EA009661B1 - Способ лечения атеросклероза - Google Patents

Способ лечения атеросклероза Download PDF

Info

Publication number
EA009661B1
EA009661B1 EA200400338A EA200400338A EA009661B1 EA 009661 B1 EA009661 B1 EA 009661B1 EA 200400338 A EA200400338 A EA 200400338A EA 200400338 A EA200400338 A EA 200400338A EA 009661 B1 EA009661 B1 EA 009661B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
lipid
activity
abzymes
stenosis
abzyme
Prior art date
Application number
EA200400338A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200400338A1 (ru
Inventor
Иван Петяев
Original Assignee
Кембридж Тераностикс Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0120428A external-priority patent/GB0120428D0/en
Priority claimed from GB0202774A external-priority patent/GB0202774D0/en
Priority claimed from GB0204611A external-priority patent/GB0204611D0/en
Priority claimed from GB0216530A external-priority patent/GB0216530D0/en
Priority claimed from GB0216755A external-priority patent/GB0216755D0/en
Application filed by Кембридж Тераностикс Лтд. filed Critical Кембридж Тераностикс Лтд.
Publication of EA200400338A1 publication Critical patent/EA200400338A1/ru
Publication of EA009661B1 publication Critical patent/EA009661B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56927—Chlamydia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/132—Amines having two or more amino groups, e.g. spermidine, putrescine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/145—Amines having sulfur, e.g. thiurams (>N—C(S)—S—C(S)—N< and >N—C(S)—S—S—C(S)—N<), Sulfinylamines (—N=SO), Sulfonylamines (—N=SO2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/166—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the carbon of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. procainamide, procarbazine, metoclopramide, labetalol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/222—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin with compounds having aromatic groups, e.g. dipivefrine, ibopamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/351—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A61K31/355—Tocopherols, e.g. vitamin E
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5383—1,4-Oxazines, e.g. morpholine ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/118—Chlamydiaceae, e.g. Chlamydia trachomatis or Chlamydia psittaci
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение касается идентификации абзимов, окисляющих липиды, в качестве ключевого патогенного фактора при атеросклеротических расстройствах. Способы и средства снижения опосредованного абзимом окисления липида в сосудистой системе предложены в качестве терапевтических подходов для лечения атеросклеротических расстройств.

Description

Иммунные комплексы, включающие немодифицированные липопротеины плазмы, как известно, имеют низкую атерогенность. Однако если липопротеины становятся модифицированными, в частности окисленными, эти иммунные комплексы становятся высокоатерогенными [Огекйоу А.Ы. е! а1. ВюЬйет. Вюрйуз. Кез. Сотт. (1989), 162, 206-211, Огекйоу А.Ы. е! а1. Айегюзс1ег. ТйготЬ. Уазе. Вю1. (1991), 11, 316-326]. Окисление липидов плазмы, которое принимает форму пероксидирования (окисления в перекисное соединение), обычно рассматривается как ответственное за развитие атеросклероза и является постоянно наблюдаемой и отмечаемой в публикациях клинической особенностью этой болезни [Со!о Υ. 1п: Ыр1б Регох1без ш Вю1оду апб Мебюте, Еб. Υад^ К., Асабетю Ргезз, №\ν Υо^к, Ьопбоп, Токуо (1982), 295-303, НаШ^е11 В. апб 1.М.С. СиЦепбде. Егее Кабюа1з т Вю1оду апб Мебюте, С1агепбоп Ргезз, ОхГогб. 1989, 8с1и.11Ь Ό е! а1. Айегюзс1ег. ТйготЬ. Уазе. Вю1. (2000), 20, 1412-1413]. Однако до настоящего момента причина этого пероксидирования в плазме была неясной.
Настоящее изобретение связано с обнаружением того, что специфическая подгруппа аутоантител способна как связывать, так и окислять липиды и липопротеины. Эти каталитические антитела («абзимы») реагируют с липопротеином низкой плотности и окисляют его с возникновением атерогенных факторов и являются первым опубликованным примером антилипидных абзимов.
В различных аспектах настоящее изобретение касается использования антител, окисляющих липиды, в качестве терапевтической мишени при лечении атеросклеротических расстройств.
Терапевтическое действие может проявляться в снижении активности опосредованного антителами окисления липидов в сосудистой системе индивида и, таким образом, уменьшением или облегчением симптомов атеросклеротических расстройств.
Активность опосредованного антителами окисления липида может быть понижена путем введения ингибитора антител окисления липида указанному индивиду или путем введения агента, который снижает количество или уровень антител, окисляющих липиды, в сосудистой системе индивида, как описано ниже.
В одном аспекте настоящего изобретения предложено использование ингибитора антител, окисляющих липиды, в производстве лекарства для использования в способе лечения атеросклеротического состояния индивида.
Способ лечения индивида, имеющего атеросклеротическое расстройство, может, таким образом, включать снижение активности опосредованного антителами пероксидирования липидов в сосудистой системе указанного индивида.
Активность опосредованного антителами окисления липидов может быть снижена путем ингибирования окисляющих липиды антител в сосудистой системе индивида, например, путем использования ингибитора или путем понижения количества или уровня окисляющих липиды антител в сосудистой системе индивида, как описано ниже.
Антитело, окисляющее липиды, представляет собой молекулу, которая является элементом суперсемейства иммуноглобулина, которое обладает способностью связывания и каталитической активностью. После очистки, например, с использованием белка С, окисляющее липид антитело проявляет как связывание с антигеном, так и каталитическую активность (т.е. окисление липида).
И связывание, и каталитическое действие могут быть характерными свойствами окисляющего липиды антитела. В альтернативном случае, активность в отношении окисления липида может быть обусловлена каталитической молекулой, которая сильно связана с антителом и очищается совместно с ним в комплексе (например, при использовании колонки с белком С/белком А или белком Ь). Эта каталитическая молекула может представлять собой иммуноглобулин или не являться иммуноглобулином, представляя собой молекулу типа фермента или иона металла. После очистки комплекс проявляет способность к связыванию вследствие наличия антитела и каталитическую активность ввиду наличия каталитической молекулы. Окисляющее липиды антитело может, в альтернативном варианте, инициировать окисление липида по другому механизму, например, путем изменения окружения антигена липида (например, через активацию моноцитов) или путем изменения липида или липопротеина, что способствует окислению липида.
Каталитическое антитело может быть специфическим для конкретного эпитопа, который несут ряд
- 1 009661 антигенов, и может поэтому связываться с различными антигенами, которые имеют один и тот же эпитоп. Антитело может не проявлять какое-либо заметное связывание с другими эпитопами. Антитело, таким образом, как говорят, «специфически связывается» с эпитопом или с антигеном, включающим эпитоп. Эпитоп, который опознается антителом, может быть включен в молекулу хозяина и антигена от инфекционного агента, например бактерии, грибка, вируса или простейших одноклеточных (протозоа). Окисляющее липиды антитело, произведенное хозяином в качестве ответной реакции на инородный антиген, например при патогенной инфекции, может таким образом включаться в перекрестную реакцию с липидами или липопротеинами хозяина или другими антигенами.
Окисляющее липид антитело может, таким образом, связываться как с молекулой хозяина, так и с инородным антигеном, и может катализировать окисление одной или обеих из этих молекул. Молекула антитела может окислять, в особенности окислять в перекисное соединение, липидную часть липопротеинов плазмы, в особенности - липопротеинов низкой плотности.
Антиген, который связан с окисляющим липиды антителом, может быть элементом семейства молекул, обладающих высокой степенью идентичности последовательностей (т.е. гомологи), которые найдены в ряде инфекционных агентов (например, в двух или более видах грамотрицательных бактерий), или антиген может быть специфичным для конкретного инфекционного агента (т.е. не иметь гомологов в других видах). Кроме того, тот же самый эпитоп может присутствовать в антигенах различных инфекционных агентов, которые иным путем не имеют высоких уровней идентичности последовательностей (т. е. не являются гомологами). Примеры антигенов, которые являются общими для ряда инфекционных агентов, включают аполипопротеин В, ОтрА, липополисахарид, йкрбО МОМР. (Р)ОМР, р54 и липид А.
Молекулы антител, которые катализируют окисление липида, называются здесь каталитическими молекулами антител, антилипидными абзимами, абзимами или окисляющими липиды антителами. Как описано выше, такие каталитические антитела могут иметь внутреннюю, или характерную активность оксидазы липида или другую активность, которая приводит к окислению липида, или могут быть естественным образом ассоциированы (т.е. связаны или присоединены нековалентным образом в их естественном состоянии внутри тела) с молекулой, обладающей активностью оксидазы липида.
Атеросклеротические расстройства, пригодные для лечения описанными здесь способами, могут включать атеросклероз, ишемическую (коронарную) болезнь сердца: ишемию миокарда (стенокардию), инфаркт миокарда; аневризматическую болезнь; атероматозную периферическую сосудистую болезнь: болезнь подвздошной аорты, хроническую и критическую ишемию нижних конечностей, висцеральную ишемию, болезнь почечной артерии, церебрально-васкулярную болезнь, инсульт, атеросклеротическую ретинопатию, тромбоз и отклонения в свертывании крови и гипертонию. Такие состояния могут быть медицинскими или ветеринарными состояниями.
Индивиды, которые могут быть объектами воздействия методов согласно настоящему изобретению, включают людей и животных, в том числе домашних животных, таких как собаки, кошки, лошади и попугаи, животные на ферме, такие как овцы и крупный рогатый скот, и редких или экзотических животных типа слонов и тигров. Ссылки на «человеческое» здесь следует понимать как включающие и «животное», за исключением тех случаев, когда из конкретного контекста следует иное.
Ингибитор или другой агент, как описано здесь, можно использовать в способе, который включает операцию оценки состояния индивида в отношении атеросклеротического расстройства. Это может быть достигнуто путем определения активности опосредованного антителами окисления липида в образце, полученном от индивида, как описано ниже. Индивид, в котором идентифицировано наличие окисляющих липиды антител, свидетельствующих об атеросклеротическом состоянии, может быть подвергнут терапевтическому лечению в соответствии с предложенными способами для облегчения данного состояния или его симптомов. Уровень или количество окисляющих липиды абзимов является показателем серьезности состояния и может использоваться для определения специфического режима лечения, как описано здесь.
Ингибитор или другой агент можно, таким образом, использовать в способе, который включает испытание способности антитела из образца, полученного от индивида, окислять липид, и введение ингибитора или другого агента для снижения опосредованной антителами активности окисления липидов в сосудистой системе индивида.
Способ может дополнительно включать определение опосредованной антителами активности окисления липидов в образце, полученном от индивида после указанного снижения опосредованной антителами активности окисления липидов.
Опосредованную антителами активность окисления липидов можно определять так, как описано ниже.
Экспериментальные данные, приведенные в настоящем изобретении, также показывают, что подгруппа антител, которые возникают в качестве реакции на инфекции хламидии (СЫатуй1а), являются аутоантителами, которые вступают в перекрестную реакцию с антигенами хозяина и ответственны за окисление липидов плазмы в перекисные соединения. Показано, что каталитические антихламидийные антитела против хламидии присутствуют в антилипопротеиновых фракциях 1дО, извлекаемых из атеросклеротических повреждений человека и сыворотки крови пациентов с клиническими осложнениями
- 2 009661 атеросклероза, но отсутствуют среди 1дС, которые извлекают из сыворотки крови здоровых людей. Каталитические антитела, которые связывают и окисляют липид, как описано здесь, могут поэтому обладать реактивностью по отношению к клеткам СЫашуФа, т.е. связываться с ними.
Пока атеросклероз в прошлом связывали с присутствием в артериальных стенках бактерий СЫашуб1а рпеитошае [Кощатеи М. е! а1. Сйси1а!юи (2000), 101,252-257, §18соу1ск Ό.8. е! а1. 1. 1пГсс1. Όίδ. (2000), 181, 8ирр1. 3, 8417-420], серологические тесты для обнаружения в плазме или сыворотке пациентов специфичных антихламидийных антител [Меиба11 М. е! а1. (1995) 1. 1иГес1. 30 121-128, \Уапд 8.-Р. е! а1. (1970) 70, 367-374] не могли использоваться для идентификации или диагностики пациента с атеросклерозом. Значительная часть популяции имеет историю инфекции СЫатуФа и, следовательно, имеет в своей сыворотке специфичные антихламидийные антитела без какого-либо клинического проявления атеросклероза [Пау1б8ои М. е! а1. Сйси1а1юи (1998), 98, 628-633т, 8оид У.С. е! а1. УоиЮ Меб. 1. (2000), 41, 319327]. Само по себе присутствие в плазме или сыворотке антихламидийных антител поэтому не является показателем атеросклероза.
Однако каталитические антихламидийные антитела, которые вступают в перекрестную реакцию с антигенами человека и катализируют окисление липопротеинов плазмы, как показано здесь, являются полезными в качестве мишеней при лечении атеросклеротических заболеваний.
Окисляющее липиды антитело может, таким образом, связываться с антигеном клеток СЫатуб1а или быть реактивным к нему, т. е. молекулы антител могут быть антихламидийными абзимами или молекулами антител.
Антигеном СЫатуб1а, как описано здесь, может быть любой иммуноген или иммуногенный компонент клетки СЫатуб1а, т.е. молекулы из СЫатуб1а, которые вызывают или способны вызывать иммунную реакцию в млекопитающем по отношению к клеткам СЫатуб1а, например Н§р60 (Ншйтеи е! а1. (2001) Еиг Ке^р. 1. 17 (6) 1078-1082, Кшиииеи А. е! а1. (2001) 8саиб. 1. 1ттиио1. 54 (1-2) 76-81). Предпочтительно антиген представляет собой белок или липидный антиген, т. е. он включает или представляет собой группу или фрагмент липида. Липидным антигеном может быть, например, липид, липопротеин или другой компонент клетки, связанный с липидом, который связывает антихламидийные антитела, и термин «липидный антиген» относится к любому из этих компонентов. Такой антиген может быть очищен, и/или выделен, или находиться внутри клетки СЫатуб1а. Известны соответствующие способы очистки и/или выделения такого липопротеина, например ВЭЖХ (НРЬС).
Показано, что антитела, вырабатываемые в ответ на аполипопротеин В человека, являются реактивными к клеткам Сй1атуб1а (см. пример 7). В некоторых вариантах осуществления изобретения окисляющее липид антитело, как описано здесь, может, таким образом, быть реактивным по отношению к аполипопротеину В человека. Клетка Сй1атуб1а может представлять собой клетку вида, принадлежащего к группе Сй1атуб1а рыйаск Группа Сй1атуб1а р§й1ас1 включает Сй1атуб1а рыйаш и СЫатуб1а риеитошае. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, клетка СЫатуб1а представляет собой клетку С111атуб1а райат овцы.
Соответствующие рецептуры живой СЫатуб1а р§й1ас1 овцы в лиофилизированной форме являются коммерчески доступными (1и!егуе!).
Ингибитор окисляющего липиды антитела может ингибировать связывание окисляющего липиды антитела с антигеном липида (т.е. блокировать связывающий сайт абзима) или может ингибировать окислительную активность антитела в отношении липида (т.е. блокировать каталитически активные центры).
Ингибиторы, которые блокируют каталитически активные центры абзимов, могут включать хелатирущие металл агенты, примеры которых показаны в табл. 7. Ионы металлов переменной валентности в каталитическом центре абзима подвергают целенаправленному воздействию таких хелатных агентов, чтобы нейтрализовать каталитические свойства абзима. Хелатирующие металл агенты, которые ингибируют абзимы, включает аспирин.
Другие такие ингибиторы включают антагонисты субстрата, которые предотвращают связывание абзима с его целевым эпитопом (эпитопами) в организме хозяина. Связывающими антагонистами могут быть либо пептид, липид, полисахарид, либо любой другой синтетический или природный продукт, который аналогичен эпитопу абзима. Такой антагонист может быть смоделирован на антигене липида, который может быть, например, антигеном хозяина, т.е. антигеном человека или патогенным антигеном.
Активный центр абзима может быть изменен другими способами для того, чтобы инактивировать его каталитические свойства. Например, активный центр абзима может содержать фото- (УФ-) чувствительную группу (группы), которая может быть модифицирована экстракорпоральным (УФ) облучением плазмы/сыворотки, чтобы инактивировать свойства этих молекул окислять липиды до перекисных соединений.
Примеры ингибиторов, которые блокируют места связывания абзимов, включают молекулы антиидиотипических антител, включая ЕаЬ/Ρν или другие фрагменты и производные антител, или молекулы пептида, представляющие фрагмент (фрагменты) комплементарного контура их активных центров (т.е. которые аналогичны антиидиотипической молекуле антитела), что позволяло бы им ингибировать связывание абзимов с их целевыми антигенами. Соответствующие молекулы антитела могут быть получены
- 3 009661 путем использования поликлональной или моноклональной стратегии или фагового отображения.
Могут использоваться другие соединения с антагонистическими свойствами, чтобы конкурировать с антигеном за сайт связывания абзима, например пептид, липид, полисахариды или любой другой синтетический или встречающийся в природе продукт, который аналогичен эпитопу, с которым связывается абзим. Для того чтобы разрушить связывание, можно также использовать другие соединения или химические и физические процедуры, например облучение, как описано выше, которые могут модифицировать сайты связывания абзимов.
Представленные здесь данные показывают, что антибактериальное лекарственное средство азитромицин (ηζίΙΙιΐΌΐηνοίη) является ингибитором активности абзима. Таким образом, предполагаемые ингибиторы могут включать обе молекулы, структурно связанные с азитромицином и антимикробными агентами, такими как эритромицин, рокситомицин (гохййготусш), офлоксацин (ойохаст), клинафлоксацин (с1тайохасш), ципрофлоксацин (щргойохаст), клиндамицин (с1шбатуст), азитромицин (ηζίΙΙιΐΌΐηναη). доксициклин (бохусусйпе), миноциклин (ттосусйпе) и тетрациклин.
В ряде аспектов изобретения предложено использование азитромицина в производстве медикамента для использования в лечении атеросклероза, а также использование азитромицина в сочетании со вторым ингибитором абзима, например хелатирущим металлы агентом типа аспирина, в производстве медикамента для использования в лечении атеросклероза. Например, азитромицин и хелатирующий агент, такой как аспирин, можно объединить в одной композиции или вводить одновременно или последовательно.
В ряде аспектов изобретения предложено использование азитромицина в способе ингибирования окисляющего липиды антитела, как описано здесь, и способ ингибирования окисляющего липиды антитела, включающий приведение указанного антитела в контакт с молекулой азитромицина.
Активность опосредованного антителами окисления липида в перекисное соединение в сосудистой системе индивида можно снижать путем снижения количества или уровня окисляющих липиды антител в сосудистой системе индивида, например, используя специфические терапевтические агенты, как описано здесь.
Способ лечения атеросклеротических расстройств может включать отщепление или удаление антител, которые окисляют липиды, из сосудистой системы нуждающегося в этом индивида. Агенты, подходящие для использования в таких способах, описаны ниже.
В ряде аспектов изобретения предложено использование агента, который снижает уровень абзимов в сосудистой системе индивида, в производстве медикамента для использования в способе лечения атеросклеротического состояния в указанном индивиде и способ лечения атеросклеротического состояния, включающий снижение уровня абзимов в сосудистой системе индивида.
Такой способ может включать операцию определения присутствия или количества окисляющих липиды антител, как описано здесь, в образце, полученном от индивида, до и/или после операции устранения или удаления.
Антитела, которые окисляют липиды, т.е. абзимы, могут быть удалены из сосудистой системы, т.е. из циркуляции, любым из множества способов. Клетки, ответственные за производство абзимов, можно ингибировать, нейтрализовать или устранить, например, используя специфические антитела против этой субпопуляции клеток В. Ингибирование производства абзимов может быть достигнуто как путем связывания антитела, так и путем воздействия цитотоксических агентов, загружаемых на эти антитела и дотавляемых в клетки В.
Производство специфических антиабзимных антиидиотипичных антител может быть активизировано. Это может быть достигнуто, например, путем идентификации подходящих антиидиотипичных антител при использовании методики, связанной с проявляемым фагами антителом, и введения этих антител или кодирующей их нуклеиновой кислоты в индивида, или путем имплантации рекомбинантных клеток хозяина, которые производят антиидиотипические антитела.
Агент для сокращения уровней абзима может представлять собой химический, физический или биологический объект, который внедрен в хозяина и самостоятельно или совместно с гомеостазом/метаболизмом хозяина, прямо или косвенно инактивирует, или нейтрализует, или устраняет циркуляцию абзимов. Например, можно использовать полимер или другое вещество, которые несут аналогичные эпитопу мишени с высоким сродством и поэтому способны к связыванию циркулирующих абзимов, но также способны быть поглощенными и переваренными фагоцитными клетками, таким образом удаляя связанные абзимы из циркуляции.
Плазму пациента можно подвергнуть диализу через сорбенты или мембраны для специфического удаления абзимов из циркуляции, или плазму можно подвергнуть экстракорпоральной обработке химическими или физическими средствами для осуществления инактивации абзимов. Сорбент может, например, быть загружен специфическим эпитопом или хелатообразователем для специфического удаления абзимов из циркуляции путем использования экстракорпоральных систем диализа. В других вариантах осуществления сыворотку или плазму можно облучать экстракорпорально, как описано выше, чтобы инактивировать абзимы.
Специфические противомикробные средства, например противохламидийные бактерицидные аген
- 4 009661 ты, можно использовать для удаления окисляющих липиды антител из сосудистой системы путем устранения бактериальной инфекции из организма хозяина. Такие противомикробные средства могут также мобилизовать собственные механизмы гомеостаза тела для прекращения/блокировки/устранения производства окисляющих липиды антител. Примеры соответствующих противомикробных средств представлены в табл. 8.
Способ может включать сочетание одного или более из вышеупомянутых подходов, которые могут применяться к индивиду одновременно или последовательно. Например, активность окисления липидов антителами можно снижать или устранить, например, путем использования первого ингибитора, такого как антиоксидант, при одновременном или последовательном введении другого ингибитора, такого как хелатирующий металлы агент. Подходящие сочетания ингибиторов включают, как описано здесь, аспирин и азитромицин.
В альтернативном варианте одновременно или последовательно с антимикробным средством можно вводить ингибитор, такой как антиоксидант, чтобы снизить находящееся в циркуляции количество или уровень окисляющих липиды антител.
Комбинации агентов, специфически направленных против абзимов, таких как антихламидийные абзимы, можно, таким образом, использовать одновременно или последовательно для лечения атеросклеротического состояния. Точный выбор агентов, доз, продолжительности и других параметров может быть определен практикующим врачом в соответствии с индивидуальным случаем. Эта эффективность специфического лечения может быть определена для каждого индивидуального случая путем контроля изменений активности абзимов в сыворотке подвергнутых лечению пациентов при использовании описанных здесь способов.
В некоторых обстоятельствах продуцирование абзимов может быть вызвано в ответной реакции на патогенную инфекцию, при этом абзимы, произведенные против патогенов, вступают в перекрестную реакцию с антигенами организма хозяина и вызывают окисление липидов.
В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ лечения индивида, имеющего атеросклеротическое состояние, включающий введения индивиду двух или более агентов, выбранных из группы, состоящей из антиоксидантов, хелатирующих агентов и антимикробных соединений.
В одном из аспектов изобретения предложено использование антимикробного агента в производстве медикамента для использования в способе лечения атеросклеротического состояния индивида.
Подходящее антимикробное соединение может быть выбрано из группы, состоящей из эритромицина, рокситомицина, офлоксацина, клинафлоксацина, ципрофлоксацина, клиндамицина, азитромицина, доксициклина, миноциклина и тетрациклина.
Некоторые противомикробные соединения, включая азитромицин, как показано здесь, также ингибируют антитела, окисляющие липиды.
Предпочтительно противомикробные вещества вводят в сочетании с ингибитором абзимов, таким как антиоксидант или хелатирующий металлы агент.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения индивида, имеющего атеросклеротическое состояние, включающий введение индивиду двух или более агентов, выбранных из группы, состоящей из антиоксидантов, хелатирующих соединений и противомикробных соединений.
Подходящие антиоксиданты, хелатирующие соединения и противомикробные соединения описаны здесь в другом месте.
Способ может включать определение активности окисления липидов антителами образца, полученного от индивида до, во время и/или после указанного лечения.
Еще одним классом агентов, пригодных для снижения уровней абзимов, являются вакцины и иммунотерапевтические агенты на основе антигенов клетки хламидии. Введение вакцины, включающей клетки хламидии, как показано здесь, снижает или устраняет активность абзимов (см. табл. 10 - после вакцинации). Вакцины хламидии можно поэтому использовать для снижения содержания или устранения абзимов в сосудистой системе людей и животных, имеющих атеросклероз, или для блокирования производства абзимов.
В следующих аспектах настоящего изобретения предложена вакцина хламидии, в частности вакцина СЫатуФа рпеитошае, для использования в лечении атеросклеротического расстройства, причем способ лечения атеросклеротического расстройства включает введение вакцины хламидии индивиду, нуждающемуся в этом, и использование вакцины хламидии, как описано, при получении лекарства для использования при лечении атеросклеротического состояния.
Вакцина представляет собой невирулентный материал, включающий один или более антиген от патогена, такого как хламидия, в частности СЫатуФа рпеитошае, который стимулирует активный иммунитет индивида и защищает от инфекции этим патогеном или другими близкородственными патогенами.
Вакцина хламидии может представлять собой невирулентную клетку хламидии, в частности клетку СЫатуФа рпеитошае, например, убитую нагреванием или обработанную водным раствором формальдегида клетку хламидии или компонент, вытяжку или фракцию такой клетки. Ветеринарные вакцины хламидии известны в технике, и рецептуры на основе живых СЫатуФа ρδίΙΙηοί овцы в лиофилизованной форме являются коммерчески доступными (!п!егуе1).
- 5 009661
Подходящая вакцина хламидии, в частности вакцина С11атуб1а рпеитошае, может находиться в составе лекарственной (т.е. не ветеринарной) рецептуры. Такая рецептура пригодна для введения человеку.
Как описано выше, способы данного изобретения могут включать оценку индивида в отношении атеросклеротического расстройства до, во время и/или после лечения путем определения активности окисления липидов антителами образца, полученного от индивида. Активность окисления липида является показателем индивида, имеющего атеросклеротическое состояние и таким образом являющегося кандидатом для лечения в соответствии с предложенными способами.
Активность окисления липидов может быть определена путем испытания способности антитела из образца, полученного от индивида, к окислению липида. Например, антитело из серологического образца может быть захвачено с использованием иммобилизованного антиидиотипического антитела и определена активность захваченного антитела в отношении окисления липида.
Присутствие в образце антитела, которое окисляет липиды, является показателем индивида, имеющего атеросклеротическое расстройство или страдающего от него или имеющего риск появления такого расстройства в будущем. Такой индивид может быть подходящим образом подвергнут лечению с использованием описанных здесь способов. Количество, уровень или активность таких антител являются показателями серьезности расстройства, т.е. увеличенные количества и/или активность антител являются показателем увеличения серьезности расстройства. Таким образом могут быть определены наличие и/или серьезность атеросклеротического расстройства индивида.
Окисляющее липид антитело может связываться с антигеном хламидии.
Может быть определено связывание с антигеном хламидии молекулы антитела из образца, полученного от индивида и обладающего активностью окисления липидов (т.е. окисляющего липиды) или окисление липидов антителом, полученным от индивида, который связывается с антигеном хламидии. В альтернативном варианте может быть определено как связывание с антигеном хламидии, так и активность окисления липида молекулой антитела из образца, полученного от индивида.
Подходящий образец может представлять собой сыворотку, плазму, кровь или другой биологический образец, предпочтительно серологический или плазменный образец. Антитело или молекула антитела, как описано здесь, предпочтительно представляет собой молекулу 1дС.
Методика определения связывания не является признаком настоящего изобретения, и специалисты способны выбрать соответствующую методику в соответствии с их предпочтениями и общими знаниями.
Активность окисления липида, включая активность окисления липида в пероксидные соединения, может быть определена путем определения окисление липида организма хозяина (т.е. липида из образца), липида от инородного антигена типа клетки хламидии, или липида из другого источника, который может, например, быть добавлен в качестве части метода испытания.
Окисление липида может быть определено путем измерения накопления продуктов или побочных продуктов, таких как совместно окисленные репортерные молекулы или исчезновения или расхода субстратов, таких как немодифицированные липиды, или косубстратов, таких как кислород.
Много способов определения окисления липида в пероксидное соединение известны в технике и являются подходящими для использования в соответствии с настоящим изобретением. Точная методика определения окисления липида не является признаком настоящего изобретения, и специалисты способны выбрать подходящую методику в соответствии с их предпочтениями и общими знаниями.
Подходящие способы, например, описаны в СРС НапбЬоок ок Мебюбк ког Охудеп Рабюа1 Векеагсй (СРС Руководство по методам исследования радикала кислорода), СРС Ргекк, Воса РаЮп. Попба (1985), Охудеп Рабюа1к ίη Вю1одюа1 8ук1етк. МеИобк ίη Епгуто1оду, ν. 186, Асабетю Ргекк, Ьопбоп (1990); Охудеп Раб1са1к ш Вю1одюа1 8ук1етк. МеИобк ш Епгуто1оду, ν. 234, Асабетю Ргекк, 8ап О1едо, №\ν Уогк, Вок1оп, Ьопбоп (1994); и Егее Рабюа1к. А ргасбса1 арргоасй. ШЬ Ргекк, Охкогб, №\ν Уогк, Токуо (1996).
В предпочтительных вариантах осуществления окисление определяют путем определения образования (т. е. присутствия или количества) продукта окисления липида.
Могут быть определены продукты и/или интермедиаты окисления липидов, в которых было инициировано окисление, или могут быть определены продукты окисления и/или интермедиаты липидов, в которых распространяется окисление.
Соответствующие продукты окисления липидов могут включать альдегиды типа малонового диальдегида (МДА, МОА), перекиси (липида), диеновые соединения или газообразные углеводороды. Продукты окисления липидов могут быть определены любым подходящим способом. Например, продукты окисления липида до пероксидных соединений могут быть определены путем использования ВЭЖХ (Вготеп, Р.К., апб Ке11у, Е.1. 1п: Егее Рабюа1к. А ргасбса1 арргоасй. ШЬ Ргекк, Охкогб, №\ν Уогк, Токуо (1996), 119-131), УФ-спектроскопии (Кш1ег, М. ОнаШЦаОте апа1ук1к ок 4-11убгоху-2-попепа1. 1Ыб., 133145), или газовой хроматографии с масс-спектрометрией (Могготе, Ι.Ό., апб КоЬейк, Ь.1. Е2-1коргок1апек: ргок1ад1апбш-Пке ргобис!к ок Пр1б регох1ба!юп. 1Ь1б., 147-157).
Окисление липида в пероксидное соединение может приводить к окислению белков, углеводов, нуклеиновых кислот и других типов молекул. Продукты такого окисления также могут использоваться
- 6 009661 для косвенного измерения активности абзимов. Кроме того, окисление в пероксидное соединение может приводить к изменениям в свойствах репортерных молекул, связанным с распространяющимся окислением липида. Как описано ниже, репортерные молекулы могут быть инкапсулированы в этих липидах, например как липосомы, и высвобождение репортерной молекулы из липосомы является показателем окисления.
Соответствующие репортерные вещества и молекулы могут включать неповрежденные светящиеся бактерии, люминол, люцигенин Дисщешп), фолазин (рйо1акш) и люциферин. Такие вещества могут, например, быть соединены с молекулами, включающими НгОг/Ог’УОг, такими как пероксидаза, эстераза, оксидаза, люцифераза, каталаза, пероксид дисмутазы, перилен, ΝΑΌ+, и акридиниевые сложные эфиры бис(трихлорфенил)оксалата (СатрЬе11 А.К. Сйетбиттексепсе. УСН, ЕШк Нопгооб Иб.. Епд1апб, 1988).
Другие материалы, восприимчивые к свободнорадикальным цепным реакциям, также можно использовать для определения окисления липида. Например, окисление липида в пероксидные соединения, как цепной процесс, инициирует и ускоряет полимеризацию акриламида. Таким образом, окисление липида может быть определено путем определения сополимеризации 14С-акриламида (Козлов Ю.П. (1968) «Роль свободных радикалов в нормальных и патологических процессах». Докторская диссертация. МГУ, Москва, 1968).
Так как окисление липидов и липопротеинов в пероксидные соединения является процессом, протекающим с участием свободных радикалов, содержание абзимов, окисляющих липиды, может быть измерено путем обнаружения этих радикалов. Радикалы могут быть обнаружены или определены путем использования внутренней низкоуровневой хемилюминесценции (с использованием сенсибилизаторов или без них) (Владимиров В. А. и Аршаков А.И. Окисление липидов в пероксидные соединения в биологических мембранах. Наука, Москва (1972); У1аб1т1гоу, Υ.Α. 1Щгш8к 1о\\'-1еуе1 сйетбитшексепсе. 1п: Егее Вабкак. Α ргасйса1 арргоасй. 1ВЬ Ргекк, ОхГогб, №\ν Υо^к, Токуо (1996), 65-82), электронного парамагнитного резонанса (со спиновыми ловушками (Макоп, В.Р. Ιη уйго апб ίη у1уо бе!есбоп оГ Ггее габ1са1 те1аЬо1йе8 χνίΐΐι е1ес!гоп крш гекопапсе. 1п: Егее Вабкак. Α ргасйса1 арргоасй. 1ВЬ Ргекк, ОхГогб, №\ν Υо^к, Токуо (1996), 11-24) или без спиновых ловушек (Петяев М.М. Биофизические подходы в диагностике рака. Медицина, Москва (1972)) или другими способами, известными в технике. Окисление липидов также может быть определено путем определения расхода жирных кислот или других субстратов этой реакции.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения определяют образование малонового диальдегида (МДА) с помощью реакции с 1 тМ 2-тиобарбитуровой кислоты путем определения поглощения при 525 нм.
Липид, подвергаемый окислению антихламидийным абзимом, может включать липидную часть липопротеина, жирной кислоты, фосфолипида, холестерина, сложного эфира холестерина или триглицерида. Как описано выше, активность окисления липида абзимом может также приводить к окислению белка (протеина), углевода и/или нуклеиновой кислоты, например белковой и/или углеводной части липопротеина.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления определяют окисление липида хламидии, потому что это предусматривает удобный одностадийный анализ, который можно использовать для определения, например, присутствия или отсутствия антихламидийного абзима. Окисление липида хламидии происходит в присутствии специфического к Сй1атуб1а антитела, который связывает и окисляет антиген хламидии, включающий липид.
Атеросклеротическое состояние в индивиде может быть оценено путем контактирования образца, полученного от индивида, с антигеном клетки хламидии, и определения окисления липида в указанном образце.
Определение окисления липида может включать определение количества, уровня или степени окисления, которое вызвано контактом с антигеном Сй1атуб1а. Предпочтительно, антиген клетки хламидии представляет собой антиген липида, и определяют окисление антигена липида.
Антиген может быть очищен и/или изолирован или, более предпочтительно, он может быть включен в клетку хламидии. Атеросклеротическое состояние индивида можно, таким образом, оценить путем контактирования образца, полученного от индивида, с клеткой хламидии, и определение окисления липида указанной клетки.
Окисление липида, например в образце, в присутствии клетки или антигена хламидии можно сравнивать с окислением липида в отсутствие клетки или антигена хламидии. Увеличение окисления липида является показателем присутствия антилипидного абзима.
Окисление липида/липопротеина в пероксидные соединения представляет собой цепную свободнорадикальную реакцию и способно к самораспространению от одной молекулы к другой, к содержащей липид мицелле или к целой клетке (после присоединения к ее мембране через рецепторы или неспецифическую абсорбцию) (Сйетка1 апб Вюсйетка1 Α8ресΐ8 оГ 8ирегох1бе апб 8ирегох1бе Октийке. Е1кеукг/№г1й-Но11апб, №\ν Υо^к, Лтк1егбат (1980); Ыр1б Регох1бек т Вю1оду апб Мебкше. Лсабетю Ргекк, Ог1апбо, 8ап Эк^о, 8ап Егапсксо, №\ν Υо^к, Ьопбоп (1982); На1йте11, В., апб Сийепбде, 1.М.С. Егее Ваб1са1к ш Вю1оду апб Мебкше. С1агепбоп Ргекк. ОхГогб (1996); Ох1бапк, Αηΐ^оx^баηΐ8, апб Егее Вабкак.
- 7 009661
Тау1ог апб Ргапск. №а§Ыпд1оп (1997)).
В некоторых вариантах выполнения описанных здесь способов распространение окисления в пероксидные соединения используется для облегчения обнаружения абзимов. окисляющих липиды.
Например. микроконтейнер. такой как липосома. пузырек или микрокапсула. которая имеет мембрану из материала. восприимчивого к свободнорадикальному разложению. например фосфолипидную мембрану. может быть нагружена красителем. флуорохромом или другим репортерным веществом или индикаторным материалом. например таким как эозин. флуорескамин (Р1иоге8сатте). родамин В или малахитовая зелень. и использована для обнаружения окисляющего липид абзима. Таким образом. окисление липида в описанных здесь способах может быть определено путем определения высвобождения инкапсулированного репортерного вещества.
Нагруженный микроконтейнер может быть смешан с образцом плазмы или сыворотки. Затем к смеси добавляют антиген хламидии. преимущественно включенный в клетку хламидии или в ее часть. После этого любые окисляющие липид абзимы в образце связываются с антигеном и инициируют окисление в пероксидные соединения.
Атеросклеротическое состояние может быть оценено путем контактирования образца. полученного от индивида. с антигеном клетки хламидии в присутствии микроконтейнера. восприимчивого к окислению липида и содержащему репортерное вещество. и определения высвобождения указанного репортерного вещества из микроконтейнера.
Инициирование окисления липида/липопротеина путем взаимодействия антигена хламидии с абзимом будет самораспространяться и охватывать покрытие микроконтейнера. Это повреждает покрытие и вызывает высвобождение репортерного вещества в окружающий раствор. Затем обнаруживают это высвобождение.
Если интенсивность сигнала. произведенного высвобождением репортера. недостаточна для получения регистрируемого или обнаруживаемого сигнала. в реакционную смесь может быть включен агент распространения свободных радикалов или сенсибилизатор. например свободные ионы и комплексы Ре2+/Со+ или других металлов кратковременной валентности. Эти и другие сенсибилизаторы служат для размножения количества свободных радикалов в системе.
Высвобождение инкорпорированного материала из микроконтейнера ведет к изменениям в физических/химических свойствах реакционной смеси. которые могут быть зарегистрированы визуально (или другими обычными средствами). Альтернативно. поврежденные/фрагментированные/растворенные микроконтейнеры могут быть отделены от немодифицированных активным центрифугированием или пассивной седиментацией.
Вместо липосом или других микроконтейнеров (нагруженных репортерными веществами) в качестве цели для распространения окисления липидов/липопротеинов в пероксидные соединения. вызванного антилипидными абзимами. могут использоваться эритроциты от самой пробы крови. Бактерии или антигены хламидии можно вводить или приводить в контакт с пробой крови. возможно в присутствии сенсибилизатора. для обеспечения распространения реакции окисления в пероксидные соединения. Окисление липида можно определять путем определения гемолиза эритроцитов в пробе крови.
Любое инициирование окисления липида/липопротеина взаимодействием антигена хламидии с абзимом в образце приведет к самораспространению и распространению на мембрану клетки эритроцита. приводя к повреждению и в конечном счете лизису (растворению) клетки. Появление гемолиза в образце цельной крови в качестве реакции на добавление бактерий/антигенов СЫатуб1а поэтому является показателем присутствия окисляющих липиды абзимов. Гемолиз может быть определен любым подходящим способом.
Атеросклеротическое состояние может быть оценено путем контактирования образца. получаемого от индивида и включающего эритроциты с антигеном клетки хламидии. и определения гемолиза указанных эритроцитов.
Липосомы или другие микроконтейнеры могут быть нагружены. например. веществом. который может проявлять цвет. отличающийся от красного цвета гемоглобина. В альтернативном варианте центрифугирование исследуемых образцов или даже пассивная седиментация позволяет отделить неповрежденные микроконтейнеры/эритроциты. Высвобождение репортерного красителя или гемолиз являются показателями присутствия окисляющих липиды антител в анализируемом материале. Интенсивность сигнала коррелирует с их активностью/концентрацией.
Так как цельная кровь может быть проанализирована с использованием описанных выше способов. они не включают операцию центрифугирования и могут использоваться вне лаборатории или в домашних условиях. Присутствие или серьезность атеросклероза можно. например. определить путем сравнения наблюдаемого репортерного сигнала или гемолиза с известными значениями для пациентов. страдающих атеросклерозом. и нормальных индивидов. Такое сравнение может быть выполнено с использованием диаграммы. шкалы. графика или калибровки. которая указывает количество или уровень репортерного сигнала или гемолиза при конкретных стадиях или степени серьезности атеросклероза.
Окисление липида в пероксидные соединения является окислительно-восстановительным процессом. который также может быть измерен путем использования объединенной окислительно
- 8 009661 восстановительной системы (редокс-системы). Соответствующие редокс-системы включают физические и химические системы. Например, сенсорный чип можно использовать для обнаружения изменений в редокс-потенциале связанной с ним реакции окисления липида. Ряд сенсорных чипов на основе редоксферментов или редокс-медиаторов известен в технике. Оба эти типа сенсоров можно приспособить/использовать для обнаружения связанных с ними молекул свободных радикалов или редоксмолекул (На11 Е.А.Н. Вювеивогв. Рс6\уоо6 Ргевв Ы6., Сгеа1 Вгйаш, 1990).
Накопление Н2О2, произведенного окислением липида в перекисные соединения, может быть измерено, например, путем добавления связанной с ним реакции на основе пероксидазы, в которой пероксид водорода будет использоваться для окисления другого ее субстрата (субстратов) и производить окрашенный продукт. Накопление О2*-, произведенного окислением липида в пероксидные соединения, может быть определено путем использования О2*--чувствительных молекул типа цитохрома С или рибофлавина (витамина В2).
В альтернативном варианте при окислении липида в пероксидные соединения расходуется молекулярный кислород, и, следовательно, можно использовать любую О2-зависимую химическую реакцию или физический процесс, например, кислородный электрод или полярографию. (Ро1агодгарйу. Е6. Ко1(НоГГ Ι.Μ., Ыидаие 1.1. 1п1ег8с1еисе РиЫййега, Ыете Уогк, Ьоибои, 19520.)
Аспекты настоящего изобретения далее будут проиллюстрированы со ссылками на сопутствующие фигуры чертежей, описанные выше, и пояснены нижеприведенными экспериментальными примерами и таблицами, предназначенными для иллюстрации, но не налагающими ограничений. Дальнейшие аспекты и варианты выполнения будут очевидны для специалистов.
Все документы, упомянутые в данном описании, включены в него путем ссылки.
На фиг. 1 представлены результаты реакции агглютинации между 100:1 СЫашуШа овцы и 1дС, экстрагируемым из атеросклеротического повреждения человека.
На фиг. 2 представлена зависимость окисления СЫашуШа овцы в пероксидные соединения от концентрации 1дС атеросклеротического повреждения человека. Концентрация СЫашуШа была постоянной, рН составлял 5,7.
На фиг. 3 представлена зависимость кинетики Михаэлиса-Ментена (МюйаеШ-Мейеи) окисления липида в пероксидные соединения в СЫашуШа овцы с 1,8 мкг 1дС из атеросклеротического повреждения человека; кажущееся КМ=13,3-16,1 на 1 мкл суспензии СЫашуШа; рН 5,7.
На фиг. 4 показано влияние добавления суспензии СЫашуШа овцы на окисление липида в пероксидное соединение в сыворотке человека. 10 мкл бактериальной суспензии было добавлено к 990 мкл разбавленной 1:1 сыворотки; рН 5,7; все смешанные образцы были подвергнуты инкубации при 37°С в течение 18 ч (номера сывороток - те же, что в табл. 5).
На фиг. 5 показана корреляция между степенью стеноза коронарной артерии и активностью окисляющих липиды антихламидийных антител у пациентов, страдающих ИБС. Серьезность стеноза представлена в значениях шкалы, которая была рассчитана как интегральный параметр стеноза коронарных артерий, оцениваемых с помощью ангиографии.
На фиг. 6 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и концентрации триглицеридов в сыворотке пациента, страдающего ИБС.
На фиг. 7 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и общей концентрацией холестерина в сыворотке пациента, страдающего ИБС.
На фиг. 8 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и концентрацией ΕΌΕ-холестерина в сыворотке пациента, страдающего ИБС.
На фиг. 9 показана корреляция между степенью стеноза мозговой артерии и активностью окисляющих липиды антихламидиевых антител в сыворотке пациента, страдающего ишемической церебральной болезнью (ИЦБ). Серьезность стеноза представлена в значениях шкалы, которая была рассчитана как интегральный параметр стеноза мозговых артерий, оцениваемых с помощью ангиографии.
На фиг. 10 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и концентрацией триглицеридов в сыворотке пациента, страдающего ишемической церебральной болезнью (ИЦБ).
На фиг. 11 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и общей концентрацией холестерина в сыворотке пациента, страдающего ишемической церебральной болезнью (ИЦБ).
На фиг. 12 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и концентрацией ΕΌΕ-холестерина в сыворотке пациента, страдающего ишемической церебральной болезнью (ИЦБ).
На фиг. 13 представлена перекрестная реакция антител антиаполипопротеина В с СЫашуШа.
На фиг. 14 показано влияние инактивации абзима на свертывание крови.
Табл. 1 содержит данные, показывающие влияние ЦС фракции, которую извлекают из атеросклеротического повреждения человека на окисление в перекисное соединение липида бактерий СЫашуШа; рН 5,7; все измерения сделаны трехкратно.
Табл. 2 содержит данные, показывающие способность к перекрестной реакции для повреждения 1дС между липопротеинами сыворотки человека и вытяжкой СЫашуШа ряИащ овцы.
Табл. 3 содержит данные, показывающие влияние СЫашуШа кошки на окисление в пероксидные
- 9 009661 соединения липида в сыворотке человека; все измерения сделаны трехкратно.
Табл. 4 содержит данные, показывающие роль 1§С в инициировании окисления липида в пероксидное соединение СЫатуЛа овцы в плазме человека; все измерения сделаны трехкратно.
Табл. 5 содержит данные, показывающие влияние добавления СЫатуЛа овцы в контрольную сыворотку и в сыворотку пациентов с клиническими осложнениями атеросклероза.
В табл. 6 показано ингибирование активности окисления липида атеросклеротического повреждения 1дО с помощью ингибиторов-антиоксидантов.
В табл. 7 представлены примеры хелатирующих металлы агентов, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
В табл. 8 представлены примеры противомикробных веществ, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
В табл. 9 представлены примеры антиоксидантов, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
В табл. 10 представлены уровни окисляющих липиды антихламидийных антител в здоровой и инфицированной овце (числа в скобках представляют % увеличения/уменьшения по отношению к контрольным).
В табл. 11 показано ингибирование абзимов при использовании хелатирующих металлы агентов.
В табл. 12 показано ингибирование ίη νίΐτο активности абзима при использовании хелатирующих металл агентов.
В табл. 13 показано влияние аспирина на активность антихламидийных абзимов у пациентов с коронарной болезнью сердца.
В табл. 14 показано влияние аспирина на активность антихламидийных абзимов у пациентов с немой ишемией миокарда.
В табл. 15 показана активность абзимов у пациентов, подвергнутых лечению антимикробным агентом.
В табл. 16 показана активность абзимов у пациентов, подвергнутых ежедневному лечению антимикробным агентом совместно с аспирином.
В табл. 17 показано клиническое состояние пациентов, подвергнутых лечению только антимикробным агентом.
В табл. 18 показаны средние уровни абзима в группах индивидов, страдающих от состояний, связанных с атеросклерозом.
В табл. 19 показаны индивидуальные уровни абзимов у пациентов, страдающих от стенокардии и подвергнутых подвергнутых подвергнутых лечению лечению лечению получавших или не получавших аспирин.
В табл. 20 показана индукция абзимов у кроликов, инокулированных СЫатуб1а.
В табл. 21 показано влияние обработанной формалином хламидии (СЫатуб1а) на кроликов, имеющих индуцированные абзимы.
В табл. 22 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов, азитромицином, 500 мг ежедневно (терапия группы А).
В табл. 23 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов, азитромицином, 500 мг, плюс аспирин, 250 мг, ежедневно (терапия группы В).
В табл. 24 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов, азитромицином, 500 мг ежедневно плюс антиоксиданты (терапия группы С).
В табл. 25 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов терапии группы Ό, подвергнутых лечению аспирином, 250 мг ежедневно (терапия группы Ό).
В табл. 26 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов контрольной группы.
В табл. 27 показаны сводные результаты антиабзимной терапии.
В табл. 28 показана оценка тяжести стенокардии (апдша ресЮгь) с помощью модифицированной анкеты Роуза-Блэкберна (Ко8е-В1аскЬит) до и после лечения.
В табл. 29 показаны подсчеты абзимов и результатов теста Роуза-Блэкберна до и после лечения пациентов с ИБС, показавших отрицательную реакцию на наличие антихламидийного 1дС.
В табл. 30 показаны ингибиторные свойства азитромицина при воздействии на абзимы.
В табл. 31 показано влияние различных лекарств на активность антихламидийного абзима.
В табл. 32 показано влияние антиабзимной терапии на тромбоз и свертывание крови.
Эксперименты
Материалы и методы.
Образцы.
Использовались по 3 образца сыворотки от 22 пациентов с клиническими осложнениями атеросклероза, показанных к операциям шунтирования коронарной артерии и брюшной аорты в Центре сердечнососудистой хирургии Клинического Госпиталя № 1 в Ростове-на-Дону, Россия.
Из этих пациентов 20 были мужчины и 2 женщины, в возрасте от 47 до 66 лет. Один из этих пациентов, номер 6/6а, имел острый инфаркт миокарда в момент испытания, и следовательно, данные этого пациента не были включены в некоторые окончательные вычисления. Контрольная группа включала
- 10 009661 клинически здоровых добровольцев, 5 из которых были мужчины и 5 женщины, в возрасте от 40 до 55 лет.
Части атером брюшной аорты от 7 из этих пациентов были использованы для извлечения фракции 1дС с использованием в качестве сорбента белка А, как описано ниже.
Экстракция 1дС из атеросклеротического повреждения.
Части аорты (массой во влажном состоянии приблизительно 200-400 мг) были разрезаны на части приблизительно 10 мг каждая, помещены в 5,0 мл РВ8 с 1% неионным ПАВ 1дера1 СА-630 и гомогенизированы механическим гомогенизатором (ийта-Титтах) на полной мощности с 15 мм зондом три раза по 3 секунды каждый, с 20-секундными интервалами охлаждения. После гомогенизации нерастворимые компоненты были отделены центрифугированием при 5000 д в течение 10 мин, и надосадочные жидкости были использованы для анализа.
Надосадочную жидкость обрабатывали белком А, присоединенным к поперечносшитой 4% гранулированной агарозе при 37°С в течение 30 мин. Фракцию иммуноглобулина, присоединенную к гранулам, затем подвергали вращению при 5000д в течение 10 мин и декантировали надосадочную жидкость. Чтобы удалить любые липопротеины, присоединенные к осажденным иммуноглобулинам, образцы были снова суспендированы с помощью 10% 1дера1 СА-630. Затем их подвергали центрифугированию при 5000д в течение 10 мин, и надосадочную жидкость декантировали.
Для удаления ПАВ осуществляли три последовательных промывки в избытке фосфатного буфера с центрифугированием в том же режиме. Удаление липопротеина из фракции иммуноглобулина было подтверждено отсутствием холестерина в этой фракции.
Определение антихламидиевых абзимов.
Кровь была отобрана из локтевой вены утром после голодания в течение ночи, сыворотка была отделена и заморожена при -20°С до испытания.
Присутствие антихламидийных антител было измерено в реакции агглютинации (свертывания) с клетками СЫашуФа овцы и путем анализов методом ЕЬ18А (на основе рекомбинантного антигена).
Для реакции агглютинации постепенные разбавления исследуемой сыворотки были инкубированы 106 живых клеток СЫашуФа овцы в течение 24 ч при 37°С. Появление агрегатов было обнаружено и оценено при 700 нм. Анализ методом ЕЫ8А выполнен в соответствии с инструкциями изготовителя (Мебас).
Титр > 1:64 рассматривался как сероположительный.
Определение окисления липидов в пероксидные соединения.
Окисление липида в пероксидные соединения оценивали по уровню концентрации МДА, которая была измерена спектрофотометрическим методом [Отарет, Н.Н. е! а1. Етее Каб1с. Вю1. Меб. (1993) 15, 353]. Этот метод основан на образовании окрашенного продукта при взаимодействии малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой.
Реакционная способность в перекрестной реакции между липопротеинами сыворотки и СЫашуб1а.
1дС фракцию, включающую антихламидийные абзимы, экстрагировали из атеросклеротического повреждения человека, как описано выше. 100 мкл этой фракции (содержащей 1 мкг/мл) был предварительно инокулирован 890 мкл цельной или обезжиренной сыворотки от здорового донора в течение 1 ч в 37°С; рН 5,7.
Липопротеины (и связанный материал) были удалены из сыворотки путем препаративного ультрацентрифугирования в растворе КВг в соответствии с ранее описанным методом [Науе1 К.1. е! а1. 1. Сйи. 1п\еМ. (1955) 34, 1345-1353.22].
Затем к сыворотке добавили 10 клеток Сй1атуб1а рыйаа (1и1етуе1) в 10 мкл объеме. Степень окисления, индуцированного контактом с клетками хламидии, определяли с использованием описанного выше метода.
В присутствии связывания между антихламидийными абзимами и липопротеинами плазмы не наблюдается никакого дополнительного окисления при контакте с клетками хламидии, поскольку антихламидийные абзимы удалены путем ультрацентрифугирования.
В отсутствие связывания между антихламидийными абзимами и липопротеинами плазмы наблюдается окисление при контакте плазмы с клетками хламидии, потому что антихламидийные абзимы все еще присутствуют в образце.
Анализ антихламидийных абзимов.
При анализе антихламидийных абзимов использовали следующие реактивы:
1) живые Сй1атуб1а овцы (лиофилизованная форма);
2) РВ8 (для растворения бактерий);
3) 0,05М ацетатный буфер, рН 4,0;
4) 40% трихлоруксусная кислота;
5) 1 мМ 2-тиобарбитуровая кислота.
Присутствие или количество каталитических антихламидийных антител в образце было установлено следующим образом.
1. Образцы исследуемой сыворотки разбавили 1:1 0,05М ацетатным буфером с рН 4,0, чтобы ко
- 11 009661 нечная величина рН этих образцов составляла 5,6-5,8.
2. 990 мкл разбавленной сыворотки смешивали с 10 мкл коммерческой вакцины живой СЫатуШа овцы.
3. Образцы затем инкубировали в течение ночи (12-16 ч) при 37°С.
4. К каждому образцу добавляли 250 мкл 40% трихлоруксусной кислоты и 250 мкл 1 мкМ 2тиобарбитуровой кислоты.
5. Все образцы помещали в водяную баню и кипятили 30 мин.
6. Образцы охлаждали и центрифугировали при 3000д в течение 10 мин.
7. Надосадочные жидкости собирали и измеряли их поглощение при λ=525 нм для определения концентрации малоновых диальдегидов (МДА, ΜΌΑ), которые являются продуктами окисления липида в пероксидные соединения.
Результаты
Пример 1.
1дО экстрагировали из атеросклеротического повреждения пациента с использованием метода, описанного выше. Было установлено, что в этой фракции 1дО присутствуют антихламидийные антитела (фиг. 1).
Была определена способность извлеченной фракции 1дО окислять липид. Показано, что фракция 1дО вызывает окисление в пероксидные соединения липидов штаммов СЫатуШа рвй1ас1, полученных как от кошек, так и от овец (табл. 1). Кинетический анализ этой реакции окисления в пероксидные соединения показал, что реакция имела ферментативный характер (фиг. 2, 3). Бактерию хламидии можно поэтому рассматривать как субстрат для их антител, извлекаемых из атеросклеротического повреждения человека.
Эпитопы для антихламидийных абзимов были далее исследованы с использованием неионных ПАВ. Обработка СЫатуШа средствами Тгйои Х-100 или 1дера1 СА-630 предотвращает окисление липидов в бактериях экстрагированными абзимами. Подобные результаты были получены и при обработке липопротеинов низкой плотности сыворотки крови человека.
Это дает указание на то, что эпитопы для каталитических антител являются конформационными, и/или целостность антигена важна для инициирования окисления липидов как в липопротеинах, так и в СЫатуШа.
Затем была определена способность антихламидийных абзимов вступать в перекрестную реакцию с липопротеинами плазмы. 1дО, экстрагированный из атеросклеротического повреждения, был предварительно инкубирован с сывороткой пациента, чтобы позволить антилипопротеиновым антителам в экстракте взаимодействовать с немодифицированными липопротеинами. Затем липопротеины и связанные с ними антитела были удалены ультрацентрифугированием.
Было установлено, что каталитические антихламидийные антитела были удалены с липопротеином (табл. 2). Это показывает, что каталитические антихламидийные антитела вступают в перекрестные реакции как с липопротеинами сыворотки, так и с бактериями штаммов СЫатуШа овцы.
Далее было исследовано присутствие антихламидийных антител в сыворотке пациентов, страдающих атеросклерозом. Наблюдалось, что добавление СЫашуШа овцы к сыворотке пациентов вызывает увеличение окисления липидов в пероксидные соединения в пределах образца. Подобный же эффект наблюдали со штаммом СЫатуШа кошки (табл. 3).
Наблюдаемые эффекты были следствием присутствия окисляющих липиды антихламидийных антител во фракции 1дО сыворотки пациента (табл. 4). Поэтому наблюдали, что каталитические антитела из сыворотки пациентов, страдающих атеросклерозом, вступают в перекрестную реакцию как с липопротеинами, так и с СЫатуШа овцы.
Корреляционный анализ концентрации антихламидийных и антилипопротеиновых антител в сыворотке человека показал, что оба эти параметра имеют статистически значимую положительную корреляцию с высоким коэффициентом корреляции 0,82. Это дополнительно указывает на то, что одно и то же антитело обладает обоими видами связывающей активности.
При исследованиях пациентов, страдающих атеросклерозом, с использованием метода анализа, описанного выше, каталитические антихламидийные антитела были найдены у 81% пациентов с клиническими осложнениями атеросклероза и только у 10% из контрольной группы (фиг. 4, табл. 5). Это показывает, что данные антитела являются патогенным маркером этой болезни.
Это исследование впервые демонстрирует существование антилипидных/липопротеиновых абзимов в биологических системах. Их появление при атеросклерозе, но не в норме, указывает, что эти абзимы играют важную роль в патогенезе этой болезни и ее осложнений. Оно также может установить взаимосвязь таких основных биохимических/иммунологических расстройств, как активация окисления липида в пероксидные соединения, появление антилипопротеиновых антител и хламидийная инфекция, причем все они вовлекаются в развитие атеросклероза.
Присутствие в плазме индивида окисляющих липиды антихламидийных антител указывает на то, что уже начались патологические изменения, характерные для этого заболевания. Так как эти абзимы ответствены за окисление липида/липопротеина, и этот процесс обычно коррелирует со степе
- 12 009661 нью/интенсивностью генерализации атеросклероза, то уровень/активность антилипидных абзимов отражает тяжесть этого заболевания.
Изменения в профиле липопротеина и повышение общего холестерина в плазме/сыворотке являются единственными специфическими факторами риска, установленными для атеросклероза. Однако эти изменения могут быть обнаружены только у 10-15% всех пациентов с клиническими осложнениями этой болезни. Обнаружение окисляющего липиды антихламидийного антитела является вторым специфичным маркером атеросклероза, но имеет намного более высокое диагностическое значение, чем измерение описанных выше параметров липида.
Приведенные здесь способы поэтому являются широко применимыми в диагностике и профилактике атеросклероза и связанных с ним состояний.
Пример 2. Ингибирование окисления липида в пероксидные соединения.
Образцы для испытаний, полученные от человека.
Антитела экстрагировали из обширных атеросклеротических повреждений аорты человека, отобранных у четырех пациентов-мужчин, возрастной диапазон 53-64 года, в ходе операции шунтирования стеноза брюшной аорты в Центре Сердечно-сосудистой хирургии клинического госпиталя №1 в Ростовена-Дону, России. После отбора эти образцы немедленно помещали в 30% (мас./об.) раствор ИаС1 и выдерживали при 0-4°С в течение 1-2 недель до начала испытаний.
В контрольных экспериментах было показано, что в течение этого периода активность таких ферментов как трипсин, каталаза, перекись дисмутазы, глутатион-пероксидаза, креатинкиназа и лактатдегидрогеназа, наряду с уровнем фрагментации иммуноглобулина (1дО) и степенью окисления липида в пероксидные соединения (концентрация малоновых альдегидов) в значительной мере не изменялись.
Части аорты (влажной массой приблизительно 200-400 мг) были разрезаны на части приблизительно 10 мг каждая, помещены в 5,0 мл РВ8 с 1% неионным ПАВ 1дера1 СА-630 и гомогенизированы механическим гомогенизатором (ЦЦта-Тигтах) при полной мощности с 15 мм зондом три раза по 3 секунды каждый с 20-секундными интервалами охлаждения. После гомогенизации нерастворимые компоненты были отделены центрифугированием при 5000д в течение 10 мин, и надосадочные жидкости использовали для анализа.
Экстракция антител.
Антитела экстрагировали и анализировали отдельно от повреждений из четырех частей брюшной аорты, полученных от четырех различных пациентов.
Первой стадией была обработка надосадочной жидкости белком А, присоединенным к поперечносшитой 4% гранулированной агарозе, при 37°С в течение 30 мин. После этого фракцию иммуноглобулина, присоединенную к гранулам, подвергали вращению при 5000д в течение 10 мин. Надосадочную жидкость декантировали. С целью удаления любых липопротеинов, присоединенных к осажденным иммуноглобулинам, образцы были вновь суспендированы с помощью 10% 1дера1 СА-630. Затем их центрифугировали при 5000д в течение 10 мин, и надосадочная жидкость была декантирована. Для удаления ПАВ выполняли три последовательных промывки в избытке фосфатного буфера с центрифугированием в том же режиме. Удаление липопротеина из фракции иммуноглобулина было подтверждено отсутствием в этой фракции холестерина.
Липопротеины.
Липопротеины низкой плотности (ЛНП, ЬОЬ) с 6=1,030-1,050 были получены из плазмы здоровых доноров последовательным препаративным ультрацентрифугированием в растворе КВг в соответствии с ранее описанным методом [Науе1 В.1. е! а1. 1. Сйи. 1иуек!. (1955) 34, 1345-1353]. ЬПЬ в этих препаратах может быть уже связан с иммуноглобулинами плазмы.
Эти иммуноглобулины могут потенциально препятствовать реакции между ЬОЬ и их антителами, присоединенными к белку А, или могут быть связаны самим этим белком. Во избежание этих возможных артефактов, перед титрованием липопротеинов антителами повреждения при исследованиях сродства было важно удалять ЬОЬ с присоединенным антителом, используя количество гранул белка А с агарозой, соответствующее насыщению.
Чтобы определить уровень ЬОЬ (выраженный в виде концентрации холестерина), калибровочную кривую проводили для каждой новой партии липопротеинов и в течение каждого нового эксперимента.
Окисление ЬОЬ в пероксидные соединения с помощью 1дС из повреждения.
Образцы ЬОЬ с исследуемыми антиоксидантами или без них (контрольные опыты) были инкубированы с 1дС из повреждений в течение 16 ч при 37°С и при рН 5,6. Степень окисления липида в перекисные соединения, выраженная в виде концентрации малонового диальдегида (МДА, МЭА), была измерена согласно следующей процедуре. К 1,0 мл каждого образца были добавлены 250 мкл 40% трихлоруксусной кислоты и 250 мкл 1 мМ 2-тиобарбитуровой кислоты. После кипячения образцов в водяной бане в течение 30 мин их охлаждали и центрифугировали при 3000д в течение 10 мин. Надосадочные жидкости собирали и измеряли их поглощение при λ=525 нм.
Результаты этого эксперимента представлены в табл. 6.
Установлено, что ряд ингибиторов, обладающих активностью антиоксиданта, снижают активность окисления липидов антителами, выделенными из атеросклеротических бляшек, до величин ниже предела
- 13 009661 обнаружения в этом анализе. Поэтому все эти соединения ингибируют активность окисляющего липиды антитела.
Выделенные абзимы испытывали ίη νίίτο в отношении каталитической активности, как описано здесь, в присутствии различных ингибиторов-антиоксидантов следующих классов:
агенты, хелатирующие железо (Ее2+) - тетрациклин;
агенты, хелатирующие медь (Си2+) - ЭЭС, аспирин и пеницилламин (решсШатше);
общие агенты, хелатирующие металлы - СЫ-, N3, ΌΤΡΑ (хелатирует только свободные ионы) и пиколиновая кислота.
Результаты представлены в табл. 11.
Эти результаты показывают, что ингибирование абзима происходит путем хелатирования меди, а не хелатирования железа. Показано, что три отдельных агента, хелатирующих медь, блокируют активность, и эти результаты позволяют предположить, что абзимы контактируют со связанным ионом меди как каталитическим центром.
Пример 3. Клинический пример снижения активности окисления липидов у антихламидийных антител.
Пациент - А.М.П., белый мужчина, возраст 43 года, имел клинические признаки, похожие на ранние стадии стенокардии с жалобами на кратковременные неспровоцированные боли в груди в сочетании с одышкой. Однако ЭКГ не обнаруживала никаких патологических изменений в сердце.
Результаты испытания крови 27 декабря 2000 г. установили нормальные уровни общего холестерина и ЬПЬ-холестерина; каждый из титров антихламидийных антител 1дС и 1дА составил 1:б4 (ЕЬ18А, Мейас). Однако были обнаружены окисляющие липиды антихламидийные абзимы, и их активность составила 32 мкМ МЭА (среднее число по трем измерениям) в 1 мл его сыворотки.
Было рекомендовано следующее ежедневное лечение курсом в течение трех месяцев: тетрациклина гидрохлорид 500 мг в сочетании с коктейлем антиоксидантов - витамин Е 20 мг, витамин А 1,5 мг, витамин Вб 3,2 мг, аскорбиновая кислота 180 мг, глюконат цинка 30 мг, Ь-селенометионин 100 мкг.
Через три месяца после начала терапии жалобы на боли в груди и одышку исчезли. В конце марта, по окончании лечения и почти точно через 3 месяца после начала лечения, анализ сыворотки пациента не показал никаких изменений в титрах антихламидийных антител 1дС и 1дА (1:б4 (ЕЫ8А, Мейас)). В то же время присутствие антихламидийных абзимов обнаружено не было.
Двумя неделями позже исследование повторили с тем же результатом.
Пример 4. Влияние СЬ1атуй1а овцы на окисление в перекисное соединение липида сыворотки крови овец.
Овец подвергали вакцинированию клетками хламидии с использованием стандартных методик и исследовали на активность абзима. Результаты представлены в табл. 10.
Перед вакцинацией овцы были свободны от болезней и здоровы и не показали никаких значительных изменений между уровнями анализов с хламидиями и без них.
После вакцинации овцы показывали очень высокие уровни антихламидийных антител, но незначительные или нулевые уровни абзимов.
После аборта (самопроизвольного типа) - представлены овцы с хламидийной болезнью, у которых произошел выкидыш ввиду закупорки сосудистой системы в матке: у них уровень активности абзима, подтвержденный добавлением СЬ1атуй1а, значительно выше, чем без СЬ1атуй1а.
Эти результаты показывают, что введение хламидийной вакцины может снижать или предотвращать производство окисляющих липиды антител.
Пример 5. Связь активности абзима и стеноза артерий.
Была исследована активность окисляющих липиды антихламидийных антител и степень артериального стеноза в двух различных клинических группах. Первой была группа пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС, ΙΗΌ), а второй - группа пациентов с ишемической церебрально-васкулярной болезнью (ИЦБ, 1СБ).
Стеноз коронарной артерии.
Предварительные результаты испытания показали положительную и значимую корреляцию между активностью антихламидийных абзимов и серьезностью стеноза коронарных артерий пациентов с ИБС (фиг. 5).
Не наблюдалось связи между степенью коронарного стеноза и такими липидами сыворотки, как триглицериды, общий холестерин и холестерин липопротеинов низкой плотности, или ЬВЬ-холестерин (фиг. б, 7, 8).
Стеноз церебральной артерии.
В группе пациентов с ИЦБ наблюдалась положительная значимая корреляция между уровнем абзимов и артериальным стенозом (фиг. 9).
Как и у пациентов с ИБС, в этой группе не наблюдалось связи между степенью артериального стеноза и сывороточными триглицеридами, общим холестерином и ЬВЬ-холестерином (фиг. 10, 11, 12).
В этих экспериментах установлена положительная связь между антихламидийной активностью абзима и степенью стеноза как в сердечных, так и в мозговых артериях, и показано, что эти антитела вклю
- 14 009661 чаются как в инициирование, так и в развитие атеросклероза.
Пример 6. Ингибирование абзимов с использованием ацетилсалициловой кислоты (аспирина).
Данные, представленные в табл. 13 и 14, показывают, что активность антихламидийных абзимов, окисляющих липиды, можно ингибировать ацетилсалициловой кислотой (аспирином) путем его введения людям.
Трем пациентам с коронарной болезнью сердца (КБС, СНЭ). кровь которых имела значительный уровень абзимной активности этих абзимов, давали суточную дозу 250 мг аспирина.
Через неделю исследования крови этих патентов показали значительное ингибирование активности абзима: 5-кратное снижение у одного пациента и снижение до не поддающегося определению низкого уровня у двух других (табл. 13).
Для исключения возможности того, что введение аспирина в вышеупомянутых экспериментах совпало с естественной очисткой тел пациентов от абзимов, и для исследования ш νίνο влияния аспирина на антихламидийные окисляющие липиды абзимы, был проведен следующий эксперимент.
Был идентифицирован пациент Р с «немой» ишемией миокарда, регулярно принимавший аспирин 250 мг ежедневно. Был определен уровень абзимов в крови пациента Р, и было установлено, что он является почти необнаружимым.
Пациент Р прекратил прием аспирина в течение недели, и в его крови снова был определен уровень абзима. В сыворотке пациента Р был обнаружен значительный уровень окисляющих липиды абзимов.
Пациент Р возобновил предыдущий режим приема аспирина 250 мг ежедневно, и после 7 дня был определен уровень абзимов. Уровень этих абзимов был значительно понижен (табл. 14) относительно уровня, когда пациент не получал аспирин.
В ходе этих экспериментов пациент не имел никаких дыхательных расстройств или признаков любых других патологических состояний. Это показывает, что зарегистрированные изменения активности абзима были связаны с приемом аспирина этим пациентом.
В заключение следует отметить, что настоящие данные показывают, что ацетилсалициловая кислота ингибирует окисляющие липиды антихламидийные антитела ш νίνο, и, в частности, у пациентов с клиническими осложнениями атеросклероза.
Пример 7. Антитела, вступающие в перекрестные реакции с клетками хламидии.
Коммерчески доступный препарат антител, специфичных к Аро-В человека, был исследован на способность вступать в перекрестную реакцию с СЬ1атуб1а ρδίΙΙηοί овцы (1п1егуе1).
Наблюдали, что препарат анти-аро-В антитела содержит фракцию, которая также связывается с СЬ1атуб1а овцы (фиг. 13).
В соответствии с этим, Аро-В имеет эпитоп, который является идентичным эпитопу, существующему на мембране хламидии. Антитела, которые связывают этот эпитоп, вступают в перекрестную реакцию с клетками СЬ1атуб1а и аро-В человека.
Пример 8. Влияние антихламидийных агентов на активность абзимов ш νίνο.
Пациенты, в возрасте от 45 до 62 лет, с устойчивой стенокардией, получали либо 500 мг азитромицина один раз в сутки в течение 15 суток и 30 суток, либо 500 мг азитромицина в сочетании с 250 мг аспирина ежедневно в течение 15 суток.
Активность абзима до и после лечения показана для первой группы в таблице 15, а для второй группы в табл. 16.
Показано, что активность абзима значительно снижена в обеих группах пациентов после 15 суток, причем снижение является особенно большим в группе, получавшей азитромицин и аспирин. Также наблюдалось снижение уровней ЬОЬ. Ни у одного из пациентов не было зарегистрировано никаких побочных реакций.
В ходе лечения также наблюдалось улучшение клинического состояния пациентов (табл. 17).
Прием антихламидийного лекарственного средства азитромицина в течение двух недель, в особенности в сочетании с аспирином, снижал активность абзима и улучшал клиническое состояние пациентов, страдающих от стенокардии.
Пример 9. Активность абзимов ш νίνο.
Были определены уровни абзимов в пяти группах людей с использованием описанных здесь методов. Контрольная группа была здоровой, как было определено существующими методами. Группа с «немой» ишемией включала лиц, у которых наличие ишемии было показано с помощью теста упражнение/ЭКГ, но которым не было известно о каких-либо проблемах с их здоровьем. Были также исследованы группы лиц, страдающих устойчивой или неустойчивой стенокардией и перенесших инфаркт миокарда.
Средний уровень абзимов в каждой группе показан в табл. 18, где п - число лиц в каждой группе. Лица рассматривались как положительные на абзимы, если наблюдалось 15% увеличение окисления липидов при добавлении клеток СЪ1атуб1а с использованием описанных здесь методов. Процент лиц из каждой группы, положительных в отношении абзимов, также показан в табл. 18. Ни одна из величин в таблице не была откорректирована для лиц, принимавших аспирин.
Показано, что уровень активности абзима и доля лиц, дающих положительный результат теста на
- 15 009661 абзимы, коррелирует с серьезностью состояния индивида. Наблюдается, что активность абзима резко снижается после сердечного приступа (сравнить значения для неустойчивой стенокардии и инфаркта миокарда в острой фазе). Затем, после сердечного приступа, активность абзима у выживших пациентов постепенно повышается.
Это является показателем активной роли абзимов в индукции инфаркта миокарда. Абзимы могут формировать часть механизма агглютинации (свертыванию) тромболитических сгустков, которые блокируют кровеносные сосуды и приводят к возникновению инфаркта. Эта агглютинация в сгустки снижает обнаруживаемую активность абзима в сосудистой системе. Поскольку сгусток после инфаркта растворяется, определяемая активность абзима увеличивается.
Пример 10. Влияние аспирина на активность абзимов ίη νίνο.
Активность абзима определяли в группах лиц, страдающих устойчивой или неустойчивой стенокардией класса I, II и III, с использованием описанных здесь методов. Лицам также задавали вопрос, принимают ли они аспирин. Лица были разделены на подгруппы в зависимости от того, что они сообщили о приеме аспирина, и результаты показаны в табл. 19. Эти результаты не корректируются для лиц, принимавших аспирин, но не сообщивших об этом.
Числа, показанные в табл. 19, являются величинами активности абзима у лиц в каждой группе (т.е. класс I, принимающие аспирин и не принимающие аспирина, и т.д.).
Эти результаты показывают, что уровни абзимов соответствуют серьезности болезни. Лица, принимающие аспирин, в целом имеют более низкую активность абзима, чем не принимающие аспирина лица с теми же клиническими признаками.
Пример 11. Модель атеросклеротических расстройств животных.
Кролики были инфицированы СЫатуФа рщйаа (штамм Ьоп) интратрахеальным путем с помощью 1,5 мл 10% суспензии эмбриона цыпленка, содержащего 1х107,5 клеток СЫатуФа. Сыворотку кроликов собрали в день 0 (перед инфицированием) и затем каждые 14 суток после этого, используя стандартный путь отбора крови из сердца.
Затем сыворотку использовали в стандартном анализе ЕЫ8А для измерения титра антихламидийного ^С. В тех же образцах сыворотки измеряли уровень абзимов СЫатуФа путем использования стандартного анализа, описанного выше. Появление абзимов коррелирует с появлением антихламидийных ^С антител.
Результаты для 4 кроликов (3 инфицированных и 1 контрольного) показаны в табл. 20.
Эти результаты показывают, что модель на животных с высокими уровнями абзимов может быть получена путем инфицирования хламидией. Эти модели полезны при отслеживании прогрессирования болезни, вызванной абзимами, и при определении различных параметров, таких как скорость очищения. Модели также полезны при испытании соединений в качестве потенциальных лекарств для снижения уровней абзимов и сопутствующего улучшения симптомов.
Пример 12. Антихламидийные абзимы у кроликов.
Образование окисляющих липиды антихламидийных антител было продемонстрировано на модели с использованием кроликов, полученной, как описано выше, путем интратрахеального инфицирования СЫатуФа РзШасТ
Результаты показаны в табл. 21. Кролики были инфицированы интратрахеально с помощью 1,5 мл 10% суспензии эмбриона цыпленка, содержащего 1х107,5 СЫатуФа РДйаа (штамм Ьоп), и кровь отбирали из сердец кроликов. Уровни абзимов показаны на 7-й день после подкожного введения вакцины обработанных формалином 1х 107,5 СЫатуФа ΡδίΙΙηοί (штамм Ьоп) (см. табл. 21).
Появление абзимов совпало с накоплением антихламидийного ^С. обнаруженного в соответствии с анализом ЕЫ8А. Введение тех же бактерий, но в виде препарата, обработанного формалином, на 14-й день с момента инфицирования (кролик 3) вело к увеличению титров антихламидийных ЦС в анализе ЕЫ8А на 7-й день после этой инокуляции. В то же время в сыворотке этого кролика наблюдалось 2кратное снижение активности абзима, от 131 до 64 мкМ МДА/мл.
Такого снижения активности абзима не наблюдалось у двух других кроликов, которые не получали эту инокуляцию.
Таким образом, наблюдалось, что инокуляция препаратом вакцины антигена СЫатуФа снижает присутствие/активность антихламидийных абзимов.
Пример 13. Антиабзимная терапия при ишемической болезни сердца.
Группа из 30 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) была отобрана для экспериментальной терапии с целью снижения/устранения активности антихламидийных абзимов в их сыворотке (группа терапии), а группа из 20 «соответственных» пациентов не подвергалась терапии (не получавшая лечения «контрольная группа пациентов»). Исследование проводилось в Саратовском кардиологическом центре (Российская Федерация) с июня до августа 2002 г.
Группа терапии включала 23 мужчины и 7 женщин, имеющих средний возраст 55±1,1 лет. Контрольная группа пациентов для контроля уровня абзимов включала 20 пациентов с ИБС, из которых 15 были мужчины, а 5 женщины, их средний возраст составлял 53±1,2 лет. Каждый пациент давал письмен
- 16 009661 ное согласие на его/ее участие в исследовании.
Все пациенты страдали стенокардией ΙΙ-ΙΙΙ класса согласно классификации Канадского Кардиологического Общества. 15 пациентов в группе терапии и 10 в контрольной группе пациентов имели в прошедшем году историю инфаркта миокарда. Диагноз ИБС для других 15 пациентов в первой группе и 10 в контрольной группе пациентов был подтвержден коронарной ангиографией, которая обнаружила 70% или более артериальных стенозов.
Помимо степени генерализации или тяжести атеросклероза, все группы были согласованы не только по возрасту, полу и факторам риска, но также и по лекарствам, нитратам, β-блокаторам, ингибиторы ангиотензин-преобразующего фермента и т.д.
Прогрессирование клинического состояния пациентов было проверено при помощи модифицированного Протокола Брюса (Вгисе Рго1оео1) для исследования ЭКГ при использовании упражнения на бегущей дорожке/напряжения и при помощи анкеты Роуза-Блэкберна (Ро5е-В1аскЬигп ОмеЧюппайе) (Сагбюуа8си1аг 8игуеу МеШобк. \УНО. Семема, 1968).
Основным параметром отбора пациента для исследования был уровень антихламидийной активности абзима в избытке 15 мкМ малонового диальдегида (МОЛ) на 1 мл сыворотки. Группа терапии была разделена на 4 терапевтических подгруппы.
1) Группа терапии А - получали неспецифичный ингибитор антихламидийных абзимов, азитромицин, который также обладает антимикробными свойствами, в предписанной дозе 500 мг ежедневно.
2) Группа терапии В - был предписан совместный прием азитромицина, в той же дозе, вместе с ацетилсалициловой кислотой (аспирином). Последняя имеет очевидную способность к специфическому блокированию абзимов путем хелатирования ионов меди в их активном центре. Доза аспирина составляла 250 мг в сутки.
3) Группа терапии С - был предписан совместный прием двух типов неспецифичных ингибиторов абзимов со свойствами антиоксиданта, антимикробного азитромицина в той же дозе, как в предыдущих группах, и витаминов Е, А, С. Суточная доза витамина Е составляла 30 мг, витамина А 1500 ЕЙ, а витамина С 90 мг.
4) Группа терапии Ό - пациенты этой группы получали только аспирин, 250 мг ежедневно.
Кровь пациентов всех трех групп исследовали каждые две недели. Терапии продолжали в зависимости от эффективности подавления/устранения антихламидийной активности абзима, и представлены результаты исследований, проводимых в срок до 60 суток после начала приема плацебо/терапии.
Титр антихламидийных антител был измерен в группе терапии с использованием описанного ранее метода (см. табл. 28). Также была измерена тяжесть клинических симптомов (см. табл. 28).
Результаты контроля подавления антихламидийной активности абзима представлены в следующих таблицах (табл. 22-27).
Во-первых, было отмечено, что через две недели терапии во всех группах наблюдалось значительное снижение активности абзима. Наиболее значительным оно было в группе терапии В, где использование неспецифичного ингибитора азитромицина было объединено с использованием специфичного ингибитора аспирина (табл. 23). Действительно, уровень активности в этой группе достиг уровня клинически здоровых личностей (см. сводную таблицу 28). Важным наблюдением было то, что в этой группе у пациента ТСВ7 установлено большое увеличение уровня абзимов (которое коррелировало с ухудшением клинических симптомов) на 45-й день (две звездочки в табл. 23), а затем после следующих 15 суток лечения пациент начал чувствовать себя лучше и количество абзимов снизилось до 0. ТСВ7 также показал увеличение уровней АроВ (звездочка в табл. 7) в то же время в течение 45 суток, когда наблюдалось увеличение в уровне абзимов.
Наименее эффективная терапия была в группе терапии А (только азитромицин - табл. 22), где у 27% пациентов (3 из 11, отмеченные звездочкой) не наблюдалось никаких изменений в активности абзимов через 15 суток. Однако непрерывное снижение у большинства пациентов было реверсировано для двух из них в первой группе на 30-й день исследования (ТСА2 и ТСА6, табл. 1, отмечено двумя звездочками). Это наблюдение, наряду с тем фактом, что имелись некоторые пациенты с остаточным, хотя и пониженным, значительным уровнем активности абзима, привело к увеличению длительности лечения в течение следующих 30 суток, приводя к значительному уменьшению этой активности у всех пациентов. При терапии группы А клинические симптомы пациентов ТСА2 и ТСА6 улучшились в течение 15 суток и коррелировали со снижением уровня абзимов, однако клинические симптомы ухудшались и уровень абзимов увеличился около 30-го дня исследования (две звездочки - табл. 22).
В группе терапии С (азитромицин и антиоксиданты) у одного из пациентов (ТСС1) не проявилось никакого уменьшения активности абзимов (звездочка - табл. 24).
Использование одного аспирина в предписанной дозе, без азитромицина, вело к снижению активности абзимов, но в меньшей степени, чем наблюдалось для сочетания лекарств (группа терапии Ό табл. 25).
Применение антиабзимной терапии значительно улучшило клиническое состояние большинства пациентов, которое было оценено с помощью модифицированной анкеты Роуза-Блэкберна (табл. 27) и проверено с использованием ЭКГ с бегущей дорожкой/нагрузкой. В то же самое время не имелось ника
- 17 009661 кой положительной клинической динамики, отмеченной в контрольной группе, ни для одного из пациентов. В табл. 27 РСС обозначает контрольную группу пациентов, § обозначает результаты, полученные иммунофлуоресцентным анализом, §§ обозначает результаты, полученные иммуноферментативным анализом, §§§ обозначает результаты, полученные иммунотурбидиметрическим анализом. * обозначает статистически значимое различие.
Не наблюдалось никаких статистически значимых изменений для следующих параметров коагуляции: время свертывания крови каолином, время активированного частичного тромбопластина, протромбиновое время. Не зарегистрировано никаких изменений в уровне серологического креатинина и ферментов печени аланин-аминотрансфераза (А1ашпе аттойапзГегазе) и аспартат-аминотрансфераза (Азраг1а1е аттойапзГегазе).
Никто из пациентов в группах экспериментальной терапии не имел положительных изменений в клиническом состоянии в течение многих месяцев/лет до их отбора для исследования. Поэтому это отсутствие позитивной динамики может использоваться в качестве «внутреннего» контроля для значительного клинического прогресса наблюдаемых пациентов.
Первоначальные интенсивные режимы ингибитора абзимов, обладающего антимикробными свойствами, полностью устранили присутствие антихламидийных 1дС.
Атакой на антихламидийные абзимы были достигнуты значительные улучшения в отношении концентраций липида и тромбоза (табл. 27). Поэтому можно предположить, что развивающиеся аномалии в липидном метаболизме и системе коагуляции при атеросклерозе являются вторичными по отношению к появлению этих окисляющих липиды каталитических антител.
Наблюдаемый положительный эффект азитромицина нельзя объяснить его антибактериальными свойствами, потому что только у 15 пациентов из 30 (у 50%) отобранных для исследований ранее имелась положительная реакция на присутствие хламидийной инфекции. Уровень антихламидийного 1дС в сыворотке других 8 пациентов был незначительным, ниже 1:32 при иммунофлуоресцентном анализе. У остальных 7 пациентов реакция была отрицательной.
Диагностический тест показывает, является ли пациент носителем абзимов и не обязательно коррелирует с положительной реакцией пациента на СЫатуФа 1дС антитела. Поэтому терапию не следует назначать на основе серопозитивности к СЫатуФа. Это показывает, что для осуществления изобретения полезно, когда диагностический тест связан с использованием правильной терапии, с последующими многократными прогностическими тестами для контроля за очищением от абзимов при проведении лечения.
Некоторые ИБС-пациенты при терапевтико-диагностическом исследовании были негативны по отношению к антихламидийным 1дС антителам, но имели положительную реакцию на абзимы. Показатели в отношении абзимов и теста Роуза-Блэкберна для этих пациентов до и после лечения показаны в табл. 29. Эти пациенты были подвергнуты лечению, и активность абзимов у них снижалась, с последующим улучшением клинических симптомов.
Эти результаты показывают, что наличие у пациента абзимов не обязательно коррелирует с положительной реакцией пациента на СЫатуФа 1дС антитела. Атеросклеротическое состояние не может быть диагностировано или назначена терапия на основе серопозитивности в отношении хламидии. Однако показано, что абзимы являются полезными в качестве диагностического маркера атеросклеротических состояний и могут быть связаны с назначением соответствующей терапии, сопровождаемой неоднократными прогностическими тестами для контроля очищения от абзимов.
Пример 14. Антиабзимные/антиоксидантные свойства азитромицина.
Ингибирущая активность азитромицина в отношении абзимов, выделенных из атеросклеротического повреждения, была измерена, как описано выше. Результаты показаны в табл. 30. Каждое число является средним значением двукратного/трехкратного измерения, и рассчитано как разность между уровнем накопления ΜΌΆ в исследуемой сыворотке до и после добавления 0,5 иммунизирующей дозы вакцины СЫатуФа овцы ('1п1егуе1'). Влияние ΌΜ8Θ вычислено из показаний, обозначенных (**).
Установлено, что азитромицин является сильным ίη уйго ингибитором активности абзимов. Эта активность может быть причиной наблюдаемых ίη у1уо биологических эффектов, вызываемых азитромицином, таких как быстрое уменьшение активности абзимов после приема азитромицина.
Пример 15. Целостность мембраны СЫатуШа и активность абзимов.
Активность абзимов была измерена, как описано выше, с использованием образцов СЫатуШа рпеитошае или С’ЫатуШа РзШасг обработанных формалином, сернокислым аммонием или 8Ό8. В этих реакциях в испытательной системе не происходит никакой реакции окисления липидов.
Обработка бактерий СЫатуШа разобщающими агентами (агент, вызывающий диссоциацию комплексов), включая неионные ПАВ 1% Тгйоп Х-100 и 1дера1 СА-630, 10% раствор ΌΜ8Θ, которые сохраняют присутствие в системе мембранных липидов, но разрушают целостность бактериальной мембраны, полностью остановила развитие реакции окисления липида.
Эти эксперименты показывают, что липиды важны для инициирования и развития реакции (реакций) окисления липидов в пероксидные соединения, развивающейся в исследуемой системе. В частности, установлена роль липополисахарида, разрушаемого при вышеупомянутой обработке.
- 18 009661
Пример 16. Истории болезней.
Больной № 1.
У пациента. 64-летнего мужчины. ишемическия болезнь сердца была диагностирована 3 года назад. когда у него появились первые симптомы стенокардии. Диагноз был подтвержден коронарной ангиографией. которая установила стеноз двух артерий: 75% правой коронарной артерии и 100% окклюзии передней интравентрикулярной (внутрижелудочковой) артерии.
Он был отобран для терапевтико-диагностического исследования на том основании. что в его сыворотке были обнаружены абзимы. Ему была назначена комбинация двух ингибиторов абзима. азитромицина. в дозе 500 мг ежедневно. и аспирина. в дозе 250 мг ежедневно. Его уровень антихламидийных 1§С был высоким. с титром 1:256.
Перед лечением его клиническое состояние. оцениваемое по результатам модифицированного протокола Роуза-Блэкберна. было равно 19 (баллов). Активность абзима составляла 25 мкМ ΜΟΆ/мл. уровень общего холестерина 226 мг/дл. триглицериды - 90 мг/дл. холестерин липидов высокой плотности (НОБ) - 56 мг/дл. холестерин липидов низкой плотности (БББ) - 73 мг/дл. АроА - 139 мг/дл. АроВ - 81 мг/дл. аланин-аминотрансфераза (ЛБТ) - 25 ед./л (И/Б). аспартат-аминотрансфераза (Л8Т) - 29 ед./л (И/Б). креатинин - 0.71 мг/дл.
В ходе лечения не наблюдалось никаких значительных побочных реакций. При первом посещении после начала терапии. через 15 суток. пациент сообщил о некотором улучшении в отношении признаков его болезни. Это улучшение продолжалось до 30-го дня терапии. Это было подтверждено увеличением допустимого времени в ходе испытания с использованием ЭКГ и упражнения на бегущей дорожке в соответствии с модифицированным Протоколом Брюса.
В то время в его сыворотке не было обнаружено ни активности абзимов. ни присутствия антихламидийных 1§С. Уровень липидных параметров также улучшился: общий холестерин снизился до 172 мг/дл. триглицериды - до 80 мг/дл. холестерин НОБ - 52 мг/дл. холестерин БОБ - 64 мг/дл. АроА 110 мг/дл. АроВ - 67 мг/дл. Уровни ЛБТ. Л8Т и креатинина остались теми же - 25 и/т1. 27 и/т1 и 0.7 мг/дл соответственно.
По достижении 45-го дня с начала терапии пациент сообщил. что за неделю до этого. на 38-й день с начала. его состояние стало ухудшаться - частота и интенсивность приступов стенокардии внезапно увеличилась. Это совпало с повышением активности абзимов. которая достигла 80 мкМ ΜΟΆ/мл. Однако важно отметить. что не были зарегистрированы никакие традиционные антихламидийные 1дС.
Одновременно также ухудшились параметры липидного обмена: общий холестерин увеличился до 185 мг/дл. триглицериды - 143 мг/дл. холестерин БОБ - 74 мг/дл. АроА - 115 мг/дл. АроВ - 87 мг/дл. Уровни холестерина НОБ и АроА остались. по существу. теми же - 50 мг/дл и 115 мг/дл. соответственно. Важное наблюдение состояло в том. что уровень ферментов печени также изменился. ЛБТ увеличился до 35 И/Б. а Л8Т - до 39 И/Б; концентрация креатинина составила 0.8 мг/дл.
Однако продолжавшаяся терапия. по-видимому. привела к полному подавлению/устранению активности абзимов. которое также сопровождалось улучшением в отношении концентрации некоторых липидных параметров: полный холестерин понизился до 165 мг/дл. триглицериды - до 100 мг/дл. Концентрация холестерина НОБ была 47 мг/дл. холестерина БОБ - 72 мг/дл. АроА - 112 мг/дл. Уровни ЛБТ. Л8Т и креатинина составили 24 и/мл. 25 и/мл и 0.7 мг/дл соответственно.
В то же время уровень АроВ остался таким же. как перед началом лечения. составляя 80 мг/дл. Первоначально улучшенное клиническое состояние также вернулось к уровню. на котором оно было перед началом терапии. а показатель Роуза-Блэкберна был равен 19. Для стабилизации пониженного уровня абзимов в попытке улучшить клинические параметры пациента. ему было рекомендовано продолжить предписанную антиабзимную терапию.
У этого пациента с 15-го дня с начала терапии и далее не было обнаружено никаких антихламидийных 1дС. а продолжающееся использование азитромицина было направлено на регулирование подавленного уровня вступающих в перекрестные реакции абзимов. которые связывают и окисляют липопротеины. а не на бактериальную инфекцию рег ке.
Больной № 2.
У пациента. 46-летнего мужчины. была диагностирована ИБС. когда он поступил с острым инфарктом миокарда 21 февраля 2002 г. Перед этим он не имел никакой истории сердечной болезни. В мае того же года коронарная ангиография не показала никакого стеноза/сужения его коронарных артерий.
Этот пациент был отобран для терапевтико-диагностического исследования на том основании. что в его сыворотке была обнаружена значительная активность антихламидийных абзимов. Она составила 140 мкМ ΜΟΆ/мл. Была предписана комбинация двух типов ингибиторов абзима. азитромицина в дозе 500 мг ежедневно. и коктейля антиоксидантов - витаминов Е. А. С. Суточная доза витамина Е была 30 мг. витамина А - 1500 ЕС и витамина С - 90 мг.
В сыворотке этого пациента до начала лечения или в ходе него не было определено никакого обнаруживаемого уровня традиционных антихламидийных 1дЛ. 1§С или 1дМ.
Перед лечением его клиническое состояние. оцениваемое по результатам модифицированного протокола Роуза-Блэкберна. было равно 17. Уровень общего холестерина был 205 мг/дл. триглицеридов
- 19 009661
129 мг/дл, холестерина НОЬ - 39 мг/дл, холестерина ЬОЬ - 80 мг/дл, АроА -152 мг/дл, АроВ - 221 мг/дл.
В ходе лечения не было замечено никаких значительных отрицательных реакций. Пациент начал чувствовать некоторое улучшение в признаках болезни после первых двух недель лечения. Этот прогресс продолжался в течение всего периода терапии, 60 суток. Это было подтверждено значительным увеличением допустимого времени в ходе испытания с упражнением на бегущей дорожке и ЭКГ, выполненного в соответствии с модифицированным протоколом Брюса.
В конце периода наблюдения, через 60 суток, в его сыворотке не было обнаружено ни активности абзимов, ни присутствия антихламидийных 1§С.
Эти изменения в активности абзимов совпали со значительным улучшением клинического состояния пациента. Его показатели по модифицированному протоколу Роуза-Блэкберна снизились с 17 до лечения до 13 после него.
Пример 17. Влияние антиабзимной терапии на тромбоз.
Одним из показателей атеросклеротических расстройств является то, что пациенты часто поступают с аберрациями во времени, требуемом для формирования тромбов в их крови (в целом у пациентов оно увеличивается). Множество путей может приводить к образованию тромбов, и поэтому имеются четыре признанных в международной практике вида испытания на время свертывания крови. Первое называется Время активированного частичного тромбопластина (Лс^а^еб Рагба1 ТйтотЬор1ай1п Т1те, АРТТ) и проводится путем прибавления тромбопластина и кальция для измерения внутренней траектории. Второе, называемое протромбиновое время (РТ), представляет собой простое измерение внешней траектории. Время свертывания крови кремнеземом (8СТ) - это измерение свертывания, вызванного мелкими частицами (кремнезема), а Время свертывания крови каолином (КСТ) - это измерение свертывания, вызванного более крупными частицами (каолина). Для всех этих испытаний быстрое время свертывания крови является показателем более высокого риска тромбоза.
Перед началом лечения у всех пациентов во всех группах терапии были измерены времена свертывания крови с использованием всех четырех методов и рассчитано среднее значение со средней погрешностью. Измерения были повторены через 60 суток. В качестве контрольных были использованы пациенты нашей контрольной группы пациентов (измерения проводились один раз - их значения для этих пациентов не изменялись значительно с течением времени), а также нами была сформирована контрольная группа клинически здоровых людей. Результаты лечения представлены в табл. 32.
Среднее значение для пациентов перед лечением при испытании методом АРТТ было 22,4±0,89 (сопоставимо с значением для контрольной группы 25,2±1,37) и значительно отличалось от значения 49,1±7 для группы клинически здоровых людей. После лечения среднее значение этой величины у пациентов было 46,9±6,45, и поэтому оно было в пределах нормального интервала времен свертывания крови, т.е. было нормализовано.
Среднее значение для пациентов перед лечением при испытании методом РТ было 13,5±0,94 (сопоставимо с значением для контрольной группы 17,3±4,05) и было ниже, чем значение 23,7±4,01 для группы клинически здоровых людей. После лечения среднее значение этой величины у пациентов было 25,3±4,05, и поэтому оно было в пределах нормального интервала времен свертывания крови, т.е. было нормализовано.
Среднее значение для пациентов перед лечением при испытании методом 8СТ было 151±15,0 (сопоставимо с значением для контрольной группы 137±11,5) и было значительно ниже, чем значение 248±10,0 для группы клинически здоровых людей. После лечения среднее значение этой величины у пациентов было 235±17,9, и поэтому оно было в пределах нормального интервала времен свертывания крови, т. е. было нормализовано.
Среднее значение для пациентов перед лечением при испытании методом КСТ было 51,2±4,59 (сопоставимо с значением для контрольной группы 50,3±2,16) и значительно отличалось от значения 133±23,7 для группы клинически здоровых людей. После лечения среднее значение этой величины у пациентов было 126±34,2, и поэтому оно было в пределах нормального интервала времен свертывания крови, т. е. было нормализовано.
Эти результаты показывают, что антиабзиная терапия может использоваться для нормализации времени свертывания крови (при использовании всех международно признанных видов анализа времени свертывания крови) и снижает риск тромбоза и, следовательно, сердечного приступа и инсульта.
Результаты экспериментов ίη νίΐτο, показанных на фиг. 14, указывают, что добавление фракции атеромы 1§С. содержащей антихламидийные абзимы, в концентрации от 0,5 до 10 мг белка, оказывает активирующий эффект на свертывание плазмы при воздействии каолина.
Предварительная инкубация абзимов с диэтилдитиокарбаматом или с азидом натрия, которые ингибируют эти антитела посредством связывания с Си2+ в их активном центре, привела к снижению влияния абзима на свертывание плазмы.
Эти данные указывают, что антихламидийные абзимы могут непосредственно влиять на тромбоз плазмы человека и являются важным фактором в развитии ишемической болезни сердца.
- 20 009661
Таблица 1
ЦС т атсро-склеротического Окисление липидов в пероксиды,
повреждения человека, мкг мкМ МОА в мл
+ 10 мкл СЫатуЛа овцы + 2,5 мкл СЫатусИа кошки
0 (контрольный) 3 + 0,4 0±0,3
0,18 6± 1,1 2 ±0,7
0,36 0,57 2 ±1,2 0±0,5
0,8 1,35 10 + 0,9 1 ±0,2
1,8 18 ±1,0 0±0,4
5,4 19 ±0,7 0 ± 0,5
8,0 26 ±1,3 0±0,8
4 ±0,3
23 ±1,5
Таблица 2
Исследуемые системы Окисление липидов в сыворотке в пероксиды, мкМ МРА / мл
без СЫату<И{1 + 10 мкл СЫату(На овцы
Липопротеины + антитела (1 -я контрольная! Липопротеины сыворотки + 1 мкг/мл ΙβΟ* из повреждений 130 ±9,43 193 + 19,9
246 ± 17,5 342 + 8,52
Только антитела (2-я контрольная)
Липопротеин, удаленный из сыворотки ультрацентрифугированием + 1мкг/мл 1§С* из повреждений 29 ±3,57 63 + 5,42
Удаление антител предварительной абсорбцией липопротеинами сыворотки Сыворотка была первоначально инкубирована с 1 мкг/мл 1§С* из повреждения, а затем липопротеины были удалены ультрацентрифугированием 35 ±4,66 23 ± 1,71
Таблица 3
Сыворотка Контрольная сыворотка, МДА в мкМ/мя Сыворотка пациента №3’, МДА в мкМ/мл
Начальный уровень + 6.25 мкл СЫатусНа кошки 58 ±4,5 50 ±2,8 187 ±5,0 (100%) 225 ± 9,9 (120%) р < 0,05
- 21 009661
Таблица 4
Образцы Контрольная сыворотка, МДА в мкМ/мл Сыворотка пациента №2’, МДА в мкМ/мл
Начальный уровень + СЫатусИа овцы Начальный уровень + СЫатусМа овцы
10 мкл 100мкл Юмкл 100м кл
Сыворотка 56 ±6,4 58 + 5,0 48 + 6,6 128 + 9,0 (100%) 202+13,4 (158%) р<0,01 580+24,2 (453%) р<0,001
СывороткаГвО 52 + 6,2 60 + 6,6 62 +7,2 76 + 4,4 72 + 6,8 96 + 8,4
- 22 009661
Таблица 5
Случаи Окисление липидов в пероксиды, в мкМ МДА в 1 мл сыворотки
ВеГоге (Ке СЫатуЖа* асИНюп оГ АйеПЬеабФОоп оГ СЫату(11а* 1 η стегнет
Контроль: К 58 90 32
К1 К2 КЗ К4 М ΜΙ 104 124 131 106 112 70 124 148 168 124 108 70 20 24 37 18 -4/0 0
М2 78 1/10 или 86 1/10 или 8
10% 10%
М3 102 80 -22/0
М4 84 7/ 76 -8/0
96,8 + 3,99 , 108 + 5,73 (п = 10) 13,9 + 5,14
(п = 10) Р (КЛЬикбя) > 0,05 (о= 10)
пациенты: 1 116 166 50
4 86 106 20
5 122 168 46
6 40 62 22
6а 208 336 128
7 118 166 48
8 82 98 16
9 160 290 130
10 60 80 20
II 236 368 132
12 256 328 72
13 174 350 176
14 168 306 138
15 126 162 36
16 290 13/21 290 0
17 246 ИЛИ 342 17/21 96
18 270 62% 376 ИЛИ 106
81%
19 156 272 116
/
20 164 / 312 Ί 148
21 206 / 344 / 138
22 290 1 332 у 42
170+ 10,8 (п 21) 250+ 15,0 (п 21) 80,0 + 13,1 (п = 21)
р {контрол».) < 0,001 Р (контроль) < 0,001 Р (контроль) < 0Э001
Р (ЮиЬкгилЦ θ’θΐ
- 23 009661
Таблица б
ЬОБ, 480 мкг белка Уровень выработки МДА с 0,82 мкг 1дС поражений, в мкМ
Контроль + 0.1 М формиат натрия + 0.1 мМ аскорбиновой кислоты* + 0.1 М бензойной кислоты + 1% БМ8О* 0,49 + 0,023 0 0 0 0
* Антиоксиданты, одобренные для использования человеком в наиболее развитых странах.
Таблица 7
Металлы Хелатирующие агенты Патентованные препараты
Рен/Ре+3 Десферриоксамина мезилат (ОезРегпохатте Мезу1а(е) Канада: гтесагф Франция: Сагйюхапе; Италия: СагсНохапе; Еисагйюп; США: гшесагй.
Гемопроизводные Австралия: РапкетаНп; Франция: Иогтозапд; США: РапКегпаип.
Си*'/Си+2 Пеницилламин Австрия: Аг(ат1п; О1з1атте; Австралия: ϋРепатте; Бельгия: Ке1аип; Канада: Сирптте; Оереп, Франция: ΤγοΙουοΙ; Германия: Ме1асарГазе; Тпзогст; Тго1оуо1; Ирландия: О|з1атте; Италия: Репмпе; ЗиГоНап; Нидерл.: Сирптте, Ок1атте; Оегойу); Ке1аПп; Норвегия: Сирптте; ЮАР: Ме1аа1сар(азе; Испания: Сиргет; ЗиГоНапоп; Швеция: Сирптте; Швейц.: Мегсар(у1; Великобр.: О|5<ат1пе, Репйгатте; США: Сирптте; Оереп.
Тиопронин (ΤΐορΓοπϊη) Франция: Асайюпе; Германия: СарШпсг; Италия: Ерабо1; Мисо1узт; Мисозу1; ТЫо1а; ПодПз; Испания: ЗшПап; Швейц.: Мисо1узт; США: ТЫо1а. Многокомпонентные: Италия: Мисо1узт АпиЫоисо; Испания: НераЙфез!.
Триэнтина дигидрохлорид (ТпепОпе ϋΐΗγάΐΌοΙιΙοΓΪάβ) США: Зурппе.
Диэтилдитиокарбамат Ацетилсалициловая кислота
мё^ Линатоиевая/тоинатоие-вая соль ЭДТК Франция: СЬе!а(гап; Тгасета1е; Ирландия: 1лтс1а1г; Великобр.: 1лтс1ай; США: О1зо1а1е; ЕпйгаСе. Многокомпонентные: Канада: Миппе 5ирр1етеп1 Теагз; Франция: VйасЫг; Германия: Сотр1е1е; Оигасаге; Охузерг, Великобр.: ΓΙπίΙβχ С; υήίΐβχ К.
(ϋΐϊοάΐιιπι/Ίτΰοώιιιη Ес1е1а1е)
ЭДТК (ЕОеОс АсМ) Многокомпонентные: Италия: СопСа-Ьепз ХУеШпд; США: Зиттег’зЕуе Ро51-Мепз1гиа1; Τπν; Уа£1зес Р1из; Ζοηϊΐβ.
Унятиол (ΙΙηϊΐάίοΙ) Германия: О1тауа1; Мегсиуа!.
Другие металлы переменной валент-ности
* Любой двухвалентный металл
- 24 009661
Таблица 8
Антибактериальные агенты Патентованные препараты
Тетрациклин Австрия: АсЬготуст; АсПзйе; Но5(асусНп; Ьа(уст; 8(есЬп; (ейагсо; Австралия: АсЬгошуст; АсЬгошуст V; ЬаТуст; Му5(ес1т; Раптуст Р; 81ес1т-V; Тейатукот; Тейех; Бельгия: Но8(асисНпе; Канада: АсЬготуст; АсЬгошуст V; Аро-Тейа; Νονο-Тейа; Ии-Тейа; Тейасуп; Франция: Е1огосусНпе; НехасусНпе; Тейатг^; Германия: АсЬгошуст; Акпе-Руо<1гоп Киг; Акпе-Руо<1гопога1; П15ра1с1пп; НозисусИп; 1тех; фшпюсусПпМ; ЗадгНаст Ν; 51есИп; 8иргатуст; ТеГПт; ТейаЬака!; ТейаЫе1; ТейасЙго 5; Тейа1ийоп; Италия: Астописша; АтЬгаппсша; Са1ос1с1та; 1Ь1суп; 8рас1с1та; ТейаРго1ег; ТейаЬ10р1а1; ТейаГозаттша; Нидерланды: Тейагсо; ЮАР: АсЬготуст; АгсапасусЬпе; Сатта(е1; Нок1асус1те; К.о1е1; Теггех; Испания: АсНзйе; АтЬгагтДа; ВгйасЫта; КтскКпа; фштре АпйЪюЬсо; Тейа НиЬЬег; Тейа1еп; Тейагсо 81шр1е; Швеция: АсЬготуст; Асйзйе; Швейцария: АсЬготусте; Асй8|1с; 8сгуйс1; Тейазерйпе; ТпрЬасусНпе; Великобр.: АсЬготуст; Есопотуст; 8из1атус1п; ТеГгаЫб-Огдапоп; ТейасЬе!; США: АсЬготуст V; АсЬготуст; Асбзйе; Νοτ-ТеЦ Раптуст; К.оЬ11е1 КоЫсарз; Зитусш; ТеИпе; Тейасар; Тейа1ап; Тейаш.*
Эритромицин (ЕгуТЬгошуст) Азитромицин (АгйЬгошусш) Рокситромицин (ΚοχίΐίίΓοπινοίη) Офлоксацин (ОЛохаст) Клинафлоксацин (СПпаЛохаст) Ципрофлоксацин (С1ргойохас1п) Клиндамицин (Сйпбатуст) Доксициклин (ОохусусНпе) Миноциклин (МтосусНпе)
* Многокомпонентные: множество препаратов
- 25 009661
Таблица 9
А нтиокс и даты Патентованные препараты:
Альфатокоферол Австрия: АхфНеп; ЕрЬупа!; Εΐοοονΐΐ; Ενίί; Ενίΐοΐ; Те(е1й Уйатт Е; Австралия: А1рЬаКеп 8йку 8тсю(Ь; Вю£1ап МкеПе Е; Вю£1ап ИаШга! Е; Вю£1ап ХУа1ег 8о1иЫе Е; СЬе\у-Е; Е>а1-Е; 1 пуке Е Еог1е; Ιηνίίε Е; Магсо Е; Ме$а Е; Мг^аУЙ Иа1ига1 Е; Бельгия: ЕрЬупа!; Канада: Адиазо! Е; Νονο Е; Ог^апех; У|1а-Е; Франция: ЕрЬупак ТосаИа; Тосо; Тосопмпе; Германия: АпПохкагНз Е; Βϊορίο-Ε; ϋείιιΐίη; Е-МизПп; Е-У1Со1га1; Есого; ЕтЫа1; ЕрЬупа 1; Рехап Е; Рипс1о Е; 8апау1Сап 8; ТосогеП; Тосоуепоз; Тосоуйа); То^азап; УйадиП Уйатт Е; Ирландия: ЕрЬупа!; Италия: Е Рег)е; Е-УЙ; ЕУйит; ЕрНупа1; Еуазеп Сгсат; Ενίοη; ΕνίΙίηβ; ΡεηίΙνίΐ; Иа-То-Сарз; ТосоГелпа Е; Тосо£его1о Вю£1ап; Тосо^еп; У|1еп1; Норвегия: ΑΓΙ-Ε; 16 о-Е; ЮАР: ЕрЬупа); Испания: Лихта Е; ЕрЬупа); 61и1апеиппа Вб Е(е; Швеция: ЕрЬупа!; ОрЮ νΐι-Ε: Уйасту; Великабр.: Βίο Е; ЕрЬупа!; Рга1ге ОоЙ; Уйа-Е; США: Αιηίηο-Ορίί-Ε; Адиазо! Е; Адиауй-Е; Уйа-Р1из Е; Уйес.*
Маннит Австрия: ОзтоРшкНп 20%; Австралия: Мебе-Ргер; Озтйгок Канада: Озтйго!; Рг.; Мап1со1; Германия: ЕиГизо! М 20; МаппйЬозип£; ОктоРипбт 15%; Озтоз1еп120%; ТЬотаетаппй; Италия: 1зо1о1; Мапп1зЮ1; Швейц.: Маппйе; США: Озтйго1; Кезесбзок*
5ΐ1 ΐύίβηίη Австрия: Ар<Ьераг.; В>оце1а[ 1еЬегзсЬи1г; Нераг Разе Мопо; Ье§а1оп; ЗйуЬеха); Австралия: НегЬа1 Ыуег Рогти1а; 1луег Τοπίο Сарзи1ез; Ргок; Бельгия: ЬедаЬп 81Ь; Франция: Ье£а1оп; Германия: А1ера; АгбеуЬерап Ν; Саг6ииз-топор1ап1; СеГазНутапп; О|у|па1-Нера; Е>игазИутапп; Не^птапп; Не1 ϊρίαπΐ; Нера-1о£ез Ν; Нера-Мегг 8Ϊ1; Нераг-Разс; Нерагапо Ν; Нерагзух Ν; Нсра1оге1к Нера1оз; Нер1ап1; Ье£а1оп; Ье£а1оп 5П_; ко^отеб ЕеЪег-Карзе1п; Мапепб1з(е1 Сигаппа; РЬуГоЬераг; РойбсЬокп; РгоЬюрНу! V; ЗШЬепе; 8Икиг; 8й1тагй; 8йтаг; 8и1£о!йгиуу Н., Уй-о-Маг; Италия: Ерагзй; Ье£а!оп; Ьосазй; Магзй; 8йераг, 8й|тапп; 8ί1ίιεχ; δίΙΙίνεΓ, 8Итаг; Тпззй;7СМ/’.· Ье£а1оп; Испания·. Ье£а1оп; Зйаппе; 8й1таги; Швейц.: Ье^а1оп; Ье^а1оп 8)Ь.
Аскорбиновая кислота и тд.
* Многокомпонентные: множество препаратов
- 26 009661
Таблица 10
Овцы Окисление в пероксиды липидов сыворотки крови овец, в мкМ МДА в мл
- СЫатусйа + СЫатуЛа
Предвар. вакцнниров. Νο.1 Νο.2 44 39 (89%)
Пост-вакцинирование Νο.8 Νο.5 59 67(114%)
«7 85(127%)
54 46 (85%)
После аборта (выкидыш) А В 48 102(212%)
63 118(187%)
Таблица 11
Ме2* -связывающий агент, 10 мкМ каждого Активность окисления липидов анти-хлам идийным и абзимами, в мкМ МДА/мл * результат Потенциальное клиническое использование агента ингибирования антихламидийных абзимов
Контроль 24,3
0 Положит. Высокотоксич., не использ.
ΚΟΝ 0 Положит. Высокотоксич., не использ. Не
Тетрациклин 18,3 Отрицат. используется
ОТРА 45,2 Отрицат. Не используется
Пиколиновая кислота 0 Положит. Потенциальный окислитель, не
Си2<-хелат.агенты используется
ООС 0 Положит. Возможно использование
Ацетил салицило-вая (“Имутиол”, “ΙτηιιΐΐοΓ)
кислота 6,2 Положит. Возможно использование (“Аспирин”)
Пеницилламин 0 Положит. Возможно использование (“Пеницилламин”)
* Каждое число является средним значением двукратного/трехкратного измерения и рассчитано как разность между уровнем накопления МДА в исследуемой сыворотке до и после добавления 0,5 иммунизирующей дозы вакцины СЫатубга овцы ('!п!егуе!').
- 27 009661
Таблица 12
Ингибитор Механизм действия Ιη—¥Йго ингибирование (+ = ингибирование) (- = нет ингибир-я)
Тетрациклин Ге2+ ингибирование -
ϋϋϋ Ингибирование свобод, и связан. Си2+ +
Аспирин (ацетилсалицил. кислота) Ингибирование свобод, и связан. Си2+ +
Пеницилламин Ингибирование свобод, и связан. Си2+ +
СЫ- Ингибирование свобод, и связан. Металла +
N3 Ингибирование свобод, и связан. Металла +
ϋΤΡΑ Ингибирование только свобод. Металла -
Пиколиновая кислота Ингибирование свобод, и связан. Металла +
Таблица 13
Уровень активности анти-хламидийных абзимов в
Обозначение (инициал) мкМ МДА/мл
пациента с ИБС (СНЭ) Перед приемом аспирина Через 7 суток после начала приема 250 мг аспирина ежедневно
8 45 0
А 100 20
Υ 45 0
Таблица 14
Инициал пациента Уровень активности анти-хламидийных абзимов, в мкМ МДА/мл
Прием аспирина 250 мг ежедневно После прекращения приема аспирина в течение 7 суток Через 7 суток после возобновления приема 250 мг аспирина ежедневно
Г 10 65 20
Таблица 15
Активность анти-хламидийных абзимов, в мкМ МДА/мл
Пациент
До лечения Через 15 суток после начала лечения Через 30 суток после начала лечения
1. 30 6,7 3,3
2. 90 6,7 -
3. 80 0 0
4. 40 60 37
5. 50 0 0
6. 15 8,3 28
7. 10 6,7 3,3
8. 35 33 10
9. 85 75 78
10. 30 0 0
11. 40 * -
45,9 19,6 17,7
- 28 009661
Таблица 16
Пациент Активность анти-хламидийных абзимов, в мкМ МЛА/мл
До лечения Через 15 суток после начала лечения
12 100 43
13 93 27
14 33 0
15 30 0
16 153 0
17 15 0
18 25 3,3
19 15 0
58,0 9,16
Таблица 17
Пациент Клиническое состояние
До лечения После 15 суток лечения
2 Нестабильная стенокардия; Тест ЭКГ/упражнения был неприменим Стабильное состояние; Тест ЭКГ/упражнения показал значительную переносимость; Приступы стенокардии в этот период не были зарегистрированы; Возвращение к работе в полном объеме
5 Классифицирована стенокардия класса III; 10 таблеток нитроглицерина в день На основе улучшения показателей теста ЭКГ/упражнения состояние пациента было переклассифицировано на стенокардию класса II; Снижение частоты и тяжести приступов стенокардии; 5 таблеток нитроглицерина в день
Таблица 18
КОНТРОЛЬ «НЕМАЯ» ИШЕМИЯ СТАБИЛЬНАЯ СТЕНОКАРДИЯ НЕСТАБИЛЬНАЯ СТЕНОКАРДИЯ ИНФАРКТ МИОКАРДА
Острая фаза 1-й - 3-й дни На 14-й день
6,36 + 1,14 (л = 67) 68,8 + 16,7 (п= 15) 37,1 + 2,23 (п = 193) 101 + 18,1 (п=13) 14,4 + 2,60 (п = 25) 80,6 + 21,4 (п= 14)
11/67 = 16% 14/15 = 93% 130/193 = 67% 12/13=92% 12/25 = 48% 12/14 = 86%
< 0,001 Р«»нгроЛ1, < 0,001 рге»1|МЛь< 0,001 Ρ,οη,,,Γ.,,,. < 0,0 1 Рютрая фаз* < 0,01
<0,001 Рцестабстрнокар < 0,001
- 29 009661
Ишемическая болезнь сердца (всего): 168/235=71%
Таблица 19
СТАБИЛЬНАЯ СТЕНОКАРДИЯ НЕСТАБИЛЬНАЯ СТЕНОКАРДИЯ
1 11 III IV
+ аспирин + аспирин + аспирин + аспирин
15 0 45 30 45 20 70 180
75 5 0 5 40 0 90 130
15 45 70 10 10 45 30 70
15 0 50 10 45 0 250 0
ю 20 0 60 5 140 37
0 0 5 90 35 130 90
8 25 25 0 100
0 0 30 15
53 5 153 30
18 22,5 15 105
17 0 934
43 5
10 3,3
50 0
32,5 16,7
100
1/6 4/15 6/10 6/7
17% 27% 60% 66%
30,0 (п = 4) 10,0 (п = 6) 32,2 (п=16) 9,2 (п=15) 56,0 (п=11) 25,5 (п=10) 119 (п = 6) 86,7 (п = 7)
4/9 = 44% 12/26 = 46% 12/17 = 71% 12/13 = 92%
Таблица 20
КРОЛИК анти-хламидийные 1£б, ЕИ5А** Анти-хламидибные абзимы, в мкМ МДА/мл··
День с момента инфицирования День с момента инфицирования
0 14 0 14
1 0 1:1600 0 71
2 0 1:3200 - 203
3 0 1:800 0 131
контроль 0 0 0 0
Таблица 21
КРОЛИК Анти-хламидийные 1&(3, ЕЫ5А** Анти-хламидиЙные абзимы, в мкМ МДА/мл**
День с момента инфицирования День с момента инфицирования
0 14 22 0 14 22
§ + вакцина § + вакцина
1 2 3 0 0 0 1:1600 1:3200 1:800 1:1600 1:3200 1:1600 0 0 71 203 131 165 180 64
КОНТРОЛЬ 0 0 - - 0 0 - -
- 30 009661
Таблица 22
Пациенты группы терапии А Активность анти-хламидийных абзимов, в мкМ МДА/мл
До лечения Через 15 суток после начала лечения Через 30 суток после начала лечения Через 45 суток после начала лечения Через 60 суток после начала лечения
ТСА1 30 6,7 3,3 0 0
ТСА2 90 6,7 78** 17 3,3
ТОАЗ 80 0 0 0 6,7
ТОА4 40 60* 37* 0 0
ТСА5 50 0 0 20* 0
Т0А6 15 8,3 28** 43* 6,7
ТОА7 28 6,7 3,3 3,3 0
ТСА8 35 33 10 3,3 0,5
ТОА9 85 75* 78* 0 0
ТСАЮ 30 0 0 5,0 0
ТСА11 40 52* 10 0 0
47,5 22,5 22,5 7,4 1,6
Таблица 23
Пациенты ГРУППЫ тепапии В Активность аити-хламилийных абзимов. в мкМ МДА/мл
До лечения Через 15 суток после начала лечения Через 30 суток после начала лечения Через 45 суток после начала лечения Через 60 суток после начала лечения
ТСВ1 100 43 10 0 -
ТСВ2 93 27 30 0 10
ТСВЗ 33 0 0 0 0
ТСВ4 30 0 6,7 0 3,3
ТСВ5 153 0 0 0 3,3
ТОВ6 15 0 0 3,3 0
ТОВ7 25 3,3 0 80** 0
ТОВ8 15 0 3,3 10 0
58,0 9,16 6,25 11,6 2,4
Таблица 24
Активность анти-хламидийных абзимов. в мкМ МДА/мл
Пациенты группы
тепапии С До лечения Через 15 суток после начала лечения Через 30 суток после начала лечения Через 45 суток после начала лечения
ТСС1 15 28* 23* 23*
ТОС2 23 0 0 0
ТССЗ 25 17 0 13
ТСС4 60 0 0 0
ТСС5 45 1,7 0 0
ТОС6 43 18 0 0
ТСС7 140 53 20 20
ТСС8 130 57 17 3,3
ТОС9 18 0 0 13
55,6 19,4 6,67 8,10
- 31 009661
Таблица 25
Активность анти-хламидийных абзимов. в мкМ МЛА/мл
Пациенты
группы До лечения Через 60 суток после начала
терапии ϋ лечения
Т0О1 103 63
ТСО2 253 103
178 83,2
Таблица 26
Активность анти-хламидийных абзимов. в мкМ МЛА/мл
Пациенты
КОНТРОЛЬНОЙ группы (ПКГ) День 1 День 60
РСО1 43 43
РСО2 93 70
РСОЗ 60 53
РСО4 17 25
РСС5 70 55
РСО6 25 23
РС67 20 34
РСО8 70 68
РСО9 20 20
РСОЮ 30 27
РСО11 20 45
РСО12 170 150
РСО13 70 103
РСО14 45 57
РСО15 50 55
РСО16 53 71
РСО17 18 45
РСС18 15 34
РССИ9 45 67
РСО20 60 61
50,0+7,08 55,3+6,18
Таблица 27
Рагате1ег АгйЬготусш ΑζίΐΙίΓΟΓηνάη Λζίΰιτοηινοίη РСС Νοπη
ТЬегару Сгоир А + ап11ОХ14ап15 ТЬегару Сгоир С + азопт ТЬегару Сгоир В
Активность анти-хламидий- До лечения 47,5 + 8,96 55,0 ± 16,2 58,0 + 20,4 50,0+7,08 6,36 + 1,14
ных абзимов, в мкМ/МДА/мл Через 60 дн. после лечения 1,6 + 0,89 р< 0,001* 8,1 ±3,60 р < 0,05* 2,4 + 1,37 р < 0,05* 55,3+6,18 р>0,05
Антихламидий-ные До лечения 43,6 48,5 52,0 - 0
1аСг. (титр)'1 Через 60 дн. после лечения 0 р< 0,001* 0 р< 0,001* 0 р< 0,001* - 0
клинический статус. До лечения 19,4+1,79 18,6 + 0,81 20,4 ± 1,79 19,8+1,43 0
модифицир. анкета Роуза и Блэкберна (Коье С., ЕИаскЬит Н.) Через 60 дн. после лечения 14,4 + 1,14 р < 0,05* 15,4+ 1,75 р > 0,05 15,0+1,17 р<0,01* 21,5 + 1,19
коагуляция время свертывания кремнеземом**, в сек До лечения 151 + 18,8 200- 250
Через 60 дн. после лечения 222+18,4 р < 0,05*
-32009661 _________________________________________Таблица 28
I Показатели модифицированной анкеты Роуза-Блэкберна
Группа терапии/
пациент До лечения Через 60 суток после начала лечения
группа терапии А ТОА1 25 17
ТОА2 22 19
ТОАЗ 12 10
ТОА4 19 13
ТСА5 23 16
ТОА6 21 18
ТОА7 25 15
ТОА8 16 15
ТОА9 10 8
ТСАЮ 15 11
тсаи 25 17
19,4+1,79 14,4+1,14
группа терапии В ТСВ1 21 19
ТОВ2 17 14
ТСВЗ 23 14
ТОВ4 24 12
ТОВ5 19 19
ТОВ6 16 -
ТСВ7 24 13
ТСВ8 19 14
20,4 ±1,24 15,0+1,17
группа терапии С ТОС1 15 9
ТОС2 21 21
ТССЗ 18 13
ТСС4 16 16
ТОС5 19 9
ТОС6 21 21
ТОС7 17 17
ТСС8 20 13
ТСС9 20 20
18,6 + 0,81 15,4+1,75
Таблица 29
Код пациента Активность абзимов, день 0 Активность абзимов, день 60 Показатели РоузаБлэкберна, день 0 Показатели РоузаБлэкберна, день 60
ТОА2 90 3,3 22 19
ТОАЗ 80 6,7 12 10
ТСА4 40 0 19 13
ТОА6 15 6,7 21 18
ТОВЗ 15 0 23 14
ТОС5 45 0 19 9
ТОС7 140 20 17 17
- 33 009661
Таблица 30
Соединение и его концентрация Активность окисления липидов антихламидийными абзимами, в мкМ МДА/мл * Комментарии
Контроль 61
Азитромицин** Суспензия в воде 20мкМ ЮмкМ 2мкМ 1мкМ 0 0 0 19 Свойства антиоксиданта сравнимы с альфатокоферолом или более сильные
суспензия в ОМЗО 5мкМ 1мкМ 0 7
α-токофеоол в ОМ5О ЮмкМ 1мкМ 0 15
Таблица 31
ЛЕКАРСТВА Антиабзимная активность, в мкМ МДА/мл
Контроль 21,7
Бета-блокатор 1. Пропранолола гидрохлорид ΟΒδΙϋΑΝ 175 мкМ 35 мкМ 21,3
Нитраты 1. Тринитроглицерин ΡΕΚΜΝΟΑΝΙΤ 220 18,3
мкМ 44 мкМ
22 мкМ 4,4 мкМ 0
2. Изосорбиддинитрат Ι5ΟΚΕΤ 211 0 0
мкМ 0
42 мкМ Магний 0
1. Сульфат магния 101 мкМ 0
51 мкМ 40 мкМ 20 мкМ 0
* ν·1<·|/ηπ
1 Гепарин 0,1 мг/мл 16
2. Надропарин кальция ΡΚΑΧΙΡΑΚΙΝΕ 465 26
1Л 95 υι кальциевый блокатор каналов 1. Верапамила гидрохлорид 15ΟΡΤΓΝ 19.7 12.8
51мкМ 20,5
10,2 мкМ 5,1 мкМ Кортикостероиды 1. дексаметазон 25 мкМ 3
12,5 мкМ 24,0
Антибиотики 1. Линкомицина гидрохлорид 13 21,5
мкМ 6,5 мкМ 24,5
20,1 30,3 28,5
- 34 009661
Таблица 32
Обозначени е измерений времени свертывани я Средние результаты пациентов групп терапии А, В, С и О Обозначени е измерений времени свертывани я Контрольна я группа пациентов (КГП), без лечения Наша клинически здоровая контрольная группа
Коагу- До АРТТ 22,4 + 0,89
ляция* лечения РТ 13,5 + 0,94
8СТ 151 + 15,0 АРТТ 25,2 ±1,37 49,1 + 7,00
КСТ 51,2 ±4,59
Через 60 АРТТ 46,9 + 6,45 РТ 17,3 + 4,05 23,7 + 4,01
суток р < 0,005*
после РТ 25,3 ±4,05 8СТ 137 ± 11,5 248 ± 10,0
лечения р < 0,05*
8СТ 235+ 17,9 КСТ 50,3 + 2,16 133 ±23,7
р< 0,005*
КСТ 126 + 34,2
р > 0,05
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (8)

1. Способ лечения атеросклеротического состояния у индивида. включающий снижение опосредованной антителом активности окисления липидов в сосудистой системе указанного индивида.
2. Способ по п.1. отличающийся тем. что указанному индивиду вводят ингибитор указанного антитела.
3. Способ по п.1 или 2. отличающийся тем. что указанное антитело имеет сродство к клетке хламидии.
4. Способ по любому из пп.1. 2 или 3. отличающийся тем. что указанный способ дополнительно включает определение опосредованной антителом активности окисления липидов в образце сыворотки крови. полученном от индивида до. в течение и/или после указанного лечения.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов. отличающийся тем. что ингибитор выбран из группы. состоящей из антиидиотипических антител. антиоксидантов или агентов. хелатирующих металл.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов. отличающийся тем. что ингибитор выбран из группы. состоящей из десферриоксамина мезилата. гемопроизводных. пеницилламина. тиопронина. триэнтина дихлоргидрата. диэтилдитиокарбамата. динатриевой/тринатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. ацетилсалициловой кислоты. этилендиаминтетрауксусной кислоты. унитиола. альфатокоферола. маннита. азитромицина. силидианина и аскорбиновой кислоты.
7. Способ по любому из пп.1-4. отличающийся тем. что ингибитор представляет собой антимикробный агент.
8. Способ по п.7. отличающийся тем. что антимикробный агент выбран из группы. состоящей из эритромицина. рокситромицина. офлоксацина. клинафлоксацина. ципрофлоксацина. клиндамицина. азитромицина. доксициклина. миноциклина и тетрациклина.
- 35 009661
- 36 009661
Зависимость активности абзимов от стеноза коронарной артерии Активность абзимов = 10,803 + 3,6418 * стеноз Корреляция: г = 0,47818
Регрессия 95% доверит, инт.
Стеноз коронарной артерии
Фиг. 5
Зависимость триглицеридов от стеноза коронарной артерии Триглицериды = 163,10 - 1,109 * стеноз Корреляция: г = - 0,0760
Регрессия 95% доверит, инт.
О о : О Θ = о; 9 -О ° о о • О .........<£ О о о ................... -б .......о ; ------......... ...................1 °о о о ...•£Ь···; о О О ό О .............0 —— ............ ...........-.......8........-............. О -........Я5 0 8 О 8 .....о ?
Стеноз коронарной артерии
Фиг. 6
- 37 009661
Зависимость общего холестерина от стеноза коронарной артерии
Общий холестерин = 285,33 - 1,919 * стеноз Корреляция: г = - 0,0956
О ί . . о..,................. 0 о о .............. .......О*................ • О О 8 О 9 :....................§ --- О о ° о .....0 -...... : 0 8 ......0 θ - о....... .................в о § §....... — ое..........- § о о О ........о . 8 ............................ § § ......О.....§ 8
Стеноз коронарной артерии
Фиг. 7
Зависимость холестерина 1-01- от стеноза коронарной артерии Холестерин ίΟΙ. = 146,62 - 0,1908 * стеноз Корреляция: г = - 0,0089
EA200400338A 2001-08-22 2002-08-22 Способ лечения атеросклероза EA009661B1 (ru)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0120428A GB0120428D0 (en) 2001-08-22 2001-08-22 Method of analysis
US32312701P 2001-09-18 2001-09-18
US35565502P 2002-02-06 2002-02-06
GB0202774A GB0202774D0 (en) 2002-02-06 2002-02-06 Methods and means
GB0204611A GB0204611D0 (en) 2002-02-27 2002-02-27 Methods of measurement
GB0216530A GB0216530D0 (en) 2002-07-16 2002-07-16 Methods and means
GB0216755A GB0216755D0 (en) 2002-07-18 2002-07-18 Methods and means
PCT/GB2002/003884 WO2003017992A2 (en) 2001-08-22 2002-08-22 Means for treatment of atherosclerosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200400338A1 EA200400338A1 (ru) 2004-12-30
EA009661B1 true EA009661B1 (ru) 2008-02-28

Family

ID=27562595

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400338A EA009661B1 (ru) 2001-08-22 2002-08-22 Способ лечения атеросклероза

Country Status (9)

Country Link
EP (3) EP1456670B8 (ru)
JP (2) JP4374248B2 (ru)
AT (1) ATE436020T1 (ru)
AU (1) AU2002321526A1 (ru)
DE (2) DE60232913D1 (ru)
DK (2) DK1454140T3 (ru)
EA (1) EA009661B1 (ru)
ES (2) ES2328907T3 (ru)
WO (3) WO2003019196A2 (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005023368A1 (en) * 2003-09-04 2005-03-17 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Prophylaxis of and treatment for infections from the family chlamydiaceae using amino acids as leucine or methionine
WO2005027961A2 (en) * 2003-09-23 2005-03-31 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Chlamydia pmpd autotransporter and its role as adhesin
GB0323348D0 (en) * 2003-10-06 2003-11-05 Cambridge Theranostics Ltd Methods and means for modulating lipid metabolism
GB0503939D0 (en) 2005-02-25 2005-04-06 Cambridge Theranostics Ltd Chlamydia detection
GB0503940D0 (en) * 2005-02-25 2005-04-06 Cambridge Theranostics Ltd Assay methods
WO2006104402A1 (en) * 2005-03-26 2006-10-05 Protemix Corporation Limited Copper antagonist compositions
GB0515035D0 (en) * 2005-07-21 2005-08-31 Cambridge Theranostics Ltd Treatment of atherosclerotic conditions
US20090042814A1 (en) * 2005-10-14 2009-02-12 Ivan Petyaev Treatment and Diagnosis of Obligate Intracellular Pathogens
ITRM20110233A1 (it) * 2011-05-10 2012-11-11 Univ Calabria Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l?uso come neuroprotettori.

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0561744A1 (en) * 1992-03-20 1993-09-22 SIRC S.p.A. NATURAL &amp; DIETETIC FOODS Preparations containing chromium and vitamins E and C for controlling carbohydrate and lipid metabolism
EP0669132A1 (en) * 1994-02-23 1995-08-30 van der Kraaij, Antonius Marinus Maria Pharmaceutical composition of vitamin E and acetylsalicylate for treatment and prevention of atherosclerosis
WO1997041227A1 (en) * 1996-05-01 1997-11-06 T Cell Sciences, Inc. Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis
WO1998057622A1 (en) * 1997-06-19 1998-12-23 Lycored Natural Products Industries Ltd. Synergistic compositions for lycopene and vitamin e for the prevention of ldl oxidation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0561744A1 (en) * 1992-03-20 1993-09-22 SIRC S.p.A. NATURAL &amp; DIETETIC FOODS Preparations containing chromium and vitamins E and C for controlling carbohydrate and lipid metabolism
EP0669132A1 (en) * 1994-02-23 1995-08-30 van der Kraaij, Antonius Marinus Maria Pharmaceutical composition of vitamin E and acetylsalicylate for treatment and prevention of atherosclerosis
WO1997041227A1 (en) * 1996-05-01 1997-11-06 T Cell Sciences, Inc. Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis
WO1998057622A1 (en) * 1997-06-19 1998-12-23 Lycored Natural Products Industries Ltd. Synergistic compositions for lycopene and vitamin e for the prevention of ldl oxidation

Also Published As

Publication number Publication date
JP4307999B2 (ja) 2009-08-05
DK1456670T3 (da) 2009-11-16
WO2003017992A2 (en) 2003-03-06
WO2003019198A2 (en) 2003-03-06
AU2002321526A1 (en) 2003-03-10
JP2005501258A (ja) 2005-01-13
WO2003019198A3 (en) 2004-03-04
ES2329770T3 (es) 2009-12-01
EP1456670B8 (en) 2011-04-27
EP1456670A2 (en) 2004-09-15
DE60232992D1 (de) 2009-08-27
WO2003019196A3 (en) 2004-03-04
WO2003019196A2 (en) 2003-03-06
EP1454140A2 (en) 2004-09-08
JP2005502665A (ja) 2005-01-27
EP1456402A2 (en) 2004-09-15
WO2003017992A3 (en) 2004-06-17
DK1454140T3 (da) 2009-11-16
DE60232913D1 (de) 2009-08-20
EA200400338A1 (ru) 2004-12-30
JP4374248B2 (ja) 2009-12-02
ES2328907T3 (es) 2009-11-19
EP1456670B1 (en) 2009-07-15
ATE436020T1 (de) 2009-07-15
EP1454140B1 (en) 2009-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Foulis et al. Endotoxaemia and complement activation in acute pancreatitis in man.
Maggi et al. LDL oxidation in patients with severe carotid atherosclerosis. A study of in vitro and in vivo oxidation markers.
Sajithlal et al. The role of metal-catalyzed oxidation in the formation of advanced glycation end products: an in vitro study on collagen
JPH08507516A (ja) 脂質及び脂質含有粒子のグリコシル化、及びそれから誘導される診断及び治療方法及び物質
Qin et al. Vitamins C and E attenuate apoptosis, β-adrenergic receptor desensitization, and sarcoplasmic reticular Ca2+ ATPase downregulation after myocardial infarction
Schwedler et al. Native C-reactive protein induces endothelial dysfunction in ApoE−/− mice: implications for iNOS and reactive oxygen species
Sinisalo et al. The effect of prolonged doxycycline therapy on Chlamydia pneumoniae serological markers, coronary heart disease risk factors and forearm basal nitric oxide production.
EA009661B1 (ru) Способ лечения атеросклероза
US7419657B2 (en) Treatment of atherosclerotic disorders
US20220390454A1 (en) Biomarker panel targeted to diseases due to multifactorial ontology of glycocalyx disruption
Hellgren et al. Standard and reduced doses of sulfadoxine-pyrimethamine for treatment of Plasmodium falciparum in Tanzania, with determination of drug concentrations and susceptibility in vitro
US8183056B2 (en) Assay
Zhu et al. Detection of IgE antibodies specific for 1-phenyl-2, 3-dimethyl-3-pyrazoline-5-one by RAST: a serological diagnostic method for sensitivity to pyrazoline drugs
ES2328027T3 (es) Deteccion y diagnostico de encefalopatias esponjiformes transmisibles.
JPH095323A (ja) 酸化低比重リポ蛋白質の測定方法
Bayle et al. Hyperuricosuria and microhematuria in childhood
Dubé et al. Dissociation of authentic and artifactual effect of circulating heparin on drug protein binding
US20220288110A1 (en) Drug treatment and biomarker panel targeted to diseases due to multifactorial ontology of glycocalyx disruption
Shah The relationship between non transferrin bound iron and iron overload in thalassaemia and sickle syndromes
Aguilar et al. LDL induces cholesterol loading, inhibits endothelial proliferation, and angiogenesis in Matrigels: Correlation with impaired angiogenesis during wound healing 2
Priya A Study of Serum Bilirubin in Coronary Artery Disease Patients
Phan et al. MANUSCRIPT ID: CIRCULATIONAHA/2005/54185

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU