EA009607B1 - Tnf-подобный секретируемый белок - Google Patents

Tnf-подобный секретируемый белок Download PDF

Info

Publication number
EA009607B1
EA009607B1 EA200501843A EA200501843A EA009607B1 EA 009607 B1 EA009607 B1 EA 009607B1 EA 200501843 A EA200501843 A EA 200501843A EA 200501843 A EA200501843 A EA 200501843A EA 009607 B1 EA009607 B1 EA 009607B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
nucleic acid
disease
patient
acid molecule
Prior art date
Application number
EA200501843A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501843A1 (ru
Inventor
Стефен Ноэль Фитцджералд
Ричард Джозеф Фаган
Кристофер Бенджамин Фелпс
Кристин Пауэр
Марк Ибберсон
Мелани Йорке
Original Assignee
Арес Трейдинг С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Арес Трейдинг С.А. filed Critical Арес Трейдинг С.А.
Publication of EA200501843A1 publication Critical patent/EA200501843A1/ru
Publication of EA009607B1 publication Critical patent/EA009607B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к новому белку INSP058, идентифицированному в настоящей заявке как TNF-подобный секретируемый белок, и к применению указанного белка и последовательностей нуклеиновой кислоты кодирующего гена для диагностики, профилактики и лечения заболеваний.

Description

В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин функциональная геномика относится к подходу использования средств биоинформатики для определения функций исследуемых последовательностей белков. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научно-исследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных этих последовательностей.
Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической идентификации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации по настоящему изобретению, могут давать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности.
Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов приходят к важным открытиям. Например, 1псу1е Сепотюз, 1пс. была опубликована патентная заявка (\УО 00/68380), имеющая отношение к белкам внеклеточной матрицы и белкам, связанным с адгезией, человека (ΕΧΜΑΌ) и полинуклеотидам, которые идентифицируют и кодируют ΕΧΜΑΌ. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, для их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств все еще остается актуальной.
Секретируемые белки
Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки является главным фактором многих биологических процессов. Ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, все секретируются клетками. Это происходит в результате слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида. Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембрано-ассоциированный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые нацелены на секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо сохраняются в плазматической мембране. Полипептиды, которые сохраняются в плазматической мембране, имеют один или несколько трансмембранных доменов. Примерами секретируемых белков, которые играют главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса (адгезивные молекулы), протеазы, ΤΝΕ-подобные белки и факторы роста и дифференцировки.
Таким образом, изменение активности секретируемых белков обеспечивает средства изменения фенотипа заболевания и, по существу, идентификацию новых секретируемых белков, в частности ΤΝΕподобных секретируемых белков, что является чрезвычайно актуальным, поскольку они могут играть определенную роль при некоторых заболеваниях и, таким образом, могут использоваться в разработке новых методов лечения.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении, что белок ΙΝ8Ρ058 представляет собой ΤΝΡподобный секретируемый белок. В одном из вариантов осуществления первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0:8 и/или 8ЕО ГО N0:12;
(ίί) представляет собой его фрагмент, который является ΤΝΡ-подобным секретируемым белком, или который имеет антигенную детерминанту, общую с полипептидами (1); или (ш) представляет собой функциональный эквивалент (1) или (И).
Во втором варианте осуществления первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который (ί) состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:8 и/или 8Е0 ГО N0:12;
(ίί) представляет собой его фрагмент, который обладает функцией ΤNΡ-подобного секретируемого белка, либо который имеет антигенную детерминанту, общую с полипептидом (1); или (ш) представляет собой функциональный эквивалент (1) или (И).
- 1 009607
Предпочтительно фрагмент или функциональный эквивалент согласно первому или второму варианту осуществления состоит из аминокислотной последовательности, представленной в δΕΟ ГО N0:9 или δΕΟ ГО N0:16.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в δΕΟ ГО N0:8, здесь обозначен как полипептид ΙΝδΡ058. Отмечается, что белок является ΤΝΡ-подобным секретируемым белком. Установлено, что наиболее близкими белками с известной функцией в отношении этого белка являются белки комплемента 1с.|. Белки комплемента 1с.| (С1с|) являются белками, родственными ΤΝΡ, в которых с помощью кристаллографических исследований было показано, что ΤΝΡ и глобулярный домен дС'1с.| белка ЛСКР30 мыши обладают близкой третичной структурой и трехмерной организацией, что говорит об эволюционной связи между семействами ΤΝΡ и С1с.|. Как известно на настоящий момент, семейство генов С1с.| человека состоит из 13 представителей, включая коллагеновые представители семейства, такие как СКР, ЛСКР30, С0К.826, ΕΜΙΕΙΝ-1, ΕΜΙΕΙΝ-2, коллагены VII и X, и неколлагеновые представители семейства, такие как прецеребеллин и мультимерин. АСКР30 представляет собой распространенный сывороточный белок, синтезируемый в жировой ткани в ответ на инсулин, и его выработка подавлена у мышей и людей, страдающих ожирением. Недавний обзор семейства С'1с.| см. Вобтег с1 а1., (2002), ΤΚΕΝΏδ ίη Вюсйеш1са1 8с1епсе5 27 (1):19-26.
Представители семейства С'1с.| могут использоваться для лечения, профилактики и/или диагностики состояний и заболеваний, таких как клеточно-пролиферативные расстройства, включая опухолевые заболевания, меланому, опухоли легких, ободочной и прямой кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие твердые опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, расстройства ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз и воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантата; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отек, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, травму головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боль; нарушения развития; метаболические расстройства, включая диабет, остеопороз и ожирение, СПИД и заболевание почек; инфекции, включая вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, грибковую инфекцию и паразитарную инфекцию; и другие расстройства, опосредованные ΤΝΡподобными секретируемыми белками, в особенности, опосредованные белками семейства С1с|.
По-видимому, полипептид ΙΝ8Ρ058 кодируется тремя экзонами (экзон 1, кодирующий полипептид с последовательностью, представленной в δΕΟ ГО Ν0:2, экзон 2, кодирующий полипептид с последовательностью, представленной в δΕΟ ГО Ν0:4, и экзон 3, кодирующий полипептид с последовательностью, представленной в δΕΟ ГО Ν0:6). Последовательность, имеющая некоторое сходство с δΕΟ ГО Ν0:8 последовательностью, была описана в предшествующем уровне техники, хотя не указывалось, что белок является секретируемым белком с ΤΝΡ-подобной укладкой. Эта полипептидная последовательность, представленная в δΕΟ ГО Ν0:8, международной патентной заявки \У0 00/68380, исключена из объема этого аспекта настоящего изобретения.
Полипептид с последовательностью, представленной в δΕΟ ГО Ν0:10, здесь называется полипептидом ΙΝ8Ρ058δν или ΙΝδΡ058δν. Полипептид ΙΝδΡ0158δν представляет собой вариант сплайсинга полипептида ΙΝδΡ058, полученный в результате делеции в центральной части экзона 3 (δΕΟ ГО Ν0:5). Делеция в нуклеотидной последовательности, а также удаление части экзона 3, приводит к сдвигу рамки считывания, в результате чего образуется ранний стоп-кодон, и, таким образом, транслированный полипептид ΙΝδΡ058δν намного короче полипептида ΙΝδΡ058 (фиг. 10). У белка ΙΝδΡ058δν отсутствует домен, совпадающий с доменом С1 с.| и обнаруженный в полноразмерном ΙΝδΡ058, что предполагает, что ΙΝδΡ058δν может быть антагонистом ΙΝδΡ058, например, за счет конкурентного взаимодействия с версией ΙΝδΡ058 полипептида на одном и том же сайте связывания рецептора. В таком механизме полипептид ΙΝδΡ058δν не стимулировал бы рецептор и не индуцировал нормальный биологический эффект. В связи с этим, такой полипептид являлся бы конкурентным ингибитором природного полипептида. Несмотря на то, что заявитель не ограничивается этой теорией, предполагается, что каждые первые 15 аминокислот полипептида ΙΝδΡ058 и полипептида ΙΝδΡ058δν образуют сигнальный пептид.
Полноразмерная полипептидная последовательность ΙΝδΡ058 без этой предположительной сигнальной последовательности описана в δΕΟ ГО Ν0:14.
Полипептид с последовательностью, представленной в δΕΟ ГО Ν0:14, обозначен здесь как зрелый полипептид ΙΝδΡ058.
Использующийся здесь термин полипептиды ΙΝδΡ058 включает полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 ΙΝδΡ058, полипептид экзона 2 ΙΝδΡ058, полипептид экзона 3 ΙΝδΡ058, полипептид ΙΝδΡ058 и зрелый полипептид ΙΝδΡ058.
Полноразмерная полипептидная последовательность ΙΝδΡ058δν без этой предположительной сигнальной последовательности описана в δΕΟ ГО Ν0:16.
Полипептид с последовательностью, представленной в δΕΟ ГО Ν0:16, здесь называется зрелым полипептидом ΙΝδΡ058δν.
- 2 009607
Используемый здесь термин полипептиды ΙΝδΡ058δν включает полипептиды, содержащие зрелый полипептид ΙΝδΡ058δν.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид первого аспекта настоящего изобретения.
Предпочтительно, эта очищенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, представленную в 8Еф ΙΌ N0:7 (кодирующую полипептид ΙΝδΡ058), 8Еф ΙΌ N0:9 (кодирующую полипептид ΙΝδΡ058δν), 8Еф ΙΌ N0:11 (кодирующую полипептид экзона 1 зрелого ΙΝ8Ρ058), 8Е0 ΙΌ N0:13 (кодирующую зрелый полипептид ΙΝ8Ρ058), 8Е0 ΙΌ N0:15 (кодирующую зрелый полипептид ΙΝ8Ρ058δν), или представляет собой избыточный эквивалент или фрагмент этой последовательности.
Также изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:7, 8Е0 ΙΌ N0:9 (кодирующей полипептид ΙΝδΡ058δν), 8Е0 ΙΌ N0:11 (кодирующей полипептид экзона 1 зрелого ΙΝ8Ρ058), 8Е0 ΙΌ N0:13 (кодирующей зрелый полипептид ΙΝ8Ρ058), 8Е0 ΙΌ N0:15 (кодирующей зрелый полипептид ΙΝδΡ058δν), или представляет собой избыточный эквивалент или фрагмент этой последовательности.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты второго аспекта настоящего изобретения.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной вектором четвертого аспекта настоящего изобретения.
В шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с полипептидом в соответствии с первым аспектом изобретения. Предпочтительно этот лиганд ингибирует функцию секретируемого белка первого аспекта изобретения, который является секретируемым белком с активностью ΤΝΕ-подобного белка. Лиганды полипептида по настоящему изобретению могут быть в различных формах, включая природные или модифицированные субстраты, ферменты, рецепторы, небольшие органические молекулы, такие как небольшие природные или синтетические органические молекулы с массой до 2000 Да, предпочтительно 800 Да или меньше, пептидомиметики, неорганические молекулы, пептиды, полипептиды, антитела, структурные или функциональные миметики указанных выше лигандов.
В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое эффективно модифицирует экспрессию природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или регулирует активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения.
Соединение в соответствии с седьмым аспектом настоящего изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активность полипептида. Необходимо отметить, что идентификация функции ΙΝδΡ058 позволяет разработать способы скрининга, способные идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний. Лиганды и соединения по шестому и седьмому аспекту изобретения можно идентифицировать с помощью таких способов. Эти способы включены в качестве аспектов настоящего изобретения.
В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к клетке-хозяину пятого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду шестого аспекта настоящего изобретения, или к соединению седьмого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики заболеваний, связанных с ΤΝΕ-подобными секретируемыми белками. Такие заболевания могут включать, но ими не ограничиваются, клеточно-пролиферативные расстройства, включая опухолевые заболевания, меланому, опухоли легких, ободочной и прямой кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие твердые опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, расстройства ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз и воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантата; сердечнососудистые заболевания, включая гипертензию, отек, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, травму головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боль; нарушения развития; метаболические расстройства, включая диабет, остеопороз и ожирение, СПИД и заболевание почек; инфекции, включая вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, грибковую инфекцию и паразитарную инфекцию; и другие расстройства, опосредованные ΤΝΕподобными секретируемыми белками, в особенности, опосредованные белками семейства С1с.|. Эти молекулы также можно использовать для получения лекарственного средства для лечения таких заболеваний. Молекулы в соответствии с первым, вторым, третьим, четвертым, пятым, шестым или седьмым ас
- 3 009607 пектом изобретения также могут использоваться для получения лекарственного средства для лечения таких заболеваний.
В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у человека, предусматривающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или уровня активности полипептида первого аспекта настоящего изобретения в ткани этого пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют ίπ νίίτο. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем регрессии заболевания.
Предпочтительный способ определения полипептидов по первому аспекту настоящего изобретения предусматривает стадии (а) контактирования лиганда шестого аспекта настоящего изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лигандполипептид; и (Ь) определения указанного комплекса.
Что касается девятого аспекта настоящего изобретения, то специалисту известно, что для определения патологических уровней белка существуют различные методы, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа точечной мутации, методы амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы, в которых используются антитела. Аналогичные методы могут быть использованы в течение коротких или продолжительных промежутков времени, что позволяет контролировать лечение заболевания у пациента. Настоящее изобретение также относится к набору, который может быть использован в указанных методах диагностики заболевания.
Предпочтительно заболевание, диагностированное способом в соответствии с девятым аспектом изобретения, представляет собой заболевание, в которое вовлечен ΤΝΕ-подобный секретируемый белок, как описано выше.
В десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида первого аспекта настоящего изобретения в качестве ΤΝΤ-подобного секретируемого белка.
В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид первого аспекта настоящего изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или вектор четвертого аспекта настоящего изобретения, или клетку-хозяина пятого аспекта настоящего изобретения, или лиганд шестого аспекта настоящего изобретения, или соединение седьмого аспекта настоящего изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
В двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к клетке-хозяину пятого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду шестого аспекта настоящего изобретения, или к соединению седьмого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для получения лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний.
Предпочтительно такое заболевание представляет собой заболевание, в которое вовлечен ΤΝΤподобный секретируемый белок, как описано выше.
В тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида первого аспекта настоящего изобретения или молекулы нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или вектора четвертого аспекта настоящего изобретения, или клетки-хозяина пятого аспекта настоящего изобретения, или лиганда шестого аспекта настоящего изобретения, или соединения седьмого аспекта настоящего изобретения.
Для заболеваний, при которых у пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или при которых активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения ниже, чем уровень экспрессии или активность у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, клетка-хозяин, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И наоборот, для заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или при которых активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, клетка-хозяин, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.
Предпочтительно такое заболевание представляет собой заболевание, в которое вовлечен ΤΝΤподобный секретируемый белок, как описано выше.
- 4 009607
В четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным или нокаутированным по этому полипептиду животным, которые не являются человеком и которые были трансформированы с тем, чтобы экспрессировать более высокие или более низкие уровни или вообще не экспрессировать полипептид первого аспекта настоящего изобретения. Такие трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний и могут быть также использованы в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые могут использоваться для лечения или диагностики такого заболевания.
Краткое описание стандартных способов и методик, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, приводится ниже. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными способами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.
В данном описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.
Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области.
Более полное описание таких методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящие описания, которые могут быть использованы для консультации, приводятся в следующих работах: Мо1еси1аг С1ошид; А ЬаЬога1огу Мапиа1, ТЫгб ЕбШои (8атЬгоок еб. 2001); ΌΝΑ С1ошид, Уокцпсх I аиб II (Ό.Ν. С1оуег еб. 1985); Обдоиискоббе 8уи1Ьек1к (М.1. Саб еб. 1984); М.1с1с1с Ас1б НуЬпб|/абоп (Β.Ό. Натек & 8.1. Шддтк ебк. 1984); Тгаикспрбои аиб ТгаиДабои (Β.Ό. Натек & 8.1. Н|ддб1к ебк. 1984); Ап1та1 Се11 Сибиге (Κ.Ι. Бгекбиеу еб. 1986); 1ттоЫНхеб Се11к аиб Еи/утек (1КБ Ргекк, 1986); Β. РегЬа1, А Ргасбса1 Сшбе 1о Мо1еси1аг С1ошид (1984); 1бе Ме!бобк ш Еи/ушо^ду кепек (Асабетю Ргекк, 1ис.), екрес1а11у уо1итек 154 & 155; Сеие ТгаикГег Уес!огк Гог Маттабаи Се11к (1.Н. М111ег аиб М.Р. Са1ок ебк. 1987, Со1б 8рпид НагЬог ЬаЬога!огу); 1ттииосбет1са1 Мейобк ш Се11 аиб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег аиб \Уа1кег. ебк. 1987, Асабетю Ргекк, Ьоибои); 8сорек, (1987) Рго!ет Рипбсабои: Рпис1р1ек аиб Ргасбсе, 8есоиб Еббюи (8рпидег Уег1ад, Ν.Υ.) и НаибЬоок оГ Ехрептеи1а1 1ттиио1оду, Уо1итек Ι-ΐν (Э.М. Аеб аиб С.С. В1аск\уе11 ебк. 1986).
Используемый термин полипептид включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, то есть пептидными изостерами. Этот термин относится к коротким цепям (пептидам или полипептидам) и к более длинным цепям (белкам).
Полипептид по настоящему изобретению может присутствовать в форме зрелого белка либо он может присутствовать в виде пре-, про- или препробелка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препрочасти этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах пре-, про- или препропоследовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности.
Полипептид первого аспекта настоящего изобретения может образовывать часть гибридного белка. Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или более дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, пропоследовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, например к соединению, увеличивающему время полужизни полипептида (например, к полиэтиленгликолю).
Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации, хорошо известных в данной области. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах по настоящему изобретению, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и АЭР-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование СР1якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг,
- 5 009607 фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредованное транспортной РНК, такое как аргинилирование и убихитинизация.
Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы. Действительно, блокирование амино- или карбоксиконца в полипептиде либо того и другого посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах по настоящему изобретению.
В большинстве случаев модификации, которые присутствуют в полипептиде, будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептида, который получен рекомбинантным методом, природа и степень модификации, по большей части, будет определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, картины гликозилирования могут варьироваться у различных типов клеток-хозяина.
Полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, полученные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, полученные с использованием комбинации этих методов.
Функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептиду ΙΝ8Ρ058. Два полипептида могут быть определены термином гомологичные, если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин идентичность означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин сходство означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко определена (Сотри1а11опа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк, А.М., еб., ОхГогб ишуеткйу Ргекк, Νο\ν Уотк, 1988; Βίοсотрийпд. 1пГоттабс8 апб Сепоте Рго.)ес1к, 8тйй, Ό/Ψ., еб. Асабетю Ргекк, №\ν Уотк, 1993; Сотри1ет Апа1ук1к оГ 8ес.|иепсе Оа1а, Рай 1, СпГГт, А.М., апб СпГГт, Н.С., ебк., Нитапа Ргекк, №\ν 1еткеу, 1994; 8есщепсе Апа1ущк ш Мо1еси1аг Вю1оду, уоп Не1н)е, С., Асабетю Ргекк, 1987 и 8ес.|иепсе Апа1ук1к Рптет, СпЬккоу, М. апб Пеуетеих, 1., ебк., М 81оск1оп Ргекк, №\ν Уотк, 1991).
Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых они происходят), и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептида Ш8Р058. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между А1а, Уа1, Ьеи и 11е; между 8ет и Т1тг; между кислотными остатками Акр и С1и; между Акп и С1п; между основными остатками Ьук и Агд или между ароматическими остатками Р1е и Туг. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, т.е. от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Наиболее предпочтительными являются молчащие замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Особенно предпочтительными также являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков включают группузаместитель.
Обычно считается, что два полипептида, имеющие более чем 30% идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения имели степень идентичности последовательности полипептида Ш8Р058 или его активных фрагментов, составляющую более 80%. Более предпочтительными являются полипептиды по настоящему изобретению, имеющие степень идентичности к полипептиду Ш8Р058 более чем 85, 90, 95, 98 или 99% соответственно.
Функционально эквивалентными полипептидами первого аспекта настоящего изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или более методов сопоставления структур. Так, например, для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности полипептидам Ш8Р058, делается предположение, что они обладают функцией ΤΝΡ-подобного секретируемого белка, где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностями полипептида Ш8Р058, может быть использована технология информационной обработки потока данных для генома Дпрйаттабса Сепоте Тйтеабет), которая составляет один из аспектов методов поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Вюрепбшт (см. совместно рассматриваемую заявку на международный патент РСТ/СВ 01/01105). Термин значительная структурная гомология означает, что технология
- 6 009607
1прйагта11са Сепоте Тйтеайег позволяет предсказать с достоверностью 10% и выше, что два белка имеют структурную гомологию.
Полипептиды первого аспекта настоящего изобретения также включают фрагменты полипептида ΙΝ8Ρ058 и фрагменты функциональных эквивалентов полипептида ΙΝ8Ρ058 при условии, что эти фрагменты сохраняют функцию ΤΝΡ-подобного секретируемого белка либо они имеют антигенную детерминанту, общую с полипептидом ΙΝ8Ρ058.
Используемый здесь термин фрагмент означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей, аминокислотной последовательности полипептида ΙΝ8Ρ058 либо одному из их функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать по крайней мере п смежных аминокислот последовательности и в зависимости от конкретной последовательности п предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.
Фрагменты полноразмерного полипептида ΙΝ8Ρ058 могут состоять из комбинаций 1 или более соседних последовательностей экзонов или комбинаций частичных последовательностей экзонов. Например, такие комбинации могут включать экзоны 1, 2 и частичную последовательность экзона 3 из полипептида ΙΝ8Ρ058, как в случае с ΙΝ8Ρ0588ν.
Указанные фрагменты могут присутствовать в свободной форме, т.е. не являться частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент по настоящему изобретению входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. При этом в состав одного более крупного полипептида могут входить несколько фрагментов.
Полипептиды по настоящему изобретению или их иммуногенные фрагменты (содержащие по крайней мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды по настоящему изобретению, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для специалиста, такие антитела, помимо других применений, могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств.
Термин иммуноспецифический означает, что антитела имеют, в основном, более высокую аффинность к полипептидам по настоящему изобретению, чем к другим родственным полипептидам известного уровня. Используемый здесь термин антитело означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как ЕаЬ, Е(аЬ')2 и Εν, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения.
Под в основном, более высокой аффинностью понимается, что есть измеримое увеличение аффинности для полипептида изобретения по сравнению с аффинностью для известных рецепторов клеточной поверхности.
Предпочтительно аффинность в 1,5, 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105 или 106 раз выше для полипептида по настоящему изобретению, чем для известных полипептидов рецепторов клеточной поверхности.
Если желательно использовать поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизировано полипептидом первого аспекта настоящего изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Затем связанный полипептид может быть использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например иммуноаффинной хроматографией.
Моноклональные антитела против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения могут быть легко продуцированы специалистом. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной техники хорошо известна в данной области (см., например, КоЫег С. & М1181еш, С. №11иге 256:495-497 (1975); КохЬог е! а1., Иптипо^ду Тойау 4:72 (1983); Со1е е! а1., 77-96, Мопос1опа1 ЛпИЬой1е8 апй Сапсег Тйегару, А1ап К. Ьщк, Мс. (1985).
Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, то есть на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридов, например, методами ПЦР, известными в данной области, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.
- 7 009607
Могут быть также использованы химерные антитела, в которых нечеловеческие вариабельные области соединены или лигированы с человеческими константными областями (см., например, Ьш с! а1., Ргос. Иа!1. Асаб. 8сг И8А, 84, 3439 (1987)).
Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например путем их гуманизации, см., 1опск с! а1., Иа!игс, 321, 522 (1986); Усгйосусп с! а1., 8с1епсе, 239, 1534 (1988); ЯаЬа! с! а1., 1. 1ттипо1, 147, 1709 (1991); Онсеп с! а1., Ргос. Иа!1. Асаб. 8с1. И8А, 86, 10029 (1989); Осгтап с! а1., Ргос. Иа!1 Асаб. 8сг И8А, 88, 34181 (1991); апб Нобдкоп с! а1., Вю/Тссйпо1оду, 9, 421 (1991)). Используемый здесь термин гуманизованное антитело означает молекулы антитела, в которых аминокислоты СЭЯ и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но при этом оно обладает способностью связываться с донорным антителом.
В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть биспецифическое антитело, т.е. антитело, имеющее два различных антигенсвязывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.
Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами по настоящему изобретению, либо из набора ПЦР-амплифицированных У-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки необученных лимфоцитов, может быть использована техника фагового представления (МсСайебу 1. с! а1. (1990), ИаШгс 348, 552-554; Магкк 1. с! а1., (1992) Вю!ссйпо1оду 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также увеличена путем перестановки цепей (С1асккоп Т. с! а1. (1991) Иа!игс 352, 624-628).
Антитела, генерированные описанными выше методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, т.е. они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ЕЫ8А). Для этих целей антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.
Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидную последовательность, представленную в 8ЕО Ш N0:8, и функционально эквивалентные полипептиды. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и для целей, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению предпочтительно содержат по крайней мере п смежных нуклеотидов в описываемых последовательностях, и в зависимости от конкретной последовательности п предпочтительно равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также включают последовательности, комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов).
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделение из геномных или кДНК-библиотек или выделение из микроорганизма. РНК-молекулы могут быть, в основном, генерированы путем ш νίΙΐΌ- или ш ушо-транскрипции ДНК-последовательностей.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью.
Термин молекула нуклеиновой кислоты также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (РИА). Используемый здесь термин РИА означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий по крайней мере из пяти нуклеотидов и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые предпочтительно заканчиваются лизином. Концевой лизин придает данной композиции растворимость. РИА могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они предпочтительно связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и приостанавливают элонгацию транскрипта (ИШкеп Р.Е. с! а1. (1993) Апбсапссг Эгид Эек. 8:53-63).
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид 8ЕО Ш И0:8, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕО Ш И0:7.
Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые вследствие вырожденности генетического кода кодируют полипептид 8ЕО Ш И0:8. Такими молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, но не ограничиваются ими, кодирующая последовательность для отдельного зрелого полипептида; кодирующая последовательность для зрелого полипептида вместе с другими кодирующими последовательностями, такими как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препрополипептидную последовательность; кодирующая после
- 8 009607 довательность зрелого полипептида с приведенными выше дополнительными кодирующими последовательностями или без них либо вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и З'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации) и в связывании с рибосомой и обеспечивают стабильность мРНК. Молекулы нуклеиновой кислоты могут также включать вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами.
Молекулы нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов первого аспекта настоящего изобретения. Такая молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо указанной молекулой может быть вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты, к клеткам или к организмам.
Из рассматриваемых вариантов можно отметить варианты, которые отличаются от приведенных выше молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Замены, делеции или инсерции могут быть осуществлены по отношению к одному или более нуклеотидам. Варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям.
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть также сконструированы методами, в основном, известными в данной области, включая в зависимости от различных целей модификацию клонирования, процессинга и/или экспрессии генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки с помощью ПЦР генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т. п.
Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид первого аспекта настоящего изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным экспрессировать гибридный белок, который будет распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован таким образом, чтобы он содержал сайт расщепления, расположенный между последовательностью полипептида по настоящему изобретению и последовательностью гетерологичного белка и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из гетерологичного белка.
Молекулами нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть также антисмысловые молекулы, которые являются частично комплементарными молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды по настоящему изобретению, и поэтому они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (в результате гибридизации). Антисмысловые молекулы, такие как олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по настоящему изобретению, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и предупреждали ее транскрипцию в соответствии с методами, хорошо известными специалистам (см., например, СоЬеп Г8., Тгепйк ίη Рйагт. 8ск, 10, 435 (1989), Окапо, 1. ИеигосЬет. 56, 560 (1991); О'Соппог, 1. ЫеигосЬет 56, 560 (1991); Ьее е! а1., Иискю Ас1й§ Век 6, 3073 (1979); Соопеу е! а1., 8с1епсе 241, 456 (1988); Пегуап е! а1., 8Депсе 251, 1360 (1991).
Используемый здесь термин гибридизация означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно, одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем две молекулы могут контактировать друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или ВЬОТТО); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (8атЬгоок е! а1., [см. выше]).
Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного в данной области (8атЬгоок е! а1., [см.выше]). В основном, гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных ус
- 9 009607 ловиях жесткости, как описано у \Уай1 С.М. и 8.Ь. Вегдег (1987; Ме1йой§ Епхуто! 152:399-407) и К1тте1 А.Р. (1987; Ме1йой§ Епгуто1. 152:507-511).
Термин жесткость означает условия реакции гибридизации, которые способствуют ассоциации наиболее сходных молекул, но не ассоциации молекул, не обладающих таким сходством. Условия гибридизации высокой жесткости определены как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х88С (150 мМ ЫаС1, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5Х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х88С приблизительно при 65°С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35°С (8атЬгоок е! а1. [см.выше]). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости.
В предпочтительных вариантах этого аспекта настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по крайней мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ΙΝ8Ρ058 (8ЕО ΙΌ N0:8), и к молекулам нуклеиновой кислоты, которые, в основном, комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты настоящего варианта осуществления. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая по всей своей длине была по крайней мере на 97% идентична молекулам таких кодирующих последовательностей или представляла собой молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную этой последовательности. При этом предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по крайней мере на 98%, более предпочтительно по крайней мере на 99% или более идентичными указанным последовательностям. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают, в основном, такой же биологической функцией или активностью, что и полипептид ΙΝ8Ρ058.
Настоящее изобретение относится к способу определения молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, включающему стадии (а) контактирования нуклеинового зонда по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и (Ь) определения любого такого образованного дуплекса.
Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептид ΙΝ8Ρ058, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими этот полипептид.
В этой связи, наряду с другими известными методами, могут быть использованы описанные и обсуждаемые методы, которые приводятся ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны и, в основном, доступны в данной области, и могут быть реально использованы для осуществления многих вариантов настоящего изобретения, обсуждаемых в настоящей заявке. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Ι, секвеназа (И8 Вюсйетка1 Согр., С1еге1апй. ОН), полимераза Тас.| (Регкш Е1тег), термостабильная полимераза Т7 (Атегайат, СЫсадо, 1Ь) или комбинация таких полимераз и корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы, присутствующие в ΕΕΟΝΟΑ8Ε Атрййсайоп 8ух1ет и поставляемые С1Ьсо/ВКЕ (СаййегкЬигд, МО). Способ секвенирования может быть предпочтительно автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат НатШоп Мюго ЬаЬ 2200 (НатШоп, Репо, Νν), термоячейка РеШег Тйегта1 Сус1ег (РТС200; М1 Кекеагсй, ^а1ейотеп, МА), катализатор ΑΒΙ и ДНК-секвенаторы 373 и 377 (Регкш Е1тег).
Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией, эквивалентной функции полипептида ΙΝ8Ρ058, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом с использованием стандартных методик, известных в данной области (см., например, Сиггеп! Гю^сой ш Мо1еси1аг Вю1оду, Аи§цЬе1 е! а1., (ей§). Сгеепе ΡιιΝί8θιίι·ΐ8 А88ос1а1е8 апй \Уйеу Шегашепсе, №\ν Уогк, 1989, 1992). Особенно подходящими являются зонды, содержащие 15, предпочтительно по крайней мере 30, более предпочтительно по крайней мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящей от соответствующего кодирующего гена (8ЕО ΙΌ Ν0:7). Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондов специалист может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес белки, происходящие от различных источников, например человека, млекопитающего или других животных, и скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей, например отдельных членов семейства, типа и/или подтипа.
- 10 009607
Во многих случаях выделенные кДНК-последовательности будут неполными, т.е. в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет обрезана, обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных в данной области методов определения расположенных выше последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Так, например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (ВАСЕ; см., например, Егойтап е! а1., ΡΝΑ8 И8А 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии, проиллюстрированные Мага!йоп™ (С1оп!есй ЬаЬога!опек 1пс.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется сайт-рестрикционной ПЦР и предусматривает использование универсальных праймеров (8агкаг С. (1993) РСВ Ме!йобк Аррйс. 2:318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть также использована обратная ПЦР (Тпдйа Т. е! а1. (1988), М1с1е1с Ас1бк Век. 16:8186). Другим методом, который может быть использован в данном случае, является ПЦР с захватом, которая представляет собой ПЦР-амплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (йадегкЕот М. е! а1. (1991), РСВ Мебюбк Аррйс. 1, 111119). Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей, является метод Рагкег Ι.Ό. е! а1. (1991), ШсШс Ас1бк Век. 19:3055-3060). Кроме того, можно использовать ПЦР, гнездовые праймеры и библиотеки Ргото!егЕшбег™ для прогулки по геномной ДНК (С1оп!есй, Ра1о А1!о, СА). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон.
При скрининге на полноразмерные кДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности, содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека ойдо-б(Т) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'-нетранскрибированных регуляторных областей.
В одном из вариантов осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок, либо она может быть гибридизована с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важным звеном в подтверждении корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности с определением ее точной локализации физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе V. МсКикюк, Мепбейап 1пйеп!апсе ίη Мап (имеющейся в настоящее время в 1ойп Норктк Ишуегкйу \Уе1сй Мебюа1 Ь1Ьгагу). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или другими методами обнаружения генов. После предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома, любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах, которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть также использована для определения различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т.п., у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов с заболеванием.
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детекции мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации 1п кйи и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволили получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу.
- 11 009607
Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид по настоящему изобретению, могут быть также использованы методы отключения гена. Одним из методов, который может быть использован для отключения последовательность-специфического посттрансляционного гена, является интерференция РНК (ΚΝΆί) (Е1Ьа§Ыг 8.М. е! а1., №11игс 2001, 411, 494-498). Короткие дцРНКолигонуклеотиды синтезируют ίη νίΐΓο и вводят в клетку. Последовательность-специфическое связывание дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии целевого белка.
Эффективность методов отключения гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга) и на РНК-уровне - с помощью методики, основанной на ΤαςΜαη.
Векторы по настоящему изобретению содержат молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы.
Клетки-хозяева по настоящему изобретению, которые могут быть трансформированы, трансфецированы или трансдуцированы векторами по настоящему изобретению, могут представлять собой прокариотические или эукариотические клетки-хозяева.
Полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам, и многие из них подробно описаны у 8атЬгоок е! а1. (см. выше) и Регпапбе/ & НосГПсг (1993, сШ. Оепе ехргекыоп хуйепъ. ибпд па1иге Гог 111е ай оГ ехргеккюп. Лсабетк Рге§8, 8ап О|едо. Ьопбоп, Войоп. Νον Уогк, 8убпеу. Τοкуо, ^гоШо).
Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы, в основном, любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессионную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у 8атЬгоок е! а1. (см. выше). В общих чертах, кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях) и, необязательно, оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине.
Примерами подходящих систем экспрессии являются, например, хромосомная, эписомная и вирусные системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага, транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирус, паповавирусы, такие как 8У40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, псевдорабивирусы и ретровирусы или их комбинации, такие как векторы, происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть также использованы искусственные человеческие хромосомы (НАС).
Особенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНКэкспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом мозаики табака, !МУ) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Τι или рВВ322); или клеточные системы животных. Для продуцирования полипептидов по настоящему изобретению могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции.
Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид по настоящему изобретению, в клетки-хозяева может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство Οηνίδ е! а1., Вабс МеШоШ ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и 8атЬгоок е! а1. [см. выше]. Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная ΌΕΆΕ-декстраном; трасфекция; микроинжекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (см., 8атЬгоок е! а1., 1989, [см. выше], Лн5иЬе1 е! а1. [см. выше], 8рес!ог, Со1бтап & Ьет-етаМ, 1998). В эукариотических клетках экспрессионные системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интеграция).
Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид, или лидерную последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду, либо они могут быть
- 12 009607 гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге.
Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и З'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьировать по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Так, например, для клонирования в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор 1ас2 фагмиды В1ие8спр1 (81га1адепе, Ьа1о11а, СА) или плазмиды р8рогй™ (01Ьсо ВКБ) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, КПВ18СО и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей), могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности, то могут быть использованы векторы на основе 8У40 или ЕВУ с соответствующим селективным маркером.
Экспрессирующий вектор конструируют так, чтобы конкретная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты присутствовала в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями, и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регуляторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под контролем регуляторных последовательностей, то есть так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой у регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в соответствующей ориентации, т. е. с сохранением рамки считывания.
Регуляторные последовательности и другие контрольные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт.
Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида предпочтительной является стабильная экспрессия. Так, например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векторе. После введения этого вектора клетки можно оставить на 1-2 дня для роста в обогащенной среде, которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности, используемой в целях отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки, успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток такого типа.
Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек детенышей хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (СО8), клетки С127, клетки ЗТЗ, клетки ВНК, клетки НЕК 293, клетки меланомы Боуэса, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер С2) и ряд других клеточных линий.
В бакуловирусной системе материалы для получения экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, 1п1ег айа, от 1пуйгодеп, 8ап Э|едо СА (набор МахВас). В общих чертах, эти методы известны специалистам и подробно описаны у 8иштег8 & 8шйй, Техак Адпси11ша1 Ехрейшеп! 81айоп Вцйейп № 1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клетки Эго5ор1н1а 82 и клетки 8робор1ега 8£9.
- 1З 009607
В данной области известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в И8 5693506, И8 5659122 и И8 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны 2епк, РкуЮскетМгу 30:3861-3863 (1991).
В частности, могут быть использованы любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты, и из этих протопластов могут быть затем генерированы целые регенерированные растения, содержащие перенесенный ген. В частности, из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы все растения, включая, но не ограничиваясь ими, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых и овощных растений.
Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, Е.со11, 81гер1отусе5 и ВасШик киЫШк.
Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например, 8. сегеуЩае) и клетки АкрегдШик.
Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны в данной области. Примерами являются гены тимидинкиназы (^1§1ег М. е! а1., (1977), Се11 11:223-32) и аденин-фосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Ьо^у I. е! а1., (1980), Се11 22:817-23), которые могут быть использованы в 1к- или аргк -клетках соответственно.
Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΡΒ). который придает резистентность к метотрексату (^1§1ег М. е! а1., (1980), Ргос. №И. Асаб. 8сЕ 77:3567-70); ген прЕ, который придает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к 6-418 (Со1Ьеге-6агарт Р. е! а1., (1981), 1. Мо1. Вю1. 150:1-14), и гены а1к или раЕ, которые придают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицинацетилтрансферазе соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам.
Хотя присутствие или отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что присутствует также и нужный ген, однако, его присутствие и экспрессия еще нуждаются в подтверждении. Так, например, если соответствующая последовательность была встроена в последовательность маркерного гена, то трансформированные клетки, содержащие соответствующие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может находиться в тандеме с последовательностью, кодирующей полипептид по настоящему изобретению, находящийся под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индуцирование или отбор обычно указывает также на экспрессию тандемного гена.
Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по настоящему изобретению, и которые экспрессируют указанный полипептид, могут быть идентифицированы различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизация и биоанализы на присутствие белка, например, сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (РАС8) или иммуноанализы (такие как твердофазный иммуноферментный анализ [ЕБ18А] и радиоиммуноанализ [РИА]), которые предусматривают использование мембран, растворов или чипов для детекции и/или количественной оценки нуклеиновой кислоты или белка (см. НатрЮп В. е! а1., (1990), 8его1одюа1 МеЕйобк, а ЬаЬогаЕогу Мапиа1, АР8 Ргекк, 81 Раи1, МН и Маббох ^.Е. е1 а1., (1983), I. Ехр. Меб. 158, 1211-1216).
Существует широкий ряд методов мечения и конъюгирования, известных специалистам, и эти методы могут быть использованы в различных анализах на присутствие нуклеиновых кислот и аминокислот. Методами, используемыми в целях продуцирования меченых зондов для гибридизации или ПЦРзондов для определения последовательностей, родственных молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды по настоящему изобретению, являются мечение олигонуклеотидами, ник-трансляция, мечение по концам или ПЦР-амплификация с использованием меченого полинуклеотида. Альтернативно, последовательности, кодирующие полипептид по настоящему изобретению, могут быть клонированы в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов ίπ νίΐΐΌ путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или 8Р6, и меченых нуклеотидов. Эти методики могут быть осуществлены с использованием различных коммерчески доступных наборов (Ркагтааа & Цр)от (Как-ипа/оо, М1); Рготеда (Маббоп XVI) и и.8. Вюсйетюа1 Согр., С^е1апб, ОН)).
Подходящими репортерными молекулами или метками, которые могут быть использованы для облегчения определения, являются радионуклиды, ферменты и флуоресцентные, хемилюминисцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть также использованы для генерирования трансгенных животных, в частности грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект настоящего изобретения. Такое генерирование может быть осуществлено путем локальной модификации соматических клеток или манипуляций с зародышевыми линиями для введения наследуемых модификаций. Такие трансгенные животные могут быть, в частности, использованы для
- 14 009607 генерирования животных-моделей в целях поиска молекул лекарственных средств, которые являются эффективными в качестве модуляторов полипептидов по настоящему изобретению.
Полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатитах и хроматографию на лектине. Для очистки наиболее подходящей является высокоэффективная жидкостная хроматография. В случае, если данный полипептид был денатурирован в процессе выделения или очистки, то для восстановления активной конформации может быть использована хорошо известная техника рефолдинга белков.
Если необходимо, то для облегчения очистки белков могут быть также использованы специальные векторные конструкции, полученные путем присоединения последовательностей, кодирующих полипептиды по настоящему изобретению, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который облегчает очистку растворимых белков. Примерами таких доменов, облегчающих очистку белков, являются пептиды, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как гистидинтриптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах; домены белка А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе ЕЬА68 удлинение/аффинная очистка (1ттипех Согр., 8са111с. \УЛ). Для облегчения очистки между доменом для очистки и полипептидом по настоящему изобретению могут быть включены расщепляемые линкерные последовательности, такие как последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе (1пуйгодеп, 8ап П1едо, СА). Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию гибридного белка, содержащего полипептид по настоящему изобретению, присоединенный к нескольким гистидиновым остаткам, за которыми следуют тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают проведение очистки с помощью 1МАС (аффинной хроматографии на иммобилозованном ионе металла, описанной РогаШ 1. е! а1., (1992), Рго1. Ехр. РцпГ. 3:263-281), тогда как тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы позволяют выделять полипептид из гибридного белка. Обсуждение векторов, содержащих гибридные белки, можно найти у Кго11 Ό.Ι. е! а1., (1993; ΌΝΑ Се11 Бю1. 12:441-453).
Если экспрессируемый полипептид используется в аналитическом скрининге, то обычно предпочтительно, чтобы он был продуцирован на поверхности клетки-хозяина, в которой он экспрессируется. В этом случае клетки-хозяева могут быть собраны до их использования в скрининг-анализе, например, таким методом, как сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (ГАС8) или иммуноаффинным методом. Если полипептид секретируется в среду, то такая среда может быть восстановлена для выделения и очистки экспрессированного полипептида. Если полипептид продуцируется внутри клетки, то перед выделением полипептида клетки должны быть сначала подвергнуты лизису.
Полипептид по настоящему изобретению может быть использован для скрининга библиотек соединений в любом из известных методов, применяемых для скрининга лекарственных средств. Такие соединения могут стимулировать (служить агонистами) или ингибировать (служить антагонистами) уровень экспрессии гена или активность полипептида по настоящему изобретению, и поэтому они составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Предпочтительными соединениями являются соединения, способные влиять на экспрессию природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или регулировать активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения.
Соединения-агонисты или соединения-антагонисты могут быть выделены, например, из клеток, бесклеточных препаратов, химических библиотек или смесей природных продуктов. Такими агонистами или антагонистами могут быть природные или модифицированные субстраты, лиганды, ферменты, рецепторы либо структурные или функциональные миметики. Подходящее описание таких методов скрининга можно найти в работе Сойдап е! а1., Сштеп! Рго1осо1§ ш 1ттипо1оду 1(2):Сйар1ег 5 (1991).
Соединения, которые могут рассматриваться как наиболее вероятные кандидаты на хорошие антагонисты, представляют собой молекулы, которые связываются с полипептидом по настоящему изобретению, но не индуцируют каких-либо биологических эффектов полипептида после связывания с ним. Потенциальными антагонистами являются небольшие органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полипептидом по настоящему изобретению и, тем самым, ингибируют или подавляют его активность. Таким образом, связывание полипептида с нормальными связывающимися клеточными молекулами может ингибироваться так, чтобы подавлялась нормальная биологическая активность полипептида.
Полипептид по настоящему изобретению, который используется в таком методе скрининга, может находиться в растворе в свободном состоянии, может быть иммобилизован на твердом носителе, может присутствовать на клеточной поверхности, либо он может быть локализован внутри клетки. В основном такие методики скрининга предусматривают использование соответствующих клеток или клеточных мембран, экспрессирующих полипептид, который контактирует с тестируемым соединением, что приводит к связыванию либо к стимуляции или ингибированию функционального ответа. Функциональный
- 15 009607 ответ клеток, контактируемых с тестируемым соединением, сравнивают с контрольными клетками, которые не контактировали с тестируемым соединением. С помощью подходящей системы детекции такой анализ позволяет определить, может ли тестируемое соединение давать сигнал, генерируемый активацией указанного полипептида. Ингибиторы активации обычно анализируют в присутствии известного агониста и оценивают влияние этого агониста на активацию в присутствие тестируемого соединения.
Предпочтительный способ идентификации соединения-агониста или соединения-антагониста по отношению к полипептиду по настоящему изобретению включает:
(a) контактирование клетки, экспрессирующей на клеточной поверхности полипептид первого аспекта настоящего изобретения, который ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, и при этом соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и (b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом либо его активации или ингибирования путем измерения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с полипептидом.
Еще более предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста по отношению к полипептиду по настоящему изобретению включает:
(a) контактирование клетки, экспрессирующей на клеточной поверхности полипептид, который ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, и при этом соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом; и (b) определение события связывания соединения с полипептидом либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия соединения с полипептидом, с уровнем сигнала, полученного в отсутствии указанного соединения.
В других предпочтительных вариантах изобретения общие методы, описанные выше, могут дополнительно включать осуществление идентификации агониста или антагониста в присутствии меченого или немеченого лиганда для полипептида.
В другом варианте изобретения способ идентификации агониста или антагониста полипептида по настоящему изобретению включает определение факта ингибирования связывания лиганда с клетками, которые содержат полипептид по настоящему изобретению на своей поверхности, или с клеточными мембранами, содержащими такой полипептид, в присутствии соединения-кандидата в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом, и определение количества лиганда, связанного с полипептидом. Считается, что соединение, способное приводить к снижению уровня связывания с лигандом, является агонистсм или антагонистом. При этом предпочтительно, чтобы указанный лиганд был меченым.
Более конкретно, способ скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом к полипептиду, включает стадии:
(a) инкубирования меченого лиганда с целой клеткой, экспрессирующей полипептид по настоящему изобретению на клеточной поверхности, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид по настоящему изобретению;
(b) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной;
(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведение этой смеси до состояния равновесия;
(б) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и (е) сравнения различия в количествах связанного меченого лиганда стадий (Ь) и (б), где соединение, вызывающее снижение уровня связывания в стадии (б), считается агонистом или антагонистом.
В некоторых описанных выше вариантах изобретения могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения к поверхности, несущей данный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, или с помощью анализа на конкуренцию с меченым соединением-конкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, указанные антитела могут быть использованы для определения на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с указанным полипептидом.
Альтернативно, если версия дикого типа полипептида по настоящему изобретению (ΙΝδΡ058) в природе в норме связывается с рецептором, то в другом аспекте изобретения полипептид по настоящему изобретению может быть антагонистом версии дикого типа полипептида. Считается, что примером такого полипептида является ΙΝδΡ058δν. В этом аспекте изобретения полипептид по настоящему изобретению может конкурировать с полипептидом ΙΝδΡ058 за один и тот же сайт связывания на рецепторе. Полипептид ΙΝδΡ058δν не стимулировал бы рецептор таким образом, чтобы нормальное биологическое действие не было бы индуцировано. Следовательно, полипептид по настоящему изобретению является
- 16 009607 конкурентным ингибитором природного полипептида. Предпочтительно конкурентный ингибитор в соответствии с данным аспектом изобретения содержит аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ Ν0:10 или δΕΟ ΙΌ Ν0:16, или состоит из нее. Способы, описанные выше для скрининга антагонистов, могут быть легко адаптированы специалистом в данной области для скрининга на конкурентные ингибиторы.
Могут быть также разработаны анализы для определения влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей полипептид, в клетках. Так, например, анализ ΕΌΙδΑ может быть разработан так, чтобы можно было измерить секретированные или клеточноассоциированные уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами, известными в данной области, и этот анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом модифицированных клеток или тканей. Затем может быть определен уровень образования связывающих комплексов между полипептидом и тестируемым соединением.
Аналитическими способами, которые также входят в объем настоящего изобретения, являются способы, предусматривающие использование генов и полипептидов по настоящему изобретению в анализах на сверхэкспрессию или в анализах на исключение. Такие анализы предусматривают манипуляцию с уровнями указанных генов/полипептидов в клетках и оценку влияния этой манипуляции на физиологию клеток, подвергнутых манипуляции. Так, например, такие эксперименты позволяют точно выявить пути передачи сигнала и метаболические пути, в которых участвуют конкретные гены/полипептиды, а также получить информацию относительно идентичности полипептидов, с которыми взаимодействуют исследуемые полипептиды, и найти ключ к разгадке механизмов, с помощью которых регулируются родственные гены и белки.
Другой метод, который может быть использован для скрининга на лекарственные средства, дает возможность осуществлять высокоэффективный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с нужным полипептидом (см. Международную патентную заявку \У0 84/03564). В этом методе большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом по настоящему изобретению и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование не нейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными в данной области. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в приведенных выше способах скрининга на лекарственные средства.
Полипептид по настоящему изобретению может быть использован для идентификации мембраноассоциированных или растворимых рецепторов с помощью стандартной техники связывания с рецептором, известной в данной области, такой как анализы на связывание и перекрестное сшивание с лигандом, в которых полипептид метят радиоактивным изотопом, химически модифицируют или присоединяют к пептидной последовательности, которая облегчает его детекцию или очистку, и инкубируют с источником предполагаемого рецептора (например, с композицией клеток, клеточными мембранами, клеточными супернатантами, тканевыми экстрактами или с физиологическими жидкостями). Эффективность связывания может быть определена биофизическими методами, такими как поверхностный плазменный резонанс (поставляемый В1асоге АВ, Ирр8а1а, δ\\Όώπι) и спектроскопия. Анализы на связывание могут быть использованы для очистки и клонирования рецептора, но они могут быть также использованы для идентификации агонистов и антагонистов полипептида, которые конкурируют с полипептидом за связывание с рецептором. Стандартные методы проведения скрининг-анализов хорошо известны в данной области.
Настоящее изобретение также относится к набору для скрининга, используемому в методах идентификации агонистов, антагонистов, лигандов, рецепторов, субстратов и ферментов, описанных выше.
Настоящее изобретение также относится к агонистам, антагонистам, лигандам, рецепторам, субстратам, ферментам и к другим соединениям, модулирующим активность или антигенность полипептида по настоящему изобретению в соответствии с описанными выше механизмами.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение по настоящему изобретению в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Эти композиции могут быть использованы в качестве терапевтических или диагностических реагентов в качестве вакцин или в качестве других иммуногенных композиций, подробно описанных ниже.
В соответствии с используемой здесь терминологией, композиция, содержащая полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение [X], считается в основном, не содержащей примесей [здесь, Υ], если по крайней мере 85 мас.% от всего количества Χ+Υ в данной композиции составляет X. Предпочтительно X составляет по крайней мере примерно 90% по общей массе Χ+Υ в данной композиции, более предпочтительно по крайней мере примерно 95, 98% или даже 99 мас.%.
Фармацевтические композиции предпочтительно должны содержать терапевтически эффективное количество полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, лиганда или соединения по настоящему изобретению. Используемый термин терапевтически эффективное количество означает количество тера
- 17 009607 певтического агента, необходимого для лечения, ослабления или профилактики рассматриваемого заболевания или состояния, или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Для каждого соединения терапевтически эффективная доза может быть сначала оценена либо в анализе клеточной культуры, например опухолевых клеток, либо на животных-моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. Животное-модель может быть также использовано для определения соответствующего интервала концентраций и способа введения. Такая информация может быть затем использована для определения подходящих доз и способов их введения человеку.
Точное эффективное количество соединения для введения индивидууму будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья индивидуума, возраста, массы и пола индивидуума, его режима питания и частоты введения лекарственного средства, а также от комбинации(й) лекарственных средств, чувствительности данного индивидуума на реакцию и его переносимость/восприимчивость к данной терапии. Такое количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и может быть установлено врачом-клиницистом. В общих чертах, эффективная доза может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 10 мг/кг. Композиции могут быть введены пациенту либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.
Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для введения терапевтического агента. Такими носителями являются антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические агенты, такие как липосомы, при условии, что этот носитель сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию, и что данный вводимый носитель не является чрезмерно токсичным. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.
Используемыми фармацевтически приемлемыми солями могут быть, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в РеттдЮп'х РйагтасеиИса1 8сюпсс5 (Маск РиЬ. Со., N.1. 1991).
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в указанных композициях могут присутствовать и вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т.п. С помощью таких носителей могут быть получены фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т. п., для перорального введения пациенту.
Композиции по настоящему изобретению после их приготовления могут быть непосредственно введены индивидууму. Индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные, в частности человек.
Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть введены различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедулярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное или чрескожное введение (см., например, \7О 98/20734), а также подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, кишечное, местное, подъязычное, интравагинальное или ректальное введение. Для введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению могут быть также использованы генные ружья или безыгольные шприцы. В основном, терапевтические композиции могут быть приготовлены в виде растворов для инъекций, либо в виде жидких растворов или суспензий, либо они могут быть получены в виде твердых форм, подходящих для получения растворов или суспензий в жидких носителях перед их введением путем инъекции.
Указанные композиции могут быть непосредственно доставлены, в основном, путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, либо они могут быть доставлены в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в пораженный участок. При этом лечение может быть проведено по схеме введения разовой дозы или дробных доз.
Если активность полипептида по настоящему изобретению превышает активность, требуемую для лечения конкретного патологического состояния, то в данном случае может быть рассмотрено несколько подходов. Один из таких подходов включает введение индивидууму вышеописанного соединенияингибитора (антагониста) вместе с фармацевтически приемлемым носителем, где указанный ингибитор вводят в количестве, эффективном для ингибирования функции полипептида, например блокирования связывания с лигандами, субстратами, ферментами или рецепторами либо ингибирования вторичного сигнала, и, тем самым, эффективном для ослабления симптомов аномального состояния. Такими антагонистами предпочтительно являются антитела. Для минимизации иммуногенности антител, описанных выше, наиболее предпочтительно, чтобы такие антитела были химерными и/или гуманизованными.
В соответствии с другим подходом могут быть введены растворимые формы полипептидов, которые сохраняют аффинность связывания с рассматриваемым лигандом, субстратом, ферментом или ре
- 18 009607 цептором. В основном, такой полипептид может быть введен в виде фрагментов, в которых сохраняются соответствующие части.
В альтернативном подходе экспрессия гена, кодирующего полипептид, может быть ингибирована методами блокирования экспрессии, такими как использование молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты (описанных выше), которые могут быть либо эндогенно генерированы, либо введены отдельно. Модификации экспрессии генов могут быть получены путем конструирования комплементарных последовательностей или антисмысловых молекул (ДНК, РНК или ΡΝΑ) для контролирующих элементов, 5'последовательностей или регуляторных последовательностей (сигнальной последовательности, промоторов, энхансеров и интронов) гена, кодирующего полипептид. Аналогичным образом, ингибирование может быть осуществлено с использованием методики спаривания оснований с образованием тройной спирали. Спаривание с образованием тройной спирали используется, исходя из того, что такое спаривание приводит к нарушению способности двойной спирали раскрываться так, чтобы это оказалось достаточным для связывания с полимеразой, факторами транскрипции или регуляторными молекулами. Успехи в клинической терапии, достигнутые за последнее время благодаря использованию ДНК-триплекса, были описаны в литературе (Сее РЕ. е! а1., (1994): НиЬег В.Е. & Β.Ι. Сагг, Мо1еси1аг апб 1ттипо1ощс Арргоасйек, Ри1ига РиЬйкЫпд Со., М1. К1ксо, ΝΥ). Комплементарная последовательность или антисмысловая молекула могут быть также сконструированы в целях блокирования трансляции мРНК посредством предотвращения связывания транскрипта с рибосомами. Такие олигонуклеотиды могут быть введены или генерированы ίη κίΐιι в результате экспрессии ίη у1уо.
Кроме того, экспрессия полипептида по настоящему изобретению может быть предотвращена с использованием рибозимов, специфичных к мРНК-последовательности, кодирующей этот полипептид. Рибозимы представляют собой каталитически активные РНК, которые могут быть природными или синтетическими (см., например, Иктап Ν. е! а1., Сигг. Ορίη. 81глс1. Вю1. (1996) 6(4), 527-33). Синтетические рибозимы могут быть сконструированы так, чтобы они специфически расщепляли мРНК в выбранных положениях и, тем самым, предотвращали трансляцию мРНК в функциональный полипептид. Рибозимы могут быть синтезированы с использованием природного рибозофосфатного остова и природных оснований, обычно присутствующих в РНК-молекулах. Альтернативно, рибозимы могут быть синтезированы с использованием неприродных остовов, например 2'-О-метил-РНК, в целях защиты от расщепления рибонуклеазой, и эти рибозимы могут содержать модифицированные основания.
РНК-молекулы могут быть модифицированы в целях увеличения внутриклеточной стабильности и времени полужизни. Возможными модификациями являются, но не ограничиваются ими, присоединение фланкирующих последовательностей у 5'- и/или у З'-концов молекулы или использование в указанном остове молекулы фосфортиоата или 2'-О-метила вместо фосфодиэстеразных связей. Эта концепция может рассматриваться и при продуцировании ΡΝΑ и может быть применена ко всем указанным молекулам посредством включения нетрадиционных оснований, таких как инозин, квеозин и бутозин, а также ацетил-, метил-, тио- и аналогичные модифицированные формы аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина, которые не могут легко распознаваться эндогенными эндонуклеазами.
Для лечения аномальных состояний, ассоциированных с недостаточной экспрессией полипептида по настоящему изобретению и его активностью, имеется несколько способов. Один из таких способов предусматривает введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения, которое активирует полипептид, т.е. соединение-агонист, описанное выше, в целях ослабления симптомов патологического состояния. Альтернативно, терапевтическое количество указанного полипептида в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем может быть введено в целях сохранения соответствующего физиологического равновесия данного полипептида.
Для осуществления эндогенного продуцирования у индивидуума данного полипептида соответствующими клетками может быть применена генотерапия. Генотерапию используют для перманентного лечения заболеваний, связанных с аномальным продуцированием полипептида, путем замены дефектного гена правильным терапевтическим геном.
Генотерапия по настоящему изобретению может быть осуществлена ίη у1уо или ех у1уо. Для генотерапии ех у1уо требуется выделение и очистка клеток, взятых у пациента, введение терапевтического гена и введение генетически модифицированных клеток обратно пациенту. В противоположность этому генотерапия ίη у1уо не требует выделения и очистки клеток пациента.
Для введения пациенту терапевтический ген обычно является упакованным. Носители для доставки генов могут быть невирусными, такими как липосомы, либо они могут представлять собой дефектные по репликации вирусы, такие как аденовирус, описанный Вегкпег К.Ь., Сигг. Тор. МюгоЬю1. Iттиηо1., 158, 39-66 (1992), или векторы на основе адено-ассоциированного вируса (ААУ), описанные Мпхусхка Ν. Сигг. Тор. МюгоЬюк ^тимк, 158, 97-129 (1992) и в патенте США № 5252479. Так, например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, может быть сконструирована для экспрессии в дефектном по репликации ретровирусном векторе. Затем эта экспрессионная конструкция может быть выделена и введена в упаковывающую клетку, трансдуцированную ретровирусным плазмидным вектором, содержащим РНК, кодирующую указанный полипептид, так чтобы указанная упаковывающая клетка продуцировала инфекционные вирусные частицы, содержащие
- 19 009607 нужный ген. Эти клетки-продуценты могут быть введены индивидууму для конструирования клеток ίη νίνο и экспрессии полипептида ίη νίνο (см. Сйар!ет 20 Сепе Тйетару апб о111ег Мо1еси1аг Сепейс-Ьакеб Тйетареийс Лрртоасйек (и цитируемые там ссылки), Нитап Мо1еси1аг Сепейск (1996), Т. δί^асйаη & Λ.Ρ.^;·ι6. ΒΙ0δ δс^еη(^Γ^с ΡιιΝίδΙκίΈ Пб.).
Другим способом является введение оголенной ДНК, где терапевтический ген непосредственно инъецируют в кровоток или в мышечную ткань.
В случае, когда полипептидами или молекулами нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению являются агенты, вызывающие заболевание, настоящее изобретение относится к их возможному применению в вакцинах для вырабатывания антител против указанного агента, вызывающего заболевания.
Вакцины по настоящему изобретению могут быть либо профилактическими (т.е. предназначенными для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е. предназначенными для лечения заболеваний после инфицирования). Такие вакцины содержат иммунизирующий(е) антиген(ы), иммуноген(ы), полипептид(ы), белок(ки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с описанными выше фармацевтически приемлемыми носителями, которыми может быть любой носитель, который сам по себе не индуцируют вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию. Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимуляторы (адъюванты). Кроме того, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид дифтерии, столбняка, холеры, Н. ру1оп и другие патогены.
Поскольку полипептиды могут разрушаться в желудке, то вакцины, содержащие полипептиды, предпочтительно вводят парентерально (например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или чрескожной инъекции). Композициями, подходящими для парентерального введения, являются водные и безводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, сообщающие данной композиции изотоничность с кровью реципиента, а также водные и безводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты или загустители.
Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут быть помещены в упаковки для разовых лекарственных форм или для дробных лекарственных форм. Так, например, эти лекарственные формы могут быть помещены в запаянные ампулы и сосуды и могут храниться в замороженном виде, в которые непосредственно перед их использованием необходимо лишь добавить стерильный жидкий носитель. Конкретная доза будет зависеть от удельной активности данной вакцины и может быть легко определена путем рутинного экспериментирования.
Также может быть произведена генетическая доставка антител, которые связываются с полипептидами в соответствии с изобретением, например, как описано в международной патентной заявке А0 98/55607.
Технология, называемая безыгольным впрыскиванием (см., например, \у\у\у.ро\убег|ес1.сош). также может быть полезной при составлении вакцинных композиций.
Множество подходящих способов для вакцинации и систем доставки вакцины описано в международной патентной заявке А0 00/29428.
Настоящее изобретение также относится к применению молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в качестве диагностических реагентов. Детекция мутированной формы гена, характеризующейся существованием молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которые ассоциируются с дисфункцией, используется в качестве диагностического средства, которое может облегчать установление диагноза заболевания или установления восприимчивости к заболеванию, возникающему в результате пониженной экспрессии, сверхэкспресии или измененной пространственной или временной экспрессии данного гена. Индивидуумы, несущие мутации в данном гене, могут быть идентифицированы на уровне ДНК рядом методов.
Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для диагностики, могут быть получены из клеток данного индивидуума, таких как клетки крови, мочи, слюны, биоптата ткани или материала, полученного после аутопсии. Геномные ДНК могут быть использованы непосредственно для детекции, либо перед проведением анализа они могут быть амплифицированы ферментативно с использованием ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР), амплификации с замещением цепи (δΌΛ) или другими методами амплификации (см. δηίΐά е! а1., №1иге. 324, 163-166 (1986); Ве.) е! а1., Стй. Рет. Вюскет. Мо1ес. Вю1., 26, 301-334 (1991); Впкептеует е! а1., I. νπΌ1. Ме!к., 35, 117-126 (1991), Vаη Вгип!, I. Вю/Тескпо1оду, 8, 291-294 (1990)).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания у пациента, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по настоящему изобретению, и сравнение полученного уровня экспрессии с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия данного заболевания. Этот способ может включать следующие стадии:
а) контактирование образца ткани, взятого у пациента, с зондом нуклеиновой кислоты в жестких условиях, в результате чего образуется гибридный комплекс между молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и указанным зондом;
- 20 009607
b) контактирование контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии а); и
c) определения присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, где детекция уровней гибридного комплекса в образце данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, является признаком наличия данного заболевания.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, включающему следующие стадии:
a) получения образца ткани от пациента, исследуемого на наличие заболевания;
b) выделения молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению из указанного образца ткани; и
c) установления диагноза заболевания у данного пациента путем обнаружения присутствия мутации молекулы нуклеиновой кислоты, которая ассоциируется с данным заболеванием.
Для облегчения детекции молекулы нуклеиновой кислоты в описанных выше способах может быть проведена стадия амплификации, например, с помощью ПЦР.
Делеции и инсерции могут быть детектированы по изменению размера амплифицированного продукта по сравнению с нормальным генотипом. Точечная мутация может быть идентифицирована путем гибридизации амплифицированной ДНК с меченой РНК по настоящему изобретению или, альтернативно, с меченой антисмысловой ДНК-последовательностью по настоящему изобретению. Полностью соответствующие последовательности могут быть дифференцированы от дуплексов с ошибочным спариванием путем гидролиза РНКазой или путем оценки различий в температурах плавления. Присутствие или отсутствие мутации у пациента может быть определено посредством контактирования ДНК с зондом нуклеиновой кислоты, который гибридизуется с ДНК в жестких условиях, в результате чего образуется гибридная двухцепочечная молекула, которая имеет негибридизованную часть цепи зонда нуклеиновой кислоты в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и установления присутствия или отсутствия негибридизованной части цепи зонда нуклеиновой кислоты как показателя наличия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации в соответствующей области ДНКцепи.
Такие способы диагностики являются особенно ценными для проведения пренатальных и даже неонатальных тестов.
Точечные мутации и другие отличия между последовательностями эталонного гена и мутантных генов могут быть идентифицированы другими хорошо известными методами, такими как прямое секвенирование ДНК или определение конформационного полиформизма одноцепочечных последовательностей (см. Огйа е! а1., Сепоннск. 5, 874-879 (1989)). Так, например, секвенирующий праймер может быть использован вместе с двухцепочечным ПЦР-продуктом или с одноцепочечной матричной молекулой, генерированной с помощью модифицированной ПЦР. Определение последовательности осуществляют в соответствии со стандартными методиками с использованием радиоактивно меченых нуклеотидов или в соответствии с методиками автоматического секвенирования с использованием флуоресцентных меток. Клонированные ДНК-сегменты могут быть также использованы в качестве зондов для детекции специфических ДНК-сегментов. Чувствительность этого метода значительно повышается при использовании в комбинации с ПЦР. Кроме того, точечные мутации и другие модификации последовательностей, такие как полиморфизм, могут быть детектированы, как описано выше, например, с использованием аллельспецифических олигонуклеотидов для ПЦР-амплификации последовательностей, отличающихся одним нуклеотидом.
Различия в ДНК-последовательностях могут быть также детектированы по изменениям электрофоретической подвижности ДНК-фрагментов в гелях, в присутствии или в отсутствие денатурирующих агентов, либо путем прямого секвенирования ДНК (например, Муегк е! а1., 8с1епсе (1985) 230:1242). Изменения в конкретных положениях данных последовательностей могут быть также выявлены либо путем проведения анализов на защиту от нуклеазы, таких как анализ на защиту от РНКазы или 81, либо путем химического расщепления (см. Сойоп е! а1., Бгос. №!1. Асай. 8сг И8А (1985) 85:4397-4401).
Помимо стандартного гель-электрофореза и секвенирования ДНК мутации, такие как микроделеции, анеуплоидии, транслокации и инверсии, могут быть также детектированы путем проведения анализа 1п кйи (см., например, Ке11ег е! а1., ΌΝΑ БгоЬек. 2пй Ей., 8!оск!оп Ρκκκ, Νο\ν Уогк, Ν.Υ., И8А (1993)), т.е. ДНК или РНК-последовательности в клетках могут быть проанализированы на мутации, не прибегая к их выделению и/или иммобилизации на мембране. Гибридизация ш кйи с флуоресценцией (ΕΙ8Η) является в настоящее время наиболее широко используемым методом, и множество его описаний уже появилось в литературе (см., например, Тгасйиск е! а1., 8с1епсе 250, 559-562 (1990) и Тгакк е! а1., Тгепйк, Сепе!., 7, 149-154 (1991)).
В другом варианте осуществления изобретения для проведения эффективного скрининга генетических вариантов, мутаций и полиморфизма может быть создан массив олигонуклеотидных зондов, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Технология создания массивов хорошо известна, находит широкое применение и может быть использована для решения ряда проблем
- 21 009607 молекулярной генетики, касающихся экспрессии генов, сцепления генов и генетической изменчивости (см., например, М. С’Нее е! а1., 8с1епсе (1996) Уо1. 274, рр.610-613).
В одном из вариантов осуществления изобретения такой массив может быть получен и использован в соответствии с методами, описанными в заявке РСТ \УО 95/11995 (СЬее е! а1.); ЬоскЬай Ό.Ε е! а1., (1996) Ыа!. В1о!есЬ. 14:1675-1680; и 8сЬета М. е! а1., (1996) Ргос. Ыа!1. Асай. δα. 93:10614-10619). Олигонуклеотидные пары могут быть использованы в количестве от двух пар до свыше одного миллиона пар. Олигомеры синтезируют в соответствующих участках на субстрате с использованием оптически направленного химического синтеза. Таким субстратом может быть бумага, найлон или мембрана другого типа, фильтр, чип, покровное стекло или любой другой твердый носитель. В другом аспекте настоящего изобретения олигонуклеотид может быть синтезирован на поверхности субстрата с использованием процедуры химического связывания и струйного аппарата для нанесения путем разбрызгивания, как описано в заявке РСТ \УО 95/25116 (Ва1йе5с11\уейег е! а1.). В другом аспекте для определения порядка расположения кДНК-фрагментов или олигонуклеотидов на поверхности субстрата и связывания этих фрагментов или олигонуклеотидов с поверхностью субстрата могут быть использованы сетчатые массивы, аналогичные массивам для дот (или слот)-блотов, с использованием вакуумной системы и методов термического, УФ-, механического или химического связывания. Массив, такой как массивы, описанные выше, может быть создан вручную или с использованием подходящих устройств (слот-блот или дот-блот-аппарата), материалов (любого твердого носителя) и оборудования (включая роботизированную аппаратуру), и этот массив может содержать 8, 24, 96, 384, 1536 или 6144 олигонуклеотидов или любое другое число от двух и выше одного миллиона, которое является подходящим для эффективного использования коммерчески доступного оборудования.
Помимо методов, описанных выше, заболевания могут быть диагностированы методами, включающими определение в образце, взятом у индивидуума, аномально низкого или аномально высокого уровня полипептида или мРНК. Для количественной оценки полипептидов пониженный или повышенный уровень экспрессии может быть измерен на РНК-уровне любыми методами, хорошо известными в данной области, например, путем амплификации нуклеиновых кислот, а именно с помощью ПЦР или ОТ-ПЦР, путем проведения анализов на защиту от РНКазы, Нозерн-блот-анализов и другими методами гибридизации.
Аналитические методы, которые могут быть использованы для определения уровней полипептида по настоящему изобретению в образце, взятом у хозяина, хорошо известны специалистам и подробно обсуждаются выше (включая радиоиммуноанализы, анализы на конкурентное связывание, Вестерн-блотанализ и ЕЫ8А-анализы). В этом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, который включает стадии (а) контактирования лиганда, описанного выше, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (Ь) детекции указанного комплекса.
Протоколы, такие как ЕЬ18А (как описано выше), РИА и РАС8, разработанные для измерения уровней полипептидов, могут быть, кроме того, взяты за основу при определении измененных или аномальных уровней экспрессии полипептида. Нормальные или стандартные значения для экспрессии полипептида получают путем объединения физиологических жидкостей или клеточных экстрактов, взятых у нормальных млекопитающих, предпочтительно у человека, с антителом против полипептида в условиях, подходящих для образования комплекса. Количество образованного стандартного комплекса может быть оценено различными методами, такими как фотометрические методы.
Антитела, которые специфически связываются с полипептидом по настоящему изобретению, могут быть использованы для диагностики состояний или заболеваний, характеризующихся экспрессией полипептида, или в анализах для наблюдения за пациентами, которым было проведено лечение полипептидами, молекулами нуклеиновой кислоты, лигандами и другими соединениями по настоящему изобретению. Антитела, подходящие для использования в диагностических целях, могут быть получены способом, аналогичным способу, описанному выше для терапии. Диагностические анализы на присутствие полипептида осуществляют методами, в которых используют антитело и метку для детекции полипептида в физиологических жидкостях или экстрактах клеток или тканей человека. При этом могут быть использованы модифицированные или немодифицированные антитела, и эти антитела могут быть помечены путем их ковалентного или нековалентного связывания с репортерной молекулой. При этом могут быть использованы репортерные молекулы широкого ряда, известные в данной области, и некоторые из них описаны выше.
Количества полипептида, экспрессируемого у индивидуума, в контрольном и зараженном образцах и образце тканей, взятых при биопсии, сравнивают со стандартными величинами. Отклонение величин, полученных для данного индивидуума, от стандартных величин позволяет определить параметры для диагностики заболевания. Диагностический анализ может быть использован для выявления отсутствия, присутствия и избыточной экспрессии полипептида и для мониторинга регуляции уровней полипептида во время терапевтического лечения. Такие анализы могут быть также использованы для оценки эффективности конкретного курса терапевтического лечения при исследовании животных в клинических испытаниях или для наблюдения за лечением отдельного пациента.
- 22 009607
Диагностический набор по настоящему изобретению может содержать:
(a) молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению;
(b) полипептид по настоящему изобретению; или (c) лиганд по настоящему изобретению.
В одном из аспектов настоящего изобретения диагностический набор может включать первый контейнер, содержащий зонд нуклеиновой кислоты, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания. Этот набор может, кроме того, включать третий контейнер, содержащий агент для расщепления негибридизованной РНК.
В альтернативном аспекте настоящего изобретения диагноститический набор может содержать массив молекул нуклеиновой кислоты, по крайней мере одной из которых является молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
Для определения полипептида по настоящему изобретению диагностический набор может содержать одно или более антител, связывающихся с полипептидом по настоящему изобретению, и реагент, используемый для детекции реакции связывания между антителом и полипептидом.
Такие наборы могут быть использованы для диагностики заболевания или восприимчивости к заболеванию, такому как клеточно-пролиферативные расстройства, включая опухолевые заболевания, меланому, опухоли легких, ободочной и прямой кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие твердые опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, расстройства ангиогенеза, саркома Калоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз и воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантата; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отек, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, травму головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боль; нарушения развития; метаболические расстройства, включая диабет, остеопороз и ожирение, СПИД и заболевание почек; инфекции, включая вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, грибковую инфекцию и паразитарную инфекцию; и другие расстройства, опосредованные ΤΝΕ-подобными секретируемыми белками, в особенности, опосредованные белками семейства С'1с|.
Различные аспекты и варианты настоящего изобретения будут более подробно проиллюстрированы на примерах, в частности для полипептида ГО8Р058.
При этом следует отметить, что в настоящее изобретение могут быть внесены конкретные модификации, не выходящие за объем изобретения.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1 - первые десять результатов, полученные из ВЬА8Т по отношению к безызбыточной базе данных NСВI с применением 8Е0 ГО N0:8 (полипептидная последовательность Ш8Р058);
фиг. 2 - сопоставление, полученное с помощью ВЬА8Т, 8Е0 ГО N0:8 (полипептидная последовательность Ш8Р058) с наиболее близкородственной структурой, о!о1ш-1 из Опсогйупсйик ке!а;
фиг. 3 - первые 20 результатов, полученные из Сепоте Тйгеабег с применением 8Е0 ГО N0:8 (полипептидная последовательность Ш8Р058). Коды РОВ для первых трех результатов относятся к следующим белковым структурам: 1с28, цепи А, С и В. Кристаллическая структура белка семейства комплемента 1с.| говорит об эволюционной связи с фактором некроза опухоли;
фиг. 4 - структурное сопоставление, генерированное Сепоте Тйгеабег между 8Е0 ГО N0:8 (полипептидная последовательность Ш8Р058) и первой РОВ структурой на фиг. 3 (1с28);
фиг. 5А - предсказание 8^дηа1Ρ-NN сигнального пептида, присутствующего в полипептидной последовательности Ш8Р058 (8Е0 ГО N0:8);
фиг. 5В: предсказание 81дпа1Р-НММ сигнального пептида, присутствующего в полипептидной последовательности Ш8Р058 (8Е0 ГО N0:8);
фиг. 6 - предсказанная нуклеотидная последовательность Ш8Р058 с трансляцией;
фиг. 7 - нуклеотидная последовательность с трансляцией продукта РСВ, клонированного с использованием праймеров Ш8Р058-С’Р1 и Ш8Р058-С’Р2;
фиг. 8 - карта рСВП-Т0Р0-П\Г8Р0588^ фиг. 9 - сопоставление клонированной нуклеотидной последовательности Ш8Р058 (IN8Ρ0588V) с предсказанной последовательностью Ш8Р058;
фиг. 10 - сопоставление предсказанной аминокислотной последовательности Ш8Р058 с аминокислотной последовательностью клонированного IN8Ρ0588V;
фиг. 11 - карта вектора экспрессии рЕАК12б;
фиг. 12 - карта Са!е^ау вектора р^ОNΚ201;
фиг. 13 - карта рЕΑК12б-IN8Ρ0588V-6НI8.
- 23 009607
Примеры
Пример 1. Ш8Р058.
8Е0 ΙΌ N0:8 использовали в качестве запроса ВЬА8Т по отношению к безызбыточной базе данных последовательностей NСΒI. Наибольшее совпадение с последовательностью запроса у последовательности о!о1т-1 из 0псогбупсбик ке1а (фиг. 1). На фиг. 2 показано сопоставление последовательности запроса Ш8Р058 с последовательностью о!о1ш-1 из Опсогупсбик ке1а. На фиг. 3 показаны 20 первых результатов из Сепоте Тбгеабег с применением 8Е0 ΙΌ N0:8 (полипептидная последовательность Ш8Р058). Коды РОВ для первых трех результатов относятся к следующим белковым структурам: цепи А, С и В 1с28. Кристаллическая структура белка семейства комплемента 1с.| говорит об эволюционной связи с фактором некроза опухоли. На фиг. 4 показано структурное сопоставление, генерированное Сепоте Тбгеабег между 8Е0 ΙΌ N0:8 (полипептидная последовательность Ш8Р058) и первой РОВ структурой на фиг. 3 (1с28).
Полипептидная последовательность Ш8Р058 (8Е0 ΙΌ N0:8) была подвергнута анализу с применением 81дпа1Р ν2.0 (как описано на вебсайте \\л\лу.сЬк.би.1.бк/кег\зсек/8|дпа1Р-2.0) программы, которая предсказывает наличие и локализацию сайтов расщепления сигнальных пептидов в аминокислотных последовательностях из различных организмов. 81дпа1Р ν2.0 содержит два способа предсказания сигнальных пептидов, §^дηа1Ρ-NN (основанный на нейронных сетях) и 81дпа1Р-НММ (основанный на скрытых моделях Маркова). Результаты 81дпа1Р для полипептидной последовательности Ш8Р058 (8Е0 ΙΌ N0:8) приведены в виде фиг. 5А и 5В. На фиг. 5А и 5В показано, что наиболее вероятный сайт расщепления для полипептидной последовательности [Ш8Р058 (8Е0 ΙΌ N0:8) расположен между положениями 15 и 16.
Пример 2. Вариант сплайсинга Ш8Р058.
1.1. Библиотеки кДНК.
Библиотеки человеческих кДНК (в векторах бактериофага лямбда (λ-)) закупали у 8йа1адепе или С1оп1есб или получали в Научно-исследовательском институте фармакологии 8егопо в векторах λ 2АР или λ СТ10 в соответствии с протоколом производителей (81га1адепе). ДНК бактериофага λ получали из лабораторных культур инфицированного штамма-хозяина Е.соН с использованием системы очистки ДНК Χνί/агб ЬатЬба Ргерк в соответствии с инструкциями производителей (Рготеда Согрогабоп, Маб1коп νΙ). Список используемых библиотек и штаммов-хозяев приведен в табл. 1. В последовательных ПЦРреакциях использовали семь пулов, представляющих 26 различных библиотек (100 нг/мкл фаговой ДНК) или фаговую ДНК из отдельных библиотек.
Таблица 1
Библиотеки кДНК человека
Библиотека Источник ткани/клетки Вектор Штамм’ хозяин Поставщик № в каталоге
6 Черное вещество человека СТЮ ЬЕ392 Получено авторами
7 Головной мозг плода человека ОТ10 ЬЕ392 Получено авторами
8 Кора головного мозга человека СТЮ БЕЗ 92 Получено авторами
9 Толстая кишка человека СТЮ БЕЗ 92 СХопЕесб НБ1034а
11 Легкие плода человека СТЮ БЕЗ 92 С1опЕесЬ НЬ1072а
12 Почки плода человека СТЮ БЕЗ 92 С1опбесб НБ1071Э
14 Костный мозг человека СТЮ БЕЗ 92 С1опбесб НБЮ58а
- 24 009607
18 Человеческая клеточная линия 4373 СТЮ ЬЕ392 Получено авторами
19 Человеческая клеточная линия СЕТос-1 υηί Зар ХЬ1- В1ие МКР’ ЗЬгаВадепе 936206
20 Сетчатка глаза человека СТЮ ЬЕ3 92 С1опСес11 НЬ1132а
21 Мочевой пузырь человека СТЮ ЬЕ392 Получено авторами
22 Человеческие тромбоциты υηί гар хы- Е1ие МЕР1 Получено авторами
23 Человеческая нейробластома Кап+Т5 СТЮ ЬЕ3 92 Получено авторами
24 Гладкая мышца бронхов человека СТЮ ЬЕ3 92 Получено авторами
25 Гладкая мышца бронхов человека СТЮ ЬЕ392 Получено авторами
26 Тимус человека СТЮ ЬЕ392 С1опЬесй НЬ1127а
27 5'-фрагмент селезенки человека СТ11 ЬЕ392 С1опЬес11 НЬ1134Ь
28 Моноциты периферической крови человека СТЮ ЬЕ3 92 С1опбес11 НЫ050а
29 Яички человека СТЮ ЬЕ392 С1опЕес1а НЫОбБа
30 Головной мозг плода человека СТЮ ЬЕ392 С1оп£ес11 НЫ065а
31 Черное вещество человека СТЮ ЬЕ392 С1опрес11 НЫОЭЗа
32 Плацента человека #11 СТ11 ЬЕ392 С1опРесН НЬ1075Ь
33 Головной мозг плода человека СТЮ Ι1Ε392 С1опБесЬ Сделано по заказу
34 Плацента человека #59 СТЮ ЬЕ392 С1опС.есй Н1,5014а
35 Гипофиз человека СТЮ ЪЕ392 С1опБес11 Н1.1097а
36 Поджелудочная железа человека #63 υηί Иар хк ХЬ1- В1ие МЕР' ЗВгаВадепе 937208
1.2. ПЦР предполагаемых кДНК, полученных из фаговой библиотеки ДНК.
Были разработаны ген-специфичные праймеры ПЦР-амплификации (Ш8Р058-СР1 и Ш8Р058-СР2, фиг. 6 и табл. 2) с тем, чтобы амплифицировать продукт с 990 п.н., который, как ожидалось, содержал почти полную предсказанную кодирующую последовательность ΙΝ8Γ058. Их использовали в ПЦР на пулах библиотеки фаговой кДНК, показанных в табл. 1. ПЦР осуществляли в конечном объеме 50 мкл, содержащем 1Х буфер АтрНТач™, 200 мкМ бЭТР, 50 пмоль каждого клонирующего праймера, 2,5 ед. АтрНТас.|™ (Регкш-Е1тег) и 100 нг каждой ДНК пула фаговой библиотеки с использованием аппарата М1 Кекеагсй ^NΑ Еидте с установленной программой, работающей в следующем режиме: 40 циклов при 94°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин и затем 1 цикл при 72°С в течение 7 мин и цикл выдерживания при 4°С.
- 25 009607
Таблица 2
Праймеры для клонирования и секвенирования Ш8Р058
Праймер Последовательность (5'-3')
1№Р05д-сР1 СТС СТС ССТ ТСТ ССТ ТСС САТ т
1ЫЗР058-СР2 ССС ОСТ ССТ САА САС ААС САА С
ССР прямой С ССС АСА АСТ ТТС ТАС ААА ААА ССА ССС ТТС ССС АСС
ССР обратный ССС САС САС ТТТ СТА САА САА АСС ТСС СТТ ТСА АТС СТС АТС СТС АТС СТС
ΙΝ3Ρ0583У-ЕХ1 ССА ССС ТТС ССС АСС АТС АСС АТС ТСС ТСС СТТ СТС СТТ ССС АТТ
ΙΝ5Ρ0583ν-ΕΧ2 ОТО ΑΤΰ ΰΤΰ ΑΤΰ ΰΤΰ СТС ССТ ТТТ ТСА ССА ААС АСА ССТ САА СА
рЕАК12-Р ССС АСС ТТС ССА СТТ САТ СТ
рЕАК12-К САТ ССА ССТ СОА ССТ СТС АС
ЗР6 АТТ ТАС СТС АСА СТА ТАС
Т7 ТАА ТАС САС ТСА СТА ТАС СС
Подчеркнутая последовательность = последовательность Козака
Последовательность, обозначенная жирным шрифтом, = стоп-кодон
Последовательность, обозначенная курсивом, = метка Н18
Продукты амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1х буфере ТАЕ (1пуйгодеп) и очищали с использованием системы очистки ДНК Χνί/агб РСК Ргерк (Рготеда). ПЦР-продукты, элюированные в 50 мкл стерильной воды, либо непосредственно субклонировали, либо хранили при -20°С.
1.3. Ген-специфические клонирующие праймеры для ПЦР.
Пара ПЦР-праймеров, имеющих длину от 18 до 25 нуклеотидов, конструировали для амплификации частичной последовательности кДНК ΙΝ8Γ058 с использованием программы Рптег Ое51дпег 8ой\уаге (8с1епййс & Ебисайопа1 8ой^аге, РО Вох 72045, ОцгИат, N0 27722-2045, И8А). ПЦР-праймеры оптимизировали так, чтобы Тт была близка к 55+10°С, и содержание ОС составляло 40-60%. Были отобраны праймеры, которые обнаруживали высокую селективность для последовательности-мишени ΙΝ8Γ058 (низкий уровень или отсутствие неспецифического праймирования). В Ш8Р058-СР1 отсутствуют первые 8 п.н. предсказанной кодирующей последовательности ΙΝ8Γ058 вследствие оптимизации разработки ПЦР-праймеров.
1.4. Субклонирование ПЦР-продуктов.
ПЦР-продукты субклонировали в клонирующий вектор, модифицированный топоизомеразой Ι (рСКИ ТОРО) с использованием набора для клонирования ТА, закупленного у 1пуйгодеп Согрогайоп, и с использованием условий, указанных производителем. Кратко, 4 мкл выделенного из геля ПЦР-продукта, полученного в результате амплификации пула Р библиотеки человека, инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре с 1 мкл вектора ТОРО и 1 мкл солевого раствора. Затем реакционную смесь трансформировали в штамм ТОР 10 Е.сой (1пуйгодеп) следующим образом: 50 мкл-аликвоту клеток Опе 81ю1 ТОР10 оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси ТОРО. Смесь инкубировали в течение 15 мин на льду, затем подвергали тепловому шоку путем инкубирования при 42°С в течение точно 30 с. Затем образцы снова помещали на лед и добавляли 250 мкл теплой среды 8ОС (при комнатной температуре). Образцы инкубировали со встряхиванием (220 об./мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем смесь для трансформации высевали на чашки с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим ампициллин (10 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.
1.5. Отбор устойчивых к ампициллину колоний.
Отобрали несколько устойчивых к ампициллину колоний и клетки высеяли уколом в отдельные лунки 96-луночного планшета, каждая из которых содержала Ь-бульон, содержащий ампициллин (100 мг/мл).
1.6. Получение и секвенирование плазмидной ДНК.
Минипрепараты плазмидной ДНК получали из уколочных культур и подвергали ДНКсеквенированию с праймером Т7 на ОАТС Вю1ес11 АО (ЗакоЬ-81аб1ег-Р1а1х 7, Ό-78467 КопПапх). Последовательность клонированного фрагмента кДНК показана на фиг. 7.
2. Идентификация кДНК- библиотек/матриц, содержащих Ш8Р0588У.
ПЦР-продукты, полученные с использованием Ш8Р058-СР1 и Ш8Р058-СР2 и мигрирующие при 453 п.н., меньший размер, чем ожидалось, идентифицировали в пуле Р библиотеки λ кДНК (тимус, селезенка, моноциты периферической крови и яичко человека). Карта плазмиды клонированного продукта ПЦР (рСКИ-ТОРО-Ш8Р058) (плазмида с идентификационным номером 12917) показана на фиг.8. В клонированной последовательности отсутствуют первые 8 п. н. предсказанной кодирующей последователь
- 26 009607 ности 1И8Р058, но она идентична предсказанной последовательности 1И8Р058 вплоть до положения нуклеотида 267, где она отклоняется от прогноза вследствие делеции 538 п.н. (фиг.9). Трансляция самой длинной 0КБ (включая отсутствующие на 5'-конце 8 п.н.) дает белок из 99 аминокислот, из которых аминокислоты 1-89 являются идентичными прогнозу 1И8Р058 (фиг. 11). Следовательно, клонированная последовательность соответствует короткому варианту сплайсинга 1И8Р058 (названному 1И8Р0588У).
3. Конструирование плазмид для экспрессии 1И8Р0588У в клетках НЕК293/ЕВИА.
Клон рСК11-Т0Р0, содержащий кодирующую последовательность (0КБ) 1И8Р0588У, идентифицированную путем ДНК-секвенирования ДНК (фиг. 7), затем использовали для субклонирования вставки в вектор для экспрессии рЕАК12б в клетках млекопитающего (фиг.11) с использованием методики клонирования Са!с^ауТМ (1пуйгодсп).
3.1. Генерирование Са!еетау-совместимой 0КБ 1И8Р0588У, присоединенной к последовательностиметке 6Н18. с сохранением рамки считывания.
Первая стадия способа клонирования Са!с^ау включает двухстадийную ПЦР-реакцию, которая генерирует 0КБ 1И8Р0588У, фланкированную у 5'-конца сайтом рекомбинации а!!В1 и последовательностью Козака, и у 3'-конца - последовательностью, кодирующей, с сохранением рамки считывания, 6гистидиновую (6Н18) метку, стоп-кодоном и сайтом рекомбинации аПВ2 (Са!с^ау-совместимой кДНК). Первая ПЦР-реакционная смесь (в конечном объеме 50 мкл) содержала 1,5 мкл (приблизительно 25 нг) рСК II Т0Р0-1И8Р0588У (плазмида 12917 и фиг. 8), 1,5 мкл бИТР (10 мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера Р£х, 1 мкл Мд804 (50 мМ), 0,5 мкл каждого геноспецифического праймера (100 мкМ) (прямого праймера 1И8Р058-ЕХ1 и обратного праймера 1И8Р058-ЕХ2) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Р£х Р1а!шцт (1пу11годсп). ПЦР-реакцию осуществляли с использованием начальной стадии денатурации при 95°С, 1 мин, с последующим проведением 10 циклов при 94°С, 15 с; 55°С, 30 с и 68°С, 2 мин и цикл выдерживания при 4°С. ПЦР-продукты очищали непосредственно из реакционной смеси с использованием системы очистки ДНК Χνί/агб РСК Ргср (Ргогпсда) в соответствии с инструкциями производителей. Вторая ПЦРреакционная смесь (в конечном объеме 50 мкл) содержала 10 мкл очищенного ПЦР-продукта, 1,5 мкл бИТР (10 мМ), 5 мкл 10х полимеразного буфера Р£х, 1 мкл Мд804, (50 мМ), 0,5 мкл каждого праймера для конверсии Са!с^ау (100 мкМ) (прямого праймера ССР и обратного праймера ССР) и 0,5 мкл ДНКполимеразы Р£х Р1айпцт. Вторую ПЦР-реакцию осуществляли в следующих условиях: 95°С, 1 мин., 4 цикла при 94°С, 15 с; 50°С, 30 с и 68°С, 2 мин; 25 циклов при 94°С, 15 с; 55°С, 30 с и 68°С, 2 мин с последующим циклом выдерживания при 4°С. ПЦР-продукты очищали, как описано выше.
3.2. Субклонирование Са!с^ау-совместимой 0КБ 1И8Р0588У во встраивающий вектор рЭ0ИК201 Са!с^ау и экспрессирующий вектор рЕАК12б.
Вторая стадия способа клонирования Са!с^ау включает субклонирование Са!с^аумодифицированного ПЦР-продукта во встраивающий вектор рЭ0ИК201 Са!с^ау (1пуйгодсп, фиг. 12), которое осуществляли следующим образом: 5 мкл очищенного ПЦР-продукта инкубировали с 1,5 мкл вектора рЭ0ИК201 (0,1 мкг/мкл), 2 мкл буфера ВР и 1,5 мкл клоназной ферментной смеси ВР (1пу11годсп) при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию прекращали добавлением протеиназы К (2 мкг) и инкубировали при 37°С еще 10 мин. Аликвоту реакционной смеси (2 мкл) трансформировали в клетки ЭН10В Е.соИ путем электропорации с использованием импульсного устройства Вюгаб Сепс Риксг. Трансформанты высевали на ЬВ-планшеты с канамицином. Плазмидный минипрепарат ДНК (М1ш-ргср) приготавливали из 1-4 полученных колоний с использованием набора Αί/агб Р1ик 8У М1шргсрк (Рготсда) и затем 1,5 мкл плазмидного элюата использовали в реакционной смеси для рекомбинации, содержащей 1,5 мкл вектора рЕАК12б (фиг. 9) (0,1 мкг/мкл), 2 мкл буфера ЬК и 1,5 мкл клоназы ЬК (1пуйгодсп) в конечном объеме 10 мкл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем реакцию прекращали добавлением протеиназы К (2 мкг) и смесь инкубировали при 37°С в течение еще 10 мин. Аликвоту реакционной смеси (1 мкл) использовали для трансформации клеток ЭН10В Е.сой путем электропорации.
Клоны, содержащие правильную вставку, идентифицировали путем проведения ПЦР для колоний, как описано выше, за исключением того, что для этой ПЦР использовали праймеры рЕАК12б (рЕАК12б Б и рЕАК12б К). Плазмидный минипрепарат ДНК выделяли из клонов, содержащих правильную вставку, с использованием роботизированной системы С1аргср ТигЬо 9600 (С1адсп) или вручную с использованием набора Αί/агб Р1ик 8У М1шргср (Рготсда) и последовательность подтверждали с использованием праймеров рЕАК12б Б и рЕАК12б К.
Очищенный в градиенте СкС1 максипрепарат ДНК плазмиды рЕАК12б-1И8Р0588У-6Н18 (плазмида Ш номер 13081, фиг. 13) получали из 500 мл культуры клонов с подтвержденной последовательностью (8атЬгоок, I. с! а1., Мо1сси1аг С1ошпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб сбйюп, 1989, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргскк), ресуспендировали при концентрации 1 мкг/мкл в стерильной воде и хранили при -20°С.
Кроме того, с применением вектора экспрессии рЕА/К12б-1И8Р0588У-6Н18 теперь могут быть выполнены дополнительные эксперименты. Трансфекция линий клеток млекопитающих с этим вектором может сделать возможной экспрессию высокого уровня белка 1И8Р0588У и, таким образом, дать возможность для непрерывного исследования функциональных характеристик полипептидов 1И8Р0588У. Следующие материал и способы являются примером, подходящим для таких экспериментов.
- 27 009607
Культура клеток
Клетки почек эмбриона человека 293, экспрессирующие ядерный антиген вируса Эпштейна-Барр (ΗΕΚ293-ΕВNΑ, [пуйгодеп). поддерживали в суспензии бессывороточной среды Εχ-клеток νΡΚ0 (посевной материал, поддерживающая среда, ΣΚΗ). За 16-20 ч до трансфекции (день -1), клетки высевали во флаконы с 2х Т225 (50 мл на флакон в среде ΌΜΕΜ/Ρ12 (1:1)), содержащие посевную среду с 2% ΡВδ (РЕН), при плотности 2х105 клеток/мл). На следующий день (день трансфекции 0) осуществляли трансфекцию с использованием реагента .^ίΡΕΙ™ (2 мкл/мкг плазмидной ДНК, Ρο1уΡ1и8-трансфекция). Для каждого флакона плазмидную ДНК совместно трансфецировали с ДНК 0ΡΡ (флуоресцентного репортерного гена). Затем смесь для трансфекции добавляли во флаконы с 2х Т225 и инкубировали при 37°С (5% С02) в течение 6 дней. Подтверждение позитивной трансфекции можно провести путем качественной оценки флуоресценции на день 1 и на день 6 (Ахюуей 10 2еЬ8).
На 6 день (день сбора), супернатанты из двух флаконов объединяли и центрифугировали (например, при 4°С, 400 д), и затем помещали в сосуд, содержащий уникальный идентификатор. Одну аликвоту (500 мкл) оставляли для ОС (количественной оценки) 6Н18-меченого белка (ОС внутреннего биопроцессинга).
Крупномасштабные партии получали в соответствии со следующим протоколом под названием ΡΕΙ-трансфекция суспензионных клеток, описанным в литературе под кодовым названием ВΡ/ΡΕI/ΗΗ/02/04, с использованием полиэтиленимина от Ροϊν^^!'^^ используемого в качестве агента для трансфекции.
Способ очистки
Образец культуральной среды, содержащей рекомбинантный белок с С-концевой меткой 6Н18, разводили холодным буфером А (50 мМ NаΗ2Ρ04; 600 мМ №С1; 8,7% (мас./об.) глицерина, рН 7,5). Затем образец фильтровали через стерильный фильтр (ΜίΙΙίροΐΌ) и выдерживали при 4°С в стерильном квадратном сосуде со средой (№11депе).
Очистку осуществляли при 4°С на рабочей станции νΙδΙ0Ν (Аррйеб Вюкуйетк), подсоединенной к автоматическому устройству для загрузки образцов (ЪаЬотайс). Процедура счистки состояла из двух последовательных стадий, т.е. сначала проводили металлоаффинную хроматографию на колонке с Ρο^ο8 20 МС (Аррйеб Вюкуйетк), загруженной ионами Νί (4,6x50 мм, 0,83 мл), и затем проводили гельфильтрацию на колонке (1,0x10 см) со средой, содержащей сефадекс 0-25 (Атегайат Ρйа^тас^а).
Для проведения первой стадии хроматографии металлоаффинную колонку регенерировали 30 колоночными объемами раствора Ε^ΤΑ (100 мМ Ε^ΤΑ; 1Μ №С1; рН 8,0), снова загружали ионы металла путем промывки 15 колоночными объемами 100 мМ раствора Νίδ04, после чего промывали 10 колоночными объемами буфера А, затем промывали 7 колоночными объемами буфера В (50 мМ NаΗ2Ρ04; 600 мМ №С1; 8,7% (мас./об.) глицерин, 400 мМ имидазол; рН 7,5) и, наконец, уравновешивали 15 колоночными объемами буфера А, содержащего 15 мМ имидазола. Образец переносили с помощью устройства для загрузки образцов ЬаЬотайс в 200 мл-петлю для образца и затем загружали на аффинную колонку с металлическим Νί при скорости потока 10 мл/мин. Колонку промывали 12 колоночными объемами буфера А и затем 28 колоночными объемами буфера А, содержащего 20 мМ имидазола. Во время промывки 20 мМ имидазолом слабо связанные примесные белки элюировались с колонки. И, наконец, рекомбинантный Нщ-меченый белок элюировали 10 колоночными объемами буфера В при скорости потока 2 мл/мин и собирали элюированный белок.
Для проведения второй стадии хроматографии гель-фильтрационную колонку с сефадексом 0-25 регенерировали 2 мл буфера Ό (1,137Μ №С1; 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ ΚΉ2Ρ04; 8 мМ NаΗ2Ρ04; рН 7,2), а затем уравновешивали 4 колоночными объемами буфера С (137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ КΗ2Ρ04; 8 мМ Nа2ΗΡ04; 20% (мас./об.) глицерин; рН 7,4). Фракции пиков, элюированные с Νί-колонки, автоматически пропускали через многофункциональное устройство для загрузки образцов, подсоединенное к рабочей станции νΙδΙ0Ν, загружали в колонку с сефадексом 0-25 и затем белок элюировали буфером С при скорости потока 2 мл/мин. Эту фракцию фильтровали через стерильный центрифужный фильтр (Μ11йроге), замораживали и хранили при -80°С. Аликвоту образца анализировали с помощью Вестернблоттинга с ДСН-ПААГ (4-12% гель NиΡΑ0Ε; №уех) с использованием анти-Н18 антител. Гель NиΡΑ0Ε можно окрашивать в растворе для окрашивания, содержащем 0,1% кумасси синего К250 (30% метанол, 10% уксусная кислота), при комнатной температуре в течение 1 ч и затем обесцвечивать в 20% метаноле, 7,5% уксусной кислоте до тех пор, пока фон не становился прозрачным, а полосы белка не становились отчетливо видимыми.
После электрофореза белки подвергали электрофоретическому переносу из геля на нитрицеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5% сухим молоком в буфере Е (137 мМ №С1; 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ КΗ2Ρ04; 8 мМ №2№04; 0,1% твина 20, рН 7,4) в течение 1 ч при комнатной температуре и затем инкубировали со смесью 2 кроличьих поликлональных анти-Нщ антител (0-18 и Н-15, 0,2 мгк/мл каждого; δаηίа Сгнх) в 2,5% сухом молоке в буфере Е в течение ночи при 4°С. После инкубирования в течение еще 1 ч при комнатной температуре мембрану промывали буфером Е (3x10 мин) и затем инкубировали со вторым ΗКΡ-конъюгированным антикроличьем антителом (ОАК0, НВД 0399), разведенным 1/3000
- 28 009607 в буфере Е, содержащем 2,5% сухое молоко, в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки буфером Е (3x10 мин) мембрану проявляли в течение 1 мин с помощью ЭХЛ-набора (Атегкйаш Рйагтас1а). Затем мембрану экспонировали с пленкой НурегШт (Атегкйат Рйагташа), пленку проявляли и снимок Вестерн-блота визуально анализировали.
Для образцов, которые после окрашивания кумасси обнаруживали детектируемые полосы белка, концентрацию белка в образцах можно определять с использованием набора для анализа на белок ВСА (Р1егсе), содержащего альбумин бычьей сыворотки в качестве стандарта.
Кроме того, для определения действия на активацию транскрипции генома клетки-хозяина можно использовать сверхэкспрессию или подавление экспрессии полипептидов ΙΝ8Ρ058δν в линиях клетки. Партнеры димеризации, коактиваторы и корепрессоры полипептидов ΙΝ8Ρ058δν можно идентифицировать посредством иммунопреципитации в сочетании с Вестерн-блоттингом и иммунопреципитацией в сочетании с масс-спектроскопией.

Claims (55)

1. Полипептид, который:
(ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0:8 и/или 8ЕЦ ΙΌ N0:14;
(ίί) представляет собой фрагмент (1), который обладает функцией ΤΝΕ-подобного секретируемого белка или содержит антигенную детерминанту, общую с полипептидом (1); или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (1) или (ίί).
2. Полипептид по п.1, который:
(ί) состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0:8 и/или 8ЕЦ ΙΌ N0:14;
(ίί) представляет собой фрагмент (1), который обладает функцией Т№-подобного секретируемого белка или содержит антигенную детерминанту, общую с полипептидом (1); или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
3. Полипептид, который представляет собой функциональный эквивалент подпункта (ίίί) п.1 или 2 и который является гомологичным аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:8.
4. Полипептид, представляющий собой фрагмент или функциональный эквивалент по любому из пп.1-3, аминокислотная последовательность которого идентична 8ЕЦ ΙΌ N0:8 или ее активному фрагменту более чем на 80%, предпочтительно более чем на 85, 90, 95, 98 или 99%.
5. Полипептид, представляющий собой фрагмент или функциональный эквивалент по любому из пп.1-4, который обладает значительной структурной гомологией с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0:8.
6. Полипептид, представляющий собой фрагмент по любому из пп.1-2 или 4, имеющий антигенную детерминанту, общую с полипептидом по подпункту (ί) по любому из пп.1-4, которая состоит из 7 или более аминокислотных остатков аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:8.
7. Полипептид по пп.1-2, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ΙΌ N0:10 и/или 8ЕО ΙΌ N0:16.
8. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по любому из предшествующих пунктов.
9. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты по п.8, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0:7, 8ЕЦ ΙΌ N0:9, 8ЕЦ ΙΌ N0:13, 8ЕЦ ΙΌ N0:15, или в высокой степени эквивалентна этим последовательностям, или является их фрагментом.
10. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты по п.8 или 9.
11. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10.
12. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.11.
13. Лиганд, который специфически связывается с полипептидом по любому из пп.1-7.
14. Лиганд по п.13, который представляет собой антитело.
15. Соединение, которое либо повышает, либо снижает уровень экспрессии или активность полипептида по любому из пп.1-7.
16. Соединение по п.15, которое связывает полипептид по любому из пп.1-7, не вызывая при этом какого-либо биологического эффекта полипептида.
17. Соединение по п.15 или 16, которое представляет собой природный или модифицированный субстрат, лиганд, фермент, рецептор или структурный или функциональный миметик.
18. Применение полипептида по любому из пп.1-7, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10, вектораа по п.11, клетки-хозяина по п.12, лиганда по п.13 или 14 или соединения по любому из пп.15-17 в терапии или в диагностике заболевания.
19. Способ диагностики заболевания у пациента, предусматривающий оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по любому из пп.1-7, или оценку активности полипептида по
- 29 009607 любому из пп.1-7 в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия заболевания.
20. Способ по п.19, который осуществляют ш уйго.
21. Способ по п.19 или 20, который предусматривает стадии (а) контактирования лиганда по п.13 или 14 с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лигандполипептид; и (Ь) определения указанного комплекса.
22. Способ по п.19 или 20, предусматривающий стадии:
a) контактирования образца ткани пациента с зондом нуклеиновой кислоты в жестких условиях, при которых возможно образование гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 и зондом;
b) контактирования контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и
c) определения гибридных комплексов в указанных образцах, где определение уровней гибридного комплекса в образце пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
23. Способ по п.19 или 20, предусматривающий:
a) контактирование образца нуклеиновой кислоты ткани пациента с праймером нуклеиновой кислоты в жестких условиях, при которых возможно образование гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10 и праймером;
b) контактирование контрольного образца с указанным праймером в условиях, аналогичных условиям стадии а);
c) амплификацию образца нуклеиновой кислоты и
й) определение уровня амплифицированной нуклеиновой кислоты в образце пациента и контрольном образце, где определение уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты в образце пациента, которые значительно отличаются от уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
24. Способ по п.19 или 20, предусматривающий:
a) получение образца ткани пациента, исследуемого на наличие заболевания;
b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10 из указанного образца ткани и
c) диагностирование заболевания у пациента путем обнаружения мутации в молекуле нуклеиновой кислоты, связанной с заболеванием, что указывает на наличие заболевания.
25. Способ по п.24, который дополнительно предусматривает амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты с образованием амплифицированного продукта и определение наличия или отсутствия мутации в амплифицированном продукте.
26. Способ по п.24 или 25, где присутствие или отсутствие мутации у пациента определяют путем контактирования указанной молекулы нуклеиновой кислоты с зондом нуклеиновой кислоты, который гибридизуется с указанной молекулой нуклеиновой кислоты в жестких условиях с образованием гибридной двухцепочечной молекулы, где гибридная двухцепочечная молекула содержит негибридизовавшуюся часть зонда нуклеиновой кислоты в любой области, соответствующей мутации, связанной с заболеванием; и определением присутствия или отсутствия негибридизовавшейся части зонда как показателя наличия или отсутствия мутации, связанной с заболеванием.
27. Способ по любому из пп.19-26, где указанное заболевание включает, но ими не ограничивается, клеточно-пролиферативные заболевания, включая опухолевые заболевания, меланому, опухоли легких, ободочной и прямой кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие твердые опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, расстройства ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз и воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантата; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отек, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, травму головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боль; нарушения развития; метаболические расстройства, включая диабет, остеопороз и ожирение, СПИД и заболевание почек; инфекции, включая вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, грибковую инфекцию и паразитарную инфекцию; и другие расстройства, опосредованные ΤΝΕ-подобными секретируемыми белками, в особенности, опосредованные белками семейства С1с.|.
28. Применение полипептида по любому из пп.1-7 в качестве ΤΝΕ-подобного секретируемого белка.
29. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-7.
30. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.810.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по п.11.
- 30 009607
32. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяин по п.12.
33. Фармацевтическая композиция, содержащая лиганд по п.13 или 14.
34. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.15-17.
35. Композиция вакцины, содержащая полипептид по любому из пп.1-7 или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10.
36. Применение полипептида по любому из пп.1-7, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10, вектора по п.11, клетки-хозяина по п.12, лиганда по п.13 или 14, соединения по любому из пп.15-17 или фармацевтической композиции по любому из пп.29-34 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, такого как клеточно-пролиферативные расстройства, включая опухолевые заболевания, меланому, опухоли легких, ободочной и прямой кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие твердые опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, расстройства ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз и воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантата; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отек, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, травму головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боль; нарушения развития; метаболические расстройства, включая диабет, остеопороз и ожирение, СПИД и заболевание почек; инфекции, включая вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, грибковую инфекцию и паразитарную инфекцию; и другие расстройства, опосредованные ΤΝΡподобными секретируемыми белками, в особенности, опосредованные белками семейства С1с.|.
37. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту полипептида по любому из пп.1-7.
38. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10.
39. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту вектора по п.11.
40. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту клеткихозяина по п.12.
41. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту лиганда по п.13 или 14.
42. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту соединения по любому из пп.15-17.
43. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту фармацевтической композиции по любому из пп.29-34.
44. Способ лечения заболевания по п.43, где при заболевании уровень экспрессии природного гена или активность полипептида у пациента с заболеванием ниже, чем уровень экспрессии или активность у здорового пациента, и вводимые пациенту полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, лиганд, соединение или композиция являются агонистами.
45. Способ лечения заболевания по п.43, где при заболевании уровень экспрессии природного гена или активность полипептида у пациента с заболеванием выше, чем уровень экспрессии или активность у здорового пациента, и вводимые пациенту полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, лиганд, соединение или композиция являются антагонистами.
46. Способ мониторинга лечения заболевания у пациента, предусматривающий мониторинг в течение определенного периода времени уровня экспрессии или активности полипептида по любому из пп.17 или уровня экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10 в ткани указанного пациента, где изменение указанного уровня экспрессии или активности за определенный промежуток времени по сравнению с контрольным уровнем является показателем регресса указанного заболевания.
47. Способ идентификации соединения, которое является эффективным для лечения и/или диагностики заболевания, предусматривающий контактирование полипептида по любому из пп.1-7 или молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10 с одним или несколькими соединениями, предположительно обладающими аффинностью связывания с указанным полипептидом или молекулой нуклеиновой кислоты, и селекцию соединения, которое специфически связывается с указанной молекулой нуклеиновой кислоты или полипептидом.
48. Способ идентификации соединения, которое является эффективным для лечения и/или диагностики заболевания, предусматривающий контактирование полипептида по любому из пп.1-7 или молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10 с одним или несколькими соединениями, предположительно обладающими аффинностью связывания с указанным полипептидом или молекулой нуклеиновой кислоты, и селекцию соединения, которое специфически связывается с указанной молекулой нуклеиновой кислоты или полипептидом.
49. Набор, используемый для диагностики заболевания, включающий первый контейнер, содержащий зонд нуклеиновой кислоты, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой
- 31 009607 кислоты по любому из пп.8-10; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации указанной молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для диагностики заболевания.
50. Набор по п.49, дополнительно включающий третий контейнер, содержащий агент для расщепления негибридизировавшейся РНК.
51. Набор, включающий массив молекул нуклеиновой кислоты, по крайней мере одной из которых является молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10.
52. Набор, включающий одно или несколько антител, связывающихся с полипептидом по любому из пп.1-7; и реагент, который может использоваться для определения реакции связывания между указанным антителом и указанным полипептидом.
53. Трансгенное или нокаутированное животное, не являющееся человеком, трансформированное для того, чтобы экспрессировать более высокие, более низкие уровни полипептида по любому из пп.1-7, или вообще не экспрессировать его.
54. Способ скрининга соединения, эффективного для лечения заболевания, предусматривающий контактирование животного по п.53 с соединением-кандидатом и определение эффективности указанного соединения для лечения заболевания у животного.
55. Способ по любому из пп.37-48 или 54, где указанное заболевание представляет собой одно из заболеваний, перечисленных в п.27.
EA200501843A 2003-05-21 2003-05-21 Tnf-подобный секретируемый белок EA009607B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/GB2003/002179 WO2004104040A1 (en) 2003-05-21 2003-05-21 Tnf-like secreted protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501843A1 EA200501843A1 (ru) 2006-06-30
EA009607B1 true EA009607B1 (ru) 2008-02-28

Family

ID=33462624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501843A EA009607B1 (ru) 2003-05-21 2003-05-21 Tnf-подобный секретируемый белок

Country Status (11)

Country Link
US (1) US7514533B2 (ru)
EP (1) EP1629008A1 (ru)
JP (1) JP2007527692A (ru)
CN (1) CN1816565A (ru)
AU (1) AU2003241006B2 (ru)
BR (1) BR0318307A (ru)
CA (1) CA2525181A1 (ru)
EA (1) EA009607B1 (ru)
IL (1) IL171895A0 (ru)
MX (1) MXPA05012414A (ru)
WO (1) WO2004104040A1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002022802A1 (en) * 2000-09-13 2002-03-21 Smithkline Beecham Corporation Novel compounds
WO2002066505A2 (en) * 2001-01-16 2002-08-29 Genset S.A. Gmg-3, gmg-4, and gmg-6 polynucleotides and polypeptides and uses thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
EP0388186A1 (en) * 1989-03-17 1990-09-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company External regulation of gene expression
US5252479A (en) * 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5362865A (en) * 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
EP0730663B1 (en) 1993-10-26 2003-09-24 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5693506A (en) * 1993-11-16 1997-12-02 The Regents Of The University Of California Process for protein production in plants
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
ES2332435T3 (es) 1997-06-04 2010-02-04 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector dirigido a tumores.
GB2347932B (en) 1998-11-18 2003-05-07 Oxford Biomedica Ltd Vectors for the delivery of 5T4 antigen
AU5129800A (en) 1999-05-11 2000-11-21 Incyte Genomics, Inc. Extracellular matrix and adhesion-associated proteins
GB0006153D0 (en) 2000-03-14 2000-05-03 Inpharmatica Ltd Database

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002022802A1 (en) * 2000-09-13 2002-03-21 Smithkline Beecham Corporation Novel compounds
WO2002066505A2 (en) * 2001-01-16 2002-08-29 Genset S.A. Gmg-3, gmg-4, and gmg-6 polynucleotides and polypeptides and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA05012414A (es) 2006-02-13
IL171895A0 (en) 2006-04-10
US20070155958A1 (en) 2007-07-05
EA200501843A1 (ru) 2006-06-30
CN1816565A (zh) 2006-08-09
US7514533B2 (en) 2009-04-07
AU2003241006A1 (en) 2004-12-13
AU2003241006B2 (en) 2011-03-24
JP2007527692A (ja) 2007-10-04
EP1629008A1 (en) 2006-03-01
WO2004104040A1 (en) 2004-12-02
CA2525181A1 (en) 2004-12-02
BR0318307A (pt) 2006-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2007010809A (es) Proteina lipocalina.
EA007985B1 (ru) Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен
EA013251B1 (ru) БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДОМЕНЫ vWFA И/ИЛИ ANT_IG
EA007813B1 (ru) Секретируемый белок
JP4999688B2 (ja) 細胞表面糖タンパク質
EA007611B1 (ru) Белок, имеющий в своей структуре цистиновые узлы
ES2352339T3 (es) Proteínas defensinas.
EA010405B1 (ru) Семейство секретируемых белков
US6849728B1 (en) GLUT10: a glucose transporter in the type 2 diabetes linked region of chromosome 20Q12-13.1
JP2005507638A (ja) ヒトｇタンパク質共役型受容体９３８７０およびその使用
ES2368072T3 (es) Receptor de proteínas similares a tgr3.
KR100971270B1 (ko) 이피에프 수용체 에세이, 화합물 및 치료학적 조성물
JPH11501817A (ja) ヒト臍静脈内皮細胞で発現されるヒアルロン酸レセプタ
EA009607B1 (ru) Tnf-подобный секретируемый белок
JP2005500012A (ja) 核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン
EA010420B1 (ru) Молекулы-антагонисты цитокинов
JP2003526369A (ja) 新規ポリヌクレオチドおよび同一物をコードする核酸
KR20050111346A (ko) 분비 단백질 계통
JPH1175866A (ja) マウスＦｒｉｚｚｌｅｄ−６ 遺伝子に類似したヒト７ＴＭ受容体
US20040213738A1 (en) CIRL3-Like proteins, nucleic acids, and methods of modulating CIRL3-L-mediated activity
US6998255B1 (en) Human G-protein coupled receptor
JP2002525117A (ja) Ｓｌｇｐタンパク質及び核酸分子並びにそれらの使用
JP2006526386A (ja) Ｉｌ−８様タンパク質
EP1458865A2 (en) Human vanilloid receptor protein and polynucleotide sequence encoding same
US20040161799A1 (en) KOR3like-proteins and methods of modulating KOR3L-mediated activity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU