ITRM20110233A1 - Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l?uso come neuroprotettori. - Google Patents

Description

Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso come neuroprotettori

La presente invenzione concerne azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso come neuroprotettori. In particolare, l’invenzione concerne azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso come neuroprotettori nel trattamento o nella prevenzione del danno cerebrale causato da ischemia o emorragia, ad esempio nei seguenti disordini: stroke, trombosi cerebrale, embolismo cerebrale, attacchi ischemici transitori, arresto cardiaco, encefalopatia ipertensiva, emorragia cerebrale, trauma cerebrale e altri tipi di patologie, per esempio a livello dell’occhio (glaucoma) e del midollo spinale, associate ad un danno tissutale traumatico o ischemico. Inoltre, azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili sono utili come trattamento profilattico durante le procedure chirurgiche (per es. endoarterectomia carotidea e impianto di bypass coronarico) in cui esiste un potenziale rischio di danno tissutale ischemico.

L’ischemia cerebrale à ̈ la seconda causa di morte e la prima causa di disabilità a lungo termine nel mondo, associata pertanto ad importanti conseguenze cliniche e socioeconomiche che sottolineano il bisogno di terapie efficaci. Infatti, à ̈ stato stimato che ogni anno 15 milioni di persone sono colpite da questa patologia, che causa morte in circa 5 milioni di pazienti e invalidità permanente in altri 5 milioni.

L’ischemia cerebrale à ̈ caratterizzata da una riduzione della circolazione sanguigna nel cervello, che causa la compromissione di specifiche funzioni neurologiche che dipendono dal tipo di aree colpite. Le cause patofisiologiche sono eterogenee, includendo la trombosi, l’embolismo o l’emorragia. In particolare, l’ictus ischemico acuto, che rappresenta più dell’80% dei casi di ischemia cerebrale, si riferisce ad un accidente cerebrovascolare causato da trombosi o embolismo.

Quando un trombo o un embolo, proveniente dal cuore, dall’aorta o dalle arterie carotidi o vertebrali, si insidia nella circolazione cerebrale, il flusso ematico nella porzione distale del vaso occluso viene impedito. Pertanto, il ridotto apporto sanguigno al cervello produce invalidità e morte attraverso l’induzione di una complessa serie di processi cellulari che alla fine portano ad un danno tissutale irreversibile.

Come conseguenza del ridotto apporto energetico, le cellule si depolarizzano, si rigonfiano e una quantità eccessiva di amminoacidi eccitatori viene rilasciata nello spazio extracellulare. Il glutammato, in particolare, mediante attivazione dei recettori N-metil-D-aspartato, causa un abnorme influsso di calcio nella cellula e la successiva induzione di un danno cellulare irreversibile che si verifica entro pochi minuti nella regione di core ischemico, ovvero nell’area direttamente perfusa dal vaso occluso, dove ha luogo una riduzione severa (>90%) del flusso ematico.

Negli ultimi vent’anni, numerose strategie neuroprotettive, mirate a bloccare questi meccanismi dannosi (per es. bloccanti dei canali al calcio, antagonisti del glutammato, etc.) hanno portato a risultati deludenti nei trials clinici, sia per la mancanza di efficacia nell’uomo, sia per la comparsa di effetti collaterali gravi (Ginsberg, Neuropharmacology 2008; 55:363-389). Attualmente, l’unico farmaco efficace à ̈ l’attivatore tissutale del plasminogeno, ma solo pochi (meno del 5%) pazienti colpiti da ictus ischemico possono beneficiarne a causa della sua ristretta finestra terapeutica. Inoltre, anche in presenza di una trombolisi efficace, la maggior parte dei pazienti svilupperà deficit neurologici e sarà esposta ad un alto rischio di emorragia intracerebrale (Hacke et al., N Engl J Med 2008; 359:1317-29; Huang et al., Cerebrovasc Dis 2006; 22:423-428).

Alla luce di quanto esposto sopra risulta pertanto evidente l’esigenza di poter disporre di nuove terapie neuroprotettrici per il trattamento del danno cerebrale che superino gli svantaggi delle terapie note.

A tale scopo, la ricerca dovrebbe essere incentrata sul recupero del territorio periferico della penombra, dove la riduzione del flusso ematico non supera il 65-70% grazie alla presenza di vasi collaterali, e dove i meccanismi di morte cellulare vengono reclutati e procedono più lentamente rispetto al core, allargando pertanto la finestra temporale per il trattamento farmacologico (Lo et al., Nat Rev Neurosci 2003; 4:399-415; Endres et al., Cerebrovasc Dis 2008; 25:268-278).

Nella penombra l’evoluzione del danno tissutale à ̈ fortemente influenzata da eventi neuroinfiammatori che coinvolgono mediatori solubili e cellule specializzate attivati localmente o reclutati dalla periferia (see Amantea et al., FEBS J 2009; 276:13-26; Meisel et al., Nat Rev Neurosci 2005; 6:775-786). L’infiltrazione delle cellule dendritiche, dei linfociti e dei macrofagi avviene durante le prime fasi dopo l’insulto (Garcia et al., Am J Pathol 1994; 144:188-99; Kostulas et al., Stroke 2002; 33:1129-34; Yilmaz et al., Clin Sci Lond 2009; 118:147-57) e potrebbe significativamente influenzare l’evoluzione del danno cerebrale come sottolineato dall’evidenza che i topi SCID (con immunodeficienza combinata grave) sono protetti dal danno ischemico focale (Hurn et al., J Cereb Blood Flow Metab 2007; 27:1798-1805). La mancanza di linfociti T e B in questi topi porta anche ad una riduzione dei livelli cerebrali di mRNA per alcune citochine specifiche (per es. IL-6) e per i recettori delle chemochine (per es. CCR2, CCR3) dopo il danno da ischemia-riperfusione.

E’ interessante notare come studi recenti abbiano mostrato l’efficacia di farmaci immunomodulatori, quali FK506 o minociclina, nell’ischemia cerebrale (Brecht et al., Anat Rec 2009; 292:1993-2001; Noto et al., Biol Pharm Bull 2007; 30:313-317; Yrjanheikki et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:15769–74; Yrjanheikki et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:13496–500; see also Kim and Suh, Behav Brain Res 2009; 196:168-79), sottolineando ulteriormente il ruolo cruciale dei mediatori dell’infiammazione locale e sistemica sull’evoluzione del danno cerebrale ischemico.

L’azitromicina (N-metil-11-aza-10-deosso-10-diidroeritromicina) à ̈ un antibiotico ad ampio spettro appartenente alla classe dei macrolidi. L’azitromicina à ̈ stata scoperta indipendentemente da Bright, U.S. Pat. No 4,474,768 e da Kobrehel et al., U.S. Pat. No.

4,517,359. L’azitromicina agisce legando la subunità ribosomiale 50S dei microrganismi sensibili, interferendo così con la sintesi proteica microbica. Viene utilizzata in clinica per il trattamento di infezioni delle vie respiratorie, della cute e dei tessuti molli, di infezioni odontostomatologiche, di uretriti non gonococciche (da Chlamydia trachomatis), dell’ulcera molle (da Haemophilus ducreyi) (Zuckerman et al., Infect Dis Clin North Am. 2009;23(4):997-1026).

La prognosi dello stroke à ̈ fortemente influenzata da complicanze quali l’insorgenza di infezioni batteriche (Davenport et al., 1996; Stroke 27,415-20); in particolare, la polmonite rappresenta la causa più comune di aggravamento clinico del paziente ischemico (Henon et al., 2005, Stroke 26:392-8; Hilker et al., 2003, Stroke 34:975-81; Katzan et al., 2003, Neurology 60:620-5). Benchà ̈ gli studi sperimentali abbiano dimostrato un’efficacia del trattamento antibatterico preventivo con moxifloxacina nel migliorare l’esito clinico di animali sottoposti ad ischemia cerebrale focale (Meisel et al., 2004, Stroke 35:2-6), tali dati sono stati solo parzialmente confermati in clinica (Harms et al., 2008, PloSOne 3:e2158). Sono inoltre noti studi precedenti che hanno valutato l’effetto del trattamento cronico con dosi antimicrobiche di azitromicina sull’esito di patologie ischemiche, come effetto secondario all’azione antiinfettiva del farmaco (Anderson et al., 1999, Circulation 99:1540-7; Muhlestein et al., 2000, 102:1755-60; O’Connor et al., 2003, JAMA 290:1459-66; Voorend et al., 2004, 29th International Stroke Conference – San Diego CA; Grayston et al., 2005, N Eng J Med 352:1637-45).

Gli autori della presente invenzione hanno ora trovato che l’azitromicina ha effetto neuroprotettivo nell’ischemia cerebrale.

L’uso dell’azitromicina per il trattamento dello stroke ischemico costituisce un nuovo approccio molto vantaggioso dal punto di vista clinico, poiché oltre ad essere efficace, l’azitromicina à ̈ meno tossico di altri potenziali farmaci neuroprotettivi che, quando testati in clinica, hanno prodotto risultati insoddisfacenti (Ginsberg, Neuropharmacology 2008; 55:363-389).

Caratteristiche che rendono l’azitromicina un buon candidato per la terapia dell’ischemia includono: 1) una via di somministrazione che può essere sia orale sia parenterale; 2) una buona biodisponibilità orale e una lunga emivita plasmatica (Lalak N.J. Morris DL. Clinical Pharmacokinetics. 25(5):370-4, 1993; Foulds G. et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 25 Suppl A:73-82, 1990); 3) elevato accumulo nelle cellule, in particolare nei macrofagi, dove si raggiungono livelli 110 volte superiori rispetto a quelli sierici (Gladue RP. et al., Antimicrobial Agents & Chemotherapy.

33(3):277-82, 1989); 4) assenza di controindicazioni per l’utilizzo nei bambini e nelle donne in gravidanza (FDA categoria B); 5) gli effetti tossici sono poco gravi (Steigbigel N. Macrolides and clindamycin. In Mandell G, Bennett J, Dolin R, eds. Mandell, Douglas and Bennett's Principles and practice of infectious diseases. 4<th>ed. 1995. 334-46).

Gli inventori hanno condotto uno studio sugli animali a rischio di o sottoposti ad un episodio ischemico quale l’ischemia cerebrale focale riprodotta sperimentalmente mediante occlusione dell’arteria cerebrale media (MCAo) e hanno dimostrato che l’azitromicina induce neuroprotezione ossia riduce o previene il danno cerebrale ischemico e riduce il deficit neurologico associato. L’occlusione dell’arteria può essere permanente o transitoria, ovvero (quest’ultima) seguita dal ripristino del flusso ematico dopo un periodo di ostruzione vascolare. Questi modelli animali sono, pertanto, adatti a riprodurre vari tipi di stroke nell’uomo e a valutare il potenziale neuroprotettivo di un farmaco. Inoltre, tali modelli sperimentali consentono di determinare la capacità di un farmaco di prevenire il danno cerebrale e il deficit neurologico e, quindi, permettono di valutare l’utilità di tale composto per la terapia di pazienti a rischio di stroke ischemico, per la riduzione di un successivo danno cerebrale indotto dall’evento ischemico.

L’azitromicina può quindi essere vantaggiosamente impiegata per la terapia dello stroke acuto o di altre patologie quali la trombosi cerebrale, l’embolismo cerebrale, gli attacchi ischemici transitori, l’arresto cardiaco, l’encefalopatia ipertensiva, l’emorragia cerebrale, il glaucoma e il danno spinale. Oltre all’effetto neuroprotettivo quando somministrata dopo l’insulto ischemico acuto, l’azitromicina può anche essere usato come trattamento profilattico durante procedure chirurgiche (per es. chirurgia vascolare) che comportano un elevato rischio di danno tissutale ischemico. In tali casi, il pretrattamento con azitromicina può ridurre il danno tissutale ischemico che può essere causato dalle procedure chirurgiche che coinvolgono vasi di grosso calibro, come per esempio procedure per il trattamento degli aneurismi dell’aorta toracica o dell’aorta addominale. Altre situazioni in cui il danno tissutale ischemico può essere prevenuto impiegando il trattamento descritto qui, includono il bypass coronarico, l’angioplastica coronarica, l’impianto di stents arteriosi, la ricostruzione mesenterica e renale, le procedure infrainguinali, l’endoarterectomia carotidea, la chirurgia vascolare e le ricostruzioni dei vasi maggiori.

Secondo l’invenzione, l’azitromicina à ̈ somministrata per via parenterale appena possibile dopo l’insulto cerebrale acuto o profilatticamente attraverso la via orale durante le procedure chirurgiche associate ad un potenziale rischio di danno tissutale ischemico.

Poiché l’azitromicina à ̈ in grado di prevenire il danno cerebrale in modelli di ischemia transitoria caratterizzata dal ripristino del flusso ematico, il farmaco può essere impiegato per il trattamento dello stroke ischemico sia da solo sia in combinazione con altri agenti, quali per esempio i trombolitici come l’attivatore tissutale del plasminogeno, che riduce l’estensione dell’infarto cerebrale quando somministrato fino a poche ore dopo lo stroke.

La dose neuroprotettiva di azitromicina à ̈ minore rispetto alla dose antimicrobica. Sulla base dei dati nei roditori, l’ED50 per l’azione antimicrobica di azitromicina à ̈ circa 10 mg/kg (Girard et al., 1987, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31:1948-54); mentre, in accordo con la presente invenzione, la ED50 per l’effetto neuroprotettivo à ̈ pari a 0.59 mg/kg in topi sottoposti ad ischemia cerebrale (Fig. 1). Pertanto, dosi simili o più basse di quelle generalmente usate nell’uomo sono indicate per ottenere neuroprotezione nei confronti del danno ischemico. Le dosi di azitromicina riportate nello studio descritto sotto forniscono una guida generale per l’intervallo di dosi che può essere usato dall’operatore esperto per ottimizzare le dosi e i metodi della presente invenzione. Inoltre, tali intervalli di dose non precludono l’aumento o la riduzione della dose di azitromicina, eventualmente necessari per una particolare applicazione. Per esempio, la dose e lo schema di trattamento potrebbero variare se il farmaco à ̈ somministrato in combinazione con altri trattamenti, se esistono differenze inter-individuali nella farmacocinetica, ovvero nel metabolismo o eliminazione del farmaco.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso, sia in campo medico sia veterinario, come neuroprotettori nel trattamento o nella prevenzione del danno cerebrale causato da ischemia o emorragia, in cui l’azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili sono somministrati in un’unica dose ad un mammifero, ossia un animale, ad esempio un animale domestico, o un essere umano. Le applicazioni secondo la presente invenzione si riferiscono al danno cerebrale causato da ischemia o emorragia che può essere dovuta a infarto cerebrale, infarto emorragico, trauma cranico, emorragia sub-aracnoidea, emorragia intracerebrale, trombosi cerebrale, embolia cerebrale, arresto cardiaco, ictus, attacco ischemico transitorio, lesione traumatica cerebrale, dell’occhio o del midollo spinale, occlusione dell’arteria centrale retinica. Inoltre, il danno cerebrale può essere causato da ischemia o emorragia a seguito di chirurgia vascolare, ad esempio, endoarterectomia della carotide, chirurgia di bypass dell’arteria coronaria, angioplastica coronarica, ricostruzione dell’aorta toracica o addominale, ricostruzione vascolare mesenterica o renale, procedura infrainguinale, chirurgia di stent arterioso, chirurgia venosa, ricostruzione da trauma vascolare maggiore. Il danno cerebrale può anche essere associato a lesione dell’occhio o del midollo spinale.

Preferibilmente, la dose unica può essere somministrata entro 4 ore dal danno cerebrale, ossia prima della chirurgia a scopo preventivo o dopo l’evento ischemico o emorragico a scopo terapeutico.

Come detto sopra, azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso secondo l’invenzione possono essere associati a trombolitici, quale ad esempio l’attivatore tissutale del plasminogeno, detti principi attivi potendo essere somministrati contemporaneamente, in modo separato o sequenziale. Costituisce, inoltre, oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente o consistente in azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili e un trombolitico, quale ad esempio l’attivatore tissutale del plasminogeno, come principi attivi, in associazione con uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati.

Figura 1 mostra l’effetto della somministrazione sistemica intraperitoneale (i.p.) di azitromicina (AZT), al momento della riperfusione, in topi sottoposti ad MCAo transitoria (30 min). L’area (A), il volume (B, C) di infarto e l’edema (D) cerebrali sono stati misurati dopo 48h di riperfusione in topi pretrattati con azitromicina (0.15-150 mg/kg) o veicolo (n=3-5 topi per gruppo sperimentale). *P<0.05, **P<0.01 e ***P<0.001 vs veicolo (one-way ANOVA Dunnett’s post test).

Figura 2 mostra l’effetto dell’azitromicina, somministrata per via intraperitoneale al momento della riperfusione, in ratti sottoposti a MCAo transitoria (2h). L’area (A) e il volume (B) di infarto sono stati misurati dopo 22h di riperfusione in animali trattati con il farmaco (150 o 300 mg/kg) o il veicolo (n=5-6 ratti per gruppo sperimentale). *P<0.05 e **P<0.01 vs veicolo (one-way ANOVA Dunnett’s post test).

Figura 3 mostra l’effetto dell’azitromicina somministrata i.p. 2h dopo l’inizio della riperfusione, in ratti sottoposti ad MCAo transitoria (2h). L’area (A), il volume di infarto (B) e l’edema (C) cerebrali sono stati valutati dopo 7 giorni di riperfusione in animali trattati con il farmaco (150 mg/kg) o il veicolo (n= 4 ratti per gruppo sperimentale). *P<0.05 e **P<0.001 vs veicolo (Student’s t test).

Figura 4 mostra l’effetto dell’azitromicina somministrata i.p., 2h dopo l’inizio della riperfusione, in ratti sottoposti a MCAo transitoria (2h). Il deficit neurologico (A) e il peso corporeo (B) sono stati misurati per 7 giorni consecutivi dopo l’inizio della riperfusione in animali trattati con il farmaco (150 mg/kg) o veicolo (n=4 ratti per gruppo sperimentale). P<0.05 e **P<0.01 vs veicolo (Student’s t test).

Figura 5 mostra l’effetto dell’azitromicina somministrata per via orale, 30 min prima della MCAo permanente nei ratti. L’area (A) e il volume (B) di infarto cerebrali sono stati valutati 24h dopo l’occlusione distale del vaso in animali pretrattati con il farmaco (150 mg/kg, n=3) o veicolo (N=5). *P<0.05 vs veicolo (Student’s t test).

Figura 6 mostra l’effetto dell’azitromicina somministrata per via orale, 15 min prima dell’induzione di schemia in ratti sottoposti ad MCAo transitoria (2h). Il volume (A) e l’area (B) di infarto cerebrale sono stati valutati dopo 22h di riperfusione in animali pretrattati con il farmaco (50 o 150 mg/kg) o veicolo (n=4-6 ratti per gruppo sperimentale). **P<0.001 vs veicolo (one-way ANOVA Dunnett’s posthoc test).

Figura 7 mostra l’effetto dell’azitromicina somministrata per via orale al momento della riperfusione in ratti sottoposti ad MCAo transitoria (2h). L’area (A) e il volume (B) di infarto sono stati valutati dopo 22h di riperfusione negli animali pretrattati con azitromicina (150 mg/kg) o il veicolo (n=6 ratti per gruppo sperimentale).

ESEMPIO 1: Studio degli effetti di neuroprotezione della azitromicina in modelli di ischemia cerebrale Disegno sperimentale generale

L’azitromicina à ̈ stata testata in roditori, ovvero topi e ratti, sottoposti ad ischemia cerebrale focale indotta mediante occlusione dell’arteria cerebrale media (MCAo), sia di tipo irreversibile (permanente) che reversibile (transitoria, ovvero l’occlusione vascolare à ̈ seguita dal ripristino del flusso ematico). In ogni modello sperimentale, gli animali sono stati trattati con diverse dosi di azitromicina (0.15-300 mg/kg) e l’effetto neuroprotettivo à ̈ stato paragonato ad un controllo rappresentato dalla somministrazione del veicolo usato per preparare il farmaco. Il farmaco azitromicina à ̈ stato somministrato acutamente per via orale o intraperitoneale, sia prima che a diversi tempi dopo l’induzione di ischemia.

Gli animali sono stati sacrificati uno o 7 giorni dopo l’induzione di ischemia e i cervelli esaminati per determinare il volume dell’infarto cerebrale e l’estensione dell’edema al fine di valutare gli effetti del farmaco a breve e lungo termine sul danno cerebrale ischemico. Gli animali sono stati anche esaminati dal punto di vista comportamentale al fine di valutare eventuali effetti benefici del farmaco su funzioni tipicamente compromesse dall’insulto ischemico.

Modelli di ischemia cerebrale

Gli esperimenti sono stati condotti su un modello di stroke ischemico ampiamente accettato, rappresentato dall’occlusione dell’arteria cerebrale media in ratti e topi. Gli animali sono stati operati in anestesia generale per occludere sia permanentemente che transitoriamente l’arteria cerebrale media (MCA), un’operazione che determina un danno cerebrale tipico di questo modello che include lo striato e la corteccia frontoparietale. Come controllo, à ̈ stata usata un’operazione sham, in cui gli animali sono sottoposti alla stessa procedura chirurgica condotta per l’MCAo, ma senza occlusione del vaso. Ciò consente di escludere il contributo dello stress dovuto all’operazione chirurgica come errore sistematico sui risultati ottenuti.

In particolare, l’MCAo à ̈ stata prodotta in ratti e topi seguendo la tecnica relativamente non invasiva del filamento intraluminale, come descritto da Longa et al 1989 (Stroke 20, 84-91). Gli animali sono stati anestetizzati con isoflurano e un filamento di nylon ricoperto di silicone à ̈ stato inserito nella carotide esterna e fatto avanzare lentamente nella carotide interna, fino a sentire una leggera resistenza, indicativa dell’avvenuta occlusione dell’arteria cerebrale media a livello della sua origine nel circolo di Willis.

Il flusso ematico nel territorio della MCA (corteccia frontoparietale) Ã ̈ stato misurato mediante laser Doppler e solo gli animali con una significativa riduzione del flusso (> 70%) sono stati considerati ischemici e, quindi, a rischio di sviluppare un danno cerebrale.

Il comportamento degli animali sottoposti ad MCAo à ̈ stato valutato al fine di determinare il deficit neurologico associato al danno. A tal fine à ̈ stato attribuito uno score indicativo della gravità del danno: 0=nessun deficit, 1=mancata estensione della zampa anteriore sinistra, 2= ridotta resistenza ad una spinta laterale, 3= movimento rotatorio contro laterale, 4=ambulazione solo sotto stimolazione, 5= nessuna attività motoria spontanea.

Per determinare il danno cerebrale, gli animali sono stati sacrificati a specifici tempi dopo l’induzione di ischemia e i cervelli rapidamente prelevati. La valutazione dell’area e del volume di infarto 24h dopo l’induzione di ischemia à ̈ stata effettuata usando il colorante vitale cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolo (TTC). A tal fine, otto sezioni coronali consecutive di 2 mm di spessore sono state ottenute da ogni cervello partendo dal polo frontale usando una matrice (Harvard Apparatus, Massachusetts, USA) e colorate in una soluzione di TTC al 2% in salina per 10 min a 37°C.

Per valutare il danno cerebrale 2 o 7 giorni dopo MCAo, i cervelli sono stati rimossi e immediatamente congelati in isopentano raffreddato in ghiaccio secco. Con un criostato sono state ottenute sezioni coronali (spesse 20 µm), ad intervalli di 2 mm per il ratto e di 0.5 mm per il topo, poi colorate con cresil violetto. Le immagini delle sezioni colorate con TTC o cresil violetto sono state acquisite con uno scanner digitale e analizzate usando un software per analisi di immagini (ImageJ, versione 1.3). Il volume di infarto (mm<3>) à ̈ stato determinato sommando le aree infartuate (incolore) delle sezioni e moltiplicando il valore ottenuto per la distanza fra le sezioni. L’edema cerebrale à ̈ stato calcolato sottraendo il volume dell’intero emisfero contro laterale (non infartuato) da quello dell’emisfero ipsilaterale (infartuato).

Neuroprotezione indotta dal trattamento acuto per via parenterale con azitromicina

La somministrazione sistemica dell’azitromicina al momento della riperfusione riduce in maniera dosedipendente il danno cerebrale prodotto dalla MCAo transitoria nei topi. Infatti, negli animali trattati con il farmaco per via intraperitoneale (i.p.) si osserva un significativa riduzione del volume di infarto e dell’edema cerebrali misurati 48 h dopo l’inizio della riperfusione (Fig. 1). La ED50 per l’effetto neuroprotettivo à ̈ pari a 0.59 mg/kg (95%CI = 0.24-1.43). Non à ̈ stato osservato alcuno effetto dell’azitromicina sul flusso ematico basale e sulla entità di riduzione del flusso dopo MCAo.

L’effetto neuroprotettivo dell’azitromicina à ̈ stato anche confermato nel ratto. Infatti, la somministrazione i.p. del farmaco (150-300 mg/kg) al momento della riperfusione (2h dopo l’induzione di ischemia) ha determinato una significativa riduzione del volume di infarto prodotto da 2h MCAo seguite da 22h di riperfusione (Fig. 2). E’ interessante notare come il farmaco si dimostra efficace in un modello di ischemia caratterizzato da un’occlusione vascolare più prolungata (2h) rispetto a quella prodotta nel topo (30 min).

Al fine di determinare la finestra terapeutica dell’azitromicina, essa à ̈ stata somministrata anche dopo 2h dall’inizio della riperfusione (ovvero dopo 4h dall’induzione di ischemia). Alla dose di 150 mg/kg (i.p.) il farmaco ha determinato una riduzione del 60.7% (rispetto al veicolo) dell’edema cerebrale misurato dopo 24h di MCAo, dimostrando un’ampia finestra terapeutica.

E’ ancora più interessante notare come il posttrattamento acuto con azitromicina (150 mg/kg, i.p., 4h dopo MCAo) ha prodotto un effetto neuroprotettivo a lungo termine, in quanto ha determinato una significativa riduzione (rispetto al veicolo) del volume di infarto e dell’edema cerebrale misurati dopo 7 giorni di riperfusione nei ratti sottoposti a 2h MCAo (Fig. 3). L’effetto neuroprotettivo à ̈ risultato associato anche ad una riduzione del deficit neurologico negli animali trattati con azitromicina rispetto quelli che hanno ricevuto il solo veicolo (Fig. 4A). Il miglioramento comportamentale à ̈ stato rilevato già dopo 3 giorni dal trattamento ed à ̈ risultato massimo dopo 5-6 giorni (Fig. 4A) e non correlato con variazioni del peso corporeo degli animali (Fig. 4B).

Nell’insieme questi dati dimostrano che la somministrazione sistemica dell’azitromicina risulta efficace nel limitare il danno cerebrale ischemico ed il deficit neurologico provocati dall’ischemia cerebrale focale nei mammiferi. L’evidenza che il farmaco determina neuroprotezione quando somministrato al momento della riperfusione dimostra la sua validità terapeutica in associazione ai trombolitici per migliorare il recupero neurologico dei pazienti colpiti da stroke.

Neuroprotezione indotta dalla somministrazione acuta dell’azitromicina per via orale

La somministrazione orale dell’azitromicina (150 mg/kg), 30 min prima dell’induzione di ischemia permanente, nei ratti ha determinato una significativa neuroprotezione come dimostrato dall’analisi con TTC condotta 24h dopo l’insulto (Fig. 5).

Il pretrattamento per via orale con il farmaco (150 mg/kg), 15 min prima dell’insulto, si à ̈ dimostrato efficace anche in un modello di ischemia transitoria (2h MCAo 22h di riperfusione) nel ratto (Fig. 6); al contrario, la somministrazione al momento della riperfusione, non ha prodotto alcun effetto sul danno cerebrale ischemico (Fig. 7).

Questi dati dimostrano che l’azitromicina può essere sfruttata nel trattamento profilattico durante procedure chirurgiche associate ad un elevato rischio di danno tissutale ischemico.

Ciò risulta notevolmente interessante dal punto di vista clinico poiché la maggior parte dei composti con documentata azione neuroprotettiva nei modelli sperimentali e che ha determinato qualche beneficio anche nei pazienti colpiti da ischemia, non à ̈ sfruttabile in clinica per la comparsa di gravi effetti tossici (Ginsberg, 2008, Neuropharmacology 55: 363-389). Tali effetti indesiderati ostacolano l’utilizzo di questi farmaci per il trattamento profilattico dei pazienti ad alto rischio di patologie ischemiche. Al contrario, secondo la presente invenzione, l’azitromicina à ̈ efficace nel trattamento profilattico per ridurre il rischio di stroke senza produrre effetti collaterali gravi nell’uomo.

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1) Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso come neuroprotettori nel trattamento o nella prevenzione del danno cerebrale causato da ischemia o emorragia, in cui l’azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili sono somministrati in un’unica dose ad un mammifero.
2. 2) Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui il danno cerebrale à ̈ causato da ischemia o emorragia dovuta a infarto cerebrale, infarto emorragico, trauma cranico, emorragia subaracnoidea, emorragia intracerebrale, trombosi cerebrale, embolia cerebrale, arresto cardiaco, ictus, attacco ischemico transitorio, lesione traumatica cerebrale, dell’occhio o del midollo spinale, occlusione dell’arteria centrale retinica.
3. 3) Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui il danno cerebrale à ̈ causato da ischemia o emorragia dovuta chirurgia vascolare.
4. 4) Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso secondo la rivendicazione 3, in cui la chirurgia vascolare à ̈ endoarterectomia della carotide, chirurgia di bypass dell’arteria coronaria, angioplastica coronarica, ricostruzione aorta toracica o addominale, ricostruzione vascolare mesenterica o renale, procedura infrainguinale, chirurgia di stent arterioso, chirurgia venosa, ricostruzione da trauma vascolare maggiore.
5. 5) Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui il danno cerebrale à ̈ associato a lesione dell’occhio o del midollo spinale.
6. 6) Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui il mammifero à ̈ un animale o un essere umano.
7. 7) Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti in associazione con trombolitici.
8. 8) Azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili per l’uso secondo la rivendicazione 7, in cui il trombolitico à ̈ l’attivatore tissutale del plasminogeno.
9. 9) Composizione farmaceutica comprendente o consistente in azitromicina, suoi sali o solvati farmaceuticamente accettabili e un trombolitico, come principi attivi, in associazione con uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili.
10. 10) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 9, in cui il trombolitico à ̈ l’attivatore tissutale del plasminogeno.