CN1100868C - 用冲击射流装置破碎培养细胞的方法 - Google Patents

Abstract

破碎没有细胞壁的细胞的新方法，该方法包括使悬浮的细胞通过低压冲击射流装置。该方法可破碎细胞，但不会损害释放的细胞产物。

Description

用冲击射流装置破碎培养细胞的方法

发明领域

本发明涉及使用对向喷射流破碎培养物中生长的细胞的方法，所述对向喷射流在低压下操作，从而产生足以破裂细胞，但不会破坏细胞内含物的破坏性流体剪切力。

发明背景

许多生物技术和发酵方法都需要大量在生物反应器中生长的细胞，然后将其破碎以释放所需的产物。可通过机械、化学、生物或物理方法破碎细胞。许多方案都倾向于机械破碎方法，因为这种方法不需要其它试剂(洗涤剂、酶或渗透性效应物)并避免了按比例扩大物理方法如冷冻/融解的困难。

已经开发了许多机械方法来破碎微生物。这些方法通常依赖于流体剪切力和/或压力来破碎细胞壁和膜。但是，并不是所有的生物技术和发酵方法都使用微生物。动物细胞正在成为常用的宿主细胞。由于动物细胞较大并有脆弱的膜，只需很少的能量就可达到所需破碎细胞的目的。许多为微生物系统而设计的商用系统不适宜用于动物细胞。

可用带有在定子内高速同心旋转的圆柱形转子的转子/定子装置来破碎细胞。这些装置可以在环状区域内产生急剧升降的速度梯度，从而在流体中产生足以破碎细胞的剪切力。一种称为Chaikoff Press的类似装置带有一个圆柱体和一个直径较小的活塞。活塞的运动在环状空间内的流体中产生高剪切力，使细胞破碎。这种类型的装置也称为“douncer”，并用于破碎水痘感染的MRC-5二倍体肺细胞。然而，这些方法仅适用于实验室规模，并且不能按比例扩大以用于生产。

超声或声处理破碎细胞是通过空腔化作用在流体中产生高剪切力区域。振动声波(～20kHz)在流体中产生压力间歇。在低压区域形成的蒸气泡进入高压区后破碎，产生高能量的冲击波。由于冲击波从最初的空腔化位点向外辐射，能量在流体中的散射便产生了高剪切力及热量。

曾经使用连续流声处理装置来破碎含有水痘病毒的MRC-5二倍体肺细胞。靠近冲击波形成处的区域具有足够的能量破坏水痘的感染力。因此，病毒感染力损失的量取决于每单位体积流体内产生的核形成位点的数量，而该数量与输入到流体中的能量相关。但是，连续声处理方法会使处理流体的温度升高5-10℃，这会加快病毒的降解速度。可以降低声处理的输入能量，以增加声处理后的效价；然而，破碎不足会在澄清过滤后产生更大的损失。在因声处理引起的感染效价损失和澄清后得到高效价所需的细胞破碎度之间存在最佳点。

在另一种现有方法中，使用冷冻/融解而使轮状病毒从培养物中的释放达到最大。该方法尽管有用，但很难在生产中实施。

有两种已知冲击射流(impinging jet)方法：在平板上流体射流的冲击和以对向射流进行的冲击。冲击区产生了微混合区，在该区中，剪切力受射流线速度的控制。已将这些装置用于破坏微生物细胞。在商业上，MICROFLUIDIZER装置利用一个相互作用室，在所述室中，两个射流以高达200+m/s的线速度相互冲击。报导的破碎模式是空腔化、流体剪切力和冲击。但是该装置不适用于动物细胞，因为不仅细胞会受到破碎，而且其内含物也会被破坏。

因此需要一种能有效破碎动物细胞并释放未被破坏的细胞内含物的装置。

发明描述

本发明涉及破碎没有细胞壁的培养的细胞的新方法，所述方法包括使悬浮在悬浮流体中的细胞通过低压冲击射流装置。

该方法的一个优点是可释放用培养的细胞制备的产物而不会破坏那些产物，所述产物是通过使细胞经冲击射流装置的低压流体控制的剪切力处理而得到的。因此，本发明的另一方面是收集包含在无细胞壁的细胞内的细胞产物的方法，该方法包括：

a)在培养条件下于培养基中培养细胞，直到产生所述细胞产物；

b)将细胞悬浮在悬浮流体中；

c)使悬浮的细胞通过低压冲击射流装置，以便在约5-100psi的压力下破碎细胞，并释放细胞产物；和

d)回收释放的细胞产物。

可将本发明方法广泛地用于没有细胞壁或已除去其细胞壁的任何细胞。尽管动物细胞是优选的，但该方法同样适用于其它细胞，如植物或真菌原生质体和细菌原生质球。唯一的要求是该细胞适合于进行细胞培养，而且优选该细胞适合于大规模培养。适宜的动物细胞的实例包括VERO细胞、CHO细胞和二倍体成纤维细胞，如MRC-5细胞。适宜的植物原生质体的实例包括烟草属、矮牵牛属、玉蜀黍属、芸苔属和种间杂种物。细胞系可以是或不是无限增殖的，而且可将其培养在静止或悬浮培养基中。对于本发明方法来说，没有特别的培养参数。

实际上可将本发明方法用于回收通过使用培养的细胞制备的任何类型的产物。所述产物的实例包括：天然产物如蛋白质；多糖；重组蛋白质，包括抗体和酶；以及病毒。在本发明优选的实施方案中，用动物细胞作为宿土细胞生产疫苗制备中所用的病毒。因此本发明包括收集在动物细胞中生长的病毒的方法，该方法包括：

a)培养用病毒感染的动物细胞；

b)将含病毒的细胞悬浮在悬浮流体中；

c)使悬浮的细胞通过低压冲击射流装置，以便破碎细胞，并释放出病毒；和

d)收集释放的病毒。

在一个特别优选的实施方案中，破碎用水痘-带状疱疹病毒，特别是水痘-带状疱疹病毒的OKA株感染的MRC-5人二倍体肺细胞，以收集用于制备活病毒疫苗VARIVAX的病毒。

附图的简单说明

图1是可用于本发明方法中的冲击射流装置示意图。

按照用于特定细胞的惯例培养细胞。适宜的培养期后，从在底物(如果它们是固定的话)中释放细胞，悬浮在流体中。该流体可与用于培养细胞的流体相同或相似，或可以是稳定剂。对于本发明来说，悬浮流体的组成并不关键。然后，使悬浮的细胞通过如图1所示的冲击射流装置。参见图1，优选在小室120内，通过两个对向射流111和101以控制的线速度来产生流体剪切力。该装置优选以连续的方式工作，使输入的流体分成两个射流100、110和流出该室的输出流130。优选将喷嘴111和101放置的非常靠近，即距离小于1英寸，并更优选约1/8至3/8英寸，以使流体剪切力达到最大。

本发明方法的一个重要方面是以非空腔化模式，在低压下，优选150psi以下，更优选100psi以下操作该装置。低压操作会缓慢地进行破碎-优选在很低的，约5-100psi的压力下破碎细胞。这是本发明方法区别于现有技术的特征之一。例如，市售的冲击射流细胞破碎器(由Microfluidics International Corp.，Newton，MA以MICROFLUIDIZER^为商标销售)在2000psi破碎动物细胞。在如此高的压力下，空腔化作用和其损伤作用均可能发生。

在冲击点的线性射流速度也是本发明的一个重要方面，因为它代表了破碎力。对于该方法而言，优选线性射流速度为约5-50m/s，优选10-30m/s。

本发明的方法专门为破碎没有细胞壁的细胞而设计的，其中以受控方式输入较低的能量。对于分别被设计用于传递高达15000和40000psi压力的匀浆器或MICROFLUIDIZER^而言，很难在远远低于其各自设计压力的低压下进行精确的控制，而本发明的方法优选使用适于在低压下运行的装置。

已经证实本发明的冲击射流方法可以提供足够的细胞破碎力以达到高的过滤产率，并且感染效价的损失可忽略不计。在初步研究中，冲击射流提供了高于冷冻/融解方法的产率。

本发明的方法与现有的细胞破碎方法相比有许多优点。第一，该装置设计简单而且既不需要活塞泵也不需要冷却装置，从而避免了与此类元件有关的问题。低压操作系统的另一优点是可用低压加工泵(叶轮泵或隔板泵)或相对的低压容器驱动流体。

由于在低压下操作，因此在破碎过程中仅产生了可忽略量的热(＜0.1℃)。

该装置体积很小，以致可将其装入连接两个容器的标准处理管中。

该冲击射流装置通过流体剪切力破碎细胞，所述流体剪切力是通过在非常确定的冲击区内微混合而产生的。在所用破碎条件下并不发生空腔化作用。避免了基于空腔化作用的破碎机制所常见的破坏性高剪切力的不均匀区域。

该冲击射流装置是可调的。可以通过增加喷射孔来增加给定线速度下的容积加工速率。

提供了用于高产率回收不稳定生物分子或病毒的、以控制的流体剪切力为基础的破碎方法。

该装置设计卫生，并使用市售的用于连贯装配的喷嘴技术，并且可以直接装到标准的处理装置中。此外，该装置还可就地灭菌。

避免了＞200psi的高压操作以及相关问题。

在优选的实施方案中，可将本发明的冲击射流细胞破碎方法用于高产率回收水痘疱疹病毒、其它病毒或来自动物细胞的细胞内蛋白质。破碎后，通过澄清过滤将细胞碎片与有关的病毒颗粒分开，然后将所得的病毒制品冷冻直到进一步加工成疫苗。

用下列非限制性实施例来更好地说明本发明。

                     实施例1

将装有用水痘病毒感染的贴壁MRC-5细胞的滚瓶用40ml的1.0x或1.5xPGSE稳定剂漂洗、分散，然后用机械臂从滚瓶中机械刮下细胞层，并从滚瓶中收集细胞。从滚瓶中取出细胞悬浮液，收集在容器中，然后冷冻到-60℃。处理前，校正冲击射流装置以确定产生所需线速度所需的压力，然后灭菌。将含有冷冻的收集物的容器融解、合并，然后放入与冲击射流装置相连的压力容器中。将压力容器中的内含物加压，使其以22.5m/s(1.0x PGSE)或25.0m/s(1.5xPGSE)的线速度通过射流装量。将射出的材料送回压力容器中，以进行第二次处理。

                      实施例2

或者可使用连续的两个射流。然后通过聚丙烯深度滤器过滤澄清破碎的细胞。通过噬菌斑试验检测效价。再使用Elzone颗粒分析仪进行粒度分析。

Claims (10)

1.破碎没有细胞壁的培养的细胞的方法，该方法包括使用低压冲击射流装置破碎悬浮于培养流体中的细胞，该射流装置输出相对的射流，其压力小于或等于150psi，线性射流速度为5到50m/s。

2.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是动物细胞。

3.根据权利要求2的方法，其中所述动物细胞选自VERO细胞、CHO细胞和二倍体成纤维细胞。

4.根据权利要求1的方法，其中所述射流装置在约5-100psi的压力下破碎细胞。

5.收集包含在没有细胞壁的细胞内的细胞产物的方法，包括：

a)在培养条件下于培养基中培养细胞，直到产生所述细胞产物；

b)将该细胞悬浮在悬浮流体中；

c)使用低压冲击射流装置破碎悬浮的细胞，该装置输出相对的射流，其压力小于或等于150psi，线性射流速度为5到50m/s，以便破碎细胞，并释放细胞产物；以及

d)回收释放的细胞产物。

6.根据权利要求5的方法，其中所述细胞是动物细胞。

7.根据权利要求6的方法，其中所述产物选自天然蛋白质、重组蛋白质和病毒。

8.收集生长在动物细胞中的病毒的方法，该方法包括：

a)培养用病毒感染的动物细胞；

b)将含病毒的动物细胞悬浮在悬浮流体中；

c)使用低压冲击射流装置破碎悬浮的动物细胞，该装置输出相对的射流，其压力小于或等于150psi，线性射流速度为5-50m/s，以便破碎细胞，并释放出病毒；和

d)回收释放的病毒。

9.根据权利要求8的方法，其中所述动物细胞是MRC-5二倍体肺细胞。

10.根据权利要求9的方法，其中所述病毒是水痘病毒。

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