EA003643B1 - Композиции, содержащие лактадгерин или его варианты, и способы их использования - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым способам и композициям, которые можно использовать в областях биологии, медицины и в экспериментах. Более конкретно настоящее изобретение относится к композициям и способам использования лактадгерина или его вариантов, или соответствующих нуклеиновых кислот для регулирования (т.е. индуцирования, ингибирования, стимуляции и т.д.) или контроля за иммунной реакцией, более конкретно ЦТЛ реакцией, а также для доставки молекул к дендритным клеткам in vitro, ex vivo или in vivo.

Description

Настоящее изобретение относится к новым способам и композиции, применимым в области биологии, медицины и в экспериментальных целях. Более конкретно настоящее изобретение относится к композициям и способам регулирования (т.е. индуцирование, ингибирование, стимуляция и т.д.) или контроля за иммунным ответом, более конкретно реакцией, опосредованной ЦТЛ, а также к способам доставки молекул к дендритным клеткам ίη νίίτο, ех νίνο или ίη νίνο.

Настоящее изобретение относится также к новым белкам, нуклеиновым кислотам и векторам и к их применению в обсуждавшихся выше областях, например, для перекрестного праймирования антигенов, фагоцитоза молекул дендритными клетками и т.д. Настоящее изобретение также относится к способам отбора молекул, способных регулировать реакцию, опосредованную ЦТЛ.

Распознавание антигена иммунной системой может осуществляться по различным механизмам. В частности, презентация антигенов хелперным Т-лимфоцитам требует процессинга указанных антигенов антиген-презентирующими клетками и их связывания с молекулами МНС класса II. Такое распознавание, по существу, приводит к стимуляции специфичных клонов В-лимфоцитов, которые затем вырабатывают антитела, специфичные по отношению к данному антигену.

С другой стороны, презентация антигена цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ) требует фагоцитоза антигена компетентными клетками (главным образом, дендритными клетками), причем эти клетки содержат подходящие молекулы МНС класса I и способны стимулировать антиген-специфичные ЦТЛ. Это явление, которое носит название перекрестные презентации антигенов или перекрестного праймирования ЦТЛ, наблюдается, например, для вирусных или опухолевых антигенов, а также для антигенов, содержащих апоптотические тельца (образующиеся в результате вирусной инфекции, опухолей, дегенерации клеток или превращений нормальных клеток и т.д.).

Поэтому перекрестная презентация антигенов является основным путем элиминации антигенов, которые связаны с патологическими состояниями. Способность индуцировать или способствовать перекрестному праймированию антигенов ίη νίνο или ίη νίίτο обеспечила бы весьма эффективный подход к лечению таких патологических состояний.

Как было указано выше, перекрестное праймирование антигенов обязательно требует фагоцитоза дендритными клетками корпускулярных антигенов, т. е. антигенов, включенных в тельца, включающие, например, липиды, такие как фосфатидилсерин. Такие корпускулярные антигены включают, например, апоптотические тельца, пузырьки или клеточные мембраны.

Изобретение относится к идентификации соединения, участвующего в фагоцитозе корпускулярного антигена дендритными клетками. Более конкретно, настоящее изобретение относится к идентификации соединения, которое опосредует взаимодействие между корпускулярными антигенами и дендритными клетками, и выполняет функцию адаптера перекрестного праймирования.

Настоящее изобретение также относится к новым композициям, включающим молекулу, связанную с определенным выше адаптером или его вариантом.

Настоящее изобретение может применяться для регуляции иммунного ответа, в частности, для ослабления иммунного ответа или наоборот для облегчения (усиления) иммунного ответа на определенный антиген. Настоящее изобретение относится также к новым векторам (таким как белки или липосомы), которые могут применяться для доставки выбранной молекулы к дендритной клетке. Настоящее изобретение относится также к способам отбора соединений, которые могут регулировать перекрестное праймирование антигенов или доставку антигенов к дендритным клеткам, а также к способам контроля за иммунным ответом у субъекта.

Антиген-презентирующие клетки (АПК) включают фрагменты схемы эндоцитоза, включая мультивезикулярные тельца (МВТ), которые являются сайтами связывания антигенных белков с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II. Эти комплексы распознаются Т-лимфоцитами. В частности, было показано, что ЕВУ-трансформированные В-лимфоциты (В-ЕВУ) секретируют такие пузырьки, называемые экзосомами (Ραροχο е! а1., Μο1. Βίο1. Се11 8 (1997) 2619). Полученные из ВЕВУ экзосомы содержат комплексы пептидМНС класса II и способны представлять их непосредственно СЭ4+Т лимфоцитам (Κηροκο е! а1., 1997). Позднее были описаны пузырьки, секретируемые другими антиген-презентирующими клетками, дендритными клетками (ДК) (ΖίΙνο^Ι е! а1., Ыа1иге МеФсше 4 (1998)594). ДК являются единственными АПК, способными вызывать первичный и вторичный иммунные ответы. Чтобы осуществить это, они выработали значительный ряд специфических свойств, которые и делают их уникальными АПК. ДК существуют в двух состояниях зрелости: незрелые ДК эффективны в отношении эндоцитоза антигена и фагоцитоза, но не эффективны в отношении активации Т-клеток, тогда как зрелые ДК отрицательно регулируют их способность к интернализации, но экспрессируют высокие уровни МНС и костимулирующих молекул, что делает их чрезвычайно эффективными в отношении активации Т-клеток.

Полученные из ДК экзосомы накапливают МНС класса II и несут также молекулы МНС класса I. Продуцируемые ДК экзосомы, будучи экспонированы опухолевым антигенным пептидом, вызывают мощные иммунные реакции, приводящие к отторжению образовавшихся опухолей (Ζίΐνοβοί е! а1., 1998). Хотя механизмы этих наблюдаемых противоопухолевых эффектов до сих пор не известны, эффективность опосредованной экзосомами имунной стимуляции позволяет предположить, что эти пузырьки действительно могут физиологически опосредовать активацию реакции Т-клеточного ответа.

Пытаясь понять молекулярные основы эффектов, полученных из ДК экзосом, на иммунную систему, заявители определили условия их продуцирования ДК и проанализировали их белковый состав. Полученные результаты показывают, что секретирование экзосом отрицательно модулируется по созревании ДК и что экзосомы концентрируют ограниченное количество белков. В частности, помимо молекул МНС класса II, был идентифицирован один основной адгезионный и направляющий мембранный белок, который ведет себя как молекулярный эффектор воздействия экзосом на иммунную систему, и его функция состоит в направлении экзосом к клеточной мишени ίη νίνο.

Более конкретно, настоящее изобретение показывает, что лактадгерин (известный также как МБО-Е8) продуцируется дендритными клетками, экспонируется на поверхности экзосом и участвует в фагоцитозе корпускулярных антигенов дендритными клетками. Настоящее изобретение также относится к вариантам лактадгерина, которые ведут себя как конкуренты лактадгерина и могут применяться для ингибирования фагоцитоза корпускулярных антигенов дендритными клетками. Настоящее изобретение также относится к новым способам доставки молекул к дендритным клеткам с использованием векторов, полученных из лактадгерина или его вариантов.

Зрелый человеческий лактадгерин представляет собой белок из 364 аминокислот. Кроме того, лактадгерин является секреторным белком и включает сигнал секреции. 8ЕО ГО N0: 1 представляет аминокислотную последовательность человеческого лактадгерина. Остатки 1-23 (подчеркнуты) представляют собой сигнал секреции, а остатки 24-387 представляют собой первичную структуру зрелого секретированного белка.

Были также идентифицированы, выделены и секвенированы мышиный, бычий и свиной лактадгерины (см., например, 81иЬЬк е! а1., ΡΝΆ8 87 (1990) 8417; Нуаггедаагб е! а1., Еиг. б.ВюсЬеш. 240 (1996) 628). Последовательность мышиного лактадгерина представлена также в 8Е0 ГО N0: 3. Аминокислотные остатки 1-22 представляют сигнал секреции, а остатки 23-463 представляют первичную структуру зрелого секретированного белка. Остатки 111-147 удалены в сплайсинговых вариантах мышиного лактадгерина.

Исходно лактадгерин был описан на поверхности глобул молочного жира (см. 81иЬЬк е! а1., кирга). Кроме того, этот белок был обнаружен до сих пор главным образом в тканях млекопитающих и в культивируемых эпителиальных клетках млекопитающих. В литературе в отношении лактадгеринов не сообщалось о каких-либо функциях, помимо их присутствия во время лактогенеза.

Настоящее изобретение обеспечивает доказательство того, что лактадгерин селективно продуцируется дендритными клетками, более конкретно, незрелыми дендритными клетками, экспонируется на поверхности антигенных пузырьков и функционирует как адаптер антигенной перекрестной презентации ЦТЛ. Поэтому настоящее изобретение относится к композициям и способам использования лактадгерина или его вариантов для опосредования иммунного ответа. Настоящее изобретение относится также к вариантам лактадгерина, которые можно использовать для ингибирования перекрестного праймирования, или для доставки антигенов к антиген-презентирующим клеткам, в частности, к дендритным клеткам. Настоящее изобретение относится также к композициям, включающим лактадгерин или его варианты с выбранными молекулами, в частности, гибридными молекулами и/или липосомами, включающими рекомбинантные молекулы лактадгерина.

Более конкретно целью настоящего изобретения является применение лактадгерина или его вариантов для регулирования иммунной реакции ίη νίΐτο, ех νίνο или ίη νίνο. Конкретной целью изобретения является использование лактадгерина или его вариантов для получения композиции для регулирования иммунного ответа, в частности, ЦТЛ-реакции. Другой конкретной целью изобретения является применение лактадгерина или его вариантов для ингибирования перекрестного праймирования антигенов, в частности, фагоцитоза антигенов дендритными клетками.

Лактадгерин содержит несколько функциональных доменов. В частности, лактадгерин включает два ЕОБ-подобных домена с ВСЭпоследовательностью, которая участвует в связывании с интегрином. Интегрин (более конкретно интегрин (ανβ5)) присутствует на поверхности дендритных клеток, и этот участок лактадгерина участвует во взаимодействии этого белка с дендритными клетками. Кроме того, по-видимому, это взаимодействие является селективным. Лактадгерин содержит также домен, гомологичный С-концевой области человеческих факторов коагуляции VIII и V, который представляет сайт связывания фосфолипидов и, в частности, фосфатидилсерина.

В настоящем изобретении постулируется и раскрывается, что лактадгерин взаимодействует с корпускулярными антигенами за счет сайтов связывания фосфолипидов и с дендритными клетками за счет ΚΌΌ домена, и таким образом опосредует фагоцитоз указанных корпускулярных антигенов.

Целью настоящего изобретения является применение лактадгерина или его вариантов, более конкретно человеческого лактадгерина или его вариантов, для образования цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных по отношению к выбранному антигену.

Другой целью настоящего изобретения является применение лактадгерина или его вариантов, более конкретно человеческого лактадгерина или его вариантов, для доставки антигена к дендритным клеткам.

В контексте настоящего изобретения лактадгерин означает белок млекопитающего, экспрессированный на поверхности глобул молочного жира, и включающий ΚΌΌ-сайт и домен, гомологичный С-концевой области фактора VIII (т.е. домен, подобный фактору VIII). Более конкретно, белок может быть человеческим, бычьим, мышиным или свиным, предпочтительно человеческим. В конкретном осуществлении под лактадгерином подразумевается человеческий лактадгерин, содержащий 8 Ер ГО N0: 1 или любой ее функциональный аналог. Термин функциональные аналоги означает природные аналоги, образующиеся, например, в силу полиморфизма или в результате пост-трансляционных модификаций, в частности, в результате сплайсинга (сплайсингов) или делеции, замещения или добавления отдельной аминокислоты, по сравнению с 8ЕР ГО N0: 1, и которые сохраняют, по крайней мере, одно функциональное свойство человеческого лактадгерина. Функциональные аналоги включают также лактадгерин других видов, в частности, мышиный лактадгерин 8ЕР ГО N0: 3.

Используемый в соответствии с настоящим изобретением лактадгерин может быть либо выделен из природных источников, либо получен с помощью технологий рекомбинантных ДНК, что будет описано далее в качестве примера.

Термин вариант лактадгерина в контексте настоящего изобретения означает искусственный белок, т.е. белок, созданный искусственным путем и который не встречается в природе как таковой. Такие варианты обычно сохраняют, по крайней мере, одно биологическое свойство лактадгерина, например свойство связывания лактадгерина, и обычно включают одно или несколько следующих изменений в первичной структуре:

(а) делецию одного или нескольких аминокислотных остатков, более предпочтительно нескольких последовательных аминокислотных остатков. В предпочтительном осуществлении делегированный вариант включает делецию нескольких аминокислотных остатков, которые перекрываются, по крайней мере, частично с доменом лактадгерина, участвующим в связы вании фосфолипидов (ФЛ), в частности фосфатидилсерина (ФС) и/или интегрина. Делеция может включать до 250 аминокислот, предпочтительно, например, до 200 аминокислот. Кроме того, в одном варианте могут быть осуществлены несколько делеций;

(b) мутацию по одному или нескольким аминокислотным остаткам, более предпочтительно, по крайней мере, по одному аминокислотному остатку, входящему в лактадгериновый сайт связывания ФС или интегрина. Мутация (мутации) может быть консервативной или неконсервативной. Предпочтительно, чтобы мутация (мутации) в сайте связывания делала (делали) сайт связывания нефункциональным. Более предпочтительно, чтобы вариант по настоящему изобретению включал от 0 до 10 точечных мутаций, еще более предпочтительно от 0 до 5;

(c) добавление одного или нескольких аминокислотных остатков. Добавляемые остатки предпочтительно расположены на Ν-или Сконцах варианта, хотя могут быть добавлены и внутренние остатки. Добавленные остатки могут иметь различные функции. Например, они могут представлять собой метки, которые можно использовать в способе очистки (С8Т. тус и т. д.). Добавленные остатки могут быть также адаптерами, которые можно использовать для связи варианта с выбранной молекулой, такой как антиген, нуклеиновая кислота, рецептор или мембранный липид. Такие адаптеры могут представлять собой, например, полилизин или другие основные аминокислоты, спейсер или любой другой ДНК-связывающий мотив. Адаптер может быть также сигналом направленной миграции, таким, например, как трансмембранный домен белка или липида. Кроме того, добавленные остатки могут также представлять выбранную молекулу, слитую с лактадгерином, что будет обсуждаться далее более подробно.

Кроме того, как было указано выше, варианты по настоящему изобретению могут объединять одну или несколько модификаций одного или нескольких указанных выше типов.

Конкретным вариантом лактадгерина по настоящему изобретению является вариант, не содержащий функциональный сайт связывания ФЛ (в частности, функциональный сайт связывания ФС) и/или функциональный сайт связывания интегрина.

Варианты, не содержащие функциональный сайт связывания ФЛ, практически не способны связывать фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин. Однако такие варианты могут сохранять функциональный сайт связывания интегрина и поэтому вести себя как конкуренты нативного лактадгерина. Варианты, не содержащие функциональный сайт связывания ФЛ (т. е. фосфатидилсерина), могут быть получены различными способами. В конкретном воплощении указанные варианты не содержат ни одного или часть сайтов связывания фосфатидил серина (ФС). В другом конкретном воплощении такие варианты содержат мутированный сайт связывания ФС. Естественно, варианты по настоящему изобретению могут также включать как делеции, так и мутации в сайте связывания ФС. Сайт связывания фосфатидилсерина лактадгерина расположен, по существу, в Сконцевых аминокислотных остатках лактадгерина, более конкретно, в 150 С-концевых аминокислотных остатках. Поэтому вариантом по настоящему изобретению может быть любой вариант лактадгерина, содержащий мутацию и/или делецию в 150 С-концевых аминокислотных остатках, и, по существу, не способный связываться с фосфатидилсерином. Более предпочтительным вариантом является полипептид, включающий ЗЕР ΙΌ N0: 1, причем указанная последовательность включает далее мутацию и/или делецию в любом из аминокислотных остатков 242-387.

В конкретном осуществлении настоящего изобретения вариант включает делецию, по крайней мере, 5, предпочтительно, по крайней мере, 10, еще более предпочтительно, по крайней мере, 20 последовательных аминокислот вышеуказанной С-концевой области. В конкретном воплощении делеция охватывает все 150 С-концевых аминокислотных остатков, более предпочтительно аминокислотные остатки 242-387 ЗЕР ΙΌ N0:1. Другим конкретным воплощением настоящего изобретения является лактадгерин без 25 С-концевых аминокислот, в частности полипептид, включающий аминокислотные остатки 24-363 ЗЕР ΙΌ N0:1, или полипептид, включающий аминокислотные остатки 23-439 ЗЕР ΙΌ N0: 3.

Примеры мутаций включают любую супрессию или замену одного или нескольких отдельных аминокислотных остатков в 150 Сконцевых аминокислотах лактадгерина. Замена может быть либо консервативной, либо неконсервативной, предпочтительно неконсервативной.

Конкретные примеры мутантных вариантов по настоящему изобретению включают любой лактадгерин, содержащий одну или несколько точечных мутаций в 25 С-концевых аминокислотах и, по существу, не способный связываться с ФС. Более конкретными примерами являются полипептиды ЗЕР ΙΌ N0: 2 или 4, содержащие одну или несколько точечных мутаций в 25 С-концевых аминокислотах.

Данные варианты по настоящему изобретению особенно интересны, так как они способны к связыванию с интегрином ανβ5, т.е. с дендритными клетками, более предпочтительно с незрелыми (человеческими) дендритными клетками, причем они практически не способны связываться с ФС. Эти варианты особенно удобны для доставки молекул к дендритным клеткам, в частности, для доставки молекул антигенов к дендритным клеткам. Эти варианты могут также способствовать перекрестному представлению выбранного антигена дендритными клетками и тем самым вызывать специфичный ЦТЛ-ответ против выбранной молекулы антигена.

Варианты лактадгерина, не содержащие функционального сайта связывания интегрина, практически не способны к эффективному связыванию с дендритными клетками. Такие полипептиды могут представлять собой любые варианты лактадгерина, не содержащие ни одного или часть сайта связывания интегрина, или которые содержат мутантный сайт связывания интегрина. Сайт связывания интегрина лактадгерина, по существу, находится в КПО-мотиве, расположенном в ^концевой части молекулы. Например, сайт связывания интегрина человеческого лактадгерина ЗЕр ΙΌ N0: 1 расположен в остатках 46-48, а сайт связывания интегрина мышиного лактадгерина ЗЕр ΙΌ N0: 4 расположен в остатках 87-89. Поэтому настоящее изобретение относится к любому лактадгерину, включающему мутацию и/или делецию в ВСЭмотиве/или ВСЭ-мотива. и который практически не способен связываться с дендритными клетками. Конкретные примеры таких вариантов представляют собой полипептиды ЗЕр ΙΌ N0: 1, в которых отсутствует один, два или все аминокислотные остатки ВСЭ в положении 4648, и полипептиды ЗЕр ΙΌ N0: 4, в которых отсутствует один, два или все аминокислотные остатки ВСЭ в положении 87-89.

Такие варианты можно использовать, например, чтобы помешать перекрестному праймированию антигенов ίη νίίτο, ех νίνο или ίη νίνο, путем конкуренции с нативным лактадгерином за связывание с корпускулярными антигенами. Другие типы ингибиторов представлены полипептидами, включающими главным образом сайт связывания фосфолипида лактадгерина, например, пептидами, включающими аминокислотные остатки 364-385 ЗЕр ΙΌ N0: 1 или их вариантами. Другие ингибиторы представлены антителами, специфичными для лактадгерина, в частности лактадгерина ФЛ, или для сайтов связывания интегрина. Такие антитела (либо поликлональные, либо моноклональные) могут быть выработаны в результате иммунизации животного соответствующими пептидами и использованы для ослабления иммунного ответа.

Соответственно, целью настоящего изобретения является также вариант лактадгерина, в котором отсутствует функциональный сайт связывания ФЛ или интегрина.

Вышеуказанные варианты можно получить в соответствии с обычными методиками, известными специалистам, и раскрытыми более подробно в примерах. Например, их можно получить с помощью технологии рекомбинантных ДНК, исходя из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей лактадгерин. Более конкретно конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирую щую лактадгерин, как определено выше, можно получить и модифицировать в соответствии с обычными методиками для введения в нее мутации (мутаций) и/или осуществления в ней делеции (делеций). Такие методики включают расщепление рестрикционными ферментами и/или экзонуклеазами, лигирование, сайтнаправленный мутагенез, амплификацию, синтез искусственных нуклеотидов и т.п. Такие модификации можно осуществить ίη νίίτο, на выделенной нуклеиновой кислоте, обычно полученной или реплицированной в компетентной клетке-хозяине, такой как эукариотическая клетка или прокариотическая клетка, или полученной в результате амплификации со специфическими праймерами, например, из дендритной клетки. В этой связи настоящее изобретение относится также к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, как определено выше. Указанная нуклеиновая кислота может быть молекулой ДНК или РНК, или синтетической нуклеиновой кислотой. Настоящее изобретение относится также к любому вектору, включающему нуклеиновую кислоту, как определено выше. Такими векторами могут быть плазмиды, космиды, эписомы, УАС8, вирусные векторы и т.д. Предпочтительные векторы включают также промоторный участок, который вызывает экспрессию нуклеиновой кислоты, так же как, необязательно, сигнал терминации транскрипции (т.е. последовательность полиаденилирования). Конструкцию таких векторов и выбор промоторного участка может быть сделан специалистом в соответствии с обычными методиками и рутинными экспериментами. На практике вектор может быть плазмидой, полученной из риС, р1С, рВР или рВ8, или вирусным вектором, полученным, например, из ретровирусов, аденовирусов или АЛУ. Настоящее изобретение относится также к клетке, включающей нуклеиновую кислоту или вектор, как определено выше, и к ее использованию, например, для получения вариантов, как определено выше. Рекомбинантная клетка по настоящему изобретению может быть прокариотической (такой как бактерия) или эукариотической (такой как дрожжевая клетка, клетка млекопитающего, клетка насекомого и т.д.). Указанные клетки можно получить обычными способами (электропорацией, осаждением, с помощью генной пушки, опосредованной липидом трансфекции и т.д.).

Другой целью настоящего изобретения является композиция, включающая вариант лактадгерина без функционального сайта связывания ФЛ или интегрина. Такую композицию можно использовать, например, для модуляции перекрестного праймирования антигенов.

Конкретной целью настоящего изобретения является композиция, включающая лактадгерин или его вариант, связанный с выбранной молекулой.

И конечно, настоящее изобретение относится к использованию лактадгерина или его вариантов для доставки молекул к дендритным клеткам.

В этой связи любую выбранную молекулу можно связать с лактадгерином или его вариантом, как определено выше, для доставки указанной молекулы к дендритным клеткам ίη νίίτο, ех νίνο или ίη νίνο, и/или для того, чтобы вызвать ЦТЛ реакцию. Выбранную молекулу можно связать с лактадгерином или его вариантом различным образом, ковалентно или нековалентно. Ковалентную связь (связывание) можно осуществить, используя любые химические, ферментативные или генетические методики. На практике химическое присоединение можно осуществить, используя обычные химические адаптеры и/или реакции, в частности, используя амидные, аминные или кислотные связи с использованием спейсеров, таких как карбонилдиимидазол и т.п., или без них.

Химическое присоединение можно также осуществить, используя систему стрептавидин/биотин или любой другой аналогичный способ.

Один конкретный способ присоединения выбранной молекулы к лактадгерину включает рекомбинантные ДНК-конструкции (т.е. генетическое связывание). В этой связи можно получить химерную нуклеиновую кислоту, включающую участок, кодирующий лактадгерин или его вариант, и участок, кодирующий выбранный полипептид, оперативно связанные друг с другом, т. е. в одной и той же рамке считывания, так что после экспрессии в клетке хозяина получают гибридный (химерный) белок. Выбранный полипептид (или пептид) можно слить с лактадгерином или его вариантом в Ν-концевом или в С-концевом положении. Предпочтительно, выбранный полипептид или пептид (т.е. гетерологичный фрагмент) слить по С-концу лактадгерина или его варианта в соответствии с настоящим изобретением.

Соответственно конкретной целью настоящего изобретения является химерный белок (или полипептид), включающий лактадгерин или его вариант, слитый с гетерологичным полипептидом или фрагментом.

Другой конкретной целью настоящего изобретения является продукт, включающий лактадгерин или его вариант, связанный с гетерологичной молекулой. Как было указано выше, связь может быть ковалентной или нековалентной.

Кроме того, так как лактадгерин опосредует фагоцитоз корпускулярных антигенов, настоящее изобретение также относится к искусственным липосомам (или липидным пузырькам), включающим лактадгерин (предпочтительно рекомбинантный) или его варианты, как раскрыто выше.

Лактадгерин может быть связан с поверхностью липосомы по его сайту связывания ФЛ. В этом варианте искусственная липосома по настоящему изобретению предпочтительно включает, по крайней мере, фосфатидилсерин как составляющий липид. Лактадгерин или его вариант может быть связан с липосомной мембраной через рецепторный фрагмент, способный связывать лигандный фрагмент, присутствующий в мембране липосомы. В частности, как указано выше, можно получить вариант лактадгерина, который включает дополнительные остатки или структуру, которые обеспечат связывание указанного варианта лактадгерина с выбранным рецептором или лигандом. В конкретном варианте вариант лактадгерина включает пептид, который связывает рецептор, присутствующий на липосомной мембране. Такой пептид может быть биотином, который связывается со стрептавидином, введенным в липосомную мембрану.

В другом конкретном варианте лактадгерин или его вариант заключен в мембрану липосомы. Такое включение (закрепление) можно осуществить, в частности, используя вариант лактадгерина, включающий якорный участок, например, такой как трансмембранный домен. Такой якорный участок можно ввести в вариант как добавленный остаток в дополнении к остаткам лактадгерина или в качестве замены его остатков, и в частности, в качестве замены сайта связывания ФЛ. Вставку можно осуществить, используя вариант лактадгерина, содержащий липид с одного из его концов, предпочтительно с С-конца, способами, известными специалистам. В этом конкретном варианте липид (т.е. жирную кислоту) связывают с С-концом лактадгерина или его варианта, обладающего способностью связывать интегрин, используя обычные методики, и полученный продукт подвергают контакту с липосомой.

Таким образом, настоящее изобретение относится также к любой композиции липидных пузырьков, включающей рекомбинантный белок, содержащий, по крайней мере, сайт связывания интегрина лактадгерином, более конкретно человеческим лактадгерином. Липидные пузырьки можно получить известными способами. Например, осуществляют контактирование выбранных липидов в подходящей среде для образования липидных бислоев и пузырьков. Лактадгерин или его варианты можно добавить к продукту до, во время или после образования искусственных липосом. Кроме того, искусственные липосомы включают экзосомы, продуцируемые клетками, которые включают рекомбинантные молекулы лактадгерина.

Настоящее изобретение относится также к полипептиду, содержащему (а) аминокислотную последовательность лактадгерина без функционального сайта связывания ФЛ, и (Ь) гетероло гичный фрагмент, позволяющий закрепить указанный полипептид в липидной мембране.

Выгодно также, чтобы композиции липосом по настоящему изобретению включали далее, по крайней мере, одну выбранную молекулу, такую как антиген. Такой выбранной молекулой может быть липид, полипептид, нуклеиновая кислота, химическая молекула и т.д.

Предпочтительно, чтобы выбранной молекулой был полипептид (такой как любой белок, пептид и т.д.) или нуклеиновая кислота. В этой связи настоящее изобретение относится также к полипептиду, включающему (а) аминокислотную последовательность лактадгерина без функционального сайта связывания ФЛ, и (Ь) гетерологичный фрагмент, позволяющий связать указанный полипептид с нуклеиновой кислотой. Такой полипептид способен образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами, такими как, например, плазмиды, и направлять указанные нуклеиновые кислоты к дендритным клеткам ίη νίίτο, ех νίνο или ίη νίνο. Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей первичную структуру вышеуказанного полипептида.

Еще более предпочтительно, чтобы молекулой был антиген, т.е. соединение, против которого желательна выработка иммунной реакции, особенно ЦТЛ реакции, цитокин (такой как 1Ь12, 1Ь4, 6М-С8Е и т.д., которые могут, например, стимулировать активацию и/или дифференцировку дендритных клеток) или токсичная молекула, которую можно использовать для исключения дендритных клеток.

Примеры молекул антигенов включают, например, вирусные белки или пептиды, белки бактерий или пептиды, или опухолевые антигены, такие как МАЯТ-1, МАСЕ, ВАСЕ, Р8А, р53, ЯЬ, Яак и т.д. Антигены могут быть интактными (т. е. целыми белками) или могут быть в форме их фрагментов.

Предпочтительным вариантом настоящего изобретения является иммуногенная композиция, включающая лактадгерин или его вариант в связи с выбранной молекулой антигена. Вакцины иммуногенных композиций по настоящему изобретению можно использовать в применении к млекопитающим, таким как человек или животные.

Антигенной молекулой может быть любой белок, полипептид или пептид, содержащий один или несколько эпитопов, вирус, фрагмент вируса, вирусный белок, полипептид или пептид, бактерия и т. д. Кроме того, вирус или бактерия могут быть инактивированы или ослаблены (т.е. обладать низкой инфекционной способностью или патогенностью). Вирус или бактерия могут представлять сам антиген или носитель антигена. В конкретном варианте настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей вирус или бактерию, где указанный вирус или бактерия экспрессиру ет лактадгерин или его вариант на своей поверхности. Лактадгерин или его вариант могут быть экспрессированы в результате химического, генетического, ферментативного или нековалентного присоединения.

В конкретном варианте настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу, где указанный рекомбинантный вирус экспрессирует лактадгерин или его вариант как молекулу на поверхности. Вирусом может быть любой вирус, ретровирус, аденовирус, АЛУ, герпесвирус и т. д. Лактадгерин или его вариант могут быть, например, экспрессированы как генетический гибрид с оболочковым белком. Рекомбинантный вирус может включать далее рекомбинантный геном, кодирующий белок, полипептид или пептид, включая иммуногенную или иммуностимулирующую молекулу.

В другом конкретном варианте настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке, причем указанная рекомбинантная клетка экспрессирует лактадгерин или его вариант как молекулу на поверхности. Более предпочтительно, чтобы рекомбинантная клетка была получена из патогенных бактерий. Эти рекомбинантные бактерии представляют таким образом усовершенствованные иммуногенные композиции, которые можно использовать для вызова эффективных иммунных ответов ίη νίνο или ίη νίΐΓο, особенно эффективных ЦТЛ-реакций. Рекомбинантные клетки можно получить в результате экспрессии в указанных клетках нуклеиновой кислоты, кодирующей лактадгерин или его вариант, необязательно связанной с сигнальным пептидом, обеспечивающим закрепление молекулы в клеточной мембране. Лактадгерин или его вариант могут также быть экспрессированы в результате контактирования клеток ίη νίΐτο с лактадгерином или его вариантом.

В этой связи настоящее изобретение относится также к гибридному полипептиду, включающему (а) аминокислотную последовательность лактадгерина без функционального сайта связывания ФЛ, слитому с (Ь) антигенным полипептидом или пептидом. Настоящее изобретение относится также к любой нуклеиновой кислоте, кодирующей такой гибридный полипептид. Указанные полипептиды и нуклеиновые кислоты можно использовать для получения композиций вакцин, в частности, композиций противоопухолевых вакцин, которые можно вводить в той форме, в какой они есть, например, с помощью внутримышечных инъекций.

Выбранная молекула может быть представлена в цитозоле липосомы и/или может быть закреплена в ее мембране и/или связана с поверхностью указанной липосомы. Выбранная молекула может быть объединена с указанной липосомой обычными способами, как было указано выше, в частности, за счет инкубирования молекулы с составляющими липидами до или во время формирования липосомы.

Настоящее изобретение относится также к рекомбинантным клеткам-хозяевам, в частности к рекомбинантным бактериям, которые экспрессируют лактадгерин или его вариант. Более предпочтительно, чтобы рекомбинантные бактерии экспрессировали лактадгерин или его вариант, обладающие способностью связывать интегрин. Введение в бактерию, например, рекомбинантного лактадгерина или его варианта позволяет обеспечить захват фракций бактериальных мембран дендритными клетками, и обеспечить эффективную выработку иммунных ответов, например, против бактериальных антигенов.

Композиции, варианты, химерные белки или липосомы по настоящему изобретению можно использовать ίη νίΐτο, ех νίνο или ίη νίνο. Ιη νίΐτο их можно использовать, например, чтобы направить или сенсибилизировать дендритные клетки, например, к нужной молекуле. В этом плане в настоящем изобретении обсуждается также способ доставки молекулы к дендритным клеткам, предпочтительно к незрелым дендритным клеткам, ίη νίΐτο, ех νίνο или ίη νίνο, включающий осуществление контакта указанной дендритной клетки (или популяции клеток, включающей дендритную клетку) с соединением, композицией или гибридным белком, как определено выше. Этот способ можно осуществить в любом подходящем приспособлении (планшете, чашке, ампуле, колбе и т.д.) при концентрации лактадгерина или его варианта в интервале от 0,01 до 1000 мкг/мл.

Варианты лактадгерина можно также использовать для того, чтобы направить любое соединение к дендритным клеткам, ίη νίΐτο, ех νίνο или ίη νίνο. Например, описанные выше варианты лактадгерина, содержащие функциональный сайт связывания интегрина, можно использовать для направления вектора (такого как вирусный, полимерный, катионный или полипептидный вектор) к дендритным клеткам. Конкретные примеры включают рекомбинантные аденовирусы. Поэтому настоящее изобретение относится к использованию лактадгерина или его варианта, содержащих функциональный сайт связывания интегрина, для направления вектора (такого как вирусный, полимерный, катионный или полипептидный вектор) к дендритным клеткам. В настоящем изобретении раскрыта также композиция, включающая вектор, связанный с лактадгерином или его вариантом.

Композиции, варианты, химерные белки или липосомы по настоящему изобретению можно также использовать ίη νίΐτο в способе скринирования и/или идентификации соединений, которые могут регулировать перекрестное праймирование антигенов и/или фагоцитоз антигенов и/или доставку молекул к дендритным клеткам. В частности, дендритные клетки можно подвергнуть контактированию с композициями, вариантами, химерными белками или липосомами по настоящему изобретению в присутствии предполагаемого продукта-кандидата или смеси, и определить способность указанного продукта-кандидата или смеси ингибировать или облегчать захват (или связывание) указанной композиции.

Настоящее изобретение относится также к способу скринирования (существенно ίη νίίτο) соединений, обладающих способностью индуцировать или ингибировать экспрессию лактадгерина. В этой связи в настоящем изобретении предложен способ, включающий (ί) осуществление контакта тестового соединения (или смеси) с культурой клеток, продуцирующих сравнительный уровень лактадгерина, (ίί) измерение количества лактадгерина, продуцируемого указанной культурой клеток, и (ш) сравнение указанного количества со сравнительным уровнем. Культура клеток может быть, например, дендритными клетками, предпочтительно, стабильной линией дендритных клеток. Дозу лактадгерина можно подобрать в соответствии с обычными методиками, такими как иммуноанализ с использованием специфических антител, РСК. и т.д. Соединения, способные усиливать экспрессию лактадгерина, можно использовать для стимуляции иммунитета субъекта, в частности, ЦТЛ-реакции субъекта.

Настоящее изобретение относится также к меченым композициям или вариантам, как раскрыто выше, и к их использованию для контроля за иммунным ответом. В частности, настоящее изобретение можно использовать для определения присутствия экзосом в биологическом образце и для корреляции уровня экзосом до физиологического состояния субъекта. Способ определения включает, например, отбор образца (такого как образец крови субъекта) , контактирование указанного образца с композицией, включающей лактадгерин или его вариант, обладающие способностью связывать интегрин, и определение присутствия (и необязательно количества) экзосом, связанных с указанным лактадгерином или его вариантом. Диагностика высоких уровней экзосом в биологическом образце может быть скоррелирована с патологическим состоянием, при котором экзосомы продуцируются, например, дендритными клетками (таким как опухоль, инфекция и т.д).

Ιη νίνο настоящее изобретение можно использовать для регулирования иммунного ответа, для доставки молекул к дендритным клеткам, регулирования фагоцитоза антигенов и/или для перекрестного праймирования антигенов, а также для контроля за иммунным ответом. В частности, настоящее изобретение относится также к использованию лактадгерина, предпочтительно человеческого лактадгерина, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, для стимуляции иммунного ответа у субъекта. В частности, введение человеческого лактадгерина или кодирующей его нуклеиновой кислоты субъекту, у которого имеется опухоль, должно повысить иммунный ответ указанного субъекта на опухоль. Для такого конкретного применения предпочтительно внутримышечное введение.

Для ίη νίνο применений можно использовать обычные дозы, адаптированные специалистами. Предпочтительно для использования ίη νίνο вводить композиции путем инъекций, таких как, например, внутривенные, внутриартериальные, внутрибрюшинные, подкожные, внутримышечные. Их можно также вводить любыми другими способами. Предпочтительно приготавливать их с соответствующими приемлемыми носителями, такими как буферы (фосфат, калий, хлорид и т. д), изотонические растворы, физиологические растворы, в соответствующих дозах, таких как, например, от 0,1 до 10000 мкг белка в единичной дозовой форме. Композиции могут также включать стабилизирующие агенты (такие как добавки, высокомолекулярные молекулы, т.е. альбумин, декстран и т.д), поверхностно-активные агенты и т.д.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут раскрыты в следующих примерах, которые следует рассматривать только как иллюстративные и никак не ограничительные.

Описание чертежей

Фиг. 1 - полный состав белка метаболически меченых экзосом и Ό1 клеток.

Экзосомы, выделенные из надосадочной жидкости метаболически меченых Ό1 клеток, обрабатывают с помощью 12% δΌδ-геля (Εχοδ), вместе с лизатом (включая как цитолитические, так и мембранные компоненты), полученным из целых клеток (Се1к), или с цитозолем (СуЮ). или с полными мембранами (шЬ), полученными из тех же клеток в отсутствии детергента. Высушенный гель обрабатывают с помощью авторадиографии в течение 24 ч (белки более 45 кДа) или 48 ч (белки менее 45 кДа). Картину максимумов для каждой полосы получают с помощью программного обеспечения И1Н1таде. Звездочками отмечены белки, присутствующие в достаточном количестве в клетках и отсутствующие в экзосомах, точками отмечены белки, которыми обогащены экзосомы.

Фиг. 2 - картина для белков в Ό1 экзосомах, выявленная окрашиванием кумасси синим.

мкг экзосом выделяют с помощью 815% градиентного δΌδ-геля и окрашивают кумасси ярко-синим. Характер полосы идентичен полосе, полученной с помощью метаболически меченых экзосом. Основные полосы (1-11) анализируют, расщепляя трипсином и с помощью ΜΑΌΌΙ-ΤΟΕ (см. табл. 1).

Фиг. 3 - анализ с помощью вестернблоттинга экспрессии лактадгерина в экзосомах, полученных из мышиных ДК. Значительная иммунореактивность была обнаружена для сыворотки А для экзосом, полученных из ДК, но не для полных клеточных лизатов. Промежу17 точная реактивность наблюдалась для экзосом, полученных из опухолевых клеток (Т8/А, карцинома клеток молочной железы), или для выделенных мембранных препаратов из ДК. Аннексия-специфические антитела реагируют со всеми экзосомными препаратами и клеточными лизатами.

Фиг. 4 - РАСксап анализ экспрессии лактадгерина для экзосом, полученных из Ό1. Латексные шарики с нанесенными экзосомами или РС8 инкубируют с антилактадгериновыми антителами (сыворотка А) или соответствующей преиммунной сывороткой. Затем шарики инкубируют со вторичными Р1ТС-мечеными антикроличьими антителами до проведения РАСксап анализа. Значительное специфическое окрашивание покрытых экзосомами шариков наблюдается для сыворотки А, но не для преиммунной сыворотки.

Фиг. 5 - РАСксап анализ экспрессии лактадгерина для экзосом, полученных из Ό1. Латексные шарики, покрытые экзосомами или РС8, инкубируют с анти-МНС класса I, антиМНС класса II, контрольными 1дС2а антителами или антилактадгериновыми моноклинальными (МС3 или МС8) или поликлональными антителами (сыворотка В). Связывание антител с шариками выявляют с помощью Р1ТСмеченых антимышиных или антикроличьих 1дС антител (1асккоп ЬаЬогаЮг1ск) до РАСксап анализа. Сильное окрашивание покрытых экзосомами шариков наблюдается для анти-МНС класса I и II, а также с различными антилактадгериновыми моноклональными и поликлональными антителами.

Материалы и методы

Клеточные линии.

Полученная из селезенки мышиная ДК клеточная линия Ό1 была описана ранее (\\^;шхюг е! а1., 1997). Ее культивируют в среде Дюльбекко, модифицированной Ысоуе (ШИМ, 8щта. 8! Риепбп, Ргапсе), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, не содержащей эндотоксина (РС8, ЫГе Тесйпо1од1ек, Сегду, Ргапсе) и 30% К.1 средой (СМС8Р-трансфектированная ΝΊΗ-ЗТЗ фибробластная кондиционированная среда). Осуществляют пассаж клеток дважды в неделю в 145 мм поп йккие-сибиге обработанных чашках Петри (4-5х10⁶ клеток на чашку). Для контроля за их неактивированным состоянием уровень экспрессии поверхностными клетками МНС класса II и костимуляторных молекул регулярно проверяют с помощью сканирования активированных флуоресценцией клеток (РАС8) по способу (^ш/1ег е! а!., 1997).

Иммунно-электронная микроскопия.

Клетки Ό1, как незрелые, так и зрелые, после обработки ЬР8 в течение 24 ч фиксируют

2% параформальдегидом в фосфатном буфере

0,2М рН 7,4 (РВ) в течение 2 ч при комнатной температуре. Фиксированные клетки обрабатывают для ультратонкого секционирования и иммунометят, как указано выше (Кароко е! а1., 1997; Мои е! а1., 1996). Короче, после промывки РВ и РВ-50 мМ глицином клетки вводят в 7,5% желатин. Небольшие блоки инфильтруют 2,3 М сахарозой при 4°С в течение 2 ч, а затем замораживают в жидком азоте. Ультратонкие криосрезы, полученные с помощью ультрарезака Ьека и11гаси1-ЕС8 ^1еп, Аикйта), восстанавливают в смеси метилцеллюлозы и 2,3М сахарозы (об./об.) и косвенно метят иммунозолотом с крысиными моноклональными антикласс II антителами М5114, а затем поликлональными антикрысиными поликлональными антителами (Иако, Иапетатк) и препаратом золота Рто!еш А до16 (полученным от Ότ. IV. 81оЕ ИераЛтеп! оГ Се11 Вю1оду, ИЛесй! Ишуегкйу Тйе Ле1йет1ап6к).

Полученные срезы в конце контрастируют и заключают в смесь метилцеллюлозы и уранилацетата и исследуют с помощью электронного микроскопа СМ 120 Т\тш РЫШрк (Ешбоует, Тйе Ле1йет1ап6к).

Очистка экзосом.

Экзосомы приготавливают либо из надосадочной жидкости трехдневной Ό1 культуры, или из свежей культуральной среды, которую инкубировали в течение 24 ч с трехдневными Ό1 клетками. Не было выявлено никакой разницы между полными композициями экзосом, выделенных из трехдневной или из 24-часовой надосадочных жидкостей. Экзосомы очищают описанным ранее способом (Кароко е! а1., 1996). Короче, среду освобождают от клеток и осколков с помощью трехкратного последовательного центрифугирования при 300 д (5 мин), 1200 д (20 мин) и 10000 д (30 мин), затем экзосомы выделяют в осадок после центрифугирования в течение 1 ч при 70000 д. Экзосомы промывают один раз в большом объеме РВ8, центрифугируют при 70000 д в течение 1 ч и снова суспендируют в 50-200 мл РВ8 с 0,01% азидом натрия (ЛаЛ₃). Количество выделенных экзосомальных белков определяют с помощью анализа Брэдфорда (ВтабГотб, Вютаб, Гуту, Ргапсе).

Флотация экзосом с градиентом сахарозы.

мг экзосом снова суспендируют в 1 мл Нерек 20 мМ, рН 7,2, содержащем 2,5М сахарозы и коктейль ингибиторов протеазы (см. следующий раздел). Непрерывный градиент сахарозы 2-0,25М вводят поверх экзосом и это центрифугируют в течение 16 ч при 35000 об./мин в 8ν41 роторе. Фракции по 1 мл каждая отбирают из верхней части градиента, центрифугируют в течение 1 ч при 100000 д и осадок помещают на 10% 8Э8-гель для проведения Вестернблоттинга.

Анализ белков с помощью 8Э8-РАСЕ.

Полные белки приготавливают из 108 Ό1 клеток, подвергшихся лизису в 1 мл Тпк 50 мм рН 7,5, ЛАС1 0,3М, ТпЮп Х-100 0,5%, ЛаЛ₃ 0,1%, с коктейлем антипротеаз (СЬАР: химостатин, леупептин, апротинин, пепстатин, 100 мМ каждого, 81дта) в течение 5 мин при 4°С. Лиза19 ты освобождают от ядер с помощью центрифугирования при 10000 д. Для выделения цитозоля и полных мембран примерно 2 х 10⁷ Ό1 клеток снова суспендируют при 4°С в 0,3 мл триэтаноламина, 10 мМ, ΕΌΤΆ 1 мМ, уксусной кислоте 10 мМ, сахарозе 250 мМ, тщательно растирают до рН 7,4 (ТЕА-сахароза) дополняют СЬАР и гомогенизируют 60 пассажами через 25 С иглу. Ядра и осколки клеток удаляют центрифугированием в течение 10 мин при 1200 д. Надосадочную жидкость, полученную после удаления ядер, центрифугируют в течение 1 ч при 100000 д; затем цитозол удаляют вместе с надосадочной жидкостью и осадок (все мембраны) снова суспендируют в 0,3 мл смеси ТЕА-сахарозаСЬАР.

Метаболическое мечение клеток и экзосом.

Метаболическое мечение Ό1 клеток осуществляют на трехдневных культурах: клетки промывают один раз в КРМ1, не содержащей метионин/цистеин, подвергают голоданию в течение 1 ч при 37°С в КРМ1, не содержащей метионин/цистеин, дополненной 30% диализованной К1 средой, и инкубируют в течение ночи при 37°С в 20 мл свежей КРМ1, не содержащей метионин/цистеиндиализованной К1, дополненной 5% не содержащей эндотоксин БС8 и 10-20 мКи/мл 358-метионин/цистеином (Ргот1х 358, ΙΟΝ, Огкау, Бгапсе). Среду для введения метки удаляют, клетки промывают один раз в полной Ό1 культуральной среде и затем инкубируют в течение 24 ч при 37°С. Экзосомы выделяют из надосадочной жидкости; из клеток приготавливают полные лизаты, цитозол и полные мембраны. Белки (20000 имп/мин каждого образца) разделяют с помощью 12% 8Э8-РА6Е, сушат и обрабатывают с помощью авторадиографии. Картину максимумов для каждой полосы получают, используя программное обеспечение ЮНппаде.

Анализ белков с помощью МАБП1-ТОБ.

мг белков из экзосом или полных лизатов обрабатывают с помощью 6-15% 8Э8-РАСЕ и окрашивают кумасси синим (Вюгай). Основные полосы в экзосомных препаратах вырезают из геля.

Короче, белки расщепляют трипсином в течение 4 ч при 37°С и полученную картину для пептидов анализируют с помощью метода Ма1пх-Акк1к1ей Ьакег ЭекогрбопЛошкабоп - Т1те оГ Ббдб! (МАБЭ1-ТОБ). Пептидный профиль для каждой из полос сравнивают с профилями для белков, имеющимися в базе данных, используя программу М8-БЙ.

Вестерн-блоттинг.

Препараты экзосом разделяют с помощью

8П8-РА6Е и белки переносят на РУЭБ мембраны. Реактивность антител определяют, используя специфические вторичные НКР-меченые антикроличий 1дС антитела (Ласккоп ЬаЬога1опек) и ЕСЬ (Атегкбат).

РАСксап анализ экзосом.

Для определения лактадгерина на полученных из ДК экзосомах используют новый анализ, основанный на химических сшивках экзосом с активированными латексными шариками (не содержащий поверхностно-активных агентов латекс, Д:3,9 мкм, 1п1егГас1а1 Эупат1ск Согр., Рогйанй, Ог. И8А). Нанесение покрытия осуществляют, инкубируя 10 мкл шариков с 30 мкг очищенных экзосом в течение 2 ч при комнатной температуре. Покрытые экзосомами шарики насыщают в 1М глицине в течение 30 мин при комнатной температуре и инкубируют со специфическими и Б1ТС-вторичными антителами (антимышиный или антикроличий 1дС, Исккоп ЬаЬога1опек) в РВ8 3% БС8, перед проведением анализа с помощью БасксаБЬиг (Вес1оп Пккткоп).

Культура человеческих ДК.

Клетки крови от здоровых добровольцев получают в результате переливания собственной крови, из которой предварительно удалены определенные клеточные и плазменные составляющие (СоЬе 8рес!га се11 керага!ог). Моноядерные клетки выделяют с помощью Б1со11-Рас.|ие (Рбагтааа) с градиентом плотности. Прилипшие к пластику РВМС (моноядерные клетки периферической крови) от здорового донора инкубируют в течение 7 дней с СМ-С8Б и Ι6-4 или 16-13, в ВР1М-1640 (ЫГе Тесбпо1од1ек) среде, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой. В конце культивирования клетки анализируют с помощью цитометрии в потоке для определения их фенотипа для СЭ1а, СЭ3, СЭ14, СЭ19, СЭ15, СЭ40, СП80, СП83, СП86 и анти НЬА-ОК.. Они демонстрируют фенотипные характеристики незрелых дендритных клеток, как было ранее описано Сбаршк е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1, 1997, 27:431-441 (т.е. для СП1а+, СП3-, СЭ14-, СЭ19-, СЭ15-, СП40+, СП80+, СП83-, СЭ86+ и анти НБА-ЭВ+). Экзосомы собирают из культуральной надосадочной жидкости так же, как собирали экзосомы из Ό1 клеточной линии

Примеры

1. Полный состав белков экзосом.

Для выяснения молекулярной основы противоопухолевого действия экзосом ш у1уо было предпринято интенсивное исследование характеристик белкового состава экзосом. Ό1 клетки метят метаболически в течение ночи с помощью смеси 358-метионин/цистеина, один раз промывают и добавляют к клеткам на 24 ч свежую не радиоактивную среду. Метаболически меченые экзосомы выделяют из этой надосадочной жидкости. По результатам двух независимых экспериментов количество радиоактивности, выделенное в экзосомах, составило 0,25% (±0,05%) радиоактивности, включенной в клетки. Количество радиоактивности, выделенной в экзосомальных белках (80 имп/мин/мг), оказалось аналогичным количеству, которое выделилось в белках из целых клеток (100 имп/мин/мг), что подтверждает тот факт, что экзосомальные препараты состоят из полученных из клеток белков, и они не загрязнены белками из внеклеточной среды.

Белковый профиль для экзосом из метаболически меченых клеток анализируют с помощью δΌδ-РАСЕ и авторадиографии и сравнивают с профилем для полных Ό1 лизатов, цитозоля или полных клеточных мембран. Как представлено на фиг. 1, экзосомы демонстрируют уникальный состав белков. По крайней мере, 7 белков (примерно 180, 90, 70, 58, 43, 32 и 27 кДа, точки на фиг. 1, полоса ехок) оказались в большем количестве в экзосомальных препаратах по сравнению с составом для целых клеток, цитозоля или полных мембран. Восемь других основных белков из целых клеток, цитозоля или полных мембран отсутствуют или присутствуют в меньшем количестве в экзосомах (см. звездочки на фиг.1, полоса клетки). Интересно, что две из интенсивных полос для экзосом (70 и 58 кДа) не определяются в цитозоле или в целых Ό1 клетках, что предполагает особенно жесткий механизм обогащения этих белков в экзосомах.

Поэтому экзосомы концентрируют уникальный субнабор клеточных белков, который, по-видимому, и отвечает за биологические активности экзосом. Для идентификации присутствующих в экзосомах белков 30 мкг экзосомальных белков вводят в 8-15% δΌδ-гель: характер полос, окрашенных кумасси ярко-синим, очень близок к характеру полос метаболически меченых экзосом (сравните фиг. 1 и 2). Поэтому все типы основных белков в экзосомальных препаратах обязаны своим происхождением клеткам, а не фетальной телячьей сыворотке (ЕС8). Все эти основные полосы вырезают (полосы 1-11 на фиг. 2), расщепляют трипсином, и полученные пептиды анализируют с помощью Ма1пх-Акк1к(ей Ьакег Иекогрйоп 1ошка(юи-1!те Ейдй! (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ). Профили для пептидов, полученные для различных полос, сравнивают с теоретическими пептидными профилями известных белков из базы данных. Полученные результаты (см. табл. 1 далее) показывают, что среди идентифицированных полос одна соответствует лактадгерину (известному также как Мйк Га! 61оЬи1е-Е6Гю ГаеЮгУШ, ΜΕ6-Ε8), белку, связанному с периферическими мембранами.

Таблица 1

Полоса	Белок	Соответствующий пептид	Полное число пептидов
4	Лактадгерин + Й8С73	10 11	28
5	Лактадгерин	12	15

проведен анализ дендритных клеток для определения того, действительно ли они продуцируют лактадгерин. С этой целью осуществляют реакцию амплификации на полной РНК, полученной из дендритных клеток, используя олигонуклеотидные праймеры, специфические для мРНК лактадгерина. Используют следующие последовательности олигонуклеотидов: Олиго 1 (8Е6 ГО N0:5): 5'-АТОСТАСТСТОСОССТСТО-3' Олиго 2 (8Е6 ГО N0:6): 5'-ОТСТТОТАОСТОСТООАОО-3'

Полную РНК получают из 5-7х10⁶ клеток способом с использованием гуанидинтиоцианата (Сйоте/й18к| апй 8аеей1, Аииа1. Вюейет. 162 (1987) 156). Реакцию обратной транскрипции осуществляют в объеме 20 мкл: 1 мкг РНК смешивают с йИТРк (250 мкМ каждого окончательно), случайными гексануклеотидами (2 нг 61Ьео-ВКЕ) и ΡΗΚκίη (20 Ед., Рготеда) в конечном объеме 15 мкл, нагревают при 60°С в течение 5 мин и охлаждают до 42°С. Добавляют четыре мкл 5хАМУ-обратной транскриптазы (ВТ), буфер и 1 мкл АМУ-ВТ (25 Ед/мкл, Воейпидег) и реакцию ведут при 42°С в течение 2 ч. РСВреакцию осуществляют в конечном объеме 50 мкл, используя 3,5 мкл из реакции обратной транскрипции, ДЫТРк (200 мкМ каждой конечн.), МдС1₂ (2 мМ конечн.), Тад или ТЕ полимеразу (Рготеда) и олигонуклеотиды, специфичные для мышиной МЕ6-Е8 кДНК (500 нМ каждой окончат.). Полученную смесь нагревают при 94°С в течение 5 мин, подвергают 35 циклам (94°С 30 с, 53°С 30 с, 72°С 45 с), и в конце 72°С 2 мин. В качестве контроля проводят аналогичную РСВ-реакцию с олигонуклеотидами, специфичными для мышиной актиновой кДНК, и проводят 25 циклов (94°С 30 с, 55°С 30 с и 72°С 30 с). 20 мкл из РСВ-реакций обрабатывают на 1% агарозном геле, содержащем бромид этидия, и наблюдают при УФ освещении. Амплифицированные полосы соответствуют 830 парам оснований для МЕ6-Е8 и 800 парам оснований для актина.

Экспрессию гена, кодирующего МЕ6-Е8, анализируют с помощью ВТ-РСВ в различных мышиных клеточных линиях: Ό1 (дендритная клеточная линия), 1774 (клеточная линия макрофагов), Р815 (мастоцитома) и Т8/А (аденокарцинома молочной железы). Ό1 используют либо в их незрелом состоянии, либо после 24 ч обработки в присутствии ЬР8, которые стимулируют их созревание. Экспрессию МЕ6-Е8 определяют только в незрелых Ό1 клетках, и для Т8/А карциномы молочной железы; ни зрелые Ό1 клетки, ни макрофаги или мастоцитомы не экспрессируют МЕ6-Е8. Хорошее качество кДНК подтверждается амплификацией полосы актина во всех образцах.

3. Экспрессия лактадгерина в мышиных и человеческих ДК и полученных из ДКэкзосомах - Продуцирование антител.

В этом примере приготавливают антитела, направленные против человеческого или мы2. Дендритные клетки, но не макрофаги, продуцирующие лактадгерин.

Учитывая вышеприведенные доказательства присутствия лактадгерина на экзосомах, продуцируемых дендритными клетками, был шиного лактадгерина. Эти антитела используют для контроля за присутствием и экспрессией лактадгерина в мышиных или ДК и полученных из ДК экзосомах. Эти антитела можно также использовать для ингибирования взаимодействия между конкретными антигенами и ДК.

Вырабатывают три различные кроличьи антисыворотки против пептидов мышиного лактадгерина. Пептиды, синтезированные искусственно, включают ΒΟΏ домен лактадгерина и имеют следующие последовательности:

- (Τ\Ί'ΕΙ)ΊΌΒΟιΙ)ΙΕΤΕΥ (остатки 79-94 8ΕΟ ГО N0: 4) для ΒΟΌ домена мышиного лактадгерина. Этот пептид используют для получения сыворотки А,

- ΟΕΕΙδρΕνΒΟΌνΒΡδΥ (остатки 38-53 8Ε0 ГО N0: 1) для ΒΟΌ домена человеческого лактадгерина. Этот пептид используют для получения сыворотки В, смесь трех пептидов, гомологичных в мышином и человеческом лактадгерине (·ΕΥΕΚΤΕΚνΑΥ8ΕΕΙ)Οι (остатки 153-166 8 ΕΟ ГО N0: 1), ΕνΤΟΙΙΤΟΟΑΒΌΕΟ (остатки 299311 8ΕΟ ГО N0: 1) и 20 ΕΡν8ΤΕΒΕ (остатки 370-387 8Ε0 ГО N0: 1). Эти пептиды используют для получения сыворотки С.

Кролики реагировали на все пептиды, кроме последнего.

Сыворотка А очень сильно реагирует с уникальной полосой 50-55 кДа, когда экзосомы из незрелых Ό1 клеток или из ДК, полученных из свежего костного мозга, анализируют с помощью Вестерн-блоттинга (фиг. 3, левая полоса). На полных Ό1 клеточных лизатах реактивность едва детектируется, но ее можно выявить, если использовать выделенные мембраны (фиг. 3, правая полоса). Откладывают равные количества белков, 2 или 6 мкг/полосу, и их качество оценивают, используя антианнексин II антитела параллельно ( фиг. 3, нижняя полоса).

Для определения лактадгерина на полученных из ДК экзосомах используют ЕАСзсап анализ, основанный на химических сшивках экзосом с активированными латексными шариками. Антимышиные лактадгериновые антитела (сыворотка А), но не соответствующая преиммунная сыворотка, также реагируют с покрытыми экзосомами латексными шариками (фиг. 4).

Антитела к МНС класса I (НС10) и Н (ΙΒ5) молекулам реагируют с шариками, покрытыми экзосомами, полученными из человеческих ДК, но не с контрольными шариками, покрытыми ЕС8 (фиг. 4). Аналогично, два античеловеческих лактадгерина моноклональных антител МС3 и МС8 также связываются с экзосомами, но не с шариками, покрытыми ЕС8. Аналогичные результаты получены с использованием поликлональных антител к лактадгерину (сыворотка В), которые в противоположность соответствующей преиммунной сыворотке также связываются с экзосомами (фиг. 5).

Эти результаты четко демонстрируют, что экзосомы, полученные как из мышиных, так и из человеческих ДК, содержат лактадгерин. Раскрытые в этом примере пептиды и антитела можно использовать в других способах по настоящему изобретению.

4. Конструирование варианта человеческого лактадгерина, который не содержит функционального сайта связывания интегрина.

В этом примере раскрыт способ создания вариантов лактадгерина, у которых отсутствует функциональный сайт связывания интегрина. Полученные при этом варианты практически не способны связываться с интегрином, более конкретно, с интегрином ανβ5. Поэтому указанные варианты эффективно не связываются с дендритными клетками, более конкретно с человеческими дендритными клетками, особенно с незрелыми человеческими дендритными клетками. Более предпочтительно, чтобы эти варианты сохраняли способность связываться с фосфолипидами, особенно фосфатидилсерином. Эти молекулы действительно представляют собой конкуренты природного лактадгерина в отношении связывания корпускулярных антигенов, таких как апоптотические тельца или пузырьки, и препятствуют развитию иммунной реакции, особенно с перекрестными праймированными антигенами.

Варианты лактадгерина, у которых отсутствует функциональный сайт связывания с интегрином, конструируют следующим способом.

Создают конструкцию нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую человеческий лактадгерин, как представлено в 8Ε0 ГО N0: 1, или, по крайней мере, аминокислотные остатки 24-387 указанной последовательности, соответствующие зрелому белку. Такая последовательность представлена, например, в 8Ε0 ГО N0: 2. Очевидно, что варианты указанной последовательности также можно использовать в качестве исходного материала. Такую конструкцию, обычно плазмиду, реплицируют в компетентной клетке-хозяине, для получения нужного количества нуклеиновой кислоты. Затем нуклеиновую кислоту обрабатывают, чтобы сделать нефункциональным ее сайт связывания с интегрином, который она кодирует. В этом плане сайт связывания интегрина расположен практически в ^концевой части белка, более конкретно в аминокислотных остатках Агд 01у Азр в положении 46-48 8Ε0 ГО N0: 1.

В конкретном примере нуклеиновую кислоту обрабатывают, расщепляя всю или часть последовательности, кодирующей аминокислотные остатки 1-100 8Ε0 ГО N0: 1, причем указанная делеция лишает белок способности связываться с интегрином ανβ5. Еще более предпочтительно модифицировать нуклеиновую кислоту путем делеции всей или части последо вательности, кодирующей аминокислотные остатки 1-100 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, причем указанная делеция должна включать, по крайней мере, всю или часть последовательности, кодирующей аминокислотные остатки Агд С1у Акр в положении 46-48 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. Предпочтительные варианты делеции включают делецию аминокислотных остатков 46-48, 45-49, 40-50 или 3555 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, необязательно в сочетании с делецией аминокислотных остатков 1-23, представляющих сигнал секреции. Такие делеции можно осуществить различными способами. В частности, делецию осуществляют, обрабатывая нуклеиновую кислоту рестрикционным ферментом, который расщепляет указанную нуклеиновую кислоту в соответствующем участке (включая искусственно созданные рестрикционные сайты), необязательно с последующим расщеплением фрагментов экзонуклеазами и/или лигированием полученных фрагментов.

В другом конкретном примере нуклеиновую кислоту модифицируют с помощью мутации (мутаций) во всей или в части последовательности, кодирующей аминокислотные остатки 1-100 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, причем указанная мутация (мутации) лишают белок способности связывать интегрин ανβ5. Еще более предпочтительно модифицировать нуклеиновую кислоту с помощью мутации (мутаций) во всей или в части последовательности, кодирующей аминокислотные остатки 1-100 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, причем указанная часть включает, по крайней мере, всю или часть последовательности, кодирующей аминокислотные остатки Агд С1у Акр в положении 46-48 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. Предпочтительные примеры вариантов включают, по крайней мере, мутацию одной аминокислоты, выбранной из аминокислотных остатков Агд С1у Акр в положении 46-48 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. Мутацию можно осуществить различными способами, включая сайт-направленный мутагенез, амплификацию с мутированными праймерами, синтез нуклеиновых кислот и клонирование и т.д. Мутация может также привести к супрессии одного отдельного аминокислотного остатка или к его замене другим консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком.

После получения нуклеиновых кислот проверяют их строение с помощью расщепления и/или секвенирования. Затем полученные нуклеиновые кислоты экспрессируют в клеткехозяине, например, в бактерии, в дрожжевой клетке или в клетке млекопитающего, и полученные таким образом варианты выделяют.

Конкретными вариантами настоящего изобретения являются

- белок, включающий аминокислотные остатки 49-387 8Ер ГО N0: 1;

- белок 8ЕЦ ГО N0: 1 с делецией аминокислотных остатков 46-48;

- белок 8ЕЦ ГО N0: 1 с делецией аминокислотных остатков 1-23 и 46-48;

- белок, включающий аминокислотные остатки 23-387 8ЕЦ ГО N0: 1, с мутацией в аминокислотном остатке Агд в положении 46;

- белок, включающий аминокислотные остатки 23-387 8ЕЦ ГО N0: 1, с мутацией в аминокислотном остатке С1у в положении 47;

- белок, включающий аминокислотные остатки 23-387 8ЕЦ ГО N0: 1, с мутацией в аминокислотном остатке Акр в положении 48;

5. Конструирование варианта человеческого лактадгерина, лишенного функционального сайта связывания фосфатидилсерина.

Этот пример раскрывает способ конструирования вариантов лактадгерина, лишенных функционального сайта связывания фосфатидилсерина (ФС). Полученные варианты практически не способны связываться с ФС и поэтому эффективно не связывают корпускулярные антигены, такие как апоптотические тельца и пузырьки. С другой стороны, указанные варианты выгодно сохраняют способность лактадгерина связываться с дендритными клетками, более конкретно с человеческими дендритными клетками, особенно человеческими незрелыми дендритными клетками. Соответственно, эти молекулы представляют собой конкуренты природным лактадгеринами в отношении связывания с дендритными клетками, препятствуя тем самым перекрестному праймированию антигенов. Эти варианты можно также использовать для доставки молекул к дендритным клеткам, в частности, для облегчения (т.е. усиления) захвата (например, фагоцитоза) молекул дендритными клетками ίη νίΐτο, ех νίνο или ίη νίνο.

Варианты лактадгерина, у которых отсутствует функциональный сайт связывания с ФС, конструируют следующим способом.

Создают конструкцию нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую человеческий лактадгерин, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, по способу примера 4. Затем нуклеиновую кислоту обрабатывают таким образом, чтобы сделать нефункциональным сайт связывания ФС лактадгерина, который она кодирует. В этом отношении сайт связывания лактадгерина расположен практически в Сконцевой части белка, более конкретно в аминокислотных остатках 242-387 8ЕЦ ГО N0: 1, еще более предпочтительно в аминокислотных остатках 350-387 8ЕЦ ГО N0: 1.

В конкретном примере нуклеиновую кислоту модифицируют с помощью делеции всей или части последовательности, кодирующей аминокислотные остатки 242-387 8ЕЦ ГО N0: 1, более предпочтительно, по меньшей мере, аминокислотные остатки 360-387 8ЕЦ ГО N0: 1, причем указанная делеция делает белок неспособным связываться с ФС. Такую делецию можно осуществить различными способами. В частности, делецию осуществляют, обрабатывая нуклеиновую кислоту рестрикционным ферментом, который расщепляет указанную нуклеино вую кислоту в соответствующем участке (включая искусственно созданные рестрикционные сайты), необязательно с последующим расщеплением фрагментов экзонуклеазами, и/или лигированием полученных фрагментов.

В другом конкретном примере нуклеиновую кислоту модифицируют с помощью мутации (мутаций) во всей или в части последовательности, кодирующей аминокислотные остатки 242-387 8Е0 ГО N0: 1, более предпочтительно, по крайней мере, в последовательности, кодирующей аминокислотные остатки 360-387 8 Ер ГО N0: 1, причем указанная мутация (мутации) делает белок неспособным связываться с ФС. Мутацию можно осуществить различными способами, включая сайт-направленный мутагенез, амплификацию с мутированными праймерами, синтез нуклеиновых кислот и клонирование и т. д.

После получения нуклеиновых кислот проверяют их строение с помощью расщепления и/или секвенирования. Затем полученные нуклеиновые кислоты экспрессируют в клеткехозяине, например, в бактерии, в дрожжевой клетке или в клетке млекопитающего, и полученные таким образом варианты выделяют.

Конкретными вариантами настоящего изобретения являются

- белок, включающий аминокислотные остатки 1-242 8ЕР ГО N0: 1;

- белок, включающий аминокислотные остатки 24-242 8Е0 ГО N0: 1;

- белок 8Ер ГО N0: 1 с делецией аминокислотных остатков 360-387;

- белок 8Ер ГО N0: 1, с мутацией в одном или нескольких аминокислотных остатках последовательности 360-387.

Описание последовательностей <110> ΙΝ5ΕΚΜ ίΝδτιτστ сотне

СЫЯ5 <120> Композиции и способы использования лактадгерина или его вариантов <130> Лактадгерин <140>

<141>

<160> 6 <Х70> РаЪепЪХп Уег. 2.1 <210> 1 <211> 1934 <212> ДНК <213> Ното зарХепа <220>

<221> СОЗ <222> (61)..(1224) <400> 1

адаа

1СССС

дс дддде

седа

>д са

1дссс

:адсд

Сдс

:ссае

.Ссс

адсд

1сссдсд с

;сссс

:дсадс

60

асд

ссд

сдс

ССС

сдс

сед

сед

дсс

дед

ссд

Сдс

ддс

дед

сед

сСс

Сдс

103

МеС

Рго

Агд

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

А1а

АХа

Ьеи

Суз

6Ху

А1а

Ьеи

Ьеи

Суз

1

5

10

15

дсс

ссс

аде

ссс

сес

дес

дсс

сСд

даС

асе

еде

есс

ааа

аас

ссс

еде

156

АХа

Рго

Зег

ьеи

Ьеи

УаХ

АХа

Ьеи

Азр

11е

Суз

Зег

Ьуз

АЗП

Рго

Суз

20

25

30

сас

аас

ддс

ддс

сса

Сдс

дад

дад

асе

Ссс

саа

даа

дед

еда

дда

дас

204

НХз

А5П

51 у

С1у

Ьеи

Суз

61 и

6Хи

11е

зег

61η

6Хи

УаХ

Агд

61 у

Азр

35

40

45

дсс

ссс

ссс

ссд

Сас

асе

сдс

асд

где

ссе

аад

ддс

сас

дед

ддс

аас

252

УаХ

РЬе

Рго

Зег

Туг

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Ьеи

Ьуз

6Ху

Туг

АХа

61 у

Азп

50

55

60

сас

еде

дад

асд

ааа

еде

дСс

дад

сса

ссд

ддс

асд

дад

аас

ддд

аас

300

.415

Суз

СХи

ТЬх

ьуз

Суз

УаХ

61и

Рго

Ьеи

6Ху

МеС

61и

Азп

61у

Азп

70 75 80

асе

дсс

аас

Сса

сад

аСс

дсс

дсс

Сса

есе

дед

сдС

дед

асе

еес

сед

348

Не

А1а

Азп

Зег

61п

Не

АХа

А1а

Зег

Зег

Уа1

Агд

Уа1

ТЬг

РЬе

Ьеи

85

90

95

ддс

сед

сад

саС

Сдд

дсе

ссд

дад

сед

дсс

сдс

сед

аас

сдс

дса

ддс

396

С1у Ьеи 51 η Ηί3 Тгр Уа1 Рго БХи Ьеи АХа Агд Ьеи Азп Агд АХа 6Ху

100 105 110 аед дсс ааС дсс Сдд аса ссс аде аде аае дас дас аас ссс сдд аСс 444

МеС УаХ Азп А1а Тгр ТЬх Рго Зег Зег Азп Азр Азр Азп Рго Тгр Не

115 120 125

сад дед 61п УаХ 130

аас сед сСд Азп Ьеи Ьеи

сдд адд аед Сдд дса аса дде дед дед асд сад

492

Агд

Агд 135

Мее

Тгр

Уа1 ТЬг

61 у 140

УаХ Уа1 ТЬх 61п

дде

дсс

аде

сдс

ССд

дсс

аде

саС

дад

Сас

сед

аад

дсс

еес

аад

дСд

540

61 у

А1а

Зег

Агд

Ьеи

АХа

Зег

ΗΪ3

61 и

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а

РЬе

Ьуз

УаХ

145

150

155

160

дсс

Сас

аде

ссе

аае

дда

сас

даа

еес

дае

еес

аСс

саС

дас

дсе

ааС

588

АХа

Туг

Зег

Ьеи

Азп

61 у

НХз

61и

РЬе

Азр

РЬе

Не

НХз

Азр

УаХ

Азп

165

170

175

ааа

ааа

сас

аад

дад

есс

дСд

дде

аас

Сдд

аас

ааа

аас

дед

дСд

сас

636

Ьуз

Ьуз

НЬз

Ьуз

61 и

РЬе

УаХ

61 у

Азп

Тгр

Азп

Ьуэ

Азп

А1а

УаХ

НХз

180

185

190

дсс

аас

сСд

ССС

дад

асе

ссС

дед

дад

дсе

сад

сас

дед

ада

сед

сас

684

УаХ

Азп

Ьеи

РЬе

61 и

ТЬг

Рго

УаХ

С1и

АХа

51п

Туг

УаХ

Ахд

Ьеи

Туг

195

200

205

ссс

асд

аде

Сдс

сас

асд

дсс

Сдс

асе

ссд

сдс

ссс

дад

сСа

сед

ддс

732

Рго

тьг

Зег

Суз

НХз

ТЬг

АХа

Суз

ТЬг

Ьеи

Ахд

РЬе

61и

Ьеи

Ьеи

61 у

210 215 220

Сде Суз 225

дад 61 и

сед Ьеи

аас дда сдс дсс аас ссс сСд ддс сед аад аас аас аде

780

Азп 61у

Суз 230

АХа Азп

Рго

Ьеи

61у 235

Ьеи

Ьуз Азп Азп

Зег 240

асе

ссс

дас

аад

сад

асе

асд

дсс

ссс

аде

аде

сас

аад

асе

сдд

ддс

Θ28

Не

Рго

Азр

Ьуз

51П

Не

ТЬг

АХа

Зег

зег

Зех

туг

Ьуз

ТЬг

Тгр

ОХу

245

250

255

ссд

сас

ссс

ссс

аде

сдд

аас

ссс

есс

СаС

дса

сдд

ссд

дас

аад

сад

876

Ьеи

Нез

Ьеи

РЬе

Зег

Тхр

Азп

Рсо

зех

Туг

АХа

Агд

Ьеи

Азр

Ьуз

С1п

260

265

270

ддс

аас

ЕСс

аас

дсс

Едд

дсс

дед

ддд

аде

Сас

ддс

аас

даЕ

сад

Сдд

924

01 у

Азп

РЬе

Азп

А1а

Тгр

νβΐ

А1а

б1у

Зег

Туг

61 у

Азп

Азр

61п

Тгр

275

280

285

сЕд

сад

дЕд

дас

сЕд

ддс

Ссс

Сед

аад

дад

дСд

аса

ддс

асе

аЕс

асе

972

Ьеи

61 п

Уа1

Азр

Ьеи

61 у

Зег

Зег

ьуз

О1и

Уа1

ТЫ

61 у

Не

Не

ТЬг

290

295

300

сад

ддд

дсе

еде

аас

ЕЕЕ

ддс

есс

дЕс

сад

ЕСС

дед

дса

есс

Еае

аад

1020

61 п

61 у

А1а

Агд

Азп

РЬе

61 у

Зег

Уа1

61п

РЬе

Уа1

АХа

Зег

Туг

Ьуз

305

310

315

320

дЕЕ

дсс

Сас

адЕ

ааЕ

дас

аде

дед

аас

Сдд

асС

дад

Сас

сад

дас

ссс

1068

Уа1

А1а

Туг

Зег

Азп

Азр

Зег

А1а

Азп

Тгр

ты

61и

Туг

61п

Азр

Рго

325

330

335

адд

асе

ддс

аде

адЕ

аад

аЕс

ССс

ссС

ддс

аас

Едд

дас

аас

сас

Ссс

1116

Агд

ТЬг

61у

Зег

Зег

Ьуз

Не

РЬе

РГО

61у

Азп

Тгр

Азр

Азп

Нхз

Зег

340

345

350

сас

аад

ад

аас

ЕЕд

СЕС

дад

асд

ссс

а Ес

сСд

дсС

сдс

СаС

дед

сдс

1164

ΗΪ3

Ьуз

Ьуз

Азп

Ьеи

РЬе

С1и

ТЬг

Рго

Не

Ьеи

А1а

Агд

Туг

Уа1

Агд

355

360

365

асе

сЕд

ССЕ

дЕа

дсс

Сдд

сас

аас

сдс

аЕс

дсс

сЕд

сдс

сЕд

дад

сЕд

1212

11е

Ьеи

Рго

Уа1

А1а

Тгр

Н1з

Азп

Агд

Не

А1а

Ьеи

Агд

Ьеи

61и

Ьеи

370 375 380 сЕд ддс ЕдЕ Сад ЕддссассЕд ссасссссад дЕсЕЕссЕдс ЕЕЕссасддд 1264

Ьеи С1у Суз

385

сссдссдссЕ сЕсддсЕЕсЕ садссссЕЕЕ аааЕсассаЕ адддсЕдддд асЕддддаад 1324
дддадддсдс	Есададдсад	сассассаса	садЕсасссс	СсссесссСс	ЕЕЕсссассс	1384
Сссассссес	асдддсссед	ссссадсссс	ЕаадссссдЕ	ссссСаассс	ссадЕссЕса	1444
седсссЕдсЕ	ЕСсссаддса	сСдадддаСс	Едадсаддсс	Едддасддас	аддааадддс	1504
ааадсадддс	дЕдсддесЕс	ссСдссссСд	Ессддассдс	сдаЕсссадд	ЕдсдСдЕдЕс	1564
Ессдсссссс	ссадсссссс	СсесасасаЕ	сасаСЕссса	ЕддсддесСс	аадаааддсс	1624
сддаассссс	аддседдада	Саасадссгс	СЕдсссдесд	дсссЕдсдЕс	ддсссЕдддд	1684

ЕассаедЕдс	сасаасЕдсЕ	дЕддсссссЕ	дЕссссаада	сасЕЕссссЕ	ЕдЕсесссСд	1744
дссдсссссс	ССдссссСЕд	СссЕдаадсс	садсдасаса	даадддддсд	дддсдддЕсЕ	1804
аЕддддадаа	адддадсдад	дЕсададдад	ссддсаСддд	ссддсадддс	дддедсседд	1864
ддсссЕсаЕд	сСддсЕСЕСс	ассссададд	асасаддсад	сЕЕссааааЕ	аЕаСЕСаСсе	1924

ЕсЕЕсасддд 1934 <210> 2 <211> 387 <212> РАТ <213> Ното зархепз <400> 2

МеЕ

Рго

Агд

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

АХа

А1а

Ьеи

Суз

61 у

А1а

Ьеи

Ьеи

Суз

1

5

10

15

А1а

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Уа1

А1а

Ьеи

Азр

11е

Суз

Зег

Ьуз

Азп

Рго

Суз

20

25

30

ΗΪ5

Азп

51 у

51 у

Ьеи

Суз

61 и

61и

Не

Зег

61 п

61и

Уа1

Агд

61у

Азр

35

40

45

ν«ι

РЬе

Рго

Зег

Туг

ТЫ

Суз

ТЬг

Суз

Ьеи

Ьуз

61у

Туг

А1а

61 у

Азп

50

55

60

Ηίβ

Суз

61и

ТЬг

Ьуз

Суз

Уа1

бХи

РГО

Ьеи

61 у

МеЕ

61 и

Азп

б1у

Азп

65

70

75

80

11е

А1а

АЗП

Зег

СХп

11е

АХа

А1а

Зег

Зег

Уа1

Агд

Уа1

ТЬг

РЬе

Ьеи

85

90

95

61у

Ьеи

С1п

Нхз

Тгр

Уа1

Рго

61 и

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

Азп

Агд

А1а

61 у

100

105

но

МеЕ

Уа1

Азп

А1а

Тгр

ТЬг

Рго

Зег

Зег

Азп

Азр

Азр

Азп

Рго

Тгр

Не

115

120

125

□1п

7а1

Азп

Ьеи

Ьеи

Агд

Агд

МеЕ

Тгр

Уа1

ТЬг

61у

Уа1

Уа1

ТЬг

61 п

130

135

140

61 у

АХа

Зег

Агд

Ьеи

А1а

Зег

Ηί3

51 и

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

145

150

155

160

А1а

Туг

Зег

Ьеи

АЗП

61 у

НХЗ

61и

РЬе

Азр

РЬе

Не

НХЗ

Азр

Уа1

Азп

165

170

175

Ьуз

Ьуз

Η1Ξ

Ьуз

51и

РЬе

νβΐ

61у

Азп

Тгр

Азп

Ьуз

Азп

А1а

Уа1

Н13

180

185

190

Уа1

Азп

Ьеи

РЬе

б!и

ТЬг

РГО

Уа1

61и

А1а

61п

Туг

Уа1

Агд

Ьеи

Туг

195 200 205

Рго

ТЬг

Зег

Суз

нхз

ТЬг

А1а

Суз

ТЫ

Ьеи

Агд

РЬе

61и

Ьеи

Ьеи

61у

210

215

220

Суз

бЬи

Ьеи

Азп

61у

Суз

А1а

Азп

Рго

Ьеи

61у

Ьеи

Ьуз

Азп

Азп

Зег

225

230

235

240

Не

? = =

Азр

Ьуз

61п

Не

ТЬг

АХа

Зег

Зег

Зег

Туг

Ьуз

ТЬг

Тгр

61 у

245

250

255

Ьеи

ΗΪ3

Ьеи

РЬе

Зег

Тгр

Азп

Рго

Зег

туг

А1а

Агд

Ьеи

Азр

Ьуз

61п

260

265

270

61 у

АЗП

РЬе

АЗП

А1а

тгр

Уа1

А1а

61У

Зег

Туг

61 у

Азп

Азр

61п

тгр

275

280

285

Ьеи

61п

Уа1

Азр

Ьеи

61 у

Зег

Зег

Ьуз

61и

Уа1

ТЫ

61у

11е

Не

ТЬг

290

295

300

61 п

61 у

А1а

Ахд

Азп

РЬе

61 у

Зег

Уа1

61 п

РЬе

Уа1

А1а

Зег

Туг

Ьуз

305

310

315

320

Уа1

А1а

Туг

Зег

Азп

Азр

Зег

А1а

Азп

Тгр

ТЫ

61 и

Туг

61п

Азр

РГО

325

330

335

Агд

ТЬг

61 у

Зег

зег

ьуз

Не

РЬе

Рго

61У

Азп

Тгр

Азр

Азп

Нхз

Зег

340

345

350

ΗΪ5

Ьуз

Ьуз

Азп

Ьеи

РЬе

61 и

ТЬг

РГО

11е

Ьеи

АХа

Агд

Туг

Уа1

Агд

355

360

365

11е

Ьеи

Рго

Уа1

А1а

Тгр

Н1з

Азп

Агд

11е

А1а

Ьеи

Агд

Ьеи

61и

Ьеи

370 375 380

Ьеи 61у Суз

385 <210> 3 <211> 2077 <212> ДНК <213> млакопитамцее <220>

<221> СОЗ <222> (46)..(1434) <400> 3 дааЕЕссдса Есададсдсд ЕддассЕЕЕЕ сссдсдЕссс дсадс аЕд сад дЕс Есс 57

МеЕ 61п Уа1 Зег сдЕ дед сед дсс дед сЕд Еде ддс аЕд сЕа сес Еде дсс ЕсЕ ддс сЕс105

Агд УаХ Ьеи А1а А1а Ьеи Суз 61у МеЕ Ьеи Ьеи Суз А1а Зег 01 уЬеи

10 1520

ЕЕс дсс дед Есе ддЕ дас ЕЕс ЕдЕ дас Есс аде сЕд Еде сЕд аас ддЕ153

РЬе А1а А1а Зег 61у Азр РЬе Суз Азр Зег Зег Ьеи Суз Ьеи Азп61у

3035 ддс асе Еде ЕЕд асд ддс саа дас аас дас аЕе Еае Еде сес Еде ссс 201

С1у ТЫ Суз Ьеи ТЬг СХу <31п Азр Азп Азр Не Туг Суз Ьеи Суз Рго

40

45

50

даа

ддс

ЕЕС

аса

ддс

СЕЕ

дЕд

Еде

ааЕ

дад

асЕ

дад

ада

дда

сса

Еде 249

61 и

61 у

РЬе

ТЬг

61 у

Ьеи

Уа1

Суз

АЗП

61и

ТЬг

61 и

Ахд

61у

рго

Суз

55

60

65

ЕСС

сса

аас

ССЕ

Еде

Еае

ааЕ

даЕ

дсс

ааа

ЕдЕ

СЕд

дЕд

асЕ

ЕЕд

дас 297

Зег Рго Азп Рго Суз Туг Азп Азр А1а Ьуз Суз Ьеи Ча1 ТЬг Ьеи Азр

75 80 аса сад сдЕ ддд дас аЕс Есс асе даа Еае аЕс Еде сад Еде ссЕ дЕд345

ТЬг СХп Агд 01 у Азр 11е РЬе ТЬг 61и Туг 11е Суз 61п Суз Рго Уа1

90 95100

ддс Еае Есд ддс

аЕс сас ЕдЕ даа

асе дад асе аас Еае Бас аас с£д

393

61у Туг

Зег О1у

Не 105

Нхз

Суз

61и

ТЬх 61и ТЬг Азп Туг Туг Азп

Ьеи

110

115

даЕ

дда

даа

Еае

а Ед

ЕЕс

асе

аса

дсс

дЕс

ссс

ааЕ

асе

дсс

дЕс

ссс

441

Азр

61у

61и

Туг

МеЕ

РЬе

ТЬг

ТЬг

АХа

Уа1

Рго

Азп

ТЬг

А1а

Уа1

Рго

120

125

130

асе

ссд

дсс

ссс

асе

ссс

да!

СЕЕ

ЕСС

аас

аас

сЕа

дсс

Есс

сдЕ

ЕдЕ

489

ТЬг

Рго

А1а

Рго

ТЬг

Рго

Азр

Ьеи

Зег

Азп

Азп

Ьеи

А1а

5ег

Агд

Суз

135

140

145

ЕсЕ

аса

сад

егд

ддс

аЕд

даа

ддд

ддс

дсс

аСС

дес

даЕ

Еса

сад

аЕЕ

537

Зег

ТЬг

61П

Ьеи

61 у

МеЕ

61и

61 у

61у

А1а

Не

А1а

Азр

Зег

61п

Не

150

155

160

Есс

дсс

Есд

Еае

дЕд

ЕаЕ

а Ед

ддЕ

ЕЕс

аЕд

ддс

ЕЕд

сад

сдс

Сдд

ддс

585

Зег

АХа

Зег

Туг

νβΐ

Туг

МеЕ

61у

РЬе

МеС

61 у

Ьеи

61 п

Агд

Тгр

61 у

165

170

175

180

ссд

дад

сЕд

дсЕ

сдЕ

СЕд

Сас

сдс

аса

ддд

а Ес

дЕс

ааЕ

дсс

Едд

сас

633

Рго

61 и

Ьеи

АХа

Агд

ьеи

Туг

Агд

ТЬг

61у

Не

Уа1

Азп

А1а

Тгр

Нхз

185

190

195

дсс

аде

аас

ЕаЕ

даЕ

аде

аад

ссс

Едд

аЕс

сад

дЕд

аас

СЕЕ

сЕд

сдд

661

А1а

Зег

Азп

Туг

Азр

зег

Ьуз

Рго

Тгр

Не

С1п

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Агд

200

205

210

1305 сас

Туг аде аад Зег Ъуз аде

Зег дсс

Уа1 ддс 01 у 405

ЕСС

РЬе

420 дед

Уа1 сад Едд асс дЕа

О1п Тгр ТЫ νβΐ

410 дад дад саа дда

61и 01и О1п 01у

415

А1а

Зех 01у Ьеи 20

РЬе А1а А1а

Зег 61у Азр РЬе Суз Азр Зех

Зех Ьеи

25

30

Суз

Ьеи

Азп

61у

61у

ТЬг

Суз

Ьеи

ТЬг

61у

61п

Азр

Азп

Азр

Не

Туг

35

40

45

Суз

Ьеи

Суз

Рхо

О1 и

О1у

РЬе

ТЬг

□1у

Ьеи

νβΐ

Суз

Азп

С1и

ТЬг

61и

Ё0

55

60

Агд

01 у

Рхо

Суз

Зех

Рго

Азп

Рго

Суз

Туг

АЗП

Азр

А1а

Ьуз

Суз

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

ТЬх

Ьеи

Азр

ТЬх

σΐη

Агд

61у

Азр

Не

РЬе

ТЬг

61 и

Туг

Не

Суз

85

90

95

01 п

Суз

Рхо

Уа1

61у

Туг

Зег

61 у

Не

Н13

Суз

61 и

ТЬх

61 и

ТЬг

Азп

100

105

110

Туг

Тух

Азп

Ьеи

Азр

61 у

б1и

Туг

МеЕ

РЬе

ТЬг

ТЬх

А1а

νβΐ

Рхо

Азп

115

120

125

ТЬх

А1а

Уа1

Рхо

ТЬг

Рго

А1а

Рхо

ТЬг

РГО

Азр

Ьеи

Зех

Азп

Азп

Ьеи

130

135

140

А1а

Зех

Агд

Суз

Зег

ТЬХ

61 п

Ьеи

61у

МеЕ

61 и

61 у

61 у

А1а

Не

А1а

145

150

155

160

Аар вех 61п Це Зег А1а Зег Туг Уа1 Туг МеЕ б1у РЬе МеЕ б1у Ьеи

165 170175

С1п Агд Тгр 61 у Рго С1и Ьеи А1а Ахд Ьеи Туг Агд ТЬг 01 у 11е Уа1

180 185190

Азп А1а Тгр Н1б А1а Зег Азп Туг Азр Зег Ьуз Рго Тхр Не 51п Уа1 195 200205

Азп Ьеи Ьеи Ахд Ьуз МеЕ Агд Уа1 Зех б1у Уа1 МеЕ ТЬг 01 п О1у А1а 210 215220

Зех Ахд А1а О1у Агд А1а 61и Туг Ьеи Ьуз ТЬг РЬе Ьуз Уа1 А1аТуг

225 230 235240

Зех Ьеи Авр 31у Агд Ьуз РЬе О1и РЬе 11е О1п Азр О1и зег б!у О1у ссс

Рго сдс Агд ддс

О1у

СЕс

РПе аас ссд дас аас Азп Ьеи Азр Азп

425 аас

Азп ссс сас аад аад

Зег Н15 Ьуз Ьуз . 430 ааа дад 01и Ьуз

435

1353 аЕд дсЕ сдс Сас дЕд сдЕ дЕс есс сса МеЕ А1а Агд Туг νβΐ Агд Уа1 Ьеи Рго

440 445 дЕд

Уа1

Есс Едд саЕ аас

Зег Тгр ΗΪ3 Азп

450

1401 асе

Не асе сед сдс сЕд дад сед сЕд ддс ЕдЕ ТЬг Ьеи Агд Ьеи О1и Ьеи Ьеи О1у Суз 455 460

ЕааЕдсЕсад ЕссЕдссадс 1454 ссааасдаЕд аддаЕддсса даддсЕдадд ддссЕссСдд сссЕдссЕсс саддсссЕдс

1514

ЕдссЕЕсЕдЕ ддсЕдасдас сЕЕсЕсддсс ЕЕсесЕссЕд аЕЕдЕасЕдд ддсЕддаддс

1574 аддаадддсс аддддаЕЕЕс ададЕЕдссс ЕЕсасссЕЕЕ сссЕсасссЕ дсадссссса

1634 саддссЕссЕ дсЕадссссс ЕЕсЕсЕсадд саЕЕсЕдддд дадЕЕддаса ддЕсЕдадаЕ

1694 дааЕададаа даададЕдаа дЕЕддддЕаЕ дЕдддсЕаЕс

ЕдЕассаасс ассссаадЕс 1754 сЕааасЕЕсс ЕдссадддсЕ ЕдасЕсадда сЕдаадддад ссссЕдасЕд сссаЕсссЕс 1814

Ессдсасасс асасаЕЕссЕ ссаЕдЕЕсса ЕЕссдддаад дададдссса сдЕссдсЕЕд

1874 сЕдЕсссЕЕд ддЕсассадд ЕссЕдссЕсс ЕаЕсЕссЕда дасдссЕсЕЕ дасссЕЕдса

1934 сЕддадссЕс адЕЕдасаад дадасЕддсд ддЕСЕддада ддЕсддЕддс ЕСЕдддЕддЕ

1994

ЕдасаддЕЕд дсЕдЕдддас сЕсЕдсЕддс ЕЕдсЕассса адЕЕаасаад садаЕЕссаа

2054 ааЕасаЕЕсд ЕдЕЕсЕссас Едд

2077 <210> 4 <211> 463 <212> РПТ

245 250 255

Азр

Ьуз

61и рье Ьеи 260

61 у Азп

Ьеи Азр Азп Азп вег Ьеи Ьуз Уа1 Азп

265

270

МеЕ

РЬе

Азп

РГО

ТЬх

Ьеи

61и

А1а

61п

Тух

Не

Ахд

Ьеи

Туг

Рхо

Уа1

275

280

285

вег

Суз

ΗΪ3

Агд

61у

Суз

ТЬх

Ьеи

Ахд

РЬе

61 и

Ьеи

Ьеи

61у

Суз

61и

290

295

300

Ьеи

ΗΪ3

61у

Суз

Ьеи

61 и

Рхо

Ьеи

61у

Ьеи

Ьуз

АЗП

АЗП

ТЬг

Не

Рго

305

310

315

320

Азр

вег

61п

МеЕ

вех

А1а

вех

вех

вех

туг

Ьуз

ТЬх

Тхр

Азп

Ьеи

Агд

325

330

335

А1а

РЬе

61 у

Тгр

Туг

Рхо

Н1з

Ьеи

61у

Агд

Ьеи

Азр

Азп

61п

61у

Ьуз

340

345

350

11е

Азп

А1а

Тхр

ТЬх

А1а

61п

вех

Азп

вег

А1а

Ьуз

61и

Тгр

Ьеи

61п

355

360

365

Уа1

Азр

Ьеи

61 у

ТЬг

61п

Агд

61 п

Уа1

ТЬг

61у

Не

Не

ТЬг

61п

61 у

370

375

380

А1а

Агд

Азр

РЬе

61у

Н1з

Не

61п

Туг

Уа1

б1и

вег

Туг

Ьуз

Уа1

А1а

385

390

395

400

ΗΪ3

вег

Азр

Азр

61у

Уа1

61п

Тхр

ТЬг

νβΐ

Туг

61 и

61 и

61п

61 у

вег

405

410

415

вех

Ьуз

Уа1

РЬе

61 п

61у

АЗП

Ьеи

АЗр

АЗП

АЗП

вег

Нхз

Ьуз

Ьуз

Азп

420

425

430

11е

РЬе

61и

Ьуз

Рхо

РЬе

МеЕ

А1а

Ахд

тух

Уа1

Агд

Уа1

Ьеи

Рго

Уа1

435

440

445

вех

Тхр

Ηϊ3

Азп

Агд

Не

ТЬх

Ьеи

Ахд

Ьеи

61 и

Ьеи

Ьеи

61 у

Суз

450 455 460 <213> млекопитакщав <400> 4

МеЕ О1п Уа1 Зег Агд Уа1 Ьеи А1а А1а Ьеи Суз б1у Мес Ьеи Ьеи Суз

10 15 <210> 3 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: олигонухлеотид <400> 5 аЪдсЬасЪсй дсдссСсйд <210> 6 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <400> б дЬсЬЪдЕадс ЪдсЪддадд 19

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение лактадгерина или его варианта для получения композиции для регулирования иммунного ответа.
2. 2. Применение по п.1 для ингибирования перекрестного праймирования антигенов.
3. 3. Применение по п.2 варианта лактадгерина, не содержащего функциональный сайт связывания с фосфолипидом и/или функциональный сайт связывания с интегрином.
4. 4. Применение по п.1 для стимуляции фагоцитоза антигенов дендритными клетками.
5. 5. Применение по п.1 для стимуляции перекрестного праймирования антигенов.
6. 6. Применение лактадгерина или его вариантов для получения композиции для доставки антигена, цитокина или токсичной молекулы к дендритным клеткам.
7. 7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лактадгерин или его вари ант является человеческим лактадгерином или его вариантом.
8. 8. Иммуногенная композиция, включающая лактадгерин или его вариант, связанный с антигеном или цитокином.
9. 9. Композиция по п.8, где указанный антиген или цитокин ковалентно связан с лактадгерином или его вариантом.
10. 10. Композиция по п.8, включающая липосому, где липосома включает лактадгерин или его вариант, ковалентно связанные с антигеном или цитокином.
11. 11. Иммуногенная композиция, включающая лактадгерин или его вариант, связанный с антигеном.
12. 12. Композиция по п.11, где антиген представляет собой белок, полипептид, пептид, вирус или бактерию.
13. 13. Химерный белок, включающий лактадгерин или его вариант, слитый с иммуногеном или иммуностимуляторным полипептидом.
14. 14. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по п.13.
15. 15. Липосома, включающая рекомбинантный лактадгерин или его вариант.
16. 16. Иммуногенная композиция, включающая химерный белок по п.13 или липосому по п.15.
17. 17. Рекомбинантный вирус, экспрессирующий лактадгерин в виде поверхностной молекулы.
18. 18. Рекомбинантная клетка, экспрессирующая лактадгерин в виде поверхностной молекулы.