KR20150141385A

KR20150141385A - 여드름균을 사멸시키는 여드름균 특이적 박테리오파지

Info

Publication number: KR20150141385A
Application number: KR1020140070033A
Authority: KR
Inventors: 김정민; 송혜순; 이원주; 김석호
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-10
Filing date: 2014-06-10
Publication date: 2015-12-18
Also published as: KR101689033B1

Abstract

본 발명은 여드름균을 사멸시키는 여드름균 특이적 박테리오파지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 대한 특이적 사멸능을 갖는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 Pacnes 2012-15(기탁번호:KCTC 12569BP)에 관한 것이다.
따라서, 피부 질병의 주요 원인이 되는 여드름균을 특이적으로 사멸하는 본 발명의 박테리오파지 Pacnes 2012-15는 보건산업 뿐 아니라 친환경 대체항생제로 이용될 가치가 높다.

Description

여드름균을 사멸시키는 여드름균 특이적 박테리오파지{Bacteriophage that kills Propionibacterium acnes}

본 발명은 여드름균을 사멸시키는 여드름균 특이적 박테리오파지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 대한 특이적 사멸능을 갖는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 Pacnes 2012-15(기탁번호:KCTC 12569BP)에 관한 것이다.

사람의 피부에는 Staphylococcus , Corynebacterium , Propionibacterium , Micrococcus , Streptococcus, Breyibacterium , Acinetobacterium , Pseudomonas 등의 세균들이 존재한다고 알려져 있으며, 특히 Propionibacterium acnes(여드름균)는 피부에 존재하는 전체 세균들 중 50% 이상을 차지하는 균으로, 사람에 따라 얼굴 피부에 10²∼10^5-6/㎠ 존재한다. 피부뿐만 아니라 구강, 대장, 결막, 외이도 등에서도 발견되는 여드름균은 산소가 거의 존재하지 않는 머리, 얼굴, 등, 가슴, 목 등의 피지선(sebaceous glands)에서 관찰되는 세균으로 포자를 형성하지 않는 비운동성 그람 양성 혐기성균이며, 주로 염증을 일으키는 기회감염세균이다.

피지선은 피부 표피 아래의 두꺼운 층인 진피 부위에 존재하며, 모낭 피지선 단위(pilosebaceous unit)를 형성하고, 모공과 연결되어 있어 친유성의 triglyceride를 함유한 피지를 피부 표면으로 분비한다.

여드름을 야기하는 여러 원인들(예, 숙주의 나이, 성별, 특정 신체 부위, 유전적 요인, 생활방식, 직업, 면역체계, 주위 환경 등) 중 여드름균에 의해 유발되는 경우는 여드름균이 모낭 피지선 단위(pilosebaceous unit)를 손상시키는 lipases, proteases, hyaluronidases 등과 같은 효소를 분비함으로써 과도한 피지 생성, 여드름균의 집락화, 숙주의 면역체계를 통한 염증반응, 비정상적인 각질화 등을 유도하는 것으로, 특히 여드름균은 피지선에서 분비되는 triglyceride를 함유한 피지를 가수분해 하여 유리 지방산으로 방출시키고, 방출된 유리 지방산에 여드름균이 결합하여 여드름균의 집락화를 유도함으로써 여드름을 발생시킨다.

여드름균에 의해 형성된 여드름을 치료하기 위해 지금까지 수십 년 동안 tetracycline, erythromycin, clindamycin, macrolides, penicillin, cephalosporin등의 항생제를 사용하였다. 그 결과 1979년 Crawford 연구팀에 의해 erythromycin과 clindamycin에 내성을 나타내는 여드름균이 발견되었고, 뒤이어 1980년대 초반에는 tetracycline에 내성을 나타내는 여드름균도 확인되었다.

전 세계적으로 항생제에 대한 여드름 내성균 관련 연구를 지속한 결과 1970년 후반에는 erythromycin, clindamycin 및 tetracycline 항생제에 내성을 나타내는 여드름균의 비율이 약 20% 정도였지만, 1995년에는 약 72.5%까지 내성균의 출현이 높아졌으며, 더욱이 tetracycline에 대한 내성균보다는 erythromycin 및 clindamycin에 대한 혼합된 내성균 출현이 빈번하였다.

여드름균의 경우 항생제를 8 주만 사용하여도 그 항생제에 대한 내성균을 관찰 할 수 있으며, 뒤이어 몇 주 이내 내성균의 수가 점진적으로 증가함을 확인할 수 있다. 이와 같이 항균제 내성균의 출현 및 확산 문제가 심각해서 현재까지 개발되어 사용되고 있는 거의 모든 종류의 항균치료제에 내성을 나타내는 다제내성 세균까지 출현하여, 항생제를 대체할 새로운 치료제의 개발이 시급하고 절실하게 요구되고 있다.

박테리오파지는 세균에 특이적으로 감염하고 용균을 일으키는 바이러스로 1915년 최초발견 이후 지금까지 다양한 세균성 질병의 치료를 위해 연구되어 왔으며, 파지 발견자인 Felix d'Herelle는 1919년에 최초로 파지를 감염질환의 치료 목적으로 사용하였다.

박테리오파지를 이용한 연구는 그루지아, 폴란드와 구소련에서 꾸준히 세균성 감염질환의 치료 목적으로 연구가 진행되고 있었으며, 실제 병원성 미생물에 대한 치료에도 사용되고 있다. 1994년, 위절제술 후에 재발한 횡경막 종양에 감염된 내성 대장균에 박테리오파지를 처리하여 깨끗하게 치료하였고, 1995년에는 급성 만성 비뇨기염증환자 46 명에게 박테리오파지를 처리하여 92%는 임상적으로 회복되었고, 84%의 환자들에서 병원성 미생물이 완벽히 제거되었다. 1999년, 신생아의 수막염을 일으키는 균인 Klebsiella pueumoniae에 항생제 처방이 실패하자 박테리오파지를 구강으로 주입하여 치료에 성공하였다. 2001년, 20 명의 난치 종양환자에게 2~9주 동안 하루에 3 번 구강으로 박테리오파지를 주입하여 치료에 성공하였으며, 2001년에는 54 명의 환자 화상부위에 예방 차원의 파지를 처리하여 Staphylococcus , Streptococcus, Proteus 등의 감염으로부터 보호하였다. 2002년, 박테리오파지와 생물분해성 혼합물을 상처와 종양에 처리하여 환자 96 명 중 67 명이 회복되었다.

2007년은 미국에서 파지가 약제로서 처음 허가된 해로, 식품의약품안전청(FDA)이 당뇨성 발 괴사의 세균감염 치료를 위한 파지 사용 1 단계 임상실험을 승인하여, 파지를 이용한 동물의 감염질환 치료 뿐 아니라 사람에게도 치료목적으로 사용할 수 있는 길이 열렸다. 미국 FDA는 2008년에 닭고기 식품 처리과정 중 살모넬라 특이적 박테리오파지를 이용한 살모넬라 오염을 저감하는 방법을 승인하였다.

이에 본 발명자들은 환자로부터 분리된 박테리오파지 Pacnes 2012-15이 여드름균을 특이적으로 사멸시키는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 여드름균(Propionibacterium acnes)에 대한 특이적 사멸능을 갖는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 Pacnes 2012-15(기탁번호:기탁번호:KCTC 12569BP)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블 개선용 의약외품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 여드름균(Propionibacterium acnes)에 대한 특이적 사멸능을 갖는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 Pacnes 2012-15(기탁번호:KCTC 12569BP)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블 개선용 의약외품을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 여드름균(Propionibacterium acnes)에 대한 특이적 사멸능을 갖는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 Pacnes 2012-15(기탁번호:KCTC 12569BP)를 제공한다.

상기 박테리오파지 Pacnes 2012-15는 한국 생명공학연구원의 유전자은행에 2014년 4월 2일자로 기탁하였다.

상기 박테리오파지 Pacnes 2012-15는 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 박테리오파지 Pacnes 2012-15은 본 발명에서 처음으로 분리 동정된 것으로서, 그 유전체의 서열 또한 본 발명자에 의해 처음으로 밝혀졌다.

이와 같은 본 발명의 특징은 본 발명의 실시예들에 잘 나타나 있다.

본 발명자들은 분리된 박테리오파지 Pacnes 2012-15의 전장 유전체를 분리하고 이에 대한 염기 서열을 결정함으로써 파지의 유전체가 29,741 bp 크기인 이중 가닥 DNA이며 46 개의 단백질 암호화 부위(open reading frame, ORF)를 가짐을 확인하였다(실시예 1 및 실시예 4 참조).

또한, 여러 가지 세균에 대한 숙주특이성 및 사멸능을 확인한 결과, 본 발명에서 분리된 박테리오파지 Pacnes 2012-15는 여드름균을 특이적으로 사멸함을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에서 상기 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 질환은 염증, 여드름, 면포, 구진, 발진, 고름물집, 결절, 낭종 및 거짓낭으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용된 ‘치료’라는 용어는 여드름균에 의해 유발된 질환의 예방, 여드름균에 의해 유발된 질환의 억제 및 여드름균에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 박테리오파지 Pacnes 2012-15 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 Pacnes 2012-15는 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로 부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 비경구적인 투여방법으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같이 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 1 × 10³ 내지 1 × 10¹¹ pfu/㎖의 박테리오파지를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에서 상기 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블은 염증, 여드름, 면포, 구진, 발진, 고름물집, 결절, 낭종 및 거짓낭으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 화장료 조성물은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.

상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 박테리오파지 Pacnes 2012-15의 함량은 이에 한정되지 않지만 1 × 10³ 내지 1 × 10¹¹ pfu/㎖의 박테리오파지를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블 개선용 의약외품을 제공한다.

상기 의약외품이란 질병을 치료하거나 예방하기 위해 쓰는 의약품보다는 인체에 대한 작용이 경미한 물품에 대해 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 약품을 지칭하는 것이다. 약사법에 따르면 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 포함될 수 있다.

본 발명은 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다. 상기 항생제는 방부제, 살균제 및 항균제일 수 있다.

따라서, 피부 질병의 주요 원인이 되는 여드름균을 특이적으로 사멸하는 본 발명의 박테리오파지 Pacnes 2012-15는 보건산업 뿐 아니라 친환경 대체항생제로 이용될 가치가 높다.

도 1은 박테리오파지 Pacnes 2012-15의 현미경 사진이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

Pacnes 2012-15 파지의 생산 및 분리

본 발명에서 사용한 파지분리를 위하여 얼굴의 여드름 부위를 면봉으로 채취하여 아래와 같이 분리하였다. BHI 배지 4.5 ml에 생장기의 여드름균 (Propionibacterium acnes) 0.5 ml을 첨가하고 면봉에 있는 샘플을 넣어 37℃에서 3 일 동안 혐기성 조건에서 배양하였다. 3 일 후 클로로포름 200 ㎕를 넣어 혼합한 뒤 4℃에서 2 시간 정치배양하고 10,000 rpm으로 10 분간 원심분리 후 상층액을 0.45 ㎛ 구멍크기의 필터로 걸렀다.

상기 용액에서 파지의 존재를 확인하기 위하여 여드름균을 포함한 여러 가지 세균을 가지고 BHI 고체배지에 균을 도말한 다음에 5 분간 말리고 용액을 점적하여 다시 말린 후, 37℃ 배양기에 넣어 3 일 동안 혐기 배양하였다. 용액이 떨어진 부위가 투명하게 보이는 것을 세균의 용혈이 일어난 것으로 판정하였다.

여드름균 특이적 파지의 순수분리를 위하여 위 용혈이 일어난 부위에서 파지를 분리하여 대수기로 증식한 여드름균 배양액과 혼합하고 0.7% agar를 함유하는 top LB agar 3 ml과 혼합한 후, BHI agar plate에 부어 잘 굳게 하였다. 37℃ incubator에서 혐기성 상태로 배양한 후에 plaque 형성 유무를 관찰하였다. plaque를 각각 분리하여 앞서 파지 분리에 사용한 여드름균을 이용하여 파지를 증폭하고 이러한 과정을 반복하여 파지를 순수분리 및 정제하였다. Stock phage는 7% DMSO가 첨가된 SM 완충용액 (100 mM NaCl, 8.1 mM MgSO4H2O, 50 mM Trisl (pH 7.5), 0.01% gelatin)로 용해하여 4℃에 보관하였다.

< 실시예 2>

Pacnes 2012-15의 여러 가지 세균에 대한 숙주특이성 및 사멸능

상기 실시예 1에서 얻은 순수 분리된 파지용액을 이용하여 영양배지에서 배양한 여드름균 등 여러 가지 세균들을 BHI broth에서 1시간 교반배양 후 BHI agar plate에 도말하고 Pacnes 2012-15 파지용액을 떨어뜨린 후, 37℃ 배양기에서 18 시간 동안 배양하여 세균용혈의 정도를 확인하였다(표 1 및 표 2 참조).

Spot test 결과

Species	Strain or isolate	Spot test result ^a	Source
Propionibacterium acnes	ATCC 11828	+	ATCC ^b
	2874	+	GNUH ^c -NCCP ^d
	2875	+	GNUH-NCCP
	2876	+	GNUH-NCCP
	2877	+	GNUH-NCCP
	2878	-	GNUH-NCCP
	391	+	JBNUH ^e -NCCP ^d
	893	+	JBNUH-NCCP
	1475	+	JBNUH-NCCP
	1490	+	JBNUH-NCCP
	1912	+	JBNUH-NCCP
	105	+	KNUH ^f -NCCP ^d
	106	+	KNUH-NCCP
	109	+	KNUH-NCCP
	112	+	KNUH-NCCP
	113	-	KNUH-NCCP
	114	+	KNUH-NCCP
	116	+	KNUH-NCCP
Propionibacterium avidum	111	-	KNUH ^f
Staphylococcus epidermidis	107	-	KNUH ^f
	108	-	KNUH ^f
	115	-	KNUH ^f
	KNUH-180	-	Laboratory collection
	KNUH-184	-	Laboratory collection
	1	-	Laboratory collection
Staphylococcus aureus	ATCC 29213	-	ATCC ^b
	KNUH-539	-	Laboratory collection
	KNUH-541	-	Laboratory collection
	KNUH-584	-	Laboratory collection
	KNUH-585	-	Laboratory collection
	KNUH-589	-	Laboratory collection
Staphylococcus aureus MRSA	1	-	Laboratory collection
Pseudomonas aeruginosa	1	-	Laboratory collection
	KNUH-558	-	Laboratory collection
	KNUH-563	-	Laboratory collection
	KNUH-564	-	Laboratory collection
	KNUH-567	-	Laboratory collection
	KNUH-582	-	Laboratory collection

Spot test 결과

Species	Strain or isolate	Spot test result	Source
Corynebacterium	1	-	Laboratory collection
	KNUH-188	-	Laboratory collection
	KNUH-309	-	Laboratory collection
	KNUH-576	-	Laboratory collection
Candida albicans	1	-	Laboratory collection
	KNUH-16	-	Laboratory collection
	KNUH-74	-	Laboratory collection
Acinetobacter baumannii	1	-	Laboratory collection
	KNUH-770	-	Laboratory collection
	KNUH-822	-	Laboratory collection
Enterococcus faecium	KNUH-1107	-	Laboratory collection
	KNUH-1120	-	Laboratory collection
	KNUH-1134	-	Laboratory collection
	KNUH-1143	-	Laboratory collection
	KNUH-1144	-	Laboratory collection
Escherichia . coli	ATCC 25922	-	ATCC ^b
	KNUH-9	-	Laboratory collection
	KNUH-33	-	Laboratory collection
	KNUH-39	-	Laboratory collection
	KNUH-42	-	Laboratory collection
	1	-	Laboratory collection
Escherichia . coli	DH5 α	-	invitrogen
Bacillus	1	-	Laboratory collection

a +, lysis; -, no lysis.

b ATCC, American Type Culture Collection.

c GNUH, Gyeongsang National University Hospital.

d National Culture Collection for Pathogens.

e JBNUH, Chonbuk National University Hospital.

f KNUH, Kyungpook National University Hospital.

그 결과, Pacnes 2012-15 파지는 Propionibacterium avidum , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus aureus , Methicillin - resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Enterococcus faecium, E. coli DH5α, Bacillus 등을 사멸시키지 못하고 여드름균만 특이적으로 사멸시켰다. 이와 같은 결과를 통해 Pacnes 2012-15 파지는 여드름균을 숙주로 하며, 이 균을 특이적으로 사멸시키는 파지임을 확인하였다.

< 실시예 3>

전자현미경을 이용한 Pacnes 2012-15의 형태관찰

본 발명에서는 파지의 모양을 관찰하기 위하여 주사전자현미경을 사용하였다. 순수분리된 파지를 탄소로 코팅된 구리판에 바른 후, 2%의 uranyl acetate로 염색하고 주사전자현미경(Philips EM 300)을 사용하여 관찰하였다.

관찰결과, 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것과 같이 각이 진 머리(icosahedral head)와 긴 하나의 꼬리가 관찰되었다(도 1 참조).

< 실시예 4>

Pacnes 2012-15의 유전학적 특성 분석

본 발명에서 파지의 유전체는 Phage DNA Isolation Kit (NORGENBIOTEK)를 사용하여 순수 분리하였다. 분리된 파지 유전체는 전체 유전자 염기서열 결정을 위하여 천랩에 맡겼다. 전체 염기서열 결정은 454 및 Illumina sequencing platforms의 혼합 방법과 CodonCode Aligner 3.7.1 에 의하여 수행되었다.

실험결과, 파지의 유전체는 이중가닥 DNA로 크기가 29,741 bp이고, 46 개의 ORF로 구성되어 있었다. 서열번호 1로 표시되는 전체 염기서열을 미국 NCBI의 BLAST 검색을 한 결과, 여드름균을 사멸시키는 PHL113M01, PHL073M02, P1.1, PA6, P100 A등을 포함한 16종류의 파지들과 87%∼89%의 유사도를 나타내며 이들은 모두 시포비리데 (Siphoviridae)에 속하는 파지들인 것으로 확인되었다.

< 제조예 1>

Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 크림의 제조

Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 크림의 제조는 통상적인 방법에 따라, 상기 <실시예 1>에서 분리한 Pacnes 2012-15 10 중량%, 1,3-부틸렌글리콜 6 중량%, 글리세린 4 중량%, 유동파라핀 5 중량%, 스쿠알렌 3 중량%, 폴리솔베이트60 1.5 중량%, 및 정제수 잔량을 혼합하여 영양크림을 제조하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 여드름균을 사멸시키는 여드름균 특이적 박테리오파지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 대한 특이적 사멸능을 갖는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 Pacnes 2012-15(기탁번호:KCTC 12569BP)에 관한 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12569BP

20140402

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A bacteriophage that kills Propionibacterium acnes <130> NP14-0023 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteriophage Pacnes 2012-15 <400> 1 ggtcttgcac gggtgtgcag ggggtggtcc gggtgggggt ttgcgggttt gtcaccatga 60 aactaatgtt tttgtggttt gttgttggaa ttgaatgttt ggttgtgttc tgttgccttt 120 gcttctgttg catgttctgc agatgatttg gccgttgtcg agggtgttga gtcctcccct 180 gctgacgggt gtgatgtggt cggcttcggg gctggttggt agctggtggg tgtcccaggt 240 gatggtggct ccgcagagtg ggcaggcgac ctggccttgt tgtcgggctt gggtgatgag 300 tcgttgccgc cagcggcggt gggcggagga tgcggtgcgg ttggtgtgtg ccatcacgcc 360 tccgctcccc aatagtgcct ctatgggctc tggttgcctc tgtaacggcc tggaatgtgt 420 tgggggtatg aataccttgc ccttgccccg ctgttcgatt ctaggggcct ttttgtgcgt 480 ttgagggggt gttctgtttg tgtcggggtg tttgttttct cttcctaccc ccacggttgt 540 gagaaagatc acattgcccc ccagcggtgt caaaagaaga aaggacacgg aagaaaacgg 600 gggagtgggt gttcgcactt cacggcttag cgcttggcgc ctagcggtgt agaacacagc 660 caaaacgtgt acacccttaa ggtttttaaa gtcttctaca tataatatac actttaagtc 720 ttacctggcg ttaagggttt acgtgtgaca cgccgtacgc cttcagccga acacgccaag 780 gtttgaagga agaacacggg tagagtgagt gtggggagtg tgcgatggga gcttgcgacc 840 aagcacacga gtcacacggt aaaagatcat cggcgctgat ggtaaaggtt cctcttctcc 900 cctgatgaag aaaagaagag aagagagaaa gaaccaaaga gagtagagaa gtaaagaagt 960 taacccctta gctcttctaa aacttttata acttatataa ttatattata ttataatacc 1020 tataagcttt aagacttata ggttataata ttaaagttta agactgatgg ttaactttaa 1080 gtatttaaag ctttaatgtt ttatagttac ttaaagtatt aaagcttata agtatttata 1140 tttactttaa gttttaaagt cttacacact gatgtaaagt ttatatcctt aagtgctaag 1200 cctttaaggt tttatactta acttaggtgt taaggtttaa agttttaaac gtttaactgt 1260 taaggtttta tatttacttt aagacttaaa ggctttaatg tttatttata accttaagtg 1320 ttaagtactt aaggttactt aaagtgttta aagcttataa gtctttaagt attaatattt 1380 actttaagtg tttaaggctt taaggctgat gccgagccct tgaggggctc ggtgctcagc 1440 gttaaggtct taagggctta gcgctaagcc ttgaagcttt aaagtgtttg gtagactgat 1500 ggatgtaagg gtgaaagccg cgtcagcgga tttcggcctt gcgtccagct ggctacctgt 1560 ccagcctatc atatgccacc tgggatgagt caaacacggt ggtttggctc tataggcggg 1620 tttgaggggt gtaaacgggt gtttttggta gtaaaggtcc aaaaattaaa cctaaacttt 1680 tccttaaatt ttcttagagt cttgtaacct ttgagggtgg ttaaggctga aacccctagc 1740 cagaacgggt ttcactccca gacagctgtc acactgtacc cctgtgtcct ttccggacac 1800 gctaggtgtt cagtgctgat gggtgttccc tcaggctttc gagtactcgt cgctaaggct 1860 cctcgtactc tcaagccttc cctgatggcg tgtacccctt tcagggctgt gcctcatcgg 1920 ctgagcctgt tcgggctgat gccgagccct tgaggggctc ggtgctaagt gctcaacccc 1980 tcagtgctaa gaccttaaag cttgaaggtg tgaaggctga tgctccccct tctttcttgt 2040 accgtgtcct tcttcccccc acagtatccc acactgtcca catagttgag gcttagctaa 2100 ccaagatagg tactcatggt ctatgccgag accgctcatc tcatacaagc ctcctgtagg 2160 cgtctagaat cgatcagaat gtgctggggg tataaatacc tagcccccac ccggcaaggc 2220 gctcctaggc gccatgcaga ggctttaaac agcatttctg ggctacactc tctacgctag 2280 atcggcagag tagcctcgag ggtgcacacc aagccaggag gatgtgatac atctcacaca 2340 gtatgagggt gtagattcca tgcccagatg gggtaccccc acttttgcga tgcagacctg 2400 catcagcctg tcaatccatc taccgaacct gctatcaccc agacataccc ctgggacgcc 2460 ctagaagtgg cctagaatcg atcagcaggg tcaaccctat ataatcctac ccccagaaga 2520 tttgaggcgc ttagaggagc aataaaggct taagtgatat acgccacacc ctatgccaca 2580 tccacatgaa acgctcacaa ccgttgagcg tagccttgac cttgatgccc cacctcaacc 2640 atcatgggat cctgtcggca caaccacaca ccccgatgaa aggacaacac gatggcctac 2700 acgctcatca cccccagctt caccaccctc tacaggcaaa ccgaaatcga tccactcaac 2760 ctccacaaca ccatcggaga ctacagtgac aacatcgatc tcgacatggt gcagcgcctc 2820 taccacgccc aagtagaaca atccatacgc ctcatccgcc cacactggat agtcaccctc 2880 gacggagccg tatacgggcc acccgactgg cagtcactca ccgagaaaga agccgaagag 2940 ttgcacgaca tcatcgacat gatcgatctt gactccatca tcgccgcatc aacccgataa 3000 acccaacaca aacccgcaac aaccaacaca agagtaaagg acatgatcat gcagaagatc 3060 gccaaccact tcacccagct ctacaccccc acccaggact gccctgagcc tttcgacctg 3120 acacgcctcg aaaacctcca 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catcacagca atgctcaacc agcccaccct ctacatatca 7380 ggggacatga caccctggga ggcctccaca cgaatcatct cactcaacac ccaacacacc 7440 accacacaga tacaacaaaa catcgacgac tacgggccag aatactatcg agacaccatc 7500 cggcacggcg aacgcatcac attctcattc cagtcaccca tcacctggac agacatcacc 7560 atggagctac aagcctacat ggaaatgtgg aaccgtttcc ccgacatcat cgtcatcgac 7620 aacctgatgg acatccaaga ctgcgagagt gactatcagg cccagcagga agccatgcaa 7680 tggatcacag ccctcggccg cgacacagga tccaccatca tcgtcaccca ccacgcaacc 7740 gacaaaacag gaaccgacat cgaacacccc ccggcacgcc gcgaaatcaa aaacggcctc 7800 tccgaaaaac cacaactcat cctcggagtc tcactctacg gtggcgaaga caacggcaac 7860 gggctcacca tacccgccga agcccgcatc gcagtgttga aacagcgcac cggcaaatcc 7920 agcccagacg gcacccgata cgaaagacta cgagcctacc ccgaatacac attcttcgga 7980 ccactggtag aaaaacagcc atggaacatg accccaacac acaaaggact atcatgtcga 8040 cacagcaatc acgcaaccgc cgggccggag ccgaatggga aacccgactc ctccaccagc 8100 tacgagacac cggccatgat atagagcgcc tccacctcaa cggcagagaa gatgagggag 8160 acctgattct caaaaccggc 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Claims

여드름균(Propionibacterium acnes)에 대한 특이적 사멸능을 갖는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 Pacnes 2012-15(기탁번호:KCTC 12569BP).
제 1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지 Pacnes 2012-15(기탁번호:KCTC 12569BP).
제 1항 또는 제 2항의 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 질환은 염증, 여드름, 면포, 구진, 발진, 고름물집, 결절, 낭종 및 거짓낭으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항의 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블 개선용 화장료 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블은 염증, 여드름, 면포, 구진, 발진, 고름물집, 결절, 낭종 및 거짓낭으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항의 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블 개선용 의약외품.
제 7항에 있어서, 상기 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의해 유발되는 피부 트러블은 염증, 여드름, 면포, 구진, 발진, 고름물집, 결절, 낭종 및 거짓낭으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 의약외품.
제 1항 또는 제 2항의 박테리오파지 Pacnes 2012-15를 유효성분으로 포함하는 항생제.