ES2328907T3 - Diagnostico y tratamiento de la aterosclerosis. - Google Patents

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Abstract

Método para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo que comprende: analizar la capacidad de un anticuerpo de una muestra de suero obtenida del individuo para oxidar lípidos y unirse a un antígeno de células de Chlamydia, siendo la presencia de un anticuerpo en dicha muestra que oxida lípidos y se une a un antígeno de células de Chlamydia indicativa de que el individuo padece o presenta riesgo de padecer un trastorno aterosclerótico.

Description

Diagnóstico y tratamiento de la aterosclerosis.
La presente invención se refiere a métodos para valorar y tratar la aterosclerosis y afecciones relacionadas en un individuo. Los métodos de la presente invención son útiles en el diagnóstico clínico, pronóstico, profilaxis y terapia de aterosclerosis y trastornos relacionados.
Los autoanticuerpos contra lípidos, tales como el colesterol [Swartz G.M., Jr., et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, 1902-1906, Alving C.R. y Swartz G.M., Jr. Critical Reviews in Immunology (1991), 10, 441-453.], fosfolípidos [Alving C.R. Biochem. Soc.. Trans. (1984), 12, 342-344.] y lipoproteínas de baja densidad (LDL) se encuentran en el plasma humano [Kabakov A.E. et al Clin. Immun. Immunopath. (1992), 63, 214-220, Mironova M et al Ibid. (1997), 85, 73-82.] y están implicados en el desarrollo de la aterosclerosis [Lopes-Virella M.F. y Virella G. Clin. Immun. Immunopath. (1994), 73, 155-167, Kiener P.A. et al Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1995), 15, 990-999.].
Por separado, ni los anticuerpos ni las LDL son un factor patogénico, sólo el complejo inmune de los dos [Tertov V.V et al Atherosclerosis (1990), 81, 183-189, Orekhov A.N. et al Biochem. Biophys. Res. Comm. (1989), 162, 206-211.].
Se sabe que los complejos inmunes que comprenden lipoproteínas de plasma no modificadas tienen una aterogenicidad baja. Sin embargo, si se modifican las lipoproteínas, en particular se oxidan, estos complejos inmunes se vuelven altamente aterogénicos [Orekhov A.N. et al Biobhem. Biophys. Res. Comm. (1989), 162, 206-211, Orekhov A.N. et al Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1991), 11, 316-326.]. La oxidación de los lípidos del plasma, que toman la forma de la peroxidación, se consideran generalmente responsable del desarrollo de la aterosclerosis y es una característica observada y publicada de manera sistemática de esta enfermedad en un centro médico [Goto Y. In: Lipid Peroxides in Biology and Medicine, Ed. Yagi K., Academic Press, New York, London, Tokyo (1982), 295-303, Halliwell B. y J.M.C. Gutteridge, Free Radicals in Biology and Medicine, Clarendon Press, Oxford, 1989, Schultz D et al Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2000), 20, 1412-1413.]. Sin embargo, hasta la presente invención, la causa de esta peroxidación en el plasma no estaba clara.
Petyaev IM (2000) J. Submicrosc Cytol Pathol 32 13 477 describe la extracción de anticuerpos que se unen y oxidan las lipoproteínas de baja densidad (LDL) de lesiones ateroscleróticas humanas.
Kalayoglu MV et al J. Infect Dis (1999) 180 3 780-790 describe la inducción de la oxidación celular de LDL por Chlamydia pneumoniae y hsp60.
La presente invención se refiere al descubrimiento de que un subgrupo de autoanticuerpos son capaces tanto de unirse como de oxidar lípidos y lipoproteínas. Estos anticuerpos catalíticos reaccionan con y oxidan lipoproteínas de baja densidad para generar factores altamente aterogénicos y son el primer ejemplo descrito de abzimas anti-lípidos.
Los anticuerpos catalíticos, tal como se describen en la presente invención, presentan varias aplicaciones relacionadas con los trastornos ateroscleróticos, por ejemplo, en métodos para evaluar, determinar o detectar un trastorno aterosclerótico en un individuo. Dichos métodos se pueden utilizar para determinar la presencia o gravedad de un trastorno aterosclerótico en un individuo o para determinar el riesgo de que un individuo padezca en el futuro un trastorno aterosclerótico. Los anticuerpos catalíticos, tal como se describen en la presente invención, también son útiles en métodos y medios relacionados con el tratamiento de trastornos ateroscleróticos.
En diversos aspectos, la presente invención proporciona métodos para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo tal como se establece en la reivindicación 1.
Un método para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo puede comprender:
analizar la capacidad de un anticuerpo de una muestra obtenida del individuo para oxidar lípidos.
La presencia en la muestra de un anticuerpo que oxida lípido es indicativo de que el individuo tiene o padece un trastorno aterosclerótico o presenta el riesgo de padecer dicho trastorno en el futuro. La cantidad, nivel o actividad de dichos anticuerpos es indicativo de la gravedad de trastorno, es decir, mayores cantidades y/o actividad de anticuerpo son indicativos de una mayor gravedad del trastorno. Estos métodos son por tanto adecuados para determinar la presencia y/o gravedad de un trastorno aterosclerótico en un individuo.
Dicho método puede comprender, por ejemplo, capturar un anticuerpo de una muestra de suero, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-idiotípico inmovilizado, y determinar la actividad de oxidación de lípidos del anticuerpo capturado.
Un anticuerpo oxidante de lípidos es una molécula que es miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas (por ejemplo, una inmunoglobulina, tal como IgG, IgM o IgE) que está asociada tanto con la actividad de unión como catalítica. Después de la purificación, por ejemplo, utilizando proteína G, un anticuerpo oxidante de lípidos muestra una actividad tanto de unión a antígeno como catalítica (es decir, oxidación de lípidos).
Las actividades de unión y catalítica pueden ser intrínsecas a un anticuerpo oxidante de lípidos. Alternativamente, la actividad oxidante de lípidos puede ser debida a una molécula catalítica que está estrechamente unida al anticuerpo y se copurifica con la misma (por ejemplo, utilizando una columna de Proteína G/Proteína A o Proteína L) en un complejo. Esta molécula catalítica puede ser una inmunoglobulina o una no inmunoglobulina, tal como una enzima o un ion metálico. Después de la purificación, el complejo muestra actividad de unión del anticuerpo y actividad catalítica de la molécula catalítica. Un anticuerpo oxidante de lípidos, alternativamente, puede iniciar la oxidación de lípidos mediante otro mecanismo, por ejemplo, alterando el medio del antígeno de los lípidos (por ejemplo, a través de la activación de monocitos) o alterar el lípido o lipoproteína para facilitar la oxidación de lípidos.
Un anticuerpo catalítico puede ser específico para un epítopo concreto que es transportado por un grupo de antígenos y, por tanto, puede unirse a diferentes antígenos que transportan el mismo epítopo. El anticuerpo puede mostrar una unión no significativa a otros epítopos. El anticuerpo se dice de este modo que se "une específicamente" al epítopo o a un antígeno que comprende el epítopo. Un epítopo que es reconocido por el anticuerpo puede ser compartido por una molécula huésped y un antígeno de un agente infeccioso, por ejemplo, una bacteria, hongo, virus o protozoos. Un anticuerpo oxidante de lípidos producido por un huésped en respuesta a un antígeno extraño, por ejemplo, durante una infección patogénica, puede, de este modo, reaccionar de manera cruzada con lípidos huéspedes o lipoproteínas u otros antígenos.
El anticuerpo oxidante de lípidos se puede unir de este modo a tanto una molécula huésped como un antígeno extraño y puede catalizar la oxidación de una o ambas moléculas.
Un antígeno puede ser un miembro de una familia de moléculas que comparten una elevada identidad en la secuencia (es decir, homólogos) que se hallan en un rango de agentes infecciosos (por ejemplo, en dos o más especies de bacterias gram -ve) o el antígeno puede ser específico a un agente infeccioso concreto (es decir, no presente homólogos en otras especies). Además, el mismo epítopo puede estar presente en antígenos de diferentes agentes infecciosos que no comparten en cambio niveles elevados de identidad en la secuencia (es decir, no homólogas). Ejemplos de antígenos que son comunes a un rango de agentes infecciosos incluyen apo-lipoproteína B, OmpA, lipopolisacárido (LPS), hsp60 MQMP, (P)OMP, p54 y lípido A.
Los individuos que pueden ser objeto de los métodos de la presente invención incluyen humanos y animales no humanos, incluyendo animales domésticos, tales como perros, gatos, caballos y loros, animales de granja, tales como ovejas y ganado y animales raros o exóticos, tales como elefantes y tigres. Por las referencias a "humano" en la presente invención debería entenderse que incluyen no humanos, a excepción de cuando el contexto específico indica lo contrario.
Un anticuerpo en un método tal como se describe en la presente invención puede estar aislado, purificado y/o extraído de una muestra, o puede estar comprendido en un suero, plasma, sangre u otra muestra biológica obtenidas de un individuo. Preferiblemente, el anticuerpo se encuentra en una muestra de sangre, suero o plasma y puede ser, por ejemplo, una molécula IgG.
A las moléculas de anticuerpo que catalizan la oxidación de lípidos se hace referencia aquí como moléculas de anticuerpo catalíticas, abzimas anti-lípidos, abzimas o anticuerpos oxidantes de lípidos. Tal como se ha descrito anteriormente, dichos anticuerpos catalíticos pueden tener una actividad de lípido oxidasa intrínseca o inherente u otra actividad que conduce a la oxidación de lípidos o pueden estar asociados de forma natural (es decir, unidos o enlazados a de forma no covalente en su estado natural en el cuerpo) con una molécula que presenta actividad lípido oxidasa.
Los métodos tal como se describen aquí pueden ser útiles en la determinación de si un individuo presenta una afección aterosclerótica y la determinación de la evolución apropiada del tratamiento. Por ejemplo, un método puede comprender analizar la capacidad de un anticuerpo de una muestra obtenida de un individuo para oxidar lípidos, y: reducir la actividad oxidante de lípidos mediada por anticuerpos en el sistema vascular del individuo; si es necesario tal como se describe a continuación.
Los datos experimentales en la presente solicitud muestra además que un subgrupo de los anticuerpos que se desarrollan en respuesta a la infección por Chlamydia son auto-anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con el antígeno huésped y son responsables de la peroxidación de lípidos de plasma. Se observa que los anticuerpos anti-Chlamydia catalíticos están presentes en fracciones de IgG anti-lipoproteína extraídas de lesiones ateroscleróticas humanas y el suero de los pacientes con complicaciones clínicas de aterosclerosis, pero no en IgG extraída del suero de personas sanas. Los anticuerpos catalíticos que se unen y oxidan lípidos tal como se describe aquí puede ser reactivo por tanto, es decir que se une a una célula de Chamydia.
Aunque la aterosclerosis se ha relacionado en el pasado con la presencia en la pared arterial de las bacterias Chlamydia pneumoniae [Roivainen M. et al Circulation (2000), 101, 252-257, Siscovick D.S. et al. J. Infect. Dis. (2000), 181, Suppl. 3, S417-420 y US6.281.199], no se puede utilizar un test serológico para detectar anticuerpos anti-Chlamydia específicos en el plasma o suero de pacientes [Mendall M. et al (1995) J. Infect. 30 121-128, Wang S-P et al (1970) 70 367-374] con el fin de identificar o distinguir un paciente con aterosclerosis. Una parte significativa de la población presenta un historial con infección por Chlamydia y, como resultado, presentan anticuerpos anti-Chlamydia específicos en su suero, sin ninguna manifestación clínica de aterosclerosis [Davidson M. et al Circulation (1998), 98, 628-633m, Song Y.G. et al Yonsei Med. J.(2000), 41, 319-327.].
La presencia de anticuerpos anti-Chlamydia per se en el plasma o el suero no es por tanto indicativo de ateroscloerosis.
Sin embargo, en la presente invención se observa que los anticuerpos anti-Chlamydia catalíticos que reaccionan de forma cruzada con antígenos humanos y catalizan la oxidación de lipoproteínas del plasma son útiles tanto como marcadores para trastornos ateroscleróticos como dianas para el tratamiento de dichos trastornos.
Un método de ensayo para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo puede por tanto comprender:
analizar la capacidad de un anticuerpo de una muestra obtenida de un individuo para unirse a un antígeno de célula de Chlamydia y oxidar lípidos.
En algunas realizaciones, un método puede incluir:
determinar la actividad de oxidación de lípidos de una molécula de anticuerpo de una muestra obtenida del individuo, donde dicha molécula de anticuerpo se une a un antígeno de Chlamydia.
En otras realizaciones, un método puede incluir:
determinar la unión a un antígeno de Chlamydia de una molécula de anticuerpo de una muestra obtenida del individuo, donde dicha molécula de anticuerpo posee actividad de oxidación de lípidos (es decir oxida lípidos).
En realizaciones adicionales, un método puede incluir:
determinar la unión a un antígeno de Chlamydia de una molécula de anticuerpo de una muestra obtenida de un individuo;
y,
determinar la actividad de oxidación de lípidos de dicha molécula de anticuerpo.
La presencia en una muestra de una molécula de anticuerpo que es reactiva con (es decir, se une) un antígeno de Chlamydia y que posee la actividad biológica de oxidar lípidos es indicativo de que el individuo padece o es susceptible o presenta el riesgo de padecer un trastorno aterosclerótico, es decir, un método puede comprender además deducir a partir de dicha actividad y unión si el individuo presenta un trastorno aterosclerótico.
La cantidad o nivel de anticuerpo oxidante de lípidos presente en la muestra es indicativa de la gravedad de la afección. Dicha molécula de anticuerpo puede oxidar, en particular peroxidar, la parte lipídica de lipoproteínas del plasma, en particular lipoproteínas de baja densidad, por ejemplo, Apo-B, tal como se describe a continuación.
Las moléculas de anticuerpo oxidantes de lípidos pueden ser abzimas o moléculas de anticuerpo anti-Chlamydia, es decir, se unen o son reactivas con un antígeno de células de Chlamydia.
Un antígeno de Chlamydia tal como se describe en la presente invención puede ser cualquier inmunógeno o componente inmunogénico de una células de Chlamydia, es decir, una molécula de Chlamydia que provoca o es capaz de provocar una respuesta inmune en un mamífero contra la células de Chlamydia, por ejemplo, Hsp60 (Huittinen et al (2001) Eur Resp. J. 17(6) 1078-1082, Kinnunen A. et al (2001) Scand. J. Immunol. 54(1-2) 76-81). Preferiblemente, el antígeno es un antígeno proteico o lipídico, es decir, comprende o consiste en un grupo o resto de lípido. Un antígeno lipídico puede ser, por ejemplo, un lípido, lipoproteína u otro componente celular asociado a lípidos que se une a anticuerpos anti-Chlamydia y el término "antígeno lipídico" se refiere a cualquiera de estos componentes. Un ejemplo de un antígeno lipídico adecuado es un lipopolisacárido (LPS). Un antígeno se puede purificar y/o aislar o estar comprendido en una célula de Chlamydia, preferiblemente en la superficie de una célula de Chlamydia. Los métodos adecuados para purificar y/o aislar dicha lipoproteína son conocidos en la técnica, por ejemplo, HPLC.
Se ha observado que los anticuerpos desarrollados contra apo-lipoproteína B humana son reactivos con células Chlamydiales (véase ejemplo 7). En algunas realizaciones, un anticuerpo oxidante de lípidos tal como se describe en la presente invención puede ser por tanto reactivo con apolipoproteína B humana. Dicho anticuerpo también puede ser reactivo con lipopolisacárido (LPS) de Chlamydia.
Una célula Chlamydial puede ser una célula de una especie que pertenece al grupo Chlamydia psittaci. El grupo Chlamydia psittaci incluye Chlamydia psittaci y Chlamydia pneumoniae. En algunas realizaciones preferidas, la célula Chlamydial es una célula Chlamydia psittaci ovina. Las preparaciones adecuadas de Chlamydia psittaci ovina viva en forma liofilizada están disponibles comercialmente (Intervet).
Tal como se ha descrito anteriormente, la oxidación de lípidos, tal como la peroxidación, es uno de los principales procesos que conducen a la conversión de lipoproteínas circulantes en factores altamente aterogénicas [Goto Y. (1982) supra, Halliwell B., y J.M.C. Gutteridge, (1989) supra, Schultz D., y Harrison D.G. (2000) supra] y anticuerpos catalíticos, por ejemplo, anticuerpos catalíticos desarrollados en respuesta a infección Chlamydial, representan un factor patogénico clave que es responsable del desarrollo de la aterosclerosis. Además, esta función hace que estos anticuerpos catalíticos sean una diana importante para la intervención terapéutica en afecciones relacionadas con la aterosclerosis.
Los métodos para evaluar un trastorno aterosclerótico tal como se describen aquí son útiles en la determinación del tratamiento terapéutico óptimo para un individuo. Por ejemplo, un individuo que presenta abzimas anti-lípidos indicativas de una afección aterosclerótica se puede someter a tratamiento terapéutico para aliviar la afección o sus síntomas. El nivel o cantidad de abzimas anti-lípidos es indicativo de la gravedad de la afección y se puede utilizar para determinar si la evolución terapéutica concreta es apropiada o no.
Un individuo que se encuentra que es susceptible o presenta un mayor riesgo de padecer un trastorno aterosclerótico puede llevar a cabo el tratamiento, por ejemplo, con antioxidantes o antibióticos tal como se describe a continuación, para reducir el riesgo de que tenga lugar el trastorno, para retrasar o evitar la aparición o reducir la gravedad del trastorno.
Los métodos pueden comprender además la etapa de reducir la actividad de oxidación de lípidos mediada por anticuerpos en dicho individuo, en particular en el sistema vascular de dicho individuo, tal como se describe a continuación.
Aunque las pruebas serológicas actuales para anticuerpos anti-Chlamydia se diseñan para medir su nivel en diluciones o titulaciones y son semicuantitativas, los métodos descritos en la presente invención permiten la medición del grado de peroxidación de lípidos causada por la fracción catalítica de estos anticuerpos. El grado de desarrollo de la reacción de oxidación es una función lineal de la concentración de anticuerpos anti-Chlamydia catalíticos presentes en la muestra (véase la figura 2). Los presentes métodos proporcionan por tanto un ensayo cuantitativo que proporciona la medida del nivel de anticuerpos anti-Chlamydia catalíticos en la muestra.
Los métodos para evaluar una afección aterosclerótica tal como se describe en la presente invención puede incluir cuantificar, medir o determinar la cantidad de molécula de anticuerpo en una muestra. La cantidad se puede determinar mediante cualquier método conveniente, por ejemplo determinando la cantidad, nivel o grado de oxidación de lípidos o actividad de oxidación de lípidos y correlacionando esto con la cantidad de molécula de anticuerpo presente.
La cuantificación de la cantidad de anticuerpo anti-Chlamydia catalítico en una muestra de un individuo se puede utilizar para cuantificar el grado de riesgo o susceptibilidad del individuo a un trastorno aterosclerótico.
Además, la cantidad de anticuerpo anti-Chlamydia catalítico en una muestra también puede ser indicativa de la gravedad del trastorno. Los métodos descritos en la presente invención son por tanto útiles en el diagnóstico y pronóstico de una afección aterosclerótica en un individuo.
La actividad de oxidación de lípidos, incluyendo la actividad de peroxidación de lípidos, se puede determinar determinando (por ejemplo midiendo o detectando) la oxidación del lípido huésped (es decir, lípido de la muestra), lípido de un antígeno extraño, tal como una célula Chlamydia, o lípido de otro origen, que se puede añadir, por ejemplo, como parte de un método de ensayo.
La oxidación de lípidos se puede determinar midiendo la acumulación de productos o subproductos, tales como moléculas informadoras acopladas cooxidadas o la desaparición o agotamiento de sustratos, tales como lípidos no modificados o cosustratos, tales como oxígeno.
En la técnica se conocen muchos métodos para determinar la peroxidación de lípidos y son adecuados para su uso según la presente invención. El modo exacto de determinar la oxidación de lípidos no es una característica de la presente invención y los expertos en la materia son capaces de elegir un modo adecuado según su preferencia y conocimiento general.
Los métodos adecuados se describen, por ejemplo, en CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, CRC Press, Boca Raton, Florida (1985), Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 186, Academic Press, London (1990); Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 234, Academic Press, San Diego, New York, Boston, London (1994); y Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996).
En realizaciones preferidas, la oxidación se determina determinando la producción (es decir, la presencia o cantidad) de un producto de oxidación de lípidos.
Se pueden determinar los productos y/o intermedios de oxidación de los lípidos en los que se inició la oxidación o se pueden determinar los productos y/o intermedios de oxidación de lípidos en los que se propagó la oxidación.
Un producto de oxidación de lípidos adecuado puede incluir aldehídos, tales como malondialdehído (MDA), peróxidos (lípidos), dienos conjugados o gases hidrocarburos. Los productos de oxidación de lípidos se puede determinar mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, los productos de peroxidación de lípidos se pueden determinar utilizando HPLC (Brown, R.K., y Kelly, F.J en: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 119-131), espectroscopía UV (Kinter, M. Quantitative analysis of 4-hydroxy-2-nonenal. Ibid., 133-145), o cromatografía de gases-espectrometría de masas (Morrow, J.D., y Roberts, L.J. F2-Isoprostanes: prostaglandin-like products of lipid peroxidation. Ibid., 147-157).
La peroxidación de lípidos puede conducir a una oxidación de proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y otros tipos de moléculas. Los productos de dicha oxidación también se pueden utilizar para la medición indirecta de la actividad de las abzimas. Además, la peroxidación puede conducir a cambios en las propiedades de moléculas informadoras asociadas con la propagación de la oxidación de lípidos. Tal como se describe a continuación, las moléculas informadoras también se pueden encapsular en estos lípidos, por ejemplo, como liposomas, y la liberación de la molécula informadora del liposoma es indicativa de oxidación.
Entre las sustancias y moléculas informadoras adecuadas se pueden incluir bacterias luminosas intactas, luminol, lucigenina, folasina y luciferina. Dichas sustancias se pueden acoplar, por ejemplo, a H_{2}O_{2}/O_{2}^{\bullet \ -}/O_{2}-utilizando moléculas, tales como peroxidasa, esterasa, oxidasa, luciferasa, catalasa, superóxido dismutasa, perileno, NAD^{+}, y ésteres de acridinio oxalato de bis (triclorofenilo) (Campbell A.K. Chemiluminescence. VCH, Ellis Horwood Ltd., Inglaterra, 1988).
Se pueden utilizar otros materiales susceptibles de reacciones en cadena con radicales libres para determinar la oxidación de lípidos. Por ejemplo, la peroxidación de lípidos, como un proceso en cadena, inicia y aumenta la polimerización de acrilamida. Por tanto, la oxidación de lípidos se puede determinar determinando la copolimerización de ^{14}C-acrilamida (Kozlov Yu P. (1968) Role of Free Radicals in normal and pathological processes. Doctorate thesis - MGU Moscow 1968).
Dado que la peroxidación de lípidos y lipoproteínas es un proceso mediado por radicales libres, se pueden medir las abzimas oxidantes de lípidos mediante la detección de estos radicales. Los radicales se pueden detectar o determinar utilizando quimioluminiscencia intrínseca de bajo nivel (con o sin sensibilizantes (Vladimirov, Y.A., y Archakov, A.I. Lipid Peroxidation in Biological Membranes. Nauka, Moscow (1972); Vladimirov, Y.A. Intrinsic low-level chemiluminescence. En: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 65-82), resonancia de spin electrónico (con "spin trapping" (Mason, R.P. In vitro and in vivo detection of free radical metabolites with electron spin resonance. En: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 11-24) o sin "spin trapping" (Petyaev, M.M. Biophysical approaches in the diagnosis of cancer. Medicina, Moscow (1972)) u otras técnicas conocidas en el sector. La oxidación de lípidos también se puede determinar determinando el agotamiento de ácidos grasos u otros sustratos de esta reacción.
En algunas realizaciones preferidas, se determina la producción de malondialdehído (MDA), tras la reacción con ácido 2-tiobarbitúrico (convenientemente 1 mM) midiendo la absorbancia a una longitud de onda adecuada, tal como 525 nm.
Entre los lípidos que son oxidados por una abzima anti-Chlamydia se pueden incluir la parte lipídica de una lipoproteína, ácido graso, fosfolípido, colesterol, éster de colesterol o triglicérido. Tal como se ha descrito anteriormente, la actividad de oxidación de lípidos de una abzima también puede conducir a la oxidación de proteínas, carbohidratos y/o ácidos nucleicos, por ejemplo, las partes de proteína y/o carbohidrato de una lipoproteína.
La oxidación de lípidos Chlamydiales se determina en algunas realizaciones preferidas porque proporciona un ensayo práctico de una etapa, el cual se puede utilizar para determinar, por ejemplo, la presencia o ausencia de una abzima anti-Chlamydia. La oxidación de lípidos Chlamydiales tendrá lugar cuando un anticuerpo específico de Chlamydia que esté presente se una y oxide un antígeno Chlamydial que comprende un lípido.
Por ejemplo, un método para evaluar una afección aterosclerótica en un individuo puede incluir:
i) poner en contacto una muestra proporcionada por un individuo con un antígeno de célula Chlamydial; y
ii) determinar la oxidación de lípidos en dicha muestra.
La determinación de la oxidación de lípidos puede incluir determinar, por ejemplo, medir o detectar, la cantidad, el nivel o grado de oxidación que es inducido como resultado de l contacto con el antígeno de Chlamydia. Preferiblemente, el antígeno de célula Chlamydia les un antígeno lipídico y se determina la oxidación del antígeno lipídico de la célula Chlamydial.
Se puede purificar y/o aislar un antígeno o, más preferiblemente, puede estar comprendido en una membrana celular intacta. En realizaciones preferidas, el antígeno puede estar comprendido con (por ejemplo, en la superficie de) una célula de Chlamydia.
Por ejemplo, un método preferido para evaluar una afección aterosclerótica en un individuo puede comprender;
i) poner en contacto una muestra proporcionada por un individuo con una célula de Chlamydia; y
ii) determinar la oxidación de los lípidos de dicha célula.
La oxidación de lípidos, por ejemplo en una muestra, en presencia de la célula o el antígeno de Chlamydia se puede comparar con la oxidación de lípidos en ausencia de la célula o antígeno de Chlamydia. Un aumento en la oxidación de lípidos es indicativo de la presencia de una abzima anti-lípidos.
La peroxidación de lípidos/lipoproteínas es una reacción en cadena con radicales libres y es capaz de autopropagarse de un molécula a la otra, a una micela que contiene lípidos, o a una célula completa (después de unirse a su membrana a través de receptores o absorción no específica) (Chemical and Biochemical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase. Elsevier/North-Holland, New York, Amsterdam (1980); Lipid Peroxides in Biology and Medicine. Academic Press, Orlando, San Diego, San Francisco, New York, London (1982); Halliwell, B., y Gutteridge, J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press. Oxford (1996); Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals. Taylor and Francis, Washington (1997)).
En algunas realizaciones de los métodos descritos aquí, la propagación de la peroxidación se utiliza para facilitar la detección de abzimas oxidantes de lípidos.
Por ejemplo, se puede cargar un microrrecipiente, tal como un liposoma, vesícula o microcápsula que tiene una membrana que está fabricada de un material susceptible de la descomposición por radicales libres, por ejemplo una membrana de fosfolípidos, con un colorante, fluorocromo y otra sustancia informadora o material de detección, por ejemplo: eosina, fluorescamina, rodamina B o verde malaquita, y se utiliza en la detección de una abzima oxidante de lípidos. La oxidación de lípidos en los métodos descritos en la presente invención se puede determinar por tanto determinando la liberación de la sustancia informadora encapsulada.
El microrrecipiente cargado se puede mezclar con una muestra de plasma o suero. A continuación, se añade a la mezcla un antígeno de Chlamydia, comprendido convenientemente en una célula de Chlamydia o parte de la misma. A continuación, cualquier abzima oxidante de lípidos en la muestra se une al antígeno e inicia la peroxidación.
La iniciación de la oxidación de lípidos/lipoproteínas mediante la interacción del antígeno de Chlamydia con una abzima se autopropagará y extenderá al recubrimiento del microrrecipiente. Esto daña el recubrimiento y provoca la liberación de la sustancia informadora en la solución circundante. A continuación, se detecta esta liberación.
Un método puede incluir:
i) poner en contacto una muestra proporcionada por un individuo con un antígeno de células Chlamydiales en presencia de un microrrecipiente susceptible de la oxidación de lípidos y que contiene una sustancia informadora; y
ii) determinar la liberación de dicha sustancia informadora del microrrecipiente.
La liberación de la sustancia informadora tiene lugar como resultado del contacto de dicho anticuerpo con el microrrecipiente que contiene la sustancia informadora o una composición que comprende el microrrecipiente que contiene la sustancia informadora.
Si la intensidad de la señal producida por la liberación del informador no es suficiente para provocar una señal registrable o detectable, se puede incluir un propagador o sensibilizador de radicales libres en la mezcla de reacción, por ejemplo: iones libres y complejos de Fe^{2+}/Co^{2+} u otros metales de valencia transitoria.
Estos y otros sensibilizadores sirven para multiplicar la cantidad de radicales libres en un sistema.
La liberación de material incorporado desde el microrrecipiente conduce a cambios en las propiedades físicas/quí-
micas de la mezcla de reacción que se pueden registrar visualmente (o mediante otros medios convencionales). Alternativamente, los microrrecipientes dañados/fragmentados/disueltos se pueden separar de los no modificados mediante centrifugación activa o mediante sedimentación pasiva.
En lugar de liposomas u otros microrrecipientes (cargados con sustancias informadoras), se pueden utilizar eritrocitos de la propia muestra de sangre como diana para la propagación de peroxidación de lípidos/lipoproteínas provocada por abismas anti-lípidos. La bacteria o antígenos de Chlamydia se pueden introducir o poner en contacto con una muestra de sangre, opcionalmente en presencia de un sensibilizador para asegurar la propagación de la reacción de peroxida-
ción. La oxidación de lípidos se puede determinar determinando la hemólisis de eritrocitos en la muestra de sangre.
Cualquier iniciación de la oxidación de lípidos/lipoproteínas mediante la interacción de antígeno de Chlamydia con abzima en la muestra se autopropagará y extenderá a la membrana celular de los eritrocitos, conduciendo a un daño y finalmente la lisis celular. La aparición de hemólisis en la muestra de la sangre completa en respuesta a la adición de bacterias/antígenos de Chlamydia es por tanto indicativa de la presencia de abismas oxidantes de lípidos. La hemólisis se puede determinar mediante cualquier método adecuado.
Un método puede incluir:
i) poner en contacto una muestra proporcionada por un individuo y que comprende eritrocitos con un antígeno de células Chlamydiales; y
ii) determinar la hemólisis de dichos eritrocitos.
La hemólisis tiene lugar como resultado de poner en contacto dicho anticuerpo con los eritrocitos o una composición que comprende los eritrocitos.
Estas realizaciones pueden ser preferidas en algunas circunstancias, ya que las muestras no requieren una separación del plasma/suero de los eritrocitos antes de su análisis. Los liposomas u otros microrrecipientes se pueden cargar con, por ejemplo, un material que puede revelar un color diferente al color rojo de la hemoglobina. Alternativamente, la rotación de las muestras de análisis o incluso la sedimentación pasiva separarían los microrrecipientes/eritrocitos no dañados. La libe ración del colorante informador o hemólisis es indicativa de la presencia de anticuerpos oxidantes de lípidos en el material analizado. La intensidad de la señal se correlaciona con su actividad/concentración.
Dado que la sangre completa se puede analizar utilizando los métodos descritos anteriormente, no se necesita etapa de centrifugación y estos métodos se pueden utilizar en condiciones fuera de laboratorio o domésticas. La presencia o gravedad de la aterosclerosis se puede determinar, por ejemplo, comparando la señal informadora observada o hemólisis con valores conocidos en pacientes con aterosclerosis e individuos normales. Dicha comparación se puede llevar a cabo utilizando una tabla, escala, grafico o calibración que indica la cantidad o nivel de señal informadora o hemólisis en etapas concretas o la gravedad de la aterosclerosis.
La peroxidación de lípidos es un proceso redox que se puede medir utilizando un sistema redox acoplado. Los sistemas redox adecuados incluyen sistemas físicos y químicos. Por ejemplo, se puede utilizar un chip sensor para detectar cambios en el potencial redox de una reacción de oxidación de lípidos acoplada al mismo. Se conocen en la técnica un conjunto de chips sensores basados en enzimas redox o en mediadores redox. Ambos tipos de sensores se pueden ajustar/utilizar para la detección de moléculas radicales libres o moléculas redox acopladas con los mismos (Hall E.A.H. Biosensors. Redwood Press Ltd., Great Britain, 1990).
Se puede medir la acumulación de H_{2}O_{2} producida por la peroxidación de lípidos, por ejemplo, mediante la adición de la reacción de base peroxidada acoplada que utilizará peróxido de hidrógeno para oxidar su otro u otros cosustratos y producir un producto coloreado. Una acumulación de O_{2}^{\bullet \ -} producida por la peroxidación de lípidos se puede determinar mediante la utilización de moléculas sensibles a O_{2}^{\bullet \ -}, tales como citocromo C o riboflavina.
Alternativamente, la peroxidación de lípidos consume oxígeno molecular, por tanto se puede utilizar cualquier reacción química dependiente de O_{2} o proceso químico, por ejemplo, eléctrodo de oxígeno o polarografía (Polarography. Ed. Kolthoff I.M., Lingane J.J. Interscience Publishers, New York, London, 19520).
Los métodos pueden incluir obtener una muestra de sangre, suero o plasma de un individuo. Se puede obtener una muestra de prueba de suero o plasma, por ejemplo, extrayendo sangre de un individuo y aislando el suero o plasma de la sangre extraída. Entre los métodos de extracción adecuados se incluyen centrifugación para separar suero y plasma del material celular.
Al utilizar métodos de ensayo de la presente invención, el experto en la materia es consciente de la necesidad de utilizar experimentos de control apropiados.
Un trastorno o afección aterosclerótica tal como se describe en la presente invención puede incluir aterosclerosis, enfermedad isquémica de corazón (coronaria), isquemia miocárdica (angina), infarto de miocardio, enfermedad aneurismal, enfermedad vascular periférica ateromatosa, enfermedad aortoilíaca, isquemia de miembros inferiores crónica y crítica, isquemia visceral, enfermedad de la arteria renal, enfermedad cerebrovascular, apoplejía, retinopatía aterosclerótica, trombosis y coagulación sanguínea aberrante, e hipertensión. Dichas afecciones pueden ser afecciones médicas o veterinarias.
Las afecciones descritas anteriormente están estrechamente relacionadas y una predisposición a una de dichas afecciones puede ser indicativa de una predisposición a otras de dichas afecciones.
Los métodos tal como se han descrito anteriormente se pueden utilizar para determinar o evaluar la presencia y/o gravedad de un trastorno aterosclerótico en un individuo. Además, dichos métodos se pueden utilizar para determinar si un individuo que no presenta síntomas de aterosclerosis puede ser susceptible de aterosclerosis en el futuro. Un individuo que es susceptible de dicho trastorno puede tener una predisposición a dicho trastorno que coloca dicho individuo con un riesgo más elevado de sufrir el trastorno durante su vida que la población en general. Aunque con un mayor riesgo de que sea así, de hecho, puede que un individuo susceptible nunca sufra el trastorno.
Las abzimas, en particular abzimas anti-Chlamydia, preferencialmente pueden unirse y oxidar ciertas isoformas de lipoproteína en una población, tal como apolipoproteína E \varepsilon4.
Un método de determinación de la susceptibilidad de un individuo a la aterosclerosis puede comprender:
en una muestra obtenida de un individuo que comprende una lipoproteína que presenta dos o más isoformas en una población, determinar la presencia en dicha muestra obtenida del individuo de una isoforma de lipoproteína que se une a un anticuerpo oxidante de lípidos preferentemente en relación a otras de dichas isoformas.
Los individuos que presentan una isoforma de lipoproteína que se une preferentemente a, o es oxidada preferentemente por, un anticuerpo oxidante de lípidos tal como se describe en la presente invención en relación a otras isoformas de la lipoproteína en la población, presentan una mayor susceptibilidad a una afección aterosclerótica en relación otros miembros de la población.
Ejemplos de isoformas de lipoproteína asociadas con una afección de la enfermedad pueden incluir la apolipoproteína E \varepsilon4.
Tal como se ha descrito anteriormente, en un individuo identificado por padecer o ser susceptible a un trastorno aterosclerótico utilizando un método tal como se describe en la presente invención, puede comprender la etapa adicional de reducir o disminuir la actividad de oxidación de lípidos mediada por anticuerpos de dicho individuo, en particular en el sistema vascular del individuo. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante la administración de un antioxidante y/o un antibiótico a dicho individuo.
Los métodos tal como se describen en la presente invención también se pueden utilizar para predecir o detectar la incidencia de trastornos ateroscleróticos en una población y estimar la gravedad de dichos trastornos.
Dicho método puede comprender: analizar la capacidad de un anticuerpo de una o más muestras obtenidas de una población para oxidar lípidos.
Se puede analizar la capacidad de un anticuerpo para unirse a un antígeno extraño, por ejemplo, un antígeno de un patógeno, tal como Chlamydia.
Se puede utilizar la proporción de muestras tomadas de una población que contiene un abzima anti-lípidos, por ejemplo, un anticuerpo anti-Chlamydia catalítico, para determinar la incidencia y/o gravedad de trastornos ateroscleróticos en la población.
Se pueden utilizar uno o más antígenos extraños (es decir, no humanos) que permiten obtener anticuerpos oxidantes de lípidos en un método de evaluación de un trastorno aterosclerótico en un individuo, en particular se pueden utilizar en dicho método una célula de Chlamydia aislada o un antígeno de Chlamydia aislado. Entre los antígenos de Chlamydia adecuados se pueden incluir Hsp60, OmpA, ApoB y lipopolisacárido (Kalayoglu M. et al (2000) J. Infect. Dis. 181 Suppl 3: S483-9).
Se pueden proporcionar reactivos para su uso en un método, tal como se describe en la presente invención, tal como células o antígenos de Chlamydia aislados como parte de un kit, por ejemplo, en un recipiente adecuado, tal como un vial en el que el contenido está protegido del medio externo. Las células se pueden proporcionar en forma liofilizada. El kit puede incluir instrucciones para el uso de las células, por ejemplo, en un método para determinar la presencia o ausencia de abismas anti-chlamydia en una muestra. Un kit puede incluir uno o más de otros reactivos necesarios para el método, tal como diluyentes de muestras y células, lípido o lipoproteína exógenas y/o reactivos para determinar la oxidación de lípidos, tales como sensibilizadores e informadores. Un kit para su uso en la determinación de la presencia o ausencia de abzimas anti-Chlamydia y, por tanto, la presencia y gravedad de la aterosclerosis en un individuo en una afección tal como se describe en la presente invención puede incluir uno o más artículos y/o reactivos para la realización del método, tales como medios para disponer de la propia muestra de prueba, por ejemplo, una jeringuilla para extraer la muestra de sangre (estando dichos componentes generalmente estériles) y recipientes, tales como tubos o "curvettes" para llevar a acabo la prueba.
Se puede utilizar un kit que comprende una célula de Chlamydia aislada y un reactivo determinante de la oxidación o un antígeno de Chlamydia aislado y un reactivo determinante de la oxidación de lípidos en un método de determinación de un trastorno aterosclerótico en un individuo.
Un kit puede comprender además instrucciones para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo y/o tampones o reactivos para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo.
Los reactivos determinantes de la oxidación de lípidos pueden incluir un desnaturalizante. Además de lípidos y proteínas desnaturalizantes en el ensayo, un desanaturalizante puede detener reacciones bioquímicas, extraer MDA de molécula acompañantes y proporcionar un pH óptimo para la detección del MDA extraído. Entre los desnaturalizantes adecuados se incluyen ácido tricloroacético, H_{2}SO_{4} y ácido fosfotúngstico.
Se puede utilizar ácido tricloroacético a una concentración del 5% a 75%, más preferiblemente del 25% al 55%, por ejemplo 30%, 40% ó 50%. Se puede utilizar H_{2}SO_{4} de 0,5 a 10 M, más preferiblemente de 2 M a 5 M, por ejemplo 3 M ó 4 M de H_{2}SO_{4}. El ácido fosfotúngstico se puede utilizar del 1% al 30%, más preferiblemente del 5% al 15%, por ejemplo 10% (p/v) de ácido fosfotúngstico.
Los reactivos determinantes de la oxidación de lípidos también pueden incluir un reactivo de detección que reacciona con un producto lipídico oxidado, tal como MDA, para producir una señal. Un reactivo de detección adecuado es el ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), que puede ser de manera conveniente 1 mM. Este reacciona con MDA para producir un cambio de color detectable a 525 nm. Esta oxidación de lípidos se puede determinar determinando el cambio en la absorbancia a 525 nm.
Otros reactivos de detección adecuados incluyen n-butanol, que es adecuado para su uso en ensayos fluorescentes, por ejemplo, que es adecuado para su uso en ensayos fluorescentes, por ejemplo, que implican la medición de la fluorescencia inherente de MDA [Brown, R.K., and Kelly, F.J. Peroxide and other products. en: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 119-131.
Se puede proporcionar un antígeno en forma cruda (es decir, una suspensión de las células completas) en forma aislada o purificada, forma sintética o recombinante, o en forma de anticuerpos anti-idiotípicos imitadores epítopos o sus fragmentos.
Un ejemplo de un kit comprende Chlamydia ovina viva (forma liofilizada), PBS (para disolver las bacterias), tampón acetato 0,05 M pH 4,0, ácido tricloroacético al 40% y ácido 2-tiobarbitúrico 1 mM.
Un kit puede incluir:
i) un microrrecipiente
ii) una sustancia informadora
iii) un antígeno de Chlamydia.
Un microrrecipiente puede ser un liposoma, vesícula o microcápsula que comprende una membrana que es degradada o dañada mediante oxidación para hacerla permeable, es decir, permite la liberación de su contenido. Dicha membrana es susceptible de la propagación de la peroxidación catalizada por abzimas de bacterias o antígenos de Chlamydia.
La sustancia informadora puede ser un colorante, fluorocromo u otro material o marcador de detección, tal como se ha descrito anteriormente. La sustancia informadora en el kit puede estar encapsulada en el microrrecipiente o se puede suministrar como un reactivo separado que a continuación se encapsula en el microrrecipiente por el usuario antes de su uso.
Un antígeno de Chlamydia es un antígeno que provoca una respuesta inmune en la infección Chlamydial, en particular un antígeno que produce anticuerpos auto-catalíticos. El antígeno puede estar comprendido en un complejo o una célula de Chlamydia. Los antígenos adecuados pueden incluir los antígenos Hsp60 y ApoB de Chlamydia.
Un kit puede comprender además instrucciones para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo y/o tampones o reactivos para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo.
Un kit puede incluir;
i) sensibilizador que permite o facilita la propagación de la peroxidación de lípidos
ii) antígeno de Chlamydia.
El sensibilizador es una sustancia o agente que propaga la reacción de peroxidación de lípidos desde el antígeno de Chlamydia a otras especies reactivas, tales como una membrana de glóbulos rojos (eritrocitos).
Un kit puede comprender además instrucciones para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo y/o tampones o reactivos para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo.
Los kits pueden comprender adicionalmente dos recipientes, por ejemplo, tubos, "curvettes", botellas, pocillos o botes. Uno de dichos recipientes se puede utilizar para la muestra de sangre de control (es decir, un recipiente de control) y uno se puede utilizar para la adición de antígeno de Chlamydia (es decir, recipiente de prueba). Dichos recipientes se pueden recubrir con un anti-coagulante. Los anticoagulantes adecuados son conocidos en la técnica.
Cuando los recipientes no están recubiertos con anticoagulante, el kit puede comprender por separado un anticoagulante.
Tal como se ha descrito anteriormente, un kit puede comprender también instrucciones para su uso según un método descrito en la presente invención. Un kit puede comprender además una tabla, escala, gráfico o curva que calibra la intensidad de la señal producida por el kit (es decir, hemólisis o liberación de la sustancia informadora) con la gravedad de la aterosclerosis u otro trastorno aterosclerótico en un paciente. Esto permite a partir de la muestra la determinación tanto de la presencia de un trastorno aterosclerótico como de su gravedad. La tabla y/o instrucciones pueden estar en forma de papel o pueden estar en forma de un producto informático almacenado en un medio para el registro de datos, que puede ser un disco duro o un CD-ROM o un disquete.
A continuación, se ilustrarán aspectos de la presente invención en referencia a las figuras que se acompañan descritas a continuación y ejemplos experimentales, a modo de ejemplo y no de limitación. Aspectos y realizaciones adicionales serán evidentes para un experto en la materia.
La figura 1 muestra los resultados de una reacción de aglutinación entre 1000:1 de Chlamydia ovina e IgG extraída de lesión aterosclerótica humana.
La figura 2 muestra la dependencia de la peroxidación de Chlamydia ovina con la concentración de la IgG en la lesión aterosclerótica humana. La concentración de Chlamydia fue constante y el pH fue de 5,7.
La figura 3 muestra la cinética de Michaelis-Menten de la peroxidación de lípidos en Chlamydia ovina por IgG 1,8:g en la lesión aterosclerótica humana; K_{M} aparente = 13,3-16,1:1 de suspensión de Chlamydia; pH 5,7.
La figura 4 muestra el efecto de la adición de suspensión de Chlamydia ovina sobre la peroxidación de lípidos en suero humano. Se añadió 10:1 de la suspensión bacteriana a 990:1 del suero 1.1 diluido; pH 5,7; se incubaron todas las mezclas mezcladas a 37ºC durante 18 horas (los valores de suero son los mismos que en la tabla 5).
La figura 5 muestra la correlación entre el grado de estenosis en las arterias coronarias y la actividad de anticuerpos anti-Chlamydia oxidante de lípidos en pacientes de IHD. La gravedad de la estenosis se presenta en términos de una valoración que se calculó como un parámetro entero de la estenosis de las arterias coronarias estimada por angiografía.
La figura 6 muestra la relación entre el grado de estenosis de las arterias coronarias y la concentración de triglicéridos en el suero de pacientes de IHD.
La figura 7 muestra la relación entre el grado de estenosis de las arterias coronarias y la concentración total de colesterol en el suero de pacientes de IHD.
La figura 8 muestra la relación entre el grado de estenosis de las arterias coronarias y la concentración de LDL-colesterol en el suero de pacientes de IHD.
La figura 9 muestra la correlación entre el grado de estenosis de las arterias cerebrales y la actividad de anticuerpos anti-Chlamydia oxidante de lípidos en el suero de pacientes con ICD. La gravedad de la estenosis se presenta en términos de una valoración que se calculó como un parámetro entero de la estenosis de las arterias cerebrales estimada por angiografía.
La figura 10 muestra la relación entre el grado de estenosis de las arterias coronarias y la concentración de triglicéridos en el suero de pacientes de ICD.
La figura 11 muestra la relación entre el grado de estenosis de las arterias coronarias y la concentración total de colesterol en el suero de pacientes de ICD.
La figura 12 muestra la relación entre el grado de estenosis de las arterias coronarias y la concentración de LDL-colesterol en el suero de pacientes de ICD.
La figura 13 muestra la reacción cruzada de anticuerpos anti-apolipoproteína B con Chlamydia.
La tabla 1 contiene datos que muestran el efecto de la fracción de IgG extraída de una lesión aterosclerótica humana sobre la peroxidación de lípidos de bacterias de Chlamydia; pH 5,7; todas las mediciones se realizaron por triplicado.
La tabla 2 contiene datos que muestran la reactividad cruzada par alas IgG de la lesión ente lipoproteínas de suero humano y cepa ovina de Chlamydia psittaci.
La tabla 3 contiene datos que muestran el efecto de Chlamydia felina sobre la peroxidación de lípidos en suero humano; todas las mediciones se realizaron por triplicado.
La tabla 4 contiene datos que muestran el papel de IgG en la iniciación de la peroxidación de lípidos por Chlamydia ovina en plasma humano; todas las mediciones se realizaron por triplicado.
La tabla 5 contiene datos que muestran el efecto de la adición de Chlamydia ovina en el suero de control y en el suero de pacientes con complicaciones clínicas de aterosclerosis.
La tabla 6 muestra la inhibición de la actividad oxidante de lípidos de IgG en la lesión aterosclerótica por inhibidores antioxidantes.
La tabla 7 muestra ejemplos de quelantes metálicos que se pueden utilizar según la presente invención.
La tabla 8 muestra ejemplos de antimicrobianos que se pueden utilizar según la presente invención.
La tabla 9 muestra ejemplos de antioxidantes que se pueden utilizar según la presente invención.
La tabla 10 muestra niveles de anticuerpos anti-Chlamydia oxidantes de lípidos en ovejas sanas e infectadas (los valores entre paréntesis representan el % de aumento/disminución frente al control).
La tabla 11 muestra la inhibición de abzimas utilizando quelantes metálicos.
La tabla 12 muestra la inhibición de la actividad de abzimas in vitro utilizando quelantes metálicos.
La tabla 13 muestra el efecto de la aspirina sobre la actividad de abzimas anti-Chlamydia en pacientes con Enfermedad Coronaria de Corazón.
La tabla 14 muestra el efecto de la aspirina sobre la actividad de abzimas anti-Chlamydia en pacientes con Isquemia Miocárdica Silenciosa.
La tabla 15 muestra la actividad de abzimas en pacientes tratados con agente antimicrobiano.
La tabla 16 muestra la actividad de abzimas en pacientes tratados con agente antimicrobiano más aspirina diariamente.
La tabla 17 muestra la condición clínica de pacientes tratados con sólo agente antimicrobiano.
La tabla 18 muestra los niveles promedio de abzima en grupos de individuos que padecen de afecciones relacionadas con aterosclerosis.
La tabla 19 muestra los niveles individuales de abzima en pacientes que padecen angina que recibieron o no aspirina.
La tabla 20 muestra la inducción de abzimas en conejos inoculados con Chlamydia.
La tabla 21 muestra el efecto de Chlamydia tratada con formalina en conejos que presentan abzimas inducidas.
La tabla 22 muestra la actividad de abzima anti-Chlamydia en pacientes tratados con azitromicina, 500 mg diariamente (grupo de terapia A).
La tabla 23 muestra la actividad de abzima anti-Chlamydia en pacientes tratados con azitromicina, 500 mg, más aspirina, 250 mg, diariamente (grupo de terapia B).
La tabla 24 muestra la actividad de abzima anti-Chlamydia en pacientes tratados con azitromicina, 500 mg diariamente más antioxidantes (grupo de terapia C).
La tabla 25 muestra la actividad de abzima anti-Chlamydia en pacientes del grupo de terapia D tratados con aspirina, 250 mg diariamente (grupo de terapia D).
La tabla 26 muestra la actividad de abzima anti-Chlamydia en el grupo de pacientes de control.
La tabla 27 muestra un resumen de los resultados de la terapia anti-abzima.
La tabla 28 muestra una evaluación de la gravedad de la angina de pecho mediante el Cuestionario de Rose-Blackburn modificado antes y después del tratamiento.
La tabla 29 muestra las valoraciones de abzima y el Test de Rose-Blackburn antes y después del tratamiento para pacientes de IHD que fueron negativas para IgG anti-Chlamydia.
La tabla 30 muestra las propiedades inhibidoras de azitromicina en abzimas.
La tabla 31 muestra el efecto de varios fármacos sobre la actividad de abzima anti-Chlamydia.
La tabla 32 muestra el efecto de la terapia anti-abzima sobre la coagulación de la sangre y la trombosis.
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Experimentos Materiales y Métodos Muestras
Se utilizaron 3 muestras de suero de 22 pacientes con complicaciones clínicas de aterosclerosis admitidas para operaciones de by-pass de arteria coronaria y aorta abdominal en el Centro Quirúrgico Cardiovascular del Hospital Clínico No. 1 en Rostov-na-Donu, Rusia.
20 de estos pacientes eran hombres y 2 mujeres, con edades entre 47 y 66. Uno de estos pacientes, No.6/6a presentó un infarto de miocardio agudo en el momento del ensayo, por tanto en algunos cálculos finales no se incluyeron los datos de este paciente. El grupo de control estaba comprendido de voluntarios clínicamente sanos, 5 de los cuales eran hombres y 5 eran mujeres con edades entre 40 y 55.
Las piezas de ateroma de la aorta abdominal de 7 de estos pacientes se utilizaron para extraer la fracción de IgG mediante un adsorbente de proteína A tal como se describe a continuación.
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Extracción de IgG de lesión aterosclerótica
Las piezas de aorta (aproximadamente 200-400 mg de peso en húmedo) se cortaron en piezas de aproximadamente 10 mg cada una, se colocaron en 5,0 ml de PBS con detergente no iónico Igepal CA-630 al 1% y se homogeneizó con un homogeneizador mecánico (Ultra-Turrax) a toda potencia con una sonda de 15 mm tres veces durante 3 segundos cada una con intervalos de enfriamiento de 20 segundos. Después de la homogeneización, se separaron los compo-
nentes insolubles por centrifugación a 5000 g durante 10 minutos y se utilizaron los sobrenadantes para el análisis.
El sobrenadante se trató con proteína A unida a agarosa al 4% en gránulos reticulados a 37ºC durante 30 minutos. La fracción de inmunoglobulina unida a los gránulos se giró a continuación a 5000 g durante 10 minutos y se decantó el sobrenadante. Con el fin de extraer cualquier lipoproteína unida a las inmunoglobulinas sedimentadas, las muestras se resuspendieron con un 10% de Igepal CA-630. A continuación, se centrifugaron a 5000 g durante 10 minutos y se decantó el sobrenadante.
Para eliminar el detergente, se realizaron tres lavados consecutivos en exceso de tampón fosfato con centrifugación bajo la misma pauta. La extracción de lipoproteína de la fracción de inmunoglobulina se confirmó por la ausencia de colesterol en esta fracción.
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Determinación de Abs anti-Chlamydia
Se recogió sangre de una vena antecubital en la mañana después de un ayuno durante toda la noche, se separó el suero y se congeló a -20ºC antes de analizarse.
La presencia de anticuerpos anti-Chlamydia se midió en la reacción de aglutinación con células de Chlamydia ovina y mediante ensayos ELISA (basados en antígeno recombinante).
Para la reacción de aglutinación, se incubaron diluciones graduales de los sueros analizados durante 24 horas a 37ºC con 10^{6} de Chlamydia ovina viva. La aparición de agregados se detectó y estimó a 700 nm. El ensayo ELISA se realizó según las instrucciones del fabricante (Medac).
Un título \geq1:64 se consideró que era positiva.
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Determinación de la peroxidación de lípidos
La peroxidación de lípidos se evaluó como el nivel de concentración de MDA que se midió mediante un método espectrofotométrico [Draper, H.H. et al Free Radic. Biol. Med. (1993) 15, 353]. Este método se basa en la formación de un producto coloreado cuando el malondialdehído reacciona con ácido tiobarbitúrico.
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Reactividad cruzada entre lipoproteínas del suero y Chlamydia
La fracción de IgG que comprende abzimas anti-Chlamydia se extrajo de una lesión aterosclerótica humana tal como se ha descrito anteriormente. 100:1 de esta fracción (que contenía 1 g/ml) se preincubó con 890:1 del suero completo o deslipidado de un donante sano durante 1 hora a 37ºC; pH 5,7.
Las lipoproteínas (y material asociado) se extrajeron del suero mediante ultracentrifugación preparativa en una solución de KBr según el método descrito anteriormente [Havel R.J et al. J. Clin. Invest. (1955) 34, 1345-1353.22].
A continuación, se añadieron al suero 105 células Chlamydia psittaci (Intervet) en un volumen 10:1. La cantidad de oxidación inducida por contacto con las células Chlamydia se determinó a continuación utilizando el método descrito anteriormente.
En presencia de unión entre las abzimas anti-Chlamydia y las lipoproteínas del plasma, no se observa oxidación adicional en el contacto con las células de Chlamydia, ya que las abzimas anti-Chlamydia se eliminan mediante ultracentrifugación.
En ausencia de unión entre las abzimas anti-Chlamydia y las lipoproteínas del plasma, se observa oxidación en el contacto del plasma con las células de Chlamydia, ya que las abzimas anti-Chlamydia aún están presentes en la muestra.
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Ensayo para abzimas anti-Chlamydia
Los reactivos utilizados en el ensayo de abzimas anti-Chlamydia son los siguientes:
1. Chlamydia ovina vivas (forma liofilizada)
2. PBS (para disolver bacterias)
3. Tampón acetate 0,05M pH 4,0
4. Ácido tricloroacético al 40%
5. Ácido 2-tiobarbitúrico 1 mM.
La presencia o cantidad de anticuerpos anti-Chlamydia catalíticos en una muestra se detectaron tal como se indica a continuación:
1. Las muestras de suero analizadas se diluyen 1:1 mediante tampón acetato 0,05 M pH 4,0 para obtener un pH final de estas muestras entre 5,6-5,8.
2. Se mezclan 990 ml del suero diluido con 10 ml de la vacuna comercial de Chlamydia ovina viva.
3. A continuación, las muestras se incuban durante toda la noche (12-16 horas) a 37ºC.
4. A cada muestra, se añaden 250 ml de ácido tricloroacético al 40% y 250 ml de ácido 2-tiobarbitúrico 1 mM.
5. Todas las muestras se colocan en un baño de agua y se ponen a ebullición durante 30 minutos.
6. Las muestras se enfrían y se centrifugan a 3.000 g durante 10 minutos.
7. Los sobrenadantes se recogen y se mide su absorción a \lambda 525 nm para determinar la concentración de malondialdehído (MDA) que son productos de peroxidación de lípidos.
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Resultados Ejemplo 1
Se extrajo IgG de una lesión aterosclerótica en un paciente utilizando el método descrito anteriormente. Se observaron anticuerpos anti-Chlamydia presentes en esta fracción de IgG (figura 1).
Se determinó la capacidad de la fracción de IgG extraída para oxidar lípidos. Se observó que la fracción de IgG provocaba una peroxidación de lípidos en cepas tanto ovina como felina de Chlamydia psittaci (tabla 1). El análisis cinético de esta reacción de peroxidación mostró que la reacción tenía un carácter enzimático (fig. 2, 3). La bacteria Chlamydia se puede considerar por tanto como un sustrato para sus anticuerpos extraídos de una lesión aterosclerótica humana.
Los epítopos para abzimas anti-Chlamyidia se investigaron además utilizando detergentes no iónicos. El tratamiento de Chlamydia con Triton X-100 o Igepal CA-630 abortó la oxidación de los lípidos en las bacterias por las abzimas extraídas. Se obtuvieron resultados similares para el tratamiento de lipoproteínas de baja densidad de suero humano.
Esto proporciona la indicación de que o los epítopos para los anticuerpos catalíticos son conformacionales y/o la integridad del antígeno es importante para iniciar la oxidación de lípidos tanto en lipoproteínas como Chlamydia.
A continuación, se determinó la capacidad de abzimas anti-Chlamydia para reaccionar de forma cruzada con lipoproteínas del plasma. La IgG extraída de la lesión aterosclerótica se preincubó con suero de un paciente para permitir que los anticuerpos anti-lipoproteína en el extracto interaccionaran con las lipoproteínas no modificadas. Las lipoproteínas y anticuerpos unidos a las mismas se extrajeron a continuación mediante ultra-centrifugación.
Se observó que los anticuerpos anti-Chlamydia catalíticos se extraían con la lipoproteína (Tabla 2). Esto demuestra que los anticuerpos anti-Chlamydia catalíticos reaccionan de forma cruzada con las lipoproteínas del suero y con la cepa ovina de bacterias de Chlamydia.
A continuación, se investigó la presencia de anticuerpos anti-Chlamydia en el suero de pacientes con aterosclerosis. Se observó que la adición de Chlamydia ovina al suero de los pacientes provocaba un aumento en la peroxidación de lípidos en la muestra. Se observó un efecto similar con una cepa de Chlamydia felina (tabla 3).
Los efectos observados eran debidos a la presencia de anticuerpos anti-Chlamydia oxidantes de lípidos en la fracción de IgG en el suero de pacientes (tabla 4). Se observó por tanto que los anticuerpos catalíticos del suero de pacientes con aterosclerosis reaccionaban de forma cruzada con lipoproteínas y Chlamydia ovina.
El análisis correlative de la concentración de anticuerpos anti-Chlamydia y anti-lipoproteína en suero humano mostró que ambos parámetros presentan una unión positiva estadísticamente significativa con el coeficiente de correlación elevado 0,82. Esto proporciona además la indicación de que el mismo anticuerpo posee ambas actividades de unión.
En los estudios, con pacientes con aterosclerosis utilizando el método de ensayo descrito anteriormente, se observó que los anticuerpos anti-Chlamydia catalíticos en el 81% de los pacientes con complicaciones clínicas de aterosclerosis y sólo en el 10% del grupo de control (figura 4, tabla 5). Esto demuestra que estos anticuerpos son un marcador patogénico de esta enfermedad.
Este estudio demuestra por primera vez la existencia de abzimas anti-lípidos/lipoproteínas en sistemas biológicos. Su aparición en la aterosclerosis pero no en individuos sanos indica que estos abzimas juegan un papel importante en la patogénesis de esta enfermedad y sus complicaciones. También puede interrelacionar los principales trastornos bioquímicos/inmunológicas, tales como la activación de la peroxidación de lípidos, la aparición de anticuerpos anti-lipoproteína y la infección por Chlamydia, todos ellos implicados en el desarrollo de la aterosclerosis.
La presencia de anticuerpos anti-Chlamydia oxidantes de lípidos en el plasma de un individuo indica que los cambios patológicos específicos para esta enfermedad ya han comenzado. Dado que estos abzimas son responsables de una oxidación de lípidos/lipoproteínas y que este proceso se correlaciona normalmente con el grado/intensidad de generalización de la aterosclerosis, el nivel/actividad de abzimas anti-lípidos refleja la gravedad de esta enfermedad.
Los cambios en el perfil de lipoproteínas y el aumento del colesterol total en el plasma/suero son los únicos factores de riesgo específicos establecidos para la aterosclerosis. Sin embargo, estos cambios se pueden detectar para únicamente el 10-15% de todos los pacientes con complicaciones clínicas de esta enfermedad. La detección de anticuerpos anti-Chlamydia oxidantes de lípidos es el segundo marcador específico para la aterosclerosis, pero tiene un valor diagnóstico mucho más elevado que la medición de los parámetros de lípidos descritos anteriormente.
Los métodos de la presente invención son por tanto ampliamente aplicables en el diagnóstico y profilaxis de la aterosclerosis y afecciones relacionadas.
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Ejemplo 2 Inhibición de la peroxidación de lípidos Muestras humanas
Se extrajeron anticuerpos de lesiones ateroscleróticas avanzadas de aorta humana extraída de cuatro pacientes masculinos, de edad ente 53 y 64, durante cirugía con bypass de una estenosis aórtica abdominal en el Centro de cirugía cardiovascular del hospital clínico No. 1 en Rostov-na-Donu, Rusia. Después de la recuperación, se pusieron estas muestras inmediatamente en una solución de NaCl al 30% p/v y se almacenaron a 0-4ºC durante 1-2 semanas antes del examen.
En experimentos de control, se observó que durante este periodo las actividades de enzimas, tales como tripsina, catalasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, creatina quinasa y lactato deshidrogenasa, junto con el nivel de fragmentación de inmunoglobulina (IgG) y el grado de peroxidación de lípidos (concentración de malonaldehídos), no cambiaron significativamente.
Las piezas de aorta (aproximadamente 200-400 mg de peso en húmedo) se cortaron en piezas de aproximadamente 10 mg cada una, se colocaron en 5,0 ml de PBS con detergente no iónico Igepal CA-630 al 1% y se homogeneizó con un homogeneizador mecánico (Ultra-Turrax) a toda potencia con una sonda de 15 mm tres veces durante 3 segundos cada una con intervalos de enfriamiento de 20 segundos. Después de la homogeneización, se separaron los componentes insolubles por centrifugación a 5000 g durante 10 minutos y se utilizaron los sobrenadantes para el análisis.
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Extracción de anticuerpos
Los anticuerpos se extrajeron y analizaron por separado de las lesiones de las cuatro piezas de la aorta abdominal obtenida de los cuatro pacientes diferentes.
La primera etapa fue el tratamiento del sobrenadante con proteína A unida a agarosa al 4% en gránulos reticulados a 37ºC durante 30 minutos. A continuación, la fracción de inmunoglobulina unida a los gránulos se giró a continuación a 5000 g durante 10 minutos. Se decantó el sobrenadante. Con el fin de extraer cualquier lipoproteína unida a las inmunoglobulinas sedimentadas, las muestras se resuspendieron con un 10% de Igepal CA-630. A continuación, se centrifugaron a 5000 g durante 10 minutos y se decantó el sobrenadante. Para eliminar el detergente, se realizaron tres lavados consecutivos en exceso de tampón fosfato con centrifugación bajo la misma pauta. La extracción de lipoproteína de la fracción de inmunoglobulina se confirmó por la ausencia de colesterol en esta fracción.
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Lipoproteínas
Se obtuvieron lipoproteínas de baja densidad, d = 1,030-1,050, a partir del plasma de donantes sanos mediante ultracentrifugación preparativa secuencial en solución de Kbr según el método descrito anteriormente [Havel R.J. et al J. Clin. Invest. (1955) 34, 1345-1353]. Las LDL se pueden asociar con inmunoglobulinas del plasma en estas preparaciones [Bauer B.J. et al Atherosclerosis (1982), 44, 153-160].
Estas inmunogloulinas pueden potencialmente interferir con una reacción entre LDL y sus anticuerpos unidos a la proteína A o se pueden unir mediante dicha proteína. Para evitar estos posibles hechos, era importante, antes de la titulación de las lipoproteínas con anticuerpos de la lesión en los ensayos de afinidad, extraer las LDL con anticuerpo unido utilizando una cantidad saturada de gránulos de agarosa proteína A.
Con el fin de determinar el nivel de LDL (en términos de concentración de colesterol), se realizó la curva de calibración para cada nuevo lote de lipoproteínas y durante cada nuevo experimento.
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Peroxidación de LDL por IgG de lesión
Se incubaron muestras de LDL con antioxidantes analizados o sin los mismos (control) con IgG de lesión durante 16 horas a 37ºC a pH 5,6. Se midió el nivel de peroxidación de lípidos, en términos de la concentración de malondialdehído (MDA), mediante el siguiente procedimiento. A 1,0 ml de cada muestra se añadieron 250 ml de ácido tricloroacético al 40% y 250 ml de ácido 2-tiobarbitúrico 1 mM. Después de poner a ebullición las muestras en un baño de agua durante 30 minutos, se enfriaron y centrifugaron a 3000 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes se recogieron y se midió su absorción a \lambda 525 nm.
Los resultados de este experimento se presentan en la Tabla 6.
Se observó que un conjunto de inhibidores con actividad antioxidante reducían la actividad de oxidación de lípidos de anticuerpos aislados de placas ateroscleróticas por debajo del límite para la detección en este ensayo. Por tanto, todos estos compuestos inhiben la actividad de anticuerpos oxidantes de lípidos.
Se analizaron abzimas aisladas in vitro por su actividad catalítica tal como se describe en la presente invención en presencia de varios inhibidores antioxidantes de las siguientes clases: quelantes de hierro (Fe2+) - tetraciclina quelantes de cobre (Cu2+) - DDC, aspirina y penicilamina quelantes metálicos generales - CN-, N3, DTPA (sólo iones libres de quelatos) y ácido picolínico.
Los resultados se muestran en la Tabla 11.
Estos resultados muestran que la inhibición de abzimas tiene lugar a través de la quelación de cobre en lugar de la quelación de hierro. Se demostró que tres quelantes de cobre separados bloqueaban la actividad y estos resultados sugieren que las abzimas contactan con un ion de cobre unido como centro catalítico.
Ejemplo 3 Ejemplo clínico de la reducción en la actividad de anticuerpos anti-Chlamydia oxidantes de lípidos
Paciente - A.M.P., Caucásico, hombre, 43 años, que presenta síntomas clínicos parecidos a las etapas iniciales de la angina de pecho con quejas de dolor en el pecho transitorio no provocado en combinación con respiración entrecortada. Sin embargo, un ECG no reveló cambios patológicos en el corazón.
Los resultados de un análisis de sangre el 27 de diciembre del 2000 reveló unos niveles normales de colesterol total y LDL-colesterol; los títulos de anticuerpos IgG e IgA anti-Chlamydia fueron ambos 1:64 (ELISA, Medac). Sin embargo, se detectaron abzimas anti-Chlamydia oxidantes de lípidos y su actividad fue 32 \muM de MDA (valor promedio de la medición por triplicado) por 1 ml de su suero.
Se recomendó el siguiente tratamiento diario, durante el transcurso de tres meses, 500 mg de clorhidrato de tetraciclina en combinación con un cóctel de antioxidantes - 20 mg de vitamina E, 1,5 mg de vitamina A, 3,2 mg de vitamina B6, 180 mg de ácido ascórbico, 30 mg de gluconato de zinc, 100 mg de L-selenometionina.
A los tres meses después del inicio de la terapia, desaparecieron las quejas de dolor del pecho y respiración entrecortada. Al final de marzo, al final del tratamiento y casi exactamente 3 meses después del inicio del tratamiento, el análisis de su suero no mostró cambios en los títulos de anticuerpos IgG e IgA anti-Chlamydia (1:64 (ELISA, Medac)). Al mismo tiempo, la presencia de abzimas anti-Chlamydia no era detectable.
Dos semanas después se repitió la prueba con el mismo resultado.
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Ejemplo 4 La influencia de Chlamydia ovina sobre la peroxidación de lípidos de suero ovino
Se vacunaron ovejas con células de Chlamydia utilizando técnicas estándar y se ensayó la actividad de abzima. Los resultados se indican en la Tabla 10.
Las ovejas prevacunadas no presentaban la enfermedad y estaban sanas y no mostraban cambios significativos entre los niveles de ensayo con y sin Chlamydia.
Después de la vacunación, las ovejas mostraron niveles muy elevados de anticuerpos anti-Chlamydia pero mostró niveles nulos/insignificantes de abzimas.
El post aborto (tipo salvaje) representa ovejas con la enfermedad de Chlamydiosis que han abortado debido a la oclusión del sistema vascular en el útero: en éstas, el nivel de actividad de abzima verificado mediante la adición de Chlamydia es significativamente más elevada que sin Chlamydia.
Estos resultados muestran que la administración de vacuna Chlamydial puede reducir o prevenir la producción de anticuerpos oxidantes de lípidos.
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Ejemplo 5 La asociación de anctividad de abzima y estenosis arterial
Se investigó la actividad de anticuerpos anti-Chlamydia oxidantes de lípidos y el grado de estenosis arterial en dos grupos clínicos diferentes. El primero fue un grupo de pacientes con Enfermedad Isquémica Cardiaca (IHD) y el segundo grupo de pacientes con Enfermedad Isquémica Cerebrovascular (ICD).
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Estenosis de Arterias Coronarias
Los resultados preliminares de la prueba muestran una correlación positiva y significativa entre la actividad de las abzimas anti-Chlamydia y la gravedad de la estenosis de arterias coronarias de pacientes con IHD (figura 5).
No se observaron relaciones entre el grado de estenosis coronaria y lípidos del suero, tales como triglicéridos, colesterol total y colesterol de lipoproteínas de baja densidad, LDL-colesterol (figuras 6, 7, 8).
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Estenosis de arterias cerebrales
Se observó una correlación significativa positiva entre el nivel de las abzimas y la estenosis arterial en el grupo de pacientes con ICD (figura 9).
Como en los pacientes de IHD, en este grupo no se hallaron relaciones entre el grado de estenosis arterial y los triglicéridos, colesterol total y LDL-colesterol del suero (figuras 10, 11, 12).
Estos experimentos establecen una relación positiva entre la actividad de abzima anti-Chlamydia y el grado de estenosis en ambas arterias de corazón y cerebro y muestran que estos anticuerpos están implicados tanto en la iniciación como en la progresión de aterosclerosis.
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Ejemplo 6 Inhibición de abzimas utilizando ácido acetilsalicílico (aspirina)
Los datos presentados en las Tablas 13 y 14 demuestran que la actividad de abzimas anti-Chlamydia oxidantes de lípidos se puede inhibir mediante ácido acetilsalicílico (aspirina) cuando se administra a humanos.
Tres pacientes con Enfermedad coronaria de Corazón (CHD), cuya sangre presentaba un nivel significativo de actividad de abzima de estos abzimas, se trataron con una dosis diaria de 250 mg de aspirina.
Después de una semana, los análisis de sangre de estos pacientes revelaron una inhibición significativa de la actividad de abzima: 5 veces para un paciente y un nivel indetectablemente bajo para los otros dos (tabla 13).
Para eliminar la posibilidad de que la administración de aspirina en los experimentos anteriores coincida con la eliminación natural de las abzimas de los organismos de los pacientes y para investigar el efecto in vivo de la aspirina sobre abzimas anti-Chlamydiales oxidantes de lípidos, se llevó a cabo el siguiente experimento.
Se identificó un paciente F con Isquemia Miocardíaca Silenciosa que tomaba regularmente 250 mg de aspirina de manera diaria. Se determinó el nivel de abzimas en la sangre del paciente F y se observó que era casi indetectable.
El paciente F dejó de tomar aspirinas durante una semana y se determinó de nuevo el nivel de abzimas en su sangre. Se observó un nivel significativo de abzimas oxidantes de lípidos en el suero del paciente F.
El paciente F reanudó el régimen previo de 250 mg de aspirina diarias y se determinó el nivel de abzimas después de 7 días. Se redujo significativamente el nivel de estas abzimas (tabla 14) en relación con el nivel cuando el paciente no recibía aspirina.
Durante el transcurso de estos experimentos, el paciente no presentó ningún trastorno respiratorio o signos de ninguna otra afección patológica. Esto indica que las variaciones registradas de la actividad de abzima estaban relacionadas con la ingesta de aspirina por este paciente.
En conclusión, estos datos muestran que el ácido acetilsalicílico inhibe los anticuerpos anti-Chlamydia oxidantes de lípidos in vivo y, en particular, en pacientes con complicaciones clínicas de aterosclerosis.
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Ejemplo 7 Anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con células de Chlamydia
Se analizó la capacidad de reaccionar de forma cruzada con Chlamydia psittaci ovina (Intervet) de una preparación disponible comercialmente de anticuerpos específicos para Apo-B humana.
Se observó que la preparación de anticuerpos anti-apo-B contenía una fracción que también se une a Chlamydia ovina (figura 13).
Por tanto, la apo-B presenta un epítopo que es idéntico a un epítopo presente en la membrana de Chlamydia. Los anticuerpos que se unen a este epítopo reaccionarán de forma cruzada con células de Chlamydia y apo-B humana.
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Ejemplo 8 Efecto de agentes anti-Chlamydiales sobre la actividad de abzima in vivo
Se trataron pacientes, con edad entre 45 y 62, con angina estable con 500 mg de azitromicina una vez por día durante 15 días y 30 días o con 500 mg de azitromicina, 500 mg, más aspirina, 250 mg, dirariamente durante 15 días.
La actividad de abzima antes y después del tratamiento se muestra para el primer grupo en la tabla 15 y para el segundo grupo en la tabla 16.
Se observó que la actividad de abzima se reducía significativamente en ambos grupos de pacientes después de 15 días, siendo la reducción particularmente amplia en el grupo tratado con azitromicina y aspirina. También se observó una reducción en los niveles de LDL. No se registraron reacciones adversas en ninguno de los pacientes.
También se observó la condición clínica de los pacientes para mejorar durante el transcurso del tratamiento (tabla 17).
La administración del fármaco anti-Chamydial azitromicina durante dos semanas, en particular en combinación con aspirina, redujo la actividad de abzima y mejoró la condición clínica de pacientes que padecían de angina.
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Ejemplo 9 Actividad de abzima in vivo
Se determinaron los niveles de abzima en cinco grupos de personas utilizando los métodos descritos en la presente invención. Mediante las actuales técnicas se determinó un grupo de control que era sano. Un grupo con isquemia silenciosa eran individuos que se observó que eran isquémicos en una prueba de ejercicio/ECG, pero no eran conscientes de ningún problema de salud. También se analizaron los grupos de individuos que padecían una angina estable o inestable y que habían sufrido un infarto de miocardio.
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El nivel promedio de abzimas en cada grupo se muestra en la tabla 18, donde n es el número de individuos en cada grupo. Los individuos se consideraron positivos para abzimas si se observaba un aumento del 15% en la oxidación de lípidos sobre la adición de células de Chlamydia utilizando los métodos descritos en la presente invención. El porcentaje de cada grupo que eran positivos por abzimas también se muestra en la tabla 18. Ninguno de los valores en la tabla se ha ajustado para individuos que toman aspirina.
Se observa que el nivel de actividad de abzima y la proporción de individuos que indicaban positivo para abzimas se correlaciona con la gravedad de la afección del individuo. Se observa que la actividad de abzima disminuye fuertemente después de un ataque cardiaco (valores de comparación para angina inestable e infarto de miocardio de fase aguda). A continuación, la actividad de abzima aumenta progresivamente después del ataque al corazón en pacientes supervivientes.
Esto es indicativo de un papel activo para las abzimas en la inducción del infarto de miocardio. Las abzimas pueden formar parte del mecanismo de aglutinación de los coágulos trombolíticos que bloquean los vasos sanguíneos y producen el infarto. Esta aglutinación en coágulos reduce la actividad de abzima detectable en el sistema vascular. A medida que se disuelve el coágulo después del infarto, aumenta la actividad de abzima detectable.
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Ejemplo 10 Efecto de la aspirina en la actividad de abzima in vivo
Se determine la actividad de abzima en grupos de individuos con angina estable de clase I, II y III o angina inestable utilizando los métodos descritos en la presente invención. También se preguntó a los individuos si estaban tomando aspirina. Se subagruparon también los individuos según si indicaban que tomaban aspirina y los resultados se muestran en la tabla 19. Estos resultados no se ajustan para individuos que tomaban aspirina pero no lo indicaron.
Los valores en la tabla 19 son valores de la actividad de abzima de individuos en cada grupo (es decir, tomadores de aspirina de clase I y no tomadores de aspirina, etc.).
Estos resultados muestran niveles de abzima correspondientes a la gravedad de la enfermedad. Los tomadores de aspirina presentan generalmente una actividad de abzima inferior que los no tomadores de aspirina con los mismos síntomas clínicos.
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Ejemplo 11 Modelo animal para trastornos ateroscleróticos
Se infectaron conejos con Chlamydia psittaci (cepa Lori strain) mediante ruta intratraqueal con 1,5 ml de una suspensión de embrión de pollo al 10% que contenía 1X10^{7,5} de células de Chlamydia. Se recogió el suero de los conejos en el día 0 (preinfección) y a continuación cada 14 días mediante la utilización de la ruta de recogida de sangre estándar desde el corazón.
A continuación, se utilizó el suero en un ensayo ELISA estándar para medir el título de IgG anti-Chlamydia. En las mismas muestras de suero, se midió la cantidad del nivel de abzima de Chlamydia utilizando el ensayo estándar descrito previamente. La aparición de abzimas se correlaciona con la aparición de anticuerpos IgG anti-Chlamydia.
Los resultados para 4 conejos (3 infectados y 1 de control) se muestran en la tabla 20.
Estos resultados muestran que un modelo animal con niveles elevados de abzima se puede generar mediante la infección con Chlamydia. Estos modelos son útiles en el seguimiento de la progresión de la enfermedad causada por abzimas y la determinación de varios parámetros, tales como la velocidad de eliminación. Los modelos también son útiles en el ensayo de compuestos como fármacos potenciales para la reducción de niveles de abzima y la mejora concomitante en los síntomas.
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Ejemplo 12 Abzimas anti-Chlamydia en conejos
La producción de anticuerpos anti-Chamydia oxidantes de lípidos se demostró utilizando un modelo de conejo producido tal como se ha descrito anteriormente mediante infección intratraqueal con Chlamydia Psittaci.
Los resultados se muestran en la Tabla 21. Se infectaron conejos intratraquealmente con 1,5 ml de una suspensión al 10% de embrión de pollo que contenía 1x10^{7,5} de Chlamydia Psittaci (cepa Lori) y se recogió la sangre a partir de los corazones de los conejos. Se muestran los niveles de abzima en el séptimo día después de una inyección subcutánea de una vacuna, 1x10^{7,5} de Chlamydia Psittaci (cepa Lori) tratada con formalina (\NAK tabla 21).
La aparición de abzimas coincidió con la acumulación de IgG anti-Chamydia detectada mediante ELISA. Una inyección de las mismas bacterias, pero en una preparación tratada con formalina, en el día 14 de la infección (conejo 3) condujo a un incremento en los títulos de IgG anti-Chamydia por ELISA en el séptimo día después de esta inoculación. A la vez, en el suero de este conejo había una reducción de 2 veces en la actividad de abzima, de 131 a 64 \muM MDA/ml.
No hubo tal reducción en la actividad de abzima registrada para los otros dos conejos que no recibieron esta inoculación.
Se observó por tanto que la inoculación de la preparación de vacunas del antígeno de Chlamydia reducía la presencia/actividad de abzimas anti-Chlamydia.
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Ejemplo 13 Terapia anti-abzima en la enfermedad isquémica cardiaca
Se seleccionó un grupo de 30 pacientes con enfermedad isquémica cardiaca (IHD) para terapia experimental para reducir/eliminar la actividad de abzimas anti-Chlamydia en su suero (el grupo para terapia) y un grupo de 20 pacientes "emparejados" no tratados (el Grupo de pacientes de control no tratados). La prueba tuvo lugar en el Centro Cardiológico de Saratov (Federación Rusa) de junio a agosto del 2002.
El grupo para terapia comprendía 23 pacientes hombres y 7 pacientes mujeres con una edad promedio de 55 \pm 1,1 años. El grupo de pacientes de control para monitorizar el nivel de abzimas comprendía 20 pacientes con IHD, de los cuales 15 eran pacientes hombres y 5 eran pacientes mujeres con una edad promedio de 53 \pm 1,2 años. Cada paciente proporcionó el consentimiento escrito para su participación en la prueba.
Todos los pacientes presentaban una angina de clase II-III de la clasificación de la Sociedad Cardiológica Canadiense. 15 pacientes en el grupo de terapia y 10 en el grupo de pacientes de control presentaban un historial de infarto de miocardio en el año pasado. El diagnóstico de IHD para los otros 15 pacientes en el primer grupo y 10 en el grupo de pacientes de control se confirmó mediante angiografía coronaria que detectaba el 70% o más de la estenosis
arterial.
A parte del grado de generalización o gravedad de la aterosclerosis, todos los grupos se emparejaron no sólo por la edad, género, y factores de riesgo, sino también por la medicación, nitratos, \beta-bloqueantes, inhibidores de enzimas conversoras de angiotensina, etc.
La progresión de la condición clínica de los pacientes se monitorizó mediante el uso del Protocolo de Bruce modificado para la prueba ECG de ejercicio/estrés en cinta ergométrica y en el Cuestionario de Rose-Blackburn (Cardiovascular Survey Methods. WHO, Ginebra, 1968).
El principal parámetro de la selección de un paciente para la prueba fue un nivel de actividad de abzima anti-Chlamydia superior a 15 \muM de malondialdehído (MDA) por ml de suero. El grupo de terapia se dividió en 4 subgrupos terapéuticos:
1.) Grupo de terapia A. - aquellos a los que se administró un inhibidor no específico de abzimas anti-Chlamydia, azitromicina, que también muestra propiedades antimicrobianas, se les prescribió con una dosis diaria de 500 mg.
2.) Grupo de terapia B - se prescribió una administración combinada de azitromicina, en la misma dosis, con ácido acetilsalicílico (aspirina). Ésta última presenta la capacidad aparente de bloquear específicamente las abzimas mediante iones quelantes de cobre en su centro activo. La dosis de aspirina fue 250 mg por día.
3.) Grupo de terapia C- se prescribió una administración combinada de dos tipos de inhibidores no específicos de las abzimas con propiedades antioxidantes, azitromicina antimicrobiana, en la misma dosis que en los grupos previos, y vitaminas E, A, C. La dosis diaria de vitamina E fue de 30 mg, vitamina A 1.500 EU y vitamina C 90 mg.
4.) Grupo de terapia D - A los pacientes en este grupo se les administró solamente 250 mg de aspirina diaria.
La sangre de los pacientes de los tres grupos se analizó cada dos semanas. Se continuaron las terapias sujetas a la eficacia de la supresión/eliminación de la actividad de abzima anti-Chlamydia y los resultados de las pruebas se muestran hasta 60 días después de la administración de placebo/terapia.
El título de anticuerpos anti-Chlamydia se midió en el grupo de terapia utilizando el método previamente descrito (véase la tabla 26). También se midió la gravedad de los síntomas clínicos (véase la tabla 28).
Los resultados de la monitorización de la supresión de la actividad de abzima anti-Chlamydia se presentan en las siguientes tablas (tablas 22-27).
Al principio se observó que a las dos semanas de la terapia hubo en todos los grupos una reducción significativa en la actividad de abzima. Lo más destacado fue en el grupo de terapia B donde el uso de un inhibidor no específico, azitromicina, se combinó con el uso de un inhibidor específico, aspirina (Tabla 23). De hecho, el nivel de la actividad en este grupo alcanzó el nivel de individuos clínicamente sanos (ver tabla resumen 28). Una observación importante fue que el paciente TGB7 en este grupo mostró un gran aumento en el nivel de abzimas (que se correlacionaba con un empeoramiento de los síntomas clínicos) en el día 45 (doble asterisco - tabla 23) y, a continuación, después de 15 días de tratamiento el paciente empezó a sentirse mejor y las abzimas se redujeron a 0. TGB7 también mostró un aumento en los niveles de ApoB (asterisco - véase la tabla 7) a la vez que un aumento en el nivel de abzimas a los 45 días.
La terapia menos eficaz fue en el grupo de terapia a (sólo azitromicina - Tabla 22) donde para el 27% de los pacientes (3 de 11, marcados con un asterisco) no hubo cambios en la actividad de abzima después de 15 días. Sin embargo, la reducción continuada para la mayoría de pacientes se invirtió para dos de ellos en el primer grupo en el día 30 de la prueba (TGA2 y TGA6, Tabla 1, marcado con dos asteriscos). Esta observación, junto con el hecho de que hubo algunos pacientes con un nivel constante significativo, aunque reducido, de la actividad de abzima, condujo a la extensión del tratamiento durante otros 30 días, dando lugar a descensos significativos en todos los pacientes. En el grupo de terapia A los síntomas clínicos de los pacientes TGA2 y TGA6 mejoraron durante 15 días y se correlacionaron con la reducción en el nivel de abzimas, aunque los síntomas clínicos empeoraron y el nivel de abzimas aumentó alrededor del día 30 de la prueba (doble asterisco - tabla 22).
En el grupo de terapia C (azitromicina y antioxidantes), hubo un paciente (TGC1) que no mostró un descenso en la actividad de abzima (con asterisco - Tabla 24).
El uso de aspirina sola, en la dosis prescrita, sin azitromicina, condujo a una reducción en la actividad de abzima, pero en un menor grado que el observado con la combinación (grupo de terapia D - tabla 25).
La terapia anti-abzima aplicada mejoró significativamente la condición clínica de la mayoría de los pacientes, que se evaluó con el cuestionario de Rose-Blackburn modificado (tabla 27) y se verificó mediante el uso de la prueba ESG de ejercicio/estrés en cinta ergométrica. Al mismo tiempo, no se observó una dinámica clínica positiva en el grupo de control, ni para un solo paciente. En la tabla 27 PCG indica Grupo de pacientes de control, \NAK indica los resultados obtenidos mediante ensayo fluorescente, \NAK\NAK indica los resultados obtenidos mediante ensayo inmunoenzimátio, \NAK\NAK\NAK indica
los resultados obtenidos mediante ensayo inmunoturbidimétrico. * indica una diferencia estadísticamente significativa.
No se observaron cambios estadísticamente significativos para los siguientes parámetros de coagulación: tiempo de coagulación con caolín, tiempo parcial de tromboplastina activada, tiempo de protrombina. No se registraron cambios en el nivel de creatinina en el suero y las enzimas del hígado alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa.
Ninguno de los pacientes en los grupos de terapia experimental presentó cambios positivos en sus condiciones clínicas para un conjunto de meses/años antes de su selección para la prueba. Por tanto, esta ausencia de dinámica positiva se puede utilizar como el control "interno" para el progreso clínico significativo de los pacientes que se había observado.
El régimen intensivo original de inhibidor de abzima, que presenta propiedades antimicrobianas, eliminó totalmente la presencia de IgG anti-Chlamydia.
Mediante el marcaje de las abzimas anti-Chlamydia, se consiguieron mejoras significativas en las concentraciones de lípido y trombosis (tabla 27). Por tanto, es posible sugerir que las anormalidades en el desarrollo del metabolismo de lípidos y el sistema de coagulación en la aterosclerosis son secundarias a la aparición de estos anticuerpos catalíticos oxidantes de lípidos.
El efecto beneficioso observado de azitromicina no pudo explicarse por sus propiedades antibacterianas, ya que sólo en 15 pacientes de 30 (el 50%) seleccionados para la prueba habían dado positivo de antemano en la presencia de infección por Chlamydia. El nivel de IgG anti-Chlamydia en el suero de otros 8 pacientes fue insignificante, por debajo de 1:32 en ensayo inmunofluorescente. Los otros 7 pacientes dieron negativo. La prueba de diagnóstico indica si un paciente transporta abzimas y no se correlaciona necesariamente con que el paciente dé positivo por anticuerpos IgG de Chlamydia. Por lo tanto, la terapia no debería prescribirse en base a la seropositividad por Chlamydia. Esto demuestra la utilidad en la invención cuando la prueba de diagnóstico está unida a la administración de la terapia correcta seguido de pruebas de pronóstico repetidas para monitorizar la eliminación de abzimas utilizando el tratamiento.
Ciertos pacientes de IHD dieron negativo en la prueba teranóstica para anticuerpos IgG anti-Chlamydia, pero dieron positivo para abzimas. Las valoraciones de abzimas y de la prueba de Rose-Blackburn antes y después del tratamiento para estos pacientes se muestran en la tabla 29. Se trataron estos pacientes y su actividad de abzima se redujo con una posterior mejora de los síntomas clínicos.
Estos resultados muestran que si un paciente transporta abzimas no se correlaciona necesariamente con que el paciente dé positivo para anticuerpos IgG de chlamydia. No se puede diagnosticar o prescribir una terapia para una afección aterosclerótica en base a a seropositividad por Chlamydia. Sin embargo, se observa que las abzimas son útiles como marcadores de diagnóstico de afecciones ateroscleróticas y se pueden relacionar con la administración de la terapia apropiada seguido de pruebas de pronóstico repetidas para monitorizar la eliminación de abzimas.
Ejemplo 14 Propiedades anti-abzima/antioxidante de azitromicina
Se midió la actividad inhibidora de azitromicina sobre abzimas aisladas de una lesión aterosclerótica tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 30. Cada número es un promedio de la medición por duplicado/triplicado y se calculó como la diferencia entre el nivel de acumulación de MDA en el suero analizado antes y después de la adición de 0,5 de la dosis de inmunización de vacuna de Chlamydia ovina ("Intervet"). El efecto de DMSO se dedujo de las lecturas donde se indica (**).
Se observó que la azitromicina era un fuerte inhibidor in vitro de la actividad de abzima. Esta actividad puede ser responsable de los efectos biológicos in vivo observados con azitromicina, tal como un rápido descenso en la actividad de abzima después de la administración de azitromicina.
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Ejemplo 15 Integridad de la membrana de Chlamydia y actividad de abzima
La actividad de abzima se midió tal como se ha descrito anteriormente utilizando muestras de Chlamydia pneumoniae o Chlamydia Psittaci tratadas con formalina, sulfato de amonio o SDS. En estas reacciones, no hubo reacción de oxidación de lípidos en el sistema de prueba.
El tratamiento de las bacterias de Chlamydia con agentes caotrópicos, incluyendo detergentes no iónicos Triton X-100 e Igepal CA-630 al 1%, solución al 10% de DMSO, que conservan la presencia de los lípidos de membrana en el sistema pero rompen la integridad de la membrana bacteriana, anuló completamente el desarrollo de la reacción de oxidación de lípidos.
Estos experimentos indican que los lípidos son importantes para la iniciación y el desarrollo de la reacción o reacciones de peroxidación de lípidos que se desarrollan en el sistema de prueba. En particular, se indica un papel para los lipopolisacáridos que se rompen mediante los tratamientos anteriores.
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Ejemplo 16 Historiales de los casos
Caso No 1.
Se diagnosticó un paciente hombre de 64 años con la Enfermedad Isquemica Cardiaca 3 años antes cuando presentó los primeros síntomas de angina de pecho. El diagnóstico se confirmó mediante angiografía coronaria, que estableció una estenosis de dos arterias: 75% de la arteria coronaria derecha y 100% de oclusión de la arteria intraventricular anterior.
Se seleccionó para la prueba teranóstica en base a que se detectaron abzimas en su suero. Una combinación de dos inhibidores de abzimas, azitromicina, en la dosis diaria de 500 mg, y aspirina, en la dosis diaria de 250 mg. Su nivel de IgG anti-Chlamydia era elevado con un título de 1:256.
Antes del tratamiento, su condición clínica, estimada mediante una valoración del protocolo de Rose-Blackburn modificado, fue de 19. La actividad de abzimafue de 25 \muM MDA/ml, el nivel del colesterol total de 226 mg/dL, triglicéridos - 90 mg/dL, HDL-colesterol - 56 mg/dL, LDL-colesterol - 73 mg/dL, ApoA - 139 mg/dL, ApoB - 81 mg/dL, alanina aminotransferasa (ALT) - 25 U/L, aspartato aminotransferasa (AST) - 29 U/L, creatinina - 0,71 mg/dL.
Durante el tratamiento no se observaron reacciones adversas significativas. En su primera visita después del inicio de la terapia, 15 días, indicó una cierta mejora en los signos de su enfermedad. Esta mejora continuó hasta el día 30 de la terapia. Esto se corroboró por un incremento en el tiempo de tolerancia durante la prueba ESG de ejercicio en cinta ergométrica por el protocolo de Bruce modificado.
En ese momento no se detectó en el suero ni la actividad de abzima ni la presencia de IgG anti-Chlamydia. El nivel de parámetros de los lípidos también mejoró: colesterol total se redujo hasta 172 mg/dL, triglicéridos hasta - 80 mg/dL, HDL-colesterol - 52 mg/dL, LDL-colesterol - 64 mg/dL, ApoA - 110 mg/dL, ApoB - 67 mg/dL. El nivel de ALT, AST y creatinina permaneció igual - 25 U/ml, 27 U/ml y 0,7 mg/dL respectivamente.
Al llegar al día 45 desde el inicio de la terapia, el paciente indicó que una semana antes, en el día 38 desde el principio, su condición empezó a deteriorarse - la frecuencia y la intensidad de los ataques de angina aumentaron repentinamente. Esto coincidió con un aumento en la actividad de abzima, que llegó a 80 \muM MDA/ml. Sin embargo, es importante indicar que no se registraron IgG anti-chlamydia "tradicionales".
Al mismo tiempo, también empeoraron los parámetros del metabolismo lipídico: el colesterol total aumentó hasta 185 mg/dL, triglicéridos - 143 mg/dL, LDL-colesterol - 74 mg/dL, ApoA - 115 mg/dL, ApoB - 87 mg/dL. El nivel de HDL-colesterol y ApoA permanecieron esencialmente constantes - 50 mg/dL y 115 mg/dL, de manera correspondiente. Una observación importante fue que también cambió el nivel de enzimas del hígado, ALT aumentó hasta 35 U/L y AST hasta 39 U/L; concentración de creatinina fue 0,8 mg/dL.
Sin embargo, la terapia continuada pareció suprimir/eliminar completamente la actividad de la abzima, que también estuvo acompañado de una mejora en la concentración de algunos parámetros de lípidos: el colesterol se redujo hasta 165 mg/dL, triglicéridos hasta - 100 mg/dL. La concentración de HDL-colesterol fue 47 mg/dL, LDL-colesterol - 72 mg/dL, ApoA - 112 mg/dL. El nivel de ALT, AST y creatinina fue de 24 U/ml, 25 U/ml y 0,7 mg/dL, respectivamente.
Al mismo tiempo, el nivel de ApoB permaneció en el nivel de pretratamiento a 80 mg/dL. La condición clínica inicialmente mejorada también regresó al nivel en el que estaba antes del inicio de la terapia, la valoración de Rose-Blackburn fue 19. Para estabilizar el nivel suprimido de las abzimas en un intento de mejorar los parámetros clínicos del paciente, se recomendó continuar la terapia anti-abzima prescrita.
No se detectó IgG anti-Chlamydia en este paciente a partir del día 15 del inicio de la terapia en adelante y el uso continuado de azitromicina se destinó a controlar el nivel suprimido de las abzimas de reacción cruzada, que se unen y oxidan lipoproteínas, en lugar de a la infección bacteriana per se.
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Caso No. 2
Se diagnosticó un paciente hombre de 46 años con IHD cuando fue admitido con un infarto de miocardio agudo el 21 de febrero del 2002. Antes de eso, no presentaba un historial con enfermedades del corazón. El siguiente mayo una angiografía coronaria no reveló estenosis/estrechamiento de sus arterias coronarias.
Este paciente se seleccionó para una prueba teranóstica en base a que se detectó actividad significativa de las abzimas anti-Chlamydia en su suero. Fue de 140 \muM MDA/ml. Se prescribió una combinación de dos tipos de inhibidores de abzimas, azitromicina, en la dosis de 500 mg diarios, y un cóctel de antioxidantes de las vitaminas E, A, C. La dosis diaria de vitamina E fue de 30 mg, vitamina A 1.500 EU y vitamina C 90 mg.
No hubo un nivel detectable de IgA, IgG o IgM anti-Chlamydia "tradicional" detectado en el suero de este paciente antes o durante el periodo de tratamiento. Antes del tratamiento, su condición clínica, estimada mediante la valoración del protocolo de Rose-Blackburn modificado, fue de 17. El nivel de colesterol fue 205 mg/dL, triglicéridos - 129 mg/dL, HDL-colesterol - 39 mg/dL, LDL-colesterol - 80 mg/dL, ApoA - 152 mg/dL, ApoB - 221 mg/dL.
Durante el tratamiento no se observaron reacciones adversas significativas. El paciente empezó a sentir una cierta mejora en los signos de la enfermedad después de las primeras dos semanas de tratamiento. Este progreso continuó durante todo el periodo de la terapia de 60 días. Esto fue corroborado por un aumento significativo en el tiempo de tolerancia durante la prueba ESG de ejercicio en cinta ergométrica llevada a cabo según el protocolo de Bruce modificado.
Al final del periodo de observación, después de 60 días, ni la actividad de abzima ni la presencia de IgG anti-Chlamydia se detectaron en su suero.
Estos cambios en la actividad de abzima coincidieron con una mejora significativa en la condición clínica del paciente. Su valoración en el protocolo de Rose-Blackburn modificado se redujo desde 17 antes del tratamiento hasta 13 después del mismo.
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Ejemplo 17 Efecto de la terapia anti-abzima en la trombosis
Uno de los indicadores de trastornos ateroscleróticos es que los pacientes presentan a menudo aberraciones en el tiempo que tarda su sangre para formar coágulos (esto aumenta generalmente en los pacientes). Una serie de mecanismos puede conducir a la formación de coágulos y, por tanto, existen cuatro pruebas reconocidas internacionalmente para el tiempo de coagulación. La primera es la denominada Tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) y funciona mediante la adición de tromboplastina y calcio para medir el mecanismo intrínseco. La segunda denominada Tiempo de protrombina (PT) es una medición simple del mecanismo extrínseco. El tiempo de coagulación con sílice (SCT) mide la coagulación inducida por partículas finas (sílice) y el Tiempo de coagulación con caolín (KCT) mide la coagulación inducida por partículas más grandes (Caolín). Para todos estos tiempos de coagulación rápidos son indicativos de mayores riesgos de trombosis.
Antes del tratamiento, se midieron los tiempos de coagulación utilizando los cuatro métodos para todos los pacientes en todos los grupos de terapia y se calculó el promedio con un error estándar. Las mediciones se repitieron 60 días después. Los controles eran nuestro Grupo de control de pacientes (mediciones tomadas una vez - los valores no cambiaron significativamente para estos pacientes durante el tiempo) y también forman nuestro grupo de control clínicamente sano. Los resultados del tratamiento se muestran en la tabla 32.
El valor promedio para pacientes antes del tratamiento para la prueba APTT fue 22,4 \pm 0,89 (en comparación con el valor del Grupo de pacientes de control de 25,2 \pm 1,37) y fue significativamente diferente del valor del grupo clínicamente sano de 49,1 \pm 7. Después del tratamiento, los pacientes presentaron un valor promedio de 46,9 \pm 6,45 y, por tanto, se encontraba en el "intervalo normal" de los tiempos de coagulación, es decir, se había normalizado.
El valor promedio para pacientes antes del tratamiento para la prueba de PT fue 13,5 \pm 0,094 (en comparación con el valor del Grupo de pacientes de control de 17,3 \pm 4,05) e inferior al valor del grupo clínicamente sano de 23,7 \pm 4,01. Después del tratamiento, los pacientes presentaron un valor promedio de 25,3 \pm 4,05 y, por tanto, se encontraba en el "intervalo normal" de los tiempos de coagulación, es decir, se había normalizado.
El valor promedio para pacientes antes del tratamiento para la prueba de SCT fue 151 \pm 15,0 (en comparación con el valor del Grupo de pacientes de control de 137 \pm 11,5) y significativamente inferior al valor del grupo clínicamente sano de 248 \pm 10,0. Después del tratamiento, los pacientes presentaron un valor promedio de 235 \pm 17,9 y, por tanto, se encontraba en el "intervalo normal" de los tiempos de coagulación, es decir, se había normalizado.
El valor promedio para pacientes antes del tratamiento para la prueba de KCT fue 51,2 \pm 4,59 (en comparación con el valor del Grupo de pacientes de control de 50,3 \pm 2,16) y significativamente diferente al valor promedio del grupo clínicamente sano de 133 \pm 23,7. Después del tratamiento, los pacientes presentaron un valor promedio de 126 \pm 34,2 y, por tanto, se encontraba en el "intervalo normal" de los tiempos de coagulación, es decir, se había normalizado.
Estos resultados muestran que la terapia anti-abzima se puede utilizar para normalizar los tiempos de coagulación (utilizando todos los ensayos de tiempo de coagulación reconocidos internacionalmente) y reducir el riesgo de trombosis y, por tanto, los ataques al corazón y la apoplejía.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.
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Claims (16)

1. Método para evaluar un trastorno aterosclerótico en un individuo que comprende:
analizar la capacidad de un anticuerpo de una muestra de suero obtenida del individuo para oxidar lípidos y unirse a un antígeno de células de Chlamydia,
siendo la presencia de un anticuerpo en dicha muestra que oxida lípidos y se une a un antígeno de células de Chlamydia indicativa de que el individuo padece o presenta riesgo de padecer un trastorno aterosclerótico.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
determinar la unión a un antígeno de células de Chlamydia de una molécula de anticuerpo de una muestra obtenida del individuo; y
determinar la actividad de oxidación de lípidos de dicha molécula de anticuerpo.
3. Método según la reivindicación 1, que comprende:
poner en contacto la muestra con una antígeno de células de Chlamydia; y
determinar la oxidación de lípidos.
4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno de células de Chlamydia está comprendido en una célula de Chlamydia.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la oxidación de lípidos se determina determinando la producción de un producto de oxidación de lípidos.
6. Método según la reivindicación 5, en el producto de la oxidación de lípidos es malondialdehído (MDA).
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la oxidación de lípidos se determina determinando la hemólisis de eritrocitos.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la oxidación de lípidos se determina determinando la liberación de una sustancia informadora desde un microrrecipiente.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende determinar la cantidad de dicha molécula de anticuerpo en dicha muestra.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho trastorno aterosclerótico es aterosclerosis.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula de Chlamydia es una célula de una especie que pertenece al grupo de Chlamydia psittaci.
12. Método según la reivindicación 11, en el que la célula de Chlamydia es una célula de Chlamydia psittaci ovina.
13. Uso de una célula de Chlamydia aislada en un método de evaluación de un trastorno aterosclerótico en un individuo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Uso de un antígeno de Chlamydia aislado en un método de evaluación de un trastorno aterosclerótico en un individuo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
15. Método de aislamiento de un anticuerpo oxidante de lípidos, que comprende:
aislar una población de anticuerpos de una muestra de una lesión aterosclerótica obtenida de un individuo y;
aislar uno o más anticuerpos de dicha población que son reactivos con una célula de Chlamydia.
16. Método según la reivindicación 15, que comprende determinar la actividad de oxidación de lípidos de dichos uno o más anticuerpos.
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