EA015930B1 - Применение йота-каррагинана для лечения риновирусной инфекции и фармацевтическая композиция для лечения риновирусной инфекции, содержащая йота-каррагинан - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к применению йота-каррагинана в эффективном антивирусном количестве в качестве активного антивирусного ингредиента для изготовления антивирусной фармацевтической композиции для профилактики или лечения риновирусной инфекции. Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции для профилактики или терапевтического лечения риновирусной инфекции, содержащей эффективное количество активного антивирусного компонента йота-каррагинана и к твердому предмету гигиены или санитарии, покрытому или пропитанному указанной антивирусной композицией.

Description

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и противовирусных средств, а именно к фармацевтической композиции, содержащей каррагинан в качестве активного антивирусного ингредиента, и к ее использованию для предупреждения или терапии риновирусных инфекций.

Уровень техники

Пикорнавирусы - это очень крупное семейство вирусов, состоящее из мелких вирусов, содержащих рибонуклеиновую кислоту и вызывающих многие серьезные заболевания человека и животных. Пикорнавирусы делятся на четыре основных группы: энтеровирусы, риновирусы, кардиовирусы и афтовирусы.

Риновирусы человека делятся по меньшей мере на 100 серотипов и являются основными возбудителями простуды. Из-за большого количества серотипов создание вакцины затруднено; поэтому противовирусные средства могут представлять лучший способ лечения. Риновирусы содержат капсид, который состоит из четырех вирусных белков - УР1, УР2, УР3 и УР4. Белки УР1, УР2 и УР3 организованы в 60 повторяющихся протамерных икосаэдрических единиц. Считается, что эти белки являются причиной разнообразия антигенов риновирусов.

Риновирусные инфекции вызывают простуду с такими симптомами, как лихорадка, кашель и заложенность носа. Риновирусы - вторые по частоте возбудители пневмонии и бронхиолита у детей младшего возраста, а также частая причина обострения заболевания дыхательных путей у больных бронхиальной астмой, хроническими обструктивными заболеваниями легких или муковисцидозом. В зависимости от возраста риновирусная инфекция вызывает от трети до половины обострений бронхиальной астмы, кроме того, риновирусная инфекция связана с госпитализацией по поводу астмы взрослых и детей.

Современные подходы к лечению включают введение специфичной по отношению к риновирусам РНК, как раскрыто в ΌΕ 19825395, связывающейся с капсидом вируса в области углубления (каньона), которое необходимо для связывания с рецептором хозяина (например, 1САМ-1 - межклеточная молекула адгезии 1) и заражения клетки.

Другой способ предусматривает введение растворимых белков 1САМ-1 или производные 1САМ-1, как раскрыто в патентах США 6326004 и 6096862 (ПСАМ-1 - укороченная 1САМ-1), чтобы нейтрализовать вирусные частицы (вирионы).

Химические соединения с антивирусной активностью против риновирусов раскрыты в ЕР 0523803.

Симптомы риновирусной инфекции вызываются чрезмерной или неспецифичной реакцией иммунной системы. Поэтому обычные формы лечения риновирусной инфекции включают введение анальгезирующих средств, таких как аспирин или ацетаминофен/парацетамол, а локализованные формы лечения, направленные на глотку (часто в форме пастилок), включают назальные противоотечные средства, которые ослабляют воспаление в полости носа за счет сужения местных кровеносных сосудов, противокашлевые средства (которые подавляют кашлевой рефлекс головного мозга или разжижают слизь в легких) и антигистаминные препараты первого поколения, например бромфенирамин, хлорфенирамин и клемастин (которые ослабляют секрецию слизистых желез и тем самым противодействуют заложенности/жидким выделениям из носа, но также могут вызвать у пользователя сонливость).

Сульфатированные полисахариды, включая каррагинаны, известны в данной области техники своей антивирусной эффективностью. В самом интересном обзоре, Сопха1сх М.Е. с1 а1. (1987, Аийш1сгоЬ. Адеи15 СйетоЛег. 31, 1388-1393) сообщают об антивирусной эффективности различных сульфатированных полисахаридов, включая йота-каррагинан, против некоторых вирусов животных. Йота-каррагинан продемонстрировал антивирусную активность против вирусов, имеющих внешнюю оболочку - Н8У-1, Н8У-2, вируса леса Семлики (8ЕУ), вируса осповакцины и африканского вируса лихорадки свиней (А8Е); а также против лишенного такой оболочки вируса энцефаломиокардита (ЕМС). Йота-каррагинан не оказывал никакого влияния на покрытые оболочкой вирус везикулярного стоматита (У8У) и вирус кори, а также на лишенные оболочки вирус полиомиелита типа 1 и аденовирус типа 5.

В патенте США 2003/181415 А раскрыта антивирусная активность сульфатированных полисахаридов, таких как сульфат целлюлозы, против различных вирусов, имеющих оболочку, в частности против вируса простого герпеса (Н8У), вируса папилломы и ВИЧ.

В XV О 2005/004882 А раскрыта терапия вирусных инфекций, исключая риновирусную инфекцию, сульфатированными полисахаридами, такими как каррагинаны.

В патенте США 2005/171053 А1 раскрыто применение лямбда-каррагинана для подавления распространения передаваемой половым путем инфекции, включая ВИЧ-1-инфекцию.

Уатаба е1 а1. (1997, СагЬойубШе Ро1утег5, Арр1. 8с1еи. РиЬ115Йег5 32, 51-55) раскрыли активность против ВИЧ-1 активность лямбда-, каппа- и йота-каррагинана, а также их сульфатированных производных.

8.Е.Т15сйег е1 а1. (2006, С’агЬо11убга1е Ро1утег5, Арр1. 8с1еи. РиЬЛйега 63, 459-465) раскрыли активность каррагинана, выделенного от Меп8Ое11а дейбшт, против вирусов лихорадки денге и простого герпеса.

Саг1исс1 е1 а1. (2004, Аи1Мга1 Кекеагсй, Екеу1ег 8с1еисе ВУ. 64, 137-141) раскрыли защитное влияние лямбда-каррагинана при генитальной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса у мышей.

Ри)о1 е1 а1. (2006, Р1аи1а Мебюа 72, 121-125) раскрыли антивирусную активность каррагинана, выде

- 1 015930 ленного от С1дат11па ккойзЬетди, против интраперитонеальной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса у мышей.

Термин каррагинан часто используется как собирательный для извлекаемых из морских водорослей (тйоборйусеае) линейных сульфатированных полисахаридов, построенных из остатков галактозы. Каррагинан используется, главным образом, как загуститель, желатинирующее средство, стабилизатор или эмульгатор в фармацевтических и продовольственных продуктах.

Существует более 10 различных каррагинанов в зависимости от рода морской водоросли, из которого их извлекают. Три основных типа - йота-, каппа- и лямбда-каррагинан, которые мало отличаются по строению и степени сульфатирования. Йота-каррагинан - это образующий мягкий гель сульфатированный галактан, который преимущественно извлекают из красной морской водоросли СщагОпа 51е11а1а и Сйопбтик спкрик. Каппа-каррагинан образует твердые, жесткие гели; его преимущественно получают из Каррарйусш соИопи. Лямбда-каррагинан - наиболее распространенная форма, ее часто используют для загущения молочных продуктов.

Несмотря на давно известную антивирусную активность некоторых каррагинанов против вирусов, например ВИЧ или Н8У, механизм антивирусной активности каррагинанов все еще нуждается в объяснении.

В свете вышеупомянутого настоящее изобретение относится к антивирусной композиции на основе каррагинана, пригодной для профилактики или терапии риновирусной инфекции (ринита).

Эксперименты, приведшие к настоящему изобретению, неожиданно продемонстрировали, что несмотря на возможное резервирование в данной области техники, выбранные каррагинаны проявляют антивирусную активность против риновирусных инфекций (ринита), причем лучшие результаты дает йота-каррагинан.

Описание изобретения

Первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению йотакаррагинана в эффективном антивирусном количестве в качестве активного антивирусного ингредиента для изготовления фармацевтической композиции для профилактики или терапевтического лечения риновирусной инфекции, причем композиция пригодна для местного применения или нанесения на слизистую оболочку, предпочтительно для использования в виде спрея для носа, порошка, включая порошок для вдыхания, геля, мази, пены или жидкого раствора, в частности лосьона, раствора для полоскания или капель.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению каррагинана, предпочтительно йота-каррагинана, для изготовления фармацевтической композиции для профилактики или терапевтического лечения физического состояния, выбранного из группы, состоящей из микробной инфекции, воспалительного заболевания, аллергии и поврежденной или подавленной иммунной системы, где каррагинан присутствует в комбинации по меньшей мере с одним другим фармацевтически активным соединением или лекарственным средством. В такой композиции каррагинан может проявить адъювантную антириновирусную функцию. Упомянутое по меньшей мере одно другое фармацевтически активное соединение или лекарственное средство могут быть выбраны из группы, состоящей из стероида, например кортизона, и антигистаминного средства.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению йота-каррагинана в эффективном антивирусном количестве в качестве активного антивирусного ингредиента в фармацевтической композиции для профилактики или терапевтического лечения риновирусной инфекции.

Указанная композиция предназначена для лечения риновирусной инфекции у человека, представляющего собой пациента с высоким риском, выбранного из группы, состоящей из больного бронхиальной астмой, человека, страдающего от аллергии, и человека, страдающего от воспалительного заболевания.

Термин активный антивирусный ингредиент, используемый в данном документе, относится к соединению каррагинана, которое при введении в эффективной дозе или количестве вмешивается прямо или косвенно либо и прямо, и косвенно в цикл риновирусной инфекции в эукариотической клетке, конкретнее вмешивается по меньшей мере в одну часть цикла риновирусной инфекции, выбранной из группы, состоящей из проникновения вируса в эукариотическую клетку, репликации вируса в эукариотической клетке, сборки вируса и высвобождения вируса из инфицированной эукариотической клетки. Сюда также включен любой эффект по неспецифическому ингибированию повышения титра вируса или неспецифическому снижению титра вируса в эукариотической системе хозяина или системе хозяинамлекопитающего. Кроме того, этот термин относится к соединению с профилактической эффективностью, которая защищает по меньшей мере в некоторой степени или снижает вероятность заболеть вирусной инфекцией.

Таким образом, настоящая фармацевтическая композиция может вводиться до или после начала вирусной инфекции. Термин профилактика или профилактическое лечение, который используется в данном документе, относится к введению настоящей фармацевтической композиции, чтобы защитить, по меньшей мере до некоторой степени, или ослабить риск заболевания вирусной инфекцией.

Термин лечение или терапевтическое лечение, который используется в данном документе, от

- 2 015930 носится к введению настоящей фармацевтической композиции человеку, инфицированному вирусом, чтобы облегчить патологическое воздействие инфекции, включая снижение тяжести и/или частоты появляющихся симптомов или устранение таких симптомов, исправление возможных повреждений, вызванных или связанных с такой вирусной инфекцией, включая ингибирование или профилактику вторичных вирусных, бактериальных, грибковых или любых других видов микробной инфекции.

Собирательный термин каррагинан относится к смеси по меньшей мере двух гомо- или гетерополимеров йота-, каппа- или лямбда-каррагинана, то есть к смеси гомо- или гетерополимеров йота- и лямбда-каррагинана, йота- и каппа-каррагинана или йота-, каппа- и лямбда-каррагинана, если явно не указано иного или если иное значение не выводимо из существа раскрытия.

Гомополимер каррагинана представляет собой молекулярно чистое соединение каррагинана, состоящее из каррагинана одного типа: йота-, каппа- или лямбда. Гетерополимер каррагинана содержит субъединицы по меньшей мере двух различных типов каррагинана, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из субъединиц йота-, каппа- и лямбда-каррагинана.

Термин смесь каррагинанов может также относиться к композиции, содержащей в качестве активного антивирусного ингредиента по меньшей мере один вид гетерополимера каррагинана, таким образом смесь преимущественно будет смесью различных субъединиц каррагинана, как части упомянутого по меньшей мере одного гетерополимерного каррагинана, присутствующего в композиции.

Следующий вариант осуществления изобретения относится к такой антириновирусной композиции для профилактического или терапевтического применения, где указанная риновирусная инфекция является острой или хронической риновирусной инфекцией.

Настоящая композиция на основе каррагинана пригодна для местного применения с целью терапии воспаления кожи или слизистой. Однако возможно и системное, например парентеральное или пероральное, введение, особенно композиции, преимущественно содержащей низкомолекулярные фракции каррагинана. У каррагинана, применимого по настоящему изобретению, средняя молекулярная масса равна приблизительно 15000-5000000 Да. Низкомолекулярная фракция содержит каррагинан со средней молекулярной массой от приблизительно 15000 до приблизительно 50000 Да, среднемолекулярная фракция - со средней молекулярной массой от приблизительно 50000 до приблизительно 500000 Да, а высокомолекулярная фракция - от приблизительно 500000 до приблизительно 5000000 Да.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция пригодна для местного использования или нанесения на слизистые оболочки. Подходящими формами готовых к употреблению галеновых препаратов являются кремы, гели, мази, порошки (включая порошки для ингаляции), аэрозоли, пены или жидкие растворы, например лосьоны для кожи, растворы для полоскания или капли в нос. Другие подходящие формы галенового препарата будут очевидны для среднего специалиста в данной области техники, включая, например, назальные системы для введения препарата, раскрытые в патенте США 6391452.

Кроме активных антивирусных ингредиентов настоящая композиция типично содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и необязательно дополнительные добавки или ингредиенты.

Подходящий носитель может быть разбавителем, например водой или физиологическим раствором, наполнителем или другим носителем, пригодным и применимым для введения активных ингредиентов. Необязательные добавки могут быть выбраны из группы, состоящей из 8ίΟ₂, ΤίΟ₂, связующего, такого как микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, камедь трагаканта, желатин, крахмал, лактоза, моногидрат лактозы, альгиновая кислота или кукурузный крахмал; смазывающего или поверхностно-активного вещества, такого как стеарат магния или лаурилсульфата натрия; скользящего вещества, такого как коллоидный диоксид кремния; подсластителя, такого как сахароза или сахарин. Дополнительные добавки в препарате могут являться, но не ограничены, буферами или средствами, регулирующими рН, например, выбранными из лимонной кислоты, уксусной кислоты, фумаровой кислоты, хлористоводородной кислоты, яблочной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты, пропионовой кислоты, серной кислоты, винной кислоты или их комбинации.

Могут присутствовать дополнительные ингредиенты, включая лекарственные средства, отличающиеся от каррагинана, или фармацевтически активные вещества.

Каррагинан может использоваться в форме любой фармацевтически приемлемой соли, например могут использоваться натриевые соли каррагинана. Другие фармацевтически приемлемые соли включают, среди прочего, калийные, литиевые и аммониевые соли каррагинана.

В другом варианте осуществления изобретения композиция предназначена для местного применения и содержит йота-каррагинан в количестве от 0,01 до 20%, предпочтительно от 0,1 до 10%, наиболее предпочтительно от 0,5 до 5 мас.% (мас./мас.) препарата.

Обычно композиция будет представлять собой апирогенный, стерильный препарат. В случае жидкого препарата стерильность может обеспечиваться, например, путем фильтрации через подходящий мембранный фильтр. Способы изготовления стерильных или асептических фармацевтических композиций известны в данной области техники и не являются частью настоящего изобретения.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может быть нанесена в виде по

- 3 015930 крытия на твердые поверхности предметов гигиены или санитарии, в частности гигиенических или санитарных перчаток, ткани или бумаги, особенно ткани или бумаги для ухода за носовой полостью и на носовые платки. Конкретнее, фармацевтическая композиция может быть нанесена, например, распылена подобно дезинфицирующим средствам на перчатки, гигиенические ткани или бумагу, включая ткани для носа, чтобы проявить вирусоцидный эффект по меньшей мере до некоторой степени, тем самым способствуя снижению повторного аутоинфицирования человека загрязненными кончиками пальцев, а также ослабить распространение вируса между различными людьми, которые находятся в тесном контакте, например контакте рук, друг с другом. В зависимости от природы предмета санитарии или гигиены, предмет может быть покрыт, увлажнен или другим способом пропитан фармацевтической композицией.

Такие обработанные вышеуказанной композицией предметы также могут включать, но не ограничиваться ватными тампонами, противопылевыми масками или лицевыми масками. Даже помада может содержать антивирусное эффективное количество каррагинана. Эти предметы гигиены или санитарии могут использоваться профилактически или наряду с терапевтическим лечением против вирусной инфекции и могут помочь в профилактике или снижении риска инфекции.

Соответственно, вариант осуществления изобретения относится к твердому предмету гигиены или санитарии, где антивирусная композиция нанесена на твердую поверхность продукта гигиены или санитарии, в частности гигиенической или санитарной перчатки, ткани или бумаги, особенно ткани или бумаги для носа, посредством либо нанесения покрытия, либо пропитывания.

Применимые по настоящему изобретению йота-, каппа- и лямбда-каррагинаны имеются в продаже, но также могут быть получены извлечением из морских водорослей в соответствии с процедурами экстракции, известными в данной области техники.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению йотакаррагинана.

В конкретном варианте осуществления антивирусная фармацевтическая композиция по настоящему изобретению по существу свободна от форм каррагинана, отличающихся от йота-, каппа- и лямбдакаррагинана, хотя следовые количества таких других каррагинанов могут присутствовать. Для различных применений йота-каррагинан может быть по существу единственным видом каррагинана, присутствующим в композиции.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению каррагинана в получении антивирусной композиции, где композиция содержит либо только йота-каррагинан, либо дополнительно к йота-каррагинану по меньшей мере один другой тип каррагигана, например каппа-каррагинан и лямбдакаррагинан. При этом композиция содержит не менее 50% (мас./мас.), не менее 80%, и предпочтительно не менее 95% йота-каррагинана по отношению к общей массе каррагинанов, присутствующих в композиции. Процентные содержания приведены в процентах по массе (мас./мас. %) относительно сухой массы каррагинанов, присутствующих в композиции.

Вышеупомянутые значения концентрации каррагинана аналогичным образом применимы к гомо- и гетерополимерным каррагинанам.

Обнаружено, что каррагинан нетоксичен после перорального или подкожного введения, или после ингаляции даже в чрезвычайно больших дозах, поэтому Рооб апб Эгид Абтшкйабоп (ΡΌΑ) отнесло его к категории веществ в целом признанных безопасными.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению каррагинанов в изготовлении антивирусной композиции, которая содержит по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное вещество, антивирусное соединение, предпочтительно сульфат целлюлозы.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает результаты определения ингибирования клеточной смерти, индуцированной НРУ (ХТТ).

Ордината - оптическая плотность (ΟΌ), измеренная при 492 нм; абсцисса - различные тестовые пробы; 1 - неинфицированные клетки; 2 - необработанные, инфицированные клетки; 3 - инфицированные клетки, обработанные йота-каррагинаном; 4 - инфицированные клетки, обработанные каппакаррагинаном; 5 - инфицированные клетки, обработанные лямбда-каррагинаном.

Фиг. 1А - клетки, инфицированные НВУ-2; фиг. 1В - клетки, инфицированные НРУ-14.

Фиг. 2 показывает определение пиковых титров в супернатанте от инфицировавших клеток Не1а с помощью ТСГО₅₀.

Ордината - титр ТСГО₅₀; абсцисса - концентрация йота-каррагинана в мкг/мл; и - необработанные клетки; Т (лечение) - клетки были инфицированы в течение одного часа, и спустя один час после обработки была добавлена указанная концентрация йота-каррагинана; Р (профилактика) - суспензию вируса инкубировали с указанной концентрацией йота-каррагинана в течение часа перед инфекцией. Дополнительная обработка идентична Т: клетки инфицировали при ΜΟΙ 0,01. Пиковые титры НКУ-2 наблюдали на 3-й день (фиг. 2А), НКУ-14 - на 4-й день (фиг. 2В).

Фиг. 3 показывает эффективность йота-каррагинана в ингибировании репликации риновируса в инфицированных клетках носового эпителия человека, определенную методом ТСГО₅₀.

Ордината - 1од титра ТСГО₅₀; абсцисса - концентрация йота-каррагинана в мкг/мл; МОСК - необра

- 4 015930 ботанные контрольные клетки; фиг. ЗА - клетки, инфицированные НКУ-1А; фиг. 3В - клетки, инфицированные НКУ-2; фиг. ЗС - клетки, инфицированные НКУ-8; фиг. 3Ό - клетки, инфицированные НКУ-16; фиг. ЗЕ - клетки, инфицированные НКУ-39; фиг. ЗЕ - клетки, инфицированные НКУ-83.

Фиг. 4 показывает эффективность йота-каррагинана против риновируса при повторном лечении, определенную по снижению цитопатического эффекта. Ордината - снижение цитопатического эффекта, %; абсцисса - концентрация йота-каррагинана, нг/мл; НКУ2Р0 - оригинальный штамм риновируса (без циклов репликации); НКУ2Р10 - штамм риновируса НКУ2Р0 после 10 циклов репликации в клетках НеЬа.

Следующие примеры приведены для лучшего понимания изобретения, описанного в данном документе. Примеры предназначены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение в любом отношении. Кроме того, подразумевается, что настоящее изобретение должно также включать вариации явно раскрытых вариантов осуществления до степени, которая будет понятна среднему специалисту в данной области техники.

Пример 1. Влияние различных типов каррагинанов на риновирусы человека типа 2 (НК.У-2) и типа 14 (НКУ-14).

Субсливающиеся клетки НеЬа инкубировали с вирусной суспензией, которую перед этим инкубировали в течение 5 мин с 125 мкг/мл полимеров, как указано в фиг. 1. Через 48 ч жизнеспособность клеток определили методом ТОХ2 ХТТ (§щта).

Как показано на фиг. 1, самым эффективным полимером являлся йота-каррагинан (столбец 3), который был эффективен против обоих типов риновируса, в то время как лямбда- (столбец 5) и каппакаррагинаны (колонка 4) продемонстрировали эффективность против НКУ-2, но не НКУ-14. Усами на графике показано стандартное отклонение между шестью независимыми лунками.

Пример 2.

Полимеры, указанные в табл. 1, исследовали с помощью теста на ингибирование индуцированной НКУ-2 и НКУ-14 клеточной смерти (ХТТ) при концентрации 100 мкг/мл.

Как показано в табл. 1, йота-каррагинан обеспечил защиту против обоих типов риновируса («+» указывает на по меньшей мере 95%-ю защиту по сравнению с неинфицированными контрольными клетками). Каппа-каррагинан и лямбда-каррагинан были активны против НКУ-2, но не НКУ-14. Полимеры хитозана, карбоксиметилцеллюлоза и карбоксиметилхитозан не продемонстрировали ингибирующего эффекта вообще.

Таблица 1. Антивирусная активность нескольких исследованных полимеров

Полимер	ΗΚν-2	НКУ-14
Йота-каррагенан	+	+
Каппа-каррагенан	4-	-
Лямбда-каррагенан	+	-
Хитозан	-
Карбоксиметилцеллюлоза	-	-
Карбоксиметилхитозан	-	-

Пример 3.

Йота-каррагинан был эффективен против НКУ-2 и НКУ-14 в лечении и профилактики на вирусной модели репликации. Статистически значимое снижение пикового титра вируса наблюдалось при концентрациях, равных 6,25 пг/мл и более. Самым эффективным на модели профилактики против НКУ-2 был йота-каррагинан, который приводил к снижению пикового титра вируса более чем на 99,9%.

Пример 4. Эффект йота-каррагинана против выбранных подтипов риновируса человека.

Субсливающиеся клетки НеЬа на 96-луночных планшетах инкубировали с вирусной суспензией с ΜΟΙ (тиШрНейу οί тГссПоп), равным 0,5.

Через 20 мин после заражения вирусной суспензией добавили питательную среду, содержащую 3кратные разведения полимера. Через 48-72 ч жизнеспособность клеток определили с помощью ТОХ2 ХТТ (§1§та). ЕС₅₀ вычислили с помощью Ехсе1-Ей.

Таблица 2

Вирус	Ηκν-ι	ΗΒν-2	ΗΚν-8	НКУ-14	ΗΚν-16	ΗΚν-39
ЕС50	0,7 мкг/мл	21 мкг/мл	<0, 5 • мкг/мл	400 мкг/мл	381 мкг/мл	117 мкг/мл

Йота-каррагинан был активен против всех исследованных риновирусов человека на ранее инфицировавших клетках НеЬа. Концентрация каррагинана, необходимая, чтобы ингибировать цитопатический эффект на 50%, колебалась в широких пределах: от <0,5 мкг/мл для НКУ-8 до 400 мкг/мл для НКУ-14. Полученный результат указывает, что йота-каррагинан ингибирует репликацию широкого спектра подтипов риновируса в инфицировавших клетках НеЬа.

- 5 015930

Пример 5. Ингибирование репликации риновируса на клетках носового эпителия человека йотакаррагинаном.

Первичные клетки носового эпителия человека (Рготосе11) высевали в 24-луночные планшеты (2,9-10⁴ клеток на лунку) и культивировали в течение 3 дней при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Клетки инфицировали в момент слияния почти 60% штаммами риновируса НКУ-1 А, НКУ-2, НКУ-8, НКУ-14, НКУ-16, НКУ-39, НКУ-83 и НКУ-84. Риновирусы НКУ-1 А, НКУ-2, НКУ-8, НКУ-16, НКУ-39 и НКУ-83 оказывают литический эффект при репликации в клетках носового эпителия человека. НКУ-14 и НКУ-84 не вызывают лизиса клеток, а потому не подвергались дальнейшему тестированию. Предварительно вирусы инкубировались с йота-каррагинаном в концентрации 4, 40 и 400 мкг/мл, а также с МОСК в качестве контроля. МО1 был равен 0,34. Супернатант забирали в период с 48 до 72 ч после заражения и использовали для определения титра ТСГО₅₀. Как показано на фиг. 3, обработка йота-каррагинаном в концентрации 40 мкг/мл снижала титр вируса в супернатантах по меньшей мере на два порядка (>99%) по сравнению с контрольными клетками с имитацией обработки (на оси Υ отложен 1од титра вируса). Эти данные ясно указывают на то, что йота-каррагинан ингибирует репликацию вируса в первичных клетках эпителия человека. Поскольку в настоящее время не существует животной модели для исследования риновируса человека ίη νίνο, использованные в этих экспериментах эпителиальные клетки носового эпителия человека представляют собой наиболее важную ίη νίίτο модель, доступную в настоящее время. Усы на графиках обозначают стандартное отклонение между тремя исследованными выборками.

Пример 6. Определение эффективности йота-каррагинана против риновирусной инфекции после повторного лечения (проверка на возможное развитие устойчивости вируса).

Оригинальные вирусы НКУ2Р0 и НКУ2Р10, полученные после 10 селективных циклов репликации в клетках НеЬа, исследовали на снижение цитопатического эффекта. Клетки НеЬа (8-10⁴ клеток на лунку) высевали на шестилуночные планшеты. Клетки заражали соответствующей питательной средой с добавкой полимера каррагинана до финальной концентрации каррагинана 1,6; 5,3; 17, 50, 150 и 450 мкг/мл, также содержащей вирус с МО1 0,1.

В качестве контроля одну лунку подвергли ложному заражению не содержащей вируса питательной средой с добавкой каррагинана, а еще одну лунку инфицировали суспензией вируса, содержащей питательную среду без каррагинана. После инкубации в течение 20 мин после заражения лунки дважды промыли и ко всем лункам, кроме отрицательного контроля (т.е. чистая инфекция без ингибирования), добавили контрольную среду (без вируса, с добавкой каррагинана в выбранных концентрациях). Пробы брали из каждой экспериментальной лунки сразу после того, как наблюдался явный цитопатический эффект в лунках, служивших отрицательным контролем. В последующем цикле селекции для заражения клеток Не1а использовали содержащий вирус супернатант из лунок, обработанных каррагинаном, в которых наблюдался явный цитопатический эффект по сравнению с незараженным контролем. Типично, в экспериментальных лунках цитопатический эффект наблюдался при двух наименьших концентрация каррагинана, т.е. 1,6 и 5,3 мкг/мл.

Процедуру повторили 10 раз и полученные в результате вирусы сравнили по цитопатическому эффекту с оригинальными вирусами. Краткое описание: через 48 ч после заражения добавляли реагент ТОХ2 (81§та) и определяли ОЭ_{450 нм}, и измеряли снижение цитопатического эффекта в % по сравнению с неинфицированным контролем.

Чтобы проверить на возможное возникновение устойчивости вируса к каррагинану, вирус, использованный для первой инокуляции (вирус 2_001 на фиг. 4), и вирус, полученный после 10 циклов репликации (вирус 20_001 на фиг. 4), исследовали на снижение цитопатического эффекта, используя клетки НеЬа по экспериментальному протоколу, слегка отличавшемуся от описанного выше. Краткое изложение: клетки НеЬа заражали соответствующим вирусом при МО1 0,1 и через 20 мин после заражения инокулят удаляли и добавляли питательную среду, содержащую полимер каррагинана в конечной концентрации 1,6; 5,3; 17, 50, 150 и 450 мкг/мл (см. абсциссу на фиг. 4). Через 48 ч после заражения добавляли реагент ТОХ2 (81§та) и определяли ОЭ_{450 нм}, и измеряли снижение цитопатического эффекта в % по сравнению с неинфицированным контролем (фиг. 4, ордината). Усы на графиках обозначают стандартное отклонение между 6 независимыми лунками.

Как графически представлено в фиг. 4, в пробах, полученных из супернатанта первого и десятого цикла инфекции, не обнаружено статистически значимых различий в чувствительности вируса к каррагинану. Это указывает на то, что во время процедур отбора не возникло устойчивых мутантов. Следовательно, эти данные свидетельствуют, что развитие устойчивости риновирусов во время ίη νίνο терапии йота-каррагинаном маловероятно, даже в случае непрерывного или повторного введения в течение длительного периода.

Claims (18)

1. Применение йота-каррагинана в эффективном антивирусном количестве в качестве активного антивирусного ингредиента для изготовления фармацевтической композиции для профилактики или терапевтического лечения риновирусной инфекции.

- 6 015930

2. Применение по п.1, где указанная риновирусная инфекция является острой или хронической риновирусной инфекцией.

3. Применение по п.1 или 2, где композиция пригодна для местного применения или нанесения на слизистую оболочку, предпочтительно для использования в виде спрея для носа, порошка, включая порошок для вдыхания, геля, мази, пены или жидкого раствора, в частности лосьона, раствора для полоскания или капель.

4. Применение по любому из пп.1-3, где указанная композиция предназначена для лечения риновирусной инфекции у человека, представляющего собой пациента с высоким риском, выбранного из группы, состоящей из больного бронхиальной астмой, человека, страдающего от аллергии, и человека, страдающего от воспалительного заболевания.

5. Применение йота-каррагинана в эффективном антивирусном количестве в качестве активного антивирусного ингредиента в фармацевтической композиции для профилактики или терапевтического лечения риновирусной инфекции.

6. Фармацевтическая композиция для профилактики или терапевтического лечения риновирусной инфекции, содержащая в эффективном антивирусном количестве в качестве активного антивирусного компонента йота-каррагинан.

7. Композиция по п.6, которая пригодна для местного применения и содержит йота-каррагинан в количестве от 0,01 до 20% (мас./об).

8. Композиция по п.7, которая пригодна для местного применения и содержит йота-каррагинан в количестве от 0,1 до 10% (мас./об).

9. Композиция по п.8, которая пригодна для местного применения и содержит йота-каррагинан в количестве от 0,5 до 5% (мас./об) композиции.

10. Композиция по любому из пп.6-9, дополнительно содержащая по меньшей мере один другой тип каррагинана, например каппа-каррагинан и лямбда-каррагинан.

11. Композиция по любому из пп.6-10, где композиция содержит не менее 50% (мас./мас.) йотакаррагинана по отношению к общей массе каррагинанов, присутствующих в композиции.

12. Композиция по п.11, где композиция содержит не менее 80% (мас./мас.) йота-каррагинана по отношению к общей массе каррагинанов, присутствующих в композиции.

13. Композиция по п.12, где композиция содержит не менее 95% (мас./мас.) йота-каррагинана по отношению к общей массе каррагинанов, присутствующих в композиции.

14. Композиция по любому из пп.6-13, дополнительно содержащая по меньшей мере один фармацевтически активный, антивирусный компонент.

15. Композиция по любому из пп.6-14, которая нанесена на твердую поверхность предмета гигиены или санитарии, в частности гигиенических или санитарных перчаток, ткани или бумаги, особенно ткани или бумаги для ухода за носовой полостью и носовых платков.

16. Композиция по любому из пп.6-15, дополнительно содержащая по меньшей мере еще одно фармацевтически активное соединение, предпочтительно стероид или антигистаминный препарат.

17. Твердый предмет гигиены или санитарии, покрытый или пропитанный антивирусной композицией по любому из пп.6-16.

18. Твердый предмет гигиены или санитарии по п.17, который выбран из группы, состоящей из перчаток, гигиенических тканей, гигиенической бумаги, предметов гигиены лица и предметов санитарии лица, применяемых в области рта и/или носовой полости, в частности ткани или бумаги для ухода за носовой полостью и носовых платков.