EA000703B1

EA000703B1 - Способ дезинтеграции культивированных клеток с использованием устройства на основе применения сталкивающихся струй

Info

Publication number: EA000703B1
Application number: EA199800266A
Authority: EA
Inventors: Дуглас Б. Сиферт; Франк С. Леу
Original assignee: Мерк Энд Ко., Инк.
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-02
Publication date: 2000-02-28
Also published as: TW426733B; AU7204496A; WO1997012959A1; EP0854913A1; BR9610773A; CZ104198A3; SK43498A3; CN1203626A; AR003776A1; EA199800266A1; CN1100868C

Description

Настоящее изобретение относится к способу дезинтеграции культивированных клеток путем использования противоположно направленных струйных потоков при низком давлении, создающих деструктивный сдвиг в жидкости, который является достаточно мощным для разрушения клеток, но недостаточно мощным для повреждения содержимого клеток.

Предпосылки создания изобретения

Многие способы биотехнологии и ферментации требуют большого количества клеток для культивирования в биологических реакторах с последующим их разрушением в целях высвобождения нужных продуктов. Дезинтеграция клеток может быть осуществлена механическими, химическими, биологическими или физическими способами. Многие специалисты предпочитают механические способы дезинтеграции, поскольку они не требуют использования дополнительных реагентов (детергентов, ферментов или агентов осмомолярности) и позволяют избежать необходимой адаптации физических способов, таких как замораживание/оттаивание, для крупномасштабного производства.

Для дезинтеграции микроорганизмов был разработан ряд механических методов. Эти методы основаны, главным образом, на сдвиговом усилии, создаваемом в жидкости, и/или компрессии в целях разрушения клеточной стенки и мембраны. Однако не во всех способах биотехнологии и ферментации используются микроорганизмы. Все более распространенным объектом для выбора клеток-хозяев становятся клетки животных. Поскольку клетки животных являются более крупными и имеют хрупкую мембрану, то для разрушения этих клеток требуются меньшие затраты энергии. Многие системы, производимые промышленностью и предназначенные для микробиологических систем, не пригодны для применения к клеткам животных.

Для дезинтеграции клеток животных могут быть использованы роторные/статорные устройства, имеющие цилиндрический ротор, концентрически вращающийся с высокой скоростью внутри статора. В этом устройстве создается крутой градиент скорости в кольцевой зоне, в результате чего генерируется сдвиговое напряжение, достаточное для разрушения клеток. Аналогичное устройство, называемое прессом Чайкова (Chaikoff), имеет цилиндр и поршень немного меньшего диаметра. Движение поршня создает высокое сдвиговое усилие в жидкости внутри кольцевого пространства, что приводит к разрушению клетки. Устройство такого типа также называют даунсером (от названия гомогенизатора Даунса), и используют для дезинтеграции диплоидных клеток легких MRC-5, инфицированных вирусом ветряной оспы (Varicella). Однако эти методы применяются лишь для лабораторных исследований и не пригодны для крупномасштабного производства.

Ультразвуковая обработка клеток приводит к их разрушению путем создания в жидкости областей высокого сдвигового напряжения благодаря процессу кавитации. Колебательные акустические волны (~20 кГц) создают перепад давления в жидкости. Пузырьки пара, образованные в области низкого давления, лопаются после их попадания в область высокого давления, создавая тем самым ударные волны высокой энергии. Поскольку ударные волны распространяются радиально от первоначальной зоны кавитации, то в результате этого генерируется высокое сдвиговое напряжение, а также продуцируется тепло вследствие диссипации энергии в жидкости.

Для дезинтеграции диплоидных клеток MRC-5, инфицированных вирусом ветряной оспы, было использовано устройство для ультразвуковой обработки непрерывного действия. Область, находящаяся в непосредственной близости от источника ударной волны, является достаточно энергетичной для разрушения инфекционности вируса ветряной оспы. Поэтому, уровень снижения инфекционности вируса зависит от числа сайтов нуклеации, генерированных на единицу объема жидкости, которое соответствует количеству энергии, поступающей в жидкость. Однако процесс непрерывной ультразвуковой обработки также приводит к повышению температуры в жидкости на 5-10°С, что увеличивает степень деградации вируса. Энергетические затраты на ультразвуковую обработку могут быть снижены с повышением титров после обработки; однако меньшая степень дезинтеграции приводит к большим потерям при пропускании через осветляющие фильтры. Потери инфекционных титров, обусловленные ультразвуковой обработкой, и степень дезинтеграции клеток, необходимая для получения высоких титров после осветления, могут быть оптимизированы.

В другом известном способе, для максимизации высвобождения ротавируса из культуры была использована методика замораживания/оттаивания. Этот метод имеет определенные достоинства, однако, он мало применим в промышленном производстве.

Известны две методики, основанные на использовании сталкивающихся струй, а именно, столкновение струи жидкости с плоскостью, и столкновение с противоположно направленной струёй. Область столкновения продуцирует образование зоны микросмешивания, где сдвиговое усилие регулируется линейной скоростью струи. Эти устройства были использованы для дезинтеграции микробных клеток. В выпускаемом промышленностью устройстве, микрофлюидизаторе (MICROFLUIDIZER), используется камера взаимодействия, где два струйных потока сталкиваются друг с другом при линей3 ных скоростях, достигающих 200+ м/с. Отмечается, что механизм такой дезинтеграции основан на кавитации, сдвиговом напряжении в жидкости и соударении. Однако это устройство не пригодно для дезинтеграции клеток животных, поскольку оно разрушает не только клетки, но также и их содержимое.

Поэтому было бы желательно разработать такое устройство, которое позволяло бы эффективно дезинтегрировать клетки животных, не повреждая при этом их содержимое.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новому способу дезинтеграции культивированных клеток, в которых отсутствует клеточная стенка, предусматривающему пропускание клеток, суспендированных в соответствующей жидкости для суспендирования, через устройство со сталкивающимися струями при низком давлении.

Одно из преимуществ этого способа заключается в том, что продукты, продуцируемые культивированными клетками, могут быть высвобождены из этих клеток без какой-либо их деструкции путем воздействия на эти клетки сдвиговым усилием, регулируемым жидкостью, подаваемой под низким давлением с помощью вышеуказанного устройства. Поэтому, в другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу сбора клеточного продукта, содержащегося внутри клеток, не имеющих клеточной стенки, где указанный способ предусматривает:

a) культивирование клеток в условиях роста в культуральной среде до тех пор, пока не будет продуцирован клеточный продукт;

b) суспендирование клеток в жидкости для суспендирования;

c) пропускание суспендированных клеток через устройство со сталкивающимися струями низкого давления так, чтобы дезинтеграция клеток происходила под давлением от около 5 до 100 фунт/кв. дюйм (34, 470-689,4 кПа) с последующим высвобождением клеточного продукта; и

d) выделение высвобожденного клеточного продукта.

Способ настоящего изобретения может быть широко применен к любым клеткам, у которых отсутствует клеточная стенка, или у которых была удалена клеточная стенка. Хотя клетки животных являются предпочтительными, однако, этот способ может быть также с успехом применен и в отношении других клеток, таких, как протопласты растений или грибов и сферопласты бактерий. При этом требуется лишь одно условие, а именно, чтобы эти клетки были способны к культивированию, и чтобы эти клетки были предпочтительно пригодными для крупномасштабного культивирования. Примерами подходящих клеток животных являются клетки VERO, клетки СНО, и диплоидные фибробласты, такие как клетки MRC-5. Примерами подходящих растительных протопластов являются Nicotiana, Petunia, Zea, Brassica, и межвидовые гибриды. Клеточные линии могут быть иммортализованы или не иммортализованы, и кроме того, они могут быть культивированы либо в стационарной культуре, либо в суспензионной культуре. Ни один из этих параметров культивирования не имеет решающего значения для способа настоящего изобретения.

Способ настоящего изобретения может быть использован для выделения фактически любого типа продукта, продуцируемого с использованием культивированных клеток. Примерами таких продуктов являются натуральные продукты, такие как белки; полисахариды; рекомбинантные белки, включая антитела и ферменты; и вирусы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве клеток-хозяев для продуцирования вирусов, применяемых в промышленности для изготовления вакцин, используются клетки животных. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу сбора вируса, культивированного в клетках животных, где указанный способ предусматривает;

a) культивирование клеток животных, инфицированных вирусом;

b) суспендирование вируссодержащих клеток животных в жидкости для суспендирования;

c) пропускание суспендированных клеток животных через устройство со сталкивающимися струями для дезинтеграции клеток и высвобождения вируса; и

d) сбор высвобожденного вируса.

В одном особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения, диплоидные клетки легких человека MRC-5, инфицированные вирусом ветряной оспы - опоясывающего лишая (Varicella Zoster), а особенно штаммом ОКА вируса ветряной оспы - опоясывающего лишая, дезинтегрируют для сбора вируса в целях получения живой вирусной вакцины, VARIVAX®.

Краткое описание чертежа

Фиг. 1. - cхематическое изображение устройства с применением сталкивающихся струй, которое может быть использовано в способе настоящего изобретения.

Клетки культивируют как это обычно принято для конкретного типа клеток. После соответствующего периода культивирования клетки отделяют от субстрата (в случае, если они заякорены на субстрате) и суспендируют в жидкости. Такой жидкостью может быть та же самая жидкость, которая была использована для культивирования клеток, или аналогичная ей жидкость, либо такой жидкостью может быть стабилизатор. В соответствии с настоящим изобретением, состав жидкости для суспендирования не имеет решающего значения. Затем, суспендированные клетки пропускают через устройство с применением сталкивающихся струй, такое, как показано на фиг.1. В соответствии с этим чертежом, сдвиг в жидкости предпочтительно генерируется посредством столкновения в небольшой камере 120 двух противоположно направленных струйных потоков 111 и 101 с регулируемой линейной скоростью. Это устройство предпочтительно работает в непрерывном режиме, где входящий поток разделяется на две струи 100 и 110, а выходящий поток 130 сливается в камеру. При этом для максимизации сдвигового напряжения в жидкости, предпочтительно, чтобы сопла 111 и 1 01 находились в непосредственной близости друг от друга, то есть, на расстоянии менее, чем один дюйм (25,4 мм), а более предпочтительно, на расстоянии приблизительно 1/8 - 3/8 дюйма (3,175 - 9,25 мм).

Решающим фактором в данном аспекте осуществления способа настоящего изобретения, является то, что это устройство работает при низком давлении, в режиме отсутствия кавитации, предпочтительно при давлении менее чем около 150 фунт/кв.дюйм (1034,1 кПа), а более предпочтительно менее чем 1 00 фунт/кв. дюйм (689,4 кПа). Работа данного устройства при низком давлении приводит к мягкой дезинтеграции клеток, при этом, предпочтительно, чтобы дезинтеграция клеток происходила при очень низком давлении, составляющим от около 5 до 100 фунт/кв. дюйм (34,470-689,4 кПа). Такое низкое давление является одним из основных особенностей способа настоящего изобретения, отличающих его от предшествующих известных способов. Так, например, коммерчески доступный дезинтегратор, продающийся под торговым знаком MICROFLUIDIZER® фирмой Microfluidics International Corp., Newton, MA, и используемый для дезинтеграции клеток животных, работает при давлении 2000 фунт/кв.дюйм (13788 кПа). При таком высоком давлении, очевидно, происходит кавитация, которая приводит к нежелательному повреждающему воздействию на клетки.

Линейная скорость струи в точке столкновения также является критическим фактором в способе настоящего изобретения, поскольку этот параметр определяет деструктивную силу. Для данного метода, предпочтительная линейная скорость струи составляет приблизительно 5-50 м/с, а предпочтительно 10-30 м/с.

Способ настоящего изобретения предназначен специально для дезинтеграции клеток, у которых отсутствует клеточная стенка, причем, в этом способе, более низкие затраты энергии обеспечиваются путем регуляции. Действительно, при таком высоком давлении, на котором работает гомогенизатор или микрофлюидизатор MICROFLUIDIZER®, а именно при давлении 15000 и 40000 фунт/кв.дюйм (103410 и 275760 кПа), соответственно, было бы трудно обеспечить точный контроль при низких давлениях, которые были бы значительно ниже соответствующих расчетных технических данных, тогда, как в способе настоящего изобретения предпочтительно используется устройство, которое оптимизировано для работы при низких давлениях.

Было показано, что способ настоящего изобретения, основанный на применении сталкивающихся струй, обеспечивает адекватное разрушение клеток, и дает высокий выход после фильтрации с незначительными потерями инфекционного титра. В предварительных исследованиях было установлено, что метод с применением сталкивающихся струй дает значительно более высокий выход по сравнению с методом замораживания/оттаивания.

По сравнению со стандартными способами дезинтеграции клеток, способ настоящего изобретения имеет ряд преимуществ. Во-первых, устройство, используемое в способе настоящего изобретения, имеет простую конструкцию, и не требует ни использования поршневого насоса, ни системы охлаждения, что позволяет избежать проблем, связанных с устройствами такого типа. Еще одним преимуществом этого способа является применение системы, работающей при низком давлении, что позволяет использовать насос низкого давления (лопастый или диафрагменный насос) или баллон относительно низкого давления, используемый для подачи жидкости.

Благодаря низкому рабочему давлению, используемому в этом способе, в процессе дезинтеграции клеток продуцируется лишь очень незначительное количество тепла (< 0,1°С).

Описанное устройство имеет очень небольшие размеры, такие, что оно может быть введено в стандартную систему трубопровода, соединяющего два резервуара.

Устройство, основанное на применении сталкивающихся струй, позволяет разрушать клетки посредством сдвигового напряжения в жидкости, создаваемого путем микросмешивания в точно определенной зоне столкновения. В используемых условиях дезинтеграция клеток, кавитации не происходит. Поэтому, в данном способе удается избежать возникновения гетерогенных зон повреждающего клетки высокого сдвигового напряжения, которые обычно ассоциируются с механизмами дезинтеграции, основанными на кавитации.

Данное устройство с применением сталкивающихся струй может быть адаптировано для крупномасштабного производства. Объемный расход в этом технологическом процессе при данной линейной скорости может быть увеличен путем увеличения отверстия для подачи струи.

Дезинтеграция клеток, основанная на приложении регулируемого сдвигового напряжения в жидкости, обеспечивает высокий выход лабильных биологических молекул или вирусов.

По своей конструкции, данное устройство является достаточно гигиеничным; в нем ис7 пользуются коммерчески доступные технологии сопла для непрерывного производства; и оно может быть непосредственно включено в стандартные технологические линии. Кроме того, это устройство может быть стерилизовано на месте.

В этом устройстве не используется высокое давление > 200 фунт/кв.дюйм (1378,8 кПа), что позволяет избежать связанных с ним проблем.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения, способ дезинтеграции клеток с применением сталкивающихся струй может быть использован для получения высокого выхода вируса ветрянки и опоясывающего лишая, а также других вирусов или внутриклеточных белков, продуцируемых клетками животных. После дезинтеграции клеточный дебрис отделяют от ассоциированных с ними вирусных частиц с помощью осветляющего фильтра, и полученные вирусные препараты замораживают вплоть до их использования в приготовлении вакцины.

Для более наглядной иллюстрации настоящего изобретения, ниже приводятся примеры, которые не должны рассматриваться как ограничение изобретения.

Пример 1 .

Роллер-флаконы, содержащие связанные и инфицированные вирусом ветряной оспы клетки MRC-5, споласкивают, наливают в них 40 мл либо 1,0х, либо 1,5х стабилизатора PGSE, и с этих роллер-флаконов собирают пласт клеток путем его механического соскабливания со стенок флакона с использованием механической руки робота. Клеточную суспензию удаляют из роллер-флакона, собирают в сосуд, и замораживают до -60°С. До обработки аппарат со сталкивающимися струями калибруют в целях определения давления, необходимого для получения нужной линейной скорости, а затем стерилизуют. Замороженный собранный материал, содержащийся в сосудах, оттаивают, объединяют, и помещают в автоклав, подсоединенный к аппарату со сталкивающимися струями. В автоклав с находящимся в нем материалом подают давление так, чтобы линейная скорость сквозного потока струй составляла 22,5 м/с (1,0х PGSE) или 25,0 м/с (1,5х PGSE). Отработанный материал подают обратно в автоклав на второй цикл.

Пример 2.

Альтернативно, могут быть использованы две струи, последовательно следующие друг за другом. После этого, дезинтегрированные клетки осветляют путем фильтрации через полипропиленовые объемные фильтры. Иммуногенность вирусов анализируют методом бляшек. Анализ размера вирусных частиц может быть также проведен с помощью анализатора частиц

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ дезинтеграции культивированных клеток, у которых отсутствует клеточная стенка, предусматривающий пропускание клеток, суспендированных в культуральной жидкости, через устройство со сталкивающимися струями при низком давлении, где давление меньше или равно 150 фунт/кв.дюйм (1034,2 кПа) и линейная скорость струи от 5 до 50 м/с.
2. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что указанными клетками являются клетки животных.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что клетки животных выбирают из группы, включающей клетки VERO, клетки СНО и диплоидные фибробласты.
4. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что дезинтеграция клеток в указанном струйном устройстве происходит под давлением от около 5 до 100 фунт/кв.дюйм (34,470-689,4 кПа).
5. Способ сбора клеточного продукта, содержащегося внутри клеток, у которых отсутствует клеточная стенка, предусматривающий:

a) культивирование клеток в условиях роста в культуральной среде до тех пор, пока не будет продуцирован клеточный продукт;

b) суспендирование клеток в жидкости для суспендирования;

c) пропускание суспендированных клеток через устройство со сталкивающимися струями низкого давления с линейной скоростью струи от 5 до 50 м/с так, чтобы дезинтеграция клеток происходила под давлением от около 5 до 1 00 фунт/кв.дюйм (34,470-689,4 кПа) с последующим высвобождением клеточного продукта; и

d) выделение высвобожденного клеточного продукта.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанными клетками являются клетки животного.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный продукт выбирают из натурального белка, рекомбинантного белка и вируса.
8. Способ сбора вируса, культивированного в клетках животного, где указанный способ предусматривает:

a) культивирование клеток животного, инфицированных вирусом;

b) суспендирование вируссодержащих клеток животного в жидкости для суспендирования;

c) пропускание суспендированных клеток животных через устройство со сталкивающимися струями низкого давления, где давление меньше или равно 150 фунт/кв.дюйм (1034,2 кПа) и линейная скорость струи от 5 до 50 м/с, для дезинтеграции клеток и высвобождения вируса; и

d) сбор высвобожденного вируса.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанными клетками животного являются диплоидные клетки легких MRC-5.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанным вирусом является вирус ветряной оспы.