од1ек) системы, включающей насос (квадратурный или бинарный) с дегазатором, автоматическим пробоотборником, колоночным нагревателем, детектором на диодной матрице (ΌΑΌ) и колонкой, указанной в соответствующих способах. МЗ детектор был оснащен либо источником ионизации электрораспылением, либо ЕЗСЧ источником двойной ионизации (электрораспыление в сочетании с химической ионизацией атмосферного давления). Азот использовали в качестве распыляющего газа. Температуру источника поддерживали либо при 140°С, либо при 100°С. Сбор данных осуществляли либо с использованием программы МаккЬупхОреп1упх, либо программы СЬеткаПоп-АдПеп! Эа1а Вго\\'кег.

Общая методика для АссцЮт-ЗОЭ оборудования.

ИРЬС (сверхэффективная жидкостная хроматография) измерения осуществляли с использованием Асс.|ш1у ИРЬС (\Уа1егк) системы, включающей пробоотборник, бинарный насос с дегазатором, четырехколоночный нагреватель, детектор на диодной матрице (ОАЭ) и колонку, указанную в соответствующих способах. МЗ детектор был оснащен ЕЗСЧ источником двойной ионизации (электрораспыление в сочетании с химической ионизацией атмосферного давления). Азот использовали в качестве распыляющего газа. Температуру источника поддерживали при 140°С. Сбор данных осуществляли с использованием программы МаккЬупх-Ореп1упх.

МС методика для ЖХ способов 1 и 2.

Масс-спектры высокого разрешения (времяпролетный детектор ТОР) получали только в режиме положительной ионизации или в режимах положительной/отрицательной ионизации путем сканирования от 100 до 750 ед.мас. (итак). Напряжение на игле капилляра было 2,5 кВ для режима положительной ионизации и 2,9 кВ для режима отрицательной ионизации. Напряжение на конусе было 20 В для обоих режимов положительной и отрицательной ионизации. Стандартное вещество лейцин-энкефалин использовали для точного определения массы.

МС методика для ЖХ способов 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

Масс-спектры низкого разрешения (одинарный квадрупольный детектор ЗОЭ) получали только в режиме положительной ионизации или в режимах положительной/отрицательной ионизации путем сканирования от 100 до 1000 ед.мас. (итак). Напряжение на игле капилляра было 3 кВ. Для режима положительной ионизации напряжение на конусе составляло 20, 25 или 20/50 В. Для режима отрицательной ионизации напряжение на конусе составляло 30 В.

Способ 1.

В добавление к общей методике: ВЭЖХ с обращенной фазой осуществляли на картридже ХЭВ-С18 (1,8 мкм, 2,2x30 мм) от АдПеп! со скоростью потока 1 мл/мин при 60°С. Используемые условия градиента: 90% (0,5 г/л раствора ацетата аммония), 5% В (ацетонитрил), 5% С (метанол) до 50% В и 50% С, затем до 100% В, и уравновешивали до начальных условий к 9,0 мин эксперимента. Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Способ 2.

В добавление к общей методике: ВЭЖХ с обращенной фазой осуществляли на колонке ЗипПге-С18 (2,5 мкм, 2,2x30 мм) от ^а!егк со скоростью потока 1,0 мл/мин при 60°С. Используемые условия градиента: 95% (0,5 г/л раствора ацетата аммония+5% ацетонитрила), 5% В (ацетонитрил или ацетонитрил/метанол 1/1), до 100% В, и уравновешивали до начальных условий к 9 или 7 мин эксперимента. Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Способ 3.

В добавление к общей методике: ВЭЖХ с обращенной фазой осуществляли на картридже ХЭВ-С18 (1,8 мкм, 2,2x30 мм) от АдПеп! со скоростью потока 0,8 мл/мин при 60°С. Используемые условия градиента: 90% (0,5 г/л раствора ацетата аммония), 10% В (смесь ацетонитрил/метанол, 1/1), до 100% В, и уравновешивали до начальных условий к 9,0 мин эксперимента. Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Способ 4.

В добавление к общей методике: ВЭЖХ с обращенной фазой осуществляли на колонке ЗипПге-С18 (2,5 мкм, 2,2x30 мм) от ^а!егк со скоростью потока 1,0 мл/мин при 60°С. Используемые условия градиента: 95% (0,5 г/л раствора ацетата аммония+5% ацетонитрила), 5% В (смесь ацетонитрил/метанол, 1/1), до 100% В, и уравновешивали до начальных условий к 7 мин эксперимента. Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Способ 5.

В добавление к общей методике: ВЭЖХ с обращенной фазой осуществляли на колонке ХВППдеС18 (2,5 мкм, 2,2x30 мм) от ^а!егк со скоростью потока 1,0 мл/мин при 60°С. Используемые условия

- 24 019673 градиента: 95% (0,5 г/л раствора ацетата аммония+5% ацетонитрила), 5% В (смесь ацетонитрил/метанол, 1/1), до 100% В, и уравновешивали до начальных условий к 9,0 мин эксперимента. Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Способ 6.

В добавление к общей методике: ВЭЖХ с обращенной фазой осуществляли на колонке Есйрке Р1и§С18 (3,5 мкм, 2,2x30 мм) от Ащ1еп1 со скоростью потока 1,0 мл/мин при 60°С. Используемые условия градиента: 95% (0,5 г/л раствора ацетата аммония+5% ацетонитрила), 5% В (ацетонитрил или смесь ацетонитрил/метанол, 1/1), до 100% В, и уравновешивали до начальных условий к 7 мин эксперимента. Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Способ 7.

В добавление к общей методике: ИРЬС с обращенной фазой осуществляли на ВЕН-С18 колонки (1,7 мкм, 2,2x50 мм) от \Уа1ег5 со скоростью потока 0,8 мл/мин при 60°С. Используемые условия градиента: 95% (0,5 г/л раствора ацетата аммония+5% ацетонитрила), 5% В (смесь ацетонитрил/метанол, 1/1), до 20% А, 8 0% В, затем до 100% В, и уравновешивали до начальных условий к 7 или 5 мин эксперимента. Объем вводимой пробы - 0,5 мкл.

Способ 8.

В добавление к общей методике: ИРЬС с обращенной фазой осуществляли на колонке ВЕН-С18 (1,7 мкм, 2,2x50 мм) от \Уа1ег5 со скоростью потока 1,0 мл/мин при 50°С. Используемые условия градиента: 95% (0,5 г/л раствора ацетата аммония+5% ацетонитрила), 5% В (ацетонитрил), до 40% А, 60% В, затем до 5% А, 95% В, и уравновешивали до начальных условий к 5 мин эксперимента. Объем вводимой пробы - 0,5 мкл.

II. Исследования биораспределения.

Общий способ.

Исследования биораспределения осуществляли с использованием здоровых самцов крыс ХУМег (масса тела 200-500 г) через 2, 30 и 60 мин после инъекции (п.и.) (п=3/точка времени). Для [¹⁸Е]В-4 исследовали только точки времени 2 и 30 мин. Крысам вводили путем инъекции около 30 мкКи радиоактивного индикатора через хвостовую вену под анестезией (2,5% изофлурана в О₂ при скорости потока 1 л/1 мин) и их умерщвляли путем декапитации в указанных выше точках времени. Кровь и основные органы собирали в тарированные пробирки и взвешивали. Радиоактивность в крови, органах и других частях тела измеряли с использованием автоматического гамма-счетчика. Распределение радиоактивности в различных частях тела в различных точках времени п.и. радиоактивного индикатора рассчитывали и выражали в виде процента от введенной путем инъекции дозы (% ΙΌ) и в виде процента от введенной путем инъекции дозы на 1 г ткани (% ΙΌ/г) для выбранных органов. % ΙΌ рассчитывали в виде имп./мин в органе/общее полученное количество имп./мин. Для расчета общей радиоактивности в крови массу крови принимали за 7% от массы тела.

А. Результаты анализа биораспределения для соединения [¹⁸Е]В-1.

Результаты ίη νΐνο анализа распределения [¹⁸Е]В-1 у самцов крыс ХУМаг представлены в табл. 1 и 2. В табл. 1 представлен % ΙΌ на момент времени 2, 30 и 60 мин п.и. радиорадиоактивного индикатора. В точке времени 2 мин п.и. около 4,0% от введенной дозы присутствовало в крови, и это количество уменьшалось до 2,2% к точке времени 60 мин после инъекции радиоактивного индикатора. Общее начальное накопление радиоактивного индикатора в головном мозге составляло 0,59%, при этом 0,09% в мозжечке, и 0,49% ΙΌ в остальных частях головного мозга. В точке времени 60 мин после введения радиорадиоактивного индикатора 54% ΙΌ присутствовало в печени и кишечнике. Из-за липофильного характера радиоактивного индикатора его выведение с мочой было минимальным и только ~2,6% ΙΌ присутствовало в мочевой системе через 60 мин п.и. Наблюдали увеличивающееся накопление в желудке (3% ΙΌ, 10% ΙΌ, 17% ΙΌ в точке времени соответственно 2, 30 и 60 мин п.и.). Благодаря большой массе туловища животного значительное количество введенной дозы (~28% ΙΌ) присутствовало в туловище животного во всех точках времени, в которых осуществляли исследования. Обычно масса туловища животного составляет до >90% от общей массы тела животного. В табл. 2 представлены значения % ΙΌ/г для различных органов в точках времени 2, 30 и 60 мин п.и.

- 25 019673

Таблица 1

Биораспределение [¹⁸Р]В-1 у здоровых крыс в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и.

Орган	% Ιϋ*
2 мин	30 мин	60 мин
Моча	0, 09±0, 1	0,2910,0	1,2210,2
Почки	4,2410,5	1,4410,2	1,38+0,1
Печень	41,94+2,2	45, 2915, 2	34,4918,0
Селезенка+поджелудочная железа	1,92+0,2	0,5710,2	0, 43+0,1
Легкие	0,9210,2	0,42 + 0,1	0,2610,1
Сердце	0,60+0,1	0,21+0,0	0,16+0, 0
Желудок	3,09±0,1	9,73+1,7	16, 7414, 6
Кишечник	10,79+1,5	14,67 + 3,3	19, 61 + 1,5
Полосатое тело	0,03610,012	0,013±0,001	0,006+0,002
Гиппокамп	0,01810,004	0, 006+0, 000	0,005+0,001
Кора головного мозга Остальная часть	0, 06910, 008	0, 026+0, 004	0,018+0,004
головного мозга	0,36710,054	0, 127±0, 010	0, 116+0,027
Головной мозг в целом	0,49010,067	0,17210,012	0, 145±0,032
Мозжечок 0	,09110,018	0,02810,000 0,023+0,005
Кровь	3,96±0,5	2,4010,4	2,1610,4
Туловище	33,1212,3	25,5012,1	23,6813,9

Данные выражали как среднее значение - 80;

η=3 на точку времени;

^а процент от введенной путем инъекции дозы рассчитывали как имп./мин в органе/общее полученное значение имп./мин.

Таблица 2

Концентрация [¹⁸Р]В-1 в различных органах в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и.

Орган	% 1Р/га
2 мин	30 мин	60 мин
Почки	1,7510,24	0,6110,11	0,4610,02
Печень	3,40+0,31	3,7210,87	2,5310,23
Селезенка+поджелудочная железа	1,47+0,15	0,3910,04	0,26+0,07
Легкие	0,6910,34	0,2710,04	0,1610,05
Сердце	0,7610,09	0,2410,03	0,1510,04
Полосатое тело	0,64810,075	0,25010,029	0,16210,042
Гиппокамп	0,30710,041	0,09610,012	0,074+0,050
Кора головного мозга Остальная часть	0,734+0,148	0,20410,016	0,113+0,031
головного мозга	0,41110,023	0,13810,013	0,107+0,030
Головной мозг в целом	0,44410,026	0,148+0,014	0, 10510,035
Мозжечок	0,60710,019	0,14510,020	0,07910,021
Кровь	0,2110,02	0,1210,01	0,1010,02
Головной мозг+мозжечок	0,47 + 0,03	0,1510,02	0,1010,03

Данные выражали как среднее значение - 80; η=3 на точку времени;

^а % Ю г значения рассчитывали как % Ю масса органа, г.

Поскольку почки и печень являются органами выведения, они имели самые высокие значения %

ГО/г, около 1,8% ГО/г для почек и 3,4% ГО/г для печени в точке времени 2 мин п.и. Значения % ГО/г для различных отделов головного мозга, а именно полосатого тела, гиппокампа, коры головного мозга и мозжечка, представлены в табл. 2. Для введения поправки на разницу в массе тела между разными животными значение (%) ГО/г ткани нормализовали в соответствии с массой тела. Нормализованные значения представлены в табл. 3. Для всех исследованных областей головного мозга наблюдали значительное уменьшение концентрации радиоактивности в период времени от 2 до 30 мин (<0,07% ГО/г, скорректированное на массу тела в точке времени 30 мин п.и.), что указывало на значительное вымывание радиоактивного индикатора из всех исследуемых областей головного мозга.

Таблица 3

Концентрация [¹⁸Р]В-1 в различных органах в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и., нормализованная в соответствии с массой тела животного

Орган	% Ιϋ/г х масса тела в кга
2 мин	30 мин	60 мин
Почки	0,4710,05	0,1710,01	0,15+0,01
Печень	0,92+0,05	1,02+0,13	0,8110,13
Селезенка+поджелудочная железа	0,40+0,03	0,1110,02	0,0810,02
Легкие	0,1910,08	0,08+0,02	0,05±0,02
Сердце	0,21+0,02	0,07+0,01	0,05+0,01
Полосатое тело	0,175+0,02	0,070+0,01	0,051+0,01
Гиппокамп	0,08310,01	0,027+0,01	0,02310,02
Кора головного мозга Остальная часть	0,19910,04	0,05710,01	0,036+0,01
головного мозга	0, 111 + 0,00	0,039+0,01	0,03410,01
Головной мозг в целом	0, 120+0,01	0,04210,01	0,033+0,01
Мозжечок	0,16410,01	0,041+0,01	0,025+0,01
Кровь	0,06+0,01	0,03+0,01	0,03+0,01
Головной мозг+мозжечок	0,13+0,01	0,0410,01	0,03+0,01

Данные выражали как среднее значение - 80; η=3 на точку времени;

^а % ГО/'г значения рассчитывали как % Ю масса органа, г.

В табл. 4 представлены отношения 2/30 мин и 2/60 мин значений % ГО/г (нормализованных в соот

- 26 019673 ветствии с массой тела животного) для различных областей головного мозга. Для всех областей головного мозга отношения 2/30 мин составляли >2,49, указывая на то, что уже началось вымывание в течение этого периода времени. Самое медленное вымывание наблюдали для полосатого тела, представляющего собой область с самой высокой экспрессией ΡΌΕ 10.

Таблица 4

Выведение [¹⁸Е]В-1 из различных областей головного мозга, рассчитанное как отношение 2/30 мин и 2/60 мин для % Ш/г значений (нормализованных в соответствии с массой тела животного)

Область головного мозга	мин/30 мин	2 мин/60 мин
Полосатое тело	2,49	3, 41
Гиппокамп	3,06	3, 63
Кора головного мозга	3,47	5, 55
Остальная часть	2,36	3,29
головного мозга
Головной мозг в целом	2,88	3, 60
Мозжечок	4,01	6, 60
Кровь	1, 65	1, 83

В табл. 5 представлены отношения между полосатым телом и другими областями головного мозга, а также кровью в различных точках времени после инъекции [¹⁸Е]В-1. Полосатое тело рассматривали как ΡΌΕ 10А-обогащенную область и мозжечок как сравнительную область. Поэтому высокое отношение полосатое тело-к-мозжечку желательно для получения хорошего качества изображения ш νί\Ό. Максимальное отношение полосатое тело-к-мозжечку составляло около 2, что является достаточно низким для хорошего агента визуализации ΡΌΕ10.

Результаты этих исследований биораспределения показывают, что отсутствует какое-либо существенное удерживание [¹⁸Е]В-1 в ΡΌΕ 10А-обогащенной области, т.е. в полосатом теле.

Таблица 5

Отношения полосатое тело-к-другим областям головного мозга (рассчитанное из % Ш/г значений, нормализованных в соответствии с массой тела животного) в точке времени 2, 30 и 60 мин после инъекции [¹⁸Е]В-1В

Область головного мозга	2 мин	30 мин	60 мин
Поло са то е тело/гиппокамп	2, 11	2, 59	2,24
Полосатое тело/кора	0, 88	1,22	1, 43
головного мозга
Полосатое тело/мозжечок	1,07	1,72	2,06
Полосатое тело/кровь	з, ю	2, 05	1, 66

В. Результаты анализа биораспределения для соединения [Г]В-3

Результаты ш νίνυ исследования распределения [¹⁸Е]В-3 у самцов крыс \У151аг представлены в табл. 6 и 7. В табл. 6 представлены значения % Ш в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и. радиорадиоактивного индикатора. Общее начальное накопление радиоактивного индикатора в головном мозге достаточно низкое: 0,39% Ш в точке времени 2 мин п.и., при этом 0,31% Ш в головном мозге и 0,07% Ш в мозжечке. В точке времени 30 мин п.и. 0,035% Ш обнаружено в полосатом теле, которое имеет самую высокую экспрессию ΡΌΕ10Α и где радиоактивный индикатор, как предполагают, должен продемонстрировать связывание. Скорость выведения из кровотока достаточно медленная. В точке времени 2 мин п.и. около 4,0% от введенной дозы присутствовало в крови, и это количество уменьшалось до 3,3% к 60 мин п.и. Радиоактивный индикатор выводился преимущественно посредством гепатобилиарной системы, поскольку в целом 50% Ш обнаружено в печени и кишечнике через 60 мин после введения радиорадиоактивного индикатора. Из-за липофильного характера радиоактивного индикатора его выведение с мочой было минимальным и только ~3,2% Ш обнаружено в мочевой системе через 60 мин п.и. Также неожиданно высокую аккумуляцию наблюдали в желудке (2,6% Ш, 6,7% Ш, 20% Ш в точке времени соответственно 2, 30 и 60 мин п.и.). Благодаря большой массе туловища животного значительное количество введенной дозы (~27% Ш) присутствовало в туловище животного во всех точках времени, в которых осуществляли исследования. Обычно масса туловища животного составляет до >90% от общей массы тела животного.

В табл. 7 представлены значения % Ш/г для различных органов в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и.

- 27 019673

Таблица 6

Биораспределение [¹⁸Р]В-3 у здоровых крыс в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и. * мин 60 мин

Орган мин

Моча	0,17±0,0	1, 11+0,	, 2	1,69+0,2
Почки	3,66±0,6	1, 22 + 0,	.2	1,48 + 0,0
Печень	47,78+2,3	42,62 + 1		30,31+5,7
Селезенка+поджелудочная	1,01+0,3	0,31+0,	, 1	0,31+0,0
железа
Легкие	0,72 + 0, 1	0, 47 + 0,	, 1	0,38 + 0,1
Сердце	0,39+0,0	0, 18±0,	, 0	0,18±0,0
Желудок	2,55+0,4	6,70+1,	, 2	19,96+3,9
Кишечник	8,78 + 1,0	21,48 + 2	, 5	19,44+2,8
Полосатое тело	0,023+0,006	0,035+0,	006	0,030+0,006
Гиппокамп	0,011+0,002	0,006+0,	001	0,006+0,002
Кора головного мозга	0,035+0,010	0,019+0,	002	0,017+0,002
Остальная часть
0,236+0,038	0,121+0,	025	0,115+0,026
головного мозга
Головной мозг в целом	0,305+0,049	0,180+0,	027	0,169+0,032
Мозжечок	0,071+0,016	0,026+0,	004	0,023+0,009
Кровь	3,98 + 0,4	3,93+0,	. 4	3,34+0,7
Туловище	32,20+1,2	23,51±2	, 0	24,04+1,5

Данные выражали как среднее значение ±8Ώ; п=3 на точку времени;

^а процент от введенной путем инъекции дозы рассчитывали как имп./мин в органе/общее полученное значение имп./мин.

Таблица 7

Концентрация [¹⁸Р]В-3 в различных органах в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и.

Орган	%Ш/га
2 мин	30 мин	60 мин
Почки	1,86+0,27	0,61+0,06	0,48+0,02
Печень	5,52+0,17	4,72+0,16	2,44+0,40
Селезенка+поджелудочная железа	1,09+0,16	0,30+0,05	0, 20+0,02
Легкие	0,58+0,08	0,37+0,07	0,24+0,03
Сердце	0,58+0,11	0,24+0,02	0,16+0,02
Полосатое тело	0,462+0,059	0,575+0,098	0,564+0,156
Гиппокамп	0,202+0,033	0,095+0,010	0,077+0,015
Кора головного мозга Остальная часть	0,308+0,038	0,122+0,014	0,086+0,020
головного мозга	0,281+0,045	0,150+0,014	0,123+0,023
Головной мозг в целом	0,288+0,042	0,166+0,013	0,133+0,023
Мозжечок	0,286+0,064	0,107+0,016	0,085+0,030
Кровь	0,27+0,01	0,27+0,02	0,15+0,03
Головной мозг+мозжечок	0,30+0,08	0,16+0,01	0, 13+0,02

Данные выражали как среднее значение ±8Ώ; п=3 на точку времени;

^а % ГО/'г значения рассчитывали как % П ) масса органа, г.

Поскольку почки и печень являются органами выведения, они имели самые высокие значения % ΣΌ/г, около 1,9% ΣΌ/г для почек и 5,5% ΣΌ/г для печени в точке времени 2 мин п.и. Значения % ΣΌ/г для различных областей головного мозга, а именно полосатого тела, гиппокампа, коры головного мозга и мозжечка, представлены в табл. 7. Для введения поправки на разницу в массе тела между различными животными значения % ΣΌ/г ткани нормализовали в соответствии с массой тела. Нормализованные значения представлены в табл. 8. В точке времени 2 мин п.и. самую высокую концентрацию радиоактивности в головном мозге наблюдали в области полосатого тела (0,098% ΣΌ/г, скорректировано на массу тела), и она увеличивалась со временем (0,221% ΣΌ/г корр. в точке времени 30 мин и 0,278% ΣΌ/г корр. в точке времени 60 мин п.и.). Эта аккумуляция радиоактивности в полосатом теле согласуется с более высокой экспрессией ΡΌΕ10 фермента в этой области. Для гиппокампа, коры головного мозга и мозжечка, областей с минимальной экспрессией РЭЕ10А, концентрация в точке времени 30 мин снижалась по сравнению с точкой времени 2 мин, указывая на вымывание радиоактивного индикатора из этих областей головного мозга. Небольшое увеличение в точке времени 60 мин для этих областей головного мозга может быть из-за образования радиоактивного метаболита(метаболитов), который проникает в головной мозг.

- 28 019673 % ΙΡ/г х масса тела в кг^а

Орган

Таблица 8 Концентрация [¹⁸Е]В-3 в различных органах в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и., нормализованная в соответствии с массой тела животного мин 30 мин 60 мин

Почки Печень	0,39+0,07	0,13±0, 1,00±0,	01 03	0,15+0, 0,77+0,	00 13
1,17+0,	07
Селезенка+поджелудочная железа	0,	,23+0,	04	0,06+0,	01	0,06+0,	01
Легкие	0,	,12±0,	02	0,08±0,	02	0,08±0,	01
Сердце	0	,12+0,	03	0,05+0,	01	0,05±0,	01
Полосатое тело	0,	098±0.	, 01	0,121±0	, 02	0, 178±0.	, 05
Гиппокамп	о.	043±0	, 01	0,020+0	, 00	0, 024+0,	, 00
Кора головного мозга	0/	066±0,	, 01	0,026±0	, 00	0, 027+0,	, 01
Остальная часть головного мозга	0,	060+0	, 01	0,032±0	, 00	0, 039+0,	, 01
Головной мозг в целом	о.	061±0	, 01	0,035±0	, 00	0, 042+0,	, 01
Мозжечок	о,	061±0	, 02	0,023±0	, 00	0, 027+0,	, 01
Кровь	0	,06+0,	01	0,06+0,	01	0,05±0,	01
Головной мозг+мозжечок	0,	,06+0,	01	0,03+0,	01	0,04±0,	01

В табл. 9 представлены отношения 2/30 мин и 2/60 мин для значений % ГО/г (нормализованных в соответствии с массой тела животного) для различных областей головного мозга. Что касается отношений 2 мин/30 мин, мозжечок имел самое высокое отношение 2,71, указывая на то, что скорость выведения радиоактивного индикатора из этой области самая высокая, затем следуют кора головного мозга (2,54) и гиппокамп (2,24), т.е. области с минимальной экспрессией РЭЕ10. Для полосатого тела, с другой стороны, 2/60 мин отношение (0,55) было меньше, чем 2/30 мин отношение (0,81), указывая на аккумуляцию [¹⁸Е]В-3 в РЭЕ 10А-обогащенном полосатом теле.

мин/30 мин 2 мин/60 мин

0, 81	0, 55
2,14	1,77
2, 54	2,39
1,90	1,53
1,75	1,45
2, 71	2,27
1,01	1,19

Таблица 9 Выведение [¹⁸Е]В-3 из различных областей головного мозга, рассчитанное как отношение 2/30 мин и 2/60 мин для значений % ГО/г (скорректированных на массу тела животного)

Область головного _______мозга_______

Полосатое тело Гиппокамп Кора головного мозга Остальная часть головного мозга Головной мозг в целом Мозжечок Кровь

В табл. 10 представлены отношения между полосатым телом и другими областями головного мозга, а также кровью в различных точках времени после инъекции [¹⁸Е]В-3. Полосатое тело рассматривали как РИЕ10А-обогащенную область и мозжечок как сравнительную область. Поэтому высокие отношения полосатое тело-к-мозжечку желательны для получения хорошего качества изображений ш у1уо. В точке времени 2 мин п.и. отношение полосатое тело-к-мозжечку составляло около 1,6, и это отношение увеличивалось до 6,6 к точке времени 60 мин после введения радиоактивного индикатора. Отношения полосатое тело-к-коре головного мозга и полосатое тело-к-гиппокампу также составляли >6,5 (60 мин п.и.), подтверждая специфическое удерживание [¹⁸Е]В-3 в полосатом теле.

Таблица 10

Отношения полосатое тело-к-другим областям головного мозга (рассчитанное из % ГО/г значений, нормализованных в соответствии с массой тела животного) в точке времени 2, 30 и 60 мин после инъекции [¹⁸Е]В-3

Область головного мозга 2 мин 30 мин 60 мин полосатое тело/гиппокамп полосатое тело/кора головного мозга полосатое тело/мозжечок полосатое тело/кровь

2,28	6, 03	7, 32
1,50	4, 69	6, 50
1, 61	5, 38	6, 63
1,73	2, 16	3,74

Результаты этих анализов биораспределения показывают, что хотя начальное накопление в головном мозге было достаточно низким, наблюдали непрерывную аккумуляцию [¹⁸Е]В-3 в полосатом теле, в то время как со временем происходило вымывание из сравнительной области мозжечка. Это предполагает специфическое удерживание [¹⁸Е]В-3 в РИЕ10А-обогащенной области, которой является полосатое тело.

С. Результаты анализа биораспределения для соединения [¹⁸Е]В-4.

Результаты ш у1уо исследования распределения [¹⁸Е]В-4 у самцов крыс \У|Чаг представлены в табл. 11 и 12. Из-за достаточно низкого начального накопления в головном мозге и низкой аккумуляции в полосатом теле анализ биораспределения в точке времени 60 мин не осуществляли. В табл. 11 представлены значения % ГО в точке времени 2 и 30 мин п.и. радиорадиоактивного индикатора. Общее начальное

- 29 019673 накопление радиоактивного индикатора в головном мозге достаточно низкое: 0,40% ГО в точке времени 2 мин п.и., при этом 0,32% ГО в головном мозге и 0,07% ГО в мозжечке. В точке времени 30 мин п.и. 0,019% ГО присутствовало в полосатом теле, что является достаточно низким показателем, поскольку полосатое тело имеет самую высокую экспрессию ΡΌΕ10Α, и в этой области головного мозга радиоактивный индикатор, как предполагают, должен продемонстрировать связывание. Радиоактивный индикатор выводился преимущественно через печень (47% ГО в точке времени 30 мин п.п.) в кишечник (20% ГО в точке времени 30 мин п.п.). Из-за липофильного характера радиоактивного индикатора его выведение с мочой было минимальным, и только ~2,5% ГО присутствовало в мочевой системе через 30 мин п.и. Также неожиданно высокую аккумуляцию наблюдали в желудке (2,8% ГО и 8% ГО в точке времени соответственно 2 и 30 мин п.и.). В табл. 12 представлены значения % ГО/г для различных органов в точке времени 2 и 30 мин п.и.

Таблица 11

Биораспределение [¹⁸Е]В-4 у здоровых крыс в точке времени 2 и 30 п.и.

Орган —	% ΙΟ*
2 мин	30 мин
Моча		0, 28±0,1	0,75±0	',1
Почки		4,99±0,2	1,71±0,	. 3
Печень		35,98±3,1	47,40±3	, 5
Селезенка+поджелудочная		2,37+0,2	0,56+0,	. 1
железа
Легкие		1,12±0,0	0,35±0,	. 1
Сердце		0,62±0,2	0,28±0,	1
Желудок		2, 80±0,2	8,08±3,	. 7
Кишечник		12,02±2,1	11,Э8±1	, 9
Полосатое тело	0	,018±0,003	0,019±0,	003
Гиппокамп	0	,00б±0,002	0,004±0,	000
Кора головного мозга	0	, 036±0,007	0,022±0,	002
Остальная часть	0	,257+0,014	0,162+0,	030
головного мозга
Головной мозг в целом	0	,317±0,014	0,208±0,	027
Мозжечок	0	,065±0,011	0,028±0,	002
Кровь		4,55+0,4	3,35+0,	5
Туловище		36,93±1,3	26,15±1	,2

Данные выражали как среднее значение ±8Ώ;

п=3 на точку времени;

^а процент от введенной путем инъекции дозы рассчитывали как имп./мин в органе/общее полученное значение имп./мин.

Таблица 12

Концентрация [¹⁸Е]В-4 в различных органах в точке времени 2 и 30 мин п.и.

Орган __________* ΙΡ/Γ*

	2 мин	30 мин
Почки	1,34±0,35	0,68±0,12
Печень	2,32±0,28	3,85+0,04
Селезенка+поджелудочная железа	1,17+0,03	0,40±0,02
Легкие	0, 4 6+0, 07	0,24 + 0,02
Сердце	0,45+0,13	0,24+0,04
Полосатое тело	0,467±0,002	0,458+0,041
Гиппокамп	0,193±0,031	0,108±0,013
Кора головного мозга Остальная часть	0,355+0,012	0,145+0,026 -
головного мозга	0,248±0,030	0,149±0,019
Головной мозг в целом	0,263±0,029	0,157+0,019
Мозжечок	0,231±0,031	0,104+0,005
Кровь	0,14±0,04	0, 18±0,03
Головной мозг+мозжечок	0,269+0,066	0,151+0,016

Данные выражали как среднее значение ±8Ώ;

п=3 на точку времени; ^а % II) ! значения рассчитывали как % II) масса органа, г.

Поскольку почки и печень являются органами выведения, они имели самые высокие значения % ГО/г, около 1,3% ГО/г для почек и 2,3% ГО/г для печени в точке времени 2 мин п.и. Значения % ГО/г для различных областей головного мозга, а именно полосатого тела, гиппокампа, коры головного мозга и мозжечка, представлены в табл. 2. Для введения поправки на разницу в массе тела между различными животными значение % ГО/г ткани нормализовали в соответствии с массой тела. Нормализованные значения представлены в табл. 13. В точке времени 2 мин п.и. самую высокую концентрацию радиоактивности в головном мозге наблюдали в области полосатого тела (0,226% ГО/г, скорректирована на массу тела). Для гиппокампа, коры головного мозга и мозжечка это значение составляло соответственно 0,091% ГО/г корр., 0,168% ГО/г корр., 0,109% ГО/г корр. В точке времени 30 мин п.и. концентрация в полосатом теле снижалась до 0,125% с поправкой на массу тела. Для других областей головного мозга вымывание было более высоким (<0,040% ГО/г с поправкой на массу тела в точке времени 30 мин п.и.).

- 30 019673

Таблица 13

Концентрация [¹⁸Р]В-4 в различных органах в точке времени 2 и 30 мин п.и., нормализованная в соответствии с массой тела животного % ΙΌ/г х масса тела в

Орган кг^а

	2 мин	30 мин
Почки	0,63 + 0,17	0,19±0,03
Печень	1,09+0,08	1,05+0,03
Селезенка+поджелудочная железа	0,55+0,03	0,11±0,01
Легкие	0,22+0,03	0,07+0,00
Сердце	0,21+0,06	0,07+0,01
Полосатое тело	0,22б±0,01	0,125+0,01
Гиппокамп	0,091±0,01	0, 029±0,00
Кора головного мозга Остальная часть	0,168+0,00	0, 040 + 0, 01
головного мозга	0,117±0,01	0,041+0,00
Головной мозг в целом	0,124+0,01	0, 043 + 0,00
Мозжечок	0,109±0,01	0,029±0,00
Кровь	0,07±0,01	0,05+0,01
Головной мозг+мозжечок	0,13±0,01	0,04 + 0,00

В табл. 14 представлены отношения 2/30 мин и 2/60 мин для значений % ΙΌ/г (нормализованные в соответствии с массой тела животного) для различных областей головного мозга. Что касается отношений 2/30 мин, кора головного мозга имела самое высокое отношение 4,24, указывая на то, что скорость выведения радиоактивного индикатора из этой области самая высокая, затем следуют мозжечок (3,82) и гиппокамп (3,08), которые не экспрессируют РОЕ10. Для полосатого тела отношение 2/30 мин было самым низким (1,80), указывая на более медленное вымывание [¹⁸Р]В-4 из РОЕ10А-обогащенной области полосатого тела.

Область головного мозга 2 мин/30 мин

Таблица 14

Выведение [¹⁸Р]В-4 из различных областей головного мозга, рассчитанное как отношение 2/30 мин для значений % ΙΌ/г, нормализованных в соответствии с массой тела животного

Полосатое тело	1, 80
Гиппокамп	3, 08
Кора головного мозга	4,24
Остальная часть	2, 87
головного мозга
Головной мозг в целом	2, 90
Мозжечок	3, 82
Кровь	1, 36

В табл. 15 представлены отношения между полосатым телом и другими областями головного мозга, а также кровью в различных точках времени после инъекции [¹⁸Р]В-4. Полосатое тело рассматривали как РПЕ10А-обогащенную область и мозжечок как сравнительную область. Поэтому высокие отношения полосатое тело-к-мозжечку желательны для получения хорошего качества изображений ίη νΐνο. В точке времени 2 мин п.и. отношение полосатое тело-к-мозжечку составляло около 2,07, и это отношение увеличивалось до 4,38 к точке времени 30 мин после введения радиоактивного индикатора. Отношения полосатое тело-к-коре головного мозга и полосатое тело-к-гиппокампу также составляли >3,16, подтверждая удерживание [¹⁸Р]В-4 в полосатом теле.

Таблица 15 Отношения полосатое тело-к-другим областям головного мозга (рассчитанное из значений % ΙΌ/г, нормализованных в соответствии с массой тела животного) в точке времени 2 и 30 мин после инъекции [¹⁸Р]В-3 ______Область головного мозга______

Полосатое тело/гиппокамп

Полосатое тело/кора головного мозга

Полосатое тело/мозжечок Полосатое тело/кровь мин 30 мин

2, 49	4,25
1,35	3,16
2, 07	4,38
3, 47	2, 61

ΙΙΙ. Анализ радиоактивного метаболита соединения [Р]В-3.

А. Анализ содержания в плазме радиоактивного метаболита в точке времени 2/30/60 мин п.и.

Метаболическую стабильность соединения [¹⁸Р]В-3 исследовали у здоровых крыс (п=2) путем определения относительных количеств исходного радиоактивного индикатора и радиоактивных метаболитов в плазме в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и. радиоактивного индикатора. После внутривенного (в.в.) введения около 1,7 мКи [¹⁸Р]В-3 через хвостовую вену под анестезией (2,5% изофлурана в О₂ при скорости потока 1 л/1 мин) кровь собирали через хвостовую вену в указанных выше точках времени (у одного и того же животного) в содержащие гепарин лития пробирки (4,5 мл ЬН Р8Т пробирки; ВО уасШатег, ВО, Ргапкйп Ьакек, И8А) и хранили на льду для остановки метаболизма. Затем кровь центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин для отделения плазмы. Выделяли образец плазмы объемом около 0,2 мл и осторожно вводили в него около 10 мкл аутентичного нерадиоактивного В-3 (1 мг/мл раствор) и 10 мкл промежуточного соединения Ι-7 (1 мг/мл раствор, основной метаболит в соответствии с ίη νίίτο исследованиями) для идентификации. Плазму затем вводили в систему ВЭЖХ, состоящую из колонки

- 31 019673

СйтотоШй РегГогтапсе (С_!8, 3x100 мм, Мегск), которую элюировали смесями 0,05 М ЫаОАс рН 5,5 (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В). Для анализа использовали следующий способ: изократное элюирование при помощи 100% А в течение 4 мин при скорости потока 0,5 мл/мин, затем линейный градиент до 90% В к 14 мин при скорости потока 1 мл/1 мин и изократное элюирование смесью 10% и 90% В при скорости потока 1 мл/мин вплоть до 17 мин. После пропускания через встроенный в линию УФ-детектор (254 нм) ВЭЖХ элюат собирали в виде 1-мл фракций (фракции собирали каждую минуту) с использованием автоматического устройства для сбора фракций. Для хорошего разделения исходного радиоактивного индикатора и полярного радиоактивного метаболита [¹⁸Е]1-7 фракции собирали каждые 30 с, начиная с 8 мин после введения в систему ВЭЖХ вплоть до 12 мин после введения в систему ВЭЖХ. Радиоактивность во всех фракциях измеряли с использованием автоматического гамма счетчика. Пик, соответствующий исходному [¹⁸Г]В-3, элюировался примерно на 18 мин, тогда как ожидаемый радиоактивный метаболит [¹⁸Е]1-7 элюировался в промежутке приблизительно от 13 до 15 мин. Неидентифицированный полярный радиоактивный метаболит, элюирующийся в промежутке от 3 до 5 мин, также был определен в головном мозге. Обобщенные результаты анализа радиоактивного метаболита в плазме представлены в табл. 16.

Таблица 16

Относительные процентные количества исходного радиоактивного индикатора и радиоактивных метаболитов в плазме крысы в точке времени 2, 30 и 60 мин п.и. [¹⁸Е]В-3. Результаты представлены как среднее значение ±8Ό (п=2)

Среднее вначение±5Р (п=2) мин 30 мин 60 мин

Полярные метаболиты_____3,7±2,б 47, 0 + 4, 1 61,6+7,7

Радиоактивный индикатор 96,3±2,6 53,0±4,1 38,4±7,7

Анализ показал, что в точке времени 2 мин после введения радиорадиоактивного индикатора около 96% определенной в плазме радиоактивности было в форме исходного радиоактивного индикатора. В точке времени 30 мин п.и. 47% полярных радиоактивных метаболитов было определено в плазме, и это количество увеличивалось до 62% в точке времени 60 мин п.и. Наиболее полярный радиоактивный метаболит возможно образовывался в результате расщепления и окисления [¹⁸Е]фторэтильной цепи, поскольку этот полярный метаболит также был определен в головном мозге (см. ниже). Второй полярный радиоактивный метаболит, элюирующийся близко к исходному радиоактивному индикатору, можно было идентифицировать как [¹⁸Е]1-7. Радиоактивность, соответствующая (более липофильным) фракциям, элюирующимся после исходного радиоактивного индикатора, была незначительной, и это указывает на то, что не было образования липофильных радиоактивных метаболитов, которые, если бы они присутствовали, смогли проникать через гематоэнцефалический барьер.

В. Перфузионный анализ радиоактивного метаболита в головном мозге в точке времени 30/60 мин п.и.

Для каждой исследуемой точки времени двум крысам вводили инъекцию около 0,6 мКи [¹⁸Г]В-3. В точке времени 30 или 60 мин после введения радиоактивного индикатора крыс умерщвляли путем введения слишком большой дозы нембутала. После остановки дыхания крысам вводили солевой раствор путем перфузии (Μίηί Р1а5со®. Вгаип, МеПипдеп, Оеттапу) до тех пор, пока печень не становилась бледной. Головной мозг выделяли, головной мозг и мозжечок разделяли и гомогенизировали в 3 и 2 мл ацетонитрила соответственно примерно в течение 2 мин. Объем 1 мл полученного гомогената разводили равным объемом воды и часть этого гомогената фильтровали через 0,22-мкм фильтр (Мййроте, ВейГотй, И8А). Около 0,4 мл фильтрата разводили 0,2 мл воды и осторожно вводили 10 мкл аутентичного нерадиоактивного В-3 (1 мг/мл раствор) и 10 мкл 1-7 (1 мг/мл раствор, основной метаболит в соответствии с щ νίΐ го исследованием) для идентификации. Гомогенат головной мозг/мозжечок затем вводили в систему ВЭЖХ, состоящую из аналитической колонки ХВпйде™ (С_!8, 5 мкМ, 3x100 мм, \Уа1ег5), и элюировали смесью 0,05 М натрийацетатного буфера рН 5,5 и ацетонитрила (70:30 об./об.) при скорости потока 0,8 мл/мин. ВЭЖХ элюат собирали в виде 1 мл фракций (фракции собирали каждую минуту) после пропускания через УФ-детектор и радиоактивность в фракциях измеряли с использованием автоматического гамма-счетчика.

Пик, соответствующий исходному [¹⁸Г]В-3, элюировался примерно на 15 мин, тогда как основной радиоактивный метаболит [¹⁸Г]1-7, присутствующий в плазме, не был определен в головном мозге. Полярный метаболит, элюирующийся примерно на 2 мин, также был определен в плазме (см. выше) и проходил через гематоэнцефалический барьер, как было определено на основании ш νίΙΐΌ инкубационных исследований (см. ниже). Обобщенные результаты перфузионного анализа радиоактивного метаболита в головном мозге крысы представлены в табл. 17. Доля неполярных радиоактивных метаболитов, определенных в головном мозге, была незначительной. Процентное количество полярного метаболита, определенное в мозжечке, было выше, чем в головном мозге. В точке времени 30 мин п.и. около 86% радиоактивности присутствовало в виде исходного радиоактивного индикатора в головном мозге, в мозжечке оно составило около 69%. Через 60 мин количество исходного радиоактивного индикатора в головном мозге уменьшилось до ~72%, в мозжечке оно было около 47%.

- 32 019673

Таблица 17

Относительные процентные количества исходного радиоактивного индикатора и радиоактивных метаболитов в головном мозге и мозжече у обработанных перфузией крыс в точке времени 30 и 60 мин п.и. [¹⁸Е]В-3. Результаты представлены как среднее значение ±8Ό (п=2)

(%)	30 мин п.и.	60 мин п.и.
Головной мозг	Мозжечок	Головной МОЗГ	Мозжечок
Полярный метаболит	14,4 + 10,1	30,6+9,8	28,2+7,9	53,0+11,3
Исходный радиоактивный индикатор	85,6+10,1	69,4+9,8	71,8+7,9	47,0+11,3

С. Анализ радиоактивного метаболита в крови, плазме и гомогенате головного мозга крысы после 1п νίΙΐΌ инкубации с [¹⁸Е]В-3 при 37°С в течение 60 мин.

Кровь, плазму и гомогенированный головной мозг крысы инкубировали с около 0,27 мКи [¹⁸Е]В-3 при 37°С. После 60 мин инкубации образцы помещали на лед для остановки метаболизма. Образцы крови и гомогената головного мозга подготавливали и анализировали при помощи ОФ-ВЭЖХ, описанной выше. Количество радиоактивных метаболитов, определенное в крови, плазме и головном мозге крысы после 1 ч инкубации было незначительным. Это указывает, что полярный радиоактивный метаболит (гипотетически представляющий собой [¹⁸Е]фторэтильное производное), наблюдаемый в головном мозге и мозжечке обработанных перфузией крыс в точке времени 30 и 60 мин п.и. [¹⁸Е]В-3, образовывался периферически (в печени) и проходил через гематоэнцефалический барьер.

IV. М^с^οΡΕΤ исследования визуализации.

Эксперименты визуализации осуществляли на Еосик™ 220 т^с^οΡΕΤ сканирующем устройстве (Сопсогбе Мйгокуйетк, КпоххШе, ΤΝ, И8А) с использованием самцов крыс \У1к1аг с массой тела в пределах от 300 до 600 г. В ходе всех сканирований животные находились под газовой анестезией (2,5% изофлурана в О2 при скорости потока 1 л/1 мин). Динамические сканы 120 мин получали в режиме регистрации данных в виде списка. После реконструкции изображений их полуавтоматически совместно регистрировали с [¹¹С]раклоприд-матрицей головного мозга крысы и представляющие интерес объемы ^ΟΣ) формировали для различных анатомических структур головного мозга (полосатое тело, кора головного мозга и мозжечок), на основании этого строили кривые время-активность (ТАС) для каждого индивидуального изображения с использованием БМОЭ программы (ГМОЭ Тес11по1още8 ЬЙ.). Осуществляли нормализацию в соответствии с массой тела животного и введение дозы путем инъекции. Концентрацию радиоактивности в различных областях головного мозга выражали как δϋΎ (стандартизированная величина поглощения) в виде функции времени в секундах после введения радиорадиоактивного индикатора. Параметрические значения потенциала связывания (ВР) рассчитывали для всех полученных изображений с использованием упрощенной эталонной модели ткани, где ТАС мозжечка использовали как входящую ТАС для неспецифического связывания с использованием указанной выше программы (ГМОВ).

А. ΙΗκιόΡΕΤ исследования с использованием соединения [¹⁸Е]В-3.

Трем крысам вводили путем инъекции около 2,2 мКи композиции [¹⁸Е]В-3 с высокоспецифической активностью через хвостовую вену под анестезией (2,5% изофлурана в О₂ при скорости потока 1 л/1 мин) и осуществляли базовое сканирование в течение 2 ч.

Сигнал высокой интенсивности наблюдали в полосатом теле и только фоновую радиоактивность в кортикальных областях, а также в мозжечке. ТАС показывали, что после введения [¹⁸Е]В-3 происходило большое начальное накопление радиорадиоактивного индикатора в полосатом теле, кортикальных областях и мозжечке. После такого начального большого накопления из-за активности кровотока неспецифическая радиоактивность выводилась из кортикальных областей и мозжечка. В полосатом теле концентрация радиоактивности достигала своего максимума (среднее δϋΎ 1,04) примерно к 16 мин п.и. и оставалась на этом уровне вплоть до примерно 53 мин п.и. Максимального отношения полосатое тело-кмозжечку 5,6:1 (п=3) достигали в точке времени 23 мин после введения, и такое отношение сохранялись на уровне около 5,6 вплоть до около 53 мин после введения. После этого отношение медленно уменьшалось вплоть до конца эксперимента в результате выведения активности из полосатого тела. ВР значение рассчитывали с использованием упрощенной эталонной модели ткани, где ТАС полосатого тела считали как Ρ^Ε10-обогащенный ТАС, и ТАС мозжечка использовали как ТАС с низким уровнем ΡΌΕ10. Среднее ВР на базовой линии составляло 4,2 (п=3).

Исследования с использованием предварительной обработки, где нерадиоактивный аналог В-3 вводили подкожным путем при дозе 2,5 мг/кг массы тела, осуществляли с использованием одной крысы (одно из трех животных, которых использовали для базового сканирования). В точке времени 60 мин после предварительной обработки крысе вводили путем инъекции 2,24 мКи композиции [¹⁸Е]В-3 с высокоспецифической активностью через хвостовую вену под анестезией (2,5% изофлурана в О₂ при скорости потока 1 л/1 мин) и осуществляли динамическое сканирование в течение 2 ч.

Когда животное было предварительно обработано холодным соединением, отношение полосатое тело-к-мозжечку снижалось до 1,9. Также было примерно 80% снижение ВР значения при использовании

- 33 019673 предварительной обработки по сравнению с базовыми сканами (ВР после блокирования равен 0,8 (п=1)).

Исследования биораспределения, а также исследования при помощи иисгоРЕТ визуализации показали специфическое удерживание или более медленное вымывание этого радиоактивного индикатора из полосатого тела, являющегося РИЕ10-обогащенной областью. Поэтому [¹⁸Е]В-3 является подходящим средством для визуализации и количественного определения РЭЕ10А с использованием РЕТ.

В. МюгоРЕТ базовое исследование с использованием соединения [¹⁸Е]В-4.

Одной крысе вводили путем инъекции около 4 мКи композиции [¹⁸Е]В-4 с высокоспецифической активностью через хвостовую вену под анестезией (2,5% изофлурана в О₂ при скорости потока 1 л/1 мин) и осуществляли базовое сканирование в течение 2 ч.

Сигнал высокой интенсивности наблюдали в полосатом теле и только фоновую радиоактивность в кортикальных областях, а также в мозжечке. ТАС показывали, что после введения [¹⁸Е]В-4 происходило большое начальное накопление радиорадиоактивного индикатора в полосатом теле, кортикальных областях и мозжечке. После этого начального большого накопления из-за активности кровотока, неспецифическая радиоактивность выводилась из кортикальных областей и мозжечка. Выведение из полосатого тела было более медленным, указывая на удерживание радиоактивного индикатора в этой области. Максимального отношения полосатое тело-к-мозжечку 4,4:1 достигали в точке времени 6 мин после введения, и такое отношение сохранялось на уровне около 4,4 вплоть до около 13 мин после введения. После этого отношение уменьшалось достаточно быстро из-за выведения активности из полосато тела. ВР значение рассчитывали с использованием упрощенной эталонной модели ткани. Значение ВР на базовой линии составляло 2,5 (п=1).

Исследования биораспределения, а также исследования при помощи иисгоРЕТ визуализации показали специфическое удерживание или более медленное вымывание [¹⁸Р]В-4 из области полосатого тела, являющейся РИЕ10-обогащенной областью.

Соединение [¹⁸Р]В-4 также может быть подходящим средством для визуализации РЭЕ10А экспрессии в головном мозге с использованием РЕТ.

Сравнение кинетики [¹⁸Р]В-3 и [¹⁸Е]Ве£.

Сравнивали кинетику двух перспективных РЭЕ10А РЕТ лигандов [¹⁸Р]В-3 и [¹⁸Р]Ве£ (2-{4-[1-(2[¹⁸Р]фторэтил)-4-пиридин-4-ил-1Н-пиразол-3-ил]феноксиметил}хинолин 00-2010/097367).

Здоровым самцам крыс 0151аг вводили путем в.в. инъекции через хвостовую вену под анестезией (2,5% изофлурана в О₂ при скорости потока 1 л/1 мин) обладающий высокоспецифической активностью радиоактивный индикатор [¹⁸Р]В-3 или [¹⁸Р]Ве£ и осуществляли динамическое сканирование с использованием рРЕТ в течение 120 мин. В ходе сеансов сканирования животные находились под газовой анестезией (2,5% изофлурана в О₂ при скорости потока 1 л/1 мин). Концентрацию радиоактивности в различных областях головного мозга выражали в виде 8υν значения как функцию времени п.и. радиорадиоактивного индикатора путем нормализации в соответствии с массой тела животного и вводимой дозой.

Исходные кривые время-активность.

Для обоих радиоактивных индикаторов четко наблюдали вымывание радиоактивности из мозжечка и коры головного мозга, т.е. областей головного мозга, где экспрессия РЭЕ10А является минимальной. Оба радиоактивных индикатора удерживались в полосатом теле, однако кинетика в этой области головного мозга у двух этих РЕТ лигандов разная. [¹⁸Е]Ве£ достигает своего максимального значения концентрации радиоактивности [средняя 8υν=0,73] примерно к 57 мин п.и. и остается на этом уровне вплоть до конца эксперимента. [¹⁸Е]В-3 достигает своего максимального значения концентрации радиоактивности [средняя 8υν=1,04] примерно к 16 мин п.и. Вымывание [¹⁸Е]В-3 из полосатого тела начинается примерно к 53 мин п.и. Более быстрая кинетика [¹⁸Е]В-3 по сравнению с [¹⁸Е]Ве£ также отражена в отношениях полосатое тело-к-мозжечку. Для [¹⁸Е]В-3 максимального отношения полосатое тело-к-мозжечку около 5,6 достигали в точке времени 23 мин п.и., и такое отношение оставалось на уровне около 5,6 вплоть до примерно 53 мин п.и. После этого отношение медленно уменьшалось вплоть до конца эксперимента изза выведения активности из полосатого тела. Для [¹⁸Е]Ве£ максимальное отношение полосатое тело-кмозжечку 4,2 достигалось примерно через 32 мин п.и., и оно оставалось постоянным вплоть до окончания сканирования.

- 34 019673

Таблица 18

Сравнение некоторых кинетических параметров [¹⁸Е]Ке£ и [¹⁸Т]В-3 на базовой линии [^1аг]кес [^1ак]в-з (Ξυν юо мин/зиы макс.) полосатое тело (период времени макс.ЗОТ) полосато® тело период времени макс, отношения 8/С *макс. 30ν в полосатом теле *макс. отношение 3/С ~57 мин п.и.окончание сканирования

-32 мин п.и.окончание сканирования

0,7

4,2

0,7 мин П.И.-53 мин п.и.

~23 мин п.и.-53 мин п.и.

1,0

5, 6

8/С = Отношение полосатое тело-к-мозжечку;

* усредненные значения в период максимума.

Более медленная кинетика требовала большего времени обнаружения в клинических условиях с получением устойчивых значений объема распределения. Поэтому [¹⁸Р]В-3 является более перспективным в качестве ΡϋΕΙΟΑ лиганда для анализов визуализации головного мозга человека. Кроме того, [¹⁸Е]В-3 достигает более высокой концентрации радиоактивности в полосатом теле и более высокого отношения полосатое тело-к-мозжечку по сравнению с |Б|ИсГ (табл. 18), обеспечивая более высокое качество ίηνίνο визуализации и более точное количественное определение потенциала связывания ΡϋΕΙΟΑ.

Claims (8)

1. Соединение формулы (I) или его стереоизомерная форма, где Кд представляет собой 2-фторэтил, 2,2,2-трифторэтил или 3-фторпропил;

и равно 1, 2 или 3;

каждый К₂ независимо представляет собой С|.,алкил. цикло пропил, С1_₃алкилокси, галогенС1_₃алкилокси, галоген, трифторметил, трифторметокси, дифторметокси или циано, где по меньшей мере один Е представляет собой [¹⁸Е], или его сольват либо соль.

2. Соединение по п.1, где Κι представляет собой 2-фторэтил.

3. Соединение по п.1, где К₂ представляет собой 6-метил, 3,5-диметил или 5-метокси.

4. Соединение по π. 1, где соединение представляет собой 2-[[4-[1-(2-фторэтил)-4-(4-пиридинил)7Н-пиразол-3 -ил] фенокси] метил] -3,5 -диметилпиридин-сукцинат.

5. Стерильная композиция, содержащая соединение формулы (I) по п.1, растворенное в солевом растворе.

6. Применение соединения формулы (I) по п.1 для получения изображения ткани, клеток или организма ίη νίίτο или ίη νίνο.

7. Способ получения изображения ткани, клеток или организма, включающий контактирование с тканью, клетками или организмом или введение в ткань, клетки или в организм соединения формулы (I) по π. 1 и получение изображения ткани, клеток или организма с использованием системы визуализации методом позитрон-эмиссионной томографии.

8. Промежуточное соединение формулы (VI) о' или его стереоизомерная форма, где ш равно 1 или 2;

и равно 1, 2 или 3;

каждый К₂ независимо представляет собой С1_₃алкил, цикло пропил, С1_₃алкилокси, галогенС1_₃алкилокси, галоген, трифторметил, трифторметокси, дифторметокси или циано,

-35 019673 или его сольват либо соль.