CN104955825A - 放射性标记的化合物 - Google Patents
放射性标记的化合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104955825A CN104955825A CN201480006218.6A CN201480006218A CN104955825A CN 104955825 A CN104955825 A CN 104955825A CN 201480006218 A CN201480006218 A CN 201480006218A CN 104955825 A CN104955825 A CN 104955825A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- experimenter
- methyl
- pet
- pde10a
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 *c1cc(-c2n[n](ccc(NC(c([n](*)nc3)c3C(N(*)*)=O)=O)c3)c3n2)ccc1 Chemical compound *c1cc(-c2n[n](ccc(NC(c([n](*)nc3)c3C(N(*)*)=O)=O)c3)c3n2)ccc1 0.000 description 1
- ANFUITZOKHDEQO-UHFFFAOYSA-N CCOC(c1c(C(O)=O)[nH]nc1)=O Chemical compound CCOC(c1c(C(O)=O)[nH]nc1)=O ANFUITZOKHDEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEOATGWNEJVDHO-UHFFFAOYSA-N C[n]1ncc(C(N2CCOCC2)=O)c1C(Nc1cc2nc(-c3cccc(OCCF)c3)n[n]2cc1)=O Chemical compound C[n]1ncc(C(N2CCOCC2)=O)c1C(Nc1cc2nc(-c3cccc(OCCF)c3)n[n]2cc1)=O LEOATGWNEJVDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPSUSTOCTQEVDO-UHFFFAOYSA-N C[n]1ncc(C(N2CCOCC2)=O)c1C(Nc1cc2nc(-c3cccc([O](C)=C)c3)n[n]2cc1)=O Chemical compound C[n]1ncc(C(N2CCOCC2)=O)c1C(Nc1cc2nc(-c3cccc([O](C)=C)c3)n[n]2cc1)=O DPSUSTOCTQEVDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/041—Heterocyclic compounds
- A61K51/044—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins
- A61K51/0453—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/041—Heterocyclic compounds
- A61K51/044—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins
- A61K51/0455—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/041—Heterocyclic compounds
- A61K51/044—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins
- A61K51/0463—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
- C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
- C07B59/002—Heterocyclic compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/60—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances involving radioactive labelled substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
- C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
- C07B2200/05—Isotopically modified compounds, e.g. labelled
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及式(I)的放射性标记的化合物,其中R1、R2、R3和R4是如本文中所限定的。
Description
本发明涉及式I的放射性标记的化合物,
其中
R1和R2独立地选自C1-7烷基,C1-7卤代烷基,R1和R2,与它们所连接的氮原子一起,形成杂环烷基,
R3是C1-7烷基,
R4是氢、C1-7烷氧基或C1-7卤代烷氧基,并且
其中,R1、R2、R3或R4中的任一个标记有选自3H、11C和18F的放射性核素。本发明的化合物可用于PDE10A功能性的标记和诊断成像。
已经发现,式I的放射性标记的化合物可以用作PET(正电子成像术)和/或放射自显影放射性示踪剂以用于PDE10A功能性的标记和诊断分子成像。分子成像是基于分子探针(例如放射性示踪剂)与生物学靶标(例如受体,酶,离子通道或任何其他能够结合或保留分子探针的细胞或细胞外成分)的选择性和特异性相互作用,其通过PET,核磁共振,近红外或其他方法被可视化。PET,是一种核医学成像形式,其理想地适合于产生三维图像,所述三维图像提供关于生物学靶标在指定器官中的分布或关于这样的器官或细胞的代谢活性或关于药物进入这样的器官,结合生物学靶标和/或改变生物学过程的能力的重要信息。因为PET是一种非侵入式的成像技术,所以其可以用于研究人和动物中疾病的病理生理学和药物对指定分子靶标或细胞过程的作用。对指定分子靶标具有特异性的PET放射性示踪剂的可用性可以有助于药物开发和理解药物的作用机制。此外,PET放射性示踪剂可以通过显示作为疾病的结果发生的病理生理学变化而有助于疾病的诊断。PDE10A是一种由单一基因编码的双底物PDE,如三个独立的研究小组在1999年报道的(Fujishige K.,等,Eur J Biochem(1999)266(3):1118-1127,Soderling S.H.,等,ProcNatl Acad Sci USA(1999)96(12):7071-7076,Loughney K.,等,Gene(1999)234(1):109-117)。PDE10A在氨基酸序列(779aa)、表达的组织特异性模式、对cAMP和cGMP的亲和力以及特异性和一般性抑制剂对PDE活性的影响方面与该多基因家族的其它成员不同。
PDE10A具有所有PDE家族中最局限的分布之一,其主要在脑中表达,特别是在伏核和尾状壳核中表达。此外丘脑,嗅球,海马和额叶皮质也显示中等水平的PDE10A表达。所有这些脑区域都被提出参与精神分裂症和精神病的病理学,提示PDE10A在这些破坏性精神疾病中具有中心作用。在中枢神经系统之外,也在周围组织中观察到PDE10A的转录表达,所述周围组织如甲状腺,垂体腺,胰岛素分泌型胰腺细胞和睾丸(Fujishige,K.等,J.Biol.Chem.1999,274,18438–18445,Sweet,L.(2005)WO2005/012485)。另一方面,只在肠神经节、在睾丸和附睾精子中观察到PDE10A蛋白的表达(Coskran T.M.等,J.Histochem.Cytochem.2006,54(11),1205-1213)。
人脑是一个复杂的器官,其由数百万个互相联系的神经元组成。对涉及疾病的异常性的理解对于有效诊断和新疗法的未来开发是关键的。对人生物化学异常性的研究正迅速成为药物发现和开发过程的必要和完整成分。传统上,新药的发现和开发在进行时非常强调体外技术以选择有希望的先导候选物,这些候选物随后在活体动物中被测试,之后是人体施用。因为体外系统仅反映生命系统的部分复杂性并且人疾病的体内动物模型通常仅是人病理学的近似,所以日益认识到在该过程中在早期阶段对活人中药物-受体相互作用的加强了解将是进一步加强新疗法的有效和及时发现和开发的主要驱动力。近年来,已经日益多地使用人医学成像来评估病理学,疾病进展和药物作用。这些成像形式包括PET,MRI,CT,超声,EEG,SPECT等(British Medical Bulletin,2003,65,169-177)。因此,使用非侵入式的成像形式,例如PET,对于未来的药物开发是无价的工具。非侵入式的核成像技术可以用于获得关于多种活体受试者的生理学和生物化学的基础和诊断信息。这些技术依赖于使用复杂的成像装置,所述装置能够检测由施用到所述活体受试者的放射性示踪剂发出的辐射。所获得的信息可以被重构以提供平面和断层分析图像,所述图像揭示作为时间的函数的放射性示踪剂分布。使用放射性示踪剂可以产生这样的图像,所述图像包含关于结构,功能以及最重要的受试者的生理学和生物化学的信息。该信息的大部分无法通过其他手段获得。用于这些研究中的放射性示踪剂被设计成在体内具有限定的行为,这允许确定关于受试者的生理学或生物化学的具体信息。目前,放射性示踪剂可用于获得关于心脏功能,心肌血流,肺灌注,肝功能,脑血流,区域脑葡萄糖和氧代谢,若干脑受体和酶的功能和阿尔茨海默病中淀粉状蛋白β斑块沉积的可视化的有用信息(PET Molecular Imaging and Its Biological Applications(PET分子成像及其生物学应用),Eds.Michael E.Phelps,Springer,New York,2004.AmetamyS.等,Chem.Rev.,2008,108,1501-1516.Nordberg A.等Nat.Rev.Neurol.,2010,6,78-87)。
此外,
-PET成像在药物开发的早期阶段提供人中正常和异常神经化学的非侵入式和定量测定从而加强疗法的高效和有效的发现。
-示踪剂剂量的标记化合物使得以下的新药的早期评估成为可能:生物分布研究;受体占用率研究以优化药物给药方案和表征药物作用的下游反应。
-使用非侵入式技术来了解人中的疾病机制与疾病的诊断和管理和新疗法的未来开发密切相关。
PET中常用的放射性核素包括11C,13N,15O或18F。原则上,可能通过用PET核素来替代一个母体化合物原子来标记所有药物,但仅有极少的被发现可用作人体内的成像剂。11C,13N,15O和18F的放射性半衰期分别为20,10,2和110min。这些短的半衰期为其作为示踪剂使用PET探查生物学过程的用途提供多种优势。使得在同一受试者中在同一天内的重复研究成为可能。PET被越来越多地用作确定在明确定义的化合物中药物-剂量-酶/受体占用率关系的工具。使用特异性结合靶受体或酶的PET放射性示踪剂可以提供关于以下的信息:
-药物进入脑并结合靶位点的能力,
-指定剂量的药物产生的靶位点的占用程度,
-占用率的时间过程,以及
-目的药物的相对血浆和组织动力学。
占用研究利用通常与研究的药物候选物不相同的PET放射性示踪剂进行(British Medical Bulletin,2003,65,169-177)。
氚标记的化合物是尤其有价值的并且被广泛地用于涉及高分辨率放射自显影的研究。氚的物理(核)性质,辐射的低的最大β能(18keV)和高的最大比活(29Ci/mg氢原子),使得氚对于确定化合物(例如药物和激素)在生物学样品中的精确位置是理想的同位素。
本发明涉及式I的放射性标记的化合物
其中
R1和R2独立地选自C1-7烷基,C1-7卤代烷基,R1和R2,与它们所连接的氮原子一起,形成杂环烷基,
R3是C1-7烷基,
R4是氢、C1-7烷氧基或C1-7卤代烷氧基,并且
其中,R1,R2,R3或R4中的任一个标记有选自3H、11C和18F的放射性核素。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及式I的放射性标记的化合物,其中
R1是C1-7烷基,
R2是C1-7氟烷基,
R3是甲基,
R4是氢,其中R2标记有18F或3H,或R3标记有11C。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及式I的放射性标记的化合物,其中
R1和R2与它们所连接的氮原子一起,形成杂环烷基,优选吗啉基,
R3是甲基,
R4是C1-7氟烷氧基,其中R4标记有18F。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及式I的放射性标记的化合物,其中
R1和R2与它们所连接的氮原子一起,形成杂环烷基,优选吗啉基(morpholinyl),
R3是甲基,
R4是C1-7烷氧基,其中R4标记有3H或11C。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及式I的放射性标记的化合物,所述化合物选自由以下组成的组:
在一个特别的实施方案中,本发明涉及式I的放射性标记的化合物,其用作PDE10A PET示踪剂和/或放射自显影示踪剂。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及式I的放射性标记的化合物,其用于PDE10A结合研究。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及式I的放射性标记的化合物,其用于对受试者脑中的PDE10A进行诊断成像。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及用于对受试者组织中的PDE10A进行正电子成像术(PET)成像的方法,所述方法包括:
向所述受试者施用有效量的本发明的化合物,
使所述化合物渗透到所述受试者的组织中;和
收集所述受试者的CNS或脑组织的PET图像。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及用于检测受试者组织中PDE10A功能性的方法,所述方法包括:
向所述受试者施用有效量的本发明的化合物,
使所述化合物渗透到所述受试者的组织中;和
收集所述受试者的CNS或脑组织的PET图像。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及式I的放射性标记的化合物用于制备组合物的用途,所述组合物用于对受试者脑中的PDE10A进行诊断成像。
在一个特别的实施方案中,本发明涉及药物组合物,所述药物组合物包含本发明的化合物和药用赋形剂。
附图简述
图1:放射自显影放射性配体[3H]-4结合PDE10A的特异性:在不存在(图1A)和存在(图1B)10μM参比PDE10A阻断剂(MP-10)的情况下,将径向大鼠脑切片与放射性配体(0.1nM)温育。
图2:放射自显影放射性配体[3H]-21结合PDE10A的特异性:在不存在(图2A)和存在(图2B)10μM参比PDE10A阻断剂(MP-10)的情况下,将径向大鼠脑切片与放射性配体(0.1nM)温育。
图3:猕猴(macaque)脑中从60到90min p.i.总计的PET示踪剂[18F]-20的冠状(图3A),径向(图3B)和横向(图3C)PET图像。在纹状体水平在冠向和横向上显示切片,从左至右。
图4:猕猴脑中从60到90min p.i.总计的PET示踪剂[18F]-4的冠状(图4A),径向(图4B)和横向(图4C)PET图像。在纹状体水平在冠向和横向上显示切片,从左至右。
图5:狒狒(baboon)脑中从10到90min p.i.总计的PET示踪剂[11C]-21的横向PET图像。
图6:狒狒脑中从10到90min p.i.总计的PET示踪剂[11C]-4的横向PET图像。
定义
术语“烷氧基”表示式-O-R’的基团,其中R’是烷基。烷氧基部分的实例包括甲氧基,乙氧基,异丙氧基,和叔丁氧基。
术语“卤代烷氧基”表示其中烷氧基基团的至少一个氢原子被相同或不同卤素原子,特别是氟原子替代的烷氧基基团。卤代烷氧基的实例包括单氟-,二氟-或三氟-甲氧基,-乙氧基或-丙氧基,例如3,3,3-三氟丙氧基,2-氟乙氧基,2,2,2-三氟乙氧基,氟甲氧基,或三氟甲氧基。术语“全卤代烷氧基”表示烷氧基基团的所有氢原子都被相同或不同卤素原子取代的烷氧基基团。
术语“卤代烷基”表示其中烷基基团的至少一个氢原子被相同或不同的卤素原子、特别地被氟原子代替的烷基。卤代烷基的实例包括单氟-、二氟-或三氟-甲基、-乙基或-丙基,例如3,3,3-三氟丙基,2-氟乙基,2,2,2-三氟乙基,氟甲基,或三氟甲基。术语“全卤烷基”表示这样的烷基,其中所述烷基的所有氢原子被相同或不同的卤素原子代替。
术语“烷基”表示具有1至12个碳原子的单价直链或支链的饱和烃基。在具体的实施方案中,烷基具有1至7个碳原子,并且在更具体的实施方案中具有1至4个碳原子。烷基的实例包括甲基,乙基,丙基,异丙基,正丁基,异丁基,仲丁基,或叔丁基。
术语“杂环烷基”表示具有3至9个环原子的单价饱和的或部分不饱和的单-或二环环体系,其包含选自N、O和S的1、2或3个环杂原子,剩下的环原子是碳。在特别的实施方案中,杂环烷基是具有4至7环原子的单价饱和的单环环体系,其包含选自N、O和S的1、2或3个环杂原子,剩下的环原子是碳。单环饱和的杂环烷基的实例有氮杂环丙烷基,氧杂环丙烷基,氮杂环丁烷基,氧杂环丁烷基,吡咯烷基,四氢呋喃基,四氢-噻吩基,吡唑烷基,咪唑烷基,唑烷基,异唑烷基,噻唑烷基,哌啶基,四氢吡喃基,四氢硫代吡喃基,哌嗪基,吗啉基,硫代吗啉基,1,1-二氧代-硫代吗啉-4-基,氮杂环庚基,二氮杂环庚基,高哌嗪基,或氧杂环庚基。二环饱和的杂环烷基的实例有8-氮杂-二环[3.2.1]辛基,奎宁环基,8-氧杂-3-氮杂-二环[3.2.1]辛基,9-氮杂-二环[3.3.1]壬基,3-氧杂-9-氮杂-二环[3.3.1]壬基,或3-硫代-9-氮杂-二环[3.3.1]壬基。部分不饱和的杂环烷基的实例有二氢呋喃基,咪唑啉基,二氢-唑基,四氢-吡啶基,或二氢吡喃基。
术语“半最大抑制浓度”(IC50)表示在体外获得对生物学过程的50%抑制所需的具体化合物的浓度。IC50值可以对数转化为pIC50值(-log IC50),其中较大的值指示按指数更大的效力。IC50值不是绝对值而是取决于实验条件例如所用的浓度。IC50值可以使用Cheng-Prusoff方程式转化为绝对抑制常数(Ki)(Biochem.Pharmacol.(1973)22:3099)。
术语“受试者”表示脊椎动物。在某些实施方案中,脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括人,非人灵长类如黑猩猩和其他猿和猴物种,农场动物如牛,马,绵羊,山羊和猪,家养动物如兔,狗和猫,实验室动物,包括啮齿类,如大鼠,小鼠和豚鼠。在某些实施方案中,哺乳动物是人。术语受试者不表示特定的年龄或性别。
术语“药用盐”表示这样的盐,其不是在生物学上或其他方面不合需要的。药用盐包括酸加成盐和碱加成盐。
术语“药用赋形剂”和“治疗惰性赋形剂”可互换地使用并且表示药物组合物中不具有治疗活性并且对施用对象无毒性的任何药用成分,如用于制备药物产品的崩解剂,粘合剂,填充剂,溶剂,缓冲剂,张性剂,稳定剂,抗氧化剂,表面活性剂,载体,稀释剂或润滑剂。
药物组合物
另一个实施方案提供含有本发明的化合物和治疗惰性载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物,以及使用本发明的化合物制备此种组合物和药物的方法。在一个实施例中,可以通过在环境温度在适当的pH并且以所需的纯度,与生理用载体(即,在所采用的剂量和浓度对受者无毒性的载体)混合将式[I]的化合物配制成盖伦制剂施用形式。制剂的pH主要取决于化合物的具体用途和浓度,但是优选在约3至约8范围内。在一个实施例中,在pH 5的乙酸盐缓冲液中配制式[I]的化合物。在另一个实施方案中,将式[I]的化合物灭菌。化合物可以被存储为例如固体或无定形组合物,冻干制剂或水溶液。
典型的制剂通过将本发明的化合物与载体或赋形剂混合来制备。合适的载体和赋形剂对于本领域技术人员是已知的并且详述于例如,Ansel,Howard C.,等,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Ansel的药物剂型和药物递送系统)Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2004;Gennaro,Alfonso R.,等Remington:The Science and Practice of Pharmacy.(Remington:药学科学和实践)Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2000;和Rowe,Raymond C.Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)Chicago,Pharmaceutical Press,2005。制剂还可以包含一种以上缓冲剂,稳定剂,表面活性剂,湿润剂,润滑剂,乳化剂,助悬剂,防腐剂,抗氧化剂,遮光剂,助流剂,加工助剂,着色剂,甜味剂,增香剂,调味剂,稀释剂和其他已知的添加剂以提供药物(即,本发明的化合物或其药物组合物)的精致递呈或有助于药物产品(即,药剂)的制备。
实施例
制备冷的参比化合物(4,20,21),如WO2012076430中所述。
缩写列表:A=非衰减修正活性;DCM=二氯甲烷;DIPEA=二异丙基乙胺;DMF=二甲基甲酰胺;EOB=轰击结束;EOS=合成结束;EtOAc=乙酸乙酯;EtOH=乙醇;HATU=(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐);Hept=庚烷;HPLC=高压液相色谱;LC-MS=液相色谱/质谱;MeCN=乙腈;K2.2.2=4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]-二十六烷;NMP=N-甲基吡咯烷酮QMA=甲基化季铵;R1=反应器1;R2=反应器2;RBF=圆底烧瓶;Rf=前沿比(frontal ratio);RCP=放射化学纯度;Rt=保留时间;RT=室温;SA=比放射性;SPE=固相提取;TEA=三乙胺;TFA=三氟乙酸;THF=四氢呋喃;TLC=薄层色谱;Tol=甲苯。
实施例1
[18F]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺]([18F]-4)
[18F]-放射性氟化的总体考虑
将HPLC品质的水用于需要水的所有过程。溶剂和试剂购自SigmaAldrich Singapore,分别为HPLC和最高纯度级。将Synthra RN plus合成模块(Synthra GmbH)用于所有放射化学过程。在富集的[18O]-水中的溶液中的[18F]-氟化物(98%,2.5mL)利用来自GE Healthcare的PETtrace回旋加速器制备。在QMA药筒(Waters)上的加载活动后,通过用含有在水(0.3mL)中的MeCN(0.7mL),K2.2.2(12至15mg)和K2CO3(4mg)的溶液洗涤所述药筒而将氟-18转移到5-mL玻璃碳反应器1(R1)中。对于SPE制剂,使用Empore药筒标准密度(6mL)。将所述药筒相继用EtOH(5mL)和水(10mL)洗涤以活化。在对粗物质进行纯化前,用指定洗脱液(总体积200mL)平衡半制备型HPLC柱。
在配有流动–RAM 1”NaI/PMT放射性检测器(LabLogic)的PerkinElmer HPLC系列200或Agilent 1260系列上进行质量控制。将配有安全保护套的Phenomenex柱Luna C18(2)3μm150x4.6mm用于各批次的放射性-HPLC质量控制。利用配备氩/甲烷气体(90/10)的Bioscan AR-2000进行放射性-TLC。
实施例1.1
3-甲基-[1,2,3]氧杂噻唑烷2,2-二氧化物(2)
将[1,2,3]氧杂噻唑烷2,2-二氧化物(1,60mg,487μM,1.0当量;CASNr.19044-42-9;European Journal of Medicinal Chemistry 2007,42,1176-1183)与Tol(1.2ml)和MeOH(0.6ml)合并从而提供无色溶液。在冷却至0℃后,逐滴加入(重氮基甲基)三甲基硅烷(2M溶液,在己烷中,609μl,1.22mmol,2.5当量),并将黄色反应混合物在0℃搅拌30min。然后在室温继续搅拌过夜。将溶剂蒸发,加入H2O并且利用EtOAc萃取产物。获得粗产物,为黄色油(53mg,64%),并将其原样用于下一步。MS:m/z=138.1([M+H]+)。
实施例1.2
[18F]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺]([18F]-4)
在真空下通过共沸蒸馏干燥[18F]-KF/K2.2.2复合物(52.7GBq)。进行利用MeCN(1mL)的二次蒸馏以保证[18F]-KF/K2.2.2复合物的完全干燥。然后将3-甲基-[1,2,3]氧杂噻唑烷2,2-二氧化物(2)(4.2mg,30.6μmol)在无水MeCN(1mL)中的溶液加入到反应性[18F]-氟化物。将所得的溶液在110℃加热10min,然后冷却至60℃。在真空和氮气流下,将MeCN在60℃蒸发4分钟,然后在98℃蒸发3分钟直至达到最大真空值(在无氮气流的情况下5mBar,A=40.2GBq,产率EOB=95%)。在向R1加入TFA(500μL)后,将所得的溶液在110℃加热10分钟。将溶剂在100℃在真空和氮气流下蒸发直至达到最大真空值(在无氮气流的情况下5mBar,10分钟)。在25℃冷却后,将在THF(1mL)中的DIPEA(0.2mL)的溶液加入到R1(密封的),将所得的溶液在25℃搅拌3分钟并且转移到预加载有1-甲基-5-(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基氨基甲酰基)-1H-吡唑-4-碳酰氯(5)(CASNr.1380331-83-8;WO2012076430)(3.2mg,8.3mol)的R2中,(A=12.7GBq,产率EOB=38%)。将溶液在87℃加热10min然后在60℃冷却,之后在氮气流下冲洗。将粗混合物在真空下浓缩5min并且用HPLC洗脱液(1.8mL;洗脱液A:MeCN/AMF缓冲剂100mM pH=4.070/30;洗脱液B:MeCN/AMF缓冲剂100mM pH=4.030/70)稀释。将所得的溶液在室温搅拌3min(A=5.7GBq,产率EOB=22%)。将粗混合物加载到半制备型柱中并且利用梯度洗脱纯化(6.5mL.min-1:0至12min A/B 25/75然后12min至25min A/B 30/70;柱:Phenomex Luna C18(2)5μm 250x10mm;注射体积:2mL;UV检测波长=254nm)。将放射性的峰(Rt=14.58min,v=4.3mL)收集到盛有水(45mL)的圆底烧瓶中。通过固相提取以2mL.min-1提取放射性化合物。在用水(10mL)洗涤后,相继使用EtOH(0.5mL)和盐水(3mL)将产物从筒中洗脱出来。将这些级分合并到盛有盐水(2mL)的无菌小瓶中(A=560MBq,产率EOB=3.4%,SA EOS=327MBq.μg-1,合成时间=183min)。放射性剂量通过放射性-TLC(Rf=0.45Hept/EtOAc 3/23,100%)和分析型放射性-HPLC(Rt=11.15min,RCP=100%;HPLC系统:Agilent 1260系列;洗脱液A:MeCN/水70/30B7;洗脱液B:MeCN/水30/70B7;洗脱方法:等度洗脱,0.63mL.min-1A/B 30/70;柱:Phenomex Luna C18(2)3μm 150x4.6mm;注射体积:20μL;UV检测波长=254nm)进行质量控制。通过利用冷的2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺](4)作为参比化合物进行掺杂来确认示踪剂的身份(UV-痕迹:Rt=11.12min,[18F]-痕迹:Rt=11.15min
实施例2
[11C]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺]
制备中间体8
2-[1-二甲基氨基-亚甲-(Z)-基]-3-氧代-琥珀酸二乙酯(8)
在0℃向乙基氯-氧代-乙酸乙酯(6)(10.0g,73.3mmol)在DCM(50ml)中的溶液逐滴加入3-(N,N-二甲基氨基)丙烯酸乙酯(7)(10.4g,73.3mmol)和吡啶在DCM(60ml)中的溶液。将反应混合物在25℃搅拌20h。将混合物用DCM(200ml)稀释,用水(2x 200ml)洗涤。将水层用DCM(2x 200ml)再萃取。将合并的有机层用盐水(75ml)洗涤,用无水Na2SO4干燥,过滤并在真空中蒸发,从而提供2-[1-二甲基氨基-亚甲-(Z)-基]-3-氧代-琥珀酸二乙酯(8)(15.0g;粗产物,84%),为黄色固体。LC-MS:244.2([M+H]+)。
制备中间体9
2-苄基-2H-吡唑-3,4-二甲酸二乙酯(9)
在25℃向2-[1-二甲基氨基-亚甲-(Z)-基]-3-氧代-琥珀酸二乙酯(8)(5.00g;20.6mmol;粗)在EtOH(50ml)中的溶液加入苯肼盐酸盐(6.02g,30.9mmol),之后加入催化量的HClaq(0.2ml)并且在25℃继续搅拌12h。在真空中除去溶剂。将所得的粗剩余物溶解在水(50ml)中并将水层用EtOAc(2x50ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤,用无水Na2SO4干燥,过滤并且在真空中浓缩。将因此获得的粗物质通过柱色谱用普通硅胶纯化(30%EtOAC/己烷),从而提供2-苄基-2H-吡唑-3,4-二甲酸二乙酯(9)(3.5g,52%),为微黄色液体。LC-MS:303.1([M+H]+)。
制备中间体10
2-苄基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-乙酯(10)
在0℃向2-苄基-2H-吡唑-3,4-二甲酸二乙酯(9)(1.50g,5.00mmol)在THF(15ml),MeOH(7ml)和水(7ml)的混合物中的溶液加入一水合氢氧化锂(208mg,5.00mmol)。将反应混合物在25℃搅拌1h。在真空中除去溶剂。将所得的粗物质用水(15ml)稀释。将水层用EtOAc(2x 10ml)洗涤,冷却至0℃,并且用1N HCl水溶液酸化(pH 5)。将所得的沉淀的固体过滤并且在真空下干燥,从而提供2-苄基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-乙酯(10),为白色固体。(0.7g,51%)LC-MS:275.1([M+H]+)。
实施例2.1
1-苄基-5-(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基氨基甲酰基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(12)
将2-苄基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-乙酯(中间体10)(0.50g,1.80mmol)在草酰氯(10ml)中的溶液在50℃加热2h。在真空中小心地除去挥发性物质。然后在0℃向粗酰基氯逐滴加入吡啶(15ml),之后加入2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基胺(11,CAS Nr.1380331-14-5,WO2012076430)(450mg,1.80mmol)。将所得的反应混合物在25℃搅拌10min。将混合物倒在冰冷的水上。将因此获得的所得的固体过滤,相继用水和己烷洗涤并且最终通过与Tol共沸干燥,从而产生1-苄基-5-(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基氨基甲酰基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(12)(0.45g,53%),为灰白色固体。LC-MS:467.0([M+H]+)。
实施例2.2
1-苄基-5-(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基氨基甲酰基)-1H-吡唑-4-甲酸(13)
在0℃向1-苄基-5-(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基氨基甲酰基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(12)(0.50g,1.07mmol)在THF(25ml)中的溶液加入一水合氢氧化锂的水溶液(1M;1.34ml,1.34mmol)。然后将反应混合物在25℃搅拌2h。将混合物用1N HCl水溶液酸化(pH-2)。将所得的沉淀过滤,用水洗涤,然后用己烷洗涤,并且最终通过与Tol共沸而干燥,从而提供1-苄基-5-(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基氨基甲酰基)-1H-吡唑-4-甲酸(13)(0.25g,53%),为灰白色固体。LC-MS:439.1([M+H]+)。
实施例2.3
2-苄基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺](14)
在0℃向1-苄基-5-(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基氨基甲酰基)-1H-吡唑-4-甲酸(13)(0.30g,0.684mmol)在DMF(5ml)中的溶液加入HATU(0.54g,1.44mmol),(2-氟-乙基)-甲基-胺盐酸盐(0.309g,2.74mmol)和DIPEA(0.48ml,2.74mmol)。将所得的反应混合物在25℃搅拌16h。将混合物用水(10ml)稀释并且搅拌15min。将所得的沉淀的固体过滤,用水充分洗涤,并且通过与Tol共沸干燥,之后在真空下进一步干燥,这产生2-苄基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺](14)(200mg,69%),为灰白色固体。LC-MS:498.0([M+H]+)。
实施例2.4
2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺](15)
在0℃在氮气下,向2-苄基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺](14)(1.6g,3.2mmol)在无水DCM(100ml)中的溶液加入三溴化硼(1M溶液,在DCM中,6.4ml,6.4mmol)。将混合物在0℃搅拌0.5h。通过1N NaOH水溶液中和反应混合物。在真空下除去溶剂。将因此获得的粗物质通过柱色谱用硅胶纯化(5%MeOH/DCM),从而提供2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺](15)(500mg,38%),为灰白色固体。LC-MS:408.1([M+H]+)。
实施例2.5
[11C]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺]([11C]-4)
向1mL小V瓶加入2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺](15)(4mg)。将前体溶解在0.1mL二甲基甲酰胺中。在另一个1mL小V瓶中,将1,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷(0.56mg)溶解在0.1mL二甲基甲酰胺中,之后加入9.5μL在四氢呋喃中的1M叔丁醇钾。将2个小瓶的内容物充分混合并且将最终的小瓶用隔膜密封盖住,之后加入[11C]甲基碘。将制备自[11C]二氧化碳并由氦流运载的[11C]甲基碘放入以上溶液中。在放射性的平台后,将反应小瓶在室温静置2min,然后用0.2mL制备型HPLC流动相猝灭,所述流动相由30%乙腈/70%含水缓冲液(57mM TEA,用o-磷酸调至pH 3.2)组成。通过反相HPLC(Waters XBridge C18 10x 150mm,10μ)以15mL/min在254nm纯化粗反应产物。将与前体(Rt=2.2min)分开的放射性产物(Rt=7.7min)远距离收集在50mL水的贮水池(reservoir)中。将在水的贮水池中的产物级分加载到C18 Sep-Pak上。然后用10mL 0.9%氯化钠注射剂将C18Sep-Pak冲洗至废液(waste)。利用1mL乙醇然后利用14mL 0.9%氯化钠注射剂将终产物自C18 Sep-Pak洗脱下来,通过在无菌、无热原小瓶中的0.22μ滤器灭菌。
[11C]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺]([11C]-4)的平均无衰减的修正放射化学产率为约10%。测定等分试样(0.1mL)的放射性并且通过分析型HPLC(35%乙腈/65%含水缓冲液(57mM TEA,用o-磷酸调至pH 3.2);WatersXBridge C18 10x 150mm,10μ)以2mL/min在254nm进行检验。观察到对应于2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺(4)的单个放射性峰(Rt=4.5min)。在合成结束时通过将放射性和与载体的UV吸光度峰相关联的质量相关确定的合成结束时的比放射性超过9000mCi/μmole。
实施例3
[3H]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺]
实施例3.1
[3H]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-羟基-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺([3H]-17)
在0℃将{甲基-[1-甲基-5-(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基氨基甲酰基)-1H-吡唑-4-羰基]-氨基}-乙酸甲酯(16)(CAS Nr.1380330-71-1;WO2012076430)(22mg,49μmol)在1ml THF中的溶液加入到在150μlTHF/庚烷(2:1)中的50μmol硼氚化锂的溶液。在室温搅拌3h后,将反应混合物用0.2ml丙酮猝灭,之后加入20μl TFA在0.4ml THF中的溶液。在减压下除去溶剂,将所得的剩余物溶解在10ml THF中,并使溶液通过短的二氧化硅Sep-Pak筒。在蒸发溶剂后,将所得的粗产物通过HPLC(Nuleodur C18 Gravity,在9min内用在乙腈中的0.1%TFA/在水中的0.1%TFA 10:90至46:54洗脱,然后用95%乙腈洗脱3min)纯化。收集产物级分并且随后通过加入碳酸氢盐水溶液进行中和。通过固相提取(StrataX)分离纯的化合物。在用水洗涤所述筒后,用乙醇洗脱产物,从而产生97%放射化学纯度的325mCi的[3H]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-羟基-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺]。
实施例3.2
[3H]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺([3H]-4)
向98mCi的[3H]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-羟基-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺]([3H]-17)在100μlDMF中的溶液加入16μl(92μmol)Huenig碱,5μl(31μmol)三乙胺三氢氟酸盐和8.4μl(27μmol)全氟丁磺酰氟。将反应混合物在室温搅拌67h。在用2.5ml水稀释后,将粗产物通过固相提取(StrataX,乙醇)预纯化。在通过HPLC(Nuleodur C18 Gravity,在6min内用在乙腈中的0.1%TFA/在水中的0.1%TFA 40:60至49:51洗脱)进行最终纯化后,收集产物级分并且随后通过加入碳酸氢盐水溶液进行中和。通过固相提取(StrataX)分离纯的化合物。在用水洗涤所述筒后,用乙醇洗脱产物,从而提供21mCi的[3H]-2-甲基-2H-吡唑-3,4-二甲酸4-[(2-氟-乙基)-甲基-酰胺]3-[(2-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-酰胺]([3H]-4),其放射化学纯度>97%并且比活为47Ci/mmol。
实施例4
[18F]-2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-甲酸{2-[3-(2-氟-乙氧基)-苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基}-酰胺([18F]-20)
实施例4.1
甲苯-4-磺酸2-[3-(7-{[2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-羰基]-氨基}-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-苯氧基]-乙酯(19)
将原料2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-甲酸[2-(3-羟基-苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基]-酰胺(18)(CAS Nr.1380330-59-5;WO2012076430)(100mg,223μmol)与NMP(2.0ml)合并从而提供淡黄色溶液。加入乙烷-1,2-二基二(4-甲基苯磺酸酯)(166mg,447μmol)和碳酸铯(73mg,223μmol),并将反应混合物在60℃搅拌过夜。加入EtOAc和H2O。收集有机层并用Na2SO4干燥。在过滤并蒸发溶剂后,将粗化合物通过急骤色谱(10gSiO2筒,CH2Cl2至CH2Cl2/MeOH/NH3水300:10:1)纯化。最终的HPLC纯化产生标题化合物(38mg,26%),为灰白色泡沫。LC-MS:646.2([M+H]+)。
实施例4.2
[18F]-2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-甲酸{2-[3-(2-氟-乙氧基)-苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基}-酰胺([18F]-20)
通过在真空下共沸蒸馏干燥[18F]-KF/K2.2.2复合物(26.0GBq)。利用MeCN(1mL)进行二次蒸馏以保证[18F]-KF/K2.2.2复合物的完全干燥。然后将甲苯-4-磺酸2-[3-(7-{[2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-羰基]-氨基}-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-苯氧基]-乙酯(19)(5.8mg,8.98μmol)在无水DMSO(0.8mL)中的溶液加入到反应性的[18F]-氟化物。将所得的溶液在120℃加热30分钟,然后冷却至40℃。将粗混合物用HPLC洗脱液(4mL;洗脱液A:H2O与TFA 0.02%;洗脱液B:MeCN与TFA 0.02%)稀释并且在室温搅拌3分钟。将粗混合物加载到半制备型HPLC柱中用于纯化(以5mL.min-1进行梯度洗脱:0至20min A/B 40/60然后A/B 70/30;柱:Nucleodur C18 Pyramid7μm 250x10mm;注射体积:5mL;UV检测波长=254nm)。将放射性峰收集(Rt=18.35min,v=11mL)到盛有水(50mL)的圆底烧瓶中。通过固相提取以5mL.min-1提取放射性化合物。在用水(10mL)洗涤后,相继使用EtOH(1mL)和盐水(7mL)将产物从所述筒洗脱下来。将这些级分合并到盛有盐水(3mL)的无菌小瓶中(A=2.32GBq,产率EOB=18%,SA EOS=101MBq.μg-1,合成时间=107min)。放射性剂量通过放射性-TLC(Rf=0.25Hept/EtOAc 15/85)和分析型放射性-HPLC(Rt=4.18min,RCP=99.8%;HPLC系统:Perkin Elmer HPLC系列200;洗脱液A:H2O与TFA 0.02%;洗脱液B:MeCN与TFA 0.02%;洗脱方法:等度洗脱A/B 40/60,1.5mL.min-1;柱:Thermo Scientific Hypersil GoldC183μm 150x4.6mm;注射体积:20μL;UV检测波长=254nm)进行质量控制。通过利用冷的2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-甲酸{2-[3-(2-氟-乙氧基)-苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基}-酰胺作为参比化合物进行掺杂来确认示踪剂的身份(UV-痕迹:Rt=4.03min,[18F]-痕迹:Rt=4.14min)。
实施例5
[11C]-2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-甲酸[2-(3-甲氧基-苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基]-酰胺([11C]-21)
向1mL小V瓶加入前体2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-甲酸[2-(3-羟基-苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基]-酰胺(18)(CAS Nr.1380330-59-5;WO2012076430)。将前体溶解在0.2mL二甲亚砜中。加入三微升5N氢氧化钠,并用隔膜密封将小瓶盖住,之后加入[11C]-甲基碘。将制备自[11C]二氧化碳并由氦流运载的[11C]甲基碘放入以上溶液中。在放射性的平台后,将反应小瓶在80℃水浴中加热3min,然后用0.2mL制备型HPLC流动相猝灭,所述流动相由30%乙腈/70%含水缓冲液(57mMTEA,用o-磷酸调至pH 3.2)组成。通过反相HPLC(Waters XBridge C18 10x 150mm,10μ)以10mL/min在254nm纯化粗反应产物。将与前体(Rt=3.2min)分开的放射性产物(Rt=9.5min)远距离收集在50mL水的贮水池(reservoir)中。将在水的贮水池中的产物级分加载到C18 Sep-Pak上。然后用10mL 0.9%氯化钠注射剂将C18 Sep-Pak冲洗至废液(waste)。利用1mL乙醇然后利用14mL 0.9%氯化钠注射剂将产物[11C]-21自C18 Sep-Pak洗脱下来,通过在无菌、无热原小瓶中的0.22μ滤器灭菌。
[11C]-21的平均无衰减的修正放射化学产率为约25%。测定等分试样(0.1mL)的放射性并且通过分析型HPLC(40%乙腈/60%含水缓冲液(57mM TEA,用o-磷酸调至pH 3.2);Waters XBridge C18 10x 150mm,10μ)以2mL/min在254nm进行检验。观察到对应于[11C]-2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-甲酸[2-(3-甲氧基-苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基]-酰胺([11C]-21)的单个放射性峰(Rt=2.3min)。在合成结束时通过将放射性和与载体的UV吸光度峰相关联的质量相关确定的合成结束时的比放射性超过7500mCi/μmole。
实施例6
[3H]-2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-甲酸[2-(3-甲氧基-苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基]-酰胺([3H]-21)
将0.67mg(1.5μmol)苯酚前体(18)在300μl DMF中的溶液加入到50mCi(0.69μmol)[3H]对甲苯磺酸甲酯(4-硝基苯磺酸甲酯-[甲基-3H])在200μl DMF中的溶液,之后加入0.7mg(3.6μmol)碳酸铯。在室温搅拌3h后,将反应混合物用氯化铵水溶液稀释并且用叔丁基甲基醚萃取。在分离和蒸发有机层后,将所得的粗产物通过HPLC(XBridge C18,利用乙腈/水20:80至70:30在15min内进行洗脱)纯化。收集产物级分,随后通过固相提取(Sep-Pak C18)分离纯的化合物。在用乙醇洗脱后,以>99.4%的放射化学纯度和76Ci/mmol的比活获得5mCi的[3H]-2-甲基-4-(吗啉-4-羰基)-2H-吡唑-3-甲酸[2-(3-甲氧基-苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基]-酰胺([3H]-21)。
药理学试验
进行下列试验以便测定本发明的化合物的活性。使用与先前所述的方法(Fawcett,L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000,97(7),3702-3707)类似的基于闪烁近似测定法(Scintillation Proximity Assay)(SPA)的方法来测定本发明的化合物的PDE10A活性。
人PDE10A全长测定法在96孔微量滴定板中进行。50μl的反应混合物包含20mM HEPES pH=7.5/10mM MgCl2/0.05mg/ml BSA(Sigma cat.#A-7906),50nM cGMP(Sigma,cat.#G6129)和50nM[3H]-cGMP(GEHealthcare,cat.#TRK392 S.A.13.2Ci/mmol),3.75ng/孔PDE10A酶(EnzoLife Science,Lausen,Switzerland cat#SE-534),有或无特定测试化合物。使用一系列浓度的潜在抑制剂来生成用于计算导致50%效力的抑制剂浓度的数据(例如IC50,抑制50%的PDE10A活性的竞争剂的浓度)。测试在没有酶的情况下的非特异性活性。反应通过加入底物溶液(cGMP和[3H]-cGMP)开始并于室温下持续20分钟。通过加入在18mM硫酸锌溶液(终止剂)中的25μl YSi-SPA闪烁珠粒(GE Healthcare,cat.#RPNQ0150)来终止反应。在摇动下1h后,将板于170g离心一分钟以便让珠粒沉淀。其后,在Perkin Elmer Top-Count Scintillation板读取仪上测量放射量。
根据式(I)的化合物具有低于10μM,更具体地低于5μM,仍更具体地低于1μM的IC50值。下表显示示踪剂的数据。
实施例 | PDE10A抑制IC50[nM] |
4 | 0.94 |
20 | 0.59 |
21 | 5.1 |
体外放射自显影(图1和2)
1)体外放射自显影
通过体外放射自显影、使用雄性Sprague-Dawley大鼠研究氚化的放射性配体结合位点的分布以及PDE10A的结合特异性。将动物宰杀并将其脑快速取出并冻在干冰粉末中。在恒冷箱切片机中切割10μm厚的径向切片并且解冻安装在粘附载玻片上。将脑切片首先在Ringer缓冲液(NaCl 120mM,KCl 5mM,CaCl22mM,MgCl21mM,Tris-HCl 50mM pH 7.4)中在室温温育10min,然后在含有放射性配体的Ringer缓冲液中温育60min。为了评估放射性示踪剂的非特异性结合(NSB),将额外的一系列切片与含有放射性示踪剂和参比高亲和力PDE10A抑制剂(MP-10)的Ringer缓冲液温育。
在温育结束时,将切片在冰冷的Ringer缓冲液中清洗3x 5min,然后快速地在4℃的蒸馏水中浸蘸一次。将安装在载玻片上的脑切片在冷空气流下干燥3h并且与[3H]-微尺度([3H]-microscale)一起暴露于Fuji成像板达5天。然后在高分辨率Fuji BAS读出器中扫描所述成像板。与目的脑区域结合的放射性示踪剂的总量(TB)使用MCID图像分析程序测量并且表示为fmol的结合的放射性示踪剂/mg的蛋白质。与PDE10A特异性结合的放射性配体的量(%SB)根据式%SB=100-(NSB/TB*100)计算。获得的结果显示特异性结合总计超过95%(见图1和2)。
食蟹猴(cynomolgus monkey)中的PET成像实验(图3和4)
在异氟烷麻醉下,在最多1分钟内,将所有剂量的氟-18标记的放射性示踪剂经静脉注射注入;在施用后,插管用5mL盐水冲洗。将放射性示踪剂制备成含有最多10%EtOH的无菌盐水。
在扫描前,将平均体重为7-8kg的动物雄性食蟹猴(毛里求斯血统的食蟹猴(Macaca fascicularis))禁食过夜或达最少6小时。动物准备在无麻醉下进行。将所述动物置于椅子上并且约束臂/腿。将静脉内导管插入右和左头静脉中用于放射性示踪剂的注射并且作为流体滴注的入口点。在扫描前,将所述动物用异丙酚(3-6mg/kg)麻醉,转移到PET照相机床(PETcamera bed),在那里气管导管被插入以用于施用气体麻醉。将猴子仰卧地安置在扫描仪躺椅上的PET兼容性儿科限制器中,并且在异氟烷麻醉(1-2%)下放置。将气管导管连接至二氧化碳分析仪用以监测呼吸速率和潮汐的二氧化碳水平。经由脉冲测氧法连续监测百分比动脉氧饱和。在无菌条件下,将导管插入股动脉以用于动脉血取样。将动物置于利用CT侦查扫描的PET扫描仪的膛内。在确认正确的姿势后,获得透射扫描。
然后动物被给药以放射性示踪剂。在General Electric Discovery VCT整体扫描仪上进行动态三维(3D)PET扫描;同时的35个切片,轴向视场15.7cm。获取在床位置(头在视场的中心)的180分钟的动态发射数据。记录准确的扫描时间以及放射性示踪剂的施用时间和血液取样时间点。
在每次获取期间,自股动脉收集动脉血样品用以确定全血和血浆输入功能。在施用放射性示踪剂后10s,20s,30s,40s,50s,60s,90s,2min 5min,10min,20min,40min,60min,90min,120min和180min,使用被校准和归一化以用于测量18F的专门的PETγ计数器(Wizard2,Perkin Elmer)测量全血和血浆中的放射性浓度。将全血样品称重并计数。以相同方式处理血浆样品。
对应于真实放射性示踪剂的血浆中放射性的分数通过对在施用后2,5,10,20,40,60,90和120min收集的动脉血浆样品进行放射性-HPLC确定。
狒狒中的体内PET成像(图5和6)
在雄性狒狒(东非狒狒(papio anubis))中进行PET实验。在PET研究前,将动物禁食12小时。最初用5-7mg/kg限制剂量的盐酸氯胺酮经肌肉内使狒狒镇静从而实现浅水平麻醉,然后保持0.3-0.4mg/kg/h的连续异丙酚静脉内注入(Injectable Emulsion)。通过注入等渗压盐水来保持循环体积。插入股动脉导管用于血液取样。在整个研究过程中,连续监测包括心率,ECG,血压和氧饱和度在内的生理学生命特征。将动物放置在ECAT脑PET扫描仪(High Resolution Research Tomograph,CPSInnovations,Inc.,Knoxville,TN)中。将动物的头部与连到头部固定器的热塑性面罩配合以用于可再现的固定。最初进行6min透射扫描(1mCiCs-137点源)以用于衰减校正。作为1分钟推注,静脉内施用[11C]-放射性示踪剂(约20mCi或1.5μg)。在开始放射性示踪剂施用后启动PET扫描和动脉血取样,并且在施用放射性示踪剂后的0至120分钟获取PET图像。使用针对衰减,散射和死时间(dead-time)校正的迭代有序子集预期-最大化(OSEM)算法重构发射PET扫描。将标准VOI模板转移至每个个体动物的基线PET。PET成像研究的结果显示放射性示踪剂容易地渗透到狒狒脑中并且特异性地积聚在表达PDE10A的脑区域如尾状壳核(caudate putamen)中。
Claims (14)
1.式I的放射性标记的化合物,
其中
R1和R2独立地选自C1-7烷基,C1-7卤代烷基,R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基,
R3是C1-7烷基,
R4是氢、C1-7烷氧基或C1-7卤代烷氧基,并且
其中,R1、R2、R3或R4中任一个标记有选自3H、11C和18F的放射性核素。
2.权利要求1的放射性标记的化合物,其中
R1是C1-7烷基,
R2是C1-7氟烷基,
R3是甲基,
R4是氢,其中或者R2标记有18F或3H,或者R3标记有11C。
3.权利要求1的放射性标记的化合物,其中
R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基,优选吗啉基,
R3是甲基,
R4是C1-7氟烷氧基,其中R4标记有18F。
4.权利要求1的放射性标记的化合物,其中
R1和R2与它们所连接的氮原子一起,形成杂环烷基,优选吗啉基,
R3是甲基,
R4是C1-7烷氧基,其中R4标记有3H或11C。
5.权利要求1-4的放射性标记的化合物,其选自由以下组成的组:
6.权利要求1-5的放射性标记的化合物,其用作PDE10APET示踪剂。
7.权利要求1-5的化合物,其用于PDE10A结合研究。
8.权利要求1-5的化合物,其用作PET示踪剂或放射自显影放射性配体。
9.权利要求1-5的化合物,其用于对受试者脑中的PDE10A进行诊断成像。
10.用于对受试者组织中的PDE10A进行正电子成像术(PET)成像的方法,所述方法包括:
a)向所述受试者施用有效量的权利要求1-5的化合物,
b)使所述化合物渗透到所述受试者的所述组织中;和
c)收集所述受试者的CNS或脑组织的PET图像。
11.用于检测受试者组织中PDE10A功能性的方法,所述方法包括
a)向所述受试者施用有效量的权利要求1-5的化合物,
b)使所述化合物渗透到所述受试者的所述组织中;和
c)收集所述受试者的CNS或脑组织的PET图像。
12.权利要求1-5中任一项所限定的化合物用于制备组合物的用途,所述组合物用于对受试者脑中的PDE10A进行诊断成像。
13.药物组合物,其包含权利要求1-5中任一项所述的化合物和药用赋形剂。
14.如上所述的本发明。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13153404 | 2013-01-31 | ||
EP13153404.2 | 2013-01-31 | ||
PCT/EP2014/051180 WO2014118039A1 (en) | 2013-01-31 | 2014-01-22 | Radiolabeled compounds |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104955825A true CN104955825A (zh) | 2015-09-30 |
Family
ID=47628036
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480006218.6A Pending CN104955825A (zh) | 2013-01-31 | 2014-01-22 | 放射性标记的化合物 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160031878A1 (zh) |
EP (1) | EP2951176A1 (zh) |
JP (1) | JP2016513083A (zh) |
KR (1) | KR20150111354A (zh) |
CN (1) | CN104955825A (zh) |
BR (1) | BR112015017674A2 (zh) |
CA (1) | CA2899781A1 (zh) |
HK (1) | HK1210610A1 (zh) |
MX (1) | MX2015009377A (zh) |
RU (1) | RU2015133164A (zh) |
WO (1) | WO2014118039A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112500336A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-03-16 | 内蒙古永太化学有限公司 | 一种度鲁特韦母核中间体的制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012076430A1 (en) * | 2010-12-07 | 2012-06-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Triazolopyridine compounds |
CN102548991A (zh) * | 2009-09-24 | 2012-07-04 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 作为磷酸二酯酶10a抑制剂的咪唑并吡啶或咪唑并嘧啶衍生物 |
WO2013000924A1 (en) * | 2011-06-27 | 2013-01-03 | Janssen Pharmaceutica Nv | 1-ARYL-4-METHYL-[1,2,4]TRIAZOLO[4,3-a]QUINOXALINE DERIVATIVES |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070032404A1 (en) | 2003-07-31 | 2007-02-08 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Methods for treating diabetes and related disorders using pde10a inhibitors |
EP2400991A1 (en) * | 2009-02-24 | 2012-01-04 | Janssen Pharmaceutica, N.V. | Radiolabelled pde10 ligands |
WO2010138577A1 (en) * | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Radiolabeled pde10 inhibitors |
JP5778164B2 (ja) * | 2009-10-30 | 2015-09-16 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプJanssen Pharmaceutica Naamloze Vennootschap | 放射標識pde10リガンド |
DE102010042833B4 (de) * | 2010-10-22 | 2018-11-08 | Helmholtz-Zentrum Dresden - Rossendorf E.V. | Neue Halogenalkoxychinazoline, deren Herstellung und Verwendung |
SG190686A1 (en) * | 2010-11-10 | 2013-07-31 | Lundbeck & Co As H | Radiolabelled phenylimidazole-based ligands |
-
2014
- 2014-01-22 EP EP14703290.8A patent/EP2951176A1/en not_active Withdrawn
- 2014-01-22 RU RU2015133164A patent/RU2015133164A/ru unknown
- 2014-01-22 KR KR1020157020606A patent/KR20150111354A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-01-22 MX MX2015009377A patent/MX2015009377A/es unknown
- 2014-01-22 JP JP2015555643A patent/JP2016513083A/ja active Pending
- 2014-01-22 CN CN201480006218.6A patent/CN104955825A/zh active Pending
- 2014-01-22 CA CA2899781A patent/CA2899781A1/en not_active Abandoned
- 2014-01-22 BR BR112015017674A patent/BR112015017674A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-01-22 WO PCT/EP2014/051180 patent/WO2014118039A1/en active Application Filing
-
2015
- 2015-07-30 US US14/813,293 patent/US20160031878A1/en not_active Abandoned
- 2015-11-17 HK HK15111337.2A patent/HK1210610A1/zh unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102548991A (zh) * | 2009-09-24 | 2012-07-04 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 作为磷酸二酯酶10a抑制剂的咪唑并吡啶或咪唑并嘧啶衍生物 |
WO2012076430A1 (en) * | 2010-12-07 | 2012-06-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Triazolopyridine compounds |
WO2013000924A1 (en) * | 2011-06-27 | 2013-01-03 | Janssen Pharmaceutica Nv | 1-ARYL-4-METHYL-[1,2,4]TRIAZOLO[4,3-a]QUINOXALINE DERIVATIVES |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2016513083A (ja) | 2016-05-12 |
WO2014118039A1 (en) | 2014-08-07 |
US20160031878A1 (en) | 2016-02-04 |
KR20150111354A (ko) | 2015-10-05 |
MX2015009377A (es) | 2015-10-09 |
BR112015017674A2 (pt) | 2017-07-11 |
RU2015133164A (ru) | 2017-03-06 |
HK1210610A1 (zh) | 2016-04-29 |
CA2899781A1 (en) | 2014-08-07 |
EP2951176A1 (en) | 2015-12-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11542234B2 (en) | 2-alkoxy-6-[18F]fluoronicotinoyl substituted lys-c(O)-glu derivatives as efficient probes for imaging of PSMA expressing tissues | |
Doorduin et al. | [11 C]-DPA-713 and [18 F]-DPA-714 as new PET tracers for TSPO: a comparison with [11 C]-(R)-PK11195 in a rat model of herpes encephalitis | |
JP2022508699A (ja) | Lpa1受容体のイメージングのための放射性リガンド | |
JP2009522240A (ja) | 陽電子放出断層撮影として有用なラジシコール誘導体 | |
CN109475594A (zh) | 用于成像ido1酶的放射性配体 | |
US20170143856A1 (en) | Method for labeling exosomes with radioactive substance and use thereof | |
JP4554202B2 (ja) | 放射性標識神経ペプチドyy5受容体拮抗薬 | |
JPWO2009004914A1 (ja) | フッ素およびヒドロキシ基で置換されたアルコキシ基を有するpetプローブ | |
JP5820887B2 (ja) | 放射性標識されたフェニルイミダゾールベースのリガンド | |
Chen et al. | 18F-Labelled pyrrolopyrimidines reveal brain leucine-rich repeat kinase 2 expression implicated in Parkinson’s disease | |
CN103596950B (zh) | 对淀粉状蛋白具有亲和性的化合物 | |
Thomae et al. | Synthesis and preclinical evaluation of an 18F labeled PDE7 inhibitor for PET neuroimaging | |
JP2013507345A (ja) | インビボイメージング剤としてのフルマゼニルの[18f]標識類似体 | |
CN104955825A (zh) | 放射性标记的化合物 | |
KR101829913B1 (ko) | 방사성 금속 표지 벤조사이아졸 유도체 및 그 유도체를 포함하는 방사성 의약품 | |
EP2850044B1 (en) | Use of fluorinated derivatives of 4-aminopyridine in therapeutics and medical imaging | |
Zhang et al. | Positron Emission Tomography (PET) Imaging of Metabotropic Glutamate Receptor Subtype 2 (mGlu 2) Based on a Negative Allosteric Modulator Radioligand | |
Branquinho et al. | Radiosynthesis and in vivo evaluation of fluorinated huprine derivates as PET radiotracers of acetylcholinesterase | |
KR101307671B1 (ko) | 글리신 1 운반체의 방사성표지된 억제제 | |
EP3630287A1 (en) | Radiolabeled and fluorescent parp inhibitors for imaging and radiotherapy | |
Wei et al. | Easily automated radiosynthesis of [18F] P10A-1910 and its clinical translation to quantify phosphodiesterase 10A in human brain | |
Tang et al. | 68Ga-pAKTi PET/CT imaging as a non-invasive method to assess tumor response to PI3Kα Inhibitor in breast cancer | |
JP2021116238A (ja) | 新規化合物、およびその利用 | |
EP3835293A1 (en) | Monoamine oxidase b imaging probe | |
US9610369B2 (en) | Compound suitable for detection of vesicular acetylcholine transporter |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1210610 Country of ref document: HK |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150930 |
|
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1210610 Country of ref document: HK |