CN113209072A - 二烯丙基三硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌分泌系统制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二烯丙基三硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌分泌系统制剂中的应用。本发明发现二烯丙基三硫醚轻微抑制铜绿假单胞菌PAO1菌株的生长,但能够显著抑制该菌II型和VI型分泌系统中关键基因的表达,抑制该菌分泌系统的功能和毒力因子的分泌。因此二烯丙基三硫醚可应用于制备抑制铜绿假单胞菌分泌系统的制剂中,控制该菌的毒力和致病性。
Description
技术领域:
本发明属于有害微生物防控技术领域,具体涉及二烯丙基三硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌分泌系统制剂中的应用。
背景技术:
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的革兰氏阴性的院内条件致病菌,可引起致死性感染疾病。它广泛存在于自然界、土壤、空气和人的皮肤、肠道、呼吸道以及粘膜等处,可通过多种途径传播。铜绿假单胞菌正常情况下不会感染人体的组织,但是在人体免疫力低下、严重创伤或手术治疗、囊性肺纤维化以及恶性肿瘤化疗、放疗时,极易发生铜绿假单胞菌感染。该菌具有多耐药、易变异、易定植等特点,给临床治疗带来极大的挑战。
细菌的致病性依赖于分泌毒力因子的能力,这些毒力因子可以表达在细胞表面,也可以通过分泌系统到达细胞外基质或者直接进入宿主细胞。铜绿假单胞菌的分泌系统是其重要的致病机制,因此抑制该菌的分泌系统能控制该菌的毒力和致病力。
发明内容:
本发明的目的是提供一种二烯丙基三硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌细菌分泌系统制剂中的应用。
本发明通过实验表明,二烯丙基三硫醚能够抑制铜绿假单胞菌II型和VI型分泌系统中关键基因的转录,从而抑制这两种类型分泌系统的功能和相关毒力因子的分泌。
因此,本发明的目的是提供二烯丙基三硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌细菌分泌系统制剂中的应用。
优选,是二烯丙基三硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌II型和VI型分泌系统制剂中的应用。
优选,所述的铜绿假单胞菌优选为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1。
优选,所述的二烯丙基三硫醚,其在铜绿假单胞菌培养液中的浓度为0.16-5μL/mL。
进一步优选,所述的二烯丙基三硫醚,其在铜绿假单胞菌培养液中的浓度为0.63μL/mL。
本发明的第二个目的是提供一种抑制铜绿假单胞菌细菌分泌系统的制剂,含有二烯丙基三硫醚作为活性成分。
本发明发现二烯丙基三硫醚能够抑制铜绿假单胞菌II型和VI型分泌系统,因此可以用于制备抑制铜绿假单胞菌分泌系统制剂中应用。
附图说明:
图1是二烯丙基三硫醚作用下铜绿假单胞菌PAO1的生长曲线;
图2是二烯丙基三硫醚作用下铜绿假单胞菌PAO1的转录组KEGG富集分析的细菌分泌系统通路图。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1悬液的制备:将指数生长期的铜绿假单胞菌PAO1培养液取样,离心,用PBS缓冲液洗涤一次,重悬于PBS中,并将菌浓度稀释至108CFU/mL,得到铜绿假单胞菌PAO1菌悬液。
1.二烯丙基三硫醚对铜绿假单胞菌生长的影响
分别向试管中加入LB培养基、二烯丙基三硫醚,并接入指数生长期的铜绿假单胞菌PAO1菌悬液,总体积均为10mL,使铜绿假单胞菌PAO1的菌浓度均为106CFU/mL,二烯丙基三硫醚的浓度分别为0(对照)、0.16μl/mL、0.63μl/mL、1.25μl/mL、2.5μl/mL和5.0μl/mL。将几个实验组分别取样加入到自动生长曲线测定仪(Bioscreen C)专用的蜂窝培养板中,每孔加入350μL的培养液,每个实验组三个平行。将蜂窝培养板置于自动生长曲线测定仪中,37℃振荡培养3天,每小时测定一次OD600。以OD600为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制二烯丙基三硫醚作用下PAO1的生长曲线,以此研究二烯丙基三硫醚对PAO1生长的影响。
2.二烯丙基三硫醚对铜绿假单胞菌的细菌分泌系统中关键基因表达量的影响
向50mL无菌LB液体培养基中加入处于对数生长期的铜绿假单胞菌PAO1菌悬液,使菌液终浓度为106CFU/mL。加入二烯丙基三硫醚,使得终浓度为0(对照组三个生物学重复分别命名为A1、A2、A3)和0.63μl/mL(实验组三个生物学重复分别命名为B1、B2、B3);将各组置于37℃、180rpm条件下培养5h;离心并收集菌体,-80℃速冻后备用。
使用Trizol(Thermo公司)的试剂盒提菌体总RNA。提取后用超微量分光光度计(Implen,Munich,德国)检测RNA的纯度。每份RNA样品的A260/A280值应该在1.8~2.0之间。转录组测序在华大基因有限公司(深圳,中国)完成。参考基因组和基因模型注释文件直接从NCBI基因组网站下载。使用bowtie2-2.2.3构建参考基因组索引并将clean reads比对到参考基因组。Rockhopper被用来识别新基因、操纵子和转录起始位点。然后,利用时延神经网络提取转录起始位点上游700个碱基对,进行启动子预测。用DESeq R包(1.18.0)进行组间差异表达分析,通过使用Benjamini和Hochberg的方法控制伪发现率,调整得到的p值。经DESeq鉴定,基因的校正p值<0.05,则为差异表达。《京都基因与基因组百科全书》(KEGG)数据库是一种从分子水平信息了解各种生物系统功能和属性的资源库,特别是指通过基因组测序等高通量实验技术生成的大规模分子数据集。用KOBAS软件进行差异表达基因KEGG通路富集分析。
实验结果:
1.二烯丙基三硫醚轻微抑制铜绿假单胞菌的生长
不同浓度的二烯丙基三硫醚作用下,铜绿假单胞菌PAO1的生长曲线见图1。从图中可以看出,对照组中铜绿假单胞菌的生长曲线包含了生长延滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期。不同浓度梯度的二烯丙基三硫醚暴露下,铜绿假单胞菌的生长曲线与对照组相比,细胞的生长延滞期延长,指数生长期的生长速率降低,稳定期相应的延后。因此,二烯丙基三硫醚轻微抑制铜绿假单胞菌的生长。
2.二烯丙基三硫醚抑制了铜绿假单胞菌细菌分泌系统通路中关键基因的转录
二烯丙基三硫醚处理5h后,铜绿假单胞菌的转录组差异表达基因KEGG富集分析中富集到了细菌分泌系统通路(Bacterial secretion system),该通路中的详细差异表达基因见图2。图2的KEGG富集细菌分泌系统通路图中,II型分泌系统中显著下调的mRNA为:GspD、GspC、GspF、GspG、GspH、GspI、GspJ、GspK、GspL和GspE,其他节点的mRNA为表达水平不变;VI型分泌系统中显著下调的mRNA为:VgrG、Hcp、IcmF和ClpV,其他节点的mRNA为表达水平不变。从图2中可以看出,细菌II型和VI型分泌系统中关键基因大部分都发生了表达下调。实验结果表明,二烯丙基三硫醚能够抑制铜绿假单胞菌分泌系统的功能,从而抑制该菌毒力因子的分泌和致病性。
综上的实验结果表明,二烯丙基三硫醚轻微抑制铜绿假单胞菌的生长,但是会显著抑制该菌的II型和VI型细菌分泌系统中关键基因的表达。因此,二烯丙基三硫醚可以应用到制备抑制铜绿假单胞菌细菌分泌系统和毒力因子的制剂中,用以控制该菌的毒力和致病性。
Claims (8)
1.二烯丙基三硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌细菌分泌系统制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,是二烯丙基三硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌II型和/或VI型分泌系统制剂中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述的铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的二烯丙基三硫醚,其在铜绿假单胞菌培养液中的浓度为0.16-5μL/mL。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的二烯丙基三硫醚,其在铜绿假单胞菌培养液中的浓度为0.63μL/mL。
6.一种抑制铜绿假单胞菌细菌分泌系统的制剂,其特征在于,含有二烯丙基三硫醚作为活性成分。
7.根据权利要求6所述的抑制铜绿假单胞菌细菌分泌系统的制剂,其特征在于,所述的抑制铜绿假单胞菌细菌分泌系统的制剂是抑制铜绿假单胞菌II型和/或VI型分泌系统制剂。
8.根据权利要求6或7所述的抑制铜绿假单胞菌细菌分泌系统的制剂,其特征在于,所述的铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1。
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