EA014434B1

EA014434B1 - Фармацевтическая композиция с иммунодепрессивным и противоопухолевым действием, способ ее получения

Info

Publication number: EA014434B1
Application number: EA200801885A
Authority: EA
Inventors: Константин Валентинович ГАЙДУЛЬ
Original assignee: Лимонова, Анастасия Викторовна
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2010-12-30
Also published as: EA200801885A1

Abstract

Изобретение относится к области медицины, конкретно, к созданию новой фармацевтической композиции и способу ее получения. Фармацевтическая композиция, обладающая иммунодепрессивным и противоопухолевым действием, содержит эффективное количество трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты и вспомогательные вещества (крахмал картофельный, лактозу, магний стеариновокислый и метилцеллюлозу). Способ получения фармацевтической композиции включает смешение трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты с лактозой, крахмалом картофельным и увлажнение полученной смеси раствором связующего (2% раствор метилцеллюлозы), влажное гранулирование, сушку и сухое гранулирование. Композиция выполнена в виде капсул для применения внутрь, малотоксична, имеет высокую биодоступность.

Description

Изобретение относится к области медицины, конкретно к созданию фармацевтической композиции, обладающей иммунодепрессивным и противоопухолевым действием, содержащей в качестве активного вещества синтетическое химическое соединение - трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль (1бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты ( далее - А).

Известно, что А, являясь биологически активным веществом с иммунодепрессивными и противоопухолевыми свойствами, может быть использовано в медицине и фармакологии для создания лекарственных препаратов [1, 2].

Фармацевтические композиции и готовые лекарственные формы, полученные на основе использования А, в литературе не описаны.

Известен синтетический иммунодепрессант азатиоприн, используемый в современной медицинской практике в виде таблеток по 0,05 г [3, 4].

Данный препарат вызывает у пациентов нежелательные побочные реакции - тошноту, рвоту, потерю аппетита, аллергические состояния, токсический гепатит и др. Он противопоказан при выраженном угнетении гемопоэза, лейкопении, тяжелых заболеваниях печени, беременности.

Задачей настоящего изобретения является расширения номенклатуры синтетических лекарственных препаратов, обладающих иммунодепрессивным и противоопухолевым действием, а также отличающихся хорошей переносимостью и минимумом побочных эффектов, предложена новая фармацевтическая композиция.

Задачей изобретения является создание фармацевтической композиции, обладающей иммунодепрессивной и противоопухолевой активностью, имеющей оптимальную биодоступность и эффективность, содержащей в качестве действующего вещества трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль (1бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты, а также разработка способа ее получения.

Решение поставленной задачи достигается тем, что предлагаемая фармацевтическая композиция содержит в качестве действующего вещества трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль (1-бензилиндолил3-тио)уксусной кислоты и опытно подобранные вспомогательные вещества (разрешенные к применению в фармацевтической промышленности).

Фармацевтическая композиция (готовая лекарственная форма) представляет собой твёрдую желатиновую капсулу, в которой содержится действующее вещество А в терапевтически эффективной дозе 0,1 г, а также вспомогательные вещества: крахмал картофельный - 0,05 г, лактоза - 0,0963 г, магний стеариновокислый - 0,0025 г и метилцеллюлоза - 0,0012 г (всего 0,250 г).

Фармацевтическая композиция и готовые лекарственные формы, полученные на основе использования А ранее в литературе не описаны.

Заявленные соотношения компонентов обеспечивают необходимые технологические свойства гранулированной массы для заполнения капсул и фармакопейное качество готовой лекарственной формы.

Предложен также способ получения композиции, включающий смешение трис-(2гидроксиэтил)аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты с лактозой и крахмалом картофельным, увлажнение полученной смеси раствором связующего вещества (водный раствор метилцеллюлозы), влажное гранулирование, сушку и сухое гранулирование.

В связи с тем, что субстанция действующего вещества не обладает технологическими свойствами, необходимыми для получения гранулированной массы (отсутствие сыпучести, большой насыпной вес, электростатичность), состав массы получали методом влажной грануляции. Использование метода прямого смешивания А со вспомогательными веществами положительных результатов не даёт, так как у полученной массы отсутствует сыпучесть, и она имеет большой насыпной вес, что препятствует наполнению капсул необходимым количеством активного вещества.

Использование указанных вспомогательных веществ и их экспериментально подобранные соотношения позволили получить массу с хорошей сыпучестью для заполнения капсул. Капсулы обладают необходимой распадаемостью, оптимальным высвобождением действующего вещества, стабильны при хранении.

Пример 1.

Способ получения фармацевтической композиции (состав, мас.%: соединение А - 40; крахмал картофельный - 20; лактоза - 38,5; магний стеариновокислый - 1,0; метилцеллюлоза - 0,5).

В смеситель загружают 50,0 г крахмала картофельного, 96,25 г лактозы и 100 г трис-(2гидроксиэтил)аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты; массу перемешивают до однородного состояния. Затем в смеситель загружают предварительно приготовленный 2% водный раствор метилцеллюлозы в количестве 62,5 мл, перемешивают, подвергают влажному гранулированию на грануляторе и передают на сушку до остаточной влажности (1±0,5%). Сухое гранулирование проводят вручную на металлическом сите, затем гранулят опудривают магнием стеариновокислым - 2,5 г. Получают 247 г гранулированной массы (выход 98,5%), которой заполняют твёрдые желатиновые капсулы.

Распадаемость: не более 20 мин.

Растворение: не менее 80% за 30 мин.

Пример 2. Изучение общетоксических свойств фармацевтической композиции

Для изучения острой токсичности использовались нелинейные крысы обоего пола.

- 1 014434

Содержимое капсул растворяли в дистиллированной воде и вводили животным внутрижелудочно с помощью зонда в дозах 500, 1000, 2000, 3000 и 5000 мг/кг. В каждой группе было по 6 крыс. За животными наблюдали в течение двух недель. Изучали гибель крыс (ЬИ₅₀) и клиническую картину отравления. Установлено, что по показаниям острой токсичности композиция, содержащая А и вспомогательные вещества, относится к малотоксичным препаратам.

Для изучения хронической токсичности использовались кролики обоего пола, которым в течение 6 месяцев внутрижелудочно вводились капсулы, содержащие А и вспомогательные вещества (суточные дозы композиции составляли 40 и 80 мг/кг, что превышает предполагаемую терапевтическую дозу для человека в несколько раз). В каждой группе было по 10 животных. Установлено, что композиция (готовая лекарственная форма) не оказывает токсического влияния на организм экспериментальных животных: не изменялось поведение, внешний вид, масса тела, ректальная температура. Отдельно наблюдаемые колебания биохимических показателей не были связаны с токсическим действием композиции и находились в пределах физиологической нормы. Не выявлено существенных изменений гематологических показателей, свидетельствующих о нарушениях в лейкоэритроцитарном составе крови.

При патоморфологическом изучении тканей внутренних органов не установлено патологических изменений, связанных с токсическим действием препарата.

Внутрижелудочное шестимесячное введение кроликам капсул (содержащих композицию) не оказывает местного раздражающего действия на область желудочно-кишечного тракта.

Пример 3. Определение биодоступности композиции.

В опытах на кроликах определяли биодоступность композиции, содержащей А и вспомогательные вещества.

Для определения абсолютной биодоступности кроликам внутрь вводили по одной капсуле композиции. Определено содержание действующего вещества в плазме крови животных (метод ВЭЖХ), рассчитаны фармакокинетические параметры, характеризующие скорость и степень всасывания действующего вещества, его элиминацию, определена абсолютная биодоступность составов капсул.

Показано, что после назначения внутрь композиции действующее вещество А хорошо высвобождается из капсул, быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта. Действующее вещество А длительно находится в крови (24 ч) и медленно выводится из сосудистого русла. Абсолютная биодоступность для композиции составляет 0,71.

Пример 4. Изучение специфической фармакологической (иммунодепрессивной и противоопухолевой) активности композиции.

Методы исследования

Животные.

В работе использовали здоровых половозрелых животных - мышей линии СВА, ΌΒΑ/2, С57ВЬ/6, мышей гибридов (С57ВЬ/6хЭВА/2)Р1 (Β6Ό2Ρ1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 1820 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышает ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста получены одновременно из одного питомника (Рассвет, г. Томск).

До и в период экспериментов контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях - стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе.

Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).

Опыты проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных (Страсбург, 1986) и одобренными комитетом по биомедицинской этике НИИ клинической иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск). Исследование фармацевтической композиции проводили в несколько серий опытов, соответственно каждая серия опытов имела свой контроль.

Определение количества 1дМ антителообразующих клеток ΐη νίνο

Фармацевтическую композицию (содержимое капсул, растворенное в культуральной среде ΚΡΜΙ 1640) вводили мышам внутрижелудочно в дозе 25 мг/кг (что соответствует дозе 10 мг/кг чистой субстанции А) в объеме 0,5 мл ежедневно один раз в сутки в день иммунизации и в последующие 3 дня (индуктивная/продуктивная фазы формирования гуморального иммунного ответа). Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (культуральная среда ΚΡΜΙ 1640). Животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 10 /мышь однократно. Количество 1дМ АОК в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа (5-е сутки после иммунизации) по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом [5]. Результаты выражали в абсолютном количестве 1дМ АОК в селезенке. В каждой исследуемой группе было по 10 животных.

Модель люпус-подобного иммунокомплексного гломерулонефрита у мышей осуществлялась путём переноса самкам Β6Ό2Ε1 лимфоидных клеток родительской линии ΌΒΑ/2 [6]. Вводили клетки лимфатических узлов, тимуса и селезёнки в соотношении 1:3:6 (соответственно по 5х10⁶ клеток лимфатических узлов, 15х10⁶ клеток тимуса, 30х10⁶ клеток селезёнки), выделенных ех 1етрого, в стерильной среде ΚΡΜΙ-1640. Каждая мышь-реципиент получала по 50х10⁶ клеток путём внутривенной инъекции в хво

- 2 014434 стовую вену в объёме 0,5 мл среды двукратно с интервалом в пять дней. Для контроля использовались интактные животные того же генотипа, пола, возраста, что и в опыте. При этом у мышей-реципиентов к 3-му месяцу развивается люпус-подобное поражение почек аутоиммунного генеза.

Поражение почек тестировали по уровню белка в моче. Содержание белка в моче определяли калориметрически с красителем Киш8а1 ЬгШап! Ыие (ЬоЬа Ретсйет1е) с помощью ТйеПес МиШзкап, длина волны λ 570 пт. Реактив готовили следующим образом: 10 мг Кумасси растворяли в 5 мл С₂Н₅ОН. После полного растворения красителя добавляли 11,2 мл 70% Н₃РО₄. Общий объём доводили до 100 мл, фильтровали. К 5 мкл мочи, разведённой в 5 раз в ЗФР, добавляли 150 мкл красителя Кумасси. Калибровочную кривую строили по ВЗЛ (100-1000 мкг/мл).

Модель острой РТПХ (реакция трансплантат против хозяина) осуществляли путём внутривенного переноса самкам Β6Ό2Ρ1 100х10⁶ клеток селезенки родительской линии С57ВЬ/6 (С57В1 /6^В6И2Р1). Выраженность острой РТПХ оценивали по количеству живых мышей через 21 день и через 28 дней после индукции реакции.

Для определения противоопухолевых свойств композиции использовалась модель метастазирования клеток гепатомы Г27 в легкие у мышей.

Результаты исследования

1. Изучение иммунодепрессивных свойств композиции в модели первичного гуморального иммунного ответа.

Изучали влияние действующего вещества А и фармацевтической композиции на индуктивную/продуктивную фазы первичного гуморального иммунного ответа: содержимое капсул в дозе 25 мг/кг ( и вещество А в дозе 10 мг/кг) вводили мышам одновременно с антигеном и далее в течение 3-х суток ежедневно. Проведено несколько серий опытов. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1. Влияние А и композиции на первичный гуморальный иммунный ответ у мышей Β6Ό2Ρ1

Группы животных	1§М АОК/селезенку
Контроль	22484
А	14521 (-36%)*
Композиция	15133 (-33%)*

* процент подавления

Таким образом, полученные результаты говорят о том, что композиция отличается выраженным достоверным иммунодепрессивным (подавляющим) эффектом в отношении формирования гуморального иммунного ответа, сравнимым с чистой субстанцией (при одинаковой дозе содержания действующего вещества).

2. Изучение иммунодепрессивных свойств композиции в модели острой РТПХ.

Мышам-реципиентам Β6Ό2Ρ1 в день переноса клеток селезенки от родителя С57В1/6 вводили внутрижелудочно композицию в дозе 25 мг/кг (в дозе 10 мг/кг действующего вещества) и далее ежедневно в течение 12 суток. Учет количества живых мышей проводили на 21 и 28 день от момента индукции РТПХ. Данные представлены в табл. 2.

Таблица 2. Влияние композиции на развитие острой РТПХ

Группы животных

РТПХ________

РТПХ+А *

день

5/17*

11/16* день 4/17 10/16 в числителе - количество живых мышей, в знаменателе - количество мышей в опыте.

Как видно из представленных в табл. 2 данных, композиция существенно подавляет развитие острой РТПХ и повышает выживаемость животных более чем в 2 раза.

3. Изучение иммунодепрессивных свойств композиции в модели аутоиммунного заболевания.

Мышам с иммунокомплексным гломерулонефритом ежедневно вводили внутрижелудочно композицию в дозе 25 мг/кг (в дозе 10 мг/кг действующего вещества), курс составил 13 введений. Контрольным мышам в таком же режиме вводили азатиоприн (в дозе 10 мг/кг действующего вещества). Определяли уровень белка в моче до введения препаратов, через 7 дней от начала введения и по окончании курса. Данные представлены в табл. 3 и 4.

- 3 014434

Таблица 3. Влияние композиции на уровень белка в моче у мышей с гломерулонефритом

Фармацевтическая композиция
Белок в моче (мг/мл)
до лечения	8 день от начала лечения	19 день от начала лечения
1	2	3
5.3	4.8	4.2
6.6 1 5.2 4.1 5.8 6.0 < л	5.9 2 2.5 3.8 5.8 5.2 с о α.ζ.	4.5 3 2.9 4.0 3.1 3.1 Л £
6.7	6.1	5.8
3.5	1.5	3.0
3.6	3.2	3.3
М*=5.3	М*=4.4	М*=3.7

- среднее значение

Таблица 4. Влияние азатиоприна на уровень белка в моче у мышей с гломерулонефритом

Азатиоприн
	Белок в моче (мг/мл)
до лечения	8 день от начала лечения	19 день от начала лечения
4.4	3.8	4.0
5.0	4.5	4.4
5.6	4.5	4.3
5.8	4.7	3.3
М*=5.2	М*=4.4	М*=4.0

* - среднее значение

Как видно из данных табл. 3 и 4, композиция оказывает иммунодепрессивный эффект у мышей с иммунокомплексным гломерулонефритом сравнимый с известным лекарственным препаратом азатио прином.

4. Изучение противоопухолевых свойств композиции

Мышам линии СВА внутривенно вводили клетки гепатомы Г27 в дозе 100x10 /мл. Учет метастазов в легких проводили на 15 день после перевивки опухоли. Композицию вводили в различных дозах внутрижелудочно (14 введений по одному разу в день). Результаты представлены в табл. 5.

- 4 014434

Таблица 5. Влияние композиции на процесс метастазирования клеток гепатомы Г27 в легкие у мышей СВА

Группы	М18*	Частота мета-стазирования Количествово мышей с метастазами/общее количество мышей	% ингибиции
Контроль	5,4	4/5
Композиция 25мг/кг	1,6	3/5	в 3,4 раза
50мг/кг	2,6	3/5	в 2,0 раза

М18*- среднее число метастазов в легких

Как видно из данных табл. 5, композиция эффективно (достоверно) ингибирует процесс метастазирования клеток опухоли (гепатомы Г27) в легкие у мышей.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что разработана новая фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего вещества эффективное количество трис-(2гидроксиэтил)аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты. Композиция малотоксична и имеет достаточно высокую абсолютную биодоступность (0,71). Композиция может быть выполнена в виде капсул. Капсулы обладают необходимой распадаемостью и высвобождением действующего вещества, стабильны при хранении. Срок хранения 2 года.

Разработан также способ получения композиции, который может быть реализован в промышленности.

В опытах на мышах изучены иммунодепрессивные и противоопухолевые свойства композиции. Показано, что она проявляет выраженный иммунодепрессивный эффект у мышей в модели формирования гуморального иммунного ответа, в модели иммунокомплексного гломерулонефрита, а также в модели острой РТПХ. Композиция оказывает противоопухолевое действие, достоверно подавляя процесс метастазирования клеток гепатомы Г27 в легкие у мышей. Известные в настоящее время лекарственные препараты, обладающие подобными свойствами, применяются в медицинской практике для лечения аутоиммунных и опухолевых заболеваний, а также для предотвращения отторжения трансплантированных органов и тканей [3].

Список литературы

1. Пат. 2228178 РФ А61К 31/405, А61Р 37/06, заявл. 23.12.2002, опубл. 10.05.2004.

2. Пат. 2240793 РФ А61К 31/404, А61Р 35/00, заявл. 09.12. 2003, опубл. 27.11.2004.

3. Машковский М.Д. //Лекарственные средства, 14-е издание, 2001, том. 2, стр. 197.

4. Сеей ТехЪоок οί Меб1ете, 18Ш ебйюп, 1988, р. 584 апб р. 1095.

5. Сипптдкат А.1., З/ентЬете А.// 1ттипо1оду, 1968, νοί. 14(4), Р.599-600.

6. К1тига М., ОЫейтапп Е.//С1т. 1ттипо1. Апб 1ттипораФо1., 1987^о1.43, Хо.1.-Р.97-109.

Claims

1. Фармацевтическая композиция, обладающая иммунодепрессивными и противоопухолевыми свойствами, характеризующаяся тем, что она выполнена в виде капсулы и содержит в качестве действующего вещества трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты и вспомогательные вещества в количестве мас.%: действующего вещества - 40 и вспомогательных веществ - 60, при этом в качестве вспомогательных веществ она включает в мас.%: крахмал картофельный - 20, лактозу - 38,5, магний стеариновокислый - 1 и метилцеллюлозу - 0,5.

2. Способ получения фармацевтической композиции по п.1, характеризующийся тем, что действующее вещество трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты смешивают с лактозой и картофельным крахмалом, далее полученную смесь увлажняют раствором связующего (2% раствор метилцеллюлозы), затем последовательно осуществляют влажное гранулирование, сушку и сухое гранулирование, гранулят опудривают магнием стеариновокислым.

α Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2