EA013519B1

EA013519B1 - Противобактериальный или педикулоцидный препарат, содержащий аллицин

Info

Publication number: EA013519B1
Application number: EA200700663A
Authority: EA
Inventors: Норман Джон Беннетт; Питер Дэвид Джослинг
Original assignee: Стоун Айлэнд Холдингз Лтд.
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2002-09-23
Publication date: 2010-06-30
Also published as: WO2003024437A1; AU2002334074B2; GB0122793D0; ZA200403002B; EA200700663A1; EA009169B1; EA200400451A1; EP1435928A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к аллицину. В частности, изобретение относится к противобактериальным и педикулоцидным препаратам, содержащим аллицин или метаболит аллицина и фармацевтически приемлемый эксципиент. Также установлено синергическое действие аллицина в препаратах, содержащих кроме него по меньшей мере одно другое противобактериальное или педикулоцидное средство.

Description

Настоящее изобретение относится к аллицину.

Считается, что аллицин, соединение серы, имеющее формулу

представляет собой основное активное соединение, характеризующееся многочисленными терапевтическими свойствами, которые описаны для чеснока (ЛШит κηΐίνίι.ιιη). В естественном состоянии чеснок содержит не аллицин, а его предшественник-аллиин [(+)8-аллил-Ь-цистеинсульфоксид]. Аллиин превращается в аллицин в результате действия фермента аллиназы или аллиинлиазы, также компонента чеснока. Аллиин и аллиназу получают вместе, когда разрезают или дробят чесночные зубки. Следующее уравнение представляет схему синтеза.

О

Ц | аллинааа/НоО

----—~ аллицин аллиин пировиноградная кисло га О + 2 .,,-1 + 2 ΝΗ.

=4

II О

Однако аллиназа быстро и необратимо инактивируется продуктом ее реакции, аллицином, а также инактивируется в кислых условиях, таких как в желудке. Поэтому на практике выход аллицина из зубков чеснока оказывается значительно ниже теоретического максимума. Действительно, выход обычно составляет порядка 0,3-0,5%.

В АО 97/39115 описан непрерывный способ синтеза аллицина, который включает приготовление колонки, содержащей аллиназу, иммобилизованную на твердом носителе, пропускание раствора аллиина через колонку и получение раствора аллицина в вытекающей жидкости.

Кроме того, авторы настоящей заявки получали аллицин в высушенной распылением форме и приобретали в капсулах от фирмы АШсш 1п1етаИопа1 Ытйеб οί На1Г Ноше, МПИагу Воаб, Вус. Бак! 8и88ех, ΤΝ31 7ΝΥ, ИпПеб Кшдбот, под товарным наименованием аллимакс (АББ1МАХ).

Настоящее изобретение основано на исследованиях новых терапевтических свойств аллицина.

В наиболее общем аспекте настоящее изобретение относится к противобактериальному или педикулоцидному препарату, содержащему аллицин или метаболит аллицина и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Предпочтительно препарат содержит по меньшей мере одно другое противобактериальное или пе дикулоцидное средство.

Более предпочтительно другое средство выбирают из (1) пенициллинов, включая ампициллин, пиперациллин, карбенициллин, амоксициллин, метициллин и пенициллин С; (ίί) аминогликозидаз, включающих в себя гентамицин, тобрамицин, стрептомицин и амикацин; (ш) тетрациклинов; (ίν) макролидов, включая эритромицин; (ν) цефалоспоринов и цефамицинов, включающих в себя цефуроксим, цефамандол и моксалактам; и (νί) фузидиновой кислоты, рифампицина, новобиоцина, ванкомицина, ципрофлоксацина, хлорамфеникола и метронидазола.

Соответственно, метаболит аллицина представляет собой по меньшей мере одно вещество из числа ΌΑΌ8 (диаллилдисульфид), ΌΑΤ8 (диаллилтрисульфид), эдзоена, аллитридия или винилдитиина.

Предпочтительно для перорального введения или введения в виде суппозитория, вагинального суппозитория или назального препарата фармацевтически приемлемый эксципиент представляет собой твердую композицию, на которую присоединяют аллицин или его метаболит. Более предпочтительно, если требуется, твердая композиция содержит средство, увеличивающее объем, такое как лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или дикальцийфосфат; загуститель, такой как смола или крахмал; дезинтегрирующий агент, такой как натрийгликолят крахмала или поперечно-сшитый повидон; способствующее высвобождению средство, такое как стеарат магния; эмульгатор; поверхностно-активное вещество и подсластители, ароматизаторы и красители. Наиболее предпочтительно аллицин связывают способом распылительной сушки, а твердая композиция содержит модифицированный крахмал, такой как мальтодекстрин, аравийская камедь, диоксид кремния и эмульгатор, такой как стеарат магния.

Соответственно, для местного применения фармацевтически приемлемый эксципиент входит в состав крема или мыла. Альтернативно, эксципиент может представлять собой лосьон, мазь, зубную пасту, жидкость для полоскания рта или препарат для волос, такой как шампунь, гель для укладки волос или кондиционер. Если уместно, такие препараты могут включать в себя комбинации следующих веществ: поверхностно-активных веществ, ароматизаторов, красителей, стабилизаторов, антиоксидантов, эмульгаторов, загустителей, восков, глицеринов, жиров, веществ, способствующих суспендированию, дефлокулирующих веществ и антиоксидантов, все из которых могут быть, а могут и не быть гипоаллергенами. Предпочтительно эксципиент-крем содержит белый полутвердый парафин, эмульгатор, такой как стеарат, предпочтительно стеарат магния, глицерин, воду, желтый полутвердый парафин и стабилизатор, такой как цитрат калия. Наиболее предпочтительно эксципиент-крем представляет собой водный крем, предпочтительно водный крем ВР. Соответственно, наполнитель-мыло содержит эфир серной кислоты, кокамид и кокобетаин. Возможно, эксципиент, кроме того, может включать в себя ароматизаторы и кра сители.

- 1 013519

Предпочтительно для перорального, парентерального или местного применения соотношение аллицина к наполнителю является таким соотношением, которое обеспечивает концентрацию аллицина между 1 и 2000 ч./млн, предпочтительно между 50 и 1000 ч./млн, более предпочтительно между 250 и 500 ч./млн.

На фиг. 1 представлены средние размеры зон к аллициновой жидкости относительно клинических изоляторов 81арйу1ососсик аитеик, проявивших резистентность, промежуточную резистентность и чувствительность к мупироцину;

на фиг. 2 - средние размеры зон к аллициновому крему относительно клинических изоляторов 81арйу1ососсик аитеик, проявивших резистентность, промежуточную резистентность и чувствительность к мупироцину;

на фиг. 3 - минимальные ингибиторные (М1С) и минимальные бактерицидные (МВС) концентрации для аллицина (мкг/мл) относительно клинических изоляторов 81арйу1ососсик аитеик;

на фиг. 4 - зоны ингибирования, образованные аллицином в отношении МК8Л103;

на фиг. 5 отражена реакция степени 1 с Оксфордским штаммом и стрептомицином;

на фиг. 6 - реакция степени 2 с Оксфордским штаммом и ванкомицином;

на фиг. 7 - реакция степени 3 МК8Л102.

Приведенные выше и другие аспекты данного изобретения в дальнейшем описывают более подробно со ссылкой на следующие примеры только как показательный пример.

1. Противомикробные свойства одного аллицина.

Определение минимальной ингибиторной концентрации (М1С) методом пробирочного разведения.

Используя асептический способ, 1 мл питательной среды двойной концентрации разливали в каждую из 11 пробирок Кана (Кйап). В первую пробирку, пробирка 1, (обозначенная контроль) добавляли 1 мл стерильной деионизованной воды. Во вторую пробирку, пробирка 2, добавляли 1 мл аллицина (2000 ч./млн в водном растворе), смешивали, используя механический смеситель, и 1 мл переносили из пробирки 2 в пробирку 3. Процесс повторяли последовательно до пробирки 11.

Следовательно, получали серию двойных разведений между 1/2 и 1/1024. 4 мкл культуры, выращенной в течение ночи на питательной среде, использовали для инокулирования каждой пробирки. Содержимое пробирок смешивали и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Наблюдали за помутнением в пробирках и самую низкую концентрацию без помутнения регистрировали как М1С.

Определение минимальной бактерицидной концентрации (МВС).

Из каждой из пробирок М1С-серии, в которых не было обнаружено никакого помутнения, отбирали 100 мкл и рассеивали на поверхности чашки питательного агара, используя стерильный стеклянный шпатель. Чашки инкубировали при 37°С в течение 24 ч и следили за появлением бактериальных колоний. Самую низкую концентрацию, при которой не наблюдали никаких жизнеспособных бактерий, регистрировали как МВС.

Определение М1С с использованием многоточечного инокулятора.

Исходный раствор аллицина 1/4 об./об. готовили добавлением 5 мл аллицина (2000 ч./млн в водном растворе) к 15 мл стерильной воды. Отбирали 10 мл приготовленного раствора, добавляли к 10 мл расплавленного, охлажденного питательного агара двойной концентрации, смешивали и использовали для приготовления чашки с разведением 1/8 об./об. Оставшиеся 10 мл аллицина (1/4) разбавляли 10 мл стерильной воды, чтобы получить раствор с разведением 1/8 об./об. 10 мл 1/8-раствора использовали для приготовления 1 чашки с разведением 1/16 об./об. Серийное разведение продолжали до тех пор, пока не получали чашки с разведением аллицина 1/1024 об./об. Чашки оставляли для уравновешивания и высушивали при 44°С в течение 15 мин.

Тестируемые микроорганизмы (табл. 1) культивировали на питательном бульоне при 37°С в течение 18 ч. 0,3 мкл неразведенных культур засевали на поверхность приготовленных высушенных чашек, используя многоточечный инокулятор. Чашки инкубировали при 37°С в течение 24 ч и наблюдали за ростом. Общее количество жизнеспособных организмов определяли по способу Милеса-Мисра (М11екМ1кга).

- 2 013519

Таблица 1

Гранположительные бактерии	Грамотрицательние бактерии	Дрожжи
Вас111из 8иЬШ1з	Аеголюпаз ЬубгорЬИа	СапсИйа а!Ысапз
ЕпТегососиз	ЕзсЬегхсЫа соИ
£аеса11з	ЫСТС 10418
ЫзТегга	РзецЦотопаз аегидхпоза
топосуТодепез
ΜβΤΐιίάίΙΙίη	5а1топе11а ЕурЫтцг1шп
Еез1з1апТ
ЗТарЬу1ососсиз
аигеиз (ΜΚΞΆ)
31арЬу1ососсиз	ΥθΧΞίηίβ
аигеиз ЫСТС 6571	еп1егосо1И:1са

Минимальные ингибиторные концентрации, установленные методом пробирочного разведения.

Из тестируемых микроорганизмов Ркеиботопак аегидтока оказался наименее чувствительным к аллицину, а СапФба а1Ысапк был наиболее чувствительным (табл. 3). Были рассчитаны величины М1С и МВС для аллицина и представлены в табл. 2. Полученный образец аллицина анализировали при концентрации 2000 ч.

Минимальные ингибиторные концентрации, установленные с помощью многоточечного инокулятора.

М1С определяли, используя многоточечный инокулятор (табл. 3). Величины М1С вычисляли, используя аллицин при концентрации 2000 ч./млн, и результаты хорошо согласовались с результатами, полученными способом пробирочного разведения.

Противомикробную активность аллицина продемонстрировали в отношении одиннадцати микробных видов. Относительные чувствительности микроорганизмов отличались, Ркеиботопак аегидшока оказался наименее чувствительным, а СапФба а1Ысапк был наиболее чувствительным.

Стафилококки являются одним из наиболее важных видов бактерий, вызывающих заболевание у человека. Они являются нормальными обитателями верхних дыхательных путей, кожи, вагины и кишечника. Они являются представителями группы, называемой пиогенными кокками (гноеродными). Стафилококк легко передается от бессимптомных носителей (без признаков заболевания) или от субъектов с заболеванием через кожный контакт, аэрозоли или от неживых объектов. Стафилококк может вызывать патологический процесс почти в каждом органе и ткани организма.

- 3 013519

Таблица 2

М1С и МВС, оп	эеделенные методом пробирочного разведения
5 * аигеиз ИСТС 6571	03/04/01	06/04/01 И	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
М1С	1/128	1/64	1/64	2 3
МВС	1/4	1/8	1/4	375
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	1,43x10	“Σ’ЗхТС	1,43x10“

Е. соИ ΝΟΤΟ 10418	03/04/01	06/04/01'	18/04/01	Концентрация
(частей миллион)	на
М1С	1/128	1/64	1/32	28
МВС	1/32	1/16	1/16	94
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	1, 13x10’	6,75x10“	1,05χ10^1υ

Е. £аесаИз	03/04/01	06/04/01	18/04/01	Концентрация
(частей миллион)	на
М1С	1/16	1/32	1/32	75
МВС	1/4	1/2	1/4	600
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	1,80x10“	1, 63x10“	7,75x10'

А, ЬуМгорЫ1а	03/04/01	06/04/01	18/04/01	Концентрация
(частей миллион)	на
МТС	1/64	1/16	1/256	49
МВС	1/32	1/16	1/32	75
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	2,55x10“	4,25x10“	2,33x10“

З.бурЫтигтит	03/04/01	06/04/01	18/04/01	Концентрация
(частей миллион)	на
МТС	1/64	1/64	1/32	31
МВС	1/16	1/16	1/8	150
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	8,90x10“	6,00x10“	1,80x10“

- 4 013519

Υ. епбегосоШУса	03/04/01	06/04/01	18/04/01	Концентрация
(частей миллион)	на
М1С	1/512	1/64	1/128	15
мвс	1/64	1/64	1/64	28
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	9, 50x10'	1,70х10^э	2,18х10^1и

Ь. шопосухооепез	03/04/01	06/04/01	18/04/01	Концентрация
(частей миллион)	на
М1С	1/64	1/128	1/64	23
мвс	1/8	1/4	1/16	262
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	2,30x10“	7,75x10'	1,15x10^й

МКЗА	03/04/01	06/04/01	Концентрация
(частей миллион)	на
М1С	1/64	1/64	28
мвс	1/4	1/2	675
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	9,00x10'	”9,75x10'

Р.аегидтпоза	03/04/01	06/04/01	18/04/01	Концентрация
	(частей миллион)	на
М1С	1/8	1/8	1/8	225
мвс	1/8	1/4	1/4	375
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	5,25x10“	Г, 25x10⁹	3,75x10“

С. а1Ь1сапз	03/04/01	06/04/01	18/04/01	Концентрация
(частей миллион)	на
М1С	1/512	>1/512	1/512	>3,5
мвс	1/128	1/32	1/64	33
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	3, 40x10“	3,05x10“	3, ООхЮ^1,

- 5 013519

Таблица 3

М1С, определенная с помощью многоточечного инокулятора

3.аигеиз ЫСТС 6571	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
М1С (Серия 1)	<1/40	1/128	1/128	1/128	14
М1С (Серия 2)	<1/40	1/128	1/128	1/128
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	1,43x10“	2,3x10“		1, 43Х10⁸

Е. со11 МСТС 10418	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
МТС (Серия 1)	<1/40	1/128	1/128	1/128	1 л
М1С (Серия 2)	<1/40	1/128	1/128	1/128	1 ч
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	1,13x10^й	6,75x10^е		1,О5х1О¹⁰

Е.£аеса115	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
М1С (Серия 1)	<1/40	1/32	1/32	1/32	56
М1С (Серия 2)	<1/40	1/32	1/32	1/32
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	1,80x10“	1, 63x10^й		7,75х10⁷

А. ИубгорпИа	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
М1С (Серия 1)	<1/40	1/128	1/256	1/128	12
М1С {Серия 2)	<1/40	1/128	1/256	1/128
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	2,55x10^е	4,25x10“		2,33x10°

- 6 013519

8. £ур!т1тиг1ит	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
М1С (Серия 1)	<1/40	1/64	1/64	1/64	28
М1С (Серия 2)	<1/40	1/64	1/64	1/64
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	8, βΟχίδ⁵	6,00x10“		1,80x10’

Υ. епбегосоНбтса	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
МХС (Серия 1)	<1/40	1/128	1/256	1/128	12
М1С (Серия 2)	<1/40	1/128	1/256	1/128
Общее количество жизнеспо собных (КОЕ/мл)	9,50x10'	1,10x10'		2,18хЮ¹⁰

ь. топосубодепез	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
М1С (Серия 1)	<1/40	1/64	1/128	1/64	21
М1С (Серия 2)	<1/40	1/128	1/128	1/64
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	2,30x10®	7,75x10’		1,15x10^й

МЕЗА	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
М1С (Серия 1}	<1/40	1/64	1/128	1/64	26
М1С (Серия 2)	<1/40	1/64	1/64	1/64
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	9,00x10’	9,75x10'		7,50x10'

- 7 013519

Р.аегидхпоза	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
М1С (Серия 1)	1/15	>1/8	1/8	>1/8	>197
М1С (Серия 2)	1/15	>1/8	1/8	>1/8
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	5,25х10⁸	1,25x10’		3,75x10’

С. а1Ысапз	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концентрация (частей на миллион)
М1С (Серия 1)	<1/40	1/256	1/512	1/256	>5
МТС (Серия 2)	<1/40	1/512	1/512	1/256
Общее количество жизнеспособных (КОЕ/мл)	'3,40х10^б	3,05x10°		3,00x10°

В.5иЬт0115	03/04/01	06/04/01	12/04/01	18/04/01	Концептрация (частей на миллион)
М1С (Серия 1)	<1/40	1/256	1/512	1/64	>2
М1С (Серия 2)	<1/40	1/512	1/64	1/64

Метициллин (или его родственные антибиотики) является одним из основных лекарственных средств, используемых для лечения инфекционных заболеваний, вызванных §1арйу1ососси5 аигеик. Метициллинрезистентные 81арйу1ососси5 аигеик (МКБА) являются основной нозокомиальной проблемой (инфекции, вызванные штаммами, приобретенными в больнице). Большинство из названных штаммов являются резистентными к большому разнообразию антибиотиков (включая некоторые из наиболее последних). Некоторые штаммы также являются резистентными к агентам, таким как мупироцин, используемый в настоящее время для борьбы с бессимптомным носительством и образованием колоний в больницах. В некоторых отделениях интенсивной терапии 10-20% пациентов может быть заражено МКБА.

С помощью диффузионных тестов определяют чувствительность изолятов к противомикробным средствам, измеряя зоны ингибирования вокруг совокупного показателя противомикробного средства. Однако названные тесты являются наиболее общими тестами, используемыми для обследования на противомикробную резистентность. Зоны ингибирования не менее 6 мм, которые меньше зон известного контрольного штамма, указывают на бактериальную чувствительность к противомикробному средству. Размеры зон 12 мм или меньше обычно указывают на резистентность, также между указанными уровнями существует промежуточная резистентная группа.

Используя приведенные выше критерии, в следующих примерах при сравнении размеров зон с размерами зон чувствительного к антибиотику контроля клинические изоляты классифицировали как (1) резистентные к мупироцину, (и) промежуточно резистентные и (ίίί) чувствительные к мупироцину.

Бактериальные штаммы.

клинических изолятов и один контрольный штамм 8(ар11 аигеик (Оксфордский штамм, ΝΟΤΟ 6571) тестировали в фазе 1 испытаний. Все штаммы были предоставлены Королевскими госпиталями (Роуа1 Ьоийои и 8ΐ Ваг11ю1оте\у'к) в Лондоне и были идентифицированы как имеющие множественную резистентность к антибиотикам. Впоследствии семнадцать из названных штаммов плюс контроль были отобраны для фазы 2 испытаний.

Фаза 1. Диффузионный анализ.

Первоначально упомянутые испытания проводили, чтобы тестировать эффективность кремов. Однако результаты исследования кремов сравнивали с результатами тестирования чесночной и аллициновой жидкости, используя способы стандартных агаровых лунок. Резистентность к мупироцину подтверждали, используя диффузионный тест со стандартным бумажным диском Штраф Б(й). Чашки с агаром Мюллера-Гинтона (Ми11ег-Нш1оп) засевали (газонный слой) стандартизированной концентрацией 8(ар11. аигеик. Чашки оставляли для высушивания на воздухе. Круглые лунки стандартного размера вырезали в агаровой культуральной среде и заполняли одинаковым количеством (100 мкл) крема или раствора. Противобактериальную активность определяли при измерении зон ингибирования, образовавшихся вокруг каждой лунки.

- 8 013519

Чувствительность к мупироцину.

Оксфордский 81арй. аигеик образовывал зону размером 35 мм. 5 штаммов идентифицировали как полностью чувствительные (размеры зон от 33 до 45 мм), 12 зон показали промежуточную чувствительность (размеры зон между 12 и 23 мм) и 13 штаммов оказались резистентными (никакой зоны ингибирования).

Активность раствора аллицина.

Показано, что водный раствор жидкости аллицина является высокоактивным в отношении всех штаммов 81арй. аигеик, тестированных вплоть до уровней 250 ч./млн, (фиг. 1).

Активность аллицинового крема.

Когда составляли обычный водный крем, обнаружили, что аллицин является высокоактивным в отношении всех штаммов при концентрациях 500 ч./млн. Указанные концентрации соответствуют подходящим уровням для применения как местного средства (фиг. 2).

Фаза 2. Минимальные ингибиторные концентрации (М1С) и минимальные бактерицидные концентрации (МВС) для аллицина в отношении §1арйу1ососси8 аигеик.

Тестировали семнадцать клинических изолятов (выбранных из группы штаммов фазы 1) и один контрольный штамм (Оксфордский штамм, ИСТС 6571) 81арй. аигеик. Каждый штамм культивировали в течение ночи при 37°С в бульоне Мюллера-Гинтона (Οχοίά Ь1й. СМ405). Культуры разводили названным бульоном, чтобы получить концентрацию Ьод 7 КОЕ/мл, использовали десятикратную конечную концентрацию.

мл водного раствора аллицина (в концентрации 5000 ч./млн) добавляли к 8 мл бульона МюллераГинтона (бульон концентрировали, чтобы избежать эффекта разведения среды) и вдвое разводили, чтобы получить область концентраций между 1000 ч./млн (мкг/мл) и 1 ч./млн (мкг/мл) плюс 0 ч./млн (мкг/мл) в отрицательном контроле. 1 мл каждой смеси отбирали из каждой среды и добавляли 1 мл бактериального концентрата, достигая конечной концентрации приблизительно Ьод 6 КОЕ/мл.

Названные бульонные культуры инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день бульоны исследовали относительно роста (мутные культуры). Наиболее низкую концентрацию, не показавшую никакого роста (прозрачную), рассматривали как М1С.

Культуру, содержащую М1С и все вышеприведенные концентрации, субкультивировали на чашках с питательным агаром (Охо1й Ь1й, СМ3), чтобы определить МВС. Отбирали 0,1 мл каждой культуры и культивировали. Культуру с наиболее высокой концентрацией, при которой наблюдали рост (мутность) при исследовании М1С, также субкультивировали как позитивный контроль. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С. Наиболее высокую концентрацию, при которой наблюдали рост (видимые бактериальные колонии), рассматривали как МВС.

Для приготовления крема или раствора для клинического применения против §1арйу1ососси8 аигеик важно установить оптимальные концентрации противомикробного средства, которое проявляет активность в отношении тестируемых штаммов. Результаты сопоставлены в табл. 4 ниже.

Исследованный контрольный штамм (Оксфордский 81арй. аигеик) показал М1С 32 мкг/мл и МВС 256 мкг/мл. М1С§ для 17 тестированных клинических изолятов составляли или 16, или 32 мкг/мл, МВС§ составляли или 128, или 256 мкг/мл. Большинство клинических изолятов имели М1С§ 16 мкг/мл и МВС§ 128 мкг/мл, см. табл. 5.

Таблица 5

	МТС 16	МТС 32	ВСЕГО
МВС 128	13	2	15
МВС 256	2	0	2
ВСЕГО	15	2	17

88% клинических изолятов имели МКА 16 мкг/мл и 88% клинических изолятов имели МВС§ 128 мкг/мл, см. фиг. 3. Из 17 тестированных штаммов 3 оказались чувствительными к мупироцину (как показано дисковым диффузионным тестом), 8 проявили промежуточную чувствительность и 6 оказались резистентными. Все 6 резистентных к мупироцину штаммов имели МКА 16 мкг/мл, 4 штамма имели МВС§ 128 мкг/мл и 2 имели МВС§ 256 мкг/мл.

- 9 013519

Таблица 4

ЛПСз (АЛЛИМАКС)

		Разведение (частей	(+>“ рост		(-)- нет роста		(ох)- оксфордский контроль
8(арЬ.1Чо	на миллион)
	1000 500	250	125 62.5 31.25	15.6	7.3	3.7	1.8	0.9	0 §1арЬ.М> КС
825(ох)	<-)(-)(-)«	0 0	006)(-)0(-)	(-Х+)	(+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	(+Х+)	(+Х+)	ох	32
867	0000	00	(-)(-)0(-)0(-)	(-)()	(+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	(+Х+)	(+)(+)	567	16
868	(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	(-)(-)00(-)0	00	(+Х+)	(+Х+)	(+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	868	16
869	(-)(-)()(-)	(-)()	(-)(-)00(-)0	()(·)	(-Х+)	(+)(+)	(+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	869	16
870	(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	(-)(-)(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	()(+)	(+Х+)	(+Х+)	(+Х+)	(+)(+)	870	16
872	(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	(-)(-)(-)(-)(-)(-)	(-)(+)	(+Х+)	(+Х+)	(+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	572	32
873	0 0(-)(-)	(-)(-)	00(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	(-Х+)	(+)(+)	(+Х+)	(+)(+)	(+)(+)	§73	16
874	(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	(-)(-)(-)(-)(-)(-)	00	(-Х+)	(+Х+)	(+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	§74	16
§75	(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	0 00(-)0(-)	(-Х+)	(+Х+)	(+)(+)	(+)(+)	(+Х+)	(+Х+)	§75	32
§76	0000	(-)(-)	(-)(-)(-)(-)(-)(-)	(-)<-)	(+Х+)	(+)(+)	(+)(+)	(+Х+)	(+)(+)	876	16
878	«ИОН	(-)(-)	(-)(-)(-)(-)(-)(-)	00	(-Х+)	(+Х+)	(+)(+)	(+)(+)	(+Х+)	878	16
380	0(-)(-)(-)	00	000(-)(-)(-)	00	(-)(+)	(+Х+)	(+)(+)	(+)(+)	(+)(+)	880	16
§85	0(-)(-)(0	00	(-)(-)0(-)(-)(-)	(-)(-)	(-Х+)	(+Х+)	(+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	885	16
886	(-)()(-)(-)	00	000(-)(-)0	(-Х-)	(-Х+)	(+)(+)	(+Х+)	(+Х+)	(+Х+)	886	16
888	(-)(-)(-)(·)	0 0	(-)00(-)(-)0	(-Х-)	(-)(+)	(+Х+)	(+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	888	16
889	(-)00(-)	0 0	(-)(-)(-)(-)(-)(-)	(-Х-)	(-)(+)	(+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	(+)(+)	§89	16
§90	(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	0(-)00(-)(-)	(-)(-)	(-Х+)	(+)(+)	(+)(+)	(+)(+)	(+)(+)	890	16
891	0 00(-)	0 0	(-)0000(-)	(-)(-)	(+)(+)	. (+Х+)	(+)(+)	(+)(+)	(+Х+)	891	16
		МВСз
	(АЛЛИМАКС)		(+)'	= рост	(-)=	=нет роста

Разведение (частей (ох) -оксфордский контроль

δίαρΕΝ	о 1000 500	на миллион) •250	125 62.5 31.25	15.6	7.3	3.7	1.8	0.9	81арН.Ъ1о 0	мвс
825(ох)	(-)(-)(-)(-)	00	(+)(+)(+)(+)(+)(+)	(+Х+)	(+)(+)	—	—	—	----- 825	250
867	0000	00	(-Х-) (+Х+Х+Х+)	(+Х+)	(+)(+)	—	—	—	----- 267	128
868	0000	(-)(-)	(-)(-) 0(+)(+)(+)	(+Х+)	(+Х+)	—	—	—	----- 868	128
869	(-)(-)(-)(-)	00	00 (-)(+)(+)(+)	(+Х+)	(+Х+)	—	—		----- 869	128
870	(-Х-Х-Х-)	(-)(-)	00 (+Х+)(+)(+)	(+)(+)	(+Х+)	—	—		----- 870	128
872	(-)(-)(-)(-)	00	00 (+)(-)(+)(+)	(+Х+)	(+Х+)	—	—	—	.— 572	128
873	(-)(-)(-)(-)	06)	(-Х-) (+)(+)(+)(+)	(+)(+)	(+)(+)	—			----- 873	128
874	(-)00(-)	(-)(-)	(-Х-) (+М+Х+Х+)	(+Х+)	(+Х+)	—	—		----- 874	128
575	0000	00	6)0 (+Х-К+Х+)	(+)(+)	(+)(+)	—	—	—	----- 875	128
876	(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	(-)<-) (+Х+Х+Х+)	(+Х+)	(+)(+)	—	—	—	----- 876	128
877	0000	(-)(-)	6)6) (+)(-)(+)(+)	(+Х+)	(+)(+)	-----,	—	—	— 877	128
878	0(-)(-)(-)	(-)(-)	(-)(-) (+Х+Х+Х+)	(+)(+)	(+Х+)		—		----- 878	128
880	000(-)	00	(-Х-) (+Х+Х+Х+)	(+Х+)	(+Х+)	——	—		----- 880	128
885	(-)(-)(-)(-)	00	(-Х-) (+Х+Х+Х+)	(+)(+)	(+)(+)	—	—		----- 585	128
886	()(-)(-)(-)	(-Х-)	(-Х-) (+Х+Х+Х+)	(+)(+)	(+Х+)	—	—	—	—- 886	128
588	<-)(-)(-)(-)	(-Х-)	(-)(-) (+)(+)(+)(+)	(+)(+)	(+)(+)	—	—		—- 888	128
889	(-)(-)(-)(-)	00	(-)(+)(+)(-)(+)(+)	(+)(+)	(+)(+)	—	—		—- 889	256
890	000(-)	00	(-)(+) (+Х+) (+)(+)	(+)(+)	(+Х+)	—	—		..... 890	256
591	(-)(-)(-)(-)	(-)(-)	00 00 (+Х-)	(+)(+)	(+)(+)	—	—		..... 891	128

На основании полученных результатов оказалось очевидным, что активность аллицина в концентрации 500 и 1000 ч./млн соответствовала активности 1 к 10 и 1 к 5 разведениям грубого экстракта чеснока;

88% штаммов показали минимальные ингибиторные концентрации для аллицина 16 мкг/мл и 100% штаммов ингибировались аллицином при концентрации 32 мкг/мл;

88% штаммов показали минимальные бактерицидные концентрации для аллицина 128 мкг/мл и 100% штаммов уничтожались аллицином при концентрации 256 мкг/мл.

Аллицин оказался высокоэффективным в отношении как охарактеризованных, так и диких штаммов МК8А.

Кроме определения минимальной ингибиторной концентрации (М1С) проводили тестирование аллицина в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных бактериальных видов относительно селекции девяти бактериальных изолятов при более близких разведениях водных растворов аллицина (аллимакс). Результаты представлены в табл. 6. Использовали изоляты:

грамположительные:

81арйу1ососсик аитеик: Оксфордский контрольный штамм (ОХ) и 2 лаб. изолята МК8А (102 & 103) (кокки)

81ар11у1ососси5 ер1бетт1б1к (кокки)

81арйу1ососсик ругодепек (кокки)

8еттаба тегсексепк (палочки) грамотрицательные:

8а1топе11а (урЫтипит (палочки)

Ркеиботопак аешдтока (палочки)

ЕксйебсЫа сой (палочки)

Оксфордскую изочувствительную агаровую среду стерилизовали и охлаждали приблизительно до 45-50°С перед применением. Получали серийные разведения водного аллицина (аллимакс) в концентрации 5000 ч./млн в изочувствительном бульоне.

- 10 013519

Таблица 6

Грамположительные 81арбу1ососси5 аигеик (ОХ, 102 и 103) и 81арбу1ососси5

- 11 013519

мл из каждого разведения аллицина добавляли в каждую стерильную чашку Петри (каждый тест проводили в двух копиях). 18 мл охлажденной среды добавляли к аллицину, смешивали и оставляли для охлаждения и затвердевания. Бактериальные образцы готовили как посевной материал 10⁶ КОЕ/мл и 0,02 мл засевали на каждую чашку, используя многоточечный инокулятор. В каждую серию опытов включали отрицательные контроли.

Проведенные исследования выявили ряд М1Ск среди выбранных образцов грамположительных и грамотрицательных видов бактерий, наиболее чувствительными видами были стафилококки, характеризующиеся М1С между 15 и 41 ч./млн.

Наиболее резистентным грамотрицательным видом оказался Ркеиботопак аетидшока (М1С 378 ч./млн) и наиболее резистентным грамположительным видом оказалась палочка 8егга(1а тагсексепк (М1С 170 ч./млн).

Жидкие экстракты аллицина были высокоактивными в отношении клинических изолятов 81арйу1ососсик ашеик с множественной резистентностью к антибиотикам, включая те штаммы, которые были идентифицированы как резистентные к мупироцину.

Крем-препараты показали подходящие уровни активности при концентрации 500 мкг/мл, что подтверждает применение аллицинового крема как местного средства против мупироцинрезистентных и мупироцинчувствительных штаммов §1арйу1ососси8 аигеик с множественной резистентностью к антибиотикам.

Следуя аналогичной методике, подобные испытания проводили также для сравнения эффективности аллицина с эффективностью стрептомицина в отношении шести штаммов ΜΌΚ.ΤΒ (множественная лекарственная резистентность туберкулеза). Результаты представлены в табл. 7.

- 12 013519

Таблица 7

Штамм МЦКТВ	Колониеобраэукяцие единицы
	Контроль	Стрептомицин	Аллицин
3221	100	200	0
31222	147	1	0
3632	37	29	0
37018	300	9	0
37010	350	6	0
37007	65	2	0

В присутствии противомикробного средства любой рост микобактерий туберкулеза оказывается очень важным. Из полученных результатов понятно, что, в то время как отмечали рост на всех скошенных агарах, на которых штаммы обрабатывали стрептомицином, не обнаруживали никакого роста ни на одном из скошенных агаров, обработанных аллицином (водный раствор при концентрации 500 ч./млн).

Кроме того, затем проводили исследования инсектицидных свойств аллицина, в частности его педикулоцидной активности в отношении головных вшей (Реб1си1и8 йитапик). Контроль заражения головными вшами по традиции осуществляли, используя обычные инсектициды с некоторым избытком. Однако в некоторых частях мира появились штаммы головных вшей, которые устойчивы к одному или более из названных инсектицидов.

В испытании взрослых самцов и самок вшей использовали приблизительно в равном количестве. Вшей кормили в начале испытания и оставляли минимально на четыре часа для акклиматизации, время, в течение которого они могли выделить избыток воды, поглощенной с насасываемой ими порцией крови. В экспериментальные серии включали по двадцать вшей и помещали их на квадраты открытой сетчатой нейлоновой ткани (тюль) как на субстрат. Каждую серию размещали на маркированной 30-мм пластиковой чашке Петри. Аликвоту приблизительно 5-10 мл аллицина в концентрации 5000 ч./млн в водном растворе наливали на основание чистой 30-мм пластиковой чашки Петри. Ткань, несущую вшей, погружали в жидкость на 10 с, во время которых ткань вращали по крайней мере дважды, чтобы обеспечить удаление пузырьков воздуха. После удаления из жидкости ткань и насекомых слегка промокали, чтобы устранить избыток жидкости, и возвращали в маркированную чашку Петри. Процедуру повторяли на других подобных квадратах ткани в той серии.

Тканевые квадраты, несущие вшей, инкубировали при нормальных условиях содержания (30°±2°, Саиб 50%±15% повышенная влажность) в течение ночи. В конце периода экспозиции, насекомых и ткань промывали, используя мягкий косметический шампунь (Воой® Егес.|иеп1 \Уаз11 8йатроо), разведенный одна часть шампуня к четырнадцать частям воды, после чего их три раза промывали, используя 250 мл теплой водопроводной воды (34°С), которую наливали через или на тканевые квадраты. Затем тканевые квадраты промокали досуха, используя медицинскую ткань для вытирания, и инкубировали при нормальных условиях содержания в чистой пластиковой чашке Петри соответствующего размера в течение одного часа. Обеспечивали порцией крови. Вшей оставляли на четыре часа для восстановления, прежде чем еще раз обрабатывали, как описано выше. Результаты трех испытаний представлены в табл. 8 в сравнении с контрольными сериями, которые обрабатывали 60% изопропиловым спиртом через 24 ч и 48 ч.

Таблица 8

Тест	Мертвые	Живые	Болезненные	Смертность
День 1
А1	5	11	7	52,2%
А2	9	7	5	66,7%
АЗ	7	9	4	55,0%
Всего	21	27	16	57,8%

С1	2	18	0	11,0%

День 2
А1	22	1	1	95,8%
А2	19	0	2	100%
АЗ	15	0	5	100%
Всего	56	1	8	98,4%

С1	4	14	0	28,6%

Как можно видеть, аллицин показывает приемлемую эффективность в течение ночи при общей смертности 57,8% по сравнению со смертностью контроля 11%. Однако после порции насасываемой крови и второй обработки эффективность аллицина становится 98,4% против контроля 28,6%.

2. Синергическое действие аллицина в комбинации с другими противомикробными средствами.

Для оценки активности аллицина в отношении контрольных штаммов и клинических изолятов 8!арйу1ососси8 аигеик и ЕзсйепсЫа сой обследовали большое разнообразие антибиотиков, используя способы диффузии в чашках, относительно резистентности к антибиотикам и чувствительности к антибио

- 13 013519 тикам бактерий.

Использовали оксфордскую изочувствительную среду (Ι8Α, СМ471, Θχοίά, Ва81ид81оке, ИК). Названная среда рекомендована для тестирования противомикробной чувствительности Британским обществом противомикробной химиотерапии (В8АС). Использовали способы, предписанные В8АС (В8АС, 2001). Для каждой серии опытов проводили предварительные тесты, чтобы оптимизировать посевной материал, концентрацию аллицина и расстояние на чашке между тестируемыми агентами.

Бактериальные штаммы: один чувствительный к антибиотику контроль (81ар11. аитеиз, ЫСТС 6571), 2 метициллинрезистентных 81арй. аитеиз (МК.8А) и Е. сой, К12.

Антибиотики: тестировали 22 антибиотика; см. табл. 9.

Процедура.

Для каждого теста (проводили в трех копиях).

1. Приготовить культуру, выращенную в течение ночи.

2. Приготовить посевной материал, чтобы получить плотный, но не сплошной рост на стандартизированных 25-мл чашках агара. Высушить поверхность чашки.

3. Применение 6-мм стерильного пробкового бура, чтобы вырезать лунки в чашке, добавить 150 мкл аллицина.

4. Добавить антибиотический диск.

5. Инокулировать в течение ночи при 37°С.

6. Оценить синергизм (слияние зон), антагонизм (снижение в зоне ингибирования) или отсутствие эффекта. Получить большое количество результатов, чтобы выбрать те комбинации, которые следует тестировать в фазе 2 испытаний.

Результаты.

Первую серию экспериментов проводили, чтобы определить, оказывает ли изменение концентрации аллицина какое-либо влияние на возможный синергизм. В табл. 10 показано взаимодействие 8 антибиотиков с аллицином при двух концентрациях (500 250 ч./млн). Размеры зон даны в миллиметрах.

81арй. аитеиз: размеры зон для концентрации аллицина 250 ч./млн были между 5 и 9 мм и были меньше, чем размеры зон для 500 ч./млн аллицина.

Е. сой: размеры зон для концентрации аллицина 250 ч./млн составляли между 1 и 12 мм и были меньше, чем размеры зон для 500 ч./млн аллицина. Вообще размеры зон были меньше, чем размеры, полученные с 81арй. аитеиз.

Концентрацию 500 ч./млн выбрали для дальнейших испытаний, чтобы область взаимодействия между аллицином и антибиотиком была больше. Также не выявили никаких неубедительных результатов при использовании концентрации 500 ч./млн, но которые получали при использовании концентрации 250 ч./млн (табл. 10 - результаты отмечены ?).

Результаты, представленные в табл. 9, демонстрируют комбинации антибиотиков, выбранные для дальнейших исследований. Выбрали двенадцать комбинаций, все из которых имели оценку степени реакции больше 5. Комбинации с оценками выше 5, которые не были выбраны, содержали антибиотики, относящиеся к уже исследованной группе (например, группе аминогликозидаз). Гентамицин и тобрамицин, оба, были выбраны вследствие их обычного употребления при лечении пациентов и их высоких оценок степени.

В табл. 9 представлены результаты исследования сравнительной синергической активности 22 антибиотиков с аллицином в концентрации 500 ч./млн. Оценки степени реакции связывали с возможной степенью синергизма, который определяли, используя тесты диффузии в агаре.

Таблица 9

Антибиотик	Оксфорд	ΜΚ3Α103	МНЗА102	Е соН	Оцен -ка	Тест	Замечая.
Тетрациклин	3	3	3	2	11	да
Гентамицин	3	3	3	1	10	да	аминогликозидаза
Фузидиновая кислота	3	3	3	0	9	да
Рифампицин	3	3	3	0	9	да
Тобрамицин	3	2	3	1	9	да	аминогликозидаза
Новобиоцин	3	3	3	0	9	да
Амикацин	3	3	2	0	8		аминогликозидаза
Ванкомицин	2	3	2	0	7	да
Ципрофлоксацин	3	3	0	0	6	Да
Эритромицин	3	0	3	0	6	да
Цефуроксим	3	2	0	0	5	да
Моксолактам	3	2	0	0	5	да
Пиперациллин	3	1	0	1	5	да
Стрептомицин	1	1	2	0	4		аминогликозидаза
Ампициллин	3	1	0	0	4
Карбенициллин	3	1	0	0	4
Цефамандол	3	1	0	0	4
Хлорамфеникол	3	1	0	0	4
Амоксициллин	3	0	0	0	3
Метициллин	3	0	0	0	3
Пенициллин 6	3	0	0	0	3
Метронидазол	0	0	0	0	0

- 14 013519

Хотя чувствительный к антибиотикам контрольный штамм (Оксфорд) показал наибольшее число высоких оценок степени реакции, штаммы МК8А также показали хороший потенциал и отмечен возможный синергизм тетрациклина с Е. сой. На фиг. 5-9 продемонстрировано, как различные синергические взаимодействия распределились по степени.

Данные испытания четко продемонстрировали потенциал противомикробного синергического действия аллицина и большого разнообразия антибиотиков в отношении 81арйу1ососси8 аитеик, включая МК8А.

СЫогагпр-С

Егу1Ь-Е

Рцб ас]8РА

Таблица 10

МеНьМе

микр-гюрганнзм	чашка	С	А/ Я	Е	А1 К	РА	А! К	Ме	ΑΙ Й
ОхТогЦ 8а	250	31	Зв N	26	38?	35	39 8	27	38 5
	500	25	45?	26	48 N	33	48 8	30	48 5
МКЗА102	250	22	40 N	24	37?	32	37 5	0	37 N
	500	26	48 5	25	43?	32	45 3	10	45?
1ЛН8А103	250	25	40 5	10	42 N	33	40 3	15	40 N
	500	25	47 8	10	48 N	37	47 3	10	47 N
В соП К12	250	2Р	23 N	а	23 N	14	23 N	17	14 N
	500	25	26 N	25	26 N	25	26 N	25	26 N

Реп ©-Р©

Τβΐт

МоуоЬНо '

микроорганизм	чашка	Но	А! К	РО	А/ К	81	м К	Т	А/ Я
ОхТог<1 За	250	29	38 3	32	38 8	20	39 N	37	33 N
	500	33	45 3	36	45 3	20	45 N	38	45 8
МПЗ А102	250	26	40?	0	37«	15	36 N	29	36 3
	500	31	45 8	0	43 N	16	42 N	30	45 8
МНЗА103	250	23	403	0	40 N	18	40 3	30	30?
	500	30	45 3	0	44 N	16	46 3	32	46 5
Е соН К12	250	20	14 N	20	14 N	17	23 N	23	1В N
	500	25	28 N	27	26 N	18	24 N	25	26 N

СЫоташр - хлорамфеникол; Егу111 - эритромицин; Еик асИ - фузидиновая кислота; Ме111 - метициллин; Νονοό - новобиоцин; Реп О - пенициллин О; 8(гер - стрептомицин; Те! - тетрациклин.

К = результат, А1 = размер зоны аллицина.

Результаты - 8 = синергизм, N = нет синергизма, ? = неубедительные данные, А = возможный антагонизм.

Claims

1. Противобактериальный или педикулоцидный препарат, содержащий аллицин или метаболит аллицина и фармацевтически приемлемый эксципиент и дополнительно содержащий по крайней мере одно другое противобактериальное или педикулоцидное средство.

2. Препарат по п.1, в котором другое средство выбрано из (ί) пенициллинов, (ίί) аминогликозидаз, (ш) тетрациклинов, (ίν) макролидов, (ν) цефалоспоринов и цефамицинов и (νί) фузидиновой кислоты, рифампицина, новобиоцина, ванкомицина, ципрофлоксацина, хлорамфеникола или метронидазола.

3. Препарат по п.1 или 2, в котором метаболит аллицина выбран из ΌΑΌ8 (диаллилдисульфида), ΌΑΤ8 (диаллилтрисульфида), эдзоена, аллитридия и винилдитиинов.

4. Препарат по любому из пп.1-3, в котором фармацевтически приемлемый эксципиент представляет собой твердую композицию, на которой связан аллицин.

5. Препарат по п.4, в котором твердая композиция содержит модифицированный крахмал, такой как мальтодекстрин, аравийская камедь, диоксид кремния и эмульгатор, такой как стеарат магния.

6. Препарат по любому из пп.1-3, в котором фармацевтически приемлемый эксципиент представляет собой крем или мыло.

- 15 013519

7. Препарат по п.6, в котором эксципиент включает белый полутвердый парафин, эмульгатор, глицерин, воду, желтый полутвердый парафин и стабилизатор.

8. Препарат по п.7, в котором эмульгатор представляет собой стеарат, предпочтительно стеарат магния.

9. Препарат по п.8, в котором эксципиент включает оксисульфат, кокамид и кокобетаин.

10. Препарат по любому из пп.4-9, в котором отношение аллицина к наполнителю является таким, которое обеспечивает концентрацию аллицина от 1 до 2000 ч./млн, предпочтительно от 50 до 1000 ч./млн, более предпочтительно от 250 до 500 ч./млн.